ES2901769T3 - Uso de variantes de péptidos natriuréticos tipo c para tratar la osteoartritis - Google Patents

Abstract

Una variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse en un método de i) tratar la osteoartritis; ii) aumentar el crecimiento del cartílago en un sujeto con osteoartritis; iii) ralentizar la degeneración del cartílago; iv) mejorar un síntoma de osteoartritis; v) aumentar las habilidades motoras o la movilidad en un paciente con osteoartritis; vi) inhibir la degeneración de la movilidad en un paciente con osteoartritis; vii) aumentar el rango de movimiento en una articulación afectada de un sujeto que padece osteoartritis; viii) disminuir la rigidez en una articulación afectada de un sujeto que padece osteoartritis; ix) disminuir la inflamación sinovial en un sujeto; o x) prevenir la aparición de osteoartritis, en un sujeto que lo necesite, donde la variante de CNP se administra por vía intraarticular.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de variantes de péptidos natriuréticos tipo C para tratar la osteoartritis

Campo de la invención

La divulgación se refiere a variantes específicas del péptido natriurético de tipo C (CNP por sus siglas en inglés) para su uso en un método para tratar la osteoartritis, mejorar uno o más síntomas de la osteoartritis y tratar trastornos que tienen un componente de osteoartritis.

Antecedentes de la invención

La osteoartritis (OA por sus siglas en inglés) es una enfermedad degenerativa de las articulaciones. Es la enfermedad articular más prevalente que afecta aproximadamente al 10% de los hombres y al 18% de las mujeres mayores de sesenta años. De hecho, la OA es una de las principales causas de dolor y discapacidad en los adultos mayores. Es una enfermedad compleja que no tiene una causa única, sino que es el criterio de valoración final de muchos factores predisponentes, incluidos el traumatismo articular, la edad y la obesidad. Las alteraciones patológicas más comunes en las articulaciones con OA son la degradación del cartílago articular, la inflamación de la membrana sinovial, el aumento de la profundidad del hueso subcondral y el desarrollo de osteofitos. Las terapias farmacéuticas actuales para la OA se dirigen a los aspectos inflamatorios de la enfermedad, pero no a la degeneración subyacente ni a la arquitectura alterada de la articulación. Estos tratamientos antiinflamatorios solo ofrecen un alivio temporal del dolor. Por el contrario, se cree que los tratamientos que disminuirían o revertirían la degeneración de la articulación tienen efectos favorables y más duraderos sobre el dolor y la movilidad del paciente. Por consiguiente, existe la necesidad de agentes farmacéuticos que puedan disminuir la degeneración articular y / o restaurar el cartílago articular y la estructura articular en pacientes con OA.

El péptido natriurético de tipo C (CNP) (número de acceso de GenBank NP_077720, para la proteína precursora del CNP, NPPC (por sus siglas en inglés)) es un péptido pequeño de cadena única que se expresa ampliamente, principalmente en el sistema nervioso central, el tracto reproductivo, los huesos y endotelio de los vasos sanguíneos. El CNP se une a dos receptores distintos: el receptor del péptido natriurético B (NPR-B por sus siglas en inglés) y el receptor del péptido natriurético C (NPR-C por sus siglas en inglés). NPR-B es un miembro de la familia de múltiples genes de la guanilil ciclasa unida a la membrana y produce el segundo mensajero guanosina monofosfato cíclico (cGMP por sus siglas en inglés) cuando se activa mediante la unión de CNP. Por el contrario, NPR-C no tiene ningún dominio de señalización intracelular y, en cambio, funciona para eliminar los péptidos natriuréticos del espacio extracelular. Por tanto, cuando el CNP se une a NPR-C, el receptor internaliza y entrega el CNP a un lisosoma donde se degrada, lo que reduce la concentración extracelular eficaz de CNP.

El CNP se produce inicialmente a partir del gen precursor del péptido natriurético C (NPPC) como un pre-pro polipéptido de 126 aminoácidos. La eliminación del péptido señal produce pro-CNP, y la escisión adicional por la endoproteasa furina genera un péptido biológicamente activo de 53 aminoácidos (CNP-53), que se secreta y se procesa para producir el péptido maduro de 22 aminoácidos (CNP- 22). CNP-53 y CNP-22 difieren en su distribución; el CNP-53 se encuentra principalmente en los tejidos, mientras que el CNP-22 se encuentra principalmente en el plasma y el líquido cefalorraquídeo. Actualmente se desconoce la forma de CNP predominante en el cartílago. Tanto CNP-53 como CNP-22 se unen a NPR-B con cinéticas similares y ambos inducen la producción de cGMP de una manera dependiente de la dosis. La señalización corriente abajo mediada por cGMP influye en una amplia gama de procesos biológicos, incluida la osificación endocondral. Por consiguiente, los niveles elevados o deprimidos de cualquiera de los componentes de esta vía pueden conducir a un crecimiento aberrante de hueso o cartílago. Por ejemplo, la desactivación de ya sea CNP o NPR-B en modelos de ratón da como resultado animales que tienen un fenotipo enano con huesos largos y vértebras más cortas. Además, las mutaciones en NPR-B humano que bloquean la señalización del CNP dan como resultado enanismo. Por el contrario, los ratones diseñados para producir niveles elevados de CNP presentan huesos largos y vértebras alargadas.

El potencial terapéutico del CNP está limitado por su corta vida media. El CNP se elimina mediante dos mecanismos: 1) mediante la acción de la endopeptidasa neutra unida a la membrana (NEP por sus siglas en inglés), que degrada rápidamente el CNP, y 2) mediante la unión de NPR-C, que dirige al CNP a los lisosomas donde se degrada. Estos dos mecanismos de depuración son responsables de la corta vida media del CNP (~2,6 min). Para aumentar la concentración de CNP por encima de los niveles que se encuentran típicamente en el plasma humano (~5 pM), ha sido necesaria la infusión continua, lo que limita severamente su potencial terapéutico. Para superar este problema, se han desarrollado variantes de CNP con vidas medias más largas. Dado su papel potencial en la estimulación del crecimiento del cartílago, las variantes de CNP representan una nueva clase de terapéutica para ofrecer un alivio más duradero a los pacientes con OA.

El documento EP 1759710 describe el uso de un activador de guanil ciclasa B que incluye CNP como terapéutico de la osteoartritis. KR 20070017366 se refiere al tratamiento de la inflamación artrítica utilizando una sustancia activadora de guanilciclasa B como el CNP. Peake N.J. et al., Biomacromolecules, 16, 524-531 (2015) describe la liberación controlada de CNP por microencapsulación para examinar los efectos antiinflamatorios de este tipo de formulación. Los documentos US 2010/297021 y WO 2009/067639 describen variantes de CNP como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades que responden a CNP, incluidos trastornos relacionados con los huesos y trastornos del músculo liso vascular.

Breve descripción de la invención

La presente divulgación se refiere al uso de variantes de CNP para tratar la osteoartritis primaria o secundaria o uno o más síntomas asociados con la osteoartritis. Se describe en el presente documento que la administración de variantes de CNP puede conducir a un rango mejorado de movimiento de las articulaciones afectadas y un daño asociado con la osteoartritis ralentizado o disminuido en el cartílago, cartílago calcificado o hueso subcondral en animales tratados. La variante de CNP puede ser Gly-CNP-37 o Pro-Gly-CNP-37.

Específicamente, la presente invención se refiere a una variante de CNP seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOs.: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse en un método de i) tratar la osteoartritis; ii) aumentar el crecimiento del cartílago en un sujeto con osteoartritis; iii) ralentizar la degeneración del cartílago; iv) mejorar un síntoma de osteoartritis; v) aumentar las habilidades motoras o la movilidad en un paciente con osteoartritis; vi) inhibir la degeneración de la movilidad en un paciente con osteoartritis; vii) aumentar el rango de movimiento en una articulación afectada de un sujeto que padece osteoartritis; viii) disminuir la rigidez en una articulación afectada de un sujeto que padece osteoartritis; ix) disminuir la inflamación sinovial en un sujeto; o x) prevenir la aparición de osteoartritis, en un sujeto que lo necesite, donde la variante de CNP se administra por vía intraarticular.

En varias realizaciones, la invención proporciona la variante de CNP seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOs.: 1,2, 22 y 43 a 47 para usarse en un método de tratamiento de la osteoartritis primaria o secundaria o uno o más síntomas asociados a la osteoartritis, que comprende administrar la variante de CNP o la composición que comprende la variante de CNP a un sujeto que lo necesite, donde la administración trata la osteoartritis primaria o secundaria o dicho uno o más síntomas de la enfermedad. También se contempla la variante de CNP seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOs.: 1,2, 22 y 43 a 47 para usarse en un método para aumentar el crecimiento de cartílago, cartílago calcificado o hueso subcondral en un sujeto, que comprende administrar la variante de CNP o la composición que comprende la variante de CNP a un sujeto que lo necesite. La invención también contempla la variante de CNP seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOs.: 1,2, 22 y 43 a 47 para usarse en un método para ralentizar, prevenir o inhibir la degeneración asociada a la osteoartritis del cartílago, cartílago calcificado o hueso subcondral, que comprende administrar la variante de CNP o la composición que comprende la variante de CNP a un sujeto que lo necesite. Además, la invención proporciona la variante de CNP seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOs.: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse en un método para aumentar el rango de movimiento o disminuir la rigidez en una articulación afectada por osteoartritis, que comprende administrar la variante de CNP a un sujeto que lo necesite. Se describe un método para reducir el crecimiento de osteofitos en una articulación afectada por osteoartritis que comprende administrar una variante de CNP a un sujeto que padece osteoartritis.

La variante de CNP se selecciona del grupo que consta de SEQ ID NOs: 1, 2, 22 y 43 a 47 (ver a continuación). Se describen variantes de CNP que incluyen las siguientes variantes de CNP para su uso en los métodos anteriores.

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 1);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP-37) (SEQ ID NO: 2);

GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP53) (SEQ ID NO: 3);

PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP53) (SEQ ID NO: 4);

MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP53) (SEQ ID NO: 5); DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-53(M48N)] (SEQ ID NO: 6); LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-52) (SEQ ID NO: 7);

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-51) (SEQ ID NO: 8);

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-50) (SEQ ID NO: 9);

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-49) (SEQ ID NO: 10);

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-48) (SEQ ID NO: 11);

KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-47) (SEQ ID NO: 12);

SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-46) (SEQ ID NO: 13);

RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-45) (SEQ ID NO: 14);

AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-44) (SEQ ID NO: 15);

AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-43) (SEQ ID NO: 16);

WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-42) (SEQ ID NO: 17);

ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 18);

RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-40) (SEQ ID NO: 19);

LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 20);

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 21);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37) (SEQ ID NO: 22);

EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-36) (SEQ ID NO: 23);

HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-35) (SEQ ID NO: 24);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-34) (SEQ ID NO: 25);

NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-33) (SEQ ID NO: 26);

ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-32) (SEQ ID NO: 27);

RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-31) (SEQ ID NO: 28);

KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-30) (SEQ ID NO: 29);

YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-29) (SEQ ID NO: 30);

KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-28) (SEQ ID NO: 31);

GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-27) (SEQ ID NO: 32);

ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-26) (SEQ ID NO: 33);

NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-25) (SEQ ID NO: 34);

KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-24) (SEQ ID NO: 35);

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-23) (SEQ ID NO: 36);

LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-21) (SEQ ID NO: 38);

SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-20) (SEQ ID NO: 39);

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP- 19) (SEQ ID NO: 40);

GCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-18) (SEQ ID NO: 41);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N)] (SEQ ID NO: 43);

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP-37) (SEQ ID NO: 44);

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP-37) (SEQ ID NO: 45);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37(M32N)] (SEQ ID NO: 46); MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP-37) (SEQ ID NO: 47); GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (HSA-CNP-27) (SEQ ID NO: 48);

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP-27(M22N)] (SEQ ID NO: 49);

PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-HSA-CNP-27) (SEQ ID NO: 50);

MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-HSA-CNP-27) (SEQ ID NO: 51);

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 52);

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 53);

PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Pro-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 54);

MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Met-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 55);

PEGIK-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEG1K-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 56);

PEGIK-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [PEG1K-CNP-27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 57);

PEG1K-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEG1K-Pro-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 58);

PEG1 K-MGGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1 K-Met-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 59);

PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO12-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 60);

PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [PEO12-CNP-27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 61);

PEO12-PGGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO12-Pro-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 62);

PEO12-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO12-Met-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 63);

PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO24-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 64);

PEO24-G GLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [PEO24-CNP-27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 65);

PEO24-PGGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO24-Pro-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 66); y

PE024-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO24-Met-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 67).

El aumento en el crecimiento del cartílago, cartílago calcificado o hueso subcondral o ralentización de la degradación del cartílago, cartílago calcificado o del hueso subcondral se puede observar en la rodilla, hombro, codo, dedo, mano, muñeca, caderas, cuello, tobillo, columna vertebral, y / o espalda baja del sujeto. El daño o el crecimiento del cartílago se puede analizar por muerte / pérdida de condrocitos, pérdida de proteoglicanos (PG) y pérdida o fibrilación de colágeno.

La variante de CNP se usa en un método para aumentar el rango de movimiento en una articulación en un sujeto con osteoartritis, que comprende administrar una variante de CNP a un sujeto que lo necesite. La variante de CNP aumenta el rango de movimiento medido por flexión de cadera, extensión de cadera, abducción de cadera, aducción de cadera, flexión de rodilla o extensión de rodilla en un 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. También se contempla que la administración de la variante de CNP mejora los síntomas de la artritis, incluida la osteoartritis, según se evalúa en diversas escalas de dolor y de paciente, como las descritas con más detalle en la Descripción detallada. La variante de CNP puede ser Gly-CNP-37 o Pro-Gly-CNP-37.

Se describe un método para prevenir, inhibir o ralentizar el crecimiento o la formación de osteofitos en un mamífero, que comprende administrar una variante de CNP a un sujeto que lo necesite. La formación o el crecimiento de osteofitos pueden estar asociados con la osteoartritis en el sujeto. La formación o el crecimiento de osteofitos, y la prevención o inhibición de la formación o el crecimiento de los mismos, pueden determinarse mediante la medición física del tamaño de un osteofito a lo largo del tiempo y durante el curso de un régimen de tratamiento de variante de CNP. La variante de CNP puede ser Gly-CNP-37 o Pro-Gly-CNP-37.

La variante de CNP se utiliza en un método para prevenir, inhibir o ralentizar el crecimiento anormal de hueso trabecular subcondral o epifisario en un mamífero, que comprende administrar una variante de CNP a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, el crecimiento anormal del hueso subcondral o epifisario se manifiesta por el engrosamiento del hueso. En otro aspecto, el crecimiento anormal del hueso trabecular subcondral o epifisario está asociado con osteoartritis, osteoporosis u osteosclerosis. La variante de CNP puede ser Gly-CNP-37 o Pro-Gly-CNP-37.

La variante de CNP se utiliza en un método para prevenir, inhibir o ralentizar la inflamación sinovial (es decir, sinovitis) en un mamífero, que comprende administrar una variante de CNP a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, la inflamación sinovial se manifiesta al menos por la infiltración de células mononucleares en una articulación afectada. En otro aspecto, la inflamación sinovial está asociada con la osteoartritis. La variante de CNP puede ser Gly-CNP-37 o Pro-Gly-CNP-37.

Según la invención, la variante de CNP se administra por vía intraarticular. Sin embargo, una variante de CNP puede administrarse por otras vías. Las vías de administración ejemplares incluyen, pero no se limitan a, administración subcutánea, intraarticular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, intratecal, tópica, transdérmica o transmucosa.

La variante de CNP puede administrarse en respuesta a un traumatismo o lesión articular. La variante de CNP se puede administrar dentro de un mes de traumatismo o lesión articular. La variante de CNP se puede administrar dentro de una semana de traumatismo o lesión articular. La variante de CNP puede administrarse después de que se haya producido la degeneración del cartílago.

Se describe un método para evaluar el efecto de una variante de CNP en el nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago en un sujeto que tiene osteoartritis, que comprende analizar el nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago en una muestra biológica de un sujeto que tiene osteoartritis. al que se le ha administrado un péptido o variante de CNP. La variante de CNP puede administrarse al sujeto antes de ensayar el nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago.

El método para tratar la osteoartritis o uno o más síntomas o manifestaciones asociados con la osteoartritis puede comprender administrar una variante de CNP a un sujeto, donde se identificó que el sujeto tenía niveles elevados de al menos un biomarcadores asociados al cartílago. El al menos un biomarcador asociado al cartílago se puede seleccionar del grupo que consiste en CNP, cGMP, propéptidos de colágeno tipo II y fragmentos del mismo, colágeno tipo II y fragmentos del mismo, sindecan-3, anexina VI, antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA por sus siglas en inglés), propéptidos de procolágeno tipo I (PINP) y fragmentos del mismo, colágeno tipo I y fragmentos del mismo, y condroitín sulfato de agrecano.

La composición que comprende una variante de CNP se utiliza en un método como el mencionado anteriormente. La composición puede comprender además un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición puede ser una formulación liofilizada preparada a partir de una formulación que comprende un tampón de ácido cítrico / citrato o un tampón de ácido acético / acetato que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.

Además, puede comprender la administración de un segundo agente. El segundo agente puede seleccionarse del grupo que consiste en un agente antiinflamatorio, un NSAID, un corticosteroide y ácido hialurónico.

Las variantes de CNP se pueden unir a un ácido hidrófobo o se pueden unir a uno o más ácidos hidrófobos. Los ejemplos no limitantes de ácidos hidrófobos incluyen ácidos carboxílicos C⁵-C¹² de cadena lineal o ramificada, saturados o insaturados (por ejemplo, ácido pentanoico, ácido heptanoico, etc.) y ácidos grasos naturales. Los ácidos hidrófobos se pueden unir al N-terminal, al C-terminal y / o a la cadena lateral de uno o más residuos de aminoácidos. El ácido hidrófobo se puede conjugar con el N-terminal.

Las variantes de CNP pueden ser quimeras o proteínas de fusión, que comprenden una variante de CNP y un péptido o proteína escindible o etiqueta de péptido. Las proteínas o péptidos escindibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de histidina (por ejemplo, hexa-His); TAF12: factor de transcripción humano TAF12; KSI: isomerasa cetoesteroide; MBP: proteína de unión a maltosa; p-Gal: p-galactosidasa; GST: glutatión-S-transferasa; Trx: tiorredoxina; CBD: dominio de unión a quitina; BMPM: Mutación BMP-2, SUMO, CAT, TrpE, proteína A estafilocócica, proteínas estreptocócicas, proteína de unión a almidón, dominio de unión a celulosa de endoglucanasa A, dominio de unión a celulosa de exoglucanasa Cex, dominio de unión a biotina, recA, Flag, c- Myc, poli (His), poli (Arg), poli (Asp), poli (Gln), poli (Phe), poli (Cys), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente cian, biotina, avidina, estreptavidina, epítopos de anticuerpos y fragmentos de los mismos.

La variante de CNP puede ser un monómero o un dímero. Los monómeros de las variantes diméricas de CNP se pueden unir N-terminal con N-terminal a través de un enlazador o sin enlazador, N-terminal con C-terminal a través de un enlazador o sin enlazador, o C-terminal con C-terminal a través de un enlazador o sin enlazador.

Las variantes de CNP pueden tener sustancialmente la misma o mejor actividad biológica que el CNP-22 de tipo salvaje. Por ejemplo, las variantes de CNP pueden retener al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad del CNP-22 de tipo salvaje, o pueden tener mayor actividad que CNP-22, por ejemplo, con respecto a la interacción con NPR-B para estimular la generación de cGMP Alternativamente, o además, las variantes de CNP pueden retener al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad del CNP-22 de tipo salvaje, o puede tener una actividad mayor que el CNP-22, con respecto a la regulación del crecimiento óseo endocondral y la actividad de los condrocitos, que incluyen, pero no se limitan a, la proliferación de condrocitos, la diferenciación de condrocitos, inhibición de la proteína activada por mitógenos (MAP por sus siglas en inglés) quinasa / MEK (Raf-1) vía de señalización de quinasa y promoción de la osificación endocondral. Las variantes de CNP pueden comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más idéntica a los aminoácidos 6-22 o 1-22 de CNP-22 de tipo salvaje.

Las variantes de CNP pueden tener opcionalmente conjugación(es) o extensión(es), por ejemplo, en el N y / o C-terminal para facilitar el direccionamiento del cartílago, reducir el aclaramiento renal y / o aumentar la resistencia a la degradación de NEP. Dicha conjugación(es) o extensión(es) pueden comprender moléculas o secuencias formadas o derivadas de, por ejemplo, poliAsp, polyGlu, péptidos dirigidos al cartílago, sialoproteína, PEGs, carbohidratos, ácidos hidrofóbicos, NPPC o (poli) péptidos que no son CNP, o combinaciones de los mismos.

Se contempla además que las variantes de CNP se pueden conjugar con un resto polimérico o no polimérico hidrófobo, tal como, por ejemplo, ácido heptanoico, ácido pentanoico o ácidos grasos. El resto hidrófobo se puede conjugar con la cadena lateral de un residuo de aminoácido, que incluye, pero no se limita a, una lisina, una serina, una cisteína o una treonina, o se puede unir al N-terminal y / o C-terminal de la Variante de CNP.

Las variantes de CNP pueden tener un pI en el intervalo de aproximadamente ⁸ a aproximadamente 10,5 o de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10.

Se describe el uso de una composición farmacéutica que comprende una variante de CNP, opcionalmente otro agente biológicamente activo y opcionalmente un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas estériles adecuadas para administración parenteral. Las composiciones pueden comprender una variante de CNP sustancialmente pura, por ejemplo, al menos aproximadamente un 90% o un 95% de pureza. Las composiciones pueden contener menos de aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o 0,5% de contaminantes, tales como otras proteínas humanas, proteínas porcinas o CNP-53 o fragmentos del mismo (distintos de la variante de CNP deseada). La composición estéril se puede administrar a un sujeto para tratar o prevenir cualquiera de las afecciones o trastornos que responden a CNP del presente documento.

Las variantes de CNP útiles en el presente documento conservan ventajosamente la actividad de CNP y exhiben una vida media en suero aumentada. La retención de la actividad de CNP se puede mostrar, por ejemplo, como retención del efecto biológico in vivo, o retención de al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o al menos aproximadamente 100% de la actividad estimulante de cGMP de CNP-22, bajo la misma concentración (p. ej., 1 pM de péptido CNP o mayor que la ED80). Las variantes de CNP pueden presentar un aumento de al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces o 40 veces en la vida media en suero en comparación con CNP-22.

Las variantes de CNP de la presente pueden tener una mayor resistencia a NEP y exhibir una vida media aumentada en comparación con el CNP-22 de tipo salvaje. La vida media de las variantes de CNP puede incrementarse en aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, ^{6 0} %, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % o aproximadamente el 100% en comparación con CNP-22 de tipo salvaje.

Las variantes de CNP pueden aumentar la producción de cGMP in vitro, aumentar la producción de cGMP in vivo, aumentar in vivo del nivel de uno o más biomarcadores asociados con la formación o el crecimiento de cartílago o hueso, aumentar la resistencia a la escisión de NEP in vitro, aumentar la vida media plasmática o sérica in vivo, aumenta la biodisponibilidad in vivo, o aumentar el crecimiento o la regeneración del cartílago in vivo, o combinaciones de efectos de dichos aumentos, en aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 3,5 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 4,5 veces o aproximadamente 5 veces o más en comparación con CNP-22 de tipo salvaje.

Las variantes de CNP se pueden administrar a una dosis en el intervalo de aproximadamente 5 o 10 nmol / kg a aproximadamente 300 nmol / kg, o de aproximadamente 20 nmol / kg a aproximadamente 200 nmol / kg. Las variantes de CNP se pueden administrar a una dosis de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 nmol / kg u otra dosis que el médico tratante considere apropiada. Las variantes de CNP se pueden administrar a una dosis de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 u 800 pg / kg, o aproximadamente 1 mg / kg, 1,25 mg / kg, 1,5 mg / kg, 2 mg / kg u otra dosis que el médico tratante considere apropiada.

Las variantes de CNP se pueden administrar en un solo tratamiento o en múltiples dosis. Las dosis múltiples se pueden administrar diariamente o en dosis múltiples durante el transcurso del tratamiento. Se contempla que la variante de CNP se pueda administrar, en una sola dosis o en múltiples dosis, diariamente, cada dos días, cada 3 días, ² veces por semana, 3 veces por semana, semanalmente, quincenalmente, cada 3 semanas, mensualmente, cada ⁶ semanas, cada 2 meses, cada 3 meses o según lo considere apropiado el médico tratante.

La administración de la variante de CNP puede ajustarse para permitir períodos de tratamiento preventivo o terapéutico seguidos de un período de recuperación. Por ejemplo, la variante de CNP se puede administrar por vía intraarticular de acuerdo con la invención, por vía subcutánea, intravenosa o por otro modo diariamente o varias veces por semana durante un período de tiempo, seguido de un período sin tratamiento, luego se repite el ciclo. El período inicial de tratamiento (p.

ej., administración de la variante de CNP diariamente o varias veces por semana) puede ser de 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, ⁶ semanas, 7 semanas, ⁸ semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas. El período sin tratamiento puede durar 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. El régimen de dosificación de la variante de CNP puede ser diario durante 3 días seguido de 3 días de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 1 semana seguida de 3 días o 1 semana de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante ² semanas seguidas de ¹ o ² semanas de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 3 semanas seguidas de 1, 2 o 3 semanas de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ , 9, 10, 11 o 12 semanas seguidas de 1, 2, 3 o 4 semanas de descanso.

Se describe un método para tratar la osteoartritis o un trastorno que tiene un síntoma asociado a la osteoartritis, que comprende administrar una variante de CNP a un sujeto y controlar el nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago en el sujeto (por ejemplo, en una muestra biológica del sujeto), donde un aumento o disminución en el nivel del biomarcador asociado al cartílago indica un efecto terapéutico de la variante de CNP en el sujeto. Cuando el nivel de un biomarcador aumenta en asociación con cartílago, cartílago calcificado o formación o crecimiento de hueso subcondral, un aumento en el nivel de ese biomarcador puede indicar un efecto terapéutico de la variante de CNP en el sujeto. Cuando el nivel de un biomarcador disminuye en asociación con cartílago, cartílago calcificado o formación o crecimiento de hueso subcondral, una disminución en el nivel de ese biomarcador puede indicar un efecto terapéutico de la variante de CNP en el sujeto.

El método terapéutico puede comprender además ajustar la cantidad (o dosis) o frecuencia de administración de la variante de CNP, donde:

la cantidad (o dosis) o frecuencia de administración de la variante de CNP aumenta si el nivel del al menos un biomarcador asociado al cartílago está por debajo del nivel objetivo, donde el nivel del biomarcador aumenta en asociación con la formación o crecimiento de cartílago; o

la cantidad (o dosis) o frecuencia de administración de la variante de CNP disminuye si el nivel del al menos un biomarcador asociado al cartílago está por encima de un nivel objetivo, donde el nivel del biomarcador aumenta en asociación con la formación o crecimiento de cartílago; o

la cantidad (o dosis) o frecuencia de administración de la variante de CNP aumenta si el nivel del al menos un biomarcador asociado al cartílago está por encima de un nivel objetivo, donde el nivel del biomarcador disminuye en asociación con la formación o crecimiento de cartílago; o

la cantidad (o dosis) o frecuencia de administración de la variante de CNP disminuye si el nivel del al menos un biomarcador asociado al cartílago está por debajo del nivel objetivo, donde el nivel del biomarcador disminuye en asociación con la formación o crecimiento de cartílago.

Se contempla que el nivel objetivo de un biomarcador se refiere al nivel o intervalo de niveles del biomarcador que está asociado con el efecto terapéutico en el sujeto y / o el efecto beneficioso para aliviar o mejorar los síntomas del trastorno o afección. Un nivel de un biomarcador por encima o por debajo de un nivel objetivo puede ser perjudicial para el sujeto.

Se describe un método para evaluar el efecto de la administración de una variante de CNP sobre la formación o crecimiento de cartílago, cartílago calcificado o de hueso subcondral. El método puede proporcionar el ensayo o la medición del nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago en un sujeto al que se le ha administrado una variante de CNP para evaluar el efecto de la variante de CNP sobre la formación y el crecimiento in vivo de cartílago, cartílago calcificado o hueso subcondral. Un aumento en el nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago puede indicar que la administración de una variante de CNP tiene un efecto positivo sobre el cartílago, cartílago calcificado o formación o crecimiento de hueso subcondral y es un tratamiento útil para la osteoartritis y otras enfermedades relacionadas con el cartílago o trastornos asociados con una disminución de la actividad del CNP. Los ejemplos de biomarcadores asociados al cartílago incluyen, pero no se limitan a, CNP (por ejemplo, nivel endógeno de CNP-22 o CNP-53), cGMP, propéptidos de colágeno tipo II y fragmentos del mismo, colágeno tipo II y fragmentos del mismo, sindecan-3, anexina V i, antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA por sus siglas en inglés), propéptidos de procolágeno tipo I (PINP) y fragmentos del mismo, colágeno tipo I y fragmentos del mismo, y condroitín sulfato de agrecano.

Se describe un método para evaluar el efecto de una variante de CNP en el nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago en un sujeto, que comprende analizar o medir el nivel del biomarcador asociado al cartílago en una muestra biológica de un sujeto al que se la ha administrado una variante de CNP. El método puede comprender además administrar la variante de CNP al sujeto antes de ensayar o medir el nivel del biomarcador asociado al cartílago.

En los métodos (p. ej., métodos terapéuticos, de diagnóstico y de ensayo) relacionados con biomarcadores asociados al cartílago, la variante de CNP puede ser Gly-CNP-37, también denominada Gly-CNP-37, o cualquiera de los péptidos y variantes de CNP de la presente, incluidas las variantes de CNP que se muestran en el presente documento. El péptido CNP o variante puede no ser CNP-22 o CNP-53. La variante CNP puede ser Pro-Gly-CNP-37.

Se describe el uso de cualquiera de las variantes de CNP anteriores en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis y los síntomas u otras manifestaciones fisiológicas aquí asociadas con la osteoartritis. También se describen jeringas, p. ej., jeringas precargadas o de un solo uso, recipientes sellados estériles, p. ej. viales, frascos, recipientes y / o kits o paquetes que comprenden cualquiera de los péptidos o polipéptidos anteriores, opcionalmente con instrucciones de uso adecuadas.

Se entiende que cada característica descrita en el presente documento es un ejemplo ilustrativo no limitativo de cualquiera de los aspectos del presente documento y, como tal, se pretende que sea combinable con cualquier otra característica descrita en el presente documento. Por ejemplo, cuando las características se describen con un lenguaje como "una realización", "ciertas realizaciones", "algunas realizaciones", "realización adicional", "realizaciones ejemplares específicas" y / u "otra realización", cada una de estas características puede combinarse con cualquier otra característica, o características, descritas en este documento sin tener que enumerar todas las combinaciones posibles. Cuando se describen ejemplos de valores que caen dentro de los intervalos, cualquiera de estos ejemplos se contempla como posibles puntos finales de un intervalo, se contemplan todos y cada uno de los valores numéricos entre dichos puntos finales, y se prevén todas y cada una de las combinaciones de puntos finales superiores e inferiores.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra que la administración de Gly-CNP-37 a dosis baja (35,5 pg) o alta (110 pg) mostró una reducción significativa en la degeneración del cartílago en la tibia. *ANOVA p<0,05 para el vehículo.

La Figura 2 muestra que la relación de profundidad mejoró en los grupos tratados con Gly-CNP-37. *p<0,05 ANOVA para el vehículo.

La Figura 3 es un gráfico que muestra que la anchura del cartílago afectado por cualquier degeneración mejoró en los grupos tratados con Gly-CNP-37. *p<0,05 ANOVA para el vehículo.

La Figura 4 ilustra que los animales tratados con Gly-CNP-37 exhibieron una mejora superior al 50% en la degeneración sustancial del cartílago tibial.

La Figura 5 muestra que Gly-CNP-37 a 110 pg redujo significativamente la puntuación total de la articulación (sin inclusión de fémur). *ANOVA p<0,05 para el vehículo.

La Figura 6 es un gráfico que representa la puntuación total de la articulación para los animales tratados con Gly-CNP-37 cuando la puntuación del fémur se incluye en el cálculo.

La Figura 7 es un gráfico que ilustra el espesor de la placa de crecimiento medial y lateral en animales de control tratados y no tratados con Gly-CNP-37. *ANOVA p<0,05 para el vehículo.

La Figura 8 es un gráfico que representa los datos de la Figura 7 en el que el grosor lateral se restó del medial para determinar la diferencia entre los dos. *ANOVA p<0,05 para el vehículo.

La Figura 9 representa la progresión de la puntuación de la marcha en ratas de control tratadas o no tratadas con Gly-CNP-37. *ANOVA p<0,05 para el vehículo.

La Figura 10 es un gráfico que representa el Área Bajo la Curva (AUC por sus siglas en inglés) de la puntuación de la marcha de la Figura 9. Todos los valores son ANOVA p<0,05 para el vehículo.

La Figura 11 muestra las mediciones de la anchura de degeneración del cartílago total para los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. *ANOVA p<0,05 para el vehículo.

La Figura 12 muestra las mediciones de la anchura de degeneración sustancial del cartílago para animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. fPrueba t p<0,05 para vehículo SC.

La Figura 13 muestra las Puntuaciones Medias de Osteofito Tibial Medial para animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. fp <0,05 prueba t para vehículo SC.

La Figura 14 muestra el espesor medio de la placa de crecimiento en micrómetros para animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. *ANOVA p<0,05 para el vehículo. fPrueba t p<0,05 para vehículo SC.

La Figura 15 muestra las puntuaciones totales medias de las articulaciones (menos el fémur) para los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. *ANOVA p<0,05 para el vehículo. fPrueba t p<0,05 para vehículo SC.

La Figura 16 muestra puntuaciones medias de sinovitis para animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. La Figura 17 muestra el cambio medio en el peso corporal de los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. *ANOVA p<0,05 para el vehículo.

La Figura 18 muestra puntuaciones medias de la marcha para animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. Los valores son prueba t p<0,05 para vehículo SC.

La Figura 19 muestra un curso de tiempo para la concentración plasmática promedio de Pro-Gly-CNP-37 en animales después de la administración de Pro-Gly-CNP-37 por vía intraarticular o subcutánea para cada grupo de estudio. Para cada línea, el número de grupo de estudio correspondiente se presenta inmediatamente encima de la línea de datos correspondiente.

La Figura 20 muestra el ancho total medio de degeneración del cartílago tibial para animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (tanto intraarticularmente ("IA") como subcutáneamente ("SC")) en un modelo de osteoartritis en etapa tardía (la administración del tratamiento comienza veintiuno días después de la cirugía, datos recopilados en el día cuarenta). La Figura 21 muestra el ancho de degeneración sustancial del cartílago tibial medio para animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (tanto intraarticularmente ("IA") como subcutáneamente ("SC")) en un modelo de osteoartritis en etapa tardía (la administración del tratamiento comienza veintiuno días después de la cirugía, datos recopilados en el día cuarenta). La Figura 22 muestra las puntuaciones medias de degeneración del cartílago tibial para cada una de las tres zonas y el total de los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (tanto intraarticularmente ("IA") como subcutáneamente ("SC")) en un modelo de osteoartritis en etapa tardía (la administración del tratamiento comienza veintiún días después de la cirugía). *Prueba de K-W p<0,05 (post-hoc de Dunn) vs. control de vehículo IA o SC respectivo (día 40). fPrueba de M-W p<0,05 vs. vehículo IA (día 40). fPrueba de M-W p<0,05 vs. vehículo SC (día 40).

La Figura 23 muestra las puntuaciones medias de profundidad de degeneración del cartílago tibial para cada una de las tres zonas y la media para los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (tanto intraarticularmente ("IA") como subcutáneamente ("SC")) en una etapa tardía del modelo de osteoartritis (la administración del tratamiento comienza veintiún días después de la cirugía). *Prueba de K-W p <0,05 (post-hoc de Dunn) vs. control de vehículo IA o SC respectivo (día 40). fPrueba de M-W p<0,05 vs. vehículo IA (día 40). $ p<0,05 prueba de M-W vs. vehículo SC (día 40).

La Figura 24 muestra la puntuación total de la articulación con el fémur para cada una de las tres zonas y la media para los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (tanto intraarticularmente ("IA') como subcutáneamente ("SC")) en una etapa tardía del modelo de osteoartritis (la administración del tratamiento comienza veintiún días después de la cirugía). fPrueba de M-W p<0,05 vs. vehículo IA (día 40). $ p<0,05 prueba de M-W vs. vehículo SC (día 40).

La Figura 25 muestra la puntuación total de la articulación sin el fémur para cada una de las tres zonas y la media para los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (tanto intraarticularmente ("lA") como subcutáneamente ("SC")) en una etapa tardía del modelo de osteoartritis (la administración del tratamiento comienza veintiún días después de la cirugía). fPrueba de M-W p<0,05 vs. vehículo IA (día 40). $ p<0,05 prueba de M-W vs. vehículo SC (día 40).

La Figura 26 muestra la puntuación de osteofitos para animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (tanto intraarticularmente ("IA") como subcutáneamente ("SC")) en una etapa tardía del modelo de osteoartritis (la administración del tratamiento comienza veintiuno días después de la cirugía, datos recopilados en el día cuarenta).

La Figura 27 muestra el cambio en el peso corporal de los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (tanto intraarticularmente ("IA") como subcutáneamente ("SC")) en una etapa tardía del modelo de osteoartritis (la administración del tratamiento comienza veintiún días después cirugía). *Prueba de K-W p <0,05 (post-hoc de Dunn) vs. control de vehículo IA o SC respectivo (día 40). fPrueba de M-W p<0,05 vs. vehículo IA (día 40).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere en general a variantes de CNP para usarse en métodos para tratar la osteoartritis, uno o más síntomas de la osteoartritis y otros trastornos que tienen un síntoma o componente asociado a la osteoartritis. Específicamente, la presente invención se refiere a una variante de CNP seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOs.: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse en un método de i) tratar la osteoartritis; ii) aumentar el crecimiento del cartílago en un sujeto con osteoartritis; iii) ralentizar la degeneración del cartílago; iv) mejorar un síntoma de osteoartritis; v) aumentar las habilidades motoras o la movilidad en un paciente con osteoartritis; vi) inhibir la degeneración de la movilidad en un paciente con osteoartritis; vii) aumentar el rango de movimiento en una articulación afectada de un sujeto que padece osteoartritis; viii) disminuir la rigidez en una articulación afectada de un sujeto que padece osteoartritis; ix) disminuir la inflamación sinovial en un sujeto; o x) prevenir la aparición de osteoartritis, en un sujeto que lo necesite, donde la variante de CNP se administra por vía intraarticular.

Definiciones

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos utilizados en esta solicitud, incluidas la memoria descriptiva y las reivindicaciones, tienen las definiciones que se dan a continuación.

El término "alrededor de" o "aproximadamente" significa un de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor. El término "alrededor de" o "aproximadamente" puede significar entre 1, 2, 3 o 4 desviaciones estándar. El término "alrededor de" o "aproximadamente" puede significar dentro del 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, ⁸ %, 7%, ⁶ %, 5%, 4%, 3%, 2% , 1%, 0,5% o 0,05% de un valor o intervalo dado. Siempre que el término "alrededor de" o "aproximadamente" preceda al primer valor numérico de una serie de dos o más valores numéricos, se entiende que el término "alrededor de" o "aproximadamente" se aplica a cada uno de los valores numéricos de esa serie.

La definición de términos de química estándar se puede encontrar en trabajos de referencia, incluidos Carey y Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition, Vols. A y B (Plenum Press, Nueva York 1992). La práctica puede emplear, a menos que se indique lo contrario, ciertos métodos convencionales de química orgánica sintética, espectrometría de masas, cromatografía preparativa y analítica, química de proteínas, bioquímica, tecnología de ADN recombinante y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. Ver, p.ej, T.E. Creighton, Proteínas: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); Alabama Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4a edición, 2004); Sambrook, et al., Clonación molecular: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edición (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990).

"Polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero compuesto de residuos de aminoácidos, variantes estructurales de origen natural relacionadas y análogos sintéticos de origen no natural de los mismos, ligados vía enlaces peptídicos o isósteros de enlaces peptídicos. Los polipéptidos sintéticos se pueden sintetizar, por ejemplo, usando un sintetizador de polipéptidos automático. Los términos "polipéptido" y "proteína" no se limitan a una longitud mínima del producto.

La notación convencional se usa en este documento para representar secuencias de polipéptidos: el extremo izquierdo de una secuencia de polipéptidos es el amino terminal; el extremo derecho de una secuencia polipeptídica es el carboxilo terminal.

"Sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido en un polipéptido por un aminoácido natural o no natural funcional, estructural o químicamente similar. Los siguientes grupos pueden contener cada uno aminoácidos naturales que son sustituciones conservadoras entre sí:

Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

asparagina (N), Glutamina (Q);

Arginina (R), Lisina (K);

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Los siguientes grupos pueden contener cada uno aminoácidos naturales que son sustituciones conservadoras entre sí: Glicina (G), Alanina (a );

Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

Asparagina (N), Glutamina (Q);

Arginina (R), Lisina (K);

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V), Alanina (A);

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); y

Serina (S), Treonina (T), Cisteína (C).

Los aminoácidos pueden agruparse como se indica a continuación.

hidrofóbico: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp;

hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

ácido: Asp, Glu;

básico: His, Lys, Arg;

residuos que influyen en la orientación de la columna vertebral: Gly, Pro; y

aromático: Trp, Tyr, Phe, His.

Las variantes de CNP de la presente pueden generarse por medios recombinantes, usando un polinucleótido que codifica una variante de CNP. Las variantes de CNP expresadas por tales polinucleótidos pueden producirse mediante métodos que incluyen el crecimiento de células hospedadoras en medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido que codifica una variante de CNP y el aislamiento del producto de expresión de las células hospedadoras o el medio de cultivo. Los productos de expresión actuales pueden variar ligeramente del producto proteico codificado dependiendo de cualquier procesamiento postraduccional.

"Polinucleótido" se refiere a un polímero compuesto por unidades de nucleótidos. Los polinucleótidos incluyen biopolímeros de origen natural (con respecto al tipo molecular pero no necesariamente a la secuencia del biopolímero), tales como ácido desoxirribonucleico ("ADN") y ácido ribonucleico ("ARN") así como análogos de ácido nucleico. "ADNc" se refiere a un ADN que es complementario o idéntico a un ARNm, en ya sea forma monocatenaria o bicatenaria.

"Secuencia de control de la expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos que regula la expresión de una secuencia de nucleótidos unida operativamente a la misma. "Unido operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos partes en la cual la actividad de una parte (por ejemplo, la capacidad de regular la transcripción) da como resultado una acción en la otra parte (por ejemplo, la transcripción de la secuencia). Las secuencias de control de expresión pueden incluir, por ejemplo y sin limitación, secuencias de promotores (por ejemplo, inducibles o constitutivos), 3'UTRs, potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (es decir, ATG), señales de corte y empalme para intrones y codones de parada.

"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene secuencias que no están unidas entre sí de forma natural. Puede incluirse un polinucleótido recombinante ensamblado o amplificado en un vector adecuado, y el vector puede usarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula huésped que comprende el polinucleótido recombinante se denomina "célula huésped recombinante". Luego, el gen se expresa en la célula huésped recombinante para producir, p.ej, un "polipéptido recombinante". Un polinucleótido recombinante también puede cumplir una función no codificante (p. ej., promotor, origen de replicación, sitio de unión al ribosoma, etc.).

"Quimera", como se usa en este documento, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que comprende al menos dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos heterólogos (es decir, derivadas de diferentes fuentes o no asociadas entre sí como una secuencia de origen natural) que están directa o indirectamente unidas o unidas entre sí usando técnicas comúnmente conocidas en la técnica, por ejemplo, expresión recombinante o reticulación química. La secuencia heteróloga puede comprender una proteína o péptido unido directa o indirectamente a una variante de CNP, incluidas proteínas o péptidos que se pueden escindir de la variante de CNP. Las variantes de CNP pueden ser quimeras como se describe en este documento.

Las quimeras pueden incluir proteínas de fusión de CNP que comprenden una proteína portadora o una etiqueta peptídica escindibles. El término "proteína portadora escindible" o "etiqueta peptídica escindible" se refiere a una secuencia de péptido o polipéptido que puede fusionarse, directa o indirectamente a través de un enlazador, a una secuencia polipeptídica heteróloga, y se puede eliminar de la secuencia heteróloga usando un agente que escinde o separa el péptido o polipéptido escindible del polipéptido o proteína heterólogo. La proteína portadora escindible o la etiqueta peptídica pueden mejorar la generación, purificación y / o detección de la proteína de fusión o el polipéptido heterólogo. Las proteínas portadoras escindibles y las etiquetas peptídicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, factor de transcripción humano TAF12 (TAF12), isomerasa cetoesteroide (KSI), proteína de unión a maltosa (MBP por sus siglas en inglés), p-galactosidasa (p-Gal), glutatión-S- transferasa (GST por sus siglas en inglés), tiorredoxina (Trx), dominio de unión a quitina (CBD por sus siglas en inglés), mutación de BMP-2 (BMPM por sus siglas en inglés), SUMO, CAT, TrpE, proteína A estafilocócica, proteínas estreptocócicas, proteína de unión a almidón, dominio de unión a celulosa de endoglucanasa A, dominio de unión a celulosa de exoglucanasa Cex, dominio de unión a biotina, recA, FLAG®, c-Myc, poli(His), poli(Arg), poli(Asp), poli(Gln), poli(Phe), poli(Cys), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente cian, biotina, avidina, estreptavidina, epítopos de anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Por "rango de movimiento" se entiende el potencial de movimiento completo de una articulación, típicamente su rango de flexión y / o extensión. El rango de movimiento se mide típicamente con un goniómetro y se presenta en grados de arco. Se puede utilizar cualquier método de medición conocido por los expertos en la técnica para medir el rango de movimiento de la articulación de un sujeto. Un método ilustrativo para medir el rango de movimiento de una articulación lo proporcionan, por ejemplo, Norkin, C.C. y White D.J., Measurement of joint motion: a guide to goniometry (F.A. Davis Company, 2a ed. Filadelfia) (1995).

Por "rigidez articular" se entiende la sensación de dificultad para mover una articulación o la aparente pérdida del rango de movimiento de una articulación.

Un "agente de escisión" es un agente que es útil para escindir o separar, por ejemplo, un péptido o polipéptido escindible de un polipéptido o proteína heterólogo. Los agentes de escisión incluyen, pero no se limitan a, paladio, bromuro de cianógeno (CNBr), ácido fórmico, hidroxilamina, clostripaína, trombina, quimotripsina, tripsina, proteasas similares a tripsina, carboxipeptidasa, enteroquinasa (enteropeptidasa), proteasa Kex 2, proteasa Omp T , Proteasa del Factor Xa, subtilisina, proTEV, proteasa SUMO, proteasa V⁸ , proteasa de VIH, proteasa de rinovirus, proteasa de furilisina, proteasas de IgA, proteasa de Pace humana, colagenasa, proteasa de Nia, proteasa de poliovirus 2Apro, proteasa de poliovirus 3C, genenasa, furina, elastasa, Proteinasa K, pepsina, renina (quimosina), proteasas aspárticas microbianas, papaína, calpaína, quimopapaína, ficina (ficaína), bromelina (bromelasa), catespisina B, caspasas, termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, calicreína y plasmina.

Los términos "idéntico" y porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una máxima correspondencia.

La frase "sustancialmente homóloga" o "sustancialmente idéntica", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, generalmente se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad de residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se alinea globalmente.

La alineación global de secuencias para la comparación se realiza utilizando el programa EMBOSS Needle (p. ej., según lo implementado por EMBL-EBI a través de la interfaz web) utilizando parámetros predeterminados (para proteína: matriz = BLOSUM62, Gap abierto = 10, gap extendido = 0,5, formato de salida = par, penalización del gap extremo = falso, extremo de gap abierto = 10, extremo de gap extendido = 0,5; para nucleótidos, matriz = ADN completo, gap abierto = 10, gap extendido = 0,5, formato de salida = par, penalización de gap extremo = gp abierto extremo = 10, extremo de gap extendido = 0,5)

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente homólogas o idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo de forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe en el presente documento.

"Sustancialmente pura" o "aislada" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar, más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50% (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. La especie de interés puede comprender al menos aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de las especies macromoleculares presentes en la composición sobre una base molar o ponderal. La especie objeto se purifica hasta "homogeneidad esencial" si las especies macromoleculares contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales. Especies solventes, moléculas pequeñas (<500 Daltons), estabilizadores (p.ej, BSA) y las especies de iones elementales no se consideran especies macromoleculares para los fines de esta definición. Los compuestos pueden ser sustancialmente puros o aislados. Los compuestos pueden ser sustancialmente puros o aislados con respecto a los materiales de partida macromoleculares usados en su producción. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una variante de CNP sustancialmente pura o aislada mezclada con uno o más excipientes, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, con otro agente biológicamente activo.

"Tipo salvaje" (wt ) es un término que se refiere a la forma natural, incluida la secuencia, de un polinucleótido, polipéptido o proteína en una especie. Una forma de tipo salvaje se distingue de una forma mutante de un polinucleótido, polipéptido o proteína que surge de una mutación(es) genética.

Un primer polipéptido que es un "análogo" o "variante" o "derivado" de un segundo polipéptido puede ser un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 50%, 60% o 70% de identidad de secuencia, pero menos del 100% de identidad de secuencia, con el segundo polipéptido. Dichos análogos, variantes o derivados pueden estar compuestos de residuos de aminoácidos de origen no natural, que incluyen, sin limitación, homoarginina, ornitina, penicilamina y norvalina, así como residuos de aminoácidos de origen natural. Dichos análogos, variantes o derivados también pueden estar compuestos por uno o una pluralidad de residuos de D-aminoácidos, y también pueden contener peptidomiméticos o isósteros de enlaces peptídicos tales como enlaces no peptídicos entre dos o más residuos de aminoácidos o peptidomiméticos. Un primer polipéptido puede ser un "análogo", "variante" o "derivado" de un segundo polipéptido si el primer polipéptido no es un producto de escisión conocido del segundo polipéptido o no es un precursor conocido del segundo polipéptido, incluso si el primer polipéptido tiene una identidad de secuencia del 100% con el segundo polipéptido o tiene una secuencia de tipo salvaje.

El término "derivado de" como se usa en este documento puede referirse a una secuencia de polipéptido o péptido que se basa en una secuencia de polipéptido o péptido de tipo salvaje o natural y puede tener una o más deleciones, adiciones y / o sustituciones con aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales o peptidomiméticos. La secuencia derivada puede compartir al menos aproximadamente el 40%, 50%, 60% o 70%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de tipo salvaje o natural. El derivado puede ser un fragmento de un polipéptido, donde el fragmento es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntico) al polipéptido de tipo salvaje sobre un longitud de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos. Un polipéptido puede "derivarse de" un polipéptido de tipo salvaje si tiene un resto (por ejemplo, un polímero como, por ejemplo, PEG) unido directa o indirectamente a él que no está presente en el polipéptido de tipo salvaje, incluso si ambos los polipéptidos comparten el 100% de identidad en su secuencia de aminoácidos.

El polipéptido precursor del péptido natriurético C (NPPC por sus siglas en inglés) es un pre-pro polipéptido monocatenario de ¹²⁶ aminoácidos y, como se describe a continuación, después del procesamiento da como resultado en última instancia CNP-22 de tipo salvaje (wtCNP-22). La eliminación del péptido señal de NPPC produce pro-CNP, y la escisión adicional por la endoproteasa furina genera un péptido activo de 53 aminoácidos (CNP-53), que se secreta y se escinde nuevamente para producir el péptido maduro de 22 aminoácidos (CNP o CNP-22). Una "variante de CNP" puede ser al menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntica al NPPC de tipo salvaje sobre el mismo número de residuos de aminoácidos.

El término "cantidad eficaz" significa una dosis suficiente para producir un resultado deseado en una condición de salud, patología o enfermedad de un sujeto o con un propósito de diagnóstico. El resultado deseado puede comprender una mejora subjetiva u objetiva en el receptor de la dosis. "Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente eficaz para producir el efecto beneficioso pretendido sobre la salud. Se entenderá que el nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente particular pueden variar y dependerán de una variedad de factores, incluida la actividad del compuesto específico empleado; la biodisponibilidad, estabilidad metabólica, velocidad de excreción y duración de la acción de ese compuesto; el modo y el momento de administración del compuesto; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; y la gravedad de la afección particular.

"Tratamiento" se refiere a tratamiento profiláctico o tratamiento terapéutico o tratamiento de diagnóstico. "Tratamiento" puede referirse a la administración de un compuesto o composición a un sujeto con fines terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico.

Un tratamiento "profiláctico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no exhibe signos de una enfermedad o exhibe solo signos tempranos de la enfermedad, con el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar la patología. Los compuestos o composiciones pueden administrarse como tratamiento profiláctico para reducir la probabilidad de desarrollar una patología o para minimizar la gravedad de la patología, si se desarrolla.

Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos o síntomas de patología con el fin de disminuir o eliminar esos signos o síntomas. Los signos o síntomas pueden ser bioquímicos, celulares, histológicos, funcionales o físicos, subjetivos u objetivos. Los compuestos también pueden administrarse como tratamiento terapéutico o para diagnóstico.

"Diagnóstico" significa identificar la presencia, extensión y / o naturaleza de una condición patológica. Los métodos de diagnóstico difieren en su especificidad y selectividad. Si bien es posible que un método de diagnóstico en particular no proporcione un diagnóstico definitivo de una afección, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayude en el diagnóstico. Un tratamiento de diagnóstico consiste en administrar un compuesto para ayudar a diagnosticar a un sujeto.

"Biomarcador asociado al cartílago" o "marcador asociado al cartílago" se refiere a un factor de crecimiento, enzima, proteína, ácido nucleico u otra sustancia o fracción biológica detectable cuyo nivel aumenta o disminuye en asociación con, por ejemplo, renovación del cartílago, formación de cartílago y / o crecimiento de cartílago. Dichos biomarcadores se pueden medir antes, durante y / o después de la administración de una variante de CNP. Los ejemplos de biomarcadores asociados al cartílago incluyen, pero no se limitan a, CNP, cGMP, propéptidos de colágeno tipo II y fragmentos del mismo, colágeno tipo II y fragmentos del mismo, propéptidos del colágeno tipo I y fragmentos del mismo, colágeno tipo I y fragmentos del mismo, en proliferación antígeno nuclear celular (PCNA por sus siglas en inglés), condroitín sulfato de agrecano, sindecan-3 y anexina VI. Los biomarcadores asociados al cartílago se pueden medir en cualquier muestra biológica apropiada, incluidos, pero no limitados a, tejidos, sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial y orina. Los biomarcadores pueden medirse en sangre, plasma o suero de animales sometidos a estudios de eficacia / farmacodinámica in vivo y / o de medios condicionados de los estudios ex vivo.

Se puede medir el nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago y se puede ajustar la cantidad o frecuencia de administración de la variante de CNP administrada a un sujeto de acuerdo con el nivel del biomarcador medido. El nivel de biomarcador puede estar "por debajo de un nivel objetivo" o "por encima de un nivel objetivo". Un nivel objetivo de un biomarcador es un nivel o rango de niveles del biomarcador en el que se observa un efecto terapéutico en el sujeto que recibe la variante de CNP. El nivel objetivo de un biomarcador para un sujeto que tiene osteoartritis puede ser el nivel o rango de niveles del biomarcador observado en un sujeto normal no afectado. Para indicar un efecto terapéutico, el nivel objetivo de un biomarcador puede no necesitar ser equivalente al nivel o rango de niveles del biomarcador observado en un sujeto normal, pero puede estar dentro de, por ejemplo, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% del nivel "normal" o rango de niveles del biomarcador observado en un sujeto no afectado.

Por ejemplo, si el nivel de un biomarcador aumenta en asociación con la formación o el crecimiento del cartílago, el nivel objetivo del biomarcador que indica un efecto terapéutico puede ser más alto que el nivel del biomarcador en pacientes que padecen osteoartritis a los que no se les ha administrado una variante de CNP y, opcionalmente, puede ser inferior al nivel o niveles "normales", aproximadamente al nivel o niveles "normales", o por encima del nivel o niveles "normales" del biomarcador en sujetos que no padecen ese trastorno. Si el nivel de un biomarcador está por debajo de un nivel objetivo, puede indicar un efecto terapéutico inadecuado, que puede requerir un aumento en la cantidad o frecuencia de administración de la variante de CNP administrada. Si el biomarcador está por encima de un nivel objetivo, puede indicar que se ha administrado más variante de CNP de la necesaria, lo que puede requerir una disminución en la cantidad o frecuencia de administración de la variante de CNP administrada.

Como otro ejemplo, si el nivel de un biomarcador disminuye en asociación con la formación o el crecimiento del cartílago, el nivel objetivo del biomarcador que indica un efecto terapéutico puede ser más bajo que el nivel del biomarcador en pacientes que padecen osteoartritis a los que no se les ha administrado una variante de CNP y, opcionalmente, puede ser mayor al nivel o niveles "normales", aproximadamente al nivel o niveles "normales", o por debajo del nivel o niveles "normales" del biomarcador en sujetos que no padecen ese trastorno. En tal caso, puede aplicarse lo contrario de los ajustes anteriores en la cantidad de variante de CNP y la frecuencia de administración.

"Composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico en un animal sujeto, incluidos humanos y mamíferos. Una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una variante de CNP, opcionalmente otro agente biológicamente activo y opcionalmente un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica puede abarcar una composición que comprende el ingrediente(s) activo, y el ingrediente(s) inerte que forman el vehículo, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación, complejación o agregación de dos o más más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas abarcan cualquier composición preparada mezclando un compuesto y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

"Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehículos, tampones y similares farmacéuticos estándar, como una solución salina tamponada con fosfato, una solución acuosa al 5% de dextrosa y emulsiones (por ejemplo, una emulsión de aceite / agua o agua / aceite). Los ejemplos no limitantes de excipientes incluyen adyuvantes, aglutinantes, cargas, diluyentes, desintegrantes, agentes emulsionantes, agentes humectantes, lubricantes, deslizantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y agentes colorantes. Los vehículos, excipientes y diluyentes farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Los vehículos farmacéuticos preferidos dependen del modo de administración pretendido del agente activo. Los modos de administración típicos incluyen enteral (p.ej, oral) o parenteral (p.ej, inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal; o administración tópica, transdérmica o transmucosa).

Una "sal farmacéuticamente aceptable" es una sal que se puede formular en un compuesto para uso farmacéutico, incluidas, pero no limitadas a, sales metálicas (por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.) y sales de amoniaco o aminas orgánicas.

Por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un individuo sin causar ningún efecto biológico indeseable o sin interactuar de una manera perjudicial con ninguno de los componentes de la composición en la que está contenido o con cualquier componente presente sobre o en el cuerpo del individuo.

El término "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de un compuesto calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, opcionalmente en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, diluyente, portador o vehículo. Las especificaciones para las nuevas formas de dosificación unitaria dependen del compuesto particular empleado y el efecto a lograr, y la farmacodinámica asociada con cada compuesto en el huésped.

"Condiciones fisiológicas" se refiere a condiciones en el cuerpo de un animal (por ejemplo, un ser humano). Las condiciones fisiológicas incluyen, pero no se limitan a, la temperatura corporal y un entorno acuoso de fuerza iónica fisiológica, pH y enzimas.

Como se usa en este documento, el término "sujeto" abarca seres humanos y mamíferos no humanos y no mamíferos en la medida en que las composiciones de este documento sean útiles cuando se administran a tales especies no humanas. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, cualquier miembro de la clase de mamíferos: humanos, primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja como ganado, caballos, ovejas, cabras, cerdos; animales domésticos como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores, tales como ratas, ratones y cobayas, y similares. Los ejemplos de no mamíferos incluyen, pero no se limitan a, vertebrados como aves y peces. El término no denota una edad o género en particular.

Los términos "polietilenglicol", "PEG", "óxido de polietileno" y "PEO" se usan indistintamente en el presente documento a menos que se indique lo contrario. Una variante de CNP conjugada a través de un grupo amino a un polímero "PEOn" asociado con el número n, en general tiene la fórmula: CH³- [- O-CH²CH²-]n-C (= O) -NHR, donde n es el número de unidades de óxido de etileno y R denota el resto del péptido. El polímero "PEOn" puede tener opcionalmente un grupo alquileno, (CH²)m, donde m es un número entero de 1 a 5, entre el carbono carbonilo y las unidades repetidas de óxido de etileno. Dicho polímero "PEOn" (por ejemplo, PEO12 o PEO24) está monodisperso, es decir, es un único polímero discreto de un peso molecular particular. De manera similar, una variante de CNP conjugada a través de un grupo amino a un polímero "PEGnK" asociado con el número nK, en general tiene la fórmula: CH³- [- O-CH²CH²-]p-C (= O) -NHR, donde p es un número entero mayor que 1. El polímero "PEGnK" también puede tener opcionalmente un grupo alquileno, (CH²)m, donde m es un número entero de 1 a 5, entre el carbono carbonilo y las unidades repetidas de óxido de etileno. Sin embargo, dicho polímero "PEGnK" (p. ej., PEG1K, PEG2K, PEG5K o PEG20K) está polidispersado, es decir, contiene una mezcla de polímeros que tienen una distribución de pesos moleculares, donde el número nK indica el peso molecular promedio en número de polímero (Mn) en kilo Daltons. Por ejemplo, "PEG2K" conjugado con una variante de CNP indica un polímero de PEG polidispersado que tiene un peso molecular promedio en número de polímero de alrededor de 2 kDa.

Cuando se da un rango de la masa de un polímero (p. ej., PEG) (p. ej., En unidades de kDa), el rango se refiere a un rango de pesos moleculares promedio en número de polímeros, no a un rango de pesos moleculares de múltiples polímeros en una mezcla polidispersa, a menos que se indique expresamente lo contrario.

El término "halógeno", "haluro" o "halo" se refiere a flúor, cloro, bromo y / o yodo.

El término "alquilo" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente saturado lineal o ramificado, donde el alquilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes Q como se describe en el presente documento. El alquilo es un radical hidrocarburo monovalente saturado lineal que tiene de 1 a 20 (C^1-20), 1 a 15 (C^1-15), 1 a 12 (C^1-12), 1 a 10 (C¹-¹⁰), o de 1 a 6 (C^1-6) átomos de carbono, o un radical hidrocarburo monovalente saturado ramificado de 3 a 20 (C^3-20), De 3 a 15 (C^3-15), De 3 a 12 (C^3-12), De 3 a 10 (C^3-10), o de 3 a 6 (C^3-6) átomos de carbón. Como se usa en este documento, los grupos alquilo lineales C^1-6 y ramificados C^3-6 también se denominan "alquilo inferior". Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo (incluidas todas las formas isoméricas, incluidas n-propilo e isopropilo), butilo (incluidas todas las formas isoméricas, incluidas n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo), pentilo (incluidas todas las formas isoméricas) y hexilo (incluidas todas las formas isoméricas). Por ejemplo, C^1-6 alquilo se refiere a un radical hidrocarburo monovalente saturado lineal de 1 a 6 átomos de carbono o un radical hidrocarburo monovalente saturado ramificado de 3 a 6 átomos de carbono.

El término "alcoxi" se refiere a un grupo -O-alquilo. Un grupo alcoxi puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes Q como se describe en el presente documento.

El término "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo que está sustituido con uno o más átomos de haluro. Un grupo haloalquilo puede estar sustituido con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis átomos de haluro. Un grupo haloalquilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes Q adicionales como se describe en el presente documento.

El término "cicloalquilo" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente cíclico saturado con puente y / o sin puente, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes Q como se describe en el presente documento. El cicloalquilo puede tener de 3 a 20 (C^3-20), de 3 a 15 (C^3-15), de 3 a 12 (C^3-12), de 3 a 10 (C^3-10), o de 3 a 7 (C^3-7) átomos de carbón. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, decalinilo y adamantilo.

El término "heterociclilo" o "heterocíclico" se refiere a un sistema de anillo no aromático monocíclico o un sistema de anillo multicíclico que contiene al menos un anillo no aromático, donde uno o más de los átomos del anillo no aromático son heteroátomos seleccionados independientemente de O , S o N, y los restantes átomos del anillo no aromático son átomos de carbono. El grupo heterociclilo o heterocíclico puede tener de 3 a 20, de 3 a 15, de 3 a 10, de 3 a 8, de 4 a 7 o de 5 a 6 átomos en el anillo. El heterociclilo puede ser un sistema de anillo monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir un sistema de anillo condensado o puenteado, y en el que los átomos de nitrógeno o azufre pueden oxidarse opcionalmente, los átomos de nitrógeno pueden estar opcionalmente cuaternizados y algunos anillos puede ser parcial o totalmente saturados o aromáticos. El heterociclilo puede estar unido a la estructura principal en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado la creación de un compuesto estable. Los ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen, pero no se limitan a, acridinilo, azepinilo, bencimidazolilo, bencindolilo, benzoisoxazolilo, benzoisoxazinilo, benzodioxanilo, benzodioxolilo, benzofuranonilo, benzofuranilo, benzonaftofuranilo, benzopiranonilo, benzopiranilo, benzotetrahidrofuranilo, benzotetrahidrotienilo, benzotiadiazolilo, benzotiazolilo, benzotiofenilo, benzotriazolilo, benzotiopiranilo, benzoxazinilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, p-carbolinilo, carbazolilo, cromanilo, cromonilo, cinnolinilo, coumarinilo, decahidroisoquinolinilo, dibenzofuranilo, dihidrobenzisotiazinilo, dihidrobenzisoxazinilo, dihidrofurilo, dihidropiranilo, dioxolanilo, dihidropirazinilo, dihidropiridinilo, dihidropirazolilo, dihidropirimidinilo, dihidropirrolilo, dioxolanilo, 1,4-ditianilo, furanonilo, furanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, imidazopiridinilo, imidazotiazolilo, indazolilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, isobenzotetrahidrofuranilo, isobenzotetrahidrotienilo, isobenzotinienilo, isocromanilo, isocoumarinilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolidinilo, isotiazolilo, isoxazolidinilo, isoxazolilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo, oxadiazolilo, oxazolidinonilo, oxazolidinilo, oxazolopiridinilo, oxazolilo, oxiranilo, perimidinilo, fenantridinilo, fenatrolinilo, fenarsazinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pteridinilo, purinilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridinilo, piridopiridinilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, quinoxalinilio, quinuclidinilo, tetrahidrofu rilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotienilo, tetrazolilo, tiadiazolopirimidinilo, tiadiazolilo, tiamorfolinilo, tiazolidinilo, tiazolilo, tienilo, triazinilo, triazolilo y 1,3,5-tritianilo. Un grupo heterocíclico puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes Q como se describe en el presente documento.

El término "arilo" se refiere a un grupo aromático monocíclico o un grupo aromático monovalente multicíclico que contiene al menos un anillo de hidrocarburo aromático. El arilo puede tener de 6 a 20 (C^6-20), de 6 a 15 (C^6-15), o de 6 a 10 (C^6-10) átomos del anillo. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, fluorenilo, azulenilo, antrilo, fenantrilo, pirenilo, bifenilo y terfenilo. Arilo también se refiere a anillos de carbono bicíclicos o tricíclicos, donde al menos uno de los anillos es aromático y los otros pueden estar saturados, parcialmente insaturados o aromáticos, por ejemplo, dihidronaftilo, indenilo, indanilo y tetrahidronaftilo (tetralinilo). Un grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes Q como se describe en el presente documento.

El término "heteroarilo" se refiere a un grupo aromático monocíclico o un grupo aromático multicíclico que contiene al menos un anillo aromático, donde al menos un anillo aromático contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S y N. Cada anillo de un grupo heteroarilo puede contener uno o dos átomos de O, uno o dos átomos de S y / o de uno a cuatro átomos de N, siempre que el número total de heteroátomos en cada anillo sea cuatro o menos y cada anillo contenga al menos un átomo de carbono. El heteroarilo puede estar unido a la estructura principal en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado la creación de un compuesto estable. El heteroarilo puede tener de 5 a 20, de 5 a 15 o de 5 a 10 átomos en el anillo. Los ejemplos de grupos heteroarilo monocíclicos incluyen, pero no se limitan a, pirrolilo, pirazolilo, pirazolinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, isotiazolilo, furanilo, tienilo, oxadiazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, y triazinilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, indolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzotienilo, quinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzopiranilo, indolizinilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo, cromonilo, cumarinilo, cinolinilo, quinoxalinilo, indazolilo, purinilo, pirrolopiridinilo, furopiridinilo, tienopiridinilo, dihidroisoindolilo y tetrahidroquinolinilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo tricíclicos incluyen, pero no se limitan a, carbazolilo, bencindolilo, fenantrolinilo, acridinilo, fenantridinilo y xantenilo. Un grupo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes Q como se describe en el presente documento.

El término "opcionalmente sustituido" significa que un grupo, que incluye alquilo, alcoxi, haloalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo, puede estar sustituido con uno o más sustituyentes Q (como uno, dos, tres o cuatro sustituyentes Q ), donde cada Q se selecciona independientemente del grupo formado por ciano, halo, oxo, nitro, C ^1-6 alquilo, C^1-6 alcoxi, halo-C^1-6 alquilo, C^3-7 cicloalquilo, heterociclilo, C^6-14 arilo, heteroarilo, -C(O)Re, -C(O)ORe, -C (O) NRfRg, -C (NRe) NRfRg, -ORe, -OC (O) Re, -OC(O)ORe, -OC (O) NRfRg, - OC (=NRe) NRfRg, -OS (O) Re, -OS (O)2Re, -OS (O) NRfRg, -OS(O)²NRfRg, -NRfRg, - NReC (O) Rf, -NReC (O) Of, -NReC (O) NRfRg, -NReC (=NRh) NRfRg, -NReS (O) Rf, -NReS(O)²Rf, -NReS (O) NRfRg, -NReS(O)²NRfRg, -SRe, -S (O) Re, -S(O)²Re, y S(O)²NRfRg, donde cada Re, Rf, Rg y Rh es independientemente hidrógeno, C^1-6 alquilo, C^3-7 cicloalquilo, heterociclilo, C^6-14 arilo o heteroarilo; o Rf y Rg, junto con el átomo de N al que están unidos, forman heterociclilo.

B. Variantes de CNP

El uso de CNP22 como terapéutico está limitado por su corta vida media en plasma (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428­ 35 (1994)). En el plasma humano, la concentración de CNP22 suele ser inferior a cinco picomolar. CNP22 es degradado y eliminado de la circulación por NEP y NPR-C en humanos (Growth Hormone & IGF Res., 16: S6-S14). En todos los estudios en humanos y animales que utilizaron CNP22 administrado por vía sistémica, se ha utilizado la infusión continua para aumentar la concentración de CNP22 en los sujetos. Un péptido CNP que tenga una vida media más larga y al menos un nivel similar de funcionalidad sería beneficioso para una estrategia terapéutica basada en CNP. Las variantes de CNP también se describen en patentes emitidas relacionadas: Patente de Estados Unidos No. 8,377,884; Patente de Estados Unidos No. 8,198,242; y Patente de Estados Unidos No.8,598,121.

Las variantes de CNP de la presente tienen una afinidad reducida por NEP y / o NPR-C, y una susceptibilidad reducida a la escisión por NEP y / o aclaramiento por NPR-C, pero que tienen una funcionalidad sustancialmente similar o mejor que la CNP22 de tipo salvaje. La susceptibilidad reducida de las variantes de CNP a la escisión por NEP y / o el aclaramiento por NPR-C aumentaría la vida media plasmática o sérica de las variantes, aumentando así la oportunidad de que las variantes se distribuyan a los tejidos y sitios diana y efectúen los efectos farmacológicos deseados. Las variantes de CNP en este documento pueden tener una susceptibilidad reducida a la escisión por NEP y / o aclaramiento por NPR-C in vitro o in vivo en al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces o 5 veces en comparación con wtCNP22, y puede tener una vida media aumentada en plasma o suero in vivo en al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces o 5 veces en comparación con wtCNP22, mientras que retiene al menos aproximadamente 50%, 60% , 70%, 80%, 90% o 100% de la funcionalidad de wtCNP22, o tener una funcionalidad al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, o 5 veces mayor que wtCNP22. La funcionalidad de CNP se puede evaluar en términos de, por ejemplo, el nivel de uno o más biomarcadores (por ejemplo, cGMP) asociados con la formación o el crecimiento de cartílago en un estudio in vitro o in vivo. Además, la funcionalidad del CNP se puede evaluar determinando la prevención de la degeneración del cartílago osteoartrítico en un estudio ex vivo o in vivo, etc.

Los sustratos naturales de NEP son péptidos pequeños y natriuréticos (aproximadamente 2,2 a aproximadamente 3,2 kDa), son los sustratos naturales más grandes de NEP. Según los análisis cristalográficos de rayos X, el sitio activo de NEP está enterrado profundamente dentro de una cavidad central, lo que restringe efectivamente el tamaño de las moléculas de sustrato a no más de aproximadamente 3 kDa (Oefner et al., J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000)). Basado en estudios de señalización de NPR-B, variantes de CNP-22, como CNP-17 (que retiene solo el dominio cíclico, Cys6-Cys22, de CNP22) y CNP-53 (CNP-22 con una extensión de 31 aminoácidos en el N-terminal), todavía puede unirse y activar NPR-B de manera similar al wtCNP-22 de 2,2 kDa. En consecuencia, la divulgación abarca variantes de CNP conjugadas con un polímero natural (p. ej., péptido) y / o sintético (p. ej., PEG) en el N-terminal y / o C-terminal de CNP22 o variantes del mismo, que exhiben mayor resistencia a NEP pero retienen la capacidad de unirse y activar el receptor de señalización NPR-B.

Se describen las variantes de CNP representadas por la fórmula general:

(x)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 129), o

(x)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly²¹-Cys²²-(z) (SEQ ID NO: 130), donde:

(x) y (z) son cada uno independientemente un polímero natural (por ejemplo, una secuencia de péptidos que contiene al menos un aminoácido) y / o un polímero sintético (por ejemplo, PEG) como se describe en el presente documento, de manera que la masa total de la variante de CNP se caracteriza por los intervalos descritos de forma general en el presente documento, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente ⁶ o 7 kDa. Los residuos de Cys⁶ a Cys22 pueden formar una porción cíclica. (x) y / o (z) pueden comprender una extensión de aminoácidos derivada de NPPc o un polipéptido que no es CNP (por ejemplo, ANP, BNP, IgG, etc.), donde la extensión contiene ¹ a 40, ¹ a 35, ¹ a 31, 5 a 35, 5 a 31 o 5 a 15 aminoácidos. Las variantes de CNP pueden comprender una o más modificaciones y / o sustituciones con otro aminoácido natural, un aminoácido no natural, un peptidomimético y / o un isóstero de enlace peptídico en una o más de las siguientes posiciones de CNP22: Gly1, Lys4, Gly5, Cys⁶ , Phe7, Gly⁸ , Leu9, Lys10, Leu11, Ile14, Gly15, Ser16, Met17, Gly19, Leu20, y Gly21.

Se describen variantes de CNP que tienen una masa total caracterizada por los rangos descritos generalmente en este documento, por ejemplo, desde aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa hasta aproximadamente ⁶ o 7 kDa, diseñadas para una mayor resistencia a la degradación de NEP, representadas por la fórmula general:

(x)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 131), o

(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(b)4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys²²-(z) (SEQ ID NO: 132), donde:

(x) es un grupo polimérico sintético o natural, o una combinación de los mismos, donde un ejemplo no limitante de un grupo polimérico sintético es PEG (o PEO), y un ejemplo no limitante de un grupo polimérico natural es una secuencia de aminoácidos que contienen de 1 a 35 aminoácidos y derivan de NPPC o variantes del mismo con sustituciones y / o deleciones, a Np , BNP u otros (poli) péptidos distintos de CNP como, por ejemplo, albúmina sérica, IgG, glicoproteínas ricas en histidina, fibronectina , fibrinógeno, polipéptidos que contienen dedos de zinc, osteocrina o factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2);

(z) puede estar ausente o puede ser un grupo polimérico sintético o natural, o una combinación de los mismos, donde un ejemplo no limitante de un grupo polimérico sintético es PEG, y un ejemplo no limitante de un grupo polimérico natural es una secuencia de aminoácidos derivada de un polipéptido natriurético (por ejemplo, NPPC, CNP, ANP o BNP) o polipéptido no natriurético (por ejemplo, albúmina sérica o IgG); y

(b) y (h) pueden ser independientemente Lys de tipo salvaje en esa posición o pueden reemplazarse con una sustitución de aminoácidos conservadora o cualquier aminoácido natural o no natural o peptidomimético que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, incluyendo pero sin limitarse a Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Glu o Ser. En una realización, (b) es Arg. Para mejorar la resistencia a NEP, (b) no puede ser Gly.

(h) no puede ser Arg.

Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoácidos derivadas de NPPC o variantes de las mismas incluyen: Arg,

Glu-Arg;

Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 133);

Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 134);

Gly-Ala-Asn-Pro-Arg (SEQ ID NO: 135);

Gly-Ala-Asn-Gln-Gln (SEQ ID NO: 136);

Gly-Ala-Asn-Ser-Ser (SEQ ID NO: 137);

Gly-Ala-Asn-Arg-Gln (SEQ ID NO: 138);

Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID NO: 139);

Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO: 140);

Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO: 141);

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala (SEQ ID NO: 142);

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg (SEQ ID NO: 143);

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: 144);

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 145);

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 146);

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-

Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 147); and

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-

Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 148).

Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoácidos derivadas de polipéptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, A n P, BNP, albúmina sérica e IgG incluyen:

Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser (SEQ ID NO: 149);

Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 150);

Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 151);

Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 152);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 153);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 154);

Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg (SEQ ID NO: 155);

Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr (SEQ ID NO: 156);

Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln (SEQ ID NO: 157); y

Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 158).

El grupo N-terminal (x) y / o el grupo C-terminal (z) de cualquiera de las variantes de CNP que tienen un grupo (x) y / o (z), como se describe en este documento, pueden comprender independientemente una secuencia de aminoácidos que contiene una pequeña cantidad de aminoácidos naturales o no naturales ácidos, si los hay (p. ej., Asp o Glu). (x) y / o (z) pueden estar enriquecidos en aminoácidos básicos naturales o no naturales (por ejemplo, Lys, Arg o His) para mantener un pI alcalino similar al pI de CNP22 (pI 8,9). El pI de las variantes de CNP puede estar en el intervalo de aproximadamente 8 a aproximadamente 10,5, diseñado para que las variantes de CNP puedan difundirse más fácilmente a través de la matriz extracelular que rodea a los condrocitos de las articulaciones osteoartríticas. El pI de las variantes de CNP puede ser de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10,5, o de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 9 a aproximadamente 10.

(x) y / o (z) pueden estar enriquecidos en aminoácidos polares naturales o no naturales, diseñados para aumentar la solubilidad en agua. (x) y / o (z) pueden contener un pequeño número de, si los hay, aminoácidos naturales o no naturales hidrófobos (por ejemplo, Ala, Val, Leu, Ile o Met).

El N terminal de las variantes de CNP puede terminar en al menos un residuo de glicina, diseñado para aumentar la vido media en suero. Para evitar la formación de piroglutamina, el N-terminal de las variantes de CNP puede terminar en un residuo de glicina si de otra manera terminaría en glutamina. El grupo (x) puede contener una extensión de aminoácidos cuyo N-terminal termina en al menos un residuo de glicina. (x) y / o (z) no pueden contener dos aminoácidos naturales o no naturales básicos adyacentes (por ejemplo, Lys-Lys o Arg-Arg), diseñados para reducir la susceptibilidad a la escisión por la proteasa furina. (x) no puede contener dos aminoácidos básicos adyacentes inmediatamente antes de la posición correspondiente a Gly1 de CNP22.

El grupo (x) y / o el grupo (z) de las variantes de CNP pueden comprender una secuencia de aminoácidos derivada de NPPC (por ejemplo, derivada de CNP53). (x) puede comprender una secuencia de aminoácidos derivada del N-terminal de ANP o b Np . (z) puede comprender una secuencia de aminoácidos derivada de la cola de C-terminal de ANP o BNP. (x) y / o (z) pueden comprender una secuencia de aminoácidos derivada de un polipéptido no natriurético tal como, por ejemplo, IgG, albúmina de suero humano (HSA por sus siglas en inglés), glicoproteínas ricas en histidina, fibronectina, fibrinógeno, polipéptidos que contienen dedos de zinc, FGF-2 y proteínas dirigidas a huesos (por ejemplo, osteocrina, osteopontina, osteocalcina y sialoproteína).

Cuando CNP22 o una variante del mismo tiene un grupo N-terminal (x) y / o un grupo C-terminal (z), (x) y / o (z) pueden contener independientemente una secuencia de aminoácidos derivada del dominio funcional de un proteína morfogenética ósea (BMP). Una extensión de aminoácidos N-terminal y / o C-terminal derivada del dominio funcional de una BMP puede aumentar la resistencia a NEP y, por lo tanto, la vida media en suero de la variante de CNP, al aumentar la masa total de la variante de CNP a caracterizar por los intervalos descritos generalmente en el presente documento, por ejemplo, un intervalo de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa. Además, dado que ciertas BMPs son factores de crecimiento y citocinas que inducen la formación de hueso y cartílago, un fragmento derivado del dominio funcional de una BMP puede promover el crecimiento de condrocitos, cartílagos o huesos mediante un mecanismo distinto de la activación de la función guanilil ciclasa de NPR-B por el dominio cíclico de CNP22 o una variante del mismo. Los ejemplos no limitantes de BMPs que promueven la formación y el desarrollo de hueso, la formación y el desarrollo de cartílago y / o la diferenciación de osteoblastos incluyen BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 y BMP8a. El N-terminal y / o C-terminal de CNP22 o una variante del mismo pueden conjugarse independientemente a una secuencia de aminoácidos derivada de los últimos 140 aminoácidos en la porción C-terminal de b Mp 1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7, o BMP8a.

Las variantes de CNP pueden contener una extensión de aminoácidos en el N-terminal y / o C-terminal de CNP22 o CNP17, que incluyen pero no se limitan a:

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 6);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37, BL analógico) (SEQ ID NO: 22);

AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CA analógica) (SEQ ID NO: 68);

AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CB analógico) (SEQ ID NO: 69);

DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CC analógica) (SEQ ID NO: 70);

RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 71);

ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 72);

GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 73);

GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 74);

GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 75);

GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 76);

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 48); y

SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (CD analógico) (CNP17 que tiene colas N-terminal y C-terminal derivadas de BNP) (SEQ ID NO: 77).

Las variantes de CNP pueden tener una sustitución de K4R en la posición 4 de CNP22. Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP (K4R) incluyen:

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analógico AY) (SEQ ID NO: 52);

GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CI analógico) (SEQ ID NO: 78);

RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (AZ analógica) (SEQ ID NO: 79);

ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (BA analógica) (SEQ ID NO: 80);

GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CH analógico) (SEQ ID NO: 81); y GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CG analógico) (SEQ ID NO: 82).

Las variantes de CNP pueden ser quimeras que comprenden CNP22, o una variante del mismo que tiene adición(es), deleción(es) y / o sustitución (es) de aminoácidos, y un fragmento de péptido derivado de un polipéptido o proteína diferente de CNP, o el polipéptido o proteína no CNP completo, al N-terminal del péptido CNP, donde CNP22 o la variante del mismo puede tener opcionalmente una extensión de aminoácidos N-terminal de uno o más residuos de aminoácidos. Las quimeras CNP pueden comprender CNP22 o una variante del mismo que tiene una extensión de aminoácidos N-terminal de uno o más residuos de aminoácidos. Las quimeras CNP pueden contener residuos de lisina-lisina (KK) o residuos GANKK que preceden inmediatamente a la primera posición de CNP22 (Gly en el caso de CNP22) o una variante del mismo. Las quimeras CNP pueden contener uno o dos residuos diferentes de lisina-lisina que preceden inmediatamente a la primera posición de CNP22 o una variante del mismo. Los ejemplos no limitantes de residuos que pueden preceder inmediatamente a la primera posición de CNP22 o una variante del mismo incluyen KP, PK, PR, PQ, QK, QQ, RR, SS, GANKP, GANPK, GANPR, GANPQ, GANQK, GANQQ, GANRR, y GANSS.

Las variantes de CNP pueden ser quimeras que comprenden CNP22 y un fragmento de péptido N-terminal, que incluye, pero no se limita a:

GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CQ análogo) (quimera de fragmento CNP22 de glicoproteína rica en histidina (HRGP)) (SEQ ID NO: 83);

GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CR análogo) (fragmento HRGP-quimera CNP22) (SEQ ID NO: 84);

GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CX análogo) (fragmento HRGP-quimera CNP22) (SEQ ID NO: 85) ;

GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CF análogo) (fragmento IgG¹(Fc)-quimera CNP22) (SEQ ID NO: 86) ;

GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CY análogo) (quimera de fragmento CNP22 de albúmina sérica humana (HSA)) (SEQ ID NO: 87);

GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CE análogo) (fragmento HSA-quimera CNP22) (SEQ ID NO: 88);

FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CZ análoga) (fragmento de osteocrina "inhibidor de NPR C" quimera CNP22) (SEQ ID NO: 89); y

GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (DA análogo) (fragmento FGF2 "dominio de unión a heparina"-quimera CNP22) (SEQ ID NO: 90).

Las variantes de CNP pueden ser quimeras que comprenden un fragmento de péptido N-terminal y CNP22 en el que la arginina se sustituye por Lys4 de CNP22 ("CNP22 (K4R)"), que incluyen pero no se limitan a:

GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CK análoga) (fragmento IgG¹(Fc) -quimera CNP22 (K4R)) (SEQ ID NO: 91);

GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CL análogo) (fragmento HSA-quimera CNP22 (K4R)) (SEQ ID NO: 92);

GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CM análogo) (fragmento de fibronectina-quimera CNP22 (K4R)) (SEQ ID NO: 93);

GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CN análogo) (fragmento de fibrinógeno-quimera CNP22 (K4R)) (SEQ ID NO: 94);

GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CO análogo) (fragmento de fibrinógeno-quimera CNP22 (K4R)) (SEQ ID NO: 95); y

GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CP analógico) (fragmento de dedo de zinc-quimera CNP22 (K4R)) (SEQ ID NO: 96).

Las quimeras que comprenden IgG y CNP22 o una variante de los mismos están diseñadas para, entre otras cosas, aumentar la resistencia a la degradación de NEP y reducir la unión a la albúmina sérica. Las quimeras CNP que comprenden un fragmento de superficie de HSA están diseñadas, entre otras cosas, reducir la inmunogenicidad y reducir la unión a la albúmina sérica. Las quimeras HRGP-CNP22 y HRGP-CNP22 (K4R) que contienen una secuencia catiónica, rica en histidina, sin lisina y sin arginina en el N-terminal están diseñadas para, entre otras cosas, una mayor estabilidad frente a las proteasas. Las quimeras que contienen un fragmento de osteocrina están diseñadas para liberar, tras la escisión por proteasa (p. ej., furina), el fragmento de osteocrina en las placas de crecimiento óseo, donde el fragmento inhibiría el receptor de aclaramiento NPR-C. Con respecto a la quimera que comprende un fragmento de unión a heparina FGF2, la unión de heparina al fragmento está diseñada para proteger a la quimera de la degradación, proporcionando así una vida media en suero más prolongada. Las quimeras que contienen fibronectina, fibrinógeno o fragmentos de dedos de zinc están diseñadas para reducir la unión a la albúmina sérica, entre otras características.

Sin pretender ceñirse a la teoría, una variante de CNP de peso molecular de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa que tiene una mayor resistencia a la degradación de NEP y tiene una funcionalidad similar o mejorada (p. ej., unión a NPR-B y estimulación de señalización cGMP) en comparación con wtCNP22, puede ser más eficaz si no se une estrechamente a proteínas plasmáticas como la albúmina sérica. Una variante de CNP que no se une estrechamente a las proteínas plasmáticas (p. ej., albúmina sérica) puede ser más eficaz para difundirse a través del cartílago, llegar a los condrocitos de las articulaciones osteoartríticas y unirse a y activar NPR-B para la señalización de cGMP. Las variantes de CNP diseñadas para la unión reducida a proteínas plasmáticas (por ejemplo, albúmina sérica) pueden ser quimeras que comprenden CNP22 o una variante de las mismas y un fragmento peptídico de IgG. Las variantes de CNP diseñadas para la unión reducida a proteínas plasmáticas pueden ser quimeras que comprenden CNP22 o CNP22(K4R) y un fragmento de un polipéptido (por ejemplo, IgG, HSA, fibronectina, fibrinógeno, un polipéptido que contiene dedos de zinc, etc.). Las variantes de CNP diseñadas para una unión reducida a proteínas plasmáticas pueden comprender CNP22 o una variante del mismo conjugado con un polímero hidrófilo o soluble en agua. El polímero hidrófilo o soluble en agua puede ser PEG (o PEO). El polímero hidrófilo o soluble en agua (p. ej., PEG) puede funcionalizarse con uno o más grupos funcionales que imparten una carga negativa al polímero en condiciones fisiológicas, tales como, p. ej., grupos carboxilo, sulfato o fosfato, o una combinación de los mismos.

Se describen variantes de CNP que pueden incluir péptidos de CNP truncados que van desde CNP-17 humano (hCNP-17) a CNP-53 humano (hCNP-53), y que tienen secuencias de aminoácidos de tipo salvaje derivadas de hCNP-53. Dichos péptidos de CNP truncados incluyen:

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 6);

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-52) (SEQ ID NO: 7);

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-51) (SEQ ID NO: 8);

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-50) (SEQ ID NO: 9);

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-49) (SEQ ID NO: 10);

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-48) (SEQ ID NO: 11);

KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-47) (SEQ ID NO: 12); SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-46) (SEQ ID NO: 13);

RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-45) (SEQ ID NO: 14);

AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-44) (SEQ ID NO: 15);

AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-43) (SEQ ID NO: 16);

WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-42) (SEQ ID NO: 17);

ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 18);

RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-40) (SEQ ID NO: 19);

LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 20);

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 21);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37) (SEQ ID NO: 22);

EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-36) (SEQ ID NO: 23);

HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-35) (SEQ ID NO: 24);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-34) (SEQ ID NO: 25);

NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-33) (SEQ ID NO: 26);

ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-32) (SEQ ID NO: 27);

RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-31) (SEQ ID NO: 28);

KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-30) (SEQ ID NO: 29);

YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-29) (SEQ ID NO: 30);

KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-28) (SEQ ID NO: 31);

GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-27) (SEQ ID NO: 32);

ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-26) (SEQ ID NO: 33);

NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-25) (SEQ ID NO: 34);

KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-24) (SEQ ID NO: 35);

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-23) (SEQ ID NO: 36);

GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 37);

LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-21) (SEQ ID NO: 38);

SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-20) (SEQ ID NO: 39);

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-19) (SEQ ID NO: 40);

GCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-18) (SEQ ID NO: 41); y

CFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-17) (SEQ ID NO: 42).

Las variantes de CNP pueden no incluir CNP-17, CNP-22 o CNP-53.

Los péptidos CNP truncados que van desde hCNP-17 a hCNP-53 pueden contener adición(es), deleción(es) y / o sustitución(es) de aminoácidos con aminoácido(s) natural o no natural o peptidomimético(s) (p. ej. , isóstero(s) de enlace peptídico), como se describe en el presente documento, en una o más de cualquiera de las posiciones de aminoácidos de los péptidos CNP truncados particulares. Los péptidos CNP truncados que tienen secuencias de tipo salvaje o adición(es), deleción(es) y / o sustitución(es) de aminoácidos, se pueden conjugar en el N-terminal, C-terminal y / o sitio(s) interno(s) para cualquiera de los restos descritos en el presente documento, incluidos, pero no limitados a, restos dirigidos a sinovio o cartílago (p. ej., bifosfonatos, secuencias de péptidos dirigidos a hueso o cartílago (p. ej., polyAsp, polyGlu), secuencias peptídicas derivadas de dominios de proteínas de hueso dirigidos al hueso (p. ej., osteopontina, osteocalcina, sialoproteína)), secuencias de péptidos derivadas de los dominios funcionales de proteínas morfogenéticas óseas (p. ej., BMP2, BMP3, BMP5, BMP7, BMP8a), secuencias de péptidos derivadas de polipéptidos natriuréticos (p. ej., NPPC, AnP, BNP), secuencias peptídicas derivadas de polipéptidos de origen no natriurético (p. ej., albúmina sérica, IgG, glucoproteínas ricas en histidina, fibronectina, fibrinógeno, polipéptidos que contienen dedos de zinc, FGF-2, osteocrina), fracciones que reducen el aclaramiento renal (p. ej., restos de PEG cargados negativamente), polímeros hidrofílicos (p. ej., PEG), carbohidratos (p. ej., carbohidratos reconocidos por receptores en la superficie de las células dentro de las articulaciones osteoartríticas), ácidos hidrófobos (p. ej., C⁵-C¹² ácidos carboxílicos, ácidos grasos naturales), fosfolípidos y combinaciones de los mismos. Los péptidos CNP truncados que tienen secuencias de tipo salvaje o adición(es), deleción(es) y / o sustitución(es) de aminoácidos, y opcionalmente conjugados con una o más fracciones en el N-terminal, C-terminal y / o sitio(s) interno(s), puede tener una masa total caracterizada por los intervalos descritos generalmente en este documento, por ejemplo, desde aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa hasta aproximadamente 6 o 7 kDa.

Las variantes de CNP pueden ser derivados de CNP37, que es QEHPNARKYKGANKK-CNP22 (SEQ ID NO: 22). Las variantes de CNP37 pueden contener adición(es), deleción(es) y / o sustitución(es) de aminoácidos con aminoácidos o peptidomimético(s) naturales o no naturales (p. ej., isóstero(s) de enlace peptídico) en una cualquier o más de las 37 posiciones de CNP37. Los ejemplos no limitantes de sustituciones que se pueden realizar en CNP37, basados en la numeración de CNP22, incluyen K4R, G5S, GSR, G8S, K10R, G15S, S16Q, M17N, G19R y combinaciones de los mismos. Los derivados de CNP37 pueden contener una sustitución de Met17 por un aminoácido o peptidomimético natural (por ejemplo, asparagina) o no natural, diseñado en parte para evitar la oxidación del átomo de azufre de la metionina. Las variantes de CNP37 pueden contener sustitución(es) de Lys8, Lys10, Lys14 y / o Lys15 (según la numeración desde el N-terminal de CNP37) a aminoácido(s) no básico o peptiomimético(s) natural o no natural, diseñados en parte para reducir la unión de la albúmina.

Además o alternativamente a la adición (es), deleción (es) y / o sustitución (es) de aminoácidos, los derivados de CNP37 pueden conjugarse en el N-terminal, C-terminal y / o un sitio interno a cualquiera de los restos descritos en el presente documento, que incluyen, pero no se limitan a, restos dirigidos al hueso o cartílago (p. ej., dominios peptídicos dirigidos al hueso), restos que reducen el aclaramiento renal (p. ej., restos PEG cargados negativamente), polímeros hidrófilos (p. ej., PEG), secuencias de aminoácidos que comprenden uno o más aminoácidos (p. ej., fragmento de osteocrina "inhibidor de NPR-C"), carbohidratos (p. ej., carbohidratos reconocidos por receptores en la superficie de las células en las placas de crecimiento óseo), ácidos hidrófobos (p. ej., C⁵-C¹² ácidos carboxílicos y ácidos grasos naturales) y combinaciones de los mismos.

Las variantes de CNP pueden ser péptidos CNP37 modificados que tienen mutación(es) / sustitución(es) en el sitio de escisión de furina (subrayado), diseñados para mejorar la resistencia in vivo a la furina proteasa y / o que contenga glicina (subrayado) en el N-terminal, diseñado para mejorar la estabilidad del plasma y prevenir la formación de piroglutamina. Dichas variantes de CNP37 incluyen, pero no se limitan a:

GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CS) (SEQ ID NO: 97);

GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CT) (SEQ ID NO: 98);

GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CU) (SEQ ID NO: 99);

GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CW) (SEQ ID NO: 100);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP37, An. DB) (SEQ ID NO: 2); y PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 1).

Las variantes de CNP pueden incluir péptidos CNP y variantes de los mismos que pueden producirse mediante el proceso de proteína de fusión descrito en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP que se pueden producir mediante el proceso de proteína de fusión descrito en este documento, usando escisión química o proteolítica o autoescisión de proteínas, incluyen:

GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-wtCNP53) (SEQ ID NO: 3); GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 2); QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (wtCNP37) (SEQ ID NO: 22);

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (fragmento de HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 48);

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 52);

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP53(M48N)] (SEQ ID NO: ⁶ ); GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP37 (M32N)] (SEQ IS NO: 46);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP37(M32N)] (SEQ ID NO: 43);

GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP27(M22N)] (SEQ ID NO: 49);

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 53);

PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-wtCNP53) (SEQ ID NO: 4); PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 1);

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-wtCNP37) (SEQ ID NO: 44);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (wtCNP34) (SEQ ID NO: 25);

P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 50);

PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Pro-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 54);

MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-wtCNP53) (SEQ ID NO: 5); MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 47);

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-wtCNP37) (SEQ ID NO: 45);

M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 51);

MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Met-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 55).

Otras variantes de CNP, incluidos los péptidos de CNP truncados que van desde hCNP-17 a hCNP-53 y que tienen secuencias de tipo salvaje o adición(es), deleción(es) y / o sustitución(es) de aminoácidos, también pueden producirse mediante el proceso de proteína de fusión descrito en este documento, siempre que el sitio pretendido de escisión química o proteolítica de la proteína de fusión no esté presente dentro de la secuencia de aminoácidos de la variante de CNP diana en sí. Como ejemplo no limitante, el proceso de proteína de fusión descrito en el presente documento puede emplearse para producir wtCNP34 truncado usando escisión con ácido fórmico.

Para cualquiera de los péptidos de CNP y variantes de CNP de la presente que tienen residuo(s) de asparagina (Asn / N) y / o residuo(s) de glutamina (Gln / Q), ya sea que tengan una secuencia de tipo salvaje o una secuencia de aminoácidos no natural, cualquier residuo(s) Asn y / o residuo(s) Gln pueden sustituirse independientemente con cualquier otro aminoácido natural o no natural, incluyendo sustituciones conservadoras tales como Asn por Gln. Dicha sustitución(es) está diseñada en parte para minimizar o evitar cualquier desamidación potencial de asparagina y / o glutamina. Ejemplos no limitantes de péptidos y variantes de CNP en los que cualquier residuo(s) Asn y / o residuo(s) Gln puede sustituirse independientemente con cualquier otro aminoácido natural o no natural, incluidas sustituciones conservadoras como Asn por Gln, incluyen wtCNP34 , wtCNP37, Gly-wtCNP37, Pro-wtCNP37, Pro-Gly-wtCNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 48), Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 50), PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 101), y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 102). Un residuo de asparagina de los péptidos CNP y las variantes de CNP de la presente no puede estar sustituido con glutamina, ácido aspártico o ácido glutámico. Un residuo de glutamina de los péptidos de CNP y variantes de CNP de la presente no puede sustituirse con asparagina, ácido aspártico o ácido glutámico.

Como ejemplo no limitativo, los residuos de asparagina 7 y / o 15 de Pro-Gly-wtCNP37 (PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 1) puede sustituirse independientemente con cualquier otro aminoácido natural o no natural, incluida la glutamina, para evitar cualquier desamidación potencial del residuo o residuos de asparagina en ácido aspártico o ácido isoaspártico. Los residuos de asparagina 7 y / o 15 de Pro-Gly-wtCNP37 no pueden sustituirse con glutamina, ácido aspártico o ácido glutámico.

Sin embargo, se entiende que en una cualquiera o más de las variantes de CNP, hasta todas, los residuos susceptibles de desamidación o una reacción similar a la desamidación (p. ej., isomerización) pueden convertirse en otro residuo(s) mediante desamidación o una reacción similar a la desamidación en cualquier grado, hasta un 100% de conversión por residuo convertido. En las variantes de CNP: (1) uno o más, hasta todos, los residuos de asparagina (Asn / N) se pueden convertir en ácido aspártico o aspartato, y / o en ácido isoaspártico o isoaspartato, mediante desamidación hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido; (2) uno o más, hasta todos, los residuos de glutamina (Gln / Q) se pueden convertir en ácido glutámico o glutamato, y / o en ácido isoglutámico o isoglutamato, mediante desamidación hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido; (3) uno o más, hasta todos, los residuos de ácido aspártico o aspartato (Asp / D) se pueden convertir en ácido isoaspártico o isoaspartato mediante una reacción similar a la desamidación (también llamada isomerización) hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido; (4) uno o más, hasta todos, los residuos de ácido glutámico o glutamato (Glu / E) se pueden convertir en ácido isoglutámico o isoglutamato a través de una reacción similar a la desamidación (también llamada isomerización) hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido; o (5) una combinación de los anteriores.

Como ejemplo no limitante, en una cualquiera o más de las variantes de CNP, hasta todas, residuos de asparagina, glutamina, ácido aspártico y / o ácido glutámico de Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 1) se puede convertir en (1) ácido aspártico / aspartato y / o ácido isoaspártico / isoaspartato, (2) ácido glutámico / glutamato y / o ácido isoglutámico / isoglutamato, (3) ácido isoaspártico / isoaspartato y / o (4) ácido isoglutámico / isoglutamato, respectivamente, mediante desamidación o una reacción similar a la desamidación hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido, como se describe anteriormente.

Como ejemplo adicional, en una cualquiera o más de las variantes de CNP, hasta todas, residuos de asparagina y / o ácido aspártico de Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 1) se puede convertir en (1) ácido aspártico / aspartato y / o ácido isoaspártico / isoaspartato, y / o (2) ácido isoaspártico / isoaspartato, respectivamente, mediante desamidación o una reacción similar a la desamidación hasta aproximadamente 5%, 10% , 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido.

Como otro ejemplo, en una cualquiera o más de las variantes de CNP, hasta todas, residuos de asparagina, glutamina, ácido aspártico y / o ácido glutámico de Gly-wtCNP37 [GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 2) se puede convertir en (1) ácido aspártico / aspartato y / o ácido isoaspártico / isoaspartato, (2) ácido glutámico / glutamato y / o ácido isoglutámico / isoglutamato, (3) ácido isoaspártico / isoaspartato y / o (4) ácido isoglutámico / isoglutamato, respectivamente, mediante desamidación o una reacción similar a la desamidación hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido.

Como otro ejemplo más, en una cualquiera o más de las variantes de CNP, hasta todas, residuos de asparagina, glutamina, ácido aspártico y / o ácido glutámico de wtCNP37 [QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 22) se puede convertir en (1) ácido aspártico / aspartato y / o ácido isoaspártico / isoaspartato, (2) ácido glutámico / glutamato y / o ácido isoglutámico / isoglutamato, (3) ácido isoaspártico / isoaspartato y / o (4) ácido isoglutámico / isoglutamato, respectivamente, mediante desamidación o una reacción similar a la desamidación hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido.

Como ejemplo adicional, en una cualquiera o más de las variantes de CNP, hasta todas, residuos de asparagina, ácido aspártico y / o ácido glutámico de una quimera HSA-wtCNP27, GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 48), se puede convertir en (1) ácido aspártico / aspartato y / o ácido isoaspártico / isoaspartato, (2) ácido isoaspártico / isoaspartato y / o (3) ácido isoglutámico / isoglutamato, respectivamente, mediante desamidación o una reacción similar a la desamidación hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido.

Como un ejemplo adicional más, en una cualquiera o más de las variantes de CNP, hasta todas, residuos de asparagina, ácido aspártico y / o ácido glutámico de una quimera Pro-HSA-wtCNP27, PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 50), se puede convertir en (1) ácido aspártico / aspartato y / o ácido isoaspártico / isoaspartato, (2) ácido isoaspártico / isoaspartato y / o (3) ácido isoglutámico / isoglutamato, respectivamente, mediante desamidación o una reacción similar a la desamidación hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de conversión por residuo convertido.

Además, en una cualquiera o más de las variantes de CNP, hasta todas, los residuos de metionina (Met / M) pueden oxidarse a cualquier forma oxidada químicamente factible (p. ej., sulfóxido y / o sulfona) hasta aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de transformación por residuo oxidado.

Las variantes de CNP pueden comprender CNP22 o variantes del mismo conjugados en el N-terminal y / o C-terminal con resto(s) que facilitan la translocación de las variantes a través de una membrana celular o barrera celular. Las variantes de CNP pueden conjugarse en el N-terminal y / o C-terminal con la secuencia o secuencias de péptidos que facilitan el transporte de las variantes a través de una membrana celular o barrera celular, incluso a través de transportadores de péptidos activos.

El N-terminal y / o C-terminal de CNP22 o una variante del mismo puede conjugarse con restos químicos tales como, por ejemplo, polímeros naturales y / o sintéticos, para aumentar la masa total del péptido CNP modificado para los rangos descritos generalmente en este documento, por ejemplo, un intervalo de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa. Los restos químicos pueden ser polímeros biocompatibles hidrófilos o solubles en agua naturales (por ejemplo, péptidos, carbohidratos) o sintéticos (por ejemplo, PEG (o PEO)).

El N-terminal y / o C-terminal de CNP22 o una variante del mismo se puede conjugar con polímeros de PEG (o PEO) para dar como resultado una masa total caracterizada por los intervalos descritos generalmente en este documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa. La pegilación de CNP22 o una variante del mismo está diseñada, entre otras cosas, para reducir la inmunogenicidad y mejorar la vida media reduciendo el aclaramiento renal y aumentando la resistencia a proteasas. Se puede unir un resto de PEG al N- y / o C-terminal de CNP22 o cualquier variante de la presente, que incluye, pero no se limita a, CNP-17 (la porción ciclada Cys6-Cys22 de CNP22), CNP37 y variantes de CNP17, CNP^{2 2} , o CNp 37 que tiene extensión(es) de aminoácidos N- y / o C-terminal, sustitución(es) de aminoácido y / o deleción(es) de aminoácido. Los residuos Lys4 y / o Lys10 de CNP17, CNP22 o CNP37, o variantes de los mismos, pueden sustituirse con un aminoácido natural o no natural (p. ej., Arg, Gly, Ser, Gln, Glu o Cit) o peptidomimético que no contienen una amina primaria reactiva en una cadena lateral, para evitar cualquier PEGilación potencial de estos residuos de lisina. Los residuos Lys4 y / o Lys10 de los péptidos CNP pueden sustituirse por Arg. El residuo de Lys10 no puede sustituirse por Arg.

Las variantes de CNP (incluyendo CNP22 y variantes del mismo) que tienen un resto PEG (o PEO) y una extensión de aminoácidos en el N-terminal pueden contener arginina en la posición inmediatamente anterior a la posición correspondiente a Gly1 de CNP22. Dichas variantes de CNP PEGilado están diseñadas para aumentar la resistencia a la degradación de NEP, reducir la unión a la albúmina sérica y mejorar la actividad funcional del CNP (p. ej., activación de la señalización de cGMP). Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP PEGilado incluyen PEO24-G-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO: 102), PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 101), PEO24-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 103), PEO12-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 104), PEO24-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 105), PEO12-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 106), PEO24-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 107), PEO12-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 108), PEO24-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 109), PEO12-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 110), PEO24-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 111), PEO12-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 112), PEO24-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 113), PEO12-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 114), PEO24-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 115), PEO12-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 116), PEO24-R-CNP22 (SEQ ID NO: 117), y PEO12-R-CNP22 (SEQ ID NO: 118), donde PEO24 es un polímero de PEG de 1,2 kDa monodispersado y PEO12 es un polímero de PEG de 0,6 kDa monodispersado. El polímero de PEG (o PEO) se puede conjugar con el N-terminal de las variantes de CNP.

Se contempla el uso de polímeros hidrófilos o solubles en agua (p. ej., PEG) que pueden variar en tipo (p. ej., homopolímero o copolímero; copolímero aleatorio, alterno o de bloque; lineal o ramificado; monodisperso o polidisperso), enlace (p. ej., enlace hidrolizable o estable tal como, por ejemplo, enlace de amida, imina, aminal, alquileno o éster), sitio de conjugación (por ejemplo, en el N-terminal y / o C-terminal, preferiblemente no en ninguno de los residuos en la región ciclada de CNP (correspondiente a los residuos 6-22 de CNP22)), y longitud (por ejemplo, de aproximadamente 0,2, 0,4 o 0,6 kDa a aproximadamente 2, 3, 4 o 5 kDa). El polímero hidrófilo o soluble en agua se puede conjugar con el péptido CNP por medio de química basada en N-hidroxisuccinimida (NHS) o aldehídos u otra química, como se conoce en la técnica. Dichas variantes de CNP se pueden generar usando, por ejemplo, wtCNP22 (2,2 kDa), CNP17 que retiene solo la región ciclada (residuos 6-22) de wtCNP22, variantes de CNP que tienen una extensión de aminoácidos en el N-terminal y / o C-terminal de CNP22 o CNP17, o variantes que tienen sustituciones, adiciones y / o deleciones de aminoácidos tales como, por ejemplo, GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO: 119), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 78), R-CNP22 (SEQ ID NO: 71), R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 79), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 72), y ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 80). Las variantes de PEG-CNP que tienen una masa total caracterizada por los intervalos descritos generalmente en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, pueden contener un resto de PEG (o PEO) lineal monodisperso conjugado en el N-terminal y / o C-terminal mediante química basada en NHS o aldehído, o un resto de PEG ramificado de dos o tres brazos conjugado en el N-terminal y / o C-terminal mediante química basada en NHS. También se incluyen las variantes de PEG-CNp cargadas negativamente diseñadas para un aclaramiento renal reducido, que incluyen, pero no se limitan a, compuestos carboxilados, sulfatados y fosforilados (Caliceti, Adv. Drug Deliv. Rev., 55: 1261-77 (2003); Perlman, J. Clin. Endo. Metab., 88: 3227-35 (2003); Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo., 29: 440-444 (1986); Vehaskari, Kidney Intl, 22: 127-135 (1982)). El resto de PEG (o PEO) puede contener un grupo(s) carboxilo, grupo(s) sulfato y / o grupo(s) fosfato.

Los restos PEG (o PEO) conjugados con el N-terminal, el C-terminal y / o el sitio(s) interno de las variantes de CNP de la presente pueden contener uno o más grupos funcionales que están cargados positivamente en condiciones fisiológicas. Dichos restos de PEG están diseñados, entre otras cosas, para mejorar la distribución de tales variantes de CNP PEGilado a los tejidos del cartílago. Dichos restos de PEG pueden contener uno o más grupos amino primarios, secundarios o terciarios, grupos de amonio cuaternario y / u otros grupos que contienen amina (por ejemplo, urea).

Se engloban CNP22 o variantes del mismo conjugadas mediante química basada en NHS o aldehído a PEG (o PEO) de fórmula (CH²CH²O)n, donde n es un número entero de aproximadamente ⁶ a aproximadamente 100, y el polímero de PEG es de aproximadamente 0,3 kDa a aproximadamente 5 kDa. n puede ser un número entero de aproximadamente 12 a aproximadamente 50, y el polímero de PEG es de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 2,5 kDa. n puede ser de aproximadamente 12 a aproximadamente 24, y el polímero de PEG es de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 1,2 kDa. El grupo hidroxilo terminal del polímero de PEG puede estar rematado con un grupo no reactivo. El grupo de protección terminal puede ser un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo inferior como metilo.

Las variantes de CNP pueden tener uno o más enlaces peptídicos o isósteros de enlaces peptídicos que tienen una susceptibilidad reducida a la escisión por peptidasas, incluida la endopeptidasa neutra (NEP). La NEP es una endopeptidasa dependiente de zinc unido a la membrana que escinde un enlace peptídico de sustrato en el extremo amino de grandes residuos hidrófobos. Por tanto, la modificación de un enlace peptídico en un sitio de escisión de NEP a un enlace peptídico o no peptídico no natural puede impedir o disminuir la eficacia de la escisión de NEP.

Para ANP y CNP, se informa que la escisión de NEP ocurre primero en el enlace Cys6-Phe7 dentro de la región ciclada, luego en otras partes del resto de las estructuras. Para BNP, se informa que la escisión ocurre primero en el N-terminal del péptido, luego dentro de la estructura cíclica. Aunque se informa que el sitio principal de escisión de NEP en CNP es el enlace Cys6-Phe7, cuando wtCNP22 se expuso a la digestión de NEP durante 2,5 minutos in vitro, inesperadamente, todos los sitios posibles se hidrolizaron, siendo los enlaces peptídicos Cys6-Phe7 y Gly8-Leu9 ligeramente más lábiles.

La especificidad de sustrato de NEP está determinada principalmente por dos subsitios de unión a sustrato, S1' y S2' (Oefner et al., J. Mol. Biol. 296:341-349 (2000)). El sitio S1' acepta un gran residuo P1' hidrófobo del cual el enlace peptídico N-terminal se somete a hidrólisis (p. ej., Phe, Leu, Ile y Met). El sitio S2' generalmente prefiere un residuo más pequeño, denominado P2' (por ejemplo, Gly o Ser). En el caso de CNP, se informa que Phe7 es el residuo P1' preferido para el sitio NEP S1', mientras que Gly⁸ es el residuo P2 'preferido para el sitio S2'. Debido a que estos dos subsitios pueden acomodar juntos solo un cierto tamaño total de cadena lateral, cualquier aumento en el tamaño total de los residuos P1'-P2' de CNP puede potencialmente interrumpir la unión de NEP. Por ejemplo, la adición de un áto mo de cloruro en la posición 3 del anillo aromático P1' Phe7 (es decir, 3-Cl-Phe7) puede modificar potencialmente (p. ej., desestabilizar) las interacciones entre CNP y los sitios de escisión de NEP, por ejemplo en el Subsitio S1'. La adición de un grupo butilo terciario al residuo P2' más pequeño Gly⁸ (es decir, tBu-Gly⁸ ) puede interrumpir potencialmente la interacción entre CNP y el subsitio S2'.

Por consiguiente, las variantes de CNP pueden incluir CNP que tiene un aumento en el tamaño de los residuos P1'-P2', tales como Phe7-Gly8, para interferir con el reconocimiento del sustrato en el sitio activo, reduciendo así la susceptibilidad a la escisión de NEP. Los aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y / o restos peptidomiméticos se sustituyen por uno o más residuos hidrófobos P1' grandes, incluidos, pero no limitados a, Phe7, Leu9, Leu11, Ile14, Met17 y Leu20, y / o uno o más residuos P2' más pequeños, que incluyen pero no se limitan a Cys⁶ , Gly⁸ , Gly15, Ser16 y Gly19.

Las variantes de CNP pueden comprender al menos un aminoácido modificado y / o al menos un enlace peptídico modificado, al menos un residuo involucrado en el reconocimiento del sustrato y / o escisión por NEP, donde los aminoácidos modificados y los enlaces peptídicos modificados pueden ser aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, peptidomiméticos y / o isósteros de enlaces peptídicos. El sitio de escisión de NEP en CNP entre Cys⁶ y Phe7 puede modificarse. El enlace peptídico (--C (= O) - NH--) entre Cys⁶ y Phe7 puede reemplazarse con uno de los siguientes isósteros del enlace peptídico:

--CH2--NH--,

--C (=O)-- N (R)--, donde el grupo amida se alquila con cualquiera de los siguientes grupos R: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo,

--C(=O)--NH--CH2--,

--CH2--S--,

--CH²--S(O)n--, donde n es 1 o 2,

--CH2--CH2--,

--CH=CH--,

--C(=O)--CH2--,

--CH(CN)--NH--,

--CH(OH)--CH2--,

--O--C(=O)--NH--, o

--NHC(=O)NH--.

Las variantes de CNP pueden estar representadas por la fórmula: (x)-Gly¹-Leu²-Ser³-Lys⁴-Gly⁵-(b)⁶-(c)⁷-(d)⁸-Leu⁹-Lys¹⁰-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 120), donde:

(x) y (z) independientemente pueden estar ausentes o pueden seleccionarse del grupo que consiste en compuestos sintéticos dirigidos al hueso tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoácidos útiles en el direccionamiento de articulaciones o cartílagos tales como, por ejemplo, poIyAsp y polyGlu; secuencias de aminoácidos derivadas de dominios de proteínas óseas que se dirigen al hueso tales como, por ejemplo, osteopontina, osteocalcina y sialoproteína (Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev., 57: 1049-76 (2005)); moléculas poliméricas y no poliméricas que reducen el aclaramiento renal tales como, por ejemplo, PEGs cargados negativamente; y polímeros naturales (por ejemplo, aquellos que contienen aminoácidos, ácidos grasos y / o carbohidratos) y polímeros sintéticos (por ejemplo, PEGs) que aumentan la resistencia de la variante de CNP a la degradación de NEP al aumentar la masa total de la variante de CNP a los intervalos descritos generalmente en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa;

(b) y (c) pueden ser Cys6 y Phe7 de tipo salvaje, otro aminoácido natural o un aminoácido no natural, o pueden contener un isóstero de enlace peptídico como se describe en el presente documento para aumentar la resistencia a la escisión de NEP; y

(d) puede ser el Gly8 de tipo salvaje, o puede ser un aminoácido o peptidomimético natural o no natural (por ejemplo, t-Bu-Gly) más grande para reducir la unión a NEP.

Tales variantes de CNP pueden contener al menos un aminoácido modificado en (b), (c) y / o (d).

Otros enlaces peptídicos dentro del CNP pueden escindirse incluso si CNP22 o una variante del mismo tiene un enlace peptídico resistente a NEP o un enlace peptídico isóstero en Cys6-Phe7, incluidos los enlaces Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Met17 y Gly19-Leu20. Por lo tanto, las variantes de CNP pueden tener isóstero(s) de enlace peptídico en uno o más de otros sitios de escisión de NEP además del enlace Cys6-Phe7, donde los isósteros de enlace peptídico incluyen los descritos en el presente documento.

Las variantes de CNP pueden tener un análogo de cisteína en Cys6 y / o Cys22, que incluyen, pero no se limitan a, homocisteína, penicilamina, ácido 2-mercaptopropiónico y ácido 3-mercaptopropiónico. Tales variantes de CNP pueden tener un dominio cíclico formado por un enlace disulfuro entre el Cys6 o análogo de tipo salvaje y Cys22 o análogo. Uno o más residuos de CNP22 o una variante del mismo, hasta todos los residuos, pueden estar sustituidos con un D-aminoácido. La sustitución de un L-aminoácido por un D-aminoácido esencialmente mueve la cadena lateral aproximadamente 120 grados desde su posición original, interrumpiendo así potencialmente la unión del péptido CNP a NEP. L-Phe en Phe7 puede estar sustituido con su enantiómero D, D-Phe.

Un beta aminoácido como, por ejemplo, ácido 3-amino-2-fenilpropiónico (o 2-fenil-beta-alanina), puede reemplazar el alfaaminoácido de tipo salvaje Phe7. El uso de un beta-aminoácido aumenta eficazmente la longitud de la cadena principal del péptido en una unidad de metileno. La resistencia a las proteasas puede resultar del cambio en la conformación del sustrato o del aumento de la distancia entre las cadenas laterales de aminoácidos.

Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP22 que tienen un alfa-aminoácido no natural, un beta-aminoácido o un isóstero de enlace peptídico incluyen:

GLSKGC (CH²NH) FGLKLDRIGSMSGLGC (Análogo A) (SEQ ID NO: 121);

GLSKGC-(N-Me-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (Análogo B) (SEQ ID NO: 122);

GLSKGC-(D-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (Análogo E) (SEQ ID NO: 123);

GLSKGCF-(tBu-Gly) -LKLDRIGSMSGLGC (Análogo F) (SEQ ID NO: 124);

GLSKGC-(3-Cl-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (G análogo) (SEQ ID NO: 125); y

GLSKGC- [NHCH²CH (Ph) CO] -GLKLDRIGSMSGLGC (Análogo H, formado usando ácido 3-amino-2-fenilpropiónico) (SEQ ID NO: 126).

Las variantes de CNP pueden tener una masa total caracterizada por los intervalos descritos generalmente en el presente documento, p. ej., desde aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa hasta aproximadamente 6 o 7 kDa, diseñados para aumentar la resistencia a la degradación de NEP, y están representados por la fórmula: (x)-Gly¹-Leu²-Ser³-(a)⁴-Gly⁵-(b)⁶-(c)⁷--(d)8-(e) 9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-Gly20-Gly21-Cys22-(z) (SeQ ID NO: 127), donde:

(x) y (z) independientemente pueden estar ausentes o pueden seleccionarse del grupo que consiste en compuestos sintéticos dirigidos al hueso tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoácidos útiles en el direccionamiento de hueso o cartílago tales como, por ejemplo, polyAsp y polyGlu; secuencias de aminoácidos derivadas de dominios de proteínas óseas dirigidos al hueso tales como, por ejemplo, osteopontina, osteocalcina y sialoproteína; restos poliméricos y no poliméricos que reducen el aclaramiento renal tales como, por ejemplo, PEGs cargados negativamente; polímeros que contienen, por ejemplo, aminoácidos, ácidos hidrófobos y / o carbohidratos; y polímeros hidrófilos sintéticos tales como, por ejemplo, PEGs;

puede ser la Lys de tipo salvaje en esa posición o puede ser reemplazado con una sustitución conservadora de aminoácidos o un aminoácido natural o no natural o peptidomimético que no tiene una amina primaria reactiva en una cadena lateral, incluyendo pero no limitado a Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, donde (a) puede ser Arg;

se puede seleccionar del grupo que consiste en Cys e isósteros de enlaces peptídicos entre Cys6 y Phe7 tales como, por ejemplo, Cys-CH²--NH;

puede seleccionarse del grupo que consiste en L-Phe; D-Phe; ácido 3-amino-2-fenilpropiónico; derivados N-alquilados de Phe, donde el grupo N-alquilo es metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo; y análogos de Phe, donde una o más posiciones orto, meta y / o para del anillo de benceno del análogo de Phe están sustituidas con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, ciano, C^1-6 alquilo lineal o ramificado, Ci-6 alcoxi lineal o ramificado halo-Ci-6 alquilo lineal o ramificado, C^3-10 cicloalquilo, heterociclilo, C^6-14 arilo y heteroarilo (los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tirosina, 3-clorofenilalanina, 2,3-cloro-fenilalanina, 3-cloro-5-fluoro-fenilalanina, 2-cloro-6-fluoro-3-metil-fenilalanina ), o donde el anillo de benceno del análogo de Phe se puede reemplazar con otro grupo arilo (los ejemplos no limitantes incluyen 1- y 2-naftilalanina) o con un grupo heteroarilo (los ejemplos no limitantes incluyen piridilalanina, tienilalanina y furilalanina);

puede seleccionarse del grupo que consiste en Gly, terc-butil-Gly (tBu-Gly), Thr, Ser, Val y Asn;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Leu, Ser, Thr e isósteros de enlaces peptídicos tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;

puede ser la Lys de tipo salvaje en esa posición o puede ser reemplazado con una sustitución conservadora de aminoácidos o un aminoácido natural o no natural o peptidomimético que no tiene una amina primaria reactiva en una cadena lateral, incluyendo pero no limitado a Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, donde en una realización (f) no es Arg;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Leu e isósteros de enlaces peptídicos tales como, por ejemplo, N-Me-Leu; puede seleccionarse del grupo que consiste en Ile, tBu-Gly e isósteros de enlaces peptídicos tales como, por ejemplo, N-Me-Ile;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, ácido 2-aminobutírico (Abu) y ácido 2-aminoisobutírico (Aib); y

puede seleccionarse del grupo que consiste en Leu, norleucina (Nle), homoleucina (Hleu), Val, terc-butil-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg e isósteres de enlaces peptídicos tales como, por ejemplo, N-Me-Leu.

Las variantes de CNP pueden tener una masa total caracterizada por los intervalos descritos generalmente en el presente documento, p. ej., desde aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa hasta aproximadamente 6 o 7 kDa, diseñados para aumentar la resistencia a la escisión de NEP, y están representados por la fórmula: (x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-(i)15-Ser16-(j)17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 128), donde:

(x) y (z) independientemente pueden estar ausentes o pueden seleccionarse del grupo que consiste en compuestos sintéticos dirigidos al hueso tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoácidos útiles en el direccionamiento de hueso o cartílago tales como, por ejemplo, polyAsp y polyGlu; secuencias de aminoácidos derivadas de dominios de proteínas óseas dirigidos al hueso y derivados de los mismos, tales como, por ejemplo, proteínas de fusión o secuencias peptídicas de osteopontina, osteocalcina, sialoproteína, etc.; restos que reducen el aclaramiento renal, incluidos, pero no limitados a, polímeros hidrófilos o solubles en agua tales como, por ejemplo, moléculas de PEG cargadas; y restos que comprenden, por ejemplo, PEGs, aminoácidos, carbohidratos y / o ácidos hidrófobos; puede ser la Lys de tipo salvaje en esa posición o puede ser reemplazado con una sustitución conservadora de aminoácidos o un aminoácido natural o no natural o peptidomimético que no tiene una amina primaria reactiva en una cadena lateral, incluyendo pero no limitado a Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, donde (a) puede ser Arg;

se puede seleccionar del grupo que consiste en Cys e isósteros de enlaces peptídicos entre Cys6 y Phe7 tales como, por ejemplo, Cys-CH²--NH;

puede seleccionarse del grupo que consiste en L-Phe; D-Phe; ácido 3-amino-2-fenilpropiónico; derivados N-alquilados de Phe, donde el grupo N-alquilo es metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo; y análogos de Phe, donde una o más posiciones orto, meta y / o para del anillo de benceno del análogo de Phe están sustituidas con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, ciano, C^1-6 alquilo lineal o ramificado, C^1-6 alcoxi lineal o ramificado halo-C^1-6 alquilo lineal o ramificado, C^3-10 cicloalquilo, heterociclilo, C^6-14 arilo y heteroarilo (los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tirosina, 3-clorofenilalanina, 2,3-cloro-fenilalanina, 3-cloro-5-fluoro-fenilalanina, 2-cloro-6-fluoro-3-metil-fenilalanina ), o donde el anillo de benceno del análogo de Phe se puede reemplazar con otro grupo arilo (los ejemplos no limitantes incluyen 1- y 2-naftilalanina) o con un grupo heteroarilo (los ejemplos no limitantes incluyen piridilalanina, tienilalanina y furilalanina);

puede seleccionarse del grupo que consiste en Gly, terc-butil-Gly, Thr, Ser, Val y Asn;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Leu, Ser, Thr e isósteros de enlaces peptídicos tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Lys, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln y Ser;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Leu, Asn e isósteros de enlaces peptídicos tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Ile, terc-butil-Gly (tBu-Gly), Asn e isósteros de enlaces peptídicos tales como, por ejemplo, N-Me-Ile;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Gly, Arg, Ser y Asn;

puede seleccionarse del grupo que consiste en Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, ácido 2-aminobutírico (Abu) y ácido 2-aminoisobutírico (Aib); y

puede seleccionarse del grupo que consiste en Leu, norleucina (Nle), homoleucina (Hleu), Val, terc-butil-Ala (tBu-Ala), Arg, Thr, Ser e isósteres de enlaces peptídicos tales como, p. ej., N-Me-Leu.

Para mejorar la administración de las variantes de CNP a los sitios diana de trastornos relacionados con las articulaciones (p. ej., osteoartritis), las variantes de CNP se pueden unir (p. ej., en el N-terminal y / o C-terminal) a los restos que se dirigen al hueso o al cartílago. Los ejemplos no limitantes de restos dirigidos a huesos o cartílagos incluyen bisfosfonatos; hidroxiapatita; glucosamina; colágeno (por ejemplo, colágeno tipo X); polyAsp; polyGlu; y secuencias de aminoácidos derivadas de dominios de proteínas óseas dirigidos al hueso tales como, por ejemplo, osteocrina, osteopontina, osteocalcina y sialoproteína.

Además de ser menos susceptibles a la escisión de NEP, las variantes de CNP tienen potencialmente una afinidad reducida por el receptor de aclaramiento de NPR-C, al tiempo que retienen la funcionalidad de CNP. Además de la degradación mediada por NEP, la vida media de CNP22 está influenciada por el receptor de aclaramiento, NPR-C, que comparte una homología de secuencia del 58% con el dominio de unión al péptido extracelular de NPR-B. CNP22 se une estrechamente no solo a NPR-B (afinidad 7-30 pM), sino también a NPR-C (11-140 pM) (Bennett, BD et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-67 (1991); Koller, K. J. & Goeddel, D. V., Circulation, 86: 1081-88 (1992); Suga, S. et al., Endocrinology, 130: 229-39 (1992)). Aunque todavía no se ha informado de la estructura cristalina de NPR-B, la homología de secuencia y las similitudes entre las estructuras cristalinas de NPR-C y NPR-A (He, X.-L. et al., Science, 293 (5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)) sugieren que NPR-B probablemente asume un pliegue estructural general similar.

Por lo tanto, se construyó un modelo de homología de NPR-B basado en la alineación de secuencia basada en la estructura y las estructuras cristalográficas de los siguientes sistemas relacionados: CNP unido a NPR-C, ANP unido a NPR-A y ANP unido a NPR-C (He, X.-L. et al., Science, 293 (5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)). Basado en observaciones de que el receptor parece determinar la conformación del péptido unido, y que NPR-B se parece más a NPR-A con respecto a la estructura primaria y propiedades funcionales, el modelo de homología NPR-B / CNP se construyó con la estructura cristalina NPR-A / ANP como modelo. Datos de señalización publicados de variantes de CNP (patente de EE.UU. No. 5,434,133 y Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2004/0138134 A1), y de variantes funcionales de ANP que ya no se unen a NPR-C (Cunningham, EMBO 13 (11) 2508-15, 1994) se utilizaron para refinar e interpretar el modelo NPR-B / CNP.

Las variantes de CNP pueden diseñarse para mejorar la selectividad de NPR-B basándose en un modelo estructural basado en homología del complejo NPR-B / CNP. Combinando los datos de la estructura experimental y computacional de los péptidos natriuréticos unidos a los diversos receptores con los datos funcionales publicados, se generaron variantes de CNP que continúan uniéndose a NPR-B, pero que potencialmente pueden tener una afinidad reducida por el receptor de aclaramiento de NPR-C. Por ejemplo, NPR-C tiene una inserción única en una estructura de bucle en el sitio de unión del péptido, colocando sus residuos de bucle más cerca de residuos de péptidos como CNP Gly8 (o ANP Gly9), en comparación con los residuos de bucle respectivos en NPR-A y NPR-B. Estudios anteriores indicaron que la mutación G9T en ANP contribuye a reducir la afinidad por NPR-C, mejorando así la selectividad de NPR-A (Cunningham, EMBO J., 13 (11): 2508-15 (1994)). En consecuencia, se generaron variantes de CNP para reemplazar el residuo Gly8 correspondiente con un residuo más grande (Ser, Val, Thr o Asn) para interrumpir la unión de c Np a NPR-C sin afectar su unión a NPR-B. Además, se introdujeron una o más mutaciones en el extremo C-terminal de CNP, que abarca Gly15 a Gly21, que se prevé que interaccione con residuos específicos del receptor, basándose en los análisis estructurales detallados de los complejos receptor / péptido. Por ejemplo, una mutación G19R en CNP22 no da como resultado una pérdida significativa de la actividad de señalización de NPR-B. Sin embargo, esta mutación no puede modelarse en la estructura cristalina disponible de NPR-C / CNP sin alterar las conformaciones de los residuos vecinos. Estas observaciones sugieren que la mutación G19R puede interrumpir selectivamente la unión de CNP a un receptor particular, como NPR-C.

Las variantes de CNP pueden tener sustitución(es) en uno o más sitios Gly en las posiciones 1, 5, 8, 15, 19 y 21, para reducir la flexibilidad conformacional y por tanto aumentar la especificidad del receptor. Análisis comparativos de estructuras cristalinas de ANP unidas a NPR-C y NPR-A (Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279: 28625-31 (2004); He, X ­ L., J. Mol. Biol., 361: 698-714 (2006)) indican que la flexibilidad conformacional de ANP puede jugar un papel importante en la determinación de la selectividad del receptor.

Las variantes funcionales de CNP con afinidad potencialmente reducida por NPR-C pueden tener una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: G1R, G1E, GSR, G5Q, G5S, F7Y, G8T, G8S, G8V, G8N, L9S, L9T, K10Cit, K10Q, K10S, I14N, G15R, G15S, G15N, G15Cit, S16Q, M17V, M17N, G19S, G19R, G19N, L20V, L20R, L20T, L20S, G21S, G21T, y G21R. Las variantes de CNP pueden tener sustituciones multipunto en las posiciones 1, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 19, 20 y / o 21, y opcionalmente pueden tener modificaciones en cualquiera de las otras posiciones en la secuencia de péptidos de la variante.

Las variantes de CNP de la presente pueden conjugarse con restos, hasta una masa total caracterizada por los intervalos descritos de forma general en la presente, p. ej., de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, en el N-terminal, el C-terminal y / o un sitio interno, para facilitar el direccionamiento de la articulación / cartílago, reducir el NPR-C y el aclaramiento renal, aumentar la resistencia a la degradación del NEP y / o mejorar la funcionalidad del CNP. Las variantes de CNP pueden no estar conjugadas con un resto polimérico en un sitio dentro de la región cíclica (correspondiente a Cys6 a Cys22 de CNP22). Los ejemplos no limitantes de restos poliméricos o no poliméricos que pueden conjugarse con las variantes de CNP incluyen compuestos sintéticos dirigidos al hueso como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de péptidos dirigidos a huesos / cartílagos tales como, por ejemplo, polyAsp y polyGlu; secuencias de péptidos derivadas de dominios de direccionamiento óseo de proteínas óseas tales como, por ejemplo, osteopontina, osteocalcina y sialoproteína; secuencias de péptidos derivadas de los dominios funcionales de proteínas morfogenéticas óseas tales como, por ejemplo, BMP2, BMp3, BMP5, BMP7 y BMP8a; secuencias de péptidos derivadas de polipéptidos de origen natriurético tales como, por ejemplo, NPPC, ANP y BNP; otros restos naturales poliméricos o no poliméricos tales como, por ejemplo, carbohidratos, ácidos grasos y fosfolípidos; polímeros hidrófilos sintéticos biocompatibles tales como, por ejemplo, PEG (o PEO); restos hidrófobos poliméricos o no poliméricos tales como, por ejemplo, ácido heptanoico y ácido pentanoico; y combinaciones de los mismos.

Las variantes de CNP de la presente pueden tener una actividad funcional sustancialmente similar o mejor que CNP22, por ejemplo, con respecto a la estimulación de la producción y señalización de cGMP. Las variantes de CNP pueden estimular in vitro o in vivo la producción de al menos aproximadamente el 50% del nivel de cGMP producido bajo la misma concentración de wtCNP22 (por ejemplo, 1 pM). Las variantes de CNP pueden retener al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de la actividad de estimulación de cGMP del CNP22 de tipo salvaje in vitro o in vivo. Las variantes de CNP pueden tener una actividad de estimulación de GMPc mejorada en comparación con CNP22. Las variantes de CNP pueden estimular in vitro o in vivo la producción de al menos aproximadamente 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% o más del nivel de cGMP producido bajo la misma concentración de wtCNP22 (por ejemplo, 1 pM).

C. Síntesis y purificación de variantes de CNP

Las variantes de CNP útiles en la presente pueden producirse mediante expresión recombinante, usando ciertas técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D. N. Glover, Ed. (1985); y Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Las variantes de CNP pueden producirse mediante un proceso recombinante que comprende cultivar en un medio una célula huésped que comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido variante de CNP unido a un segundo polinucleótido que codifica un péptido o proteína escindible en condiciones que dan como resultado la expresión de un polipéptido de fusión codificado por los polinucleótidos, donde el polipéptido de fusión comprende el polipéptido variante de CNP directamente unido al péptido o proteína escindible o unido indirectamente al mismo mediante un enlazador. La célula huésped puede transformarse con un vector de expresión que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido variante de CNP unido al polinucleótido que codifica el péptido o proteína escindible. El polipéptido de fusión puede expresarse como una proteína soluble o como un cuerpo de inclusión. El polipéptido de fusión expresado se puede aislar de la célula huésped o el medio de cultivo, y el polipéptido de fusión aislado se puede poner en contacto con un agente de escisión para liberar la variante de CNP.

Los métodos para producir variantes de CNP se describen en las Patentes de Estados Unidos 8,198,242, 8,377,884 y 8,598,121.

D. Variantes de CNP químicamente modificadas

La modificación química de las variantes de CNP puede potencialmente impartir propiedades ventajosas a los péptidos de CNP modificados, tales como mayor estabilidad y vida media y menor inmunogenicidad (para una discusión general de la modificación química de proteínas terapéuticas, ver Pharmazie, 57 (1): 5-29 (2002)). Además de la PEGilación, glicosilación y otros procedimientos de derivatización química, por ejemplo, modificación por fosforilación, amidación, carboxilación, acetilación, metilación y creación de sales de adición de ácido, amidas, ésteres y derivados de N-acilo, también pueden enmascarar regiones potencialmente inmunogénicas y / o regiones proteolíticamente sensibles (Science, 303: 480-482 (2004)).

Los ejemplos de modificaciones químicas incluyen, sin limitación, el método de adición de polímero de Bednarsaki y el método de reticulación de Altus Corporation para mejorar la estabilidad y la resistencia a proteasas y reducir la inmunogenicidad. Bednarsaki demostró que la adición de polímeros puede mejorar la estabilidad de la temperatura de la proteína (J. Am. Chem. Soc., 114(1): 378-380 (1992)) y Altus Corporation encontraron que la reticulación de glutaraldehído puede mejorar la estabilidad de la enzima.

La modificación química de polipéptidos se puede realizar de una manera no específica (que conduce a mezclas de especies derivatizadas) o de una manera específica de sitio (por ejemplo, basada en la derivatización dirigida por reactividad de macromoléculas de tipo salvaje y / o modificación selectiva de sitio usando una combinación de mutagénesis dirigida al sitio y modificación química) o, alternativamente, usando métodos de ligación de proteínas expresadas (Curr. Opin. Biotechnol., 13(4): 297-303 (2002)).

Variantes de CNP pegilado

Para una mayor estabilidad, las variantes de CNP (incluidas las que tienen adiciones, sustituciones y / o deleciones de aminoácidos) se pueden conjugar con polímeros hidrófilos, naturales o sintéticos. Los polímeros hidrófilos pueden ser solubles en agua de modo que los péptidos CNP conjugados con ellos no precipiten en un entorno acuoso (por ejemplo, fisiológico). Además, los polímeros hidrófilos son biocompatibles, es decir, no causan daño, toxicidad o una reacción inmunológica in vivo. Los polímeros hidrófilos pueden ser ramificados o no ramificados. Los polímeros hidrófilos no pueden estar ramificados.

Son posibles varios sitios de conjugación de una variante de CNP a un polímero hidrófilo, que incluyen, pero no se limitan a: (1) solo en el N-terminal; (2) solo en el C-terminal; (3) solo en un sitio interno (por ejemplo, Lys4); (4) tanto en el N-terminal como en el C-terminal; (5) en el N-terminal y un sitio interno; y (6) en el C-terminal y un sitio interno. Las variantes de CNP pueden conjugarse con un polímero hidrófilo solo en el extremo N-terminal. La conjugación puede ser solo en un sitio interno (p. ej., Lys4). La conjugación puede estar en el N-terminal y en un sitio interno (por ejemplo, Lys4). Para una mejor funcionalidad, las variantes de CNP pueden no estar conjugadas con un polímero hidrófilo en un sitio (por ejemplo, Lys10) dentro del dominio cíclico (correspondiente a Cys6 a Cys22 de CNP-22). Si la conjugación a un polímero hidrófilo se basa en la formación de enlaces con un grupo amino primario reactivo en la variante de CNP, la conjugación en un sitio interno (p. ej., Lys4 y / o Lys10) se puede prevenir mediante la sustitución de Lys4 y / o Lys10 con un aminoácido o peptidomimético natural o no natural que no contiene un grupo amino primario reactivo en una cadena lateral, tal como, por ejemplo, Gly, Ser, Arg, Asn, Gln, Asp, Glu o citrulina (Cit). Lys4 y / o Lys10 pueden reemplazarse con Arg. Lys10 no se puede reemplazar con Arg.

Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrófilos incluyen polímeros formados a partir de monómeros que llevan ácido carboxílico (por ejemplo, ácido metacrílico (MA) y ácido acrílico (AA)), alcoholes polivinílicos, polímeros formados a partir de monómeros que llevan hidroxilo (por ejemplo, metacrilato de hidroxietilo (HEMA) , metacrilato de hidroxipropilo (HPMA), metacrilamida de hidroxipropilo y metacrilato de 3-trimetilsililpropilo (TMSPMA)), óxidos de polialquileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli (etilenglicol) (PEG), poli (propilenglicol), mono-C¹-C¹⁰ alcoxi-PEGs (p. ej., monometoxi-PEG), tresilmonometoxi-PEG, ariloxi-PEG, acrilato de PEG (PEGA), metacrilato de PEG, propionaldehído de PEG, carbonato de bis-succinimidilo PEG, copolímeros de 2-metacriloiloxietil-fosforilcolina (MPC) y N-vinilpirrolidona (VP), poli (N-vinilpirrolidona) hidroxi funcional (PVP), SIS-PEG (SIS es un copolímero de bloque de poliestireno-poliisobutilenopoliestireno), poliestireno-PEG, poliisobutileno-PEG, PCL-PEG (PCL es policaprolactona ), PLA-PEG (PLA es ácido poliláctico), p Mm A-PEG (PMMA es poli (metacrilato de metilo)), Pd MS-PEG (PDMS es polidimetiloxanona), PVDF-PEG (PVDF es fluoruro de polivinilideno), tensioactivos PLURONIC ™ (óxido de polipropileno -co-polietilenglicol), poli (tetrametilenglicol), poli (L-lisina-g-etilenglicol) (PLL-g-PEG), poli (L-lisina-g-ácido hialurónico) (PLL-g-HA) , poli (L-lisinag-fosforilcolina) (PLL-g-PC), poli (L-lisina-g-vinil pirrolidona) (PLL-g-PVP), poli (etilimina-g-etilenglicol) (PEI -g-PEG), poli (etilimina-g-ácido hialurónico) (PEI-g-HA), poli (etilimina-g-fosforilcolina) (PEI-g-PC), poli (etilimina-g-vinil pirrolidona) (PEI-g-PVP), PLL-co-HA, PLL-co-PC, PLL-co- PVP, PEI-co-PEG, PEI-co-HA, PEI-co-PC, PEI-co-PVP, celulosa y derivados de los mismos (por ejemplo, hidroxietilcelulosa), dextrano, dextrinas, ácido hialurónico y derivados de los mismos (por ejemplo, hialuronato de sodio), elastina, quitosano, sulfato acrílico, sulfonato acrílico, sulfamato acrílico, sulfato metacrílico, sulfonato metacrílico, sulfamato metacrílico, polímeros y copolímeros de los mismos, y polímeros y copolímeros de combinaciones de los mismos.

El polímero hidrófilo puede ser poli (etilenglicol) (PEG), también llamado poli (óxido de etileno) (PEO). Como se usa en este documento, el término "PEG" o "PEO" abarca todas las formas de PEG, ramificadas y no ramificadas, que se pueden usar para derivatizar polipéptidos, incluyendo, sin limitación, mono-(C¹-C¹⁰) alcoxi-PEGs y ariloxi-PEGs.

Los conjugados PEG-CNP pueden comprender un polímero de PEG (o PEO) de fórmula (CH²CH²O)n, donde n es un número entero de aproximadamente 6 a aproximadamente 100, y el polímero de PEG es de aproximadamente 0,3 kDa a aproximadamente 5 kDa. n puede ser un número entero de aproximadamente 12 a aproximadamente 50, y el polímero de PEG es de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 2,5 kDa. n puede ser de aproximadamente 12 a aproximadamente 24, y el polímero de PEG es de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 1,2 kDa. El grupo hidroxilo terminal del polímero de PEG puede estar rematado con un grupo no reactivo. El grupo de protección terminal puede ser un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo inferior como metilo, de modo que el polímero de PEG termine en un grupo alcoxi. El polímero de PEG no puede estar ramificado. CNP-22 o variantes del mismo pueden conjugarse con un polímero de PEG solo en el N-terminal.

Los PEG y los PEO incluyen potencialmente moléculas con una distribución de pesos moleculares, es decir, están potencialmente polidispersas, dependiendo de la forma en que se preparen. La distribución de tamaño / masa de una preparación polimérica se puede caracterizar estadística mente por su peso molecular promedio en peso (Mw) y su peso molecular medio numérico (Mn), cuya relación se denomina índice de polidispersidad (Mw/Mn). Mw y Mn puede medirse mediante espectroscopia de masas. Las variantes de PEG-CNP conjugadas con un resto de PEG mayor de 1,5 kDa pueden exhibir un intervalo de pesos moleculares debido a la naturaleza polidispersa de la molécula de PEG parental. Por ejemplo, en el caso de mPEG2K (Sunbright ME-020HS, NOF Co.), las masas moleculares de las moléculas de PEG se distribuyen en un intervalo de aproximadamente 1,5 kDa a aproximadamente 3 kDa, con un índice de polidispersidad de 1,036. Por el contrario, los PEG conjugados con CNP-22 o variantes del mismo usando los reactivos Ms (PEG)n (n = 4, 8, 12 o 24, indicados como, por ejemplo, "PEO12" o "PEO24") de Pierce Biotechnology (Rockford, Illinois) están monodispersos, tienen una longitud de cadena discreta y un peso molecular definido.

Los métodos para generar polipéptidos que comprenden un resto de PEG se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5,824,784). Los métodos para preparar péptidos CNP PEGilados generalmente comprenden las etapas de (a) hacer reaccionar CNP-22 o una variante del mismo con un reactivo de PEGilación en condiciones adecuadas para unir PEG al péptido CNP (por ejemplo, en el N-terminal), y (b) obtener el producto(s) de reacción. Debido a que la PEGilación de un péptido CNP podría alterar significativamente su unión a NPR-B, dependiendo del tamaño del resto de PEG y la ubicación de la PEGilación, se pueden explorar diferentes tipos de condiciones de reacción de PEG y PEGilación. La química que se puede usar para la PEGilación de un péptido CNP incluye la acilación de la amina(s) primaria reactiva del péptido usando el éster NHS de metoxi-PEG (O - [(N-succinimidiloxicarbonil) -metil] -O'-metilpolietileno glicol). La acilación con metoxi-PEG-NHS o metoxi-PEG-SPA da como resultado un enlace amida que elimina cualquier carga de la amina primaria original. Las variantes de PEG-CNP designadas con el símbolo "PEO12" o "PEO24", así como las designadas con el símbolo "PEG1K", "PEG2K", "PEG5K" o "PEG20K", se PEGilan mediante la reacción de un grupo amino primario sobre el péptido con un reactivo de PEG con terminación de metoxi, activado por éster de NHS. Las variantes de PEG-CNP también se pueden preparar mediante otros métodos, p. ej., mediante aminación reductora que implica un grupo amino primario en el péptido y un aldehído de PEG, tal como, p. ej., PEG-propionaldehído o mono-C¹-C¹⁰ alcoxi o derivados ariloxi de los mismos (véase la patente de EE.UU. 5,252,714).

A diferencia de la síntesis de proteínas ribosómicas, la síntesis de péptidos sintéticos procede del C-terminal al N-terminal. Por consiguiente, Boc-PEG (que contiene terc-butiloxicarbonilo (Boc)) es un método para unir PEG al C-terminal de un péptido (RB Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85(14): 2149-2154 (1963)). Alternativamente, se puede emplear la química Fmoc (fluorenilmetoxicarbonilo) (E. Atherton y RC Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, IRL Press (Oxford, England (1989)).

Los métodos para preparar variantes de PEG-CNP proporcionan una mezcla sustancialmente homogénea de conjugados polímero-proteína. Después de la purificación, las preparaciones discretas de PEG-CNP son suficientemente puras para el ensayo in vitro e in vivo de propiedades biológicas. La naturaleza y extensión de la PEGilación se pueden determinar usando, por ejemplo, PAGE y análisis HPLC. Al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de la variante de CNP puede estar mono-PEGilado en el N-terminal. Para optimizar los efectos beneficiosos de la PEGilación sobre las propiedades biológicas de un CNP, se puede variar la longitud del polímero, la conformación (por ejemplo, ramificada o lineal) y / o la funcionalización (por ejemplo, añadiendo un grupo cargado negativamente) de un resto de PEG. Las variantes de CNP PEGiladas se prueban para determinar la resistencia a NEP, la farmacocinética y la bioactividad (por ejemplo, la capacidad de unirse a NPR-B y estimular la generación de cGMP). Las variantes de CNP PEGiladas que muestran una resistencia mejorada a NEP y al menos aproximadamente el 50% de la actividad estimulante de cGMP de CNP-22 pueden probarse adicionalmente, por ejemplo, in vitro en un modelo de acondroplasia basado en células de condrosarcoma de rata e in vivo en un modelo animal de acondroplasia murina.

E. Métodos de uso de variantes de CNP, composiciones farmacéuticas de variantes de CNP y vías de administración

Métodos de uso de variantes de CNP

Como se describe en los Ejemplos a continuación, los experimentos presentados aquí proporcionan evidencia de que las variantes de CNP en este documento son útiles en el tratamiento de la osteoartritis. Por consiguiente, la variante de CNP para usarse en un método en el presente documento comprende administrar la variante de CNP a un sujeto diagnosticado con osteoartritis. Como resultado, se puede disminuir la velocidad de degeneración del cartílago en el sujeto y, en algunos casos, se puede revertir (es decir, se puede inducir la regeneración del cartílago). En consecuencia, se pueden mejorar los diversos síntomas y biomarcadores asociados con la osteoartritis. Los ejemplos ilustran la utilidad de Gly-CNP-37 y Pro-Gly-CNP-37, aunque otras variantes de la presente invención también pueden probarse para determinar su eficacia y usarse de manera similar. En particular, Gly-CNP-37 y Pro-Gly-CNP-37, muestran indicaciones de un crecimiento del cartílago, movilidad y habilidades motoras dramáticamente mejoradas y una disminución significativa de la degeneración del cartílago.

La osteoartritis se puede diagnosticar basándose en el informe de los signos y síntomas de los pacientes, como se describe anteriormente, así como mediante imágenes médicas para determinar el daño del cartílago en una articulación en particular. Los métodos de obtención de imágenes incluyen radiografía, resonancia magnética (MRI por sus siglas en inglés), tomografía de coherencia óptica (OCT por sus siglas en inglés) y ultrasonido (US) (Gold et al., Bone J. 51: 278­ 88, 2012). Las imágenes a menudo pueden detectar estrechamiento articular, osteofitos y quistes subcondrales en el área articular, adelgazamiento del cartílago articular, cambios degenerativos de la médula subcondral y fusión ósea. La administración de variantes de CNP como se contempla en este documento puede mejorar uno o más síntomas de osteoartritis como se menciona en este documento, incluyendo degeneración del cartílago, crecimiento del cartílago, movilidad del paciente, estrechamiento de la articulación, osteofitos y quistes subcondrales en el área de la articulación, adelgazamiento del cartílago articular, cambios degenerativos de la médula subcondral y fusión ósea, así como otros conocidos en el campo por los expertos en la técnica.

En ciertos casos, la osteoartritis se ha dividido en osteoartritis primaria y secundaria (Stacy et al., Primary Osteoarthritis Imaging, 2012). La artritis primaria se refiere a un fenómeno idiopático, que a menudo ocurre en personas mayores y en articulaciones previamente intactas, sin un factor iniciador aparente. La osteoartritis secundaria puede referirse a una enfermedad degenerativa de las articulaciones sinoviales que resulta de alguna condición predisponente, generalmente un trauma que ha afectado negativamente el cartílago articular y / o el hueso subcondral de las articulaciones afectadas. La osteoartritis secundaria puede ocurrir en individuos relativamente jóvenes. En este documento se contempla el tratamiento de la osteoartritis tanto primaria como secundaria.

La gravedad de la artritis se puede puntuar en el Índice de Osteoartritis de las Universidades de Western Ontario y McMaster (WOMAC por sus siglas en inglés) (Kirkley et al., N Engl J Med 359: 1097-1107, 2008), la Forma-36 corta (SF36 por sus siglas en inglés) Physical Component Summary (Ware et al., Med Care 30: 473-483, 1992) y Escala de Autoeficacia de Artritis (ASES por sus siglas en inglés) (Lorig et al., Arthritis Rheum 32: 37-44, 1989). La gravedad radiográfica se puede evaluar mediante la clasificación de Kellgren-Lawrence modificada (Kellgren et al., Ann Rheum Dis 1957; 16: 494-502; Blackburn et al., J Rheumatol; 21: 675-679, 1994).

La osteoartritis puede afectar el cartílago de las articulaciones, incluidos, pero no limitados a, la rodilla, el hombro, el codo, el dedo, la mano, la muñeca, las caderas, el tobillo, el cuello, la columna y / o la espalda baja. Los síntomas de la osteoartritis incluyen dolor en las articulaciones, rigidez de las articulaciones, hinchazón de las articulaciones, disminución del rango de movimiento y debilidad o entumecimiento de los brazos y piernas si hay artritis en la espalda. Actualmente existe una necesidad insatisfecha de nuevos tratamientos eficaces de la osteoartritis. Al promover la producción de matriz y el crecimiento y diferenciación de condrocitos, se muestra que las variantes de CNP en este documento son útiles para contrarrestar los efectos no deseados de FGF^{- 2} y aumentar la síntesis de matriz en sujetos que padecen artritis, incluida la osteoartritis, tratando así la artritis, incluida la osteoartritis.

El daño o el crecimiento del cartílago se puede analizar por muerte / pérdida de condrocitos, pérdida de proteoglicanos (PG) y pérdida o fibrilación de colágeno. El daño y la mejora del cartílago después del tratamiento también se pueden evaluar midiendo los niveles de al menos un biomarcador específico del cartílago como se describe en el presente documento. La mejora de la movilidad se puede controlar mediante cualquiera de las escalas de movilidad y evaluación descritas en este documento y conocidas en la técnica.

El tratamiento de la osteoartritis a menudo incluye el manejo del dolor con antiinflamatorios como aspirina, NSAIDS, que incluyen naproxeno o ibuprofeno, acetaminofeno, glucocorticoides, esteroides y ácido hialurónico. Las formas moderadas a severas de artritis también se pueden tratar con cirugía para reemplazar la articulación afectada o eliminar parte del cartílago que pueda estar causando el dolor (Kirkey et al., N Engl J Med 359: 1097-1107, 2008). Una variante de CNP en este documento se puede administrar con otro tratamiento comúnmente usado para tratar la osteoartritis como se menciona en el presente documento o conocido por un médico tratante.

Composiciones farmacéuticas de variantes de CNP

Además, se incluye el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden una variante de CNP y uno o más excipientes, vehículos y / o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones pueden comprender además uno o más de otros agentes biológicamente activos (p.ej, inhibidores de proteasas, receptor de tirosina quinasas y / o receptor de aclaramiento NPR-C).

Las composiciones pueden comprender la variante de CNP deseada en al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de pureza. Las composiciones pueden contener menos de aproximadamente 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o 0,5% de contaminantes macromoleculares, tales como proteínas y otras variantes de CNP de otros mamíferos (p.ej., humano).

Los ejemplos no limitantes de excipientes, vehículos y diluyentes incluyen vehículos, líquidos, tampones, agentes de isotonicidad, aditivos, estabilizadores, conservantes, solubilizantes, tensoactivos, emulsionantes, agentes humectantes, adyuvantes, etc. Las composiciones pueden contener líquidos (p.ej, agua, etanol); diluyentes de diversos contenidos de tampón (p.ej, Tris-HCl, tampones de fosfato, acetato, tampones de citrato), pH y fuerza iónica; detergentes y agentes solubilizantes (p.ej, Polisorbato 20, polisorbato 80); antioxidantes (p.ej, metionina, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio); conservantes (p.ej, Timerosol, alcohol bencílico, m-cresol); y sustancias voluminosas (p.ej, lactosa, manitol, sacarosa). El uso de excipientes, diluyentes y vehículos en la formulación de composiciones farmacéuticas es conocido en la técnica; ver, p.ej, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, páginas 1435-1712, Mack Publishing Co. (Easton, Pensilvania (1990.

Por ejemplo, los vehículos incluyen, sin limitación, diluyentes, vehículos y adyuvantes, así como vehículos de implantes y cargas sólidas o líquidas inertes y no tóxicas y materiales encapsulantes que no reaccionan con el ingrediente o ingredientes activos. Los ejemplos no limitantes de vehículos incluyen solución salina tamponada con fosfato, solución salina fisiológica, agua y emulsiones (p.ej, emulsiones aceite / agua). Un portador puede ser un medio disolvente o dispersante que contenga, por ejemplo, etanol, un poliol (p.ej., glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), un aceite vegetal y mezclas de los mismos.

Las composiciones pueden ser formulaciones líquidas. Las formulaciones pueden comprender una variante de CNP en un intervalo de concentración de aproximadamente ^{0 ,1} mg / ml a aproximadamente ²⁰ mg / ml, o de aproximadamente 0,5 mg / ml a aproximadamente 20 mg / ml, o de aproximadamente 1 mg / ml a aproximadamente 20 mg / ml, o de aproximadamente 0,1 mg / ml a aproximadamente 10 mg / ml, o de aproximadamente 0,5 mg / ml a aproximadamente 10 mg / ml, o de aproximadamente ¹ mg / ml a aproximadamente ¹⁰ mg / ml.

Las composiciones pueden comprender una solución tampón o un agente tamponador para mantener el pH de una solución o suspensión que contiene CNP dentro de un intervalo deseado. Los ejemplos no limitantes de soluciones tampón incluyen solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con Tris y solución salina tamponada de Hank. Los agentes tamponadores incluyen, sin limitación, acetato de sodio, fosfato de sodio y citrato de sodio. También se pueden usar mezclas de agentes tamponadores. El agente tamponador puede ser ácido acético / acetato o ácido cítrico / citrato. La cantidad de agente tamponador adecuada en una composición depende en parte del tampón particular utilizado y del pH deseado de la solución o suspensión. Por ejemplo, el acetato es un tampón de pH más eficiente a pH 5 que a pH ⁶ , por lo que se puede usar menos acetato en una solución a pH 5 que a pH ⁶. El agente tamponador puede tener una concentración de aproximadamente 10 mM ± 5 mM. El pH de una composición puede ser de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7,5, o de aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente pH 7, o de aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente pH 6,5, o de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH ⁶ , o de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 5, o está a aproximadamente pH 5,0 ± 1,0.

Las composiciones pueden contener un agente de ajuste de la isotonicidad para hacer que la solución o suspensión sea isotónica y más compatible para la inyección. Los ejemplos no limitantes de agentes de isotonicidad incluyen NaCl, dextrosa, glucosa, glicerina, sorbitol, xilitol y etanol. El agente de isotonicidad puede ser NaCl. El NaCl puede estar en una concentración de aproximadamente 160 ± 20 mM, o aproximadamente 140 mM ± 20 mM, o aproximadamente 120 ± 20 mM, o aproximadamente 100 mM ± 20 mM, o aproximadamente 80 mM ± 20 mM, o aproximadamente 60 mM ± 20 mM.

Las composiciones pueden comprender un conservante. Los conservantes incluyen, pero no se limitan a, m-cresol y alcohol bencílico. El conservante puede estar en una concentración de aproximadamente 0,4% ± 0,2%, o aproximadamente 1% ± 0,5%, o aproximadamente 1,5% ± 0,5%, o aproximadamente 2,0% ± 0,5%.

Las composiciones pueden contener un anti-adsorbente (por ejemplo, para mitigar la adsorción de una variante de CNP al vidrio o plástico). Los anti-adsorbentes incluyen, sin limitación, alcohol bencílico, polisorbato ^{2 0} y polisorbato 80. El anti­ adsorbente puede estar en una concentración de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,5%, o de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,5%, o de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, o de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, o de de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, o de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, o de aproximadamente 1% a aproximadamente 2%.

Las composiciones pueden comprender un estabilizador. Los ejemplos no limitantes de estabilizadores incluyen glicerina, glicerol, tioglicerol, metionina y ácido ascórbico y sales de los mismos. Cuando el estabilizador es tioglicerol o ácido ascórbico o una sal de los mismos, el estabilizador puede estar en una concentración de aproximadamente ⁰ ,¹ % a aproximadamente 1%. Cuando el estabilizador es metionina, el estabilizador puede estar en una concentración de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,5%, o de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,2%. Cuando el estabilizador es glicerina, el estabilizador puede estar en una concentración de aproximadamente un 5% a aproximadamente un ^{1 0 0} % (puro).

Las composiciones pueden contener un antioxidante. Los antioxidantes ejemplares incluyen, sin limitación, metionina y ácido ascórbico. La relación molar de antioxidante a variante de CNP puede ser de aproximadamente 0,1: 1 a aproximadamente 15: 1, o de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 15: 1, o de aproximadamente 0,5: 1 a aproximadamente 10: 1, o de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 10: 1 o desde aproximadamente 3: 1 a aproximadamente ^{1 0} : ¹.

Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables en las composiciones, incluidas, sin limitación, sales de ácidos minerales (p.ej, clorhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato), sales de ácidos orgánicos (p.ej, acetato, propionato, malonato, benzoato, mesilato, tosilato) y sales de aminas (p.ej, isopropilamina, trimetilamina, diciclohexilamina, dietanolamina). Se encuentra una discusión detallada de las sales farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990)).

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en diversas formas, tales como comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, ungüentos y parches transdérmicos. Las formas de dosificación de las composiciones se pueden adaptar al modo de administración deseado de las composiciones. Para la administración oral, las composiciones pueden tomar la forma de, p.ej, una tableta o cápsula (incluida la cápsula de gelatina blanda), o puede ser, p.ej, una solución, suspensión o jarabe acuoso o no acuoso. Los comprimidos y cápsulas para administración oral pueden incluir uno o más excipientes, diluyentes y vehículos comúnmente usados, tales como manitol, lactosa, glucosa, sacarosa, almidón, almidón de maíz, sacarina sódica, talco, celulosa, carbonato de magnesio y agentes lubricantes (p.ej, estearato de magnesio, estearilfumarato de sodio). Si se desea, se pueden añadir agentes aromatizantes, colorantes y / o edulcorantes a las formulaciones sólidas y líquidas. Otros ingredientes opcionales para formulaciones orales incluyen, sin limitación, conservantes, agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones orales también pueden tener un recubrimiento entérico para proteger la variante de CNP del ambiente ácido del estómago. Los métodos para preparar formas de dosificación sólidas y líquidas son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica (ver, p.ej, Remington's Pharmaceutical Sciences, mencionado anteriormente).

Se pueden preparar formulaciones para administración parenteral, p.ej, como soluciones o suspensiones líquidas, como formas sólidas adecuadas para solubilización o suspensión en un medio líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Por ejemplo, las soluciones y suspensiones inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando diluyentes, vehículos, disolventes (p.ej, solución acuosa tamponada, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio), agentes dispersantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión y similares, adecuados. Además, pueden usarse aceites fijos estériles, ásteres grasos, polioles y / u otros ingredientes inactivos. Como ejemplos adicionales, las formulaciones para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener agentes de suspensión y agentes espesantes.

Las formulaciones de CNP ejemplares se describen en las Patentes de EE.UU. 8,198,242 y 8,598,121. Se contempla el uso de formulaciones de CNP que tienen un pH en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.

Las variantes de CNP se pueden formular en vehículos farmacéuticos para su administración a sujetos afectados por síntomas de osteoartritis u osteoartritis. Las formulaciones líquidas de variantes de CNP se pueden formular de acuerdo con cualquier combinación de los ingredientes y sus cantidades o concentraciones se describen a continuación:

Las composiciones que comprenden una variante de CNP también pueden ser formulaciones liofilizadas. Las formulaciones liofilizadas pueden comprender un tampón y un agente de carga y, opcionalmente, un antioxidante. Los tampones ejemplares incluyen, sin limitación, tampones de acetato y tampones de citrato. Los agentes de carga ejemplares incluyen, sin limitación, manitol, sacarosa, dextrano, lactosa, trehalosa y povidona (PVP K24). El manitol puede estar en una cantidad de aproximadamente un 3% a aproximadamente un 10%, o de aproximadamente un 4% a aproximadamente un 8%, o de aproximadamente un 4% a aproximadamente un 6%. La sacarosa puede estar en una cantidad de aproximadamente un 6% a aproximadamente un 20%, o de aproximadamente un 6% a aproximadamente un 15%, o de aproximadamente un 8% a aproximadamente un 12%.

Las formulaciones liofilizadas de variantes de CNP se pueden preparar a partir de formulaciones formuladas de acuerdo con cualquier combinación de los ingredientes y sus cantidades o concentraciones descritas a continuación:

Una formulación que comprende una variante de CNP puede tener un pH de aproximadamente 3-7, o aproximadamente 3- 6, o aproximadamente 3,5-6,5, o aproximadamente 4-6, o aproximadamente 4-5, o aproximadamente 4,5-5,5. Para pH 4- 5,5, un agente tamponador adecuado puede ser ácido acético / acetato (por ejemplo, acetato de sodio), y para pH 5,5­ 6, un agente tamponador adecuado puede ser ácido cítrico / citrato. El ácido cítrico / citrato (por ejemplo, citrato de sodio) también es un agente tamponador adecuado en el intervalo de pH 3-6 o pH 4-6. El agente tamponador puede tener una concentración en la formulación de aproximadamente 2-50 mM, o aproximadamente 2-40 mM, o aproximadamente 2-30 mM, o aproximadamente 5-30 mM, o aproximadamente 2-20 mM, o aproximadamente 5-20 mM, o aproximadamente 5­ 15 mM.

Para minimizar o evitar la desamidación de una variante de CNP, la variante se puede formular en codisolventes orgánicos farmacéuticamente aceptables, tales como glicerina, etanol y propilenglicol. Debido a que la desamidación ocurre por hidrólisis, la sustitución de agua por un codisolvente orgánico minimiza el contacto de la variante de CNP con el agua. La concentración de uno o más disolventes orgánicos en un sistema disolvente orgánico-acuoso puede ser, por ejemplo, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 99%, o aproximadamente el 100% si no se usa agua.

Además, para minimizar o evitar la desamidación de una variante de CNP, el agua se puede eliminar de la formulación mediante liofilización. Las formulaciones liofilizadas pueden contener cualquier combinación de los siguientes componentes: tampón: acetato de sodio y ácido acético, o citrato de sodio y ácido cítrico; isotonicidad / agente de carga: manitol (por ejemplo, 3-10%, 2-8% o 4-6%); sacarosa (por ejemplo, 6-20%, 5-15% u 8-12%); antioxidantes: metionina y / o ácido ascórbico con una relación molal de cada antioxidante a variante de CNP de aproximadamente 0,1: 1 a aproximadamente 1: 1, o de aproximadamente 0,5: 1 a aproximadamente 5: 1, o de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 15: 1, o de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 10: 1, o de aproximadamente 3: 1 a aproximadamente 10: 1.

La desamidación también puede minimizarse o evitarse almacenando una composición de CNP (por ejemplo, una formulación líquida o una formulación liofilizada) a una temperatura más baja, como a aproximadamente 5 °C, 0 °C, -10 °C, -20 °C, - 30 °C, -40 °C, -50 °C, -60 °C, -70 °C, -80 °C, -90 °C o -100 °C.

Para minimizar o evitar la oxidación de residuos oxidables (por ejemplo, metionina) en una variante de CNP, la variante se puede formular con uno o más antioxidantes. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, metionina, ácido ascórbico y tioglicerol. La oxidación de, por ejemplo, residuos de metionina también se puede minimizar o prevenir purgando oxígeno de un medio líquido (si es una formulación líquida) con nitrógeno o argón, y / o purgando oxígeno de un recipiente o envasado con nitrógeno o argón.

Para minimizar o prevenir la adsorción (p. ej., adsorción de una variante de CNP a plástico o vidrio), se puede agregar polisorbato 20, polisorbato 80 o alcohol bencílico, o una combinación de los mismos, a una formulación de CNP. Cada uno del anti-adsorbente(s) puede estar en una concentración de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,5%, o de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,5%, o de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, o de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, o de de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, o de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, o de aproximadamente 1% a aproximadamente 2%. Intervalo(s) ejemplar de anti-adsorbente(s) en la formulación incluye, sin limitación, desde aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,5% de polisorbato 20, desde aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,5% de polisorbato 80, y / o desde aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente aproximadamente 1,5% de alcohol bencílico.

Una formulación líquida de CNP puede comprender, o una formulación de CNP liofilizada puede prepararse a partir de una formulación que comprende, (1) un tampón de ácido acético / acetato (por ejemplo, acetato de sodio) que tiene una concentración de aproximadamente 30 mM ± 5 o 10 mM de agente tamponador y un pH de aproximadamente 4 ± 0,5 o 1, y (2) alcohol bencílico (p. ej., como conservante y / o anti-adsorbente) a una concentración de aproximadamente 1% ± 0,5%, y opcionalmente (3) sacarosa a una concentración de aproximadamente 10% ± 5%.

También se describen kits que contienen, p.ej, frascos, viales, ampollas, tubos, cartuchos y / o jeringas que comprenden una formulación líquida (por ejemplo, inyectable estéril) o una formulación sólida (por ejemplo, liofilizada). Los kits también pueden contener vehículos o portadores farmacéuticamente aceptables (p. ej., disolventes, soluciones y / o tampones) para reconstituir una formulación sólida (p. ej., liofilizada) en una solución o suspensión para administración (p. ej., por inyección), incluyendo, sin limitación, reconstituir una formulación liofilizada en una jeringa para inyección o para diluir el concentrado a una concentración más baja. Además, las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de, p.ej, polvo, gránulos o comprimidos estériles que comprenden una composición que contiene CNP. Los kits también pueden incluir dispositivos dispensadores, tales como dispositivos dispensadores de aerosol o inyección, inyectores tipo pluma, autoinyectores, inyectores sin aguja, jeringas y / o agujas.

Como ejemplo no limitativo, un kit puede incluir jeringas que tienen una cámara única o cámaras dobles. En el caso de las jeringas de cámara única, la cámara única puede contener una formulación de CNP líquida lista para inyectarse, o una formulación de CNP sólida (p. ej., liofilizada) o una formulación líquida de una variante de CNP en una cantidad relativamente pequeña de un sistema disolvente adecuado (p. ej., glicerina) que puede reconstituirse en una solución o suspensión inyectable. Para las jeringas de doble cámara, una cámara puede contener un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable (p. ej., sistema disolvente, solución o tampón), y la otra cámara puede contener una formulación de CNP sólida (p. ej., Liofilizada) o una formulación líquida de una variante de c Np en una cantidad relativamente pequeña de un sistema disolvente adecuado (por ejemplo, glicerina) que puede reconstituirse en una solución o suspensión, usando el vehículo o portador de la primera cámara, para inyección.

Como ejemplo adicional, un kit puede incluir uno o más dispositivos inyectores de pluma o autoinyectores, y cartuchos de doble cámara. Una cámara de un cartucho puede contener un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable (p. ej., sistema disolvente, solución o tampón), y la otra cámara puede contener una formulación de CNP sólida (p. ej., Liofilizada) o una formulación líquida de una variante de CNP en una cantidad relativamente pequeña de un sistema disolvente adecuado (por ejemplo, glicerina) que puede reconstituirse en una solución o suspensión, usando el vehículo o portador de la primera cámara, para inyección. Un cartucho puede comprender una cantidad de la variante de CNP que sea suficiente para la dosificación durante un período de tiempo deseado (por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, etc.). El inyector de pluma o autoinyector se puede ajustar para administrar una cantidad deseada de la formulación de CNP desde un cartucho.

Además, las composiciones farmacéuticas que comprenden una variante de CNP se pueden formular como un sistema de liberación lenta, liberación controlada o liberación sostenida para mantener un nivel de dosificación relativamente constante durante un período de tiempo deseado, como 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o 3 meses. Las formulaciones de liberación lenta, liberación controlada y liberación sostenida se pueden preparar usando, p.ej, sistemas poliméricos biodegradables {que pueden comprender, p.ej, polímeros hidrofílicos [p.ej, polilactida, poliglicólido, poli (láctido-glicólido)]}, y puede tomar la forma de, por ejemplo, micropartículas, microesferas o liposomas, como se conoce en la técnica.

Dosis y frecuencia de dosificación

Como se usa en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente activo (por ejemplo, una variante de CNP) se refiere a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico a un paciente. La cantidad puede variar de un individuo a otro y puede depender de varios factores, incluido el estado físico general del paciente. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad terapéuticamente eficaz de una variante de CNP, utilizando materiales y procedimientos disponibles públicamente. Por ejemplo, la cantidad de una variante de CNP utilizada para la terapia debería dar una tasa aceptable de reversión de la degeneración del cartílago o aumento del crecimiento del cartílago.

La frecuencia de dosificación para un individuo en particular puede variar dependiendo de varios factores, incluido el trastorno que se está tratando y la condición y respuesta del individuo a la terapia. Una composición farmacéutica que contiene una variante de CNP se puede administrar a un sujeto aproximadamente una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días o una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, una vez cada dos semanas, o mensualmente.

Las variantes de CNP de la presente pueden administrarse a pacientes en dosis terapéuticamente eficaces para tratar, mejorar o prevenir la osteoartritis y otras afecciones que tienen un síntoma asociado a la osteoartritis. La seguridad y eficacia terapéutica de las variantes de CNP se puede determinar mediante procedimientos farmacológicos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, como, por ejemplo, determinando la LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED⁵⁰ (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD⁵⁰ / ED⁵⁰. Normalmente se prefieren los agentes activos que presentan un gran índice terapéutico.

Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un rango de dosis para uso en humanos. La dosis normalmente se encuentra dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED⁵⁰, con poca o mínima toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La dosis terapéuticamente eficaz se puede determinar a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales.

Las variantes de CNP de la presente pueden administrar a una dosis en el intervalo de aproximadamente 5 o 10 nmol / kg a aproximadamente 300 nmol / kg, o de aproximadamente 20 nmol / kg a aproximadamente 200 nmol / kg. Las variantes de CNP se pueden administrar a una dosis de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 nmol / kg u otra dosis que el médico tratante considere apropiada. Las variantes de CNP se pueden administrar a una dosis de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 pg / kg, o aproximadamente 1, 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 mg / kg, u otra dosis que el médico tratante considere apropiada. Las dosis de las variantes de CNP en este documento se pueden administrar de acuerdo con la frecuencia de dosificación / frecuencia de administración descrita en este documento, incluyendo, sin limitación, diariamente, 2 o 3 veces por semana, semanalmente, cada 2 semanas, cada 3 semanas, mensualmente, etc.

La frecuencia de dosificación / administración de una variante de CNP para un sujeto particular puede variar dependiendo de varios factores, incluido el trastorno que se está tratando y la condición y respuesta del sujeto a la terapia. La variante de CNP se puede administrar en una sola dosis o en múltiples dosis por dosificación. La variante de CNP se pueda administrar, en una sola dosis o en múltiples dosis, diariamente, cada dos días, cada 3 días, 2 veces por semana, 3 veces por semana, semanalmente, quincenalmente, cada 3 semanas, mensualmente, cada 6 semanas, cada 2 meses, cada 3 meses o según lo considere apropiado el médico tratante.

Puede administrarse una variante de CNP para permitir períodos de crecimiento (por ejemplo, condrogénesis), seguidos de un período de recuperación. Por ejemplo, la variante de CNP puede administrarse por vía intravenosa, subcutánea, intraarticular según la invención o por otro modo diariamente o varias veces por semana durante un período de tiempo, seguido de un período sin tratamiento, luego se repite el ciclo. El período inicial de tratamiento (p. ej., administración de la variante de CNP diariamente o varias veces por semana) puede ser de 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas. El período sin tratamiento puede durar 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. El régimen de dosificación de la variante de CNP puede ser diario durante 3 días seguido de 3 días de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 1 semana seguida de 3 días o 1 semana de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 2 semanas seguidas de 1 o 2 semanas de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 3 semanas seguidas de 1, 2 o 3 semanas de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas seguidas de 1, 2, 3 o 4 semanas de descanso.

Modos de administración

Las variantes de CNP, o las composiciones farmacéuticas que las comprenden, pueden administrarse a sujetos de diversas formas tales como, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intraarticular según la invención, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o intratecal. Las variantes de CNP pueden administrarse mediante una única inyección subcutánea, intraarticular según la invención, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o intratecal una vez al día, una cada dos días, una vez cada tres días o una vez a la semana.

Las variantes de CNP también se pueden administrar mediante inyección directa en o cerca del sitio de la enfermedad. Además, las variantes de CNP pueden administrarse mediante la implantación de un depósito en el sitio de acción objetivo (por ejemplo, una articulación o un área de cartílago anormal o degenerado). Alternativamente, las variantes de c Np se pueden administrar por vía sublingual debajo de la lengua (por ejemplo, tableta sublingual) o por inhalación en los pulmones (por ejemplo, inhalador o aerosol), por administración en la cavidad nasal (por ejemplo, aerosol intranasal), por administración en el ojo (p. ej., gotas para los ojos) o mediante administración transdérmica (p. ej., mediante un parche en la piel). Las variantes de CNP también se pueden administrar por vía oral en forma de microesferas, microcápsulas, liposomas (sin carga o cargados (p. ej., catiónicos)), micropartículas poliméricas (p. ej., poliamidas, polilactida, poliglicólido, poli (lactida-glicólido)), microemulsiones y similares.

Otro método de administración es mediante bomba osmótica (p. ej., una bomba Alzet) o minibomba (p. ej., una minibomba osmótica Alzet), que permite la administración controlada, continua y / o de liberación lenta de la variante de CNP o composición farmacéutica durante un período predeterminado. La bomba osmótica o minibomba se puede implantar por vía subcutánea o cerca del sitio objetivo (por ejemplo, los huesos largos de las extremidades, las epífisis, etc.).

Será evidente para un experto en la técnica que las variantes de CNP o composiciones de las mismas también pueden administrarse por otros modos. La determinación del modo de administración más eficaz de las variantes de CNP o composiciones de las mismas está dentro del conocimiento del experto en la materia.

Las variantes de CNP se pueden administrar como formulaciones farmacéuticas adecuadas para, p.ej, administración oral (incluyendo bucal y sublingual), rectal, nasal, tópica, pulmonar, vaginal o parenteral (incluyendo intramuscular, intraarterial, intratecal, subcutánea, intraarticular según la invención e intravenosa), o en una forma adecuada para la administración por inhalación o insuflación. Dependiendo del modo de administración previsto, las formulaciones farmacéuticas pueden estar en forma de formas de dosificación sólidas, semisólidas o líquidas, como tabletas, supositorios, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, lociones, y similares. Las formulaciones se pueden proporcionar en forma de dosificación unitaria adecuada para la administración única de una dosis precisa. Las formulaciones comprenden una cantidad eficaz de una variante de CNP y uno o más excipientes, vehículos y / o diluyentes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros agentes biológicamente activos.

Terapia de combinación

Se puede usar una variante de CNP en combinación con uno o más de otros agentes activos útiles para tratar, mejorar o prevenir la osteoartritis. Los otros agentes activos pueden potenciar los efectos de la variante de c Np y / o ejercer otros efectos farmacológicos además de los de la variante de CNP. Ejemplos no limitantes de agentes activos que pueden usarse en combinación con las variantes de CNP en este documento son otros péptidos natriuréticos (por ejemplo, BNP) e inhibidores (por ejemplo, antagonistas) de peptidasas y proteasas (por ejemplo, NEP y furina), NPR-C y tirosina quinasas (por ejemplo, Fg f R-3). Los ejemplos de inhibidores de NEP incluyen, sin limitación, tiorfano y candoxatril. El uso conjunto de un inhibidor de NPR-C también puede prolongar la vida media de la variante de CNP mediante la inhibición del aclaramiento de la variante por NPR-C.

La variante de CNP se puede administrar en combinación con antiinflamatorios o analgésicos como un agente antiinflamatorio, un NSAID, un corticosteroide y ácido hialurónico.

Para lograr el resultado terapéutico apropiado en las terapias de combinación, generalmente se administraría al sujeto la composición de CNP y otra terapia(s) en una cantidad combinada eficaz para producir el resultado terapéutico deseado (p.ej, cartílago restaurado o disminución de la degeneración del cartílago). Este proceso puede implicar la administración de la composición de CNP y otro agente(s) terapéutico al mismo tiempo. La administración simultánea se puede lograr mediante la administración de una única composición o formulación de proteína farmacológica que incluya tanto la variante de CNP como otro agente(s) terapéutico. Alternativamente, el otro agente(s) terapéutico se pueden tomar por separado aproximadamente al mismo tiempo que una formulación farmacológica (por ejemplo, tableta, inyección o bebida) de la variante de CNP. La variante de CNP también se puede formular en un producto alimenticio como brownies, panqueques o pasteles, aptos para la ingestión.

En otras alternativas, la administración de la variante de CNP puede preceder o seguir a la administración del otro agente(s) terapéutico en intervalos que varían de minutos a horas. Cuando el otro agente(s) terapéutico y la composición de CNP se administran por separado, generalmente se aseguraría que la variante de CNP y el otro agente(s) terapéutico se administran dentro de un tiempo apropiado entre sí de modo que tanto la variante de CNP como el otro agente(s) terapéutico puede ejercer, de forma sinérgica o aditiva, un efecto beneficioso sobre el paciente. Por ejemplo, se puede administrar la composición de CNP dentro de aproximadamente 0,5 a 6 horas (antes o después) del otro agente o agentes terapéuticos. La composición de CNP se puede administrar dentro de aproximadamente 1 hora (antes o después) del otro agente(s) terapéutico.

Identificación y seguimiento de poblaciones de pacientes

Se pueden establecer protocolos para identificar sujetos adecuados para la terapia con CNP. Por ejemplo, los pacientes adecuados pueden identificarse usando técnicas de análisis de líquido sinovial / aspiración articular, rayos X y / o resonancia magnética. También se pueden establecer protocolos para determinar si un paciente dado responde a la terapia con CNP. Por ejemplo, para el tratamiento de la osteoartritis, se pueden medir indicadores de crecimiento, como mediciones del crecimiento del cartílago y evaluaciones de la movilidad.

Un marcador de señalización de CNP es cGMP (guanosina 3',5' monofosfato cíclico). El nivel de esta molécula de señalización intracelular aumenta después de que el CNP se une a su receptor análogo NPR-B y lo activa. Los niveles elevados de cGMP se pueden medir a partir de extractos de cultivos celulares (in vitro) después de la exposición al CNP, los medios acondicionados de estudios óseos ex-planta (ex vivo) después de la exposición al CNP, y en el plasma (in vivo) a los pocos minutos de la administración de CNP por vía subcutánea, intravenosa o mediante otras vías de administración conocidas en la técnica.

Los analitos específicos del cartílago (o marcadores asociados al cartílago) también se pueden medir para evaluar la eficacia del CNP. Por ejemplo, los fragmentos de colágeno de tipo II escindido son un marcador específico del cartílago para la renovación del cartílago. El colágeno de tipo II es el principal componente orgánico del cartílago y los fragmentos de colágeno de tipo II (colágeno escindido) se liberan a la circulación y, posteriormente, se secretan en la orina, tras la renovación del cartílago. El recambio de cartílago precede a la formación de hueso nuevo.

Otros biomarcadores potenciales para la formación y el crecimiento o la degeneración del cartílago incluyen el sulfato de condroitina agrecano (marcador específico del cartílago para el recambio del cartílago), propéptidos del colágeno tipo II (marcador específico del cartílago para la formación del cartílago, antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA por sus siglas en inglés), sulfato de condroitina agrecano, syndecan-3 y anexina VI. Los biomarcadores asociados al cartílago se pueden medir, p. ej., en suero a partir de estudios in vivo de la eficacia / farmacodinámica y de los medios condicionados de estudios ex vivo, utilizando kits disponibles comercialmente.

El nivel de al menos un biomarcador asociado al cartílago puede ensayarse o medirse en un sujeto al que se le ha administrado una variante de CNP para controlar los efectos de la variante de CNP sobre la formación y el crecimiento del cartílago in vivo. Por ejemplo, un aumento en el nivel de al menos un biomarcador asociado al hueso o al cartílago puede indicar que la administración de una variante de CNP tiene un efecto positivo sobre el crecimiento óseo y es un tratamiento útil para las displasias esqueléticas y otras enfermedades relacionadas con el hueso o el cartílago o trastornos asociados con una disminución de la actividad del CNP. Los ejemplos de biomarcadores asociados al cartílago incluyen, pero no se limitan a, CNP (por ejemplo, niveles endógenos de CNP), cGMP, propéptidos de colágeno tipo II y fragmentos del mismo, colágeno tipo II y fragmentos del mismo, propéptidos del colágeno tipo I y fragmentos del mismo, colágeno tipo I y fragmentos del mismo, en proliferación antígeno nuclear celular (PCNA por sus siglas en inglés), condroitín sulfato de agrecano, sindecan-3 y anexina VI.

Los biomarcadores pueden medirse obteniendo una muestra biológica de un sujeto al que se le administrará, se le está administrando o se le administrará una variante de CNP. Los biomarcadores se pueden medir usando técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, Western Blot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y ensayo de actividad enzimática. La muestra biológica puede ser sangre, suero, orina u otros fluidos biológicos.

Los aspectos y detalles adicionales serán evidentes a partir de los siguientes ejemplos, que pretenden ser ilustrativos más que limitantes.

F. Ejemplos

EJEMPLO 1:

Modelo de osteoartritis de rata

Un desgarro unilateral del menisco medial en ratas de 275-300 gramos dará como resultado una degeneración del cartílago rápidamente progresiva, caracterizada por pérdida de condrocitos y proteoglicanos, fibrilación, formación de osteofitos y clonación de condrocitos. Este modelo se realiza mediante la sección transversal del ligamento colateral medial justo debajo de su unión al menisco, de modo que cuando se abre el espacio articular, el menisco se refleja hacia el fémur. El menisco se corta en su punto más estrecho (lejos de los huesecillos) teniendo cuidado de no dañar la superficie tibial y asegurándose de que la sección resultante produzca mitades de menisco anterior y posterior separadas y libremente móviles.

Se producen cambios degenerativos progresivos del cartílago y, a las 3-6 semanas después de la cirugía, la degeneración del cartílago tibial puede ser focalmente grave en el 1/3 externo de la tibia con cambios degenerativos de menor gravedad en el 1/3 medio e interno. Los osteofitos son, en última instancia, bastante grandes (tibia medial) y aumentan progresivamente de tamaño. El modelo es progresivo y da como resultado la pérdida total de cartílago (hasta el hueso quemado) en 12 meses en prácticamente todas las ratas, con lesiones que son razonablemente consistentes. Las ratas reanudan la carga de peso inmediatamente después de la cirugía y el análisis de la marcha sugiere poco o ningún cambio en la carga de la rodilla operada. Debido a la rápida progresión de la degeneración del cartílago, los efectos protectores no siempre son evidentes en el 1/3 externo del cartílago tibial, aunque el análisis zonal puede revelar efectos del tratamiento en el 1/3 medio e interno. Se producen cambios sustanciales en los huesos subcondrales y epifisarios en la tibia medial subyacente a las áreas de mayor gravedad de la lesión. Estos varían en magnitud y tipo desde un aumento de la basofilia de la capa de cartílago calcificado con pequeñas fracturas en el hueso subcondral hasta el colapso manifiesto del cartílago articular en áreas de resorción ósea en la epífisis con esclerosis ósea circundante. Por lo tanto, este modelo ofrece la oportunidad de evaluar no solo los efectos condroprotectores de los agentes, sino también las actividades de conservación ósea. El modelo es de duración relativamente corta y los animales son muy consistentes en su respuesta a la cirugía.

Este modelo de rata se usó para determinar el efecto de las variantes de CNP en la desaceleración o reparación del daño del cartílago en la osteoartritis, donde el CNP se administra en respuesta a una lesión o trauma articular. En este modelo, se introdujo un desgarro en el menisco para provocar una lesión articular que da como resultado la degeneración del cartílago y la osteoartritis (Janusz et al., Osteoarthritis Cartilage, 10: 785-791, 2002). Las ratas Lewis macho recibieron una meniscectomía medial unilateral el día 0; la administración del vehículo de control o la variante de CNP Gly-CNP-37 comenzó el día 7; y los animales se sacrificaron el día 29 para el análisis histopatológico de las articulaciones afectadas. Se administró Gly-CNP-37 (proporcionado a 0,71 o 2,2 mg / ml en el vehículo de control) o el vehículo de control solo mediante inyecciones intraarticulares (IA) tres veces por semana (M, W, F) durante 3 semanas. La eficacia terapéutica se evaluó mediante análisis de la marcha y examen histopatológico de la muerte de condrocitos / degeneración del cartílago en la rodilla.

Cirugía

En particular, los animales de cirugía se anestesiaron con isoflurano y se preparó el área de la rodilla derecha y la parte inferior de la pierna para la cirugía. Para el desgarro del menisco, se hizo una incisión en la piel sobre la cara medial de la rodilla y se seccionó el ligamento colateral medial después de ser expuesto mediante disección roma. El menisco medial se cortó en todo su espesor para simular un desgarro completo y la herida se cerró. Noventa minutos (90 min) después de la cirugía, los animales fueron tratados con una dosis de acetaminofén (100 mg / kg, PO) en CMC al 1% (2 ml / kg, 50 mg / ml). Se administró una dosis de seguimiento 24 horas después de la cirugía (según fuera necesario).

Histopatología

Para el análisis histopatológico, se recolectaron las articulaciones operadas de las ratas sacrificadas. Después de 4-6 días en descalcificador de ácido fórmico al 5%, las articulaciones operadas se cortan en dos mitades aproximadamente iguales en el plano frontal y se embeben en parafina. Se cortaron secciones de cada rodilla derecha operada en pasos de aproximadamente 160 pm y se tiñeron con azul de toluidina. Para evaluar los efectos de Gly-CNP-37 sobre el desarrollo de la osteoartritis, se midieron o puntuaron los siguientes parámetros para cada una de las articulaciones tratadas y se compararon con las articulaciones de control tratadas con vehículo: degeneración del cartílago, profundidad de la lesión, ancho de la lesión, daño a la capa de cartílago calcificada y hueso subcondral, engrosamiento / esclerosis del hueso trabecular subcondral / epifisario tibial medial, espesor del osteofito, daño del colágeno, espesor de la placa de crecimiento y reparación del ligamento colateral medial / sinovial.

Para algunos parámetros (donde se indique), las diferencias regionales a lo largo de la meseta tibial se tienen en cuenta dividiendo cada sección en tres zonas (1 exterior, 2 medio, 3 interior).

Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney (no paramétrica). Si corresponde, los datos también se pueden analizar más a fondo en todos los grupos, utilizando un análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía) o una prueba de Kruskal-Wallis (no paramétrica), junto con la prueba posterior de comparación múltiple apropiada. Las pruebas estadísticas hacen ciertas suposiciones con respecto a la normalidad de los datos y la homogeneidad de la varianza, y es posible que se requieran análisis adicionales si las pruebas dieron como resultado violaciones de estas suposiciones. La significancia para todas las pruebas se estableció en p <0,05.

Degeneración general del cartílago tibial y femoral medial

La degeneración general del cartílago se determinó para cada articulación mediante una evaluación de la muerte / pérdida de condrocitos, la pérdida de proteoglicanos (PG) y la pérdida o fibrilación de colágeno, y se puntuó como se indica en la Tabla 1.

TABLA 1: Criterios de puntuación histopatoló icos para la de eneración del cartíla o

Se calculó una suma de tres zonas para la degeneración del cartílago, además de expresar los datos para cada zona. Las ratas tratadas con Gly-CNP-37 a dosis baja (35,5 pg / dosis) o alta (110 pg / dosis) mostraron una reducción significativa en la degeneración del cartílago en la tibia (Figura 1) en comparación con las ratas de control no tratadas.

Profundidad y ancho de la lesión tibial medial

La profundidad de cualquier tipo de lesión (profundidad de la lesión) y la profundidad hasta la marca de marea (profundidad total) se midieron con un micrómetro ocular en el área de mayor gravedad de la lesión en cada una de las tres zonas de la meseta tibial. A partir de estas mediciones, se calculó una relación de profundidad para cada articulación dividiendo la profundidad de la lesión por la profundidad total. La profundidad total hasta la marca de marea puede servir como una medida promedio del grosor del cartílago en cada una de las tres zonas para comparar los anabólicos cuando se toman medidas en el punto medio de la zona. La Figura 2 muestra que la relación de profundidad mejoró en los grupos tratados con Gly-CNP-37 en comparación con los controles tratados con vehículo. El ancho del cartílago afectado por cualquier degeneración (pérdida de células, pérdida de proteoglicanos o daño de colágeno), medido con un micrómetro ocular, también mejoró en los grupos tratados con CNP (Figura 3). Esta medición se extiende desde el origen del osteofito con degeneración del cartílago adyacente (1/3 externo) a través de la superficie hasta el punto donde la capa tangencial y el cartílago subyacente parecen histológicamente normales.

La degeneración sustancial del cartílago se define como la pérdida de condrocitos y proteoglicanos que se extiende a través de más del 50% del grosor del cartílago medido con un micrómetro ocular. Normalmente, en este modelo el daño del colágeno es leve (definido como ~25% de profundidad) o más; sin embargo, la pérdida de condrocitos y proteoglicanos es sustancial y se extiende al menos al 50% o más de la profundidad del cartílago, indicativo de regiones en las que se han producido cambios estructurales permanentes. Se midió la anchura de las articulaciones operadas que mostraban una degeneración sustancial del cartílago en animales tratados con Gly-CNP-37 y controles tratados con vehículo para evaluar la capacidad de las variantes de CNP para reducir la degeneración sustancial. Como se muestra en la Figura 4, los controles tratados con vehículo mostraron poca o ninguna reducción en la amplitud de la degeneración mientras que los animales tratados con Gly-CNP-37 mostraron una mejora superior al 50% en la degeneración sustancial del cartílago tibial.

Daño de la capa de cartílago calcificado y del hueso subcondral

El daño a la capa de cartílago calcificado y al hueso subcondral se puntuó utilizando los criterios de la Tabla 2.

TABLA 2: ri ri n i n hi l i r l ríl l ñ n r l.

El tratamiento con Gly-CNP-37 a la dosis más alta (110 |jg / dosis) redujo el daño al cartílago calcificado y al hueso subcondral de una puntuación de aproximadamente 2,4 en los animales tratados con vehículo a 1,3 en los animales tratados con Gly-CNP-37. El tratamiento con Gly-CNP-37 a la dosis más baja (35,5 jg / dosis) también redujo el daño al cartílago calcificado y al hueso subcondral, pero en menor grado que la dosis más alta.

Engrasamiento del hueso tibial, espesor del osteofito y puntaje total de la articulación

Se puntuó el engrosamiento / esclerosis del hueso trabecular subcondral / epifisario tibial medial basándose en los criterios mostrados en la Tabla 3 usando una comparación con la tibia lateral y / o tibias mediales izquierdas normales.

TABLA 3: Puntuación histopatoló ica del en rosamiento óseo

El tratamiento con Gly-CNP-37 en ambas dosis mostró una disminución observable en el engrosamiento / esclerosis del hueso trabecular subcondral / epifisario tibial medial en comparación con los controles tratados con vehículo, aunque los resultados no exhibieron importancia según lo establecido por el estudio actual.

El grosor del osteofito (marca de marea hasta el punto más lejano que se extiende hacia la membrana sinovial) se midió con un micrómetro ocular. Las puntuaciones se asignaron al osteofito más grande en cada sección (que normalmente se encuentra en la tibia) de acuerdo con los criterios de la Tabla 4.

TABLA 4: Puntuación del rosor del osteofito

El tratamiento con Gly-CNP-37 a la dosis alta (110 jg / dosis) redujo la medición del osteofito tibial en aproximadamente un 24% (p <0,05) y redujo la puntuación de osteofito tibial en aproximadamente un 34% (p <0,05). Los osteofitos son crecimientos de hueso que se producen en las articulaciones OA. Los datos de la puntuación de osteofitos demuestran que las variantes de CNP pueden disminuir el crecimiento de osteofitos, es decir, hueso. Esta observación es sorprendente e inesperada dado el papel conocido de CNP y variantes de CNP en la promoción del crecimiento óseo.

Las "puntuaciones totales de articulaciones" se calcularon para cada articulación sumando cada una de las puntuaciones de las tres zonas de la degeneración del cartílago tibial y femoral y la puntuación de osteofitos (puntuación total de las articulaciones con fémur), y sumando cada una de las puntuaciones de las tres zonas de solo la degeneración del cartílago tibial y el puntaje de osteofito (Puntaje total de articulaciones sin fémur). Como se muestra en la Figura 5, Gly-CNP-37 a 110 pg / dosis redujo significativamente la puntuación total de articulaciones sin fémur. El tratamiento con Gly-CNP-37 a la dosis más baja de 35,5 pg / dosis también mostró y mejoró la puntuación total articular sin fémur, aunque en menor grado en comparación con la dosis más alta. Cuando se incluye la puntuación para el fémur (Figura 6), los resultados muestran que Gly-CNP-37 disminuye la puntuación articular total en ambas dosis, pero no a un nivel significativo.

Daño del colágeno, grosor de la placa de crecimiento y reparación de ligamentos / sinoviales

El daño del colágeno a través de la meseta tibial medial (la sección más gravemente afectada de las dos mitades) se evaluó midiendo el ancho total de lo siguiente utilizando un micrómetro ocular y los siguientes parámetros: cualquier daño (la fibrilación varía desde la pérdida de espesor superficial hasta la total); daño severo (pérdida total o casi total de colágeno hasta la marca de marea,> 90% de espesor); daño marcado (se extiende a través del 61-90% del grosor del cartílago); daño moderado (se extiende hasta el 31-60% del espesor del cartílago); daño leve (se extiende a través del 11-30% del grosor del cartílago); y daño mínimo (muy superficial, que afecta solo al 10% superior).

El tratamiento con Gly-CNP-37 tanto en la dosis más baja como en la más alta dio como resultado menos áreas con degeneración severa, marcada y moderada en comparación con los controles no tratados.

El espesor de la placa de crecimiento se midió en todas las rodillas en los lados medial y lateral (2 medidas / articulación) en el punto medio aproximado de la fisis medial y lateral (asumiendo un área no tangencial de la sección) usando un micrómetro ocular. La administración de Gly-CNP-37 a una dosis de 110 pg redujo significativamente el espesor de la placa de crecimiento medial. Gly-CNP-37 a una dosis de 35,5 pg mostró una reducción en el grosor medial, pero no una reducción significativa mediante análisis estadístico (Figura 7). También se determinó un análisis diferencial, en el que se restó el grosor lateral del medial para determinar la diferencia entre los dos. La Figura 8 muestra que el uso de este análisis de Gly-CNP-37 a la dosis más alta redujo significativamente el grosor de la placa de crecimiento mientras que la dosis más baja redujo el grosor de la placa de crecimiento, pero no en la misma medida que la dosis más alta.

La reparación del ligamento colateral medial / sinovial también se analizó midiendo el grosor de la reparación del ligamento sinovial / colateral medial en un área no tangencial de la sección utilizando un micrómetro ocular. Estas medidas no mostraron ninguna diferencia entre los grupos de tratamiento.

Análisis de la marcha

El análisis de la marcha se realizó aplicando tinta a la superficie ventral del pie y documentando la carga de peso durante el movimiento (huellas) a través del papel. Las patas traseras de las ratas se colocaron en tinta y luego las ratas se colocaron sobre papel y se les permitió caminar en toda su longitud. La marcha se puntuó visualmente utilizando los criterios de la Tabla 5 (las descripciones se refieren a la pierna enferma / afectada).

TABLA 5: Criterios de puntuación del análisis de la marcha

Los animales tratados con Gly-CNP-37, a la dosis mayor o menor, mostraron una mejora en la movilidad y la marcha desde aproximadamente el día 15 al día 28 del estudio (Figura 9). También se calculó el área bajo la curva (AUC por sus siglas en inglés) de la puntuación de la marcha. La Figura 10 muestra que Gly-CNP-37 a la dosis más baja disminuyó la puntuación de la marcha en mayor medida que la dosis de CNP más alta, siendo la puntuación de la marcha más baja para ambas poblaciones tratadas en comparación con los controles no tratados.

Los resultados presentados en este Ejemplo 1 indican que el tratamiento de la osteoartritis con variantes de CNP tales como Gly-CNP-37 poco después del trauma tiene efectos beneficiosos sobre los síntomas de la osteoartritis, incluida la degeneración del cartílago y la movilidad de los sujetos afectados.

EJEMPLO 2:

Se realizaron estudios adicionales en ratas usando el modelo de rata y la metodología experimental del Ejemplo 1 para investigar el uso de una segunda variante de CNP, Pro-Gly-CNP-37, en el tratamiento de la osteoartritis y compararla con Gly-CNP-37.

TABLA 6: Diseño de estudios rupos

Como se resume en la Tabla 6, se trataron grupos de ratas con vehículo, Pro-Gly-CNP-37 o Gly-CNP-37. La vía de la dosis fue intraarticular (IA) o subcutánea (SC). La programación de la dosis fue la administración intraarticular tres veces por semana (L, M y V) durante 3 semanas (TIWx3W) o la administración subcutánea una vez al día durante aproximadamente 3 semanas (QDx3W). Las ratas se sometieron a cirugía el día 0 del estudio; Los grupos 1-5 se sometieron a cirugía aproximadamente 1 semana antes que los grupos 6-7 (es decir, el estudio se realizó de forma escalonada). Las inyecciones IA se administraron como una dosis fija, mientras que las inyecciones SC se administraron a una dosis determinada por peso basada en el peso corporal registrado más recientemente. Para todas las ratas, se midieron los pesos corporales antes de la dosis. Para una rata de 300 gramos, el régimen de dosis de IA semanal para los niveles bajo, medio y alto fue aproximadamente equivalente a 15, 50 y 150 |jg / kg / día, respectivamente. Las ratas se sacrificaron el día 25 después de la dosis final y se recolectaron sus articulaciones para análisis histopatológico y puntuación.

Farmacocinética y farmacodinamia plasmática

Se evaluaron las propiedades farmacocinéticas (PK) y farmacodinámicas (PD) de las variantes de CNP. Para el análisis PK / PD, se realizaron recolecciones de sangre cronometradas en 3 ratas / grupo / punto de tiempo de la siguiente manera: 15, 30, 60 y 120 minutos después de la dosificación para los grupos IA y 5, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la dosificación para los grupos SC. Después de la extracción de sangre, líquido de lavado sinovial (SLF, ~50 jL / rodilla) se recogieron de la rodilla izquierda (normal) y derecha (operada) de cada rata.

Histopatología e inmunohistoquímica

Las rodillas se conservaron para análisis histopatológico e inmunohistoquímico (IHC). El criterio de valoración principal fue el examen histopatológico de la muerte de los condrocitos y la degeneración del cartílago en la rodilla, incluida la IHC para el antígeno nuclear de células proliferativas (PCNA). Las diversas características histopatológicas se midieron y puntuaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, en particular, véanse las Tablas 1-5 para los criterios de puntuación.

El ancho total del cartílago tibial afectado por cualquier degeneración (pérdida de células, pérdida de proteoglicanos o daño del colágeno) se midió con un micrómetro ocular. Como se muestra en la Figura 11, Pro-Gly-CNP-37 administrado IA en las dosis media y alta redujo significativamente el ancho de degeneración del cartílago total en aproximadamente un 26% y 32% respectivamente. Por tanto, las dosis de 35,5 pg y 105 pg IA alcanzaron significación estadística para el ancho de degeneración del cartílago tibial.

El efecto de las variantes de CNP sobre la degeneración sustancial del cartílago según se define por la pérdida de condrocitos y proteoglicanos que se extiende a través de más del 50% del espesor del cartílago se midió en la meseta tibial mediante un micrómetro ocular. Se observó una reducción en respuesta a la dosis en la Degeneración Sustancial del Cartílago para Pro-Gly-CNP-37 administrado por vía intraarticular (Figura 12), con una reducción del 32% en la anchura observada con la dosis IA de 35,5 pg y una reducción del 36% observada con la Dosis IA de 105 pg. Se observó una reducción estadísticamente significativa para 150 pg / kg de Pro-Gly-CNP-37 administrado por vía subcutánea diariamente durante tres semanas (una reducción del 42% en el ancho).

El grosor del osteofito (marca de marea hasta el punto más lejano que se extiende hacia la membrana sinovial) se midió con un micrómetro ocular. Se observó una tendencia de respuesta a la dosis en la Puntuación de Osteofito Tibial Medial para Pro-Gly-CNP-37 administrado por vía IA (Figura 13), con una reducción del 15% observada con 35,5 pg IA y una reducción del 14% observada con 105 pg IA . Además, se observó una reducción estadísticamente significativa (p <0,05 mediante la prueba t) del 26% para Pro-Gly-CNP-37 administrado por vía subcutánea. Las reducciones de la puntuación de Osteofitos demuestran que las variantes de CNP pueden disminuir el crecimiento anormal de hueso (osteofitos) en las articulaciones OA. De nuevo, esta observación es sorprendente e inesperada porque se ha demostrado que las variantes de CNP y CNP promueven el crecimiento de huesos largos.

Se midió el grosor de la placa de crecimiento para cada uno de los grupos. El grosor de la placa de crecimiento medial y lateral fue significativamente mayor en los animales tratados con IA tanto con 35,5 pg de IA como con 105 pg de IA de Pro-Gly-CNP-37 (Figura 14). Además, el grosor de la placa de crecimiento medial y lateral también fue mayor en los animales tratados SC con Pro-Gly-CNP-37 frente al vehículo.

Las puntuaciones totales de las articulaciones (sin fémur) se calcularon sumando cada una de las puntuaciones de las tres zonas de la degeneración del cartílago tibial y la puntuación del osteofito. Como se ve en la Figura 15, se observó una reducción significativa en la gravedad de la puntuación articular para la administración IA de 35,5 y 105 pg de Pro-Gly-CNP-37 y también para 105 pg de Gly-CNP-37. También se observó una reducción significativa en la puntuación total de la articulación (menos el fémur) para Pro-Gly-CNP-37 administrado SC.

La figura 16 muestra las puntuaciones de sinovitis. La inflamación sinovial (principalmente infiltración de células mononucleares concentrada en el lado medial) se puntuó utilizando los criterios de la Tabla 7.

TABLA 7: Puntuación de Inflamación de Sinovio

No se observaron aumentos significativos en la gravedad de la puntuación de la sinovitis en todos los grupos de dosis. La endotoxina estaba por debajo del límite de cuantificación (<0,5 UE / ml) en todas las formulaciones, excepto en Gly-CNP-37 (0,78 UE / ml).

La Figura 17 muestra los cambios medios en el peso corporal (en gramos) desde el día -4 hasta el 25 para los diferentes grupos. Se observó una reducción significativa en el aumento de peso corporal para Pro-Gly-CNP-37 administrado IA tanto a 35,5 como a 105 pg / dosis y administrado SC a la dosis de 150 pg / kg / día.

La Figura 18 muestra las puntuaciones del análisis de la marcha de los grupos. La puntuación de la marcha se redujo significativamente (48%) para Pro-Gly-CNP-37 administrado por vía subcutánea en comparación con el vehículo el día 8.

La Figura 19 y la Tabla 8 muestran la farmacocinética del plasma para los animales tratados con Pro-Gly-CNP-37 (Grupos 2, 3 y 4 (administración IA) y Grupo 7 (administración SC)). Se analizaron muestras de plasma individuales para determinar los niveles de Pro-Gly-SNP-37 y se analizaron los perfiles de concentración media frente a tiempo utilizando un modelo no compartimental para la administración extravascular en el software Phoenix WinNonlin. Los datos de cada grupo están graficados y etiquetados (encima de cada línea) con el grupo de números correspondiente en la Figura 19. Pro-Gly-CNP-37 apareció rápidamente en la circulación sistémica después de inyecciones tanto IA como SC. La exposición a las inyecciones IA (Grupos 2, 3 y 4) fue generalmente proporcional a la dosis, sin cambios marcados en t i ^/2 y CL. Aunque la exposición fue similar a la dosis IA más baja investigada, las inyecciones SC una vez al día (Grupo 7) parecieron proporcionar una respuesta que fue similar en eficacia a las dos inyecciones IA de dosis más altas que se administraron tres veces por semana.

TABLA 8: Farmacocinética de variantes de CNP

Los datos indican que el tratamiento intraarticular con Pro-Gly-CNP-37 (35,5 y 105 pg) o Gly-CNP-37 (105 pg) tuvo efectos beneficiosos significativos sobre las lesiones histopatológicas de la osteoartritis inducida por desgarro del menisco medial en ratas.

El tratamiento subcutáneo una vez al día con 150 pg / kg / día de Pro-Gly-CNP-37 proporcionó una eficacia similar o mejor que los tratamientos intraarticulares. En general, los estudios muestran evidencia de efectos condroprotectores.

EJEMPLO 3:

Se usó un modelo de osteoartritis en etapa tardía para evaluar la eficacia de Pro-Gly-CNP-37 en osteoartritis predesarrollada (es decir, osteoartritis primaria). Como se describió anteriormente en los Ejemplos 1 y 2, se indujo osteoartritis en las patas traseras de ratas cortando el menisco. Sin embargo, en contraste con los Ejemplos 1 y 2, se permitió que la patología de la lesión progresara durante tres semanas antes del tratamiento IA o SC con Pro-Gly-CNP-37 simulando así OA preexistente (es decir, osteoartritis primaria). El diseño general del estudio se describe en la Tabla 9. En particular, las ratas Lewis macho se sometieron a una cirugía de desgarro meniscal medial unilateral el día 0 del estudio; la administración del vehículo de control o Pro-Gly-CNP-37 comenzó el día 21 del estudio; y los animales se sacrificaron en puntos de tiempo programados después de la última dosis el día 22 del estudio (grupos 1-4) o el día 40 del estudio (grupos 5-11). Los criterios de valoración primarios evaluados incluyeron el examen histopatológico de la muerte de condrocitos / degeneración del cartílago en la rodilla.

TABLA 9: Diseño rupos de estudios de osteoartritis en etapa tardía

Todos los animales sobrevivieron hasta los puntos de terminación del estudio programados. Al final del estudio, las ratas fueron sacrificadas y sus rodillas fueron recolectadas, fijadas y seccionadas para análisis histopatológico y puntuadas como en las Tablas 1-5 y 7. En la Tabla 10 se presenta un resumen de los resultados del estudio.

El tratamiento con Pro-Gly-CNP-37 (35,5 o 105 pg) en dosis IA, TIWx3W y el tratamiento con Pro-Gly-CNP-37 (150 pg / kg) en dosis SC, QDx3W mostró un efecto beneficioso de leve a significativo en la etapa avanzada de osteoartritis inducida por desgarro del menisco en rata según se determina mediante la evaluación de la histopatología de la rodilla. Los resultados del tratamiento IA con Pro-Gly-CNP-37 respondieron a la dosis.

Los parámetros de artritis fueron generalmente similares entre los grupos de control de vehículo, aunque la gravedad de la lesión aumentó ligeramente en los controles SC en comparación con los controles IA, con la excepción de la sinovitis, que se redujo en las ratas tratadas con SC. El aumento de peso corporal aumentó significativamente en los controles con vehículo SC 40 días después de la cirugía en comparación con los controles IA.

TABLA 10: Resumen de datos clínicos e histopatoló icos

Las ratas tratadas IA con 35,5 pg de Pro-Gly-CNP-37 tuvieron puntuaciones de degeneración del cartílago tibial de la zona 2 significativamente reducidas (31%) en comparación con los controles con vehículo IA. Las puntuaciones sumadas de la degeneración del cartílago tibial y los anchos sustanciales de la degeneración del cartílago tibial no se redujeron

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,2, 22 y 43 a 47 para usarse en un método de i) tratar la osteoartritis; ii) aumentar el crecimiento del cartílago en un sujeto con osteoartritis; iii) ralentizar la degeneración del cartílago; iv) mejorar un síntoma de osteoartritis; v) aumentar las habilidades motoras o la movilidad en un paciente con osteoartritis; vi) inhibir la degeneración de la movilidad en un paciente con osteoartritis; vii) aumentar el rango de movimiento en una articulación afectada de un sujeto que padece osteoartritis; viii) disminuir la rigidez en una articulación afectada de un sujeto que padece osteoartritis; ix) disminuir la inflamación sinovial en un sujeto; o x) prevenir la aparición de osteoartritis, en un sujeto que lo necesite, donde la variante de CNP se administra por vía intraarticular.

2. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 1, donde la osteoartritis es osteoartritis primaria o artritis secundaria.

3. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 2, donde la variante de CNP se administra después de que se ha producido la degeneración del cartílago.

4. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 2, donde la variante de CNP se administra en respuesta a una lesión o traumatismo articular.

5. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 4, donde la variante de CNP se administra dentro de un mes de la lesión o traumatismo articular.

6. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,2, 22 y 43 a 47 para usarse según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición que comprende la variante de CNP se administra 3 veces por semana, dos veces por semana, una vez por semana o una vez cada dos semanas.

7. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 1, donde se observa el aumento del crecimiento del cartílago o la ralentización de la degeneración del cartílago en una articulación del sujeto.

8. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 7, donde la articulación se selecciona del grupo que consta de una rodilla, un hombro, un codo, un dedo, una mano, una muñeca, una cadera, un cuello, una columna vertebral y una espalda baja.

9. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 1, donde el daño o el crecimiento del cartílago se analiza por muerte / pérdida de condrocitos, pérdida de proteoglicanos (PG) o pérdida o fibrilación de colágeno.

10. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la variante de CNP comprende además un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

11. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 10, donde la variante de CNP está en una formulación liofilizada preparada a partir de una formulación que comprende un tampón de ácido cítrico / citrato o un tampón de ácido acético / acetato que tiene un pH de 4 a 6.

12. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además la administración de un segundo agente, donde opcionalmente el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un agente antiinflamatorio, un NSAID, un corticosteroide y ácido hialurónico.

13. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según la reivindicación 1, donde el rango de movimiento de una articulación afectada se determina midiendo la flexión de la cadera, la extensión de la cadera, la abducción de la cadera, la aducción de la cadera, la flexión de la rodilla o la extensión de la rodilla.

14. La variante de CNP seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 2, 22 y 43 a 47 para usarse según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se identifica que el sujeto tiene niveles aumentados de al menos un biomarcador asociado al cartílago, opcionalmente donde el al menos un biomarcador asociado al cartílago se selecciona de el grupo que consiste en CNP, cGMP, propéptidos de colágeno tipo II y fragmentos del mismo, colágeno tipo II y fragmentos del mismo, osteocalcina, antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), propéptidos de procolágeno tipo I (PINP) y fragmentos del mismo, colágeno tipo I y fragmentos del mismo, y condroitín sulfato de agrecano.