JPH04120094A - トリ由来新規生理活性ペプチド（ニワトリｃｎｐ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ニワトリ由来のナトリウム利尿作用及び血圧
降下作用を有する新規な生理活性ペプチドに関する。さ
らに詳しくはＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＧＮＰ）に
帰属される新規生理活性ペプチドの単離・同定及びその
利用方法に関する。

（従来の技術） 近年、哺乳動物において心房及び脳から、ナトリウム利
尿ペプチド（ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ
；ＮＰ）と呼ばれる種々のペプチドが発見されてきた。

現在これらＮＰは、アミノ酸−次配列の類似性及びそれ
らの前駆体構造から、３つのタイプ、すなわちＡ型Ｎ　
Ｐ　（Ａ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐ
ｔｉｄｅ；ＡＮＰ）、Ｂ型Ｎ　Ｐ　（Ｂ−ｔｙｐｅ　ｎ
ａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ；ＢＮＰ）及び
Ｃ型Ｎ　Ｐ　（Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
　ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＮＰ）のいずれかに分類すること
ができる。

このうち、ＡＮＰ　−ＢＮＰは最初それぞれ心房、脳か
ら単離・同定されたことから、ＡＮＰは心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉ
ｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ）　、Ｂ　Ｎ　Ｐは脳ナトリウム利
尿ペプチド（ｂｒａｉｎ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐ
ｅｐｔｉｄｅ）とも呼ばれている（Ｍａｔｓｕｏ　Ｈ，
ａｎｄ　Ｎａｋａｚａｔｏ、Ｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
、Ｍｅｔａｂ、　Ｃ１１ｎ、Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、、１６
．４３，１９８７；　５ｕｄｏｈ、Ｔ、ｅｔ　ａＩ　　
Ｎａｔｕｒｅ　　３３２．７８．１９８８）　。しかし
現在、ＡＮＰは心房のみならず、脳にも存在しているこ
と、同様にＢＮＰは脳のみならず心房にも存在している
ことか判り、また、ＡＮＰ　−ＢＮＰはナトリウム利尿
作用及び血圧降下作用を示すことから、ＡＮＰ　−ＢＮ
Ｐはいずれも哺乳類の体液及び血圧の恒常性を調節する
ホルモンとして、また脳においては神経伝達物質として
作用していることが明らかになってきた。

ＧＮＰはごく最近５ｕｄｏｈらにより、ＡＮＰ−’ＢＮ
Ｐのいずれにも帰属されない新しいタイプのＮＰとして
ブタ脳から単離・同定された（Ｓｕｄｏｈ　、　Ｔｅｔ
　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ
、Ｃｏｍｍｕｎ、、１６８．８６３１９９０）。すなわ
ち、ＧＮＰは２２アミノ酸残基より成り、ＡＮＰ　−Ｂ
ＮＰと同様２個のシスティン残基を含んでおり、これが
分子内でジスルフィド結合を形成し、１７アミノ酸残基
より構成された環状構造を持っている。しかもこの環状
構造を形成しているアミノ酸−欠配列にはＡＮＰ−ＢＮ
Ｐのそれらと高い相同性が見いだされた。ＧＮＰの構造
上の特徴はＡＮＰ−ＢＮＰがいずれも上記環状構造のＣ
−末端部分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆる
ティル構造（ｔａｉｌ構造）を持っているのに対し、Ｇ
ＮＰにはこの構造かない。すなわち、ＧＮＰのＣ−末端
はシスティン残基で終わっている。このことから、ＧＮ
Ｐの構造はＡＮＰ・ＢＮＰと似ているが、これらとは全
く異なっていることが判り、また、ＧＮＰがナトリウム
利尿作用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本
を用いた弛緩活性でＡＮＰ　−ＢＮＰに比へ高い比活性
を示すことから、ＧＮＰは新しいタイプのＮＰであるこ
とが判った。

以上のことから、現在哺乳動物においては少なくとも３
つの異なったタイプに属する種々のＮＰペプチドが存在
し、これらが体液量及び血圧の恒常性（ホメオスタシス
）の調節に関与していることが判ってきた。なお、現在
までのところＧＮＰの生体内分布及び生理作用の詳細に
ついてはＡＮＰ−ＢＮＰはど明確には判っていない。

一方、非哨乳類を推動物においても、ＮＰの存在か確認
されている。しかし現在までに、カエルＡＮＰ、ニワト
リＮＰ及びウナギＡＮＰが単離・同定されているだけで
、非哺乳類動物のＮＰに関する情報は哺乳類のそれに比
べ、はるかに少ない（Ｓａｋａｔａ、Ｊ、、Ｋａｎｇａ
ｗａ、に、ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ１Ｉ＋ｍｕｎ、　、　１
５５．１３３８−１３４５．１９８８；　Ｍｉｙａｔａ
、Ａ、、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、Ｋａｎｇａｗａ、に
、ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｏ、ＨＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅｓ　、Ｃｏｍｍｕｎ　、　、　１５５　、
１３３０−１３３７．１９８８；　Ｔａｋｅｉ、Ｙ、、
Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ａ、、Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｔ、Ｘ
、、Ｎａｋａｊｉｍａ、に、ａｎｄ　５ａｋａｋｉｂａ
ｒａ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ
、Ｃｏｍｍｕｎ、、１６４，５３７−５４３．１９８９
）。

ところで、本発明者らはすでにＧＮＰに特異的な抗体を
作製し、これを用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
系を構築することにより、ＧＮＰの高感度アッセイ系を
確立している（特願平２−１８６５８３）。また、この
ＲＩＡ系を用い、哺乳類以外のを推動物の組織を探索し
た結果、抗ＣＮＰ抗血清に対し免疫活性を示すペプチド
（以後１ｒ−ＧＮＰと略す）がニワトリの脳内に存在し
ていることを見いだしている。このことから、ニワトリ
など鳥類でも哺乳類と同様、今までに知られているニワ
トリ心房より単離・同定されているニワトリＮＰ（この
ペプチドはＢＮＰに帰属されている）以外に、ＧＮＰに
帰属されるペプチドが存在している可能性が高い。しか
しながら、現在までに鳥類がらこのようなペプチドを単
離・同定した報告はない。

（発明が解決しようとする課題） 従って本発明では、鳥類から既に知られているニワトリ
ＮＰ以外の新規ＮＰペプチド、特にＧＮＰに帰属される
新規ＮＰを単離・同定し、このペプチドを提供する方法
を確立することを一つの目的とする。また、この新規Ｇ
ＮＰに帰属するペプチドを見いだすことにより、ＧＮＰ
の生理作用を明らかにすることをも目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明者は、前記したようにＧＮＰを高感度に測定でき
るＲＩＡ系を確立していることがら、この測定系を用い
ることにより、ニワトリの脳がら新規ＧＮＰを見いだす
ことを計画した。

本発明では、まず、ニワトリの脳を適当な酸性溶媒例え
ば氷酢酸などの中でホモジネートし、これを出発原料に
、ペプチドの精製に常用される各種精製法を組み合せ、
前記したＲＩＡ系を指標に分子量約３０００を示すペプ
チド画分を精製したところ、最終的には第３図に示すよ
うに、抗ＣＮＰ抗血清に対し免疫活性を示すペプチドを
単一で純粋な状態で精製することに成功した。次に、こ
のペプチドの一部を還元し、このペプチドに含まれるシ
スティン残基をカルボキシメチル化し、このペプチドの
アミノ酸−次配列を決定したところ、最終的にこのペプ
チドは以下に示す構造を有する新規ペプチドであること
を見いだした。

（式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と２２位のシスティン残基（Ｃｙｓ）は分
子内でＳ−８結合を形成している。） 以下本明細書において、この新規ペプチドをＣｈｉｃｋ
ｅｎ　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐ
ｔｉｄｅ　（ｃ　ＣＮ　Ｐ）と称する。

ｃＣＮＰのアミノ酸−次配列及び構造を、今までに知ら
れている３つのタイプに分類されたＮＰのそれらと比較
したところ（第５図参照）、ｃＣＮＰはＧＮＰに帰属さ
れる新規ペプチドであることが判った。すなわち、ｃＣ
ＮＰはＧＮＰ　（第５図ではブタＧＮＰと記載している
）と同様２２アミノ酸残基より構成されており、しかも
ＧＮＰの構造的特徴に一致してＣ−末端テイル構造を持
っていない。また、ｃＣＮＰのアミノ酸−次配列の相同
性をＡＮＰ、Ｂ、ＮＰ及びＣＮＰと比べると、ＣＣＮＰ
はＧＮＰと最も高い相同性を持っていることが判った。

実際、ｃＣＮＰとＧＮＰのアミノ酸−次配列の比較をす
ると２２アミノ酸残基のうち、１９アミノ酸残基は全く
同一であった。しかも、残りの異なる３つのアミノ酸残
基についても、そのアミノ酸残基の性質（アミノ酸の塩
基性及び疎水性などの性質）は同じであることが判った
。さらに、ｃＣＮＰをラットに投与するとナトリウム利
尿作用及び血圧降下作用を示すことを見いだした。

以上のことから、ｃＣＮＰはＧＮＰに帰属される新規ペ
プチドであることか判明し、本発明を完成するに至った
。

なお、本明細書でｃｃＮＰの構造が開示されたことから
、ｃＣＮＰを得るには本明細書に示したニワトリの脳か
ら精製する方法、さらに化学合成を用いる方法以外に、
遺伝子工学的手法を用いてこれを製造することもできる
。また、ｃＣＮＰは顕著なナトリウム利尿作用及び血圧
降下作用を示すことから、これを医薬品へと応用するこ
ともできる。

以下実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１．ニワトリ　からのｃｃＮＰの■ 本実施例において、各精製工程は、前記したＲＩＡでモ
ニターした。

ニワト月５０羽から４１７ｇの脳を摘出し、細断した後
、プロテアーゼを不活化するために３倍量（Ｖ／Ｗ）の
沸騰水で１０分間処理した。冷却後氷酢酸を最終濃度が
ＩＭになるように加え、この組織をポリトロンミキサー
を用いて５分間ホモジナイズした。次に、このホモシネ
イトを遠心分離することにより（２００００ｘ　ｇ　、
　３０分）、沈澱画分と上清画分に分離し、この上清画
分に４℃でアセトンを最終濃度が６６％になるように加
えて、沈澱を生じさせた。遠心分離上清を真空乾燥し、
２容量の水で希釈し、逆相Ｃ−１８カラムにがけた（９
０ＭＩＣｈｅｍｃｏ　ＬＣ−３ＯＲＢ　ＳＰｗ−Ｃ−Ｏ
ＤＳ）　。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）で洗浄後、カラムに吸着したペプチドを０．１％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む６０％アセトニトリル（
ＣＨ３ＣＮ）で溶出し、この溶出液を減圧濃縮した後、
１Ｍ酢酸に溶解し、１Ｍ酢酸で平衡化したＳＰ−セファ
デックスｃ−２５カラム（Ｈ”−ｆｏｒｍ、１．４ｘ１
５ｃｍ　；ファルマシア）を用いたイオン交換クロマト
グラフィーにがけた。

次に、カラムに吸着したペプチドを１Ｍ酢酸、２Ｍピリ
ジン、及び２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５，０）を用いて
溶出し、各溶出液による溶出画分を５Ｐ−Ｉ。

５ｐ−ｎ及びｓｐ−ｍとし、これらをそれぞれ凍結乾燥
した。なお、前記したＲＩＡの系で抗ＣＮＰ抗血清に免
疫活性を示すペプチドの８０％は、このｓｐ−ｍに回収
されていることが判った。このようにして得たＳ　Ｐ−
１１℃画分１４０■（乾燥重量）をセファッデクスＧ−
５０カラム（ｆｉｎｅ、３．Ｏｘ１５２ｃｍ；ファルマ
シア）を用いたゲル濾過にかけた。第１図にゲル濾過の
様子を示す。溶媒は１Ｍ酢酸、フラクションサイズは１
５ｄ／チユーブ、流速は２ＯＮ１／ｈである。第１図中
、各矢印はそれぞれ、ｌ）ウシ血清アルブミン、２）ｐ
ＢＮＰ−３２，３）ｐＢＮＰ−２６，４）α−ｐＡ　Ｎ
　Ｐ　［４−２８〕、５）ｐＣＮＰ及び６）ＮａＣ１の
溶出位置を示し、斜線付きボックスは前記したＲＩＡ系
で抗ＣＮＰ抗血清に対し免疫活性を示す（ｉｒ−ＣＮＰ
）フラクションを示す。

この免疫活性フラクション（フラクション番号５５−６
１）をまとめて凍結乾燥しく乾燥重量１９■）、さらに
ＣＭ陽イオン交換体によるＨＰＬＣカラム（ＴＳＫゲル
ＣＭ−２ＳＷ：　７．６ｘ３００ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）で
精製した。下記（Ａ）と（Ｂ）の溶媒系を使用し、（Ａ
）・（Ｂ）＝１００：０から５０５０まで８０分、（Ａ
）　：　（Ｂ）＝５０・５０からＯ：　１００まで２０
分の直線濃度勾配で、流速２．０１１１／ｈで溶出した
。

（Ａ）　１０ｍＭ　ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ６，６）’、
ＣＨｓＣｔ＋＝９０．’１Ｏ（Ｖ／Ｖ）（Ｂ）　１．０
１１１Ｍ　ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ６，６１，ＣＨｓＣＮ
＝９０：１０（Ｖ／Ｖ）溶出の様子を第２図に示す。こ
のクロマトグラフィーにおいて、１ｒ−ＣＮＰは溶出時
間４２−４４分のフラクションに殆ど単一のピークとし
て溶出されたが、ペプチドピークとしては単一でなかっ
た。そこでこの１ｒ−ＣＮＰフラクションをまとめて凍
結乾燥し、０．００２％トライトンＸ−１００を含有す
るｐＨ１，４（ｆ）０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に
溶解し、抗α−ＡＮＰ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のイ
ムノアフィニティーカラム（５００μｍ）を用いてさら
に精製した。このイムノアフィニティークロマトグラフ
ィーは、本発明者らによりα−Ａ　Ｎ　ｐ　（４−２８
）及びα−Ａ　Ｎ　Ｐ　（５−２８）について既に報告
されている（Ｕｅｄａ　、Ｓ、　、５ｕｄｏｈ、Ｔ、　
、　Ｆｕｋｕｄａ　、に、　、Ｋａｎｇａｗａ　、に、
　、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ
，、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ
ｍｕｎ、困、１０５５−１０６２．１９８７）　、カラ
ムに吸着されたペプチドを１０％ＣＨ，ＣＮを含むＩＭ
　ＣＨ，Ｃ０ＯＨ溶液で溶出し、μｍボンダスフェア（
Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ）　Ｃ−１８（３，９ｘ１５０
ｍｍ、　３００　Ａ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰ
ＬＣに供し、０．１％ＴＦＡに溶解した１０−６０％の
ＣＨ，ＣＮで、６０分間かけて流速１．０ｄ／分で溶出
した。第３図ａに示すとおり、１ｒ−ＧＮＰの大部分は
溶出時間３１分のフラクションに存在し、クロマトグラ
ムのペプチドの主ピークと一致した。このようにして実
質的に純粋なペプチド（ｃＣＮＰ）を得た。

第３図ａの逆相ＨＰＬＣにおけるピークの高さ及び免疫
活性に基づ＜ｃｃＮＰの精製収量は、４１７ｇのニワト
リ脳から出発して、約１８０ｐｍｏｌ　（４００ｎｇ）
であった。

実施例２．ＣＣＮＰの　６ 実施例１で得たｃＣＮＰ約１３５ｐｍｏｌを０．５Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩバッフｙ　−（ｐＨ８，５）中２０ｍ
Ｍノジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用い３７℃、４時
間反応させ、次いで６０ｍＭのヨード酢酸ナトリウム（
ｓｏｄｉｕｍ　ｗｏｎｏｉｏｄｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉ
ｄ）を加え２０分間処理することにより、ｃＣＮＰのＳ
−力ルボキシメチル体すなゎち（ＲＣＭ）ｃｃＮＰを得
た。

この（ＲＣＭ）ｃＣＮＰを、実施例１における最終精製
工程と同様のμｍボンダスフェア（Ｂｏｎｄａｓｐｈｅ
ｒｅ）　Ｃ−１８（３，９ｘ１５０ｍｍ、　３００　Ａ
、Ｗａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰＬＣに供し、０゜１
％ＴＦＡ中のアセトニトリル１０−６０％の直線勾配に
より、流速１．０ｄ／分で６０分間溶出することにより
精製した。

続いて、このようにして得た（ＲＯＭ）ｃｃＮＰを、ア
ミノ酸配列自動分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ　４７０Ａ／１２０Ａ）に供し、エドマン法に
よりアミノ酸−次配列を分析した結果、第４図に示す結
果が得られた。同図中、各アミノ酸は一文字表記で表さ
れ、ＣｍはＳ−カルボキシメチルシスティン残基を示す
。この結果に基づいて（ＲＣＭ）ｃＣＮＰのアミノ酸−
次配列が決定された（第５図参照）。

１３、ｃｃＮＰの　　合　　びＳ−８合　の火よ 実施例２のＡで決定したアミノ酸−次配列を基にｃＣＮ
Ｐをペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ　４３０Ａ）を用いた固相合成法で合成した。な
お、合成の際システィン残基のＳＨ保護基として４−メ
チルベンジル（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）基を用
い、ＨＦを用いて完全脱保護した後、ｃＣＮＰの６．２
２位のシスティン残基のＳＨ基をフェリシアン化カリウ
ム［ＫｓＦｅ（ＣＮ）Ｊで処理することにより分子内Ｓ
−８結合を形成させた。このようにして合成したｃＣＮ
Ｐは、アミノ酸分析、アミノ酸−次配列の解析を行いそ
の構造を確認した。さらに、この化学合成したｃＣＮＰ
と実施例１で得た天然由来のｃｃＮＰは、第３図すに示
すとおりＨＰＬＣの溶出時間が完全に一致し、合成ｃＣ
ＮＰもヒヨコ直腸弛緩活性を示したことから、最終的に
ＣＣＮＰの構造は、 （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と２２位のシスティン残基（Ｃｙｓ）は分
子内でＳ−８結合を形成している。）であると決定した
。

ヒヨコ直腸弛緩活性はＫａｎｇａｗａ等及びＣｕｒｒｉ
ｅ等の方法（Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ　Ｍａｔｓｕ
ｏ、Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍｍｕｎ、、１１８．１３１−１３９，１９８４；
　Ｃｕｒｒｉｅ、Ｍ、ＧＧｅｌｌｅｒ、Ｄ、Ｍ、　、Ｃ
ｏ１ｅ、Ｂ、Ｒ，、Ｂｏｙｌａｒ、Ｊ　、Ｇ、　、Ｙｕ
ｓｈｅｎｇ。

Ｗ、、Ｈｏｒｍｂｅｒｇ、Ｓ、Ｗ、ａｎｄ　Ｎｅｅｄｌ
ｅｍａｎ、Ｐ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２１．７１−７３
．１９８３）に従い測定した。測定値は６回の繰り返し
の平均である。その結果を第１表に示す。この測定法で
ｃＣＮＰはα−ｈＡＮＰ及びｆＡＮＰ−２１に比べ各々
約２倍〜約５倍高い活性を示した。なお、ｃＣＮＰは、
類似ペプチドにとって利尿作用等の生物活性を発揮する
ために重要と考えられていたＣ−末端のテール配列（Ｗ
ａｔａｎａｂｅ、Ｔ、Ｘ、　、Ｎｏｄａ　、　Ｙ、　、
Ｃｈｉｎａ、Ｎ、　、Ｎ１５ｈｉｕｃｈｉ　、　Ｙ、　
、Ｋｕｍｕｒａ、Ｔ、、５ａｋａｋｉｂａｒａ、Ｓ、ａ
ｎｄ　Ｉｍａｉ、Ｍ、、ＥｕｒＪ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
。

１４７．４９−５７．１９８８）が欠失しティるが、ｐ
ＣＮＰと匹敵する強い直腸弛緩活性を保持していた。

第１表 利尿ペプチド 相対活性 αｈＡＮＰ 　ＣＮＰ ｆＡＮＰ−２１ ｆ　ＡＮＰ−２４ ｐＣＮＰ ｐＢＮＰ−２６ ３゜ 庄屋 ｃＣＮＰの利尿作用については、Ｋａｎｇａｗａ等及び
５ｕｄｏｈ等の方法に従い測定した（Ｋａｎｇａｗａ　
ｅｔ　ａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ　、Ｒ
ｅｓ　、Ｃｏｍｍｕｎ　、　、　１１８　、１３１−１
３９　、１９８４；５ｕｄｏｈ、Ｔ、、Ｋａｎｇａｗａ
、に、、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、　ａｎｄ　Ｍａｔｓｕ
ｏ、Ｈ，、Ｎａｔｕｒｅ、３３２．７８−８１．１９８
８）　。すなわち、雄性ＳＤクラット体重３００−４０
０　ｇ　）にベンドパルビタール５０■／ｋｇを腹腔内
投与し、麻酔し、気道確保のため気管カニユーレ（ＰＥ
−２４０クレイ・アダムス社製）を施す。股動脈に血圧
測定用のカニユーレ（ＰＥ−５０）を挿入し、また、股
静脈に挿入したカニユーレ（ＰＥ−１０）を通じてリン
ゲル液を１．８ｄ／ｈｒの速度で定常注入する。シラス
ティックチューブ（内径００２インチ、外径０．０３フ
インチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニユーレより試
験管内に採尿し、この採尿は被験物質を投与する１５分
間と投与後５分間ずつ１５分後まで及びその後経時的に
行った。この試料の量そして試料中の電解質濃度を比較
することにより、及び血圧の変化により被験物質の作用
を測定した。

なお、被験物質ｃｃＮＰは、その所定量を０．ＩＮ酢酸
に溶解した後、１／ｌＯ容量の１．３Ｍトリス溶液で中
和する。これを５０μｌの滅菌生理水で希釈し、頚静脈
から投与した。この結果、第２表に示すように、ｃＣＮ
Ｐはナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことが
判り、さらに、これらの作用は用量依存的に増大するこ
とが判った。

第２表に、ｃｃＮＰのナトリウム利尿作用及び血圧降下
作用をα−ｈＡＮＰと比較して示す。

第２表 チド （μｇ／ｋｇ） 尿（％）　Ｎａ” （％） ｋ＋ （％） ｌ− （％） 低下（％） ｃｃＮＰ ３０　　１５３±３２１６０±９１４５±１２１７１±
２４．４±１９９０　　２６１±１９１９３±６１６３
±０２２１４±５１０３±２．０２００　　２９３±５
０３８５±５０１７４±１８３３８±１０７１１．５±
１．５なお、第２表中、利尿及びナトリウム利尿応答は
、麻酔ラットへペプチドを静脈注射する前及び後に、各
１５分間の尿サンプルを集め、尿量、Ｎａ”、Ｋ＋及び
Ｃドの排泄量の変化の％（平均上標準誤差）として示し
た。各ペプチドに３−６匹のラットを用いた。

ｃＣＮＰの利尿及びナトリウム利尿作用は、α−ｈＡＮ
Ｐに比べて、約１００分の１程度に低かった。ｃｃＮＰ
はまた、麻酔ラットに投与したところ弱い血圧降下作用
も示した。典型的実験において、３０μｇ／ｋｇのｃｃ
ＮＰは、心収縮期の血圧を約３０分間にわたって約５％
低下させた。これらの結果はｐＣＮＰの結果（Ｓｕｄｏ
ｈ、Ｔ、　、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、Ｋａｎｇａｗａ、
に、　ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ。

ｍｍｕｎ、　、１６８，８６３−８７０．１９９０）と
非常に類似している。

（発明の効果） 以上のように、本発明者は、抗ＣＮＰ抗血清を用いたＲ
ＩＡ系を指標に、ニワトリの脳から新規生理活性ペプチ
ド（ｃＣＮＰ）を単離・同定することに成功すると共に
、このペプチドがナトリウム利尿作用及び血圧降下作用
を有することを見いだし、このペプチドがＧＮＰに帰属
される新規ペプチドであることを明らかにした。

本発明でｃｃＮＰが単離・同定されたことにより、ニワ
トリと哺乳類ではＢＮＰを共有するのみならずＧＮＰを
も共有していることが判明した。

このことは、ＢＮＰ及びＧＮＰが進化の初期の過程から
、体液量及び血圧の恒常性を調節するのに重要な役割を
果たすペプチドであることを示唆している。

また、本発明によりｃｃＮＰの構造が明らかにされたこ
とから、このアミノ酸−次配列を、本発明者らにより明
らかにされたブタ脳由来ＣＮＰ’（ｐＣＮＰ）と比較す
ればＧＮＰの構造活性相関を研究することができる。

以上のことから、本発明はＧＮＰの生理的役割、ひいて
は生体内における体液量及び血圧の恒常性を調節するメ
カニズムを解明する上で、大いに貢献するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ニワトリ脳からの抽出物（ｓｐ−ｍ分画をさ
らにセファデックスＧ−５０で分画したときの、溶出経
過及び各フラクションの抗ＣＮＰ抗血清に対する免疫活
性を示す図である。 第２図は、第１図のセファデックスＧ−５０カラムから
溶出した活性フラクションを、ＣＭ陽イオン交換ＨＰＬ
Ｃでさらに精製したときの溶出経過及び各フラクション
の抗ＣＮＰ抗血清に対する免疫活性を示す図である。 第３図ａは、第２図のＣＭイオン交換ＨＰＬＣから４２
−４４分目に溶出された１ｒ−ＣＮＰフラクションを、
μｍボンダスフェアＣ−１８を用いた逆相ＨＰＬＣでさ
らに精製したときの様子を示す図である。 第３図すは、化学合成したｃＣＮＰと実施例１で得た天
然由来のｃｃＮＰが、第３図ａと同様の条件下で行った
ＨＰＬＣにおいて溶出時間が完全に一致することを示す
図である。 第４図は、（ＲＣＭ）ｃｃＮＰのエドマン分解における
各サイクルのＰＴＨ−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列
を示す図である。 第５図は、各種ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰのアミノ酸−次
配列及びこれらのペプチドのアミノ酸−次配列の相同性
を示す図である。 第 回 フラツフ３／す；バ 第 凹 第 凹 騎 開 （介） 第 凹 Ｖ４フル数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
   ており、６位と２２位のシステイン残基（Ｃｙｓ）は分
   子内でＳ−Ｓ結合を形成している。）を有する新規生理
   活性ペプチド及びその酸付加塩。