FI104255B - Menetelmä ihmisen seerumialbumiinin N-terminaalifragmentteja sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä ihmisen seerumialbumiinin N-terminaalifragmentteja sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI104255B
FI104255B FI915073A FI915073A FI104255B FI 104255 B FI104255 B FI 104255B FI 915073 A FI915073 A FI 915073A FI 915073 A FI915073 A FI 915073A FI 104255 B FI104255 B FI 104255B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
hsa
variant
sequence
polypeptide
terminal
Prior art date
Application number
FI915073A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI915073A0 (fi
FI104255B1 (fi
Inventor
David James Ballance
Original Assignee
Delta Biotechnology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Delta Biotechnology Ltd filed Critical Delta Biotechnology Ltd
Publication of FI915073A0 publication Critical patent/FI915073A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104255B1 publication Critical patent/FI104255B1/fi
Publication of FI104255B publication Critical patent/FI104255B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

104255
Menetelmä ihmisen seerumialbumiinin N-terminaalifragmentteja sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi 5 Tämän keksinnön kohteena on fimsiopolypeptidien valmistusmenetelmä, jossa kaksi erillistä polypeptidiä tai niiden osaa fuusioidaan muodostamaan yksi ainoa amino-happoketju. Tällainen fuusioituminen saattaa syntyä yhdistelmä-DNA-tekniikoin muodostetun yhden ainoan jatkuvan koodaussekvenssin ekspressiosta.
10 Fuusiopolypeptidit ovat tunnettuja, mm. sellaiset, joissa prosessin viimeisenä lopputuotteena oleva polypeptidi ilmentyy N-terminaalin "johtosekvenssissä", joka edistää tai tekee mahdolliseksi polypeptidin erittymisen solusta. EP-A-116201 tuo esiin esimerkin.
15 Ihmisen seerumialbumiini HS A (human serum albumin) on tunnettu veren proteiini. EP-A-147198 tuo esiin sen ekspression transformoituneessa isännässä, tässä tapauksessa hiivassa. Aiemmassa patenttihakemuksessamme EP-A-3 222 094 puolestaan tuodaan esiin HSA:n N-terminaalin fragmentteja, tarkemmin sanoen tähteet 1-n, jossa n on 369-419, joita voidaan käyttää terapeuttisesti. Hakemuksessa mainitaan 20 myös mahdollisuus fuusioida tällaisten molekyylien C-terminaalin tähde toisiin, nimeämättömiin polypeptideihin.
Tämän keksinnön kohde on fuusiopolypeptidin valmistusmenetelmä, joka peptidi si-sältää, ainakin osana N-terminaalia, HSA:n N-terminaaliosan tai sen muunnelman • 1 « ' 25 ja, ainakin osana C-terminaaliosaa, toisen polypeptidin, paitsi että kun sanottu • · · *... HSA:n N-terminaaliosa on 1-n, jossa n on 369-419 tai sen muunnelma, sanottu po- /•f lypeptidi on • · ·
• · I
• · · I
• *: : a) ihmisen fibronektiinin osa 585-1578 tai sen muunnelma, • ·· v : 30 b) CD4:n osa 1-368 tai sen muunnelma, c) verihiutalekasvutekijä tai sen muunnelma, :T: d) transformoiva kasvutekijä tai sen muunnelma, :' j'; e) ihmisen kypsän plasman fibronektiinin osa 1 -261 tai sen muunnelma, f) ihmisen kypsän plasman fibronektiinin osa 278-578 tai sen muunnelma, « · · ' ' 35 g) ihmisen kypsän von Willebrandtin tekijän osa 1-272 tai sen muunnelma tai • * ·; · 1 h) alfa- 1-antitrypsiini tai sen muunnelma.
• · « • · · • · · » :" 1; Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
2 104255 HSA:n N-terminaali saisi edullisesti olla sanottu osa 1-n, osa 1-177 (kysteiiniin asti, kysteiini mukaan lukien), osa 1-200 (kysteiiniin asti, kysteiini poislukien) tai väliosa 1-177 ja 1-200.
5 Termillä "ihmisen seerumialbumiini" (HSA) tarkoitetaan (ei välttämättä niihin rajoittuen) tunnettuja tai vielä löytymättömiä HSA:n polymorfisia muotoja. Esimerkiksi Naskapi-albumiinissa on Lys-372 Glu-372:n asemesta ja Christchurchin pro-albumiinilla on erilainen pro-sekvenssi. Termillä "muunnelma" tarkoitetaan (ei välttämättä niihin rajoittuen) vähäisiä keinotekoisia muutoksia sekvensseissä (esim. 10 molekyylejä, joista puuttuu yksi tai muutama tähde, joissa on konservoivia substituutioita tai pieniä tähdelisäyksiä tai joiden aminohapporakenteessa on pieniä muutoksia). Polypeptidit, joiden homologia HSA:han nähden on 80 %, edullisesti 85 %, 90 %, 95 % tai 99 %, katsotaan "muunnelmiksi". Olisi myös edullista, että tällaiset muunnelmat olisivat fysiologisesti HSA:ta vastaavia, eli että muunnelmilla on vähin-15 tään jokin HSA:n farmakologinen käyttö. Lisäksi otaksutut farmakologiseen käyttöön tarkoitetut muunnelmat eivät saisi olla käsiteltävässä eliössä (erityisesti ihmisessä) immunogeenisuuttä aiheuttavia.
Konservoivia substituutioita ovat sellaiset, joissa yksi tai useampi aminohappo kor-20 vataan toisilla, joilla on niin samankaltaisia ominaisuuksia, että polypeptidien kemiaan perehtynyt henkilö voi odottaa vähintään polypeptidin sekundaarirakenteen, edullisesti tertiaarirakenteen olevan olennaisesti muuttumaton. Joitain tyypillisiä tällaisia substituutioita ovat glutamiinin korvautuminen asparagiinilla, asparagiinin , ·, · _ korvautuminen seriinillä ja lysiinin korvautuminen arginiinillä. Muunnelmista voi ' 25 vaihtoehtoisesti tai yhtä hyvin puuttua enimmillään kymmenen (edullisesti vain yksi tai kaksi) väliaminohappotahdettä (eli jotka eivät sijaitse sanotuissa HSA:n N-termi- • · /·;* naaliosan pääteosissa) verrattuna vastaavaan osaan luonnon HSA:ssa. Edullisesti ·*.: : tällaiset puuttumiset saisivat sijoittua molekyylin osiin 100-369 (suhteessa kypsään : HSA:han) (jos niitä ilmenee). Samoin korkeimmillaan kymmenen, edullisesti yksi • · · v 30 tai kaksi aminohappoa voidaan lisätä, edelleen osaan 100-369 (jos niitä ilmenee).
Termillä "fysiologisesti funktionaaliset ekvivalentit" tarkoitetaan myös suurempia molekyylejä, joissa tämä sanottu sekvenssi on, sekä lisäsekvenssi N-terminaalissa (esimerkiksi pro-HS A, pre-pro-HS A ja met-HS A).
'; ‘ ‘ 35 On selvää, etteivät mainitut "muut polypeptidit" voi olla HSA:n jäljelle jääviä osia, ' ·..: koska muutoin koko polypeptidi olisi HSA, joka ei sitten olisikaan "fuusiopolypep- :T: tidi".
• · · • · • · · 3 104255
Silloinkin kun HSA:ta muistuttava osa ei ole sanottu HSA:n osa 1-n, on edullista että ei-HSA-osa on jokin sanotuista vaihtoehdoista a) - h).
CD4:n osa 1-368 kattaa ihmisen T-lymfosyytin proteiinin CD4 neljä ensimmäistä 5 disulfidisilloin yhdistynyttä immunoglobuliinin kaltaista aluetta (domain). Sen geeni ja aminohapposekvenssi tulevat esiin teoksessa, jonka ovat kirjoittaneet D. Smith et ai, (1987) Science 328, 1704-1707. Sitä käytetään HIV-infektioita vastaan.
Ihmisen verihiutalekasvutekijää kuvaavat Collins et ai., (1985) Nature 316, 748-750. 10 Transformoivien kasvutekijöiden β (TGF-β) sekvenssejä kuvaavat Derynck et ai.
(1985) Nature 316, 701-705. Nämä kasvutekijät sopivat käytettäväksi haavojen parantamiseen.
Fn:n osan 1-261 cDNA-sekvenssi tulee esiin EP-A-207751:ssä (saatuna plasmidista 15 pFH6 endonukleaasin PvuII avulla). Tämä osa sitoo fibriiniä ja sitä voidaan käyttää ohjaamaan fuusioituja yhdisteitä verihyytymiin.
R.J. Owens ja F.E.Baralle, 1986, EMBO J 5, 2825-2830, tuovat esiin Fn:n osan 278-578 cDNA-sekvenssin. Tämä osa sitoutuu verihiutaleisiin.
20 von Willebrandtin tekijän osa 1-272 sitoutuu ja stabiloi tekijää VIII. Sekvenssiä kuvataan teoksessa Bontham et ai., Nucl. Acids Res. 14, 7125-7127.
. . , Alfa-1 -antitrypsiinien muunnelmia kuvaavat Rosenburg et ai. 1984, Nature 312, 77- ‘ 25 80. Tähän keksintöön kuuluvat erityisesti Pittsburhgin muunnelma (Met onmuta- :’ toitu arginiiniksi) sekä muunnelma, jossa Pro357 ja Met358 on mutatoitu toinen alanii- # · /·;* niksi ja toinen arginiiniksi. Näitä yhdisteitä voidaan käyttää septisen shokin ja keuh- -·* · kosairauksien hoitoon.
• · • ·« v ·* 30 Kuvattuihin polypeptidien ei-HSA-osien muunnelmiin luetaan muunnelmat, joita käsiteltiin edellä HSA-osan yhteydessä, mukaan lukien sellaiset, joissa on konser- : ’ j ’: voivia aminohapposubstituutioita samoin kuin homologeja toisilta lajeilta.
« * < « · · • li
Fuusiopolypeptideissä voi olla N-tenninaalissa aminohappoja, jotka jatkuvat yli '·'[/ 35 HSA:n N-terminaaliosan kattavan osan. Jos esimerkiksi HSA:ta muistuttava osa on ' · · ·' kypsän HSA:n N-terminaaliosa, siihen voidaan lisätä pre-, pro- tai pre-pro-sekvens- : ’: *: sejä, esimerkiksi hiivan alfatekijän johtosekvenssi. Voidaan käyttää yhteen sulautet- tuja johto-osia, jotka esittää WO-90/01063. Polypeptidi, joka liitetään HSA-osaan, 4 104255 voi olla luonnossa ilmenevä polypeptidi, sen fragmentti tai uusi polypeptidi, myös fuusiopolypeptidi. Esimerkiksi esimerkissä 3 liitetään fibronektiinifragmentti HSA-osaan neljän aminohappolinkkerin avulla.
5 On tullut esiin, että HSA-molekyylin aminoterminaaliosa on rakenteeltaan sellainen, että se suosii erityisesti tehokasta keksinnön mukaisten fuusioyhdisteiden translo-kaatiota ja kuljetusta eukaryoottisissa soluissa.
Keksinnön toinen kohde on transformoitu isäntä, jonka nukleotidisekvenssi on sel-10 laisessa järjestyksessä, että se ilmentää ylläkuvatunlaista fuusiopolypeptidiä. "Sellaisella järjestyksellä" tarkoitamme esimerkiksi että nukleotidisekvenssi on oikeassa lukujaksossa sopivan RNA-polymeraasisitoutumiskohdan ja translaatioaloitussek-venssin suhteen ja sopivan promoottorin ohjauksessa. Promoottori voi olla homologinen tai heterologinen isäntään nähden. Alavirta- (3') säätösekvenssejä voi tun-15 nettuun tapaan olla mukana. Isäntä saisi mieluiten olla hiiva (esimerkiksi Saccharo-myces spp, esim. S. cerevisiae, Kluyveromyces spp., esim. K. lactis, Pichia spp. tai Schizosaccharomyces spp, esim. S. pombe), mutta voi olla mikä tahansa muu sopiva isäntä, esim. E. coli, B. subtilis, Aspergillus niger spp., nisäkkään solu, kasvisolu tai hyönteisen solu.
20
Keksinnön kohde on siis menetelmä kuvatun fuusiopolypeptidin valmistamiseksi viljelemällä keksinnön toisen kohteen mukaista transformoitua isäntää ja eristämällä sen jälkeen fuusiopopypeptidi hyödyllisessä muodossa.
• · • · · • · ' 25 Keksinnön mukaisten menetelmien tarkoituksena on erityisesti tehostaa terapeutti- *...** seen käyttöön sopivien ihmisen proteiinien erittymiseen hiivoista ja olemme keksi- • · /·;' neet fuusioida HSA:n aminoterminaaliosiin proteiineja, joita tavallisesti saadaan • · · ·*·· · eritettyä vain tehottomasti. Eräs tällainen proteiini on potentiaalisesti arvokas haa- van parantamiseen vaikuttava polypeptidi, jossa on aminohapot 585-1578 ihmisen ··» v : 30 fibronektiinistä (jota tästä eteenpäin kutsutaan nimellä Fn 585-1578). Kuten erilli sessä (oheen liitetyssä) liitteessä olemme kuvanneet, tällä molekyylillä on solujen jakautumiseen liittyviä, kemotaktisia ja kemokineettisiä vaikutuksia, jotka edistävät : *; , haavojen paranemista. Fuusiopolypeptidejä, joissa C-terminaaliosa onFn585-1578, . . voidaan biosyntetisoituna käyttää parantamaan haavoja, erityisesti kun ihmisprote- ‘ 35 iinin hybridiä käytetään ulkoisesti. Ihmisen fibronektiinin aminohappojen osa 585- ‘ ' 1578 voidaan kuitenkin haluttaessa ottaa talteen fuusioproteiinista panemalla ennen :‘i’: fibronektiiniosan ensimmäistä aminohappoa aminohappoja, joilla on X-tekijäpilk- koutumiskohta. Kun fuusioproteiini on eristetty viljelysupematantista, haluttu mole- 5 104255 kyyli vapautetaan X-tekijäpilkkomista käyttäen ja puhdistetaan sopivaa kromatogra-fiamenetelmää käyttäen (esim. ioninvaihtokromatografia). Voidaan käyttää muitakin entsymaattisia tai kemikaalisia pilkkoutumiskohtia luovia kohtia, joko asettamalla vierekkäin sopivia N-terminaali- ja C-terminaaliosia tai insertoimalla niiden väliin 5 sopivia linkkereitä.
Ainakin joillain kuvatuilla fuusiopolypeptideillä, erityisesti niillä, joissa on sanotut CD4-ja vWF-fragmentit, PDGF ja ai AT, on pidentynyt puoliintumisaika veressä ja sen vuoksi ne ovat edullisia ja terapeuttisesti käyttökelpoisia: molekyylin ei-HSA-10 osa on terapeuttisesti käyttökelpoinen. Kun kyseessä ovat ajAT ja muut, yhdistettä annetaan tavallisesti kerta-annoksena tai muutamana harvana annoksena lyhyen ajan kuluessa, jolloin yhdiste vähemmällä todennäköisyydellä voi aiheuttaa immuunivasteen.
15 Esimerkeissä on käytetty standardin mukaisia yhdistelmä-DNA-menetelmiä tapaan, jota kuvaavat Maniatis et ai. (1982 ja äskettäin ilmestynyt 2. painos), ellei muuta ole mainittu. Faagi-M13-yhdistelmäkloonien kokoamisessa ja analysoinnissa käytettiin tapoja, joita kuvaavat Messing (1983) ja Sanger et ai (1977).
20 Molekyylien kokoamisessa käytettävät ihmisen seerumialbumiinia koodavat DNA-sekvenssit oli johdettu plasmideista mHOB12 ja pDBD2 (EP-A-322094) tai synte-toimalla oligonukleotidejä, jotka vastasivat tämän sekvenssin osia. Osia ihmisen fibronektiinistä koodaavat DNA-sekvenssit johdettiin plasmidista pFHDELl tai .v. syntetoitiin oligonukleotidejä, jotka vastasivat tämän sekvenssin osia. Plasmidi ' 25 pFHDELl, joka sisältää ihmisen plasmafibronektiiniä koodaavan cDNA:n kokonai- *...** suudessaan, saatiin ligatoimalla DNA, joka oli johdettu plasmideista pFH6, 16, 54, ;··:* 154 ja 1 (EP-A-207751).
• · · • · · • ·· · * Tämä DNA on mRNA-muunnelma, joka ei sisällä 'ED'-sekvenssiä ja jossa on 89- • · · v ; 30 aminohappomuunnelma ΠΙ-CS-alueesta (R.J. Owens, A.R. Komblihtt and F.E. Ba- ralle, 1986, Oxford Surveys on Eukaryotic Genes 3, 141-160). Tämän vektorin :T: kartta on oheenliitetty (kuvio 11) ja kypsän polypeptidin proteiinisekvenssi, jonka : *;', tämän cDNA.n ekspressio tuottaa, näkyy kuviossa 5.
35 Oligonukleotidit syntetoitiin käyttäen oligonukleotidisyntetisoijaa (Applied Biosys- ‘ ’ tems 3 80 B) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
•«· tl· t · • lit I · I · • t « 6 104255
Valmistettiin ekspressiovektori, jossa DNA, joka joka koodaa HSA-erityssignaalia ja kypsää HS Aita aminohappoon 387 tämä aminohappo, leukiini, mukaan lukien, fuusioituna samaan lukujaksoon DNA.han joka koodaa ihmisen fibronektiinin segmenttiä aminohaposta 585 aminohappoon 1578 tämä mukaan lukien, sijoitettiin 5 alavirtaan hybridipromoottoriin nähden, joka oli (patentin EP-A-258067 mukainen) erittäin tehokas galaktoosi-indusoituva promoottori, joka toimii Saccharomyces ce-revisiaessa. Heti ihmisen fibronektiinin 1578:nnen aminohapon kodonin jälkeen tuli lopetuskodoni (TAA) ja sen jälkeen S. cerevisiaen fosfoglyseraasikinaasin (PGK) geenitranskripioterminaattori. Tämä vektori vietiin sitten S. cerevisiaeen transfor-10 moimalla ja siellä se ohjasi ekspressiota ja hybridimolekyylin, joka vastaa HSAin N-terminaalin 387 aminohappoa fuusioituna C-terminaalin avulla ihmisen fibronektiinin aminohappoihin 585-1578, erittymistä soluista.
Keksintöä kuvataan seuraavassa esimerkein, joissa mainituissa kuvioissa: 15 kuvio 1 (kahdella sivulla) kuvaa aminohapposekvenssiä, jonka tällä hetkellä oletetaan parhaiten esittävän luonnon HSAita, laatikoituna ovat vaihtoehtoiset HSA(l-n):n C-terminaalit, kuvio 2 (kahdella sivulla) kuvaa DNA-sekvenssiä, joka koodaa kypsää HSAita, 20 linkkeriin 3 sisältyvä sekvenssi alleviivattuna, kuvio 3 kuvaa diagrammin muodossa mHOB 16:n rakennetta, kuvio 4 kuvaa diagrammin muodossa pHOB31 in rakennetta, kuvio 5 kuvaa (6 sivulla) kypsää protiinisekvenssiä, jota koodaa Fn-plasmidi-pFHDELl, !. ‘ 25 kuvio 6 kuvaa linkkeriä 5, esillä ovat kahdeksan muodostajaoligonukleotidiä, 4 · kuvio 7 kuvaa skemaattisesti plasmidinpDBDF2 rakennetta, • · ]···* kuvio 8 kuvaa skemaattisesti plasmidin pDBDF5 rakennetta, : kuvio 9 kuvaa skemaattisesti plasmidin pDBDF9 rakennetta, kuvio 10 kuvaa skemaattisesti plasmidin pDBDF12 rakennetta, käytetään plas-v : 30 midiapFHDELl, ja kuviossa 11 on kartta plasmidista pFHDEL 1.
··· • · · • · ·
Esimerkki 1 HSA 1-387 fuusioituna Fn 585-1578:aan v : 35 « « ·
Seuraavassa kuvataan, kuinka valmistetaan plasmideja, joilla on sekvenssejä, jotka : * · *; koodaavat HSAin osaa (EP-A-322094).
• · • · · 7 104255
Ihmisen seerumialbumiinia koodaava sekvenssi, jota seuraavien molekyylien kokoamisessa käytettiin, oli johdettu plasmidista M13mpl9.7 (EP-A-201239) tai synte-toimalla oligonukleotidejä, jotka vastasivat tämän sekvenssin osia. Oligonukleotidit syntetoitiin käyttämällä fosforamidiittikemiaa ja olinukleotidisyntetisoijaa (Applied 5 Biosystems 380B) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Syntetoitiin oligonukleotidi (linkkeri A), joka edusti osaa tunnetusta HSDA:ta koo-daavasta sekvenssistä (kuvio 2), kohdasta PstI (1235-1240, kuvio 2) valimin 381 kodoniin, kodoni muuttui GTG:stä GTC:ksi.
10
Linkkeri 1
D P H E C Y 5' GAT CCT CAT GAA TGC TAT
15 3'ACGT CTA GGA GTA CTT ACG ATA
1247
A KVFDEFK
GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA
20 CGG TTT CAC AAG CTA CTT AAA TTT
1267
P LV
CTT GTC 3' • « 4 i. ' 25 GGA CAG 5' • « • · · • · · • · ]···1 Linkkeri 1 ligatoitiin vektoriin M13mpl9 (Norrander et ai, 1983) joka oli hajotettu : käyttäen PstLtä ja HincILta ja ligaatioseosta käytettiin transfektoimaan E. coli, kanta XLl-Blue (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA). Yhdistelmäkloonit tunnis- •»· ...
v : 30 tettiin sillä, etteivät ne muuttuneet sinisiksi väliaineessa, joka sisälsi kromogeenista indikaattoria X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolyyli-β-D-galaktosidia) IPTG:n (isopro-pyylitio-P-galaktosidi) läsnäollessa. Yhdistelmäkloonin bakteriofagipartikkeleista valmistetun templaatti-DNA:n avulla suoritetulla DNA-sekvenssianalyysillä tunnis-tettiin molekyyli, jolla oli vaadittu DNA-sekvenssi, ja sille annettiin nimitys : 35 mHOB12 (kuvio 3).
• M
• · • · • · · · · II.
• 1 · • · · • · • · · g 104255 M13mpl9.7 muodostuu kypsän HSA:n koodausalueesta M13mpl9:ssa (Norrander et ai, 1983), niin että HSA:n ensimmäisen aminohapon, GAT, kodoni peittää ainoan Xhol-kohdan: 5 Asp Ala 5' CT CGAGAT GC A3'
3' GAGCTCTACGT51 XhoI
10 (Ep-A-210239). M13mpl9.7 hajotettiin XhoI:n avulla, päät tasoitettiin Sl-nukleaa- sikäsittelyllä ja sitten suoritettiin ligatointi seuraavaan oligonukleotidiin (linkkeri 2):
Linkkeri 2 15 5' T CTTT T AT CCAAGCTT GGAT A A A A G A 3' 3' AGAAAAT AGGTTCGAACCT ATTTTCT 5’
Hindlll
Ligaatioseosta käytettiin transfektoimaan E. coli XL 1-Blue, templaatti-DNA valmis-20 tettiin useammasta plakista ja sitten suoritettiin DNA-sekvenssianalyysi oikean sekvenssin sisältävän kloonin pDBDl (kuvio 3) tunnistamiseksi.
Eristettiin pDBDl:stä agaroosigeelielektroforeesin avulla 1.1 kb:n fragmentti
Hindlll - Pst-I, joka vastasi HSA:ta koodaavan alueen 5-päätä, sekä puolet insertoi- λ 25 dusta oligonukleotidilinkkeristä. Tämä fragmentti ligatoitiin sitten kaksisäikeiseen :mi1‘ mHOB12:een, joka oli etukäteen hajotettu Hindll.ta ja Pstlrtä käyttäen, ja ligaatio- • · '···' seosta käytettiin sitten transfektoimaan E. coli XLl-Blue. Valmistettiin yksisäikei- : nen templaatti-DNA useamman plakin kypsistä bakteriofagipartikkeleista. DNA:sta tehtiin kaksisäikeinen in vitro -ekstensoimalla kuumakäsitellystä (annealed) sekven-v' ·1 30 sointialukkeesta DNA-polymeraasi I:n Klenowin fragmentin avulla, läsnä deoksi- nukleosiditrifosfaatteja. Tämän DNA:n restriktioentsyymianalyysin avulla pystyttiin ·1·1: identifioimaan klooni, jolla oli oikea konfiguraatio, mHOB 15 (kuvio 3).
« «< • « 4 • Seuraava oligonukleotidi (linkkeri 3) kattaa alueen kypsän HSA:n 382:nnen amino- '·1 ' 35 hapon kodonista (glutamaatti, GAA) lysiinikodoniin 389, jonka jälkeen tulee lope- :: tuskodoni (TAA), Hindlll-kohta ja sen jälkeen BamHI-kohesiivinen pää: « « « « • « · • « · • « · • » « 1 · ·
Linkkeri 3 9 104255
E E P Q N L I K J
5’ GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA TAA GCTTG 3’ 5 3’ CTT CTC GGA GTC TTA AAT TAG TTT ATT CGAACCTAG 5' Tämä ligatoitiin kaksisäikeiseen mHOB15:een, joka oli etukäteen hajotettu Hindiin ja BamHI:n avulla. Ligaation jälkeen DNA hajotettiin Hindi:11a kaikkien ei-yhdis-telmämolekyylien tuhoamiseksi ja käytettiin sitten transfektoimaan E. coli XL1-10 Blue. Yksisäikeinen DNA valmistettiin useampien kloonien bakteriofagipartikke-leista, ja sille tehtiin DNA-sekvenssianalyysi. Yksi klooneista, jolla oli oikea DNA-sekvenssi, nimitettiin mHPB16:ksi (kuvio 3).
Luotiin molekyyli, jossa kypsää HSA.ta koodaava alue fuusioitiin HSA-erityssig-15 naaliin insertoimalla linkkeri 4 BamHLllä ja XhoLllä hajotettuun M13mpl9.7:ään, jolloin saatiin pDBD2 (kuvio 4):
Linkkeri 4
20 M K W V S F
5' GATCC ATG AAG TGG GTA AGC TTT
G TAC TTC ACC CAT TGC AAA
I S L L F L F S
i. 25 ATT TCC CTT CTT TTT CTC TTT AGC
\.y TAA AGG GAA GAA AAA GAG AAA TCG
♦ · • · ··♦ • ♦
: S A Y S R G V F
TCG GCT TAT TCC AGG GGT GTG TTT
:J: 30 AGC CGA ATA AGG TCC CCA CAC AAA
:T: R R
.·*:·. CG 3' GCAGCT 5' *'··' : 35 « i « Tässä linkkerissä lähtömetioniinin jälkeen neljännen aminohapon kodoni ja HSA- preprojohtosekvenssin treoni ACC (Lawn et ai, 1981) on vaihdettu seriiniksi AGC, . ‘1 *. jolloin on saatu Hindm-kohta.
• « 104255 10
Synteettisen DNA.n sekvenssi, joka vastasi osaa tunnetusta HSA.ta koodaavasta sekvenssistä (Lawn et ai, 1981) (aminohapot 382-387, kuvio 2), fuusioituna osaksi tunnettua fibronektiiniä koodaavaa sekvenssiä (Komblihtt et ai, 1985) (aminohapot 585-640, kuvio 2), valmistettiin syntetoimalla kuusi oligonukleotidia (linkkeri 5, 5 kuvio 6). Oligonukleotidit 2, 3, 4, 6, 7 ja 8 fosfoiyloitiin käyttämällä T4-polynuk-leotidikinaasia ja sitten oligonukleotidit kuumakäsittelyn avulla liitettiin standar-diolosuhteissa pareiksi 1+8, 2+7, 3+6 ja 4+5. Liitetyt oligonukleotidit sekoitettin keskenään ja ligatoitiin mHOB 12:11a, joka oli etukäteen hajotettu restriktioentsyy-meillä Hindi ja EcoRI. Ligaatioseosta käytettiin sitten transfektoimaan E. coli XL Ι-ΙΟ Blue. Valmistettiin yksisäikeinen templaatti-DNA useamman plakin kypsistä bakte-riofagipartikkeleista ja suoritettiin DNA-sekvenssianalyysi. Klooni, jossa halutun sekvenssin linkkeri oli oikein insertoitunut vektoriin, nimitettiin pDBDFLksi (kuvio 7). Tämä plasmidi hajotettiin sitten PstLn ja EcoRI:n avulla ja noin 0,24 kb:n fragmentti puhdistettiin ja ligatoitiin pDBD2:n 1,29 kb:n fragmentin BamHI-PstI (kuvio 15 7) ja BamHI + EcoRI: 11a hajotetun pUC19:n (Yanisch-Perron et ai, 1985) kanssa ja saatiin pDBDF2 (kuvio 7).
Plasmidi, joka sisälsi ihmisen fibronektiiniä koko sen pituudelta koodaavan DNA-sekvenssin, pFHDELl, hajotettiin EcoRLn ja XhoI:n avulla, eristettiin 0,77 kb:n 20 EcoRI-XhoI-fragmentti (kuvio 8), ligatoitiin sitten EcoRLn ja SallLn avulla hajotettuun M13mpl8:aan (Norrander et ai, 1983), ja saatiin pDBDF3 (kuvio 8).
Syntetoitiin seuraava oligonukleotidilinkkeri (linkkeri 6), EP-A-207751 :n mukaisen . . fibronektiinisekvenssin Pstl-kohdasta 4784-4791 tyrosiinikodoniin 1578 (kuvio 5), I, ' 25 jonka jälkeen tulee lopetuskodoni (TAA), Hindlll-kohta ja sen jälkeen BamHI-kohe- • siivinen pää: • · • · • · · • · : Linkkeri 6 • «
:T: 30 GPDQTEMTI EGL
GGT CCA GAT CAA ACA GAAATG ACT ATT GAAGGCTTG A CGT CCA GGT CT A GTT TGT CTT TAC TGA TAA CTT CCG AAC
• · · • · · ;:7 Q P T V E Y Stop
: 35 CAG CCC ACA GTG GAG TAT TAA GCTTG
C.: GTC GGG TGT CAC CTC AT A ATT CGAACCTAG
• · · « · · 0 • · · • · • · · n 104255 Tämä linkkeri ligatoitiin PstI- ja HindlH-hajotettuun pDBDF3:een ja saatiin pDBDF4 (kuvio 8). Seuraavat DNA-fragmentit ligatoitiin sitten yhteen Bglll.lla hajotetun pKV50:n (EP-A-258067) kanssa kuten kuviosta 8 ilmenee: pDBDF4:n 0,68 kb:n EcoRI-BamHI-fragmentti, pDBDF2:n 1,5 kb:n BamHI-StuI-fragmentti ja 5 pFHDELl:n 2,2 kb:n StuI-EcoRI-fragmentti. Saatavassa plasmidissa pDBDF5 (kuvio 8) on mukana EP-A-258067:n mukainen promoottori ohjaamassa kypsän HSA:n aminohappoja 1-387 koodaavaan DNA:han fuusioidun HSA-erityssignaalin ekspressiota, se puolestaan fuusioituna suoraan ja samaan lukujaksoon ihmisen fib-ronektiinin aminohappoja 585-1578 koodaavaan DNA:han, translaatio päättyy ket-10 junlopetuskodoniin TAA. Sitä seuraa sitten S. cerevisiaen PKG-geenitranskriptioter-minaattori. Tämä plasmidi sisältää myös sekvenssit, jotka mahdollistavat selektion ja ylläpidon Escerichia colissa ja S. cerevisiaessa (EP-A-258067).
Plasmidi vietiin S. cerevisiae S150-2B:hen (leu2-3 leu2-112 ura3-52 trpl289 his3-l) 15 standardimenetelmin (Beggs, 1978).
Transformantit analysoitiin ja niiden havaittiin tuottavan HSA-fibronektiinifuusio-proteiinia.
20 Esimerkki 2 HSA 1-195 fuusioituna Fn 585-1578:aan Tässä toisessa esimerkissä ihmisen seerumialbumiinin ensimmäinen alue (1-195) ,. fuusioidaan ihmisen fibronektiinin aminohappoihin 585-1578.
·' 25 ♦ «
Plasmidi pDBD2 hajotettiin restriktioentsyymeillä BamHI ja Bglll ja 0,79 kb:n *··♦* fragmentti puhdistettiin ja ligatoitiin BamHI-hajotettuun M13mpl9:ään ja saatiin : pDBDF6 (kuvio 9). Käytettiin oligonukleotidiä • · 30 5'-C CAAAGCTCGAGGAACTTCG-3' mutageenisenä alukkeena luomaan Xhol-kohta pDBDF6:een, in vitro -mutageneesi • (Amersham Intemationl PLC:n varustepakkaus). Kohta luotiin muuttamalla HSA:n \ emäs numero 696 T:stä G:ksi (kuvio 2). Näin muodostunut plasmidi nimitettiin ' 35 pDBDF7:ksi (kuvio 9). Sitten syntetoitiin seuraava linkkeri vastaamaan tästä juuri luodusta Xhol-kohdasta HSA:n lysiinikodoniin 195 (AAA) ja sitten fibronektiinin : * · *; isoleukiinikodonista 585 kuvion 6 mukaisten oligonukleotidien 1 ja 8 päihin.
• · · • « • ♦ • ♦ ♦ 12 104255
Linkkeri 7
D ELRDEGKAS S AK
TC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA
5 A CTT GAA GCC CT A CTT CCC TTC CGA AGC AGA CGG TTT
I TETPSQPNH
ATC ACT GAG ACT CCG AGT CAG C
TAG TGA CTC TGA GGC TC A GTC GGG TTG AGG GTG G
10 Tämä linkkeri ligatoitiin sitten kuviossa 3 näkyviin kuumakäsiteltyihin oligonukleo-tideihin 2+7, 3+6 ja 4+5 yhdessä XhoI- ja EcoRI-hajotetun pDBDF7:n kanssa ja saatiin pDBDF8 (kuvio 9). Huomattakoon, että alkuperäisen HSA:n DNA-sekvens-sin ja siis aminohapposekvenssin uudelleen luomiseksi linkkerm 7 ja muiden oligo-15 nukleotidien insertoiminen pDBDF7:ään ei luo uudestaan Xhol-kohtaa.
pDBDF8:n 0,83 kb:n BamHI-StuI-fragmentti puhdistettiin ja ligatoitiin sitten pDBDF2:2 0,68 kb:n EcoRI-BamHI-fragmentin ja PFHDELl:n 2,22 kb:n Stul-EcoRI-fragmentin kanssa Bglll-hajotettuun pKV50:een ja saatiin pDBDF9 (kuvio 20 9). Tämä plasmidi on muutoin samanlainen kuin pDBDF5, mutta se spesifioi vain HSA:n tähteet 1-195, pDBDF5:llä tähteet 1-387.
Kun tämä plasmidi viedään edellä kuvattuun C. cerevisiae S150-2B:hen, se ohjaa . ekspressiota ja erittymistä hybridimolekyylissä, joka muodostuu HSA:n jäämistä 1- ' 25 195 liitettynäfibronektiininjäämiin 585-1578.
♦ · • ♦· ···
Esimerkki 3 : HSA 1-387 fuusioituna Fn 585-1578:aan, pilkkoutuva molekyyli • « :T: 30 Jotta saataisiin tuotettua suuria määriä fibronektiinin tähteitä 585-1578, valmistettiin rakenne, jossa HSA:n tähteitä 1-387 koodaava DNA erotettiin fibronektiinin jäämiä 585-1578 koodaavasta DNA:sta sekvenssillä • · · 13 104255 joka spesifioi pilkkoutumisen tunnistuskohtaa veren hyytymistekijällä X. Tästä seuraa, että puhdistettua eritettyä tuotetta voidaan käsitellä X-tekijällä ja sitten molekyylin fibronektiiniosa voidaan erottaa HSA-osasta.
5 Tähän tarkoitukseen syntetoitiin kaksi oligonukleotidiä, kuumakäsiteltiin ne ja saatiin linkkeri 8.
Linkkeri 8
10EEPQNLI EG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATT GAA GGT
CTT CTC GGA GTC TTA AAT TAA CTT CCA
Rl TETPSQP 15 AGA ATC ACT GAG ACT CCG AGT CAG C
TCT TAG TGA CTC TGA GGC TCA GTC GGG
N S H
TTG AGG GTG G
20 Tämä linkkeri ligatoitiin kuviossa 6 näkyvien kuumakäsiteltyjen oligonukleotidien 2+7, 3+6 ja 4+5 kanssa Hindi- ja EcoRI-hajotettuun mHOB12:een ja saatiin pDBDFlO (kuvio 10). Tämä plasmidi hajotettiin Pstl:n ja EcoRI:n avulla, noin ..t 0,24 kb:n fragmentti puhdistettiin ja ligatoitiin yhteen pDBD2:n 1,29 kb:n BamHI- * » !. ' 25 Pstl-fragmentin ja BamHI-ja EcoRI-hajotetun pUC19:n kanssa ja saatiin pDBDF17 (kuvio 10).
• · • · • · · • · : pDBDFll:n 1,5 kb:n BamHI-StuI-fragmentti ligatoitiin sitten pDBDF4:n 0,68 kb:n
EcoRl-BamHI-fragmentin ja pFHDELl:n 2,22 kb:n StuI-EcoRI-fragmentin kanssa :T: 30 Bglll.lla hajotettuun pKV50:een ja saatiin pDBDF12 (kuvio 10). Tämä plasmidi vietiin S. cerevisiae S150-2B:hen. Puhdistettua erittynyttä fuusioproteiinia käsitel-·*·"· tiin X-tekijällä, jolloin saatiin vapautumaan fibronektiinifragmentit, jotka vastasivat . ·: ·. alkuperäisen molekyylin tähteitä 585-1578.
• · · « « · • « · * · « * • « « • I · « · · • · · « « · • · « ·

Claims (5)

104255
1. Menetelmä fiiusiopolypeptidin valmistamiseksi, joka fuusiopolypeptidi sisältää, ainakin osana N-terminaalia, HSA.n N-terminaaliosan tai sen muunnelman ja, 5 ainakin osana C-terminaaliosaa, toisen polypeptidin, paitsi että kun sanottu HSA:n N-terminaaliosa on 1-n, jossa n on 369-419 tai sen muunnelma, sanottu polypeptidi on a) ihmisen fibronektiinin osa 585-1578 tai sen muunnelma, b) CD4:n osa 1-368 tai sen muunnelma, c) verihiutalekasvutekijä tai sen muunnelma, d) transformoiva kasvutekijä β tai sen muunnelma, e) ihmisen kypsän plasman fibronektiinin osa Ι-ΙΟ 261 tai sen muunnelma, f) ihmisen kypsän plasman fibronektiinin osa 278-578 tai sen muunnelma, g) ihmisen kypsän von Willebrandtin tekijän osa 1-272 tai sen muunnelma tai h) alfa-l-antitrypsiini tai sen muunnelma, tunnettu siitä, että ilmennetään transformoidussa isäntäsolussa polynukleotidisekvenssi, joka koodaa mainittua fuusiopolypeptidiä. 15
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusiopolypeptidi lisäksi sisältää vähintään yhden N-terminaaliaminohapon, joka jatkuu yli HSA.n N-terminaaliosaa vastaavan osan.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusiopo- lypeptidin N-terminaali-ja C-terminaaliosien yhtymäkohdassa on pilkkoutuva alue.
4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että , , fiiusiopolypeptidin C-terminaaliosa on ihmisen plasmafibronektiinin osa 585-1578 « < < : ' 25 tai sen muunnelma. • i • I • ·* • · «
5. Polynukleotidisekvenssi, jossa on nukleotidisekvenssi sellaisessa järjestykses- • · ·.: ; sä, että se ilmentää jossain edellisessä patenttivaatimuksessa esitettyä fuusiopoly- *:**: peptidiä. :T: 30 • M t · « • · · i t 1 • · « I 4 · • « · iit • t « • « 1 • · « 4 9 4 I I « f i i lt· 15 104255
FI915073A 1989-04-29 1991-10-28 Menetelmä ihmisen seerumialbumiinin N-terminaalifragmentteja sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi FI104255B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898909916A GB8909916D0 (en) 1989-04-29 1989-04-29 Polypeptides
GB8909916 1989-04-29
PCT/GB1990/000650 WO1990013653A1 (en) 1989-04-29 1990-04-26 Fusion proteins containing n-terminal fragments of human serum albumin
GB9000650 1990-04-26

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI915073A0 FI915073A0 (fi) 1991-10-28
FI104255B1 FI104255B1 (fi) 1999-12-15
FI104255B true FI104255B (fi) 1999-12-15

Family

ID=10656000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI915073A FI104255B (fi) 1989-04-29 1991-10-28 Menetelmä ihmisen seerumialbumiinin N-terminaalifragmentteja sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0470165A1 (fi)
JP (1) JP2781459B2 (fi)
KR (1) KR100227167B1 (fi)
AU (1) AU630450B2 (fi)
CA (1) CA2015687C (fi)
FI (1) FI104255B (fi)
GB (2) GB8909916D0 (fi)
HU (1) HUT61049A (fi)
IE (1) IE67651B1 (fi)
IL (1) IL94243A (fi)
WO (1) WO1990013653A1 (fi)
ZA (1) ZA903237B (fi)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686900B1 (fr) * 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1994016085A2 (en) * 1992-12-30 1994-07-21 Zymogenetics, Inc. Hybrid proteins having cross-linking and tissue-binding activities
GB9408466D0 (en) * 1994-04-27 1994-06-22 Univ Nottingham Cloning and functional expression of neurotoxins
US5543308A (en) * 1994-10-18 1996-08-06 New England Biolabs, Inc. Isolated DNA encoding the FSEI restriction endonuclease and related methods for producing the same
US5641483A (en) * 1995-06-07 1997-06-24 Beaulieu; Andre Wound healing formulations containing human plasma fibronectin
US7112320B1 (en) 1995-06-07 2006-09-26 Andre Beaulieu Solid wound healing formulations containing fibronectin
US5877149A (en) 1995-06-07 1999-03-02 Beaulieu; Andre Deepithelialized skin diffusion cell system
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6423512B1 (en) 1996-07-26 2002-07-23 Novartis Ag Fusion polypeptides
AR008077A1 (es) * 1996-07-26 1999-12-09 Talarico Salinas Laura Beatriz Un polipeptido de fusion o una sal del mismo, su uso, un proceso para prepararlos, una composicion farmaceutica que los comprende, y un vector.
US5932693A (en) * 1996-12-10 1999-08-03 Washington University Antithrombotic peptides
WO1999037793A1 (en) 1998-01-23 1999-07-29 Novo Nordisk A/S Process for making desired polypeptides in yeast
JP4087563B2 (ja) 1998-06-15 2008-05-21 ジーティーシー バイオセラピューティックス インコーポレイテッド エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン融合物
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1803730A1 (en) * 2000-04-12 2007-07-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP4949607B2 (ja) 2001-08-15 2012-06-13 タカラバイオ株式会社 抗原特異的細胞傷害性ｔ細胞拡大培養方法
EP1997829A1 (en) 2001-12-21 2008-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ES2397319T3 (es) 2002-03-25 2013-03-06 Takara Bio Inc. Proceso para producir linfocitos citotóxicos
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR20060039940A (ko) 2003-08-22 2006-05-09 다카라 바이오 가부시키가이샤 세포 상해성 림프구의 제조 방법
CA2536918A1 (en) 2003-08-26 2005-03-03 Leland Shapiro Compositions of, and methods for, alpha-1 antitrypsin fc fusion molecules
GB0329681D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Gene expression technique
GB0329722D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Modified plasmid and use thereof
AU2005317828A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Novozymes Delta Limited Gene expression technique
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP2474318A1 (en) 2006-06-07 2012-07-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2007274035A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Novozymes Biopharma Dk A/S Process for preparing particles of proteinaceous material
JP5936112B2 (ja) 2009-02-11 2016-06-15 アルブミディクス アクティーゼルスカブ アルブミン変異体及び複合体
BR112012009450A2 (pt) 2009-10-30 2017-05-23 Novozymes Biopharma Dk As variantes de albumina
US10233228B2 (en) 2010-04-09 2019-03-19 Albumedix Ltd Albumin derivatives and variants
KR102103476B1 (ko) 2011-06-24 2020-04-23 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 알파-1 안티트립신 융합 분자용 조성물, 방법 및 용도
HK1200842A1 (en) 2011-11-18 2015-08-14 Albumedix Ltd Proteins with improved half-life and other properties
CN104736559B (zh) 2012-03-16 2022-04-08 阿尔布梅迪克斯医疗有限公司 白蛋白变体
CN105452290A (zh) 2012-11-08 2016-03-30 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体
WO2014165093A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto
MX2018001825A (es) 2015-08-20 2018-05-07 Albumedix As Variantes y conjugados de albumina.
US11912750B2 (en) 2016-11-10 2024-02-27 Keros Therapeutics, Inc. GDNF fusion polypeptides and methods of use thereof
US12497441B2 (en) * 2018-10-29 2025-12-16 Spin Therapeutics, Llc Compositions and methods for alpha-1-antitrypsin disorders

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE459586B (sv) * 1987-09-14 1989-07-17 Mta Szegedi Biolog Koezponti Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning
GB8725529D0 (en) * 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
WO1990013653A1 (en) 1990-11-15
FI915073A0 (fi) 1991-10-28
IE901554L (en) 1990-10-29
FI104255B1 (fi) 1999-12-15
GB2246783A (en) 1992-02-12
AU630450B2 (en) 1992-10-29
IL94243A0 (en) 1991-01-31
JPH04506598A (ja) 1992-11-19
HU904413D0 (en) 1992-01-28
CA2015687A1 (en) 1990-10-29
IL94243A (en) 1995-10-31
KR100227167B1 (ko) 1999-10-15
JP2781459B2 (ja) 1998-07-30
AU5564690A (en) 1990-11-29
GB9119043D0 (en) 1991-12-04
HUT61049A (en) 1992-11-30
ZA903237B (en) 1991-03-27
GB2246783B (en) 1992-10-14
CA2015687C (en) 2000-08-29
IE67651B1 (en) 1996-04-17
KR920701451A (ko) 1992-08-11
GB8909916D0 (en) 1989-06-14
EP0470165A1 (en) 1992-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104255B (fi) Menetelmä ihmisen seerumialbumiinin N-terminaalifragmentteja sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi
EP0399666B1 (en) Fusion proteins containing n-terminal fragments of human serum albumin
US5766883A (en) Polypeptides
Kojima et al. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding a precursor for rat brain natriuretic peptide
CA1340522C (en) Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
US4764504A (en) Novel atrial natriuretic/vasodilator polypeptides
FI104635B (fi) Hirudiinia tuottava transformoitu hiiva ja menetelmä hirudiinin valmistamiseksi sillä
Jenkins et al. Cloning and expression analysis of full length mouse cDNA sequences encoding the transformation associated protein p53
CA1326217C (en) Method for preparing foreign protein in yeast, recombinant dna, transformant
US5187263A (en) Expression of biologically active PDGE analogs in eucaryotic cells
Schaeffer et al. Complete structure of the human transferrin gene. Comparison with analogous chicken gene and human pseudogene
FI103892B (fi) Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa polypeptidiä/proteiinia, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien biologiset ominaisuudet sekä niiden valmistus
Payne et al. Isolation of the genomic clone for pathogenesis-related protein 1a from Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc
WO1985004870A1 (en) Novel atrial natriuretic/vasodilator polypeptides
HU211207B (en) Method for producing recombinant dna molecules containing yeart ph05 gene upstream activating sequences
HU209146B (en) Method for producing desulphato-hydrudine
HU204563B (en) Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them
FI96956C (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hirudiinijohdannaisen valmistamiseksi
AU665034B2 (en) Production of human parathyroid hormone from microorganisms
US5420242A (en) Production of human parathyroid hormone from microorganisms
Barklis et al. Structure of the Dictyostelium discoideum prestalk D11 gene and protein
Hartl et al. The N terminus of laminin A chain is homologous to the B chains
IE890559L (en) A hirudin derivative
Nishikawa et al. Efficient cleavage by α-thrombin of a recombinant fused protein which contains insulin-like growth factor I
AU701136B2 (en) Novel inhibitor

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVOZYMES DELTA LIMITED

Free format text: NOVOZYMES DELTA LIMITED

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVOZYMES BIOPHARMA UK LIMITED

Free format text: NOVOZYMES BIOPHARMA UK LIMITED