JPH04506598A - ヒト血清アルブミンのｎ―末端フラグメント含有融合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２つの個々のポリペプチドまたはそれらの部分か融合して単一のアミ ノ酸鎖を生成した融合ポリペプチドに関する。このような融合は、組換えＤＮＡ 技術によって形成された単一の連続コード配列の発現によって生じる。

融合ポリペプチドとしては、たとえば、その方法の最終的な所望生成物か、細胞 からのそのポリペプチドの分泌を促進または可能にするＮ−末端「リーダー配列 」とともに発現した場合のポリペプチドが知られている。その例は、ＥＰ−Ａ　 −１１６２０１（Ｃｈｉｒｏｎ）に開示されている。

ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）は血液中に見出される既知の蛋白質である。ＥＰ −Ａ　−１４７１９８（ＤｅｌｔａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、形質転換 宿主、この場合は酵母中てのその発現を開示している。本発明者らの以前の出願 、ＥＰ−Ａ−３２２０９４には、ＩＳＡのＮ−末端フラグメント、すなわち、治 療的利用性を有する、残基ｌ〜ｎ（ｎは３６９〜４１９である）からなるフラグ メントか開示されている。この出願はまた、このような分子のＣ−末端残基を、 とくに名指しされてはいないか、他のポリペプチドに融合することの可能性につ いて触れている。

本発明の一態様は融合ポリペプチドを提供するものである。この融合ポリペプチ ドは、そのＮ−末端部分の少なくとも一部として、ＩＳＡのＮ−末端部分または その変異体と、そのＣ−末端部分の少なくとも一部として、それを除く他のポリ ペプチドからなる融合ポリペプチドを提供する。ＩＳＡの上記Ｎ−末端部分か１ −ｎ部分（ｎは３６９〜４１９である）またはその変異体である場合には、上記 ポリペプチドは（ａ）ヒトフィブロネクチンの５８５〜１５７８部分もしくはそ の変異体、（ｂ）ＣＤ４の１〜３６８部分もしくはその変異体、（Ｃ）血小板由 来成長因子もしくはその変異体、（ｄ）形質転換成長因子もしくはその変異体、 （ｅ）成熟ヒト血漿フィブロネクチンの１〜２６１部分もしくはその変異体、（ ｆ）成熟ヒト血漿フィブロネクチンの２７８〜５７８部分もしくはその変異体、 （ｇ）成熟ヒトフオン・ビルプラント因子の１〜２７２部分もしくはその変異体 、または（ｈ）α−１−抗トリプシンもしくはその変異体である。

ＩＳＡのＮ−末端部分は、好ましくは、上記１〜ｎ部分、１〜１７７部分くシス ティンまてそれを含めて）、１〜２００部分（システィンまで、たたしそれを除 く）、または１−１７７および１〜２００の中間部分である。

「ヒ［・血清アルブミンＪ　（ＩＳＡ）の語は、ＩＳＡの既知のまたはまた発見 されていない多形型を包含する（必ずしもそれに限定されるものではない）。た とえば、アルブミンＮａ５ｋａｐｉはＧｌｕ−３７２の代わりＩ：Ｌｙｓ−３７ ２を有し、またブローアルブミンＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈは変化したブロー配 列をもっている。「変異体」の語は、配列における微小な人工的変異（たとえば 、１個もしくは２．３個の残基か欠失した分子、保存的置換もしくは残基の微小 な挿入を有する分子、またはアミノ酸構造のわずかな変化を有する分子）を包含 することを意味する（たたし、これに限定されるものではない）。すなわち、Ｉ ＳＡと８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有す るポリペプチドか「変異体」とみなされる。このような変異体はまた、生理学的 にＩＳＡと均等であることか好ましい。すなわち、変異体はＩＳＡと少なくとも １種の薬理学的有用性を共有することか好ましい。さらに、薬理学的使用が意図 される変異体候補は、処置すべき動物（とくにヒト）に対して非免疫原性てなけ ればならない。

保存的置換とは、１種または２種以上のアミノ酸か類似の性質を存する他のアミ ノ酸に置換された置換であって、ポリペプチド化学における熟練者であればその ポリペプチドの少なくとも二次構造、好ましくは三次構造に実質的な変化を生し ないことが予期てきるような置換をいう。たとえば、典型的なこのような置換の 例には、グルタミンのアスパラギンへの、アスパラギンのセリンへの、またリジ ンのアルギニンへの置換かある。変異体はまた、あるいは同時に、相当する天然 ＩＳＡ部分に対比して１０個まで（好ましくは１個または２個のみ）の中間アミ ノ酸残基（上記ＨＳＡのＮ−末端部分の末端ではない）を欠失していてもよく、 このような脱落は分子（成熟Ｈ３Ａ自体に関して）１００から３６９まての部分 （存在すれば）に生しることか好ましい。同様に、１０個まで、たたし好ましく は１個または２個のみのアミノ酸が付加されていてもよい。この場合も、付加は １００から３６９までの部分（存在すれば）に生しることか好ましい。「生理機 能的に均等なＪの語はまた、上記配列に加えてさらにＮ−末端における他の配列 （たとえばブローＩＳＡ、プレーブロー８Ａおよびｍｅ　ｔ−ＩＳＡ）からなる より大きな分子も包含する。

当然ではあるか、本発明の融合化合物中の上記「他のポリペプチド」がＩＳＡの 残余部分であることはない。

そうでないと、全体のポリペプチドがＩＳＡになってしまい、「融合ポリペプチ ド」てはなくなるからである。

Ｈ３Ａ様部分が上述のＩＳＡの１〜ｎ部分てない場合でも、非Ｈ３Ａ部分は上述 の（ａ）〜（ｈ）の実体の−っであることが好ましい。

ＣＤ４の１〜３６８部分は、ヒトＴリンパ球ＣＤ４蛋白質の最初の４個のジスル フィド連結免疫グロブリン様ドメインであり、そのアミノ酸配列についての遺伝 子は１７０４〜ｌ７０７、Ｉ　９８７）。これはＨＩＶ感染の１減に用いられる 。

ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、Ｃｏ１１ｉｎＳら：Ｎａｔｕｒｅ、　 ３１６：７４８〜７５０　（１９８５）に記載されている。同様に、形質転換成 長因子β（ＴＧＦ−β）の配列は、Ｄｅｒｙｎｃｋら：　Ｎａｔｕｒｅ。

３１６：７０１〜７０５　（１９８５）に記載されている。

これらの成長因子は創傷治癒に有用である。

Ｆｎの１〜２６１部分のｃＤＮＡ配列はＥＰ−Ａ−２（１７７５１に開示されて いる（プラスミドｐＦＨ６がらエンドヌクレアーゼＰｖｕ［によって得られる） 。この部分はフィブリンに結合し、融合化合物を血餅に向けさせるのに用いられ る。

コラーゲン結合ドメインを含存するＦｎの２７８〜５７８部分のｃＤＮＡ配列は 、Ｒ，Ｊ、Ｏｗｅｎｓ　＆　Ｆ、Ｅ、Ｂａｒａｌｌｅにより１９８６年、ＥＭＢ ＯＪ、５．２８２５〜２８３Ｏｆ１ｍ開示されている。この部分は血小板に結合 する。

フォノ・ビラブランド因子の１〜２７２部分は第■因子に結合して、それを安定 化する。その配列はＢｏｎｔｈａｍα−１−抗トリプシンの変異体にはＲｏｓｅ ｎｂｕｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ、３１２．７７〜８ｏ、１９８４）によって開示さ れた変異体が包含される。とくに、本発明はビッッパーグ変異体（Ｍ　ｅ　ｔ３ ５１かＡｒｇに変異している）およびＰｒｏ３５７とＭｅｔ”’がそれぞれアラ ニンおよびアルギニンに変異した変異株を包含する。これらの化合物は、細菌性 ショックや肺疾患の処置に有用である。

本発明のポリペプチドの非−Ｈ３Ａ部分の変異体には、Ｈ３Ａ部分について上述 したような変異体を包含し、たとえば保存的アミノ酸置換を存する変異体、また 他の種からの相同体かある。

本発明の融合ポリペプチドは、ＨＳＡのＮ−末端部分に相当する部分を越えて広 がるＮ−末端アミノ酸をもっていてもよい。たとえば、Ｈ３Ａ様部分が成熟Ｈ３ ＡのＮ−末端部分に相当する場合には、それにプレ、プロまたはプレープロ配列 、たとえば酵母のα−因子リーダー配列か付加されていてもよい。ＷＯ９０１０ １０６３号の融合リーダ一部分が使用できる。Ｈ３Ａ部分に融合したポリペプチ ドは、天然に存在するポリペプチド、そのフラグメントまたは融合ボリペチドを 含めた新規なポリペプチドであってもよい。たとえば、以下の例３におけるよう に、フィブロネクチンのフラグメントを４アミノ酸リンカ−を介してＨＳＡに融 合される。

Ｈ３Ａ分子のアミノ末端部分は、真核細胞中で、本発明の融合化合物のとくに効 率的なトランスロケーションおよび排出に有利な構造をもつことが明らかにされ ている。

本発明はその第二の態様として、上述の融合ポリペプチドの発現に適するように 配置された核酸配列を有する形質転換宿主を提供する。「適するように配置され た」の語は、たとえば、ヌクレオチド配列か適当なＲＮＡポリメラーゼ結合部位 と翻訳開始配列をもって正しい読み取り枠で、また適当なプロモーターの制御下 にあることを意味する。プロモーターは宿主に関して同種でも異種でもよい。既 知のように、所望によって下流（３′）調節配列か包含されていてもよい。宿主 としては、酵母〔たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属たとえばＳ、ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ　：Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属たとえばに、　１ａｃｔｉｓ 　；　Ｐｉｃｈｉａ属；またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｓ属たとえ ばＳ、ｐｏｍｂｅ　：ｌか好ましいか、他の任意の適当な宿主、たとえばＥ、ｃ ｏｌｉ、　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ。

Ａｓｐｅｒｇｉ　ｆｌｕｓ属、哺乳動物細胞、植物細胞または昆虫細胞であって もよい。

本発明の第三の態様は、本発明の第二の態様の形質転換細胞を培養し、ついて融 合ポリペプチドを有用な型で分離することによる、本発明の第一の態様の融合ポ リペプチドの製造方法を提供する。

本発明の第四の態様は、上述の融合ポリペプチドを投与することからなる、ヒト または他の動物の生体の治療的処置方法を提供する。

本発明の方法は、とくに、酵母からの有用なヒト蛋白質の分泌効率を改善するこ とに関し、通常は効率的には分泌されないこれらの蛋白質をＨＳＡのアミノ末端 部分に融合するとの着想に基づくものである。この種の蛋白質の一つとして、有 用な創傷治癒ポリペプチドとしての価値が考えられるヒトフィブロネクチンのア ミノ酸５８５〜１５７８（本明細書ではＦｎ５８５〜［５７８と呼ぶ）かある。

本発明者らが別出願（同日付出願）に記載しているように、この分子は、創傷治 癒に有用な細胞拡散活性、化学走化活性および化学動力学活性を有する。

Ｃ−末端部分がＦｎ５８５〜１５７８である本発明の融合ポリペプチドは、とく にハイブリッドヒト蛋白質か局所的に適用される場合、生合成されたまま、創傷 治癒の適用に使用できる。しかしながら、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸５８ ５〜１５７８の部分は所望により、Ｘ因子切断部位からなるアミノ酸をフィブロ ネクチン部分の最初のアミノ酸に先行させることによって、融合蛋白質から回収 することができる。培養上清から融合蛋白質を単離したのち、所望の分子をＸ因 子切断によって遊離させ、適当なりロマトグラフィ−（たとえばイオン交換クロ マトグラフィー）によって精製する。酵素的または化学的切断か可能な他の部位 は、Ｎ−末端とＣ−木端部分の適当な並置またはその間への適当なリンカ−の挿 入によって提供することができる。

本発明の融合ポリペプチドの少なくとも一部、とくに上記ＣＤ４およびｖＷＦフ ラグメント、ＰＤＧＦならびにα１ΔＴを包含する融合ポリペプチドでは、血中 での半減期が増大し、したがって、それ自体の利点および治療的有用性、すなわ ち分子の非ＩＳＡ部分の治療的有用性が増す。αＩＡＴ等の場合、化合物は通常 、１回限りまたは短期間に数回のみしか投与されず、長期にわたって使用される ことはないので、これらの、化合物か免疫応答を生じる可能性は小さい。

例；要約 標準的な組換えＤＮＡ操作は、とくに指示しない限り、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１ ９８２年刊および最近の第２版）によって記載された通りとした。ファージＭ１ ３組換えクコーンの構築および分析はＭｅｓｓｉｎｇ　（１９８３）およびＳａ ｎｇｅｒら（１９７７）の記載によった。

以下の分子の構築に使用されるヒト血清アルブミンの蛋白質をコードするＤＮＡ 配列は、プラスミドｍＨＯＢ１２およびｐＤＢ２　（ＥＰ−Ａ−３２２０９４、 Ｄｅｌｔａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ　、その関連部分は以下に再 掲する）から、またはこの配列の部分に均等なオリゴヌクレオチドの合成により 、誘導される。血漿フィブロネクチンをコードする完全ヒトｃＤＮＡを含有する プラスミドｐＦＨＤＥＬ１は、プラスミドｐＦＨ６，１５，５４，１５４および Ｌ　（ＥＰ−Ａ−２０７７５１；ＤｅｌｔａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔ ｄ　）に由来するＤＮＡのリゲーションによって得られた。

このＤＮＡは’ＥＤ’配列を含まないｍＲＮＡ変異体の一例てあり、ｍ−ｃｓ領 領域８９−アミノ酸変異を存する（　Ｒ，Ｊ、　Ｏｗｅｎｓ、　Ａ、　Ｒ，Ｋｏ ｒｎ−ｂｌｉｈｔｔ　＆　Ｆ、　Ｅ、　Ｂａｒａｌｌｅ：０ｘｆｏｒｄ　５ｕｒ ｖｅｙｓ　ｏｎ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｇｅｎｅ　３．１４１〜１６０．１９ ８６）。このベクターの地図は図１１に、このｃＤＮＡの発現によって産生され る成熟ポリペプチドの蛋白質配列は図５に示されている。

オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０　Ｂオリ ゴヌクレオチドシンセサイザーにより、製造業者の推奨に従って合成した（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ。

Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ　）。

ＨＳＡ分泌シグナルと３８７番目のアミノ酸、ロイシンまで（これを含む）をコ ードするＤＮＡか、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸５８５〜１５７８　（前後 を含む）セグメントをコードするＤＮＡとインフレームに融合し、Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで機能する高度に効率的なガラクトース 誘導可能プロモーターであるＥＰ−Ａ−２５８０６７（Ｄｅｌｔａ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ）のハイブリッドプロモーターの下流に配置された発現ベクタ ーを構築した。ヒトフィブロネクチンの第１５７８番目のアミノ酸のコドンは直 接、停止コドン（ＴＡＡ）、ついでＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホスホグリセレ ートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子転換ターミネータ−に続いていた。このベクター を次にＳ、　ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　ｉａｅに形質転換によって導入して、Ｈ３Ａの Ｎ−末端の３８７個のアミノ酸かＣ末端で、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸５ ８５〜１５７８に融合したハイブリッド分子を発現させ、細胞から分泌させた。

第二の例では、Ｈ３ＡのＮ−末端の１９５個のアミノ酸かＣ末端て、ヒトフィブ ロネクチンのアミノ酸５８５からの分泌を可能にする類似のベクターか構築され る。

本発明の態様を、以下に例を挙げ、添付の図面を参照しなから説明する。図中、 図１　（２頁）は、現在最も代表的と考えられる天然ＨＳ　Ａのアミノ酸配列を 示しくＨ３Ａ（１−ｎ）の選択可能なＣ末端を四角て囲んである〕、 図２（２頁）は成熟Ｈ３ＡをコードするＤＮＡ配列であり（リンカ−３に含まれ る配列は下線を付しである）、図３は、ｍＨＯＢ　ｌ　６の構築を図式的に例示 した図であり、 図４は、ｐＨ０Ｂ３１の構築を図式的に例示した図であり、 図５（６頁）はＦｎプラスミドｐＦＨＤＥＬ１でコードされる成熟蛋白質配列を 例示し、 図６は、リンカ−５を例示し、８個の構成要素オリゴヌクレオチドか示されてい て、 図７は、プラスミドｐＤＢＤＦ２の構築を図式的に示し、 図８は、プラスミドｐＤＢＤＦ５の構築を図式的に示し、 図９は、プラスミドｐＤＢＤＦ９の構築を図式的に示し、 図１０は、プラスミドｐＦＨＤＥＬｌを用いたプラスミドＤＢＤＦ　１２の構築 を図式的に示し、図１１は、プラスミドｐＦＨＤＥＬ１の地図を示す。

例１：Ｆｎ５８５〜１５７８１ゴ融合したＨＳＡＩ〜以下は、ＥＰ−Ａ−３２２ ０９４に開示されている、Ｈ３Ａの部分をコートする配列からなるプラスミドの 製造の説明である。

以下の分子の構築に用いられるヒト血清アルブミンをコードする配列は、プラス ミドＭＩ３ｍｐ１９．７（ＥＰ−Ａ−２０１２３９，ＤｅｌｔａＢｉｏｔｈｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄ、　）から、またはこの配列の一部に相当するオリゴヌク レオチドの合成により誘導される。オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０　Ｂオリゴヌクレオチドシンセサイザーにより、製造 業者の推奨に従って（ＡＢＩｎｃ、　ＷａｒｒｉＢｔｏｎ、　Ｃｈｅｓｈｉｒｅ 、　Ｅｎｇｌａｎｄ）、ホスホルアミダイト化学を用いて合成された。

既知のＨ３Ａコード配列（図２）のＰｓｔＩ部位（図２．１２３５〜１２４０） から、コドンかＧＴＧからＧＴＣへ変化されたバリン３８１まてのコドンまでの 部分であるオリゴヌクレオチドが合成された（リンカ−Ａ）。

リンカ−１ ５’　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＴＧＣＴＡＴ３’ＡＣＧＴ　ＣＴＡ　 ＧＧＡ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＴＡＧＣＣＡＡＡ　ＧＴＧ　ＴＴＣＧＡＴ 　ＧＡＡ　ＴＴ’Ｉ’　ＡＡＡＣＧＧ　ＴＴＴ　ＣＡＣＡＡＧ　ＣＴＡ　ＣＴＴ 　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＬＶ ＣＴＴ　ＧＴＣ３’ ＧＧＡ　ＣＡＧ　５’ リンカ−１を、予めＰｓｔＩとＨｉｎｃＩＩて消化したベクターＭ　ｌ　３　ｍ 　ｐ　１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、１９８３）にリゲートし、このリゲーシ ョン混合物を用いて大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ　）をトランスフェクトした。組換えクローンは、 ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド）の存在下、色素生成指示薬Ｘ −ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド） を含有するメジウム上で青色を呈しないことにより同定された。組換えクローン のバクテリオファージ粒子から調製された鋳型ＤＮＡのＤＮＡ配列分析により、 必要なりＮＡ配列をもつ分子か同定され、ｍＨＯＢ　ｌ　２と命名された（図３ ）。

Ｍ１３ｍｐ１９．７は、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、１ ９８３）中の成熟Ｈ３Ａのコード領域からなり、Ｈ３Ａの最初のアミノ酸のコド ン、ＧＡＴか唯一のＸｈｏＩ部位と次のように重複している（ＥＰ−Ａ−２１０ ２３９）。

Ａｓｐ　Ａｌａ ５’　ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡ　３’ ３’　ＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＴ　５’ Ｍｆ３ｍｐ１９．７はＸｈｏＩで消化し、Ｓｌ−ヌクレアーゼ処理してブラント 末端を作成し、ついで以下のオリゴヌクレオチド（リンカ−２）とリゲートした 。

リンカ−２ ５′ＴＣＴＴτＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡ　３’３′ＡＧＡ ＡＡＡＴＡＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴ　５’膓ｄエエエ 次にこのリゲーション混合物を用いて大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅをトランスフェク トし、数個のプラークから鋳型ＤＮＡを調製し、ついでＤＮＡ配列決定によって 分析して、正しい配列を存するクローン、ｐＤＢＤｌ　（図３）を同定した。

Ｈ３Ａコード領域の５°末端と挿入オリゴヌクレオチドリンカーの半分に相当す る１、ＩｋｂのＨｉｎｄ］ＩＩ〜ＰｓｔＴフラグメントをｐＤＢＤＩからアガロ ースゲル電気泳動によって単離した。このフラグメントを次に、予めＨｉｎｄＩ ＩＩとＰｓｔＩで消化した二本ｉ！ｍＨＯＢ１２にリゲートし、ついてこのリゲ ーノヨン混合物を用いて大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅをトランスフェクトした。数個 のプラークの成熟バクテリオファージ粒子から一本鎖鋳型ＤＮＡを作成した。Ｄ ＮＡを、アニーリングしたシクエンシングプライマーから、デオキシヌクレオシ ド三リン酸の存在下ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントによる延長て 、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏにおいて二本鎖とした。このＤＮＡの制限酵素分析により、 正しいコンフィギユレーションをもつクローン、ｍＨＯＢ１５（ｌｆｆ１４）の 同定か可能となった。

以下のオリゴヌクレオチド（リンカ−３）は、成熟Ｈ３Ａの３８２番目のアミノ 酸（グルタミン酸、ＧＡＡ）のコドンからリジン３８９のコドンまてに相当し、 これに停止コドン（ＴＡＡ）およびＨｉｎｃ！ＩＩＩ部位、リンカ−３ ε　ε　ＰＱＮＬＩＫＪ ５　’　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴＣＡＡＡ　Ｔ ＡＡ　ＧＣＴＴＧ　３　’３’　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＧＡ　ＧＴＣＴＴＡ　ＡＡＴ 　ＴＡＧ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＣＧＭＣＣＴＡＧ　５’これを、予めＨｉｎｃＩＩ とＢａｍＨＩで消化した二本鎖ｍＨＯＢ　１５にリゲートした。リゲーソヨン後 、ＤＮＡをＨｉｎｃＩｒで消化してずへての非組換え分子を破壊し、次にこれを 用いて大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅをトランスフェクトした。多数のクローンのバク テリオファージ粒子から一本ＭＤＮＡを作成し、ＤＮＡ配列分析に付した。正し いＤＮＡ配列を有する一つのクローンをｍＨＯＢ１６（図４）と命名した。

成熟ＨＳＡコード領域がＨ８Ａ分泌シグナルに融合した分子は、ＢａｍＨＩおよ びＸｈｏｒ消化Ｍ湧出　３　ｍ　ｐ１９．７にリンカ−４を挿入して、ｐＤＢＤ ２　（図４）を形成させることにより作成した。

リンカ−４ ＳｋＹ、５ＲＧＶＦ ＴＣＧ　ＧＣＴ　’　ＴＡＴ”　ＴＣＣＡＧＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＴＴＴＡＧＣ ＣＧＡ　ＡＴＡ　ＡＧＧ　ＴＣＣＣＣＡ　ＣＡＣＡＪＩＡこのリンカ−中、最初 のメチオンの後の４番目のアミノ酸のコドン、Ｈ３Ａプレープロリーダー配列（ Ｌａｗｎら、１９８１）中スレオニンのＡＣＣはセリンのＡＧＣに変化していて 、ＨｉｎｄＩ［部位を形成している。

既知のＨ３Ａ：＋−ド配列の部分（Ｌａｗｎら、１９８１）（アミノ酸３８２〜 ３８７、図２）が既知のフィブロネクチンコード配列の部分（Ｋｏｒｎ−ｂ　Ｉ 　ｉｈ　ｔ　ｔら、１９８５）（アミノ酸５８５〜６４０、図２）に融合した合 成りＮＡ配列は、６個のオリゴヌクレオチドの合成により製造した（リンカ−５ 、図６）。オリゴヌクレオチド２．３．４．６．７および８を、Ｔ４ポリヌクレ オチドキナーゼを用いてリン酸化し、ついてオリゴヌクレオチドを対にして、す なわち１＋８．２＋７．３＋６および４＋５を標準条件下にアニーリングされた オリゴヌクレオチドを次に一緒に混合して、予め制限酵素Ｈｉｎｃ［およびＥｃ ｏＲＩて消化したｍＨＯＢ　１２とリゲートした。

ついで、リゲーション混合物を用いて大腸菌ＸＬＩ−Ｂ　１　ｕ　ｅ　（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ）にトランフエクトした。次に、数個の独立のプラークに由来する成熟バクテリ オファージ粒子から一本鎖鋳型ＤＮＡを調製し、ついてＤＮＡシクエンシングに よって分析した。期待された配列のリンカ−かベクターに正しく挿入されたクロ ーンをｐＤＢＤＦｌ　（図７）と命名した。このプラスミドを次にＰｓｔｌおよ びＥｃｏＲＩで消化し、約０．２４ｋｂのフラグメントを精製し、ｐＤＢＤ２　 （図７）の１．２９ｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ’７ラグメントおよびＢａ ｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ消化ｐ　Ｕ　Ｃｌ　９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら 、１９８５）とリゲートして、ｐＤＢＤＦ２　（図７）を形成させた。

全長ヒトフィブロネクチンをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド、ｐＦＨＤ ＥＬｌをＥＣ０ＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、０．７７ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ ｌフラグメント（図８）を単離し、ついてＥｃｏＲＩと５ａｉｌでｉｈ化したＭ 　ｌ　３　ｍ　ｐ　Ｉ　８　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ら、１９８３）とリゲート して、ｐＤＢＤＦ３　（図８）を形成させた。

ＥＰ−Ａ−２０７７５１のフィブロネクチン配列の４７８４〜４７９１における Ｐｓｔ１部位からチロシン１５７８のコドン（図５）に相当し、これに続いて停 止コドン（ＴＡＡ）　、Ｈｉ　ｎｄＩＩ［部位、ついてＢａｍＨＩ付着端を有す る以下のオリゴヌクレオチドリンカー（リンカ−６）を合成した。

リンカ−６ ＧＰＤＱＴＥＭＴｒｌ！ＧＬ ＧＧＴ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＧＭ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　Ｇ Ｍ　ＧＧＣＴＴＧＡ　ＣＧＴ’　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　ＧＴ’ｒ　ＴＧＴ　 ＣＴＴ　ＴＡＣＴＧＡ　ＴＡＡ　ＣＴＴ　ＣＣＧ　ＡＡＣＱＰＴＶＥＹ　Ｓセｏ ｐ ＣＡＧ　ＣＣＣＡＣＡ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＡＴ　ＴＭ　ＧＣＴＴＧＧＴＣＧＧ Ｇ　ＴＧＴ　ＣＡＣＣＴＣＡＴＡ　ＡＴＴ　ＣＧＡＡＣＣＴＡＧこのリンカ−を 次に、ＰｓｔｌおよびＨｉｎｄＩ［消化ｐＤＢＤＦ３とリゲートしてｐＤＢＤＦ ４　（図８）を生成させた。ついで、以下のＤＮＡフラグメント、すなわちｐＤ ＢＤＦ４の０．６８ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−１の２．２ｋｂ　５ｔｕｌ−ＥｃｏＲＩ フラグメントを、−２５８０６７）と−緒にリゲートさせた。得られたプラスミ ドｐＤＢＤＦ５　（図８）は、成熟Ｈ３Ａのアミノ酸１〜３８７をコードするＤ ＮＡに融合したＨ３Ａ分泌シグナルの発現を指図するＥＰ−Ａ−２５８０６７の プロモーターを包含し、一方、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸５８５〜１５７ ８をコードするＤＮＡと直接、インフレームに融合し、その後で翻訳は停止コド ンＴＡＡにおいて停止する。これはＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｐ　Ｇ　Ｋ遺 伝子転写ターミネータ−に続いている。このプラスミドはまた、ε、　ｃｏｌｉ およびＳ、　ｃｅｒｅｙｉｓｉａｅ中での選択および維持を可能にする配列を含 存する（ＥＰ−Ａ−２５８０６７）。

このプラスミドを標準操作（Ｂｅｇｇｓ、　１９７８　）によっ例２　：Ｆｎ５ ８５〜１５７８に融合したＨ８Ａｌ〜この第二の例においては、ヒト血清アルブ ミンの最初のドメイン（アミノ酸１〜１９５）をヒトフィブロネクチンのアミノ 酸５８５〜１５７８に融合させる。

プラスミドｐＤＢＤ２をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、０．７９ｋｂフ ラグメントを精製し、ついてＢａｍＨＩ消化Ｍ１湧出ｐ１９とリゲートシて、ｐ ＤＢＤＦ６　（図６）を生成させた。

以下のオリゴヌクレオチド ５’−ＣＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＴＴＣＧ−３’を突然変異誘発プライ マーとして使用し、ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣによ って供給されているキットを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により、ｐＤ ＢＤＦ６中にＸｈｏ１部位を創製した。この部位は、Ｈ３Ａの塩基番号６９６を ＴからＧへ変化させて作成された（図２）。次に、この新たに作成されたＸｈｏ １部位がらＨ３Ａのリジン１９５のコドン（ＡＡＡ）までおよびそれに続き、フ ィブロネクチンのイソロイシン５８５のコドンから図６に示したオリゴヌクレオ チド１と８の末端までに相当する以下のリンカ−を合成した。

リンカ−７ ＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫ ＴＣＧＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＧＣ Ｔ　ＴＣＧ　ＴＣＴ　ＧＣＣＡＡＡＡ　ＣＴＴ　ＧＭ　ＧＣＣＣＴＡ　Ｃ’ｒＴ 　ＣＣＣＴＴＣＣＧＡ　ＡＧＣＡＧＡ　ＣＧＧ　ＴＴＴ工　ＴＥＴＰＳＱＰＮＳ Ｈ ＡＴＣＡＣＴ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣＧ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＣＴＡＧ　ＴＧＡ　 ＣＴＣＴＧＡ　ＧＧＣＴＣＡ　ＧＴＣＧＧＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＴＧ　Ｇこの リンカ−を、図３に示すアニーリングされたオリゴヌクレオチド、すなわち２＋ ７．３＋６および４＋５、ならびにＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＤＢＤＦ ７とともにリゲートして、ｐＤＢＤＦ８　（図９）を生成させた。元のＨ３Ａの ＤＮＡ配列、すなわちアミノ酸を再生するため、リンカ−７および他のオリゴヌ クレオチドのｐＤＢＤＦ７への挿入でＸｈｏ１部位は再生しないことに注意すべ きである。

ｐＤＢＤＦ８の０．８３ｋｂＢａｍＨＩ−３ｔｕｌフラグメントを精製し、つい てｐＤＢＤＦ２のｏ、６８ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントおよびｐＤ ＦＨＤＥＬＩの２．２２ｋｂＳｔｕｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントと、ＢｇｌＩＩ 消化ｐＫ湧出０中にリゲートして、ｐＤＢＤＦ９　（図９）を生成させた。この プラスミドは、Ｈ３ＡがｐＤＢＤＦ　８の場合の１〜３８７てはなく、残基ｌ〜 １９５のみに特定されていることを除いてｐＤＢＤＦ５と同しである。

上述の場合と同様、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｓ　Ｉ　５０−２　Ｂ中に導入 すると、このプラスミドはＨ３Ａの残基１〜１９５かフィブロネクチンの残基５ ８５〜１５７８に融合してなるハイブリッド分子の発現および分泌が指図される 。

例３：Ｆｎ５８５〜１５７８に融合したＨ３ＡＩ〜３８７（切断可能分子） フィブロネクチンの残基５８５〜１５７８の大量の製造を容易にするため、Ｈ３ Ａの残基ｌ〜３８７をコードするＤＮＡとフィブロネクチンの残基５８５〜１５ ７８をコードするＤＮＡの間に以下の配列をはさんだ。

ＥＧＲ ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＡ この配列は、血液凝固第Ｘ因子の切断認識部位を特定するものである。その結果 、精製された分泌生成物を第Ｘ因子で処理し、ついてこの分子のフィブロネクチ ン部分をＨ３Ａ部分から分離することか可能になる。

そのためには、２個のオリゴヌクレオチドを合成し、ついでそれらをアニーリン グしてリンカ−８を生成させた。

リンカ−８ ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴＣ ＴＴ　ＣＴＣＧＧＡ　ＧＴＣＴＴＡ　ＭＴ　ＴＭ　ＣＴＴ　ＣＣＡＲＩＴＥＴＰ ＳＱＰ ＡＧＡ　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣＧ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＣＴＣＴ　 ＴＡＧ　ＴＧＡ　ＣＴＣＴＧＡ　ＧＧＣＴＣＡ　ＧＴＣＧＧＧＳＨ 費Ｇ　ＡＧＧ　ＧＴＧ　Ｇ このリンカ−をついで、図６に示したようなアニーリングされたオリゴヌクレオ チド、すなわち２＋７．３＋６および４＋５と、ＨｉｎｃＩ［−ＥｃｏＲＩ消化 ｍＨ湧出　１２にリゲートして、ｐＤＢＤＦ　１０　（図７）を生成させた。こ のプラスミドを次にＰｓｔｌとＥｃ。

Ｒ１て消化し、はぼ０．２４ｋｂのフラグメントを精製し、ついでｐＤＢＤ２の １．２９ｋｂ　ＢａｍＨＩ−１０）を生成させた。

フラグメントを次に、ｐＤＢＤＦ４の０．６８ｋｂ・　てｐＤＢＤＦ　＋　２　 （図１０）を生成させた。このプラスミドをついてＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　 Ｓ　−１５０−２Ｂ中に導入した。分泌した融合蛋白質を精製し、第Ｘ因子て処 理すると、天然分子の残基５８５〜１５７８に相当するフィブロネクチンフラグ メントか遊離する。

参考文献 ＢｅｇｇｓｌＪ、Ｄ、　（１９７１３）　Ｎａｔｕｒｅ　２７５．１０４−１０ ９Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔ、ｔら　（１９８５）　ＥＭＢｏ　Ｊ、　４．１７５５− １７５９ＴＡｗｎ、　Ｒ，Ｍ、ら　（１９８１）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒ ｅｓ、　９．６１０３−６１１４Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら　（１９８２）　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａセｏｒｙ、　Ｃｏｌ ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

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Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｎ−末端部分の少なくとも一部としてＨＳＡのＮ−末端部分またはその変異 体、およびＣ−末端部分の少なくとも一部としてそれ以外の他のポリペプチドか らなり、上記ＨＳＡのＮ−末端部分が１〜ｎ部分（ｎは３６９〜４１９である） もしくはその変異体である場合は、上記ポリペプチドは（ａ）ヒトフィブロネク チンの５８５〜１５７８部分もしくはその変異体、（ｂ）ＣＤ４の１〜３６８部 分もしくはその変異体、（ｃ）血小板由来成長因子もしくはその変異体、（ｄ） 形質転換成長因子もしくはその変異体、（ｅ）成熟ヒト血漿フィブロネクチンの １〜２６１部分もしくはその変異体、（ｆ）成熟ヒト血漿フィブロネクチンの２ ７８〜５７８部分もしくはその変異体、（ｇ）成熟ヒトフォン・ビルブラント因 子の１〜２７２部分もしくはその変異体、または（ｈ）α−１−抗トリプシンも しくはその変異体である融合ポリペプチド。
2. ２．ＨＳＡのＮ−末端部分に相当する部分がさらに少なくとも１個のＮ−末端ア ミノ酸で延長されている「請求項１」記載の融合ポリペプチド。
3. ３．Ｎ−末端部分とＣ−末端部分の接合部に切断可能領域を設けた「請求項１ま たは２」記載の融合ポリペプチド。
4. ４．Ｃ−末端部分はヒト血漿フィブロネクチンの５８５〜１５７８部分またはそ の変異体である「請求項１〜３」のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
5. ５．「請求項１〜４」のいずれかに記載の融合ポリペプチドを発現するように配 列されたヌクレオチドを有する形質転換またはトランスフェクションされた宿主 。
6. ６．「請求項５」記載の宿主を培養し、ついで融合ポリペプチドを有用な形態で 分離する融合ポリペプチドの製造方法。
7. ７．治療に使用するための「請求項１〜４」のいずれかに記載の融合ポリペプチ ド。