HUT61049A - Process for producing polypeptides - Google Patents

Process for producing polypeptides Download PDF

Info

Publication number
HUT61049A
HUT61049A HU904413A HU441390A HUT61049A HU T61049 A HUT61049 A HU T61049A HU 904413 A HU904413 A HU 904413A HU 441390 A HU441390 A HU 441390A HU T61049 A HUT61049 A HU T61049A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
variant
hsa
terminal
region
fusion polypeptide
Prior art date
Application number
HU904413A
Other languages
English (en)
Other versions
HU904413D0 (en
Inventor
David James Ballance
Original Assignee
Delta Biotechnology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Delta Biotechnology Ltd filed Critical Delta Biotechnology Ltd
Publication of HU904413D0 publication Critical patent/HU904413D0/hu
Publication of HUT61049A publication Critical patent/HUT61049A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány olyan fúziós polipeptidekkel foglalkozik, amelyekben két egyedi polipeptid vagy ezek részei fuzionálva vannak, hogy egyetlen aniinosav láncot alkossanak. Az ilyen fúziós termék származhat egy egyedi, folyamatos, rekombináns DNS technikával kialakított kódoló szekvencia kifejeződéséből.
Fúziós polipeptidek már ismertek, pl. olyanok, ahol egy polipeptid - amely az eljárás kívánt végterméke - egy N-terminális vezető szekvenciá”-val együtt fejeződik ki, amely ösztönzi, vagy lehetővé teszi a polipeptid kiválasztódását a sejtből. Erre példát nyújt az EP-A-116 201 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Chiron).
A humán szérum albumin (HSA) ismert fehérje, amely a vérben található. Az EPA-147 198 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Delta Biotechnology) leírja ennek kifejezését transzformált gazdaszervezetben, ez esetben élesztőben. Korábbi, EP-A-322 094 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratban megjelent leírásunkban ismertetjük a HSA N-terminális fragmentumait, nevezetesen azokat, amelyek az 1.-n. gyököket tartalmazzák, ahol n 369 és 419 közti érték; ezek terápiás hasznosítást nyerhetnek. A fenti bejelentésben megemlítjük azt a lehetőséget, hogy az ilyen molekulák C-terminálisát fuzionálhatjuk más, meg nem nevezett polipeptidekhez.
A jelen találmány egyik szempontja szerint olyan fúziós polipeptidct nyújt, amely Nterminális területének legalább egyik részeként a HSA N-terminális területet vagy ennek egy variánsát tartalmazza, és C-terminális területének legalább egyik részeként egy másik polipeptidet tartalmaz, azzal a kikötéssel, hogy amikor a HSA említett N-terminális területe az 1.-n. terület, ahol n 369 és 419 közti érték, akkor az
említett polipeptid (a) a humán fibronektin 585. és 1578. közti területe vagy ennek variánsa; (b) a CD4 1. és 368. közti területe, vagy ennek variánsa; (c) vérlemezke eredetű növekedési faktor, vagy ennek variánsa; (d) transzformáló növekedési faktor vagy ennek variánsa; (e) az érett humán plazma fibronektin 1.-261. közti területe, vagy ennek variánsa; (f) az érettt humán plazma fibronektin278.-578. közti területe, vagy ennek variánsa; (g) az érettt humán von Willebrand-faktor 1.-272. közti területe, vagy ennek variánsa; vagy (h) alfa-1- antitripszin, vagy ennek variánsa.
A HSA N-terminális területe eló'nyösen az említett 1.-n. terület, az 1.-177. közti terület (eddig, beleértve a ciszteint), az 1.-200. közti terület, (eddig, de nem értve bele a ciszteint), vagy az 1.-177. és 1.-200. közti intermedierek valamelyike.
A humán szérum albumin (HSA) kifejezést úgy értjük, hogy magába foglalja a HSA ismert és majd ezután felfedezett polimorf formáit is (de nem korlátozódik szükségszerűen csak ezekre). így pl. a Naskapi albumin Lys-372-vel bír Glu-372 helyett, és a Christchurch proalbuminnak megváltozott előszekvenciája van. A variáns kifejezésbe értjük (de nem korlátozzuk szükségszerűen csak ezekre) a kisebb változásokkal bíró mesterséges változatokat (pl. olyan molekulákat, amelyekből hiányzik egy vagy néhány gyök, amelyekben gyökök konzervatív helyettesítései vagy kisebb beiktatások találhatók, vagy amelyek az aminosav-szerkezetben kisebb változásokkal bírnak). így azok a polipeptidek, amelyek 80 %, eló'nyösen 85 %, 90 %, 95 %, vagy 99 % homológiával bírnak a HSA-hoz, variáns-oknak tekintendők. Az ilyen variánsoknál az is előnyös, ha fiziológiailag egyenértékűek a HSA-val; pontosabban: a variánsok előnyösen egyenértékűek legalább egy gyógyászati hasznosításban a HSA-val. Ezen kívül egyik vélt variáns, amelyet farmakológiai területen alkalmazni kívánnak, se legyen immunogén a kezelendő állatokban, és különösen emberben.
A konzervatív helyettesítések olyan helyettesítések, ahol egy vagy több aminosav más, hasonló tulajdonságú aminosavval van helyettesítve; azok, akik a polipeptid kémia területén jártasak, tudják, melyek azok a helyettesítések, amelyeknél a polipeptidnek legalább a szekunder szerkezete, de előnyösen a tercier szerkezete is lényegében változatlan marad. Ilyen tipikus helyettesítés pl. glutamin kicserélése aszparaginra, aszparagin kicserélése szerinre, és lizin kicserélése argininre. A variánsok lehetnek olyanok is, amelyekben (esetleg a fenti változásokkal együtt) legfeljebb 10 (előnyösen csak 1 vagy 2) közbenső aminosavgyök (vagyis olyan, amely nem terminálisa a HSA említett N-terminális területének) hiányzik a természetes HSA megfelelő területével összehasonlítva; előnyösen az összes ilyen hiány a molekula 100.-369. közti területében van (ha van ilyen; a számozás az érett HSA-ra vonatkozik). Hasonlóképpen legfeljebb 10, előnyösen csak 1 vagy 2 aminosav hozzá is lehet téve, ahol szintén a 100. és 369. közti terület az előnyös (ha van ilyen). A fiziológiailag működőképes ekvivalens kifejezés magában foglal nagyobb molekulákat is, amelyek tartalmazzák az említett szekvenciát + még egy további szekvenciát az N-terminálisnál (pl. pro-HSA, pre-pro-HSA, és met-HSA).
Az világos, hogy az említett másik polipeptid a találmány szerinti fúziós vegyidéiben nem lehet a HSA megmaradó területe, hiszen ez esetben a teljes polipeptid HSA lenne, amely nem lehet fúziós polipeptid.
Még az esetben is, ha a HSA-szerű terület nem a HSA említett 1.-n. területe, az előnyös nem-HSA terület az említett (a) - (h) tételekben említettek valamelyike.
-5A CD4 1.-368. közti területe a humán T limfocita CD4 fehérje első négy, diszulfiddal kötött, immunglobulin-szerű tartományát képviseli, amelynek génjét és aminosav-szekvenciáját Smith D. és munkatársai ismertetik [Science 328. 1704-1707 (1987)]. Ezt arra alkalmazzák, hogy küzdjenek a HÍV fertőzések ellen.
A humán vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF) szekvenciáját Collins és munkatársai írják le [Natúré 316, 748-750 (1985)]. Hasonlóképpen a transzformáló növekedési faktor (TGF-β) szekvenciáját Derynck és munkatársai írják le [Natúré 316. 701-705 (1985)]. Ezek a növekedési faktorok a sebgyógyításban hasznosak.
Az Fn (fibronektin) 1.-261. területét kódoló cDNS szekvenciát az EP-A-207 751 számú európai szabadalmi közrebocsátást irat ismerteti (ezt a cDNS-t a pFH6 plazmidból kapják PvuII endonukleázzal). Ez a terület köti a fibrint és alkalmazható a fuzionált vegyületek irányítására a vérrögökhöz.
Az Fn 278.-578. területét, amely egy kollagén-kötő tartományt tartalmaz, kódoló cDNS szekvenciát Owens R.J. és Baralle F.E. ismertetik [EMBO Journal S., 28252830 (1986)]. Ez a terület a vérlemezkékhez kötődik.
A von Willebrand faktor 1.-272. közti területe köti és stabilizálja a VIII. faktort. Ennek szekvenciáját Bontham és munkatársai adják meg (Nucl. Acids Rés. 14, 7125-7127).
Az alfa-l-antitripszin variánsai közé értjük azokat a variánsokat, amelyeket Rosenburg és munkatársai írnak le [Natúré 312, 77-80 (1984)]. A jelen találmány elsősorbán a Pittsburgh variánst (ahol a Met Arg-ra van mutálva), valamint azt a
-6357 358 variánst foglalja magában, amelyben a Pro és a Met alaninra, illetve argininre van mutálva. Ezek a vegyületek vérmérgezési sokk és tüdő-rendellenességek kezelésére alkalmasak.
A jelen találmány polipeptidjei nem-HSA területének variánsai között az olyan típusú variánsokat találjuk, amelyeket fentebb, a HSA területekkel kapcsolatban tárgyaltunk, ide értve a konzervatív aminosav helyettesítéseket, valamint más fajokból származó homológokat is.
A jelen találmány szerinti fúziós polipeptidek rendelkezhetnek olyan N-terminális aminosavakkal is, amelyek túlnyúlnak a HSA N-terminálisának megfelelő területen, így pl. ha a HSA-szerű terület az érett HSA N-terminális területének felel meg, akkor ehhez pre-, pro-, vagy pre-pro szekvenciák lehetnek hozzátéve, pl. az élesztő alfa-faktor vezető szekvencia. Alkalmazhatjuk a WO 90/01063 számú PCT szabadalmi közrebocsátási iratban szerepló' fuzionált vezető' területeket. Az a polipeptid, amely a HSA területhez van fuzionálva, lehet valamely természetben előforduló polipeptid, ennek fragmentuma, vagy lehet egy új polipeptid, beleértve az új fúziós polipeptideket is. így pl. a későbbi 3. példában a fibronektin egy fragmentuma a HSA területhez egy 4 aminosavból álló kapcsolón keresztül van fuzionálva.
Úgy találjuk, hogy a HSA molekula amino-terminális területe úgy van megszerkesztve, hogy különösen kedvez a találmány szerinti vegyületek hatékony átvitelének és kijuttatásának eukarióta sejtekben.
A jelen találmány második szempontja szerint transzformált gazdaszervezeteket szolgáltat, amelyek olyan módon elrendezett nukleotid-szekvenciával bírnak, hogy
-Ί kifejezzék a fentebb leírt fúziós polipeptidet. Az olyan módon elrendezett kifejezésen pl. azt értjük, hogy a nukleotid szekvencia korrekt leolvasó keretben van egy megfelelő RNS polimeráz kötőhellyel és transzlációs rajtszekvenciávaí, és megfelelő promotor szabályozása alatt áll. A promotor lehet homológ vagy heterológ a gazdasejttel. A lefelé (3’ felé) levő szabályozó szekvenciák is ide értendők, ha szükségesek, mint ez a szakember számára ismeretes. A gazdaszervezet előnyösen élesztő (pl. Saccharomyces faj, mint S. cerevisiae; Kluyveromyces faj, mint K. lactis; Pichia faj; vagy Schizosaccharomyces faj, mint S. pombe), de lehet bármely más alkalmas gazdaszervezet, pl. E. coli, B. subtilis, Aspergillus faj, emlős sejt, növényi sejt, vagy rovarsejt.
A jelen találmány harmadik szemponja szerint eljárást nyújt a jelen találmány első szempontja szerinti fúziós polipeptid előállítására; az eljárás abból áll, hogy valamely, a jelen találmány második szempontja szerinti gazdasejtet tenyésztünk, majd a fúziós polipeptidet megfelelő formában elkülönítjük.
A jelen találmány negyedik szempontja emberi vagy állati test kezelésére szolgáló terápiás eljárásokat nyújt, amely valamely ilyen fúziós polipeptid beadásából áll.
A jelen találmány szerinti eljárásokban elsősorban arra fektetünk súlyt, hogy gyógyászatilag hasznos humán fehérjék kiválasztásának hatékonyságát javítsuk élesztőkből, és azért ötlöttük ki, hogy a HSA amino-terminális területeit fuzionáljuk olyan fehérjékkel, amelyeak rendesen csak igen kevéssé hatékonyan választódnak ki. Az egyik ilyen fehérje egy potenciálisan értékes sebgyógyító polipeptid, amely a humán fibronektin 585.-1578. közti területét képviseli (ezt ezentúl Fn 585.-1578.nak nevezzük). Amint ezt egy jelen bejelentéssel párhuzamosan benyújtott másik • ·-8bejelentésben leírtuk, ez a molekula a sebgyógyításhoz alkalmas sejt szaporító kemotaktikus és kemokinetikus aktivitásokkal bír. Azokat a jelen találmány szerinti fúziós polipeptideket, ahol a C-terminális terület az Fn 585.-1578., alkalmazhatjuk sebgyógyászati célra bicszintetizált formájukban, különösen, ha ezek a hibrid humán fehérjék helyileg alkalmazhatók. A humán fibronektin 585.-1578. közti aminosavait képviselő területet azonban, ha szükséges, ki is lehet nyerni a fúziós fehérjéből, a fibronektin terület első aminosava elé bevezetve olyan aminosavakat, amelyek egy X faktor hasítási helyet tartalmaznak. Miután a fúziós fehérjét izoláltuk a tenyészet felülúszójábói, a kívánt molekulát felszabadítjuk X faktorral végzett hasítással és megfelelő kromatográfiás (pl. ioncserélő kromatográfiás) tisztítással. Más helyeket is biztosíthatunk enzimes vagy kémiai hasításhoz, vagy az N-terminális és C-terrninális területek megfelelő csatlakoztatásával, vagy közéjük egy megfelelő kapcsoló beiktatásával.
A jelen találmány szerinti fúziós polipeptidek közül jónéhány - pl. az említett CD4 és vWF fragmentumokat, PDGF-et és Ai AT-t tartalmazzák - megnövekedett félélettartammal is bír a vérben és ezért előnyösen önmagukban is terápiás felhasználásra, mégpedig azokon a területeken, ahol a molekula nem-HSA területét terápiásán amúgy is alkalmazzuk. Az AT és hasonlók esetében ezt a vegyületet normálisan egy dózisban vagy legfeljebb csak néhány dózisban adhatjuk be rövid időn belül, a helyett, hogy hosszú időtartamon át adnánk; ennek megfelelően ezek a vegyületek kevésbé valószínű, hogy immunválaszt váltanak ki.
-9PÉLDÁK: ÁLTALÁNOS RÉSZ
Azokat a standard rekombináns DNS munkameneteket alkalmazzuk, amelyeket Maniatis és munkatársai írtak le (1982, majd később 2. kiadás), hacsak másképpen nem jelezzük. Az M13 fág rekombináns kiónok megalkotását és elemzését úgy végezzük, ahogyan ezt Messíng (1983), illetve Sanger és munkatársai (1977) leírták.
Az alábbi molekulák megalkotásában alkalmazott, humán szérum albumin területeit kódoló DNS szekvenciák az mH0B12 és pDBD2 plazmidokból származnak [EP-A-322 094 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat (Delta Biotechnology Ltd., ennek bizonyos részeit a későbbiekben reprodukálhatjuk)], vagy ezen szekvencia részeinek megfelelő' oligonukleotidok szintézisével készülnek. A humán fibronektin területeit kódoló DNS szekvenciák a pFHDELl plazmidból származnak, vagy ezen szekvencia részeinek megfelelő oligonukleotidok szintézisével készülnek. A pFHDELl plazmidot, amely tartalmazza a plazma fibronektint kódoló tejes humán cDNS-t, úgy kapjuk meg, hogy ligáljuk a pFH6; 16; 54; 154; és 1 plazmidokból származó DNS-t [lásd azEP-A-207 751 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratot (Delta Biotechnology Ltd.)].
Ez a DNS egy olyan mRNS variánst képvisel, amely nem tartalmazza az ED szekvenciát és a III-CS területet 89. aminosav variánsával rendelkezett [Owens R.J., Kornblihtt A.R. és Baralle F.E.: Oxford Surveys on Eukarvotic Genes_3, 141-160 (1986)]. Ennek a vektornak a térképét all. ábra szemlélteti, és ennek a cDNS-nek a kifejezésével termelt érett polipeptid fehérje-szekvenciáját az 5. ábrában mutatjuk be.
• · · ·
-10Az oligonukleotidokat az Applied Biosystems 380B oligonukleotid szintetizáló berendezés en szintetizáljuk a gyártó cég ajánlásai szerint (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, Egyesült Királyság).
Olyan kifejező' vektort alkotunk meg, amelyben aHSA kiválasztó (szekréciós) szignált és - a 387. aminosavig,beleértve azt a 387. aminosavat, a leucint is - az érett HSA-t kódoló DNS megfelelő keretben fuzionálva van a humán fibronektin 585.1578. aminosaváig (a határértékeket is beleértve) képviselő szegmenst kódoló DNSsel, és ez lefelé (downstream) van elhelyezve az EP-A-258 067 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratban (Delta Biotechnology) ismertetett hibrid promotorhoz viszonyítva, amely promotor nagyon hatékony, Saccharomyces cerevisiae-ban működőképes galaktóz-indukálható promotor. A humán fibronektin 1578. aminosavjának kodonját közvetlenül követi egy stop kodon (TTA), majd a S. cerevisiae foszfoglicerát kináz (PGK) gén transzkropciós terminátor. Ezt a vektort azután transzformációval S. cerevisiae-ba vezetjük be, ahol ez a vektor irányítja egy hibrid molekula kifejezését és a sejtekből való kiválasztását, amely hibrid molekula a PISA 387 N-terminális aminosavat képviseli C-terminálisan fuzionálva a humán fibronektin 585. - 1578. aminosavaihoz.
Egy másik példában hasonló vektort alkotunk meg, amely lehetővé teszi egy hibrid molekula kiválasztását S. cerevisiae-ből ahol ez a hibrid molekula a HSA 195 N-terminális aminosavat képviseli C-terminálisan fuzionálva a humán fibronektin 585. 1578. aminosavaihoz.
A jelen találmány különböző szemnpontjait most példák segítségével világítjuk meg, hivatkozva a mellékelt ábrákra. A mellékelt ábrák rövid magyarázata az alábbi:
-11• · · · ·
Az 1. ábra (7 lapon) a természetes HSA-t vélhetően jelenleg legjobban képviselő aminosav-szekvenciát ábrázolja, ezen belül bekeretezve a HSA (1.-n.) lehetséges különböző C-terminálisait.
A 2. ábra (7 lapon) az érett HSA-ΐ kódoló DNS szekvenciát mutatja be, ahol a szekvenciában - aláhúzva - megtalálható a 3. kapcsoló is.
A 3. ábra változatosan szemlélteti az mHOBló megalkotását.
A 4. ábra vázlatosan szemlélteti a pHOB31 megalkotását.
Az 5. ábra (25 lapon) a pFHDELl Fn-plazmid által kódolt érett fehérje szekvenciáját mutatja be.
A 6. ábra (2 lapon) az 5. kapcsolót szemlélteti, bemutatva a nyolc oligonukleotid alkotórészt.
A 7. ábra vázlatosan szemlélteti a pDBDF2 plazmid megalkotását.
A 8. ábra vázlatosan szemlélteti a pDBDF5 plazmid megalkotását.
A 9. ábra vázlatosan szemlélteti a pDBDF9 plazmid megalkotását.
A 10. ábra vázlatosan szemlélteti a pDBDF12 plazmid megalkotását, a pFHDELl plazmidot alkalmazva.
A 11. ábra a pFHDELl plazmid térképét mutatja be.
-121. PÉLDA: HSA 1.-387. AZ Fn 585.-1578.-HOZ FUZIONÁLVA
Az alábbiakban beszámolunk olyan plazmidok előállításáról, amelyek a HSA valamely területét kódoló szekvenciát tartalmaznak, amint ez az EP-A-322 094 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratban ismertetve van.
Az alábbi molekulák megalkotásában alkalmazott, humán szérum albumint kódoló szekvencia az M13mpl9.7 plazmidból származik (EP-A-20 239 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat, Delta Biotechnology Ltd.), vagy olyan oligonukleotidok szintézisével készül, amelyek ezen szekvencia részeinek felelnek meg. Az oligonukleotidokat foszforamiditos kémiai eljárást alkalmazva szintetizáljuk, Applied Biosystems 380B oligonukleotid szintetizáló berendezésen a gyártó cég útmutatásai szerint (AB Inc., Warrington, Cheshire, Anglia).
Olyan oligonukleotidot szintetizálunk (1. kapcsoló), amely az ismert HSA kódoló szekvencia (2. ábra) egy részét képviseli a Pst I helytől (2. ábra: 1235.-1240. a 381. valin kodonjáig, ahol ez a kodon GTG-ró'l GTC-re van változtatva:
» · · ·
- 13 1. kapcsoló
D P
5 ' GAT CCT
3' ACGT CTA GGA
H E c Y
CAT GAA TGC TAT
GTA CTT ACG ATA
1247
A K V F D E F K
GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA
CGG TTT CAC AAG CTA CTT AAA TTT
126 7
P L V
CTT GTC 3 '
GGA CAG 5'
Az 1. kapcsolót előzőleg Pst I -gyei és Hinc II-vel emésztett M13mpl9 vektorba
(Norrander és munkatársai, 1983) ágáljuk, majd a ligálási keveréket alkalmazzuk E. coli XLl-Blue törzs (Stratagene Cloning Systems, San Diego, Kalifornia) átfertőzésére. A rekombináns kiónokat úgy azonosítjuk, hogy olyan tápközegen, amely az X-gal kromogén indikátort (5-bróin-4-klór-3-indoál-β-D-galaktozid) tartalmazza 1PTG (izopropil-tio-β-galaktozid) jelenlétében, a kék szín kifejlődése elmarad ezeknél a rekombináns kiónoknál. A bakteriofág részecskékből készített templát DNS DNS-szekvencia elemzése egy olyan molekulát azonosít, amely a kívánt DNS szekvenciával rendelkezik; ezt ntHOB 12-nek nevezzük (3. ábra).
Az M13mpl9.7 tartalmazza az érett 1ISA kódoló területét M13mpl9-ben
- 14[Norrander és munkatársai (1983)] úgy, hogy a HSA első aminosavának megfelelő kodon, a GAT, átfed egy egyedi Xho I helyet az alábbi módon:
Asp Alá
5 ' 3 ' CTCGAGATGCA 'GAGCTCTACGT Xhol 3 ' 5 '
A fentiekkel kapcsolatban lásd az EP-A-210 239 számú európai szabadalmi
közrebocsátási iratot. Az M13mpl9.7-et Xho I-gyel emésztjük, SÍ nukleázzal kezelve tompa végűvé tesszük, majd ligáljuk az alábbi oligonukleotiddal (2. kapcsoló) :
2. kapcsoló:
5'TCTTTTATCCAAGCTTGGATAAAAGA 3' 3'AGAAAATAGGTTCGAACCTATTTTCT 5' HindlII
A ligálási keveréket azután E. coli XLl-Clue átfertó'zésére alkalmazzuk, néhány tarfoltból templát DNS-t készítünk, majd DNS szekv.encia-elemzéssel elemezzük, hogy egy korrekt szekvenciával bíró kiónt azonosítsunk; ezt a klóm pDBD 1-nek nevezzük (3. ábra).
A HSA 5’ végét és a beiktatott oligonukleotid kapcsoló egyik felét képviselő,
1,1 kb-os Hind III - Pst I fragmentumot izolálunk pDBDl-ből agaróz **♦
- 15gélelektroforézissel. Ezt a fragmentumot azután az előzőleg Hind III - Pst I-gyel emésztett kettős szálú mH0B12-vel ligáljuk, majd a ligálási keveréket E. coli XL1Blue átfertőzésére alkalmazzuk. Néhány tarfolt érett bakterofág részecskéiből egyszálú templát DNS-t készítünk. A DNS-t in vitro kettős szálúvá tesszük olyan módon, hogy kiterjesztést végzünk az összeforrasztott szekvenciáié primerből DNS polimeráz I Klenow fragmentum segítségével a dezoxinukleotid trifoszfátok jelenlétében. Ennek a DNS-nek a restrikciós enzimes emésztése lehetővé teszi egy olyan klón azonosítását, amely korrekt konfigurációjú; s ezt mH0B15-nek nevezzük (3. ábra).
Az alábbi oligonukleotid (3. kapcsoló) az érett HSA 382. aminosavának megfelelő kodontól (glutaminsav, GAA) a 389. aminosavának (lizin) megfelelő kodonig terjedő szakaszt képviseli, amelyet követ egy stop kodon (TAA), egy Hind III hely, majd egy BamHI koheziv vég:
3. kapcsoló
E E P Q N L I K J
5 ' GAA GAG CCT CAG ΑΛΤ TTA ATC AAA TAA GCTTG 3
3' CTT CTC GGA GTC ΤΤΛ ΑΛΤ TAG TTT ΛΤΤ CGAACCTAG 5'
Ezt előzőleg Hindi-vei és BamHI-gyel emésztett kettős szálú mH0B15-be ligáljuk. Ligálás után a DNS-t HincII-vel emésztjük, hogy elroncsoljunk minden nemrekombináns molekulát, majd ezt a keveréket alkalmazzuk E. coli XLl-Blue átfertőzésére. Több klón bakteriofág részecskéiből egyszálú DNS-t állítunk elő, és DNS szekvencia-elemzésnek vetjük alá. Az egyik kiónt, amely a korrekt DNS szekvenciával bír, mHOB 16-nak nevezzük (3. ábra).
Olyan molekulát alkotunk meg, amelyben az érett HSA-t kódoló terület a HSA kiválasztási szignállal van fuzionálva; ezt úgy érjük el, hogy a 4. kapcsolót beiktatjuk a BamHI-gvel és X hol-gyei emésztett M13mpl9.7-be, és így megkapjuk a pDBD2-t (4. ábra).
4. kapcsoló
M K W V S F
5 ' GATCC ATG AAG TGG GTA AGC TTT
G TAC TTC ACC CAT TCG AAA
- S L L F L p S
ATT TCC CTT CTT TTT CTC TTT AGC
TAA AGG GAA GAA AAA GAG AAA TCG
s A Y S
TCG GCT TAT TCC
AGC CGA ATA AGG
R R
CG 3 '
GCAGCT 5 '
R G V F
AGG GGT GTG TTT
TCC CCA CAC AAA
Ebben a kapcsolóban a HSA pre-pro vezető' szekvenciájában [Lawn és munkatársai (1981)] a kiindulási metionintól számított negyedik aminosav, a treonin kodonját, az ACC-t, szerint kódoló AGC-re változtattuk, hogy HindlII helyet hozzunk létre.
oligonukleotid szintézisével olyan szintetikus DNS szekvenciát állítunk elő, amely az ismert HSA kódoló szekvencia [Lawn és munkatársai (1981)] egy részét (a 382,től 387.-ig terjedő aminosavak a 2. ábra szerint) képviseli az ismert fibronektin kódoló szekvencia [Kornblihtt és munkatársai (1985)] egy részéhez (az 585.-től 640.-ig terjedő aminosavak a 2. ábra szerint) fuzionálva (5. kapcsoló, 6. ábra). A 2., 3., 4., 5., 6., 7.. és 8. oligonukleotidokat foszforilezzük T4 polinukleotid kináz alkalmazásával, majd az oligonukleotidokat standard körülmények között párokban - vagyis I + 8, 2 + 7, 3 + 6 és 4+5 - összeforrasztjuk. Az összeforrasztott oligonukleotidokat ezután összekeverjük, és az előzőleg HincII és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett mHOB12-veI Egáljuk. A ligálási keveréket azután E. coli XLl-Blue-be (Stratagene Cloning Systems, San Diego, Kalifornia) fertőzzük át. Több, egymástól független tarfoltból származó érett bakteriofág részecskéből egyszálú templái DNS-t állítunk elő, majd ezeket DNS szekvencia-elemzéssel elemezzük. Egy olyan kiónt, amelyben a várt szekvenciájú kapcsoló korrekt módon
-18beiktatódott, pDBDFl-nek nevezünk (7. ábra). Ezt a plazmidot azután Pstl-gvel ésEcoRI-gvel emésztjük és a mintegy 0,24 kb-s fragmentumot tisztítjuk, majd ligáljuk a pDBD2 1,29 kb-s BamHI-PstI fragmentumával (7. ábra) és BamHI-gvel és EcoRI-gvel emésztett pUC19-cel [Yanisch-Perron és munkatársai (1985)]; ilyen módon alkotjuk meg a pDBDF2-t (7. ábra).
Egy plazmidot, a pFHDELl-et, amely tartalmazza a teljes hosszúságú humán fibronektint kódoló DNS szekvenciát, EcoRI-gyel és Xhol-gvel emésztünk, és egy 0,77 kb-s EcoRI-XhoI fragmentumot (8. ábra) izolálunk, majd ezt ligáljuk EcoRIgyel és SalI-gyel emésztett M13mpl8-cal [Norrander és munkatársai (1983)], így alkotjuk meg a pDBF3-at (8. ábra).
Szintetizáljuk az alábbi oligonukleotidot (6. kapcsoló), amely képviseli az EP-A-207 751 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat fibronektin szekvenciájának 4784.-4791. helyén levő PstI helyétől azl578. tirozin kodonjáig terjedő szakaszt, ezt egy stop kodon (TAA), egy HindlII hely, majd egy Bambii koheziv vég követi
6. kapcsoló
G P D Q T E M T I E G L
GGT CCA GAT CAA ACA GAA ATG ACT ATT GAA GGC TTG
A CGT CCA GGT CT A GTT TGT CTT TAC TGA TAA CTT CCG AAC
Q P T V E V Stop
CAG CCC ACA GTG GAG TAT TAA GCTTG
GTC GGG TGT CAC CTC ATA ATT CGAACCTAG
-19Ezt a kapcsolót azután Esil-gyel és HindlII-mal emésztett pDBDF3-hoz ligáljuk, így alakítjuk ki a pDBDF4-et (8. ábra). Az alábbi DNS fragmentumokat ligáljuk ezután a BglII-vel emésztett pKV50-nel együtt, amint ezt a 8. ábrán bemutatjuk; a pDBD4 0,68 kb-s EcoRI-BamHi fragmentuma; a pDBDF2 l,5kb-s BamHI-Stu 1 fragmentuma; és a pFHDELl 2,2 kb-s StuI-EíűRI fragmentuma. Az így létrejövő' pDBDFS plazmid (8. ábra) magában foglalja az EP-A-258 067 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratban szerepló' promotort, hogy irányítsa egy olyan szekvencia kifejezó'dését, amelyben az érett HSA 1.-387. aminosavait kódoló DNShez HSA kiválasztó szignál van fuzionálva, a fenti HSA területhez pedig a humán fibronektin 585.-1578. aminosavait kódoló DNS is fuzionálva van megfelelő keretben, ez után viszont a transzláció a TAA stop kodonnál befejeződik. Ezt azután a
S. cerevisiae PGK gén transzkripciós terminátor követi. A plazmid tartalmaz olyan szekvenciákat is, amelyek lehetővé teszik a szelekciót és fenntartást mind Escherichia coliban, mind S. cerevisiae-ban (lásd az EP-A-258 067 számú európai szabadalmi közrebocsátási iratot).
Ezt a plazmidot azután S. cerevisiae S150-2B-be (leu2-3 leu2-112 ura3-52 trpl-289 his3-l) vzetjük be standard munkamenetekkel [Beggs (1978)]. Ezután a transzformánsokat elemezzük és úgy találjuk, hogy termelik a HSA-fibronektin fúziós fehérjét.
2, PÉLDA: HSA 1.-195, Fn 585.-1578-HOZ FUZIONÁLVA
Ebben a második példában a humán szérum albumin első tartománya (1.-195. aminosavak) van fuzionálva a humán fibronektin 585.-1578. aminosavaihoz.
-20A pDBD plazmidot BamHI-gyel és BglII-vel emésztjük, és a 0,79 kb-s fragmentumot tisztítjuk, majd BamHI-gvel emésztett M13mpl9-cel ligáljuk, így alakítjuk ki a pDBDFó-ot (9. ábra). Az alábbi képletű oligonukleotidot:
5'-CCAAAGCTCGAGGAACTTC G-3' alkalmazzuk mutagén primerként, hogy Xhol helyet alakítsunk ki a pDBDF6-ban in vitro mutagenezissel, az Amersham International PLC által forgalomba hozott készletet alkalmazva. Ezt a helyet úgy alakítjuk ki, hogy a HSA 696. számú bázisát T-ről G-re cseréljük (2. ábra). Az így' kialakított plazmidot pDBDF7-nek nevezzük (9. ábra). Ezután szintetizáljuk az alábbi kapcsolót, hogy ebből az újonnan kialakított Xhol helyből létrehozzuk a HSA 195. lizinjének kodonját (AAA), majd a fibronektin 585. izoleucinjának kodonjából a 6. ábrában bemutatott 1. és 8. oligonukleotidok végeit.
7. kapcsoló
D E L R D E G K A S S A K
TC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA
A CTT GAA GCC CTA CTT CCC TTC CGA AGC AGA CGG TTT
T m A E T P S Q P N S H
ATC ACT GAG ACT CCG AGT CAG C
TAG TGA CTC TGA GGC TCA GTC GGG TTG AGG GTG G
Ezt a kapcsolót ligáljuk a 3 ábrában bemutatott, összeforrasztott nukleotidokkal, vagyis a 2 + 7-tel, 3 + 6-tal és 4 + 5-tel. valamint az Xhol-gvel és EcoRI-gvel emésztett pDBDF7-tel, hogy kialakítsuk a pDBDF8-at (9. ábra). Meg kell jegyeznünk, hogy az eredeti HSA DNS szekvencia, és ez által az aminosav-szekvencia, helyreállítása érdekében a 7. kapcsoló és a további oligonukleotidok beiktatása pDBDF7-be nem állítja helyre az Xhol helyet.
A pDBDFS 0.83 kb-s BamHI-StuI fragmentumát tisztítjuk, majd ligáljuk a pDBDF2 0.68 kb-s EcoRI-BamHI fragmentumával és a pFHDFLl 2,22 kb-s StuI-EcoRI fragmentumával Bglll-vel emésztett pKV50-be ; így alakítjuk ki a PDBDF9-et (9. ábra). Ez a plazmid hasonlít a pDBDF5-höz, azzal a kivétellel, hogy ez a HSAnak csak az 1.-195. gyökeit határozza meg a pDBDF5-ben található 1.-387. gyökök helyett.
Amikor a fentebb már leírtak szerint S. cerevisiae S150-2B-be vezetjük be, ez a plazmid irányítja egy olyan hibrid molekula kifejeződését és kiválasztását, amely a HSA 1.-195. gyökeiből áll a fibronektin 585.-1578. gyökeihez fuzionálva.
3.PÉLDA : HSA 1.-387. Fn 585.-1578.-HOZ FUZIONÁ1VA HASÍTHATÓ MOLEKULAKÉNT
Abból a célból, hogy megkönnyítsük a fibronektin 585.-1578. közti gyökeinek nagy mennyiségű előállítását, olyan konstrukciót állítunk elő, amelyben a FISA 1.-387. közti gyökeit kódoló DNS-t elválasztjuk a fibronektin 585.-1578. közti gyökeit kódoló DNS-től, mégpedig az alábbi szekvenciával;
I E G R
ATT GAA GGT AGA
TAA CTT CCA TCT « · · *
» · • ·
-22amely egy hasítás-felismerő helyet határoz meg az X véralvadási faktor számára. Következésképpen a tisztított, kiválasztott terméket X faktorral kezeljük, majd a molekula fibronektin részét elválaszthatjuk a HSA résztől.
Abból a célból, hogy ezt megtehessük, két oligonukleotidot szintetizálunk, majd összeforrasztunk, hogy kialakítsuk a 8. kapcsolót:
8. kapcsoló E E P Q N L I E G
GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATT GAA GGT
CTT CTC GGA GTC TTA AAT TAA CTT CCA
R I T E T P S Q P
AGA ATC ACT GAG ACT CCG AGT CAG C
TCT TAG TGA CTC TGA GGC TCA GTC GGG
TTG AGG GTG G
Ezt a kapcsolót azután ligáljuk a 6. ábrában bemutatott összeforrasztott nukleotidokkal, azaz a 2 + 7-tel, 3 + 6-tal és 4 + 5-tel a HinsII-vel és EaiRI-gyel emésztett mHOB 12-be, így alakítjuk ki a pDBDFlü-et (10. ábra). A plazmidot ezután Pstl-gvel és EcoRI-gyel emésztjük és a dumán 0,24 kb-s fragmentumot tisztítjuk, majd ligáljuk a pDBD2 1,29 kb-s BnmHI-Esil fragmentumával és EcnRIgyel emésztett pUC19-cel, így alakítjuk ki apDBDFll-et (10. ábra).
A pDBDFll 1,5 kb-s BamHI-StuI fragmentumát azután ligáljuk a pDBDF4 0,68 kb-s EcoRI-BamHl fragmentumával és a pFHDELl 2,22 kb-s SluI-EmRI
I > <
-23fragmentumával a BglII-vel emésztett pKV50-be, így alakítjuk ki a pDBDF12-t (10. ábra). Ezt a plazmidot azután S. cerevisiae S150-2B-be vezetjük be. A tisztított, kiválasztott fúziós fehérjét X faktorral kezeljük, hogy a natív molekula 585.-1578. gyökeit képviselő' fibronektin fragmenumot felszabadítsuk.
♦ » »··* «· 4«*· • · · ·« é * *·· ·4 · ·· • · * ««··«·>
·*···«« · *« *
-24IRODALMI HIVATKOZÁSOK
BeggsJ.D.: Natúré 275, 104-109 (1978)
Kornblihtt és munkatársai: EMBOJ.4, 1755-1759 (1985)
Lawn R.M. és munkatársai: Nucl. Acid. Rés. 2, 6103-6114 (1981)
Maníatis T. és munkatársai: Molecular cloning: A laboratory mantial. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)
Messing J.tMethods Enzymol. 101, 20-78 (1983)
Norrander J. és munkatársai: Gene 26. 101-106 (1983)
Sanger F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Z4, 5463-5467 (1977)
Yanisch-Perron C.: Gene 32, 103-119 (1985)

Claims (7)

1. / Fúziós polipeptid azzal jellemezve, hogy tartalmazza N-terminális területének legalább részeként a HSA N-terminális területét vagy ennek valamely variánsát és C-terminális területének legalább részeként egy másik polipeptidet tartalmaz azzal a feltétellel, hogy amikor a HSA említett N-terminális területe az 1.-n. terület, ahoL az n 369. és 419. közti érték, vagy ennek variánsa, akkor az említett polipeptid (a) a humán fibronektin 585. és 1578. közti területe vagy ennek variánsa ; (b) a CD4 1. és 368. közti területe vagy ennek variánsa ; (c) vérlemezke eredetű növekedési faktor vagy ennek variánsa : (d) transzformáló növekedési faktor vagy ennek variánsa ; (e) az érett humán plazma fibronektin 1.-261. közti területe, vagy ennek variánsa ; (f) az érett humán plazma fibronektin 278.-578. közti területe, vagy ennek variánsa ; (g) az érett humán von Willebrand-faktor 1.-272. közti területe vagy ennek variánsa ; vagy (h) alfa-l-antitripszin vagy ennek variánsa.
2. / Az 1. igénypont szerinti fúziós polipeptid azzal jellemezve, hogy a HSA N-ter- minális területének megfelelő' területen túl terjedve tartalmaz még legalább egy további N-terminális aminosavat.
3. / Az 1. vagy 2. igénypont szerinti fúziós polipeptid azzal jellemezve, hogy az említett N-terminális és C-terminális területek csatlakozásánál tartalmaz egy hasítható területet.
····
4. / Az 1.-3. igénypontok bármelyike szerinti fúziós polipeptid azzal jellemezve, hogy az említett C-terminális terület a humán plazma fibronektin 585.-1578. közti területe, vagy ennek variánsa.
5. / Transzformált vagy átfertőzött gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy olyan módon elrendezett nukleotid szekvenciával bír, hogy az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti fúziós polipeptid ki tudjon fejeződni.
6. / Eljárás fúziós polipeptid előállítására azzal jellemezve, hogy valamely 5.
igénypont szerinti gazdaszervezetet tenyésztünk, majd a fúziós polipeptidet felhasználható formában elkülönítjük.
7. / Fúziós polipeptidek alkalmazása azzal jellemezve, hogy az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti fúziós polipeptidet terápiás célra alkalmazzuk.
HU904413A 1989-04-29 1990-04-26 Process for producing polypeptides HUT61049A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898909916A GB8909916D0 (en) 1989-04-29 1989-04-29 Polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU904413D0 HU904413D0 (en) 1992-01-28
HUT61049A true HUT61049A (en) 1992-11-30

Family

ID=10656000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU904413A HUT61049A (en) 1989-04-29 1990-04-26 Process for producing polypeptides

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0470165A1 (hu)
JP (1) JP2781459B2 (hu)
KR (1) KR100227167B1 (hu)
AU (1) AU630450B2 (hu)
CA (1) CA2015687C (hu)
FI (1) FI104255B1 (hu)
GB (2) GB8909916D0 (hu)
HU (1) HUT61049A (hu)
IE (1) IE67651B1 (hu)
IL (1) IL94243A (hu)
WO (1) WO1990013653A1 (hu)
ZA (1) ZA903237B (hu)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686900B1 (fr) * 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1994016085A2 (en) * 1992-12-30 1994-07-21 Zymogenetics, Inc. Hybrid proteins having cross-linking and tissue-binding activities
GB9408466D0 (en) * 1994-04-27 1994-06-22 Univ Nottingham Cloning and functional expression of neurotoxins
US5543308A (en) * 1994-10-18 1996-08-06 New England Biolabs, Inc. Isolated DNA encoding the FSEI restriction endonuclease and related methods for producing the same
US5641483A (en) * 1995-06-07 1997-06-24 Beaulieu; Andre Wound healing formulations containing human plasma fibronectin
US5877149A (en) 1995-06-07 1999-03-02 Beaulieu; Andre Deepithelialized skin diffusion cell system
US6423512B1 (en) 1996-07-26 2002-07-23 Novartis Ag Fusion polypeptides
PE99498A1 (es) * 1996-07-26 1999-01-21 Novartis Ag Polipeptidos de fusion
US5932693A (en) * 1996-12-10 1999-08-03 Washington University Antithrombotic peptides
JP2003525570A (ja) 1998-01-23 2003-09-02 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵母において所望のポリペプチドを産生する方法
AU775422B2 (en) 1998-06-15 2004-07-29 Gtc Biotherapeutics, Inc. Erythropoietin analog-human serum albumin fusion
EP1278544A4 (en) * 2000-04-12 2004-08-18 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
TW200718784A (en) 2001-08-15 2007-05-16 Takara Bio Inc Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic T lumphocytes
EP2277910A1 (en) 2001-12-21 2011-01-26 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE491021T1 (de) 2002-03-25 2010-12-15 Takara Bio Inc Verfahren zur produktion eines zytotoxischen lymphozyten
EP1666589B1 (en) * 2003-08-22 2010-02-17 Takara Bio Inc. Process for producing cytotoxic lymphocytes
EP3192872A1 (en) 2003-08-26 2017-07-19 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Inhibitors of serine protease activity and their use in methods and compositions for treatment of bacterial infections
GB0329681D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Gene expression technique
GB0329722D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Modified plasmid and use thereof
JP5631533B2 (ja) 2004-12-23 2014-11-26 ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ 遺伝子発現技術
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP2474318A1 (en) 2006-06-07 2012-07-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2049560B1 (en) 2006-07-13 2013-05-15 Novozymes Biopharma DK A/S Process for preparing particles of proteinaceous material
JP5936112B2 (ja) 2009-02-11 2016-06-15 アルブミディクス アクティーゼルスカブ アルブミン変異体及び複合体
EP2493921B1 (en) 2009-10-30 2018-09-26 Albumedix Ltd Albumin variants
KR20130070576A (ko) 2010-04-09 2013-06-27 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 알부민 유도체 및 변이체
US9938353B2 (en) * 2011-06-24 2018-04-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
PL2825556T3 (pl) 2012-03-16 2018-10-31 Albumedix A/S Warianty albuminy
GB2512156A (en) 2012-11-08 2014-09-24 Novozymes Biopharma Dk As Albumin variants
EP2968587A2 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto
EP3337816B1 (en) 2015-08-20 2024-02-14 Albumedix Ltd Albumin variants and conjugates
WO2018089702A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Keros Therapeutics, Inc. Gdnf fusion polypeptides and methods of use thereof
JP2022509517A (ja) * 2018-10-29 2022-01-20 スピン セラピューティクス， エルエルシー アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症のための組成物及び方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE459586B (sv) * 1987-09-14 1989-07-17 Mta Szegedi Biolog Koezponti Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning
GB8725529D0 (en) * 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
FI104255B (fi) 1999-12-15
GB2246783B (en) 1992-10-14
EP0470165A1 (en) 1992-02-12
JPH04506598A (ja) 1992-11-19
IE901554L (en) 1990-10-29
AU5564690A (en) 1990-11-29
GB8909916D0 (en) 1989-06-14
ZA903237B (en) 1991-03-27
FI104255B1 (fi) 1999-12-15
GB2246783A (en) 1992-02-12
CA2015687C (en) 2000-08-29
AU630450B2 (en) 1992-10-29
KR100227167B1 (ko) 1999-10-15
JP2781459B2 (ja) 1998-07-30
HU904413D0 (en) 1992-01-28
CA2015687A1 (en) 1990-10-29
IE67651B1 (en) 1996-04-17
FI915073A0 (fi) 1991-10-28
IL94243A0 (en) 1991-01-31
GB9119043D0 (en) 1991-12-04
IL94243A (en) 1995-10-31
KR920701451A (ko) 1992-08-11
WO1990013653A1 (en) 1990-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT61049A (en) Process for producing polypeptides
EP0399666B1 (en) Fusion proteins containing n-terminal fragments of human serum albumin
Kojima et al. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding a precursor for rat brain natriuretic peptide
JP2708518B2 (ja) 合成酵母リーダーペプチド
US5766883A (en) Polypeptides
US5187263A (en) Expression of biologically active PDGE analogs in eucaryotic cells
JP2791418B2 (ja) 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
IE881597L (en) Expression of Human Proapolipoprotein A-I
JPS63251095A (ja) 新規融合蛋白質およびその精製方法
US5705484A (en) Biologically active polypeptide fusion dimers
HU204563B (en) Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them
JPH01240191A (ja) 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現
AU665034B2 (en) Production of human parathyroid hormone from microorganisms
US5854025A (en) IGF-II analogues
US5420242A (en) Production of human parathyroid hormone from microorganisms
JP2001008697A (ja) Ｅ．コリでの非融合タンパク質の調製方法
JPS61501186A (ja) タウマチン（Ｔｈａｕｍａｔｉｎ）遺伝子の作製と発現
PT96310B (pt) Processo para a preparacao do promotor de transcricao da piruvato-cinase de a.niger, vectores hibridos que o contem e hospedeiros transformados com estes vectores
EP1165797A2 (de) Partikel zur gentherapie
JP2990162B2 (ja) ヒト酸性線維芽細胞成長因子の組成物、その製法、ｄｎａ構築物および酵母宿主細胞
JPS62502305A (ja) ポリペプチドの産生を向上する方法
CA1340264C (en) Recombinant dna expression of novel diuretic/vasodilator compounds
WO2002031178A1 (en) An artificial gene and vectors for expressing high-yield recombinant ovine interferon-tau in pichia pastoris
PT716705E (pt) Processo para a preparacao por recombinacao de proteinas na levedura hansenula
JPH04504949A (ja) 組換えｐｄｇｆおよび製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
DFC9 Refusal of application