JPH04504949A - 組換えｐｄｇｆおよび製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

明細書 組換えＰＤＧＦおよび製造方法 １、発明の分野 本発明はＤＮＡ構築物および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の製法に関する。 特に、本発明は細菌細胞による大量のＰＤＧＦ−Ｂの発現を可能にする構築物で ある、ＰＤＧＦ−Ｂ配列含有融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物に関する 。 ２、発明の背景 ２．１．一般的細胞性増殖因子 近年、種々の種類のヒト細胞により生産されることが見い出された多数のマイト ジェン因子、より一般的には、通常細胞性増殖因子と呼ばれるものにかなりの関 心が払われている。これらの増殖因子に共通の顕著な特性はそれらが多数の細胞 型の増殖をインビトロで刺激する能力である。通常の状態では、培養中の二倍体 細胞は、分裂開始には外因性増殖因子の存在に依存し、そしてこれらの因子が存 在しない場合細胞は細胞周期を離れ、外部から刺激される迄Ｇ　Ｉ　／　Ｇ　０ のままであろう。他方、トランスフオームされた細胞（例えば癌性細胞）は、有 糸分裂を刺激するのに外因性増殖因子には依存せず、むしろ、いかなる外部刺激 がなくても連続的に細胞分裂を可能とするい（つかの内部　制御機構を有すると 思われる。この点で、いわゆる「増殖因子」が積極的に研究されている。証拠の 有力なものは、これらのマイトジェンが腫瘍細胞により示される過剰増殖を制御 する機能の喪失とインビボで関連している「トランスフォーミングタンパク質」 としての役割を果たす可能性があることを示唆している。 事実、多（の観察では、成る種の増殖因子が成る種のヒト腫瘍細胞によりインビ トロでルーチン的に作られそして放出されることが示される。 ２．２．特異的増殖因子 成る「群」の増殖因子が主にそれらの構造的類似性により分類され定義されてい る（ＨｅｌｄｅｎおよびＷｅｓｔｅｒ−ｍａｒｋ、　Ｃｅ１ｌ　３７：　９−２ ０．１９８４）表皮増殖因子（ＥＧＰ）および成る種の腫瘍細胞増殖因子（例え ば、ＴＧＦ−α）は、細胞性ゲノムの天然の産物である可能性がある比較的低分 子量（６，０００〜７．０００）の一本鎖タンパク質である。 インシュリンおよびインシュリン様増殖因子を含むインシュリン群増殖因子（ｒ ＧＦ）も配列相同性を共有する小さなタンパク質である。 本発明にとって特に興味のあるものは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＰ）である 。ＰＤＧＰは、血小板の活性化により放出され、α−血小板中に貯蔵される増殖 因子である。血小板は血液凝固機構に絶対必要な役割を果たしており、その活性 化は組織外傷、血管壁の内皮表面への損傷、または血液中の内因性の凝固因子の いくつかに対する外傷のような種々の因子により開始される。 血小板は血管壁の破壊された表面に付着しＰＤＧＦを放出する。ＰＤＧＦは、一 般に結合組繊細胞の生成および組織の修復を開始するのに必要な繊維芽細胞およ び平滑筋の生成を刺激する強力なマイトジェンとして作用する；これはまた傷の 治療過程において必須でもある好中球に対する化学的誘引物質としても作用する 。従って、ＰＤＧＦはインビボで傷の治療に使用される医薬製剤にとり込まれる 潜在的候補標的とされてきた。 精製された形態のＰＤＧＦは分子量約３０．０００を有する陽イオン性糖タンパ ク質である。サイズの不均一性がみられるが、これはグリコジル化レベルの変動 、細胞によるプロセッシングおよび２つの形態ＰＤＧＦ−Ａと−Ｂの存在の結果 であると考えられている。ＰＤＧＦの生物学的活性形は明らかにジスルフィド橋 により連結された分子量１４．０００を有する２個の異なるポリペプチド鎖から なるヘテロダイマーである。ＰＤＧＦは細胞表面レセプターに結合することによ り活性を集成する。この結合により生ずる生理学的変化には、レセプターの自己 リン酸化およびある種の細胞質基質のチロシン残基のリン酸化が包含される。こ の作用は血管の平滑筋細胞中におけるＣａ”チャネル遮断剤により阻害されると いわれている。（Ｂｌｏｃｋ等、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８６：　２３８８−２３ ９２．　１９８９）上述したように、成る種の増殖因子が細胞の増殖を刺激する 際のトランスフォーミングタンパク質として作用しつるというかなりの推測が存 在する。興味あることに、ＰＤＧＦのＡ鎖およびＢ鎖は配列の相同性をいくつか 共有しており、特にＢ鎖はシミアン肉腫ウィルスの形質転換生成物であるｐ２８ ｖ−“１のアミノ酸配列の一部とほぼ完全に相同である（ＳＳＶ　；　Ｄｏｏｌ ｉｔｔｌｅ等。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２１：　２７５−２７６、１９８３）　ｏ　しかしながら、 ヒト天然型ＰＤＧＦと異なり、ｐ２ｓＶ−Ｉｏはホモダイマーを形成するが、こ れはさらにＰＤＧＦのサイズと同様のサイズにプロセッシングされる（Ｒｏｂｂ ｉｏｓ等、　ＥＭＢＯＪ　４：　１７８３−１７９２．１９８５）。事実、多数 のホモダイマーＡ−ＡおよびＢ−Ｂは完全な生物学的活性を有することが報告さ れている。例えば、ＰＤＧＦ様マイトジェンである骨肉腫細胞由来増殖因子はＡ ｆａホモダイマーである（）ｆｅｌｄｉｎ等、　Ｎａｔｕｒｅ　３１９：　５ｆ ｌ−５１４，１９８６）。ブタ血小板もＢ−Ｂホモダイマーを生産すると思われ る（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ等。 ＥＭＢＯＪ　３：　２９６３−２９６７、１９８４）。 高度に精製された生物学的に活性なＰＤＧＦを生産する多くの試みがなされてき ており、そして多くの人が種々の宿主系において組換えＰＤＧＦを発現させるこ とを試みてきた。米国特許第４　、４７９．８９６号はゲル電気泳動およびタン パク質の位置決定するための染色を用いる方法による、血小板からの天然ＰＤＧ Ｆの単離および回収方法を記載している。米国特許第４．７６６、０７３号、４ ，７６９゜３２８号および第４．８４９．４０７号はそれぞれ真核細胞、特に酵 母中で組換え的に生産される種々のＰＤＧＦ類似体を開示している。ヨーロッパ 特許公開第２８２３１７号は精製ＰＤＧＦ−Ｂ！Ｉ、およびこの８鎖の単離に宵 月なモノクローナル抗体を開示している。ヨーロッパ特許公開第２８８３０７号 は、酵母および哺乳動物細胞におけるＤＮＡの発現のみならずヒトＰＤＧＦ−Ａ 鎖をコードするＤＮＡを育する発現ベクターを記載している。 組換えＰＤＧＦの生産のいくつかは成功したが、これらの結果は酵母および哺乳 動物細胞のような真核細胞中で主に達成されている。これらの系においては妥当 な量の生産物が明らかに生成されつるが、これらの細胞、特に哺乳動物細胞は培 養が高価かつ困難であり、それゆえ商業的には好ましくない。原核細胞における 組換えタンパクの生産は、それが容易であり、安価で多量に生産されるので、そ れによる生産が可能であることが一般的には好ましい。しかしながら、今日まで 原核細胞、特にＥ、コリ（Ｅ、コリ）におけるＰＤＧＦの生産はほとんど成功し ていない。事実Ｅ、コリにおけるＰＤＧＦの収率は検出するのが極端に困難であ りそして／または生成物は代表的には不活性である。Ｅ、コリによる成熟ＰＤＧ Ｆの生産が何故そのように低いかは明らかでないが、機能性を有する真核生物タ ンパク質の生産に必要なプロセッシング工程は原核生物では達成できず、従って タンパク質は正しく折りたたまれず、ジスルフィド橋が適正には形成されえない 可能性があることが示唆されている（Ｄｅｖａｒｅ等、　Ｃｅ１ｌ　３６：　４ ３−４９．１９８４；Ｗａｎｇ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９： 　１０６４５−１０６４８．１９８４）。 それゆえ、ＰＤＧＦが商業的に有用な規模で生産されるためには、他の生産方法 が必要である。本発明は、生物学的に活性なＰＤＧＦ−ＢをＥ、コリから大量に 生産するのに有用な方法およびＤＮＡ構築物を提供する。 ３、発明の要約 本発明は、 （ｉ　）　（ａ）宿主細胞による発現可能な原核生物タンパク質の全部または一 部分であるセグメント；（ｂ）化学的に切断しうる部位を有するセグメント；お よび（Ｃ）ＰＤＧＦ−Ｂモノマーであるセグメント；を有する融合タンパク質を コードするヌクレオチド配列を含有する組換え遺伝子で原核生物宿主細胞を形質 転換する、ここで前記融合タンパク質のセグメントをコードする遺伝子のセグメ ントは操作可能に連結されておりかつ宿主細胞により融合タンパク質として発現 可能であり； （１ｊ）宿主細胞により生産された融合タンパク質を回収し； （ｉｉｉ）融合タンパク質を化学的に切断してＰＤＧＦ−Ｂモノマーを放出させ 、そして、 （ｉｖ）該モノマーを精製する、 ことを含んでなる、原核細胞における生物学的に活性なＰＤＧＦ−８の生産法を 提供する。 ＰＤＧＦのモノマー形は、ある場合にはそれ以上プロセッシングされることなし で生物学的活性を示しつる。 しかしながら大抵の場合ダイマー形態物を再構成するのが好ましいであろう。従 って、本発明はまた（Ｖ）ジスルフィド橋の形成により前記モノマーを二重化さ せ；そして （ｖｉ）　ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーを回収する、工程を付加的に包含する、 前記工程（ｉ）−（ｉｖ）を包含する製法をも提供する。 この方法は生産された全細胞タンパク質の３０％の多量のＰＤＧＦをＥ、コリ中 にて提供する。 この方法はまた、ＰＤＧＦ生物活性を生じうる融合タンパク質をコードする組換 え遺伝子、およびこれら組換え遺伝子を含有するベクターをも提供する。加えて 、この組換え遺伝子を含有する形質転換された原核細胞系が提供され、この細胞 系はＰＤＧＦモノマーを大量に生産しつる。 本発明の方法、遺伝子、ベクターおよび細胞系は商業的開発にとって実際的な価 格で生物学的に活性なＰＤＧＦ−８を大量に生産することを可能とする。 ４、

【図面の簡単な説明】

図１はプラスミドｐＨ−ＰＦＩ　４の構築法を示す。プラスミドｐＭＷＶ−２か ら得られた２ｋｂ長さのＢａｍ旧フラグメントを逆方向でファージＭ−３ｍｐ１ ８に組み込む（白ヌキのボックス：　ｃ−ｃｉｓ−ｍＲＮＡ配列、斜線ボックス ：成熟ＰＤＧＦ−Ｂ領域）。もとの終止コドンＴＡＧを含む長い３°範囲をＳｍ ａｒ消化により除去した。終止リンカ−をこの領域に導入した。５°−領域はエ キソヌクレアーゼ■消化により除去した。ベクターｐＪＬＡ５０４を通じて一代 継代した後、読み取りパターン中のＰＤＧＰ−８コ一ド配列をベクターｐＥＺ１ のＳａｌ　Ｉ／　ＥｃｏＲＶ切断点に組み込んだ。ＰＲ＝バクテリオファージプ ロモーター；　ｃｒｏ’　−１ａｃ　７　＝　ｃｒｏ−β−ガラクトシダーゼ融 合タンパク質；　ｔｆｄ＝ファージ転写ターミネータ−０ 図２は天然のＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸配列およびプラスミドｐＥ−ｐＦ１４によ りコードされる融合タンパク質のＣＮＢｒ切断により回収される組換えＰＤＧＦ −８の配列を示す。 ｒＰＤＧＦ−８においては、ＣＮＢｒでの切断により最初の１２個のアミノ酸が 除去されることに注目すべきである。更に０、ｒＰＤＧＦ−ＢはＣ末端で５個の アミノ酸を付加的に含有する。これらアミノ酸の３個はＰＤＧＦ−ＢＢの配列と 相図３はＰＤＧＦ−Ｂの配列を含めたプラスミドｐＨ−ｐＦ１４の完全なヌクレ オチド配列を示す。 図４は Ａ）Ｅ、　コリ細胞からの溶解物： Ｂ）％ツマー性のＳ−スルホン化ｒＰＤＧＦ−Ｂ　；Ｃ）変性後のｒＰＤＧＦ− ＢＢ　； Ｄ）精製されたｒＰＤＧＦ−８（ダイマー）；およびＳ）標準物 のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。 図５は本方法により生産された組換えＰＤＧＦ−ＢＢの生物学的活性を示す。グ ラフは当初は休止状態にあるＡＫＲ−２８繊維芽細胞における２Ｈ−チミジンの 取り込みの刺激を示す。 図６は本発明の融合タンパク質の多数の模式的表示を示す。 Ａ、天然にプロセッシングされたヒトＰＤＧＦ−Ｂモノマー形。 Ｂ９本発明の実施例により生産され、続いて臭化シアン切断されたタンパク質で 、アミノ末端で１２個のアミノ酸が欠失しカルボキシ末端で５個伸長している。 Ｃ０天然のカルボキシ末端およびＢにおけるようなアミノ末端を生成させるため のエンテロキナーゼ切断部位を有するように修飾されたβ−ｇａｌ−ＰＤＧＦ− ８融合タンパク質。 Ｄ、Ｃにおけると同様であるが、ｔｒｐＥ融合物とした。 Ｅ、Ｃにおけると同様であるが、Ｘａ因子切断部位を有する。 Ｆ、　Ｄにおけると同様であるが、Ｘａ因子切断部位を有する。 Ｇ、融合物Ｃ，Ｄ、　ＥおよびＦを適当なタンパク質分解酵素で切断した産物。 ５、発明の詳細な説明 ５．１．融合タンパク質配列 融合タンパク質は、真核生物タンパク質の発現に使用され、強力なプロモーター の制御下にある所望のタンパク質の遺伝子を配置しており、そして／または他の 方法では同定困難なタンパク質に検出可能なシグナルを付与することが知られて いる。しかしながら、発現の結果を前もって予想できず、そして、ＰＤＧＦを含 有する融合タンパク質はまだ生成も示唆もされていない。 通常の状況は、融合タンパク質のアミノ末端が原核生物配列によりコードされて おり、これは強力なプロモーターの制御下に置くことができ、そしてカルボキシ 末端は真核生物配列によりコードされる。 本発明の場合、発現に融合タンパク質を使用することにより原核宿主中で予想外 に高収率でＰＤＧＦが生産できること、および生物学的に活性なダイマーがこの ようにして生産されたモノマーから容易に生成されうることが見い出された。融 合タンパク質を生産するＤＮＡ配列の基本的な部分はｆａ）宿主細胞による発現 可能な原核生物タンパク質の少なくとも一部分を表すセグメンｈ　、　（ｂｌ化 学的に切断しつる部位を有するアミノ酸配列をコードするセグメント；および（ ＣＩＰＤＧＦの生物活性それ自体を有するか、またはダイマー形にある場合にＰ ＤＧＦ生物活性を有するタンパク質をコードするセグメントである。加えて、こ の融合タンパク配列は相互に操作可能に連結されておりかつ適当な制御エレメン トに操作可能に連結されていて従って遺伝子は選択された宿主生物により転写、 翻訳および発現できなければならない。これらの特徴を以下により詳細に論議す る。 ５　、１．１．原核生物タンパク質セグメント一般に融合タンパク質の生産にお いては、検出可能な酵素活性を生ずる配列、そして好ましくは視覚的に検出可能 な酵素的機能を有する配列を原核生物タンパク質として使用することが通常であ る。この目的に最も頻繁に使用される酵素はβ−ガラクトシダーゼである。形質 転換されたクローンをすぐ同定するには、推定形質転換体をβ−ガラクトシダー ゼ活性の存在に関してスクリーニングできる（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍ ｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ。 ｌｅ−ｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　１９７２）。このアッセイにおける色の生 成は宿主細胞による融合タンパク質の生産を示すものであり、そして色の強度は 融合タンパク質の相対的発現の指標である。しかしながら、これは融合タンパク 質生産性り本発明の実施例において記載される融合タンパク質の遺伝子を構築す る過程において、プラスミドｐＥｘ−１のＳａ　ｌ　Ｉ／　ＥｃｏＲＶ消化によ り１０００個をこえるヌクレオチド、すなわちタンパク質のほぼ３分の２が欠失 される。 それにもかかわらず、依然としてｃｒｏ−β−ｇａｌ融合タンパク質の高レベル の発現が達成された。このように、原核生物タンパク質をコードする完全な配列 の組み込みは、検出可能性の観点からは望ましいものであろうが、所望の発現レ ベルを達成するためには必要でない。 Ｃｒ０−β−ｇａ　１−ＰＤＧＦ−Ｂ−融合タンパク質を生産するクローンの同 定は、ｃｒｏ−β−ｇａｌタンパク質における有意の増大をもたらす唯一の長い 読み枠がＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子中に存在するという事実により促進される。このよ うに、クローンが容易に単離され、１４，０００の分子量増加を示す。 本発明の実施例に記載される態様においては、融合タンパク質配列のアミノ末端 部分はｃｒｏリプレッサーβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｃｒｏ−β−ｇａｌ） またはその一部である。しかしながら、本方法は、この特定配列の使用に限定さ れない。例えば、他の原核生物タンパク質は、図５に示されるようにｔｒｐＥ遺 伝子産物である（Ｋｌｅｉｄ等、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１４：　１１２５−１１ ２９．　１９８１）。 ５．１．２．化学的切断部位 した後ＰＤＧＦ配列から原核生物配列を除去しうるためには、融合タンパク質を コードするＤＮＡ配列は、原核生物配列と機能を有するＰＤＧＦ配列との間に化 学的に切断しつる部位をコードする配列を含有しなければならない。明細書およ び特許請求の範囲を通じて用いられる「化学的に切断しつる部位Ｊとは、その部 位でペプチド結合を切るために化学的試薬で処理してそれにより酵素配列をＰＤ ＧＦ配列から効果的に分離しつる部位を意味する。この機能は多くの方法で使え る。例えば、本実施例においては、天然のＰＤＧＦアミノ酸配列の１２位に存在 するメチオニンの切断に臭化シアンが使用される。 これはＰＤＧＦ配列の最初の１２アミノ酸の欠失を生ずるが、タンパク質の残り の部分は依然として非常に高レベルのＰＤＧＦ生物活性を示す。 しかしながら、他の態様では全ＰＤＧＦ配列を保持させることが好ましいであろ う。かかる場合は、酵素配列とＰＤＧＦ配列との間に連結配列を含有する融合タ ンパク遺伝子を構築できる。このリンカ−ＤＮＡ配列はタンパク分解酵素による 分解を受けやすいペプチド配列をコードしつる。使用される特異的配列は限定的 ではないが、但し使用される酵素はＰＤＧＦ配列の決定的に重要な部分内の部位 をも攻撃することはないものとする。この目的で使用されるいくつかの好ましい 酵素はエンテロキナーゼまたはＸａ因子であり、これらのそれぞれが図５に示さ れる配列を存する特異的部位を切断する。 しかしながら、他の任意のプロテアーゼにより作用を受ける配列も、その配列が ＰＤＧＦ−８配列自体の決定的に重要な部分内で反復されていないという条件で 、使用できる。酵素の作用部位についての知識により、他の切断部位を選択する ことは当業者の能力範囲内の事柄である。 ５．１．３．　ＰＤＧＦ配列 天然ＰＤＧＦ−Ｂの配列はよく知られており、図２に再現されている。適当な配 列は適当な細胞源に由来するヒトｃＤＮＡライブラリーからも単離できる。ライ ブラリーのＰＤＧＦ−８フラグメントはＰＤＧＦ−８鎖と実質的に相同なＶ−ｓ ｉｓ（ＳＳＶ）遺伝子の全部または一部とハイブリッド形成させることにより容 易に同定できる。単離したｃＤＮＡとＰＤＧＦ−Ｂ鎖の同一性はＤＮＡ配列決定 により証明できる。 しかしながら、本発明の範囲は完全な天然ＰＤＧＦ配列の使用に限定されないこ とが理解されるべきである。すでに前記したとおり、天然配列中の最初の１２ア ミノ酸の除去は生物活性に実質的に何ら影響しなかった。加えて、後記する実施 例かられかるように、天然の分子末端に数値のアミノ酸を添加してもそのタンパ ク質の活性に悪影響を与えない。従って、活性を失うことなく　ＰＤＧＦ配列に 実質的な修正を行いうろことが明らかである。それゆえ、「生物学的に活性なＰ ＤＧＦＪなる用語は、天然の配列並びに天然の配列とは異なるが必要な活性を保 持するに十分に重複的であるそれらの相同物をも包含することが意図される。配 列内になし得る変化の種類は、例えば分子の必須構造を保持する「サイレント」 または「保存的」変化である。換言すれば同一の、または機能的に均等な遺伝子 産物をコードする遺伝子配列を生ずる。欠失、付加または異なったヌクレオチド 残基の置換による天然型ヌクレオチド配列の変更が意図される。この遺伝子産物 は欠失、付加またはアミノ酸残基の置換を含み得る。置換は関与する残基の極性 、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質における類似性に 基づいて行い得る。 例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含さ れる：正に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが包含される；荷電さ れていない極性のヘッド群または類似した親水性の値を有する無極性のヘッド群 を有するアミノ酸には以下のものが包含される：ロイシン、イソロイシン、バリ ンニゲリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン：セリン、トレオニン；フ ェニルアラニン、チロシン。 当業者は利用可能でありかつ機能を存するＰＤＧＰ分子を生ずる変化の種類を認 識するであろう。 本実施例においては、モノマーを放出するのに使用される臭化シアン分解ゆえに 、融合タンパク質のＰＤＧＦ部分か天然配列の最初の１２アミノ酸を欠く態様が 記載される。　これは、■遺伝子のアミノ末端プロ配列をコードする領域がその タンパク質のダイマーを形成能および宿主を形質転換させる能力に悪影響を与え ることなく、欠失できるという以前の報告と一致する。 （Ｒｉｃｈｔｅｒ−Ｋｉｎｇら、ＰＮＡＳ　ｔＪｓＡ　８２：　５２９５−５２ ９９．　１９８５；Ｈａｎｎｉｎｋ　ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６： 　１３４３−１３４８．　１９８６；５ａｕｅｒら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５９ ：　２９２−３００．１９８６）。加えて、例示したｒＰＤＧＦ−Ｂは、Ｓｍａ 　Ｉ消化によるもとの終止コドンの欠失およびこの部位での終止リンカ−の挿入 ゆえにＣ末端に５残基が伸長されている。しかしながら、融合タンパク質はまた 、その天然の状態におけるＰＤＧＦ−Ｂ配列で生産されることもできる。 この情報から、ＰＤＧＦ配列は実質的にＮ−とＣ−両末端で修飾でき、かつ依然 として生物活性を保有し得ることは明らかである；従って、天然配列またはいず れかの末端で減少もしくは伸長された配列を存する融合タンパク質は、本明細書 および特許請求の範囲で用いられるｒＰＤＧＦモノマー」なる用語の範囲内に包 含される。再生されたダイマーＰＤＧＦは異なった長さのモノマーから成りうる ことも意図される。 ５．２．精製 単離されたＰＤＧＦ−Ｂ鎖を得るためには、その種にとって適切な培養条件下に 形質転換宿主細胞を増殖させる。 使用した種の如何に応じ、タンパク質は上清および細胞自体の両方から単離し得 る：しかしながらＥ、コリでは、タンパク質を細胞から直接に抽出する必要があ る。封入体は１掲の５ｔａｎｌｅｙおよびＬｕｚｉｏ記載の方法により細胞から 単離でき、そしてそこからタンパク質を単離できる。次に融合タンパク質をタン パク質内に設けられた特異的な切断部位に適する方法により切断してモノマーを 放出させる。 ひとたびモノマーが放出されると、その後の精製を行うことができる。低ｐｌ（ 環境下においては、他の付加的な工程に先立ちＢ鎖のチオール基を酸化から可逆 的に保護することが一般的に好ましいであろう。チオール基の保護はスルホン化 により達成できる。これは、タンパク質に亜硫酸塩および亜ジチオン酸塩を添加 することにより達成できる。しかしながら、成る種の他の方法、例えばメルカプ トエタノールの存在下におけるクロマトグラフィーまたはＤＴＮＢによるチオー ルの修飾は、有用な構築生成物を生じなかった。 ゲル浸透クロマトグラフィーは通常約１〜６モルの変性剤、例えばグアニジン塩 酸の存在下に組換えタンパク質を更にｆｆｊ製するのに好適な方法である。切断 後に残存する任意の融合タンパク質フラグメントはこの方法により容易に除去さ れる。水で透析後、沈澱か生じ、この中には幾らかの量の非タンパク性物質が濾 過後においても残留しつるが、ペプチドはギ酸で抽出することによりさらに単離 される。次にこれらペプチドをＨＰＬＣで更に精製する。前述の方法は好適な態 様を示すが、任意の適当なりロフトグラフィー法によってもＰＤＧＦは単離でき ることに注目すべきである。これらの方法の変更は当業者により容易に認識され よう。 ５．３．再生 上記したとおり、ＰＤＧＦ−Ｂモノマーが生物活性を示す幾つかの場合があり得 る。しかしながら、信頼性をもって生物活性を得るためには、ｒＰＤＧＦ−Ｂは ダイマーの形態に再生されるのが好ましい；ダイマーの形成は自然発生的に起る とは思われない。再生を達成するためには、精製され保護されたモノマー上のス ルホ基を還元し、そしてジスルフィド橋が形成される。通常、これは例えば尿素 （４モルまで）とチオール試薬の存在下で一工程で達成できる。例えば、精製さ れたタンパク質をグルタチオン（１００ミリモルまで）、または、２−メルカプ トエタノール（２％の濃度まで）で処理し続いて室温で最高２日迄インキュベー ションすることによって再生はむしろ容易になされる。これらの条件下における ダイマー形成はむしろ特異的であり、高収率である。こうして形成されたダイマ ーは、逆相クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによりさら に精製できる。このことは、全タンパク質量の約２０％を占めるＭｒ約２４．０ ００のバンドの出現により証明される。より高分子量形態のものはもしあっても わずかである。収量は培養物１１当たりｒＰＤＧＦ−ＢＢ　０．７〜１．Ｏｍｇ であった。これは、真核生物系におけるＰＤＧＦダイマーの発現率に最も匹敵す るが、ある場合には真核生物系はＰＤＧＦの商業的生産には受容し難いレベルで ある５〜２０ｎｇ／ｍ１程度の低さである（ＫｅｌｌＹ等、ＥＭＢＯＪ　４：　 ３３９９−３４０５．１９８４）。 ５．４．生物活性 本方法で調製された再生ＰＤＧＦはインビトロで試験した場合、すぐれた増殖促 進活性を有する。事実、ｒＰＤＧＦは１〜３ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度において［ ３Ｈ］−チミジンのＡＫＲ−２Ｂ繊維芽細胞へのとり込みを刺激したが（５０％ 活性）、血小板から精製したＰＤＧＦはそれより活性が僅かに低かった（１．５ 〜４ｎｇ／ｍｌ）。加えて、両方の産物は［２旧−チミジンのとり込みを同一の 最高値まで刺激した。このように、ｒＰＤＧＦ−ＢＢはヒト血小板由来ＰＤＧＦ と品質的に匹敵しうる（図４参照）。 ５．５．Ｍ御エレメントおよびベクター融合タンパク遺伝子を効果的に発現させ るには、適切な制御エレメントが選択されなければならない。一般に、この選択 は選ばれたクローニングベクターに応じてなされる。挿入された遺伝子の転写お よび翻訳を達成するためには、遺伝子は宿主細胞と適合するプロモーターの制御 下に置かれなければならない。 プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合しそして転写を開始するＤＮＡ領域 である。選択されたプロモーターは、宿主細胞生物から単離されたどれであって もよい。例えば、一般的に使用される宿主系であるＥ。 コリは、このもの、そのバクテリオファージまたはそのプラスミドに関連するｌ ａｃまたはｒｅｃＡプロモーターのような多数のプロモーターを存している。λ ファージＰＬおよびＰ、プロモーターのような、合成または組換えにより作製さ れたプロモーターは、それに隣接するＤＮＡのセグメントの高レベル生産を指示 するのに使用できる。 遺伝子の効率的な転写および翻訳を得るには、開始シグナルも必要である。例え ばＥ、コリｍＲＮＡにおいては、リポソーム結合部位には翻訳開始コドン（ＡＵ ＧまたはＧＩＧ）および、１６ＳリポソームＲＮＡの３゛末端の塩基と相補的な 他の配列が包含される。これら後者配列のいくつか（シャインーダルガルクまた は５−Ｄ）はＥ。 コリおよび他の適当な宿主細胞型において確認されている。宿主細胞系と適合し うる任意の５Ｄ−ＡＴＧ配列が使用できる。これらには、限定するものではない が、コリファージラムダのＣｒＯ遺伝子またはＮ遺伝子、またはＥ、ｌ−リトリ ブトファンＥ、Ｄ、Ｃ，ＢまたはＡ遺伝子が包含される。 インビトロでクローニングベクターにＤＮＡフラグメントを挿入するための多く の方法か存在する。ＤＮＡリガーゼは二重鎖ＤＮＡ中の隣接するヌクレオチド間 の一重鎖ニツクをとじる酵素である；それゆえ、この酵素はある種の制限酵素に より生成された、アニール化された付着端を共有結合させるのに使用できる。あ るいはまた、ＤＮＡリガーゼは平滑末端フラグメント間のホスホジエステル結合 の形成を触媒するのに使用できる。 最後に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素がフラグメントの 両末端でホモポリマー性３゛−一本鎖テイルを形成させるのに使用できる。ニ一 方の集団の３″末端にオリゴ（ｄＡ）配列を付加し、第２の集団の３°末端にオ リゴ（ｄＴ）をブロックを付加することにより２つの種類の分子をアニーリング させてダイマー環を形成させることができる。これら方法の任意のものをベクタ ー中の特定部位に遺伝子セグメントプロモーターおよび他の制限エレメントを連 結させるのに使用できる。このように、配列がベクターＡＴＧ配列に対して正し い読み枠に来る様式で、融合タンパク質をコードする遺伝子に選択されたベクタ ー中に、ベクタープロモーターおよび制御エレメントに対して特別の関係で結合 される。使用される方法は既知の任意の発現ベクターまたはその誘導体でありう る；最も頻繁に使用されるもツノ中にはｐＢＲ３２２，ｐＡＣ１０５，ｐＶＡ　 ｓ。 ｐＡＣＹＣ１７７、ＰＫＨ４７，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＢ　１１０．　ｐｍＢ ９．　ｐＢＲ３２５、Ｃｏｌ　Ｅｌ、　ｐｓｃｌｏｌ、　ｐＢＲ３１３，ｐＭＬ ２１．　Ｒ３Ｆ２１２４．　ｐＣＲｌまたはＲＲ４のようなプラスミドベクター ；ラムダｇｔ１１、ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、シャロン２８．シャロン４ Ａ、ラムダｇｔ−ｔ−ラムダＢＣ，ラムダ−ｇｔ−１−ラムダＢ、　Ｍ１３ｍｐ ７．およびＭ１３ｍｐ９のようなバクテリオファージベクターがある。 本発明の実施例で記載される態様においては、使用する発現ベクターはｐＥＸプ ラスミドファミリーの誘導体であり（ＳｔａｎｌｅｙおよびＬｕｚｉｏ、　ＥＭ ＢＯＪ、　３：２９６３−２９６７゜１９８４）　、これはＥ、コリ、詳細には ＮＦＩ株の形質転換に使用された。この組み合わせは好ましい、というのなわち 全細胞タンパク質の３０％にもなるからである。 しかしながら、他のＥ、コリ株を含む多数の異なる宿主細胞型と適合する種々の 発現ベクターが入手しつるならば、代替発現ベクターを異なる原核生物宿主細胞 系と組みあわせることは当業者のなし得る事柄でである。他の好ましい宿主細胞 系は例えばＥ、コリＨＢＩＯＩ。 ＪＭ１０９．　ＲＲ−１またはＤＨ−１である。 ６、実施例 ６．１．材料および方法 以下に、本実施例では使用される材料およびそれらを入手できる供給源または文 献を列記する。 Ｅ、コリ　ＪＭ１０３　ＰｈａｒｍａｃｉａＥ、コリ　ＮＦＩ　ＥＭＢＯＪ　３ ：１４２９−１４３４（１９８４）ｐＥＸｌ　（プラスミド）　Ｇｅｎｏｆｉｔ 　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；　またＥＭＢＯＪ　３：１４２９−１４３４（１９８ ４）Ｍ１３ｍｐ１８（ベクター）　Ｐｈａｒｍａｃｉｓ；またＦＥＢＳ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ１９８：３４４−３４８．３４５（１９８６）ｐＪＬＡ５０４（プラス ミド）　蝕朋挫：２７９−２８３．２８０（１９８７）ｐＭＶＷ−２（プラスミ ド”）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９８：３４４−３４８゜グアニジン塩酸 およびトリスはＳｉｇｍａより、ギ酸、２−プロパツール、アセトニトリルおよ びトリフルオロ酢酸はＭｅｒｃｋより、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００はＰｈ ａｒｍａｃｉａより、５ｉ−３００−ポリオールブチルクロマトグラフィーカラ ムおよびアンピシリンは５ｅｒｖａより、培地および補添物質はＧｉｂｃｏより 、そして放射性化学薬品はＡｍｅｒ　−ｓｈａｍより入手した。 増殖刺激活性は５ｈｉｐｌｅｙらのＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４４ニア１Ｏ−Ｊ ｏｈｎｓｏｎ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕ ｎ、　１０４：６６−７４．１９８２）記載のようにして新鮮な血小板から調製 した。 ゲル電気泳動は、Ｈｏｐｐｅ等のＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５５： ２５９−２６４．１９８４；　１３．５％ゲル、に記載されるようにして実施し た。アミノ酸分析はＢｉｏｔｒｏｎｉｃ’ｓ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　ＩＣ２０００ により測定した。アミノ末端配列分析はＬ１２　（Ｓｅｑｕｅｍａｔ）固相配列 決定装置を用いて実施した。この目的には、タンパク質をジイソチオシアネート で活性化したガラスにそのアミノ基により結合させた（ｔ＋ｏｐｐｅ等、上掲） 。あるいはまた、配列は４７０Ａ気相分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ）により決定された。タンパク質含量はＢｒａｄｆｏｒｄ　（Ａｎａｌ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：　２４８−２５３．１９７６）およびＲｅｄｉｎ ｂａｕｇｈ　＆　Ｔｕｒｌｅｙ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ。 １５３：　２６７−２７１．１９８６）の方法により測定した。 ６．２１発現ベクターの作製 欠陥ラムダプロファージ（λＮａｍ７Ｎａｍ５３ｃＩ　８５７デルターＨ１）を 組込んだＮＦＩ株を宿主としそ使用した（Ｋ１２デルタ−８１デルタｔｒｐ　ｌ ａｃ　Ｚ−ａｍＸｓｔａｎｌｅｙ　＆　Ｌｕｚｉｏ。 上掲）。出発物質はクローンｐＭＶＭ−２から得たｃ−ｓｉｓ−含有ＢａｍＨＩ 　ＤＮＡフラグメント（２ｋｂ）であった（Ｗｅｉｃｈ等、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ ｔ、　１９８：　３４４−３４８．１９８６）。このフラグメントをベクターＭ １３ｍｐ１８のＢａｍＨＩ接合点に逆方向にサブクローニングした。Ｓｍａｌで の消化により（図１ル−ンｂ）、未翻訳３゛配列およびＣ末端プロ配列をコード する配列が除去された。次いで翻訳終止リンカ−（ＰＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ）をこのＳｍａ　Ｉ接合点に組み込んだ（図１、レーンＣ）。ｃ−ｓｉｓ遺伝 子の５゛コード領域を除去するために、プラスミドをＰｓｔ［と５ａｌｌで消化 しく図１、レーンｅ）　、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ　（Ｇｅｎｅ　２８：　３５１−３ ５９．１９８４）記載のようにしてエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化のための５゜ および３′の付着端を生成させた（図１、レーンｆ）。 残っている第２のストランドはＳ１ヌクレアーゼを用いて除去した（図１ル−ン ｆ）。ＤＮＡポリメラーゼ−Ｉ−フレノウフラグメント処理により、平滑末端が 生成され、次いでこのプラスミドはりガーゼ処理により再び環化された。Ｅ、コ リ株ＪＭ１０３中に形質転換後、コロニーが得られた。エキソヌクレアーゼＩＩ Ｉによる短縮の程度はミニプラスミド作製およびこれらコロニーのプラスミドＤ ＮＡの配列決定により決定された。ＰＤＧＦ−Ｂ配列の読みパターンを有するＭ １３ｍｐ１８ベクターの「マルチ−クローニング部位」からの５ｐｈＩ接合点か らのＡＴＰ開始コドンを含有するプラスミドが得られた。 結果は、ＮＨｔ末端におけるわずかな変化であった。 （ｓｅｒ−１ｅｕ−ｇｌｙの代わりに、ｍｅｔ−ｐｒｏ−１ｅｕ−ｇｌｙ）。Ｐ ＤＧＦ−Ｂコード配列をＳｐｈ　Ｉ／　ＥｃｏＲＩ部分消化により切り出しプラ スミドｐＪＬＡ５０４中に組み込み（ＳｐｈＩ／ＥｃｏＲＩ）（Ｓｃｈａｕｄｅ ｒ等、Ｇｅｎｅ　５２：　２７９−２８３．１９８７）　、５ａｉｌの３゛末端 を得た。 このプラスミドを再びＳｐｈで部分消化した（図１、レーンｈ）。突出ている３ ゛末端はＴ４ポリメラーゼ処理により除去した（図１ル−ンｉ）。５ａｉｌ消化 後にＰＤＧＦ−Ｂ配列を含有する３９０ｂｐフラグメントを単離しく図１ル−ン ｊ）、そしてｐＥＸ１ベクターのＳａｌ　［／　ＥｃｏＲＶ位置に組み込んだ（ 図１、下部中央）。 プラスミド吐ｘｉのＳａ　ｌ　Ｉ／　ＥｃｏＲＶ消化により、β−ガラクトシダ ーゼの約３分の２をコードする、１０９７ヌクレオチドが除かれた。この欠失は 、ｃｒｏ−β−ｇａｌ融合タンパク質の高度の発現を変化させなかった。 ＰＤＧＦ−Ｂ配列を効率的に発現するコロニーを同定するには、ＮＦＬ株への形 質転換後に得られたコロニーを光学濃度０．３０ＤＵ（４４０ｎｍ）になる迄３ ０℃で培養し、その後にｃｒｏ−β−ｇａｌ融合タンパク質の生産を誘導するた め４２°Ｃでさらに３時間培養した。細胞を超音波処理により破壊し、ドデシル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および２−メルカプトエタノールで溶解させた。ドデ シル硫酸ナトリウムの存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動すると、多くの調 製物において６５．０ＯＯｄ（４８，０００に代わって）の分子量を有する強い バンドが生成し、このことはＰＤＧＦ配列の発現を示している。単離されたプラ スミドをｐＥ−ｐＦ１４と命名した。ｐＨ−ｐＦ１４プラスミドで形質転換した Ｅ、コリ株ＮＦＩはＡＴＣＣに寄託され、受託番号６８１０４が付与された。 ６．３．細胞の培養および封入体の調製１１の培養物中に５０〜１００μｍ／ｍ ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中にて、光学濃度が０．２０ＤＩＪ（４４ ０ｎｍ）となる迄Ｅ、コリを３０°Ｃで培養し、次いで４２℃でさらに３時間振 盪した。遠心分離にて（５００Ｑｘｇ、　１０分）細胞を収穫し、トリス−Ｈｃ ｌ（２０ｎＭ）およびＥＤＴＡ（０，５ｍＭ）、ｐｉ（７，８、の２０ｍ１中に 懸濁した。典型的な調製では２０〜３０１の培地を増殖させた。細胞は、リビブ レス（Ｒｉｂｉｐｒｅｓｓ：　５ｏｒｖａｌｌ）に２０．０００ｐｓ　ｉで２回 通すことにより破壊した。ＰＤＧＦ−８（タイプＢの血小板から得た組換えモノ マー増殖因子）に加えて、ｃｒｏリプレッサーおよびβ−ガラクトシダーゼの一 部から成る融合タンパク質は封入体を形成し、これは２％トリトンＸ−１００（ ｅ濃度）を添加後遠心分離（６０００Ｘ　ｇ、　１０分）することにより得られ た。 ６．４．還元およびＣＮＢｒ切断 ２０〜３０Ｉ！の培養物から得た封入体を２％５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム ）および２％２−メルカプトエタノールを含有するトリス−Ｈｃｌ（５０ｍＭ　 ；　ｐＨ７，８）　１００ｍ１中に溶解した（約１時間、３７℃）。少量の不溶 物質を遠心分離（２０，０ＱＯＸ　ｇ、　３０分間）により除去した。上溝液に ２倍容のアセトンを０°Ｃで添加した。０°Ｃで１５分後、沈澱を遠心分離しく ６０００Ｘ　ｇ、１０分）、これをギ酸（１００％）　８０ｍ１に溶解した。次 いで２０ｍ１の水を加え、不溶物を５０，０ＱＯＸｇ、１時間の処理にて除去し た。１ｇのＣＮＢｒおよび２００μｌの２−メルカプトエタノールを添加した； 反応混合物を室温で１晩放置した。この溶液を回転蒸発器上で乾燥した。残留物 を６Ｍグアニジン塩酸８０ｍ１を用いて溶解させ、そしてｐＨを３０％ＮａＯＨ の添加により７，５に調整した。 ＰＤＧＰ−Ｂは成熟配列のアミノ末端部分の１２位に唯一個のメチオニン残基を 有することに注目すべきである。 それゆえ、ｃｒｏ−β−ｇａｌ−ＰＤＧＦ−Ｂ融合タンパク質をメチオニン残基 の箇所てＣＮＢｒで切断すると、１２アミノ酸だけ短くなったフラグメントが生 成した。さらに、終止シグナルの導入によりＣ末端でのタンパク質の変更を生じ た（図２）。 ６．５．３−スルホン化 得られた溶液に、ＮａｚＳＯｓ　ＩｇおよびＮａｚＳｚＯａ　０．２５ｇを添加 した。この混合物を室温で５時間放置した。不溶物は遠心分離（５０，０００ｇ 　、１時間）により除去した。 ６．６．　３−スルホン化モノ？−ｒＰＤＧＦ−８の精製ゲル濾過には、上記で 得られた溶液を５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００を充填したカラム（直径５　ｃｍ、 高さ１００ｃｍ）に適用した。溶離剤は、ｐ）１７．４の５ｈ＋Ｍ　トリス−Ｈ Ｃｌを含有する４Ｍグアニジン塩酸であった。流速は毎時１６０ｍ１であった。 フラクション１５ｍ１ずつを集めた。フラクションの一部分をＳＤＳゲル電気泳 動により分析し、約１４ｋｄの分子量を有するタンパク質を含有するフラクショ ンを合わせ、５Ｉ！の水で一夜透析した。透析中に沈澱が形成され、これはギ酸 を最終濃度が１０％となるまで添加することにより溶解させた。不溶物を遠心分 離（２０，０ＱＯＸｇ、２０分）により除去した。上溝液（約１６０ｍ１）をＨ ＰＬＣカラム（直径２ｃｍ、高さ２５ｃｍ　；逆相：　５ｉ−３００ポリオール ブチル、５　μｍ、　５ｅｒｖａ）に、毎分２．５ｍｌの流速で適用した。試料 を適用後、カラムを約２倍容で洗った。 ｒＰＤＧＦ−Ｂモノマーは１０％ギ酸、６０％２−プロパツールおよび３０％Ｈ ２０に対して１０％ギ酸／Ｈ２０の直線濃度勾配で毎分２．５ｍｌの流速で１８ ０分間溶離させた。ｒＰＤＧＦ−Ｂは約４０〜６０分で溶出した。相当するフラ クションを合一して５１のＨ２Ｏで透析した。 ６．７．ダイマー形成および精製 Ｓ−スルホン化モノ７−　ｒＰＤＧＦ−Ｂを０．４ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した 。次に最終濃度が１モルとなるまで尿素を添加し、次いでグルタチオン（５ｍＭ ）および酸化型グルタチオン（０，５ｍＭ）を添加した。トリス−ＭＣＩ　（あ る場合にはトリス塩基）を添加してｐＨを７．８に調整して７．８（最終濃度約 ５０ｍＭ）に調整し、そしてこの反応混合物を室温で２日間放置した。ダイマー ｒＰＤＧＦ−ＢＢをイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。この目的に は、約２０ｍｇのタンパク質を、２０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）中 のＳ−セファロースの１ｍｌカラムに通した。 モノ？　−ｒＰＤＧＦは２０ｎＭ　トリス−ＨＣｌ　（１）Ｉ（７，４）で洗浄 することにより除去した。２０ｎＭ　）リス−ＨＣｌおよび０．３ＭＮａＣ１（ ｐＨ７，４）で再度洗った後、ダイア　−ｒＰＤＧＦ−８を２０ｍＭ　）リス− ＨＣｌおよび０．７　Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ７，４）で溶離させた。ダイマー形成 後の収量は、培養ＩＩ！当たりタンバク質０．５〜０．７ｍｇタンパク質であっ た。このタンノ（り質は高純度（ＳＯＳゲル電気泳動後）であり、マウスＡＫＲ ２Ｂ繊維芽細胞において１〜２ｎｇ／ｍｌの濃度で３Ｈ−チミジンのとり込みを 半最大に刺激した（図４および５）。 特表千４−５０４９４９　（１１） ＦＩＧｔＪｎＥ　２ ｔ　１・　１０　ロ ５ＬＪ：ａＳＬτＩＡｊＰＡＭＩＡ）：５ＸＴＲτｆｉｒ！！５ＲＪル）ＤＲＴ ＩＪＡ）ｌＦＬ％−、ｊＰｒσ−゛Ｃ〜’ＱＲＣ５ＣＣＣＮmＲＮＶＱＣ Ｉ人ΣＣにＴＲＴ！’／ＦＥＩ’；ＲＲＬＩＤＲτＮＡＮｒＬＭＰＰＣ’／１Ｖ ＱＲｃ５（１；ＣＣ？１ＮＲＮＶＱＣＲＰＴＱＶＱＬＲＰＶＱＩ／ＲＸ：ΣＩＶ ＲＫＫＰ！ＦＫＸＡＴＶＴＬ！　ＤＨＬＡＣ＊ＣＥＴＶＡＡＡＲＰｖＴＲＰＴＱ ＶＱＬＲＩ’ＶＱＶ’ＲＸ！Ｅ！ＶＲＸＸＭＦＫＫＡＭＬＪ：ＤＨＬ＾ＣＫＣＥ ＴＶ入入入ｊＬＰＶＴＲ５ＰＬＮｒつ　− Ｎ 特表平４−５ｏ４９４ｃ）（１２） ｒｏ　で ５゛０ｉ耐０２３゜６　□３□３　□３２＝　２３３ｏ　２３４５　”ＦＩＣＵ ＲＥ　３　（４ｏｆ　５１ ５−−１　コに）Ｃ惺−７−３’ ３２Ｓ０　３２６σ　３２７０　３２８０　３２９０　３３００特表千４−５０ ４９４９　（１３） ６．、紅購Ｗ口Ｑ■’ｍ−＋４　−　−　ユπ３′４２１’５　４２２０　＜； ｏ６　４２４０ＦＩＧＵＲＥ　４ Ｓ　Ａ　Ｂ　Ｄ　Ｃ６ Ｆ工ＧＬＩＲＥ　５ く　の　。　０ＬｉＪ　ｕ−ロ 特表千４−５０４９４９　（１４）

Claims (92)

【特許請求の範囲】
1. １． （ｉ）（ａ）宿主細胞による発現可能な原核生物タンパク質の少なくとも一部分 であるセグメント；（ｂ）化学的に切断しうる部位を有するセグメント；および （ｃ）ＰＤＧＦ−Ｂモノマーであるセグメント；を有する融合タンパク質をコー ドするヌクレオチド配列を含有する組換え遺伝子で原核生物宿主細胞を形質転換 する、ここで前記融合タクパク質のセグメントをコードする遺伝子のセグメント は操作可能に連結されておりかつ宿主細胞により融合タンパク質として発現可能 であり； （ｉｉ）宿主細胞により生産された融合タンパク質を回収し； （ｉｉｉ）融合タンパク質を化学的に切断してＰＤＧＦ−Ｂモノマーを放出させ ；そして、 （ｉｖ）該モノマーを回収する、 ことを含んでなる原核細胞における生物学的に活性なＰＤＧＦ−Ｂの製法。
2. ２． （ｖ）ジスルフィド橋の形成により前記モノマーを二量化させ；そして （ｖｉ）ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーを回収する、工程をさらに含んでなる請求 の範囲１記載の方法。
3. ３．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が少なくともβ−ガラクトシダーゼ 配列の一部分を含有する請求の範囲１記載の方法。
4. ４．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が少なくともβ−ガラクトシダーゼ 配列の一部分を含有する請求の範囲２記載の方法。
5. ５．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が、ｃｒｏリプレッサ−β−ガラク トシダーゼ配列を含有する請求の範囲３記載の方法。
6. ６．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が、ｃｒｏリプレッサ−β−ガラク トシダーゼ配列を含有する請求の範囲４記載の方法。
7. ７．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が、ｔｒｐＥ遺伝子産物を含有する 請求の範囲１記載の方法。
8. ８．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が、ｔｒｐＥ遺伝子産物を含有する 請求の範囲２記載の方法。
9. ９．化学的に切断しうる部位が臭化シアンにより切断されうる請求の範囲１また は２または３または４または５または６または７または８記載の方法。
10. １０．化学的に切断しうる部位がタンパク質分解酵素により切断されうる請求の 範囲１または２または３または４または５または６または７または８記載の方法 。
11. １１．酵素がエンテロキナーゼである請求の範囲１０記載の方法。
12. １２．酵素がＸａ因子である請求の範囲１０記載の方法。
13. １３．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲１または２または３または４ または５または６または７または８記載の方法。
14. １４．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲９記載の方法。
15. １５．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲１０記載の方法。
16. １６．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲１１記載の方法。
17. １７．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲１２記載の方法。
18. １８．形質転換がプラスミドで行われる請求の範囲１または２または３または４ または５または６または７または８記載の方法。
19. １９．形質転換がプラスミドで行われる請求の範囲９記載の方法。
20. ２０．形質転換がプラスミドで行われる請求の範囲１０記載の方法。
21. ２１．形質転換がプラスミドで行われる請求の範囲１１記載の方法。
22. ２２．形質転換がプラスミドで行われる請求の範囲１２記載の方法。
23. ２３．形質転換がプラスミドで行われる請求の範囲１３記載の方法。
24. ２４．形質転換がプラスミドで行われる請求の範囲１４記載の方法。
25. ２５．形質転換がプラスミドで行われる請求の範囲１５記載の方法。
26. ２６．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲１９記載の方法。
27. ２７．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲２０記載の方法。
28. ２８．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲２１記載の方法。
29. ２９．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲２２記載の方法。
30. ３０．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲２３記載の方法。
31. ３１．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲２４記載の方法。
32. ３２．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲２５記載の方法。
33. ３３．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲２６記載の方法。
34. ３４．プラスミドがｐＥｘプラスミドである請求の範囲２７記載の方法。
35. ３５．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲２６記載の方法。
36. ３６．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲２７記載の方法。
37. ３７．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲２８記載の方法。
38. ３８．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲２９記載の方法。
39. ３９．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲３０記載の方法。
40. ４０．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲３１記載の方法。
41. ４１．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲３２記載の方法。
42. ４２．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲３３記載の方法。
43. ４３．プラスミドがｐＥ−ｐＦ１４である請求の範囲３４記載の方法。
44. ４４．（ａ）宿主細胞による発現可能な原核生物タンパク質の少なくとも一部分 であるセグメント；（ｂ）化学的に切断しうる部位を有するセグメント；および （ｃ）ＰＤＧＦ−Ｂモノマーであるセグメント；を含有する融合タンパク質をコ ードするＤＮＡ配列であって、前記融合タクパク質のセグメントをコードする遺 伝子のマグメントは操作可能に連結されておりかつ宿主細胞により融合タンパク 質として発現可能であるＤＮＡ配列。
45. ４５．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が少なくともβ−ガラクトシダー ゼ配列の一部分を含有する請求の範囲４４記載の配列。
46. ４６．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が、ｃｒｏリプレッサ−β−ガラ クトシダーゼ配列を含有する請求の範囲４５記載の配列。
47. ４７．セグメント（ａ）の原核生物タンパク質が、ｔｒｐＥ遺伝子産物を含有す る請求の範囲４４記載の配列。
48. ４８．化学的に切断しうる部位が臭化シアンにより切断されうる請求の範囲４４ または４５または４６または４７記載の配列。
49. ４９．化学的に切断しうる部位がタンパク質分解酵素により切断されうる請求の 範囲４４または４５または４６または４７記載の配列。
50. ５０．酵素がエンテロキナーゼである請求の範囲４９記載の配列。
51. ５１．酵素がＸａ因子である請求の範囲４９記載の配列。
52. ５２．図３に示される配列である請求の範囲４４記載の配列。
53. ５３．図５Ｃ，Ｄ，ＥまたはＦのいずれか１に示される融合タンパク質をコード する請求の範囲４４記載の配列。
54. ５４．請求の範囲４４記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
55. ５５．請求の範囲４５記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
56. ５６．請求の範囲４６記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
57. ５７．請求の範囲４７記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
58. ５８．請求の範囲４８記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
59. ５９．請求の範囲４９記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
60. ６０．請求の範囲５０記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
61. ６１．請求の範囲５１記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
62. ６２．請求の範囲５２記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
63. ６３．請求の範囲５２記載の配列によりコードされる融合タンパク質。
64. ６４．請求の範囲４４記載の配列を含有する発現ベクター。
65. ６５．請求の範囲４５記載の配列を含有する発現ベクター。
66. ６６．請求の範囲４６記載の配列を含有する発現ベクター。
67. ６７．請求の範囲４７記載の配列を含有する発現ベクター。
68. ６８．請求の範囲４８記載の配列を含有する発現ベクター。
69. ６９．請求の範囲４９記載の配列を含有する発現ベクター。
70. ７０．請求の範囲５０記載の配列を含有する発現ベクター。
71. ７１．請求の範囲５１記載の配列を含有する発現ベクター。
72. ７２．請求の範囲５２記載の配列を含有する発現ベクター。
73. ７３．請求の範囲５３記載の配列を含有する発現ベクター。
74. ７４．プラスミドである請求の範囲４４または４５または４６または４７または ５２また５３記載の発現ベクター。
75. ７５．プラスミドである請求の範囲４８記載の発現ベクター。
76. ７６．プラスミドである請求の範囲４９記載の発現ベクター。
77. ７７．プラスミドである請求の範囲５０記載の発現ベクター。
78. ７８．プラスミドである請求の範囲５１記載の発現ベクター。
79. ７９．プラスミドｐＥ−ｐＦ１４。
80. ８０．請求の範囲６４または６５または６６または６７または７２また７３記載 の発現ベクターを含有する宿主細胞系。
81. ８１．請求の範囲６８記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
82. ８２．請求の範囲６９記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
83. ８３．請求の範囲７０記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
84. ８４．請求の範囲７１記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
85. ８５．請求の範囲７８記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
86. ８６．Ｅ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲８０記載の宿主細胞系。
87. ８７．Ｅ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲８１記載の宿主細胞系。
88. ８８．Ｅ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲８２記載の宿主細胞系。
89. ８９．Ｅ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲８３記載の宿主細胞系。
90. ９０．Ｅ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲８４記載の宿主細胞系。
91. ９１．Ｅ．ｃｏｌｉ．である請求の範囲８５記載の宿主細胞系。
92. ９２．受託番号６８１０４の下ででＡＴＣＣに寄託されている宿主細胞系。