ES2284545T3 - Vectores y transgenes con elementos reguladores para la administracion de genes del higado. - Google Patents

Abstract

Un vector recombinante que comprende dos copias de los potenciadores de protrombina humana operativamente enlazados al promotor de albúmina de suero humano.

Description

Vectores y transgenes con elementos reguladores para la administración de genes al hígado.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con construcciones que sirven de vehículo para la administración de ácido nucleico que tienen una capacidad mejorada de expresión en células diana, principalmente con hepatocitos y otras células del hígado.

Antecedentes de la invención

La habilidad para administrar ácidos nucleicos transportados por vehículos de administración, por ejemplo, virus recombinantes (adenovirus, virus adenoasociado, herpesvirus, retrovirus) que se utilizan con moléculas de ácido nucleico, tales como un plásmido, comprenden un transgén, para transfectar una célula diana; vectores de conjugación molecular; y vectores virales modificados son importantes para el tratamiento potencial de enfermedades genéticas a través de la administración génica.

El adenovirus es un virus con ADN nuclear no envuelto, con un genoma aproximadamente de 36 kb. Ver generalmente, Horwitz, M.S., "Adenoviridae and Their Replication," en Virology, 2^{da} edición, Fields y colaboradores, eds., Raven Press, New York, 1990. La recombinación (conglomerados de adenovirus dodecaedro y de adenovirus recombinante) para tipos específicos de células es útil para diferentes aplicaciones en oncología, biología evolucionista y terapia génica. Los adenovirus tienen desventajas cuando se los utiliza como sistemas de expresión para moléculas de ácido nucleico que codifican para, entre otros, proteínas, ribozimas, los ARN, ARN antisentido que son ajenos para el portador adenovirus (esto es, un transgén), incluido tropismo tanto para células divisoras como no divisoras, potencial patogénico mínimo, habilidad para replicar hasta un título alto para la preparación de linajes de vectores, y el potencial para portar insertos grandes. Ver Berkner, K.L., 1992, Curr. Top. Micro Immunol, 158:39-66; Jolly D., 1994, Cancer Gene Therapy, 1:51-64.

Los adenovirus tienen un tropismo natural para las células del tracto respiratorio, que los ha hecho vectores atractivos para ser utilizados en la administración de genes a las células del tracto respiratorio. Por ejemplo, los vectores adenovirus han sido y están siendo destinados para ser utilizados en el tratamiento de ciertas enfermedades, tales como fibrosis cística (CF), la enfermedad recesiva autosomal más común en caucásicos. En CF, las mutaciones en el gen regulador de la conductividad transmembrana de la fibrosis cística (CFTR) alteran la función del canal de cloro regulado por AMPc, dando como resultado una disfunción pulmonar. Se ha encontrado que las mutaciones génicas para codificar proteínas de CFTR alteradas no pueden ser desplazadas a la membrana celular para su funcionamiento apropiado. Se ha introducido al gen de CFTR en vectores adenovirus para tratar la CF en diferentes modelos animales y pacientes humanos. Particularmente, los estudios han mostrado que los vectores adenovirus son completamente capaces de administrar la CFTR al epitelio de las vías respiratorias de pacientes con CF, así como al epitelio de las vías respiratorias de ratas del algodón y primates. Ver, por ejemplo, Zabner y colaboradores, 1994, Nature Genetics, 6:75-83; Rich y colaboradores, 1993, Human Gene Therapy, 4:461-476; Zabner y colaboradores, 1993, Cell, 75:207-216; Zabner y colaboradores, 1994, Nature Genetics 6:75-83; Crystal y colaboradores, 1004, Nature Genetics, 8:42-51; Rich y colaboradores, 1993, Human Gene Therapy, 4:461-476.

Sin embargo, sería útil alterar el genoma de adenovirus, para permitir que sea utilizado para administrar una molécula de ácido nucleico que mejorase la expresión en el hígado, particularmente en hepatocitos.

Sería útil mediar la expresión del transgén transportado por el vector adenoviral a través del uso de uno o más elementos reguladores especializados. De esta forma se puede mejorar la expresión del transgén dentro de las células deseadas y se pueden dirigir los efectos del adenovirus a ciertas células o tejidos dentro de un organismo.

Como los adenovirus, también se han utilizado retrovirus para administrar transgenes a células diana. Como se expuso anteriormente, un transgén es una molécula de ácido nucleico que codifica, entre otros, para una proteína, ARN, ribozima, ARN antisentido, no producidos por el virus. Los viriones del retrovirus están en un rango de diámetro entre 80 y 130 nm y están compuestos de una cápside de proteína que se encuentra encapsulada en lípido. El genoma viral está metido dentro de la cápside junto con las proteínas integrasa y transcriptasa inversa. El genoma del retrovirus consiste de dos hebras de ARN. Después de que el virus entra a las células, la transcriptasa inversa sintetiza ADN viral utilizando el ARN viral como su molde. La maquinaria celular sintetiza entonces al ADN complementario que forma luego un círculo y se lo inserta dentro del genoma huésped. Después de la inserción, se transcribe el genoma del ARN viral y se completa la replicación viral.

Los ejemplos de retrovirus incluyen al virus Moloney de leucemia murina (Mo-MuLV), a los retrovirus HTLV y VIH. Los vectores del Mo-MuLV son los más comúnmente utilizados y se producen simplemente por medio del reemplazo de genes virales requeridos para la replicación con los transgenes deseados que van a ser transferidos. El genoma en vectores retrovirales contiene una larga secuencia de repetición terminal (LTR) en cada extremo con el transgén deseado o transgenes en medio. El sistema más comúnmente utilizado para la generación de vectores retrovirales consiste de dos partes, el vector retroviral y la línea celular de empaquetamiento.

Los retrovirus se clasifican típicamente por su rango de huéspedes. Por ejemplo, los virus ecotrópicos son virus que se enlazan únicamente a receptores de ratones y solamente son capaces de replicarse dentro de le especie murina. Los virus xenotrópicos se enlazan a receptores encontrados en todas las células de la mayoría de las especie,s excepto aquellas de ratones. Los virus politrópicos y anfotrópicos se enlazan a diferentes receptores que se encuentran tanto en especies murina como no murina. El rango de huéspedes se determina principalmente por medio de la interacción de enlazamiento entre glicoproteínas de la envoltura viral y proteínas específicas sobre la superficie de la célula huésped que actúan como receptores virales. Por ejemplo, en células murinas, un transportador de aminoácidos sirve como el receptor para la glicoproteína de la envoltura gp70 del virus Moloney de leucemia murina (Mo-MuLV). Se ha clonado recientemente al receptor para el Mo-MuLV y muestra una homología con un transportador fosfato. Existen seis receptores conocidos para retrovirus: CD4 (para VIH); CAT (para MLV-E (virus ecotrópico E de Murino leucémico); RAM1/GLVR2 (para el virus A de murino leucémico (MLV-A)); GLVRI (para virus de leucemia de Simio Gibón (GALV) y virus B de leucemia Felina (FeLV-B). Los receptores RAM1 y GLVR1 se expresan ampliamente en tejidos humanos.

Las líneas celulares de empaquetamiento de virus proveen todas las proteínas virales requeridas para la producción de la cápside y la maduración del virión del vector, esto es, los genes gag, pol y env. Para los vectores MMLV, es la línea celular de empaquetamiento la que determina si el vector es ecotrópico, xenotrópico o anfotrópico. La escogencia de la línea celular de empaquetamiento determina las células que serán fijadas como diana. Por lo tanto, la utilidad de los retrovirus para transferencia génica estará limitada por el hecho de que éstos sean receptores específicos.

Sin embargo, los retrovirus son útiles para los sistemas de suministro de genes debido a que los retrovirus tienen una alta eficiencia de infección y el ácido nucleico retroviral (después de transcripción inversa) se integra dentro del genoma huésped resultando en una expresión sostenida de los transgenes transportados por el vector. Sin embargo, los vectores retrovirales típicos están limitados ya que requieren células divisoras para la infectividad. Además, el suministro in vivo de estos vectores es pobre y es efectivo únicamente cuando se infecta líneas celulares auxiliares. Por lo tanto, sería útil poseer un sistema para incrementar la eficiencia de la infección retroviral.

Existen ciertas situaciones donde sería útil modificar la expresión de los transgenes transportados por los virus. Por ejemplo, la expresión del transgén específica para el tejido en células fijadas como diana puede incrementar la eficiencia de la infección, y por consiguiente, un volumen menor de virus en el organismo puede llegar a ser efectivo. Sería útil poseer un método para favorecer la expresión del transgén en una forma específica para el tejido.

Un método para dirigir poblaciones específicas de células a expresar una proteína de interés consiste en utilizar elementos reguladores heterólogos que son específicamente expresados en el tejido diana o en poblaciones de células deseadas. Esto se puede lograr a través del uso de combinaciones de potenciadores específicos para el tejido, de promotores y/o de otros elementos reguladores. Los elementos reguladores pueden ser constitutivos o inducibles, de tal forma que son regulados por medio de la ausencia o de la presencia de otras secuencias de ADN, proteínas u otros elementos o factores ambientales. Donde el transgén de interés es un gen citotóxico, una expresión con fugas sería altamente indeseable.

Resumen de la invención

Por lo tanto, la presente invención provee elementos reguladores mejorados que son útiles para dirigir la expresión transgénica al hígado. Las modalidades de acuerdo con la invención comprenden combinaciones de elementos promotores y potenciadores que son capaces de dirigir la expresión transgénica preferencialmente en el propio hígado. En una modalidad particular de acuerdo con la presente invención, se utilizan los elementos reguladores en vectores recombinantes, tales como los vectores basados en un plásmido no viral. Las modalidades de acuerdo con la invención comprenden vectores recombinantes útiles para expresión transgénica, particularmente para expresión alta y prolongada en el hígado.

Los transgenes se pueden utilizar en vectores recombinantes, tales como los vectores virales recombinantes, para dirigir la expresión de las secuencias asociadas del ADN de codificación preferencialmente en el hígado. En otras modalidades de la presente invención, se selecciona el promotor constitutivo fuerte del grupo que comprenda al promotor de albúmina en suero humano y al promotor \alpha-1-antitripsina.

En otras modalidades de la presente invención, los elementos potenciadores específicos para el hígado se seleccionan de un grupo que consiste en potenciadores de la protrombina humana [HPrT] y, potenciadores de la \alpha-1-microglobulina. Dos de estos elementos potenciadores para el hígado se utilizan en combinación con el promotor. En una modalidad, los elementos potenciadores se seleccionan de un grupo que consiste en potenciadores de la HPrT y potenciadores de la A1MB, y se los utiliza en combinación con el promotor de la \alpha-1-antitripsina.

Las modalidades preferidas de la presente invención son vectores virales recombinantes, particularmente vectores adenovirales. En las modalidades preferidas, la secuencia de codificación de ADN puede codificar una proteína terapéutica que es más efectiva cuando es suministrada al hígado. Los vectores adenovirales pueden comprender, además de los promotores y potenciadores de la presente invención, uno o más genes adenovirales con el propósito de soportar una expresión eficiente de la secuencia de codificación de ADN.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una descripción de los sitios de enlazamiento del factor de transcripción presentes en las regiones promotoras del CMV, la HSA, y la \alpha-1-antitripsina.

La Figura 2 es una descripción de los sitios de enlazamiento del factor de transcripción presentes en los potenciadores de la HSA (HSA-1.7, nucleótidos -1806 a -1737; HSA-6, nucleótidos -6081 a -6000), un potenciador de la protrombina humana (-940 a -860), un potenciador de la \alpha-1-microglobulina (-2806 a -2659) y un potenciador de la aldolasa intrónica (+1916 a +2329).

La Figura 3 es una representación esquemática de una serie inicial de combinaciones potenciador/promotor. El grupo A indica las combinaciones de los potenciadores de la HSA que fueron enlazados ya sea al promotor del mCMV o de la HSA. Los grupos B y C representan las combinaciones ya sea de la protrombina humana (HPrT) o de un potenciador de la \alpha-1-microglobulina (A1MB) enlazado al promotor del mCMV. Los grupos D y E representan a las combinaciones ya sea de HPrT o de A1MB enlazadas al promotor de la \alpha-1-antitripsina.

La Figura 4 describe la expresión del promotor del mCMV comparada con aquella del promotor del hCMV, y los efectos de añadir múltiples potenciadores de HSA (HSA-1.7, y HSA-6).

La Figura 5 describe la expresión de las construcciones que contienen al potenciador de la HPrT. El enlazamiento de este potenciador a la expresión elevada del promotor del mCMV (Panel B) hasta cerca de los niveles logrados con el promotor del CMV pero que no lo excedieron. La expresión del promotor de la \alpha-1-antitripsina fue bastante pobre, sin embargo cuando se añaden dos copias del potenciador de la HPrT, la expresión de esta combinación excede a aquella del promotor del CMV.

La Figura 6 describe los resultados de la expresión de las construcciones que contienen al potenciador de la A1MB. Se observa un incremento progresivo en la expresión con un número mayor de copias de este potenciador (hasta ocho copias) enlazadas al promotor del mCMV (Panel C). Todas las combinaciones de copias de este potenciador enlazadas al promotor de la \alpha-1-antitripsina produjeron niveles de expresión comparables a aquellos obtenidos con el promotor del CMV (Panel E).

La Figura 7 describe los resultados de la expresión obtenidos con candidatos representativos de cada serie de vectores que produjeron niveles equivalentes o superiores de expresión de \alpha-galactosidasa comparados con los del promotor del CMV.

La Figura 8 demuestra la expresión del FVIII en Ratones Beige SCID. Los casetes de expresión del Factor VIII utilizados contenían ya sea al promotor del CMV o a un promotor híbrido compuesto de dos copias del potenciador de hprt enlazado a un fragmento del promotor de la \alpha-1-antitripsina (Hprt(2)AAT). Se inyectaron 10 \mug de ADN del plásmido que contenía cualquier casete a través de la vena de la cola de ratones beige SCID utilizando la tecnología de suministro del plásmido Mirus. Se les practicó un sangrado a los ratones a los, uno, siete y catorce días después de la inyección y se determinaron los niveles en plasma del FVIII por medio de un ELISA que es específico para el FVIII humano. Cada barra representa la expresión promedio del FVIII en el plasma de cuatro ratones.

Los niveles de expresión detectados el día uno fueron comparables en los ratones que recibieron cualquier plásmido, indicando que el promotor híbrido podría producir niveles de expresión que se aproximasen a aquellos del promotor del CMV. Sin embargo, la expresión del promotor del CMV fue transitoria y cayó en picado hasta ser indetectable el día siete, mientras que, la expresión del promotor híbrido persistió hasta el día 14 (el último período de tiempo de este experimento). Esto sugiere que este promotor híbrido es una mejor escogencia para lograr una expresión transgénica de larga duración en el hígado.

La Figura 9 demuestra la expresión mediada por AAV de eritropoyetina humana recombinante [EPO] en ratones. A partir de estudios de promotores en células cultivadas Hep3B, se identificaron varias combinaciones potenciador/promotor como candidatos prometedores para lograr una expresión a largo plazo en el hígado. A partir de este panel de combinaciones, varias combinaciones fueron clonadas dentro de vectores AAV para analizar su habilidad para conducir la expresión de EPO humana recombinante. Se administraron 1 x 10^{1} partículas de cada vector AAV a ratones desnudos NCR por medio de una inyección en la vena portal. Los días 14, 28 y 42 posteriores a la inyección, se sangraron los ratones en forma retroorbital y se determinaron los niveles de EPO por medio de un ELISA específico para EPO humano. Todos los promotores mostrados en la figura anterior dieron origen a una expresión persistente más allá del día 42. No obstante, a partir de este análisis surgen tres combinaciones potenciador/promotor por ser las más prometedoras para producir altos niveles de persistencia de expresión. Dos copias del potenciador hprt enlazado a cualquiera de los promotores de la \alpha-1AT o de la HSA y dos copias del potenciador de la \alpha-1-microglobulina enlazadas al promotor de la \alpha-1-AT produjeron una expresión en el rango entre 1500 a 3000 mU EPO/ml o desde 300 \mug hasta 600 \mug de proteína/ml.

Descripción detallada de la invención

La administración de genes al hígado para propósitos terapéuticos ha sido explorada extensivamente. Esto incluye la investigación enfocada a la corrección de enfermedades genéticas del hígado así como a enfermedades sistémicas que pueden ser corregidas por medio del uso del hígado como depósito para la producción de proteína terapéutica. Para que esta aproximación a una terapia génica sea factible, la expresión del gen terapéutico debe ser duradera y aproximarse a niveles apropiados. En diferentes reportes, se ha explorado el uso de una variedad de promotores virales, no virales y específicos para el hígado, así como de diferentes combinaciones potenciador/promotor en el contexto de vectores adenovirales, AAV, retrovirales y con base en plásmidos para la expresión génica en células cultivadas e in vivo. En muchos de estos ejemplos la expresión transgénica fue transitoria y/o no suficiente para lograr un beneficio terapéutico. En el contexto de los vectores adenovirales, el promotor del CMV y el promotor del RSV dirigen altos niveles de expresión transgénica a pesar de que la longevidad de la expresión depende de la retención de la región adenoviral E4 en el vector. El desarrollo de una combinación potenciador/promotor que pueda dirigir niveles apropiados y sostenidos de expresión transgénica en el contexto de una variedad de sistemas de vectores sería, por lo tanto, beneficiosa.

Los promotores que son adecuados para la presente invención son el promotor de la albúmina de suero humano [HAS] y el promotor de la \alpha-1-antitripsina.

Los elementos potenciadores específicos para el hígado que son útiles para la presente invención son los potenciadores de la protrombina humana y los potenciadores de la \alpha-1-microglobulina. En modalidades preferidas, se pueden combinar múltiples elementos potenciadores con el propósito de lograr una expresión mayor.

Entre las modalidades de la presente invención están los vectores que comprenden dos elementos potenciadores seleccionados del grupo que consiste de potenciadores del HPrT y potenciadores del A1MB, en combinación con un promotor de la \alpha-1-antitripsina.

La estrategia para lograr niveles altos y sostenidos de expresión transgénica involucra la combinación de elementos promotores, que tienen el potencial para dirigir niveles efectivos y sostenidos de expresión, con elementos potenciadores específicos para el hígado que pueden, además, incrementar la expresión. La albúmina de suero humano y el promotor de la \alpha-1-antitripsina contienen elementos que dirigen la expresión todavía basal específica para el hígado. Los sitios de enlazamiento del factor de transcripción en estas regiones del promotor son descritos en la Figura 1. Los elementos potenciadores utilizados aquí incluyen dos potenciadores de la HSA (HSA-1.7, nucleótidos -1806 a -1737; HSA-6, nucleótidos -6081 a -6000), un potenciador de protrombina humana (-940 a -860), un potenciador de la \alpha-1-microglobulina (-2806 a -2659) y un potenciador de la aldolasa intrónica (+1916 a +2329). Se ha mostrado que cada uno de estos potenciadores incrementa grandemente la expresión transgénica cuando están enlazados a un promotor mínimo y los sitios de enlazamiento del factor de transcripción en estos elementos potenciadores se describen en la Figura 2. La Figura 3 es una representación esquemática de una serie inicial de combinaciones potenciador/promotor. El grupo A indica la combinación de los potenciadores de HSA que estaban enlazados ya sea al promotor del mCMV o de la HSA. El grupo B y el C representan las combinaciones ya sea del potenciador de la protrombina humana (HPrT) o de la \alpha-1-microglobulina (A1MB) enlazado al promotor del mCMV. Los grupos D y E representan las combinaciones ya sea de la HPrT o de la A1MB enlazada al promotor de la \alpha-1-antitripsina.

Cada una de estas combinaciones potenciador/promotor estaba enlazada a la \alpha-galactosidasa y fue analizada la actividad en células Hep3B por medio de los niveles de \alpha-galactosidasa en el medio sobrenadante después de la transfección transitoria. Como se observa en la Figura 4, la expresión del promotor del mCMV se reduce en comparación con la del promotor del CMV. Sin embargo, la combinación de cinco copias del potenciador de la HSA-1.7 con una copia del potenciador de la HSA-6 enlazado al promotor del mCMV, produjo una expresión que era más alta que aquella obtenida con el promotor del CMV. Los resultados de la expresión de las construcciones que contienen al potenciador de la HPrT se muestran en la Figura 5. El enlace de este potenciador al promotor del mCMV (Panel B) elevó la expresión a niveles cercanos alcanzados con el promotor del CMV pero no lo excedieron. La expresión del promotor de la \alpha-1-antitripsina fue bastante pobre, sin embargo cuando se añaden dos copias del potenciador de la HPrT, la expresión de esta combinación excede a aquella del promotor del CMV. Los resultados de la expresión a partir de las construcciones que contienen al potenciador de la A1MB se muestran en la Figura 6. Se observa una expresión progresivamente mayor con el incremento en el número de copias de este potenciador (hasta ocho copias) enlazadas al promotor del mCMV (Panel C). Todas las combinaciones de copias de este potenciador enlazado al promotor de la \alpha-1-antitripsina produjeron niveles de expresión comparables con aquellos obtenidos con el promotor del CMV (Panel E). Los candidatos representativos de cada serie de vectores que produjo niveles equivalentes o superiores de expresión de \alpha-galactosidasa comparados con los del promotor del CMV fueron analizados nuevamente en un experimento sencillo. Como se observa en la Figura 7, todas las combinaciones potenciador/promotor produjeron una expresión comparable con la expresión de los promotores de la HSA-1.7(5), la HSA-6(1)mCMV y HPrT(2)A1AT siendo las más altas. Estos resultados demuestran que son logrados altos niveles de expresión por medio de la combinación de múltiples copias de potenciadores específicos del hígado con diferentes elementos promotores.

Ejemplos 1. Construcciones de Plásmidos

El promotor de la alfa uno tripsina (-1200 a +44) fue amplificado por PCR con ADN polimerasa Vent (New England Bio Labs, Beverly, MA, Estados Unidos) a partir de un vector pBr 322 interno que contiene un fragmento genómico Sal I de 19 kb que incluye PI humano derivado del clon del fago \alphaNN (Dycaico y colaboradores, Science 242:1409-1412. 1988). El promotor fue luego clonado entre los sitios Hind III-EcoR I de pBluescript II SK+(Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos) para generar pBs A1AT. Se analizó la Secuencia utilizando un secuenciador automatizado Biosystems 377 de PE. El casete híbrido de alfa-galactosidasa de un vector interno fue clonado dentro del sitio Spe I de pBs A1AT para generar pBs A1AT HI AGAL. El casete de alfa-galactosidasa del intrón híbrido de alfa uno antitripsina fue luego subclonado dentro del vector lanzadera pAdQuick (antiguamente pAdvantage) Sv2 ICEU I para generar Sv2 A1AT HI AGAL.

Los elementos potenciadores específicos para el hígado humano de la albúmina 60 pb y 81 pb; (1,7 kb y 6 kb a partir del sitio de iniciación de la transcripción, respectivamente); protrombina 81 pb (-940 a -860); y Alfa-1 microglobulina/Bikunina 154 pb (-2806 a -2653) se obtuvieron a través de PCR del ADN genómico o a través de oligo síntesis. Se clonaron múltiples copias dentro de Bluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla CA, Estados Unidos). Estos elementos potenciadores fueron luego subclonados dentro de Sv2 A I AT HI AGAL a través de Cla 1-Stu 1, reduciendo al promotor de la alfa uno antitripsina a (-844 a +44) o subclonándolo dentro del vector interno Sv2 CMV HI AGAL II a través de Cla 1-SnaB 1, truncando al promotor del citomegalovirus de tipo silvestre a (-245 a -14).

2. Transfecciones Hep3 B

Se sembraron seis placas de pozos con células Hep3 B a razón de 2 x 10^{5} células por pozo. Se diluyeron 2,5 \mug de construcción de potenciador +2.5 ug CMV B (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos) en 1,5 ml de medio de suero opti-mem reducido (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Se diluyeron 20 \mul de lipofectamina 2000 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Estados Unidos) en 1,5 ml de medio de suero opti-mem reducido. Se mezclaron las dos soluciones y luego se las incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Mientras se formaban los complejos, se enjuagaron las células dos veces con medio de suero opti-mem reducido. Se incubaron las células con la solución lipídica (1,5 ml de solución por pozo) durante 3-4 horas a 37ºC en una incubadora de CO_{2} al 5%. Las células se enjuagaron una vez con 1xPBS y se reemplazó la solución lipídica con 2 ml de medio Mem que contenía piruvato de sodio 1 mM y 10% de Suero Fetal Bovino (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Estados Unidos).

3. Ensayo fluorescente de Alfa-galactosidasa

Se transfirieron cien microlitros de subrenadante de transfecciones de hepatoma a placas de 96 pozos (Corning de fondo plano). Se prepararon diluciones cinco veces hasta 1:125. Se diluyó la enzima alfa-galactosidasa A (Genzyme, Framingham, MA, Estados Unidos) dos veces desde 1250 uU/ml hasta 19.5 uU/ml para generar una curva estándar. Se añadió una solución de sustrato (1,69 mg/ml de 4-metilumbeliferil-a-D-galactosido y 26 mg/ml de N-acetil-D-galactosamina) en un amortiguador que contenía ácido cítrico 27 mM, fosfato dibásico de sodio 46 mM pH 4,4 a las muestras. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 3 horas. Se terminaron las reacciones con la adición de cincuenta microlitros de una solución de hidróxido de sodio uno molar. Se hicieron las lecturas con un Spectra Max Gemini (Molecular Devices Co. Sunnyvale, CA, Estados Unidos) con un filtro de excitación a 365 nm y un filtro de emisión a 450 nm. Se normalizó la actividad de la alfa-galactosidasa para la actividad de la \alpha-galactosidasa en lisados celulares de transfección utilizando un kit Galactolight Plus (Tropix, Bedford, MA, Estados Unidos). Todos los reactivos para el ensayo de la \alpha-galactosidasa se obtuvieron con Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos.

La invención ha sido descrita en detalle particularmente con referencia a las modalidades preferidas de la misma.

Claims (7)

1. Un vector recombinante que comprende dos copias de los potenciadores de protrombina humana operativamente enlazados al promotor de albúmina de suero humano.

2. Un vector recombinante que comprende dos copias de los potenciadores de protrombina humana operativamente enlazados a un promotor de la \alpha-1-antitripsina.

3. Un vector recombinante que comprende dos copias de los potenciadores de \alpha-1-microglobulina y un promotor de la \alpha-1-antitripsina.

4. Un vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende además una secuencia de codificación de interés.

5. Un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la secuencia de codificación es alfa-galactosidasa.

6. Un virus de ADN recombinante que comprende al vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un virus de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el virus de ADN es un virus adenoasociado o un adenovirus.