ES2211959T3

ES2211959T3 - Inmortalizacion y desinmortalizacion de celulas.

Info

Publication number: ES2211959T3
Application number: ES96918405T
Authority: ES
Inventors: David J. Anderson
Original assignee: California Institute of Technology CalTech
Current assignee: California Institute of Technology CalTech
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2004-07-16
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: JP3875267B2; DE69630955T2; AU700690B2; EP0832196A1; ATE255632T1; EP0832196B1; NO975557D0; CA2222425C; NO323174B1; US5629159A; AU6107796A; WO1996040877A1; JPH11507230A; DE69630955D1; CA2222425A1; NO975557L

Abstract

SE PROPORCIONAN METODOS Y COMPOSICIONES PARA LA INMORTALIZACION CONDICIONAL DE CELULAS.

Description

Inmortalización y desinmortalización de células.

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos y composiciones para la inmortalización y desinmortalización de células y, en particular, a los procedimientos que se aplican en terapia génica.

Antecedentes

La terapia génica, según la cual se añade ácido nucleico exógeno a una célula para corregir defectos genéticos o para tratar alteraciones, es un campo que está emergiendo rápidamente. Frecuentemente, la terapia génica utiliza células de pacientes como vehículo para el ácido nucleico exógeno; esto es, se pueden extraer las células de un paciente, manipularlas genéticamente y volverlas a introducir en el paciente. Véase, por ejemplo, la patente US Nº 5.399.346.

Un problema con esta aproximación es que las células extraídas tienen, generalmente, una duración limitada en cultivo, sin manipulación genética adicional. De esta manera, frecuentemente, las líneas celulares extraídas se transforman con un gen de inmortalización como un oncogén. Esto permite el crecimiento y proliferación indefinidas de las células. Sin embargo, las células inmortalizadas que contienen oncogenes no son candidatos apropiados para el transplante, debido a lo indeseable de introducir oncogenes en un paciente.

EP 0 808 364A, citable bajo el Art. 54(3) del CPE, describe vectores que incluyen por lo menos dos o más oncogenes.

De acuerdo con esto, es un objeto de la invención proporcionar procedimientos y composiciones para la creación de líneas celulares inmortalizadas que puedan crecer y perpetuar ex vivo y, después, inducir la desinmortalización, es decir, extraer los oncogenes, antes de la introducción en un paciente o animal.

Resumen de la invención

De acuerdo con los objetos anteriores, la invención proporciona una célula inmortalizada aislada que contiene puntos diana para recombinasas que flanquean un solo gen de inmortalización en el genoma de la célula. Los puntos diana son capaces de mediar la extracción del gen de inmortalización cuando los puntos diana se ponen en contacto con una recombinasa.

En un aspecto más, las células inmortalizadas comprenden ácido nucleico exógeno que comprende un gen marcador de selección, el cual puede ser un gen marcador de selección positivo o negativo. Las células pueden contener, también, un punto de parada y un gen marcador de selección adicional.

En un aspecto adicional, se proporcionan procedimientos para crear una célula inmortalizada que contiene puntos diana para recombinasas que flanquean un solo gen de inmortalización en el genoma de dicha célula inmortalizada. El procedimiento comprende transformar una célula con ácido nucleico exógeno que comprende a) un primer punto diana de recombinasa; b) un gen de inmortalización sencillo; y c) un segundo punto diana para recombinasa, de tal manera que en ausencia de una recombinasa dicho ácido nucleico exógeno se incorpora en el genoma de dicha célula. El ácido nucleico exógeno puede comprender, también, por lo menos un gen marcador de selección.

Otros procedimientos se proporcionan para la desinmortalización de una célula inmortalizada que contiene ácido nucleico exógeno que comprende puntos diana para recombinasas que flanquean un gen sencillo de inmortalización en el genoma de dicha célula inmortalizada. El procedimiento comprende poner en contacto dichos puntos diana para recombinasas con una recombinasa capaz de reconocer dichos puntos diana para recombinasas.

Un aspecto adicional de la invención proporciona procedimientos para la desinmortalización de una célula inmortalizada. El procedimiento comprende incorporar ácido nucleico exógeno que comprende un primer punto diana para recombinasas; un gen sencillo de inmortalización; un gen marcador de selección negativo; y un segundo punto diana para recombinasa. El ácido nucleico exógeno se incorpora en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada la cual contiene un gen de inmortalización eliminable en una orientación tal que la eliminación de la secuencia entre los puntos diana para recombinasas elimina el gen de inmortalización y el gen marcador de selección negativo. El procedimiento comprende, además, poner en contacto los puntos diana para recombinasas con una recombinasa que reconoce dichos puntos diana para recombinasa de tal manera que se extraiga dicho gen de inmortalización y dicho gen marcador de selección negativo. Las células que no han eliminado el gen de inmortalización y el gen de selección negativo se seleccionan otra vez mediante cultivo de las células en presencia de un agente de selección negativo apropiado.

Se proporcionan procedimientos adicionales para la desinmortalización de una célula inmortalizada. El procedimiento comprende incorporar ácido nucleico exógeno que comprende un primer punto diana para recombinasas; un gen de inmortalización sencillo; un gen marcador de selección positivo; y un segundo punto diana para recombinasa. El ácido nucleico se incorpora en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada que contenga un gen de inmortalización eliminable en una orientación tal que la eliminación de la secuencia entre los puntos diana para recombinasas elimina el gen de inmortalización, resultando en la expresión del marcador de selección. El procedimiento comprende, además, poner en contacto dichos puntos diana para recombinasas con una recombinasa que reconozca dichos puntos diana para recombinasas de tal manera que se elimine el gen de inmortalización. A continuación, las células se aíslan utilizando un agente de selección positivo. Se seleccionan en contra las células que no expresan el marcador de selección.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D describen el diseño de cuatro vectores para la inmortalización condicional. RTS es un punto diana para recombinasas. MPCS es un punto de clonación poliengarce múltiple, en el que se inserta un gen de inmortalización. PARADA es una secuencia de parada de la traducción o transcripción. LTR es una repetición terminal larga vírica. SV40 es el promotor procedente del SV40.

Las Figuras 2A, 2B, 2C, 2D y 2E describen realizaciones preferidas. La Figura 2(A) y 2(B) son dos diseños alternativos para el mismo vector básico. En ambos vectores, el gen de inmortalización (p.e. v-myc) se inserta en un punto de clonación múltiple poliengarce (MPCS) flanqueado de los RTS, es decir, puntos loxP o puntos FRT. Dirección cadena abajo de los MPCS existe una secuencia de "PARADA" tal como TGACTGACCTGA diseñada para evitar la traducción dirección cadena debajo de un marcador seleccionable (fosfatasa alcalina, marcadores de selección de fármacos, proteínas de superficie celular, proteína de fluorescencia verde, lacZ, etc). Existe, también, un marcador de selección de fármacos diferente para seleccionar la inmortalización inicial de las células, por ejemplo, histidinol, neomicina, higomicina, etc. El marcador de selección de fármaco es conducido por un LTR vírico y el oncogén mediante un promotor-intensificador interno (2A) tal como el intensificador de SV40 o viceversa (2B). La Figura 2C es el vector retmycgal utilizado en los Ejemplos; el gen de inmortalización utilizado fue v-myc, el segundo marcador seleccionable fue lacZ, y el primer marcador seleccionable fue el histinol. La Figura 2D es el vector rettknew.ap, en donde el gen de inmortalización era v-myc, el promotor interno era tk, el primer marcador seleccionable era neo y el segundo marcador seleccionable era la fosfatasa alcalina. La Figura 2E es el vector ret.INS.ap, en donde el gen de inmortalización era v-myc, el IRES en un punto de entrada interno del ribosoma, el primer marcador seleccionable era neo y el segundo marcador seleccionable era la fosfatasa alcalina.

Las Figuras 3A, 3B y 3C describen construcciones de inmortalización/desinmortalización que utilizan marcadores de selección negativos para asegurar que todas las células han sido desinmortalizadas. La Figura 3A utiliza el gen de inmortalización como marcador de selección para la transformación; alternativamente, el análisis clonal utilizando la exposición a un agente de selección negativo puede servir como marcador de la transformación. La Figura 3B utiliza un marcador de selección positivo como marcador de la transformación. Los genes marcadores de selección positivos y negativos se pueden localizar en cualquier orden. La Figura 3C añade una recombinasa bajo control de un promotor inducible; también se puede añadir un gen de selección positiva. Otra vez, estos genes se pueden localizar en cualquier orden. No se describen los promotores para la transcripción de genes diferentes de la recombinasa ya que estos se pueden localizar en una diversidad de sitios.

Las Figuras 4A y 4B describen la utilización de dos recombinasas y RTS diferentes. La Figura 4A permite la expresión del gen de inmortalización y un primer gen marcador de selección, con el segundo gen marcador de selección no expresado hasta el corte entre los dos RTS1. Una vez se escinde RTS 1, se expresa el segundo gen marcador de selección, permitiendo la selección de las células desinmortalizadas. Antes del transplante, la exposición a la recombinasa que reconoce RTS 2 corta el segundo marcador de selección, minimizándose, de esta manera, el ácido nucleico exógeno. La Figura 4B es similar, excepto en que se incluye un gen exógeno adicional que codifica, por ejemplo, un agente terapéutico. De esta manera, las células se pueden transplantar con el gen exógeno expresado, y algún tiempo después, se exponen las células a la segunda recombinasa para eliminar el gen exógeno.

La Figura 5 describe una construcción de inmortalización condicional que evita la utilización de un punto de PARADA colocando los RTS en medio del gen marcador de selección. Los RTS deben estar incluidos en los exones, para que en la eliminación quede uno de los RTS en el genoma. En la transformación de células con esta construcción, el gen de inmortalización y el primer gen marcador de selección se transcriben, utilizando un segundo promotor. Las células inmortalizadas se seleccionan, a continuación, basándose en el primer marcador de selección. Con la exposición a una recombinasa que reconozca los RTS, el gen de inmortalización y el primer marcador de selección se eliminan, junto con uno de los puntos RTS. El segundo marcador de selección se transcribe, siendo eliminado el segundo RTS como resultado de las señales de empalme de RNA que son reconocidas por la maquinaria celular de las células hospedadoras. Esto permite que el segundo gen marcador de selección sea transcrito.

Las Figuras 6A y 6B describen la utilización de un promotor inducible con el gen recombinasa. Las Figuras 6A y 6B corresponden a la construcción descrita en la Figura 1C, pero con un gen recombinasa bajo control de un promotor inducible. La Figura 6A describe una construcción que dejará el gen recombinasa en el genoma, después de la eliminación, y la Figura 6B describe una construcción que elimina el gen recombinasa.

Descripción detallada de la invención

La invención está dirigida a procedimientos y composiciones para la inmortalización condicional de células. Por "inmortalización condicional" se entiende en el presente documento un procedimiento mediante el cual las células se inmortalizan de tal manera que se pueden desinmortalizar algún tiempo después. De esta manera, bajo ciertas condiciones, las células se inmortalizan; bajo condiciones diferentes, tal y como se subraya más abajo, las células no se inmortalizan mucho más tiempo, vuelven a su patrón normal de senescencia y no crecen y ni proliferan indefinidamente mucho más tiempo en el cultivo celular.

Según es entendido por aquellos de la materia, por "inmortalizado" se entiende en el presente documento que las células se han transformado con un gen de inmortalización, de tal manera que la expresión del gen de inmortalización confiere la capacidad de crecer y proliferar sustancialmente de manera indefinida en el cultivo.

Por "gen de inmortalización" se entiende en el presente documento un gen que supera los mecanismos de senescencia de una célula, permitiendo a la célula que sea subcultivada, de manera sustancial, indefinidamente. Los genes de inmortalización son bien conocidos en la materia. El gen de inmortalización es, en general, exógeno a las células utilizadas y, generalmente, se integra en el genoma de la célula. Ejemplos de genes de inmortalización incluyen: (1) oncogenes nucleares tales como v-myc, N-myc, antígeno T y el oncogen del sarcoma de Ewing (Fredericksen et al., (1988) Neuron 1: 439-448; Bartlett, P. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3255-3259, y Snyder, E. Y. Et al., (1992) Cell 68: 33-51), (2) oncogenes citoplasmáticos tales como bcr-abl y la neurofibromina (Solomon, E., et al., (1991) Science 254: 1153-1160), (3) oncogenes de membrana tales como neu y ret (Aaronson, A.S.A. (1991) Science 254: 1153-1161), (4) mutaciones dominantes de genes supresores de tumores tales como el mutante p53 y el mutante Rb (retinoblastoma) (Weinberg, R.A. (1991) Science 254: 1138-1146) y (5) otros genes de inmortalización tales como el dominante negativo Notch (Coffman, C. R. et al., (1993) Cell 23: 659-671); (5) factores de crecimiento; (6) receptores de factores de crecimiento; y (7) genes de muerte anticelular tales como Bcl2. Los oncogenes particularmente preferidos incluyen el v-myc y el antígeno T de SV40.

Por "desinmortalización" se entiende en el presente documento un procedimiento mediante el cual todo o parte del gen de inmortalización de una célula inmortalizada se extrae, físicamente, del genoma de la célula, dejando que la célula vuelva a un ciclo de senescencia más normal, de tal manera que no crece ni prolifera indefinidamente más tiempo en el cultivo. Una célula desinmortalizada puede tener toda a parte de la construcción de inmortalización condicional extraída. De esta manera, como será apreciado por aquellos de la materia, junto con la descripción del presente documento, se puede preparar una diversidad de construcciones de inmortalización condicional, que resulta en diferentes cantidades de restos de ácido nucleico exógeno en el genoma de la célula. En una realización preferida, se elimina de una célula desinmortalizada todo el gen de inmortalización.

Los procedimientos de inmortalización y desinmortalización condicional de la invención se cumplen utilizando un sistema recombinasa específica de un punto. Muchos de estos sistemas son conocidos, incluyendo la recombinasa Cre procedente del bacteriófago P1, y la recombinasa FLP ("flip") procedente de Saccharomyces cerevisiae. El sistema Cre utiliza la recombinasa Cre, que es una proteína de 38 KDa, y dos puntos diana para recombinasa de 34 pares de bases (RTS), llamados loxP. Se puede dar la recombinación, directamente, entre los puntos loxP repetidos, de manera directa, en la misma molécula para eliminar el segmento de DNA que interviene. Véase Sauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5166 (1988); Sauer et al., Nuc. Acids Res. 17:147 (1989); Lakso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232; Hoess et al., J. Mol. Biol. 181:351-362 (1985); Abremski et al., Cell 32: 1301 (1983); Sternberg et al., J. Mol. Biol. 150: 467-486 (1981) y Orban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6861 (1992). El sistema FLP utiliza la proteína FLP y dos puntos diana de recombinación FLP (referidos FRT en la materia; indicados aquí como RTS) que consisten en dos repeticiones de 13 pares de bases invertidas y un espaciador de 8 pares de bases (véase, por ejemplo, O'Gorman, Science 251:1351 (1991); Jayaram, PNAS USA 82:5875-5879 (1985); Senecof et al., PNAS USA 82:7270 (1985); y Gronostajski et al., J. Biol. Chem. 260:12320 (1985)).

Por "punto diana para recombinasa" (RTS) se entiende en el presente documento una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una recombinasa para la eliminación de la secuencia que interviene. Se debe entender que se requieren dos RTS para la eliminación. De esta manera, cuando se utiliza la recombinasa cre, cada RTS comprende un punto loxP; cuando los puntos loxP son utilizados, la correspondiente recombinasa es la recombinasa cre. Es decir, la recombinasa debe corresponder a o reconocer los RTS. Cuando se utiliza la recombinasa FLP, cada RTS comprende un punto diana de recombinación FLP (FRT); cuando se utilizan puntos FRT, la recombinasa correspondiente es la recombinasa FLP.

Utilizando estos sistemas recombinasas, se pueden extraer los genes de inmortalización insertados en una célula hospedadora, una vez se han expuesto a la recombinasa adecuada. De esta manera, las construcciones de inmortalización condicional se insertan en una célula, en una orientación que resulte en la expresión del gen de inmortalización. Para todas las realizaciones, las células hospedadoras no deben expresar ácido nucleico, y, preferiblemente, no contienen ácido nucleico codificante de la recombinasa adecuada antes de la adición del ácido nucleico exógeno de la invención. Algún tiempo después, la recombinasa se expresa y contacta con los puntos diana para recombinasa, extrayendo el gen que interviene en la inmortalización.

Preferiblemente, se utilizan los genes marcadores de selección para detectar o seleccionar la inmortalización y desinmortalización exitosa. Por ejemplo, la expresión de un primer marcador de selección permite la detección de inmortalización exitosa; es decir, el gen marcador se expresa cuando los genes de inmortalización se han integrado en el genoma de la célula. La expresión de un segundo marcador de selección, preferiblemente diferente del primer gen marcador de selección, indica la extracción del gen de inmortalización, tal y como se describe con más detalle posteriormente. Estos marcadores de selección pueden ser marcadores de selección positivos o negativos. Como es bien conocido en la materia, "gen marcador de selección" o equivalentes significa genes que permiten la selección o detección de células que contienen el gen. "Selección positiva" se refiere a un procedimiento mediante el cual sólo las células que contengan el marcador de selección positivo sobrevivirán a la exposición del agente de selección positivo o serán marcadas o detectadas. Por ejemplo, la resistencia a un fármaco es un marcador de selección positivo común; las células que contengan el gen de resistencia a un fármaco crecerán en un medio que contenga el fármaco, y aquellas células que no contengan el gen de resistencia a fármaco morirán. Genes de resistencia a fármacos adecuados son la histidinol deshidrogenasa, resistencia a neomicina, resistencia a higromicina, y resistencia a puromicina, entre otros. Otros genes marcadores de selección positivos incluyen los genes que permiten la clasificación o el cribado de células. Estos genes incluyen el gen de la fosfatasa alcalina, el gen de la proteína fluorescente verde, el gen de lacZ, y marcadores de superficie como CD8, entre otros. En una realización, según se describe más abajo, el gen de inmortalización por sí mismo puede servir como marcador de selección positivo.

En una realización adicional, se utilizan marcadores de selección negativos. "Selección negativa" se refiere a un procedimiento mediante el cual las células transfectadas con un marcador de selección negativo serán matadas al exponerse a un agente de selección negativo adecuado que mate las células que contengan el marcador de selección negativo. Por ejemplo, las células que contienen el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simples (HSV-tk) son sensibles al ganciclovir (GANC®). De manera similar, el gen de Gpt da lugar a células sensibles a la 6-tioxantina. Cuando se posiciona, de manera adecuada, en una construcción de inmortalización condicional, el gen marcador de selección negativa se puede utilizar para aislar células que se han desinmortalizado. Esto es, el marcador de selección negativa se expresa con el gen de inmortalización, de tal manera que si el gen de inmortalización todavía está presente, las células serán matadas.

Generalmente, los vectores y técnicas de inmortalización-desinmortalización condicionales proceden como sigue. Las construcciones genéticas utilizadas para la inmortalización se establecen de tal manera que una primera transformación con ácido nucleico exógeno resulta en la inmortalización. Las células se pueden hacer crecer y propagar, y se pueden añadir otros genes, como se ha subrayado más arriba. En algunos casos, cuando las células son células madre, las células inmortalizadas se pueden diferenciar, si se desea. A continuación, antes del transplante o algún tiempo después, las células se manipulan de tal manera que el gen de inmortalización se elimina; es decir, las células se desinmortalizan.

En una realización preferida, el vector de clonación, que introduce el gen de inmortalización en las células, se construye de tal manera que el gen de inmortalización, cualquiera de los marcadores de selección, promotores y RTS se integran en el genoma simultáneamente. Esto es, no es necesaria la integración de DNA adicional en el genoma para que facilite la desinmortalización. De manera alternativa, el gen de inmortalización se puede introducir en el genoma con secuencias flanqueantes suficientes que permita la construcción de vectores de recombinación homólogos para introducir secuencias adicionales requeridas.

En una realización preferida, la desinmortalización sucede como resultado de una introducción de ácido nucleico exógeno adicional que codifica la recombinasa en la célula, como se subraya más abajo.

En una realización, la invención proporciona líneas de células inmortalizadas de manera condicional. Estas líneas de células inmortalizadas contienen un ácido nucleico que comprende una variedad de construcciones de inmortalización condicionales diferentes como se indica más abajo. Estas líneas de células inmortalizadas se pueden preparar mediante la transformación de por lo menos una célula con un ácido nucleico que comprenda las construcciones de la invención.

Estas líneas de células inmortalizadas, de manera condicional, se pueden utilizar en una variedad de procedimientos para la desinmortalización, como se indica más abajo.

En otra realización, las líneas celulares contienen un ácido nucleico que comprende puntos diana para recombinasa que flanquean un gen de inmortalización en el genoma de las células de las líneas celulares. Estos puntos diana deben estar orientados de manera que los RTS sean capaces de mediar en la eliminación del gen de inmortalización cuando los RTS se ponen en contacto con una recombinasa. Esto es, en ausencia de la recombinasa que reconozca los RTS, el gen de inmortalización se incorpora en el genoma de la célula y se expresa, para crear una línea de células inmortalizadas. Cuando los RTS se exponen a la recombinasa correspondiente, tiene lugar la eliminación de la secuencia entre los RTS. Puesto que esta secuencia contiene el gen de inmortalización, el acontecimiento de eliminación resulta en una pérdida del gen, es decir, la desinmortalización.

En una realización más, la invención proporciona líneas de células inmortalizadas que contienen un ácido nucleico que comprende un primer punto diana para recombinasa, un gen de inmortalización, un gen marcador de selección negativa, y un segundo punto diana para recombinasa, según se describe, de manera general, en la Figura 3A. Como antes, en ausencia de la recombinasa que reconozca los RTS, el gen de inmortalización se incorpora en el genoma de la célula y se expresa, para crear una línea de células inmortalizadas. Los RTS son capaces de mediar en la eliminación del gen de inmortalización cuando los RTS se ponen en contacto con una recombinasa. En una realización preferida, los genes de inmortalización y marcador de selección negativa están flanqueados por los RTS. De esta manera, en la transformación, el gen de inmortalización y marcador de selección negativa se expresan y las células transformadas se pueden seleccionar en base a la inmortalización o expresión del marcador de selección negativa. De la exposición o puesta en contacto con una recombinasa que reconozca los RTS, el gen de inmortalización y el marcador de selección negativa se eliminan, y las células desinmortalizadas se pueden seleccionar por exposición a un agente de selección negativa. Esto es, las células desinmortalizadas sobrevivirán y, aquellas que todavía contengan el gen de inmortalización y el gen marcador de selección negativa morirán.

En una realización adicional, la invención proporciona líneas de células inmortalizadas que contienen un ácido nucleico que comprende un primer punto diana para recombinasa, un gen de inmortalización, un gen marcador de selección y un segundo punto diana para recombinasa. Como antes, en ausencia de la recombinasa que reconozca los RTS, el gen de inmortalización se incorpora en el genoma de la célula y se expresa, para crear una línea de células inmortalizadas. Los RTS son capaces de mediar en la eliminación del gen de inmortalización cuando los RTS se ponen en contacto con la recombinasa. En una realización, la orientación de la construcción es preferiblemente de tal manera que en ausencia de una recombinasa, el gen de inmortalización se expresa pero no el gen marcador de selección. Esto se realiza, preferiblemente, mediante la adición de un punto de parada a la construcción, tal como la mostrada en las Figuras 1 y 4, aunque como se describe en la Figura 5, también se puede realizar teniendo uno de los RTS en medio del gen marcador de selección, dentro de los intrones. En la exposición a una recombinasa que reconozca los RTS, la secuencia que interviene se elimina, resultando en una pérdida del gen de inmortalización y la expresión del gen marcador de selección, permitiendo, de esta manera, la selección de las células desinmortalizadas. Alternativamente, la orientación de la construcción es tal que en la transformación, se expresan el gen de inmortalización y el gen de selección, permitiendo, de esta manera, la selección de inmortalización. En la exposición de una recombinasa que reconozca los RTS, el gen de inmortalización y el gen de selección se eliminan, y las células resultantes se pueden seleccionar por la desinmortalización mediante la pérdida del gen de selección.

En una realización más, la invención proporciona líneas de células inmortalizadas que contienen un ácido nucleico que comprende un primer punto diana para recombinasa, un gen de inmortalización, un primer gen marcador de selección, un segundo punto diana para recombinasa y un segundo gen marcador de selección. En esta realización, la orientación de la construcción es tal que en la transformación, el gen de inmortalización y el primer gen marcador de selección se expresan, y el segundo gen marcador de selección no. Esto se cumple preferiblemente mediante la adición de un punto de parada a la construcción, aunque como antes, se puede realizar mediante vías alternativas. En la exposición o contacto con una recombinasa que reconozca los RTS, el gen de inmortalización y el primer gen marcador de selección se eliminan y el segundo gen marcador de selección se expresa. Esto permite la selección de células desinmortalizadas en base al segundo gen marcador de selección.

Varias realizaciones específicas se muestran en las Figuras, las cuales utilizan un vector de clonación retrovírico preferido con los sistemas recombinasa Cre/loxP o FLP/FRT. Aquellos expertos en la materia reconocerán que una diversidad de construcciones resultará en la creación de células inmortalizadas, las cuales se pueden desinmortalizar, a continuación, de las que se muestran en las Figuras solo unas pocas.

En una realización preferida, las construcciones de inmortalización condicional son como se describen en las Figuras 1 y 2. Primero, se construye un vector de clonación que contiene: un primer marcador de seleccionable con un primer promotor; un segundo promotor; un punto de clonación múltiple poliengarce (MPCS) flanqueado por puntos diana para recombinasa (RTS); y un segundo marcador seleccionable. El gen de inmortalización, generalmente un oncogén, se inserta en los MPCS, junto con una secuencia de parada opcional que evita la expresión del segundo marcador seleccionable. Las secuencias de parada como TGACTGACCTGA son conocidas en la materia. De esta manera, en ausencia de una recombinasa, el gen de inmortalización se expresa utilizando el segundo promotor y el primer marcador seleccionable se expresa utilizando el primer promotor. Esto permite la selección de células inmortalizadas, transformadas, pero la secuencia de parada evita la expresión del segundo marcador. De esta manera, las células inmortalizadas se pueden clonar y hacer crecer, y se pueden añadir genes si se desea. Para la desinmortalización, se lleva a cabo la expresión (preferiblemente temporal) de la recombinasa adecuada, utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Esto resulta en la eliminación de los puntos diana para recombinasa, los MPCS que contiene el gen de inmortalización, y la secuencia de parada. De esta manera, el segundo gen marcador seleccionable se expresa ahora y las células desinmortalizadas se pueden seleccionar en base a este gen marcador.

En la Figura 1A, el primer marcador seleccionable se traduce mediante el primer promotor (o alternativamente a partir del promotor interno al LTR) y el gen de inmortalización insertado en el MPCS se lleva mediante el segundo promotor. En ausencia de una recombinasa, la secuencia de parada evita la traducción del segundo marcador seleccionable. En la exposición a la recombinasa, el gen de inmortalización y la secuencia de parada se eliminan, permitiendo el segundo marcador seleccionable dejar salir el segundo promotor. En la Figura 1B, la traducción del gen de inmortalización se lleva mediante el promotor LTR interno, el primer marcador seleccionable se traduce mediante el promotor de SV40 o equivalentes, pero la secuencia de parada previene la traducción del segundo marcador seleccionable. En la exposición a la recombinasa, el gen de inmortalización y la secuencia de parada se eliminan, permitiendo la traducción del segundo marcador seleccionable. En la Figura 1C, el primer marcador seleccionable y el gen de inmortalización se traducen, ya sea mediante un primer promotor o mediante el promotor de LTR, pero la secuencia de parada previene la traducción del segundo marcador seleccionable. En la exposición a la recombinasa, el gen de inmortalización y la secuencia de parada se eliminan, permitiendo la traducción del segundo marcador seleccionable a través del promotor o del LTR. En la Figura 1D, la traducción de la proteína fluorescente verde y el gen de inmortalización sucede mediante el promotor LTR (u otro promotor). La proteína fluorescente verde sirve como marcador de selección. En la exposición a la recombinasa, el gen de inmortalización y la secuencia que codifica la proteína fluorescente verde se eliminan. De esta manera, las células se pueden seleccionar primero por la presencia de la proteína fluorescente verde y, a continuación, por su ausencia.

Los RTS se exponen a o se ponen en contacto con una recombinasa de cualquier número de maneras. Por "exponen a" o "ponen en contacto con una recombinasa que reconoce los RTS" se entiende en el presente documento que la proteína recombinasa debe interaccionar con los RTS de manera que permita la eliminación de la secuencia entre los RTS. Generalmente, todo lo que se requiere es que la proteína recombinasa esté presente dentro de la célula que contenga los RTS. Esto se puede realizar mediante la expresión del gen que codifica la recombinasa en las células que contienen la construcción de inmortalización condicional, como se subraya más abajo.

En una realización preferida, la expresión de la recombinasa es temporal, ya que, así, la recombinación específica en un punto es rápida y eficiente, en general. La expresión temporal se consigue mediante diversos procedimientos bien conocidos en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, transfección de un plásmido de DNA mediante precipitación con fosfato de calcio, electroporación, lipofección u otros procedimientos físico-químicos, transducción utilizando un vector retrovírico o la expresión a partir de otro vector vírico recombinante como un adenovirus. La expresión adenovírica es particularmente preferida puesto que son comunes las elevadas eficacias en la expresión.

En una realización alternativa, el gen que codifica la recombinasa se coloca bajo control de un promotor inducible y es parte de la construcción de inmortalización/desinmortalización. Generalmente, se puede incluir en cualquiera de las realizaciones descritas en las Figuras un promotor inducible unido operativamente al gen de la recombinasa. Las construcciones de este tipo se describen de manera general en las Figuras 6 y 3C. La Figura 6A corresponde a la Figura 1C con un promotor inducible/gen de recombinasa añadido, el cual abandonará el genoma. La Figura 6B corresponde a la Figura 1C cuando la recombinasa sea eliminada. Puesto que solo es necesaria una pequeña cantidad de la recombinasa para que tenga lugar la eliminación de las secuencias entre los RTS, es deseable utilizar promotores fuertemente regulados para evitar acontecimientos de recombinación prematuros. Las señales de parada de la transcripción que flanquean la recombinasa también son deseables. La recombinación y la eliminación del gen de inmortalización, y preferiblemente del gen de la recombinasa, sucede así cuando se administran las condiciones de inducción adecuadas.

En una realización preferida, se utilizan marcadores de selección negativos, o una combinación de marcadores de selección positivos y negativos. Los marcadores de selección negativos son particularmente útiles en prevenir que las células inmortalizadas sean transplantadas. Por ejemplo, los marcadores de selección negativos se pueden expresar junto con el gen de inmortalización. Después de la desinmortalización, las células se exponen al agente de selección negativo, como GANC, que mata cualquiera de las células que todavía contenga el gen HSV-tk que está próximamente unido a un gen de inmortalización. Ejemplos concretos se muestran en la Figura 3. En la Figura 3A, los RTS flanquean un gen de inmortalización y un gen de selección negativo. Según se ha descrito más arriba, el gen de inmortalización sirve como primer marcador de selección. Alternativamente, las colonias clonales que contienen el gen de selección negativo se pueden identificar utilizando un marcador de selección negativo; esto es, se utilizan colonias clonales para identificar colonias originales que contengan el gen de selección negativa. El(los)

\hbox{promotor(es)}

utilizados para llevar la expresión de los genes de inmortalización y de selección negativa se pueden localizar en cualquiera de los lados del primer RTS. Cuando se pone en contacto con una recombinasa, el gen de inmortalización y el gen de inmortalización se eliminan y la célula se desinmortaliza. Cualquiera de las células inmortalizadas que quede se puede matar exponiendo las células desinmortalizadas, de manera putativa, al agente de selección negativo; en el caso del gen de timidina quinasa del virus del herpes simples, por ejemplo, las células se pueden exponer a GANC. Esto reduce y elimina, de manera potencial, las células inmortalizadas restantes, lo cual es deseable cuando se utilizan células para transplante. Esta construcción es particularmente preferida puesto que resulta en una muy poca cantidad, sino ninguna, de ácido nucleico exógeno restante en el genoma de la célula, lo cual también es deseable para el transplante. En la Figura 3B existe un gen de selección positiva incluido en la construcción para seleccionar las células inmortalizadas. En la Figura 3C, el sistema es similar a la Figura 3A excepto en que se incluye la recombinasa bajo control de un promotor inducible, eliminando la necesidad de más manipulación

\hbox{genética.}

En una realización preferida, los puntos de parada se utilizan para prevenir la traducción de los marcadores de selección antes de la desinmortalización, como se ha indicado de manera general más arriba para una diversidad de construcciones. Alternativamente, según se indica en la Figura 5, es posible prevenir la expresión de los marcadores de selección funcionales poniendo los RTS en medio de los genes marcadores de selección. Este procedimiento se basa en la fiel eliminación de uno de los RTS mediante la recombinasa y el otro mediante un procesamiento de mRNA, ya que cualquier nucleótido que quede resultará muy probablemente en mutaciones en el en el desplazamiento del marco de lectura y, de esta manera, en un marcador de selección no funcional.

En una realización adicional, se utiliza más de un conjunto de RTS. Esto se puede hacer utilizando juegos de RTS adicionales que sean reconocidos por la misma recombinasa o, alternativamente, utilizando RTS que sean reconocidos por una recombinasa diferente.

Cuando se utilizan juegos adicionales de RTS para la misma recombinasa, se debería de tener cuidado en el diseño de las construcciones de tal manera que el corte entre dos RTS cualesquiera dé un resultado deseable o medible. Esto es, puesto que el corte puede darse entre dos RTS cualesquiera, es posible que un solo RTS, con ácido nucleico exógeno flanqueando sea dejado dentro del genoma.

En una realización preferida, se utilizan juegos de RTS procedentes de diferentes recombinasas. Esto puede ser de particular utilización cuando se introducen en el genoma genes exógenos. Por ejemplo, utilizando la construcción descrita en la Figura 4A, se seleccionan las células inmortalizadas utilizando el primer marcador de selección. Para la desinmortalización, se utiliza la recombinasa que reconoce los puntos RTS 1 y las células desinmortalizadas se seleccionan utilizando el segundo marcador de selección. El segundo gen de selección se puede transcribir utilizando el primer promotor, en cuyo caso sólo se activará en la desinmortalización, o su propio promotor, que permite la transcripción durante los estados inmortalizado y desinmortalizado. Se transplantan las células desinmortalizadas que expresan la proteína exógena. Algún tiempo más tarde, por ejemplo cuando el producto del gen exógeno no se requiere más, la exposición a la segunda recombinasa resulta en la eliminación del segundo marcador de selección y del gen exógeno. De manera alternativa, el gen exógeno sólo se puede requerir ex vivo, en cuyo caso la segunda recombinasa se puede utilizar antes del transplante. Como para las otras construcciones descritas aquí, aquellos expertos en la materia serán capaces de construir una variedad de construcciones funcionales similares utilizando las enseñanzas del presente documento.

En una realización adicional, se utilizan dos recombinasas para eliminar prácticamente todo el ácido nucleico exógeno antes del transplante. Por ejemplo, utilizando la construcción mostrada en la Figura 4B, se seleccionan las células inmortalizadas utilizando el primer marcador de selección. Para la desinmortalización, la recombinasa que corresponda a los puntos RTS 1 se pone en contacto con la construcción, y las células se seleccionan en base al segundo marcador de selección que se transcribe a partir del primer promotor. Las células se pueden en poner en contacto, a continuación, con una segunda recombinasa que reconoce los puntos RTS 2 antes del transplante, para eliminar todo excepto un único punto RTS. Aunque el acontecimiento de eliminación es muy eficaz, se puede utilizar para la selección una pérdida del marcador de selección, utilizando colonias clonales.

En una realización, el acontecimiento de recombinación elimina el primer marcador seleccionable. Esto se puede preferir en situaciones en las que las células desinmortalizadas son para ser transplantadas y, de esta manera, sea deseable minimizar la introducción de genes exógenos en un paciente.

En una realización preferida, el primer marcador seleccionable es un gen resistente a un fármaco como el la histidinol deshidrogenasa, resistencia a neomicina, resistencia a higromicina y resistencia a puromicina, entre otros. En esta realización, el segundo marcador detectable es un gen que permitirá la clasificación y cribado de células, y puede incluir el gen de la fosfatasa alcalina, el gen para la proteína fluorescente verde, el gen de lacZ, marcadores de superficie como CD8 o cualquier otro de los genes subrayados para el primer marcador seleccionable, mientras los marcadores de selección primero y segundo sean diferentes genes dentro de cualquier célula única. En algunas realizaciones, la frecuencia de transformación puede ser tan elevada que se pueda eliminar ya sea el primer o el segundo marcador seleccionable, aunque, en general, es preferible que retenga por lo menos el segundo marcador seleccionable si las células inmortalizadas se destinan al transplante, ya que es deseable asegurar que las células que contengan el oncogén no sean transplantadas en un mamífero. En una realización, se utiliza un único marcador de selección, por ejemplo un marcador como la proteína fluorescente verde que permite la clasificación de las células. En esta realización, el marcador se expresa cuando se introduce el gen de inmortalización y se separan las células transformadas de las células no transformadas mediante clasificación celular. En la desinmortalización, el gen marcador se elimina y las células se vuelven a clasificar con las células desinmortalizadas que carecen del marcador.

En una realización más, las células inmortalizadas se seleccionan en base al fenotipo. Por ejemplo, el gen de inmortalización puede servir como primer marcador detectable, ya que las células que no contengan el gen no crecerán indefinidamente en el cultivo y se pueden eliminar en base a esto. Alternativamente, los marcadores se pueden detectar utilizando análisis clonal; por ejemplo, cuando se utiliza el gen HSV-TK, se pueden analizar los clones por la actividad TK.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "célula manipulada genéticamente" o "célula recombinante" se refiere a una célula dentro de la cual se ha introducido ácido nucleico extraño (es decir, que no se encuentra de manera natural), p.e. DNA. Por ácido nucleico "extraño" o "heterólogo" o "exógeno" se entiende en el presente documento un ácido nucleico que no se une habitualmente al genoma de la célula, o está en una forma que no se encuentra de manera natural en el genoma. De esta manera, los genes de inmortalización tales como los oncogenes o puntos diana para recombinasa no se pueden encontrar de manera natural en el genoma de la célula hospedadora y, de esta manera, las células inmortalizadas que contengan estas secuencias están manipuladas genéticamente. En algunas realizaciones, las células inmortalizadas de manera condicional se manipulan para que expresen uno o más genes adicionales. Dichos genes pueden estar contenidos, habitualmente, dentro del genoma, es decir, homólogo, pero que no se exprese en una extensión apreciable, o son heterólogos, es decir, que habitualmente no se encuentran dentro del genoma. Por ejemplo, los genes homólogos del factor de crecimiento se pueden introducir en una célula en una forma no frecuente dentro del genoma; es decir, secuencias reguladoras como promotores que permitan la expresión del factor de crecimiento en niveles que normalmente no se han visto en la célula, o dentro de tipos celulares que normalmente no expresan el factor de crecimiento. Alternativamente, se pueden introducir genes heterólogos. De esta manera, las células inmortalizadas de manera condicional de la invención, se pueden manipular genéticamente para que contengan más de una secuencia de ácido nucleico exógeno.

Las construcciones de inmortalización condicionales y el procedimiento de la invención pueden contener, también, genes exógenos adicionales que sean terapéuticamente beneficiosos. Por ejemplo, se pueden introducir genes que codifiquen factores de crecimiento para facilitar la supervivencia de las células transplantadas o para el tratamiento del paciente. Por ejemplo, se pueden utilizar las neurotrofinas, que incluyen el factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotrofina-3 (NT3), neurotrofina-4 (NT4) y factor neurotrofina derivado de cerebro (BDNF). En el caso en el que se utilicen células diferentes de las células neurales, genes exógenos apropiados incluyen aquellos que codifiquen factores de crecimiento, como el factor de crecimiento humano, factor de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento neurales, etc; citoquinas; enzimas e inhibidores enzimáticos; interferones como los interferones \alpha, \beta o \gamma; factores de coagulación (Factor VIII); ADA; genes de muerte anticelular; y otras proteínas.

De esta manera, por ejemplo, se pueden inmortalizar las células para manipulaciones ex vivo tales como la introducción de DNA extraño que codifique agentes terapéuticos, y, a continuación, desinmortalizarlas, permitiendo la introducción en un paciente de las células manipuladas genéticamente, las cuales expresan un agente terapéutico. Alternativamente, las células por sí mismas son agentes terapéuticos y se transplantan para reemplazar células alteradas o que mueren, p.e., en la enfermedad de Parkinson.

En una realización, se extraen las células de un paciente con un defecto genético y se manipulan para que contengan por lo menos una copia de un gen corregido antes de volver a introducir las células utilizando las técnicas de la invención. Las alteraciones genéticas que se pueden tratar de esta manera son conocidas en la materia.

Además del gen de inmortalización, las células de la invención tienen ácido nucleico exógeno adicional, como se describe de manera más completa posteriormente. Este ácido nucleico exógeno incluye por lo menos dos puntos diana para recombinasa y, preferiblemente, genes (marcadores) de selección, puntos de finalización de la transcripción, secuencias engarce y otros genes de interés según se ha descrito más arriba.

El ácido nucleico extraño o el ácido nucleico exógeno se puede introducir mediante una variedad de técnicas conocidas en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE, microinyección, transformación retrovírica, transformación adenovírica, transformación de herpes vírico, fusión de protoplasto y lipofección.

En una realización preferida, el DNA extraño se introduce en las células utilizando la técnica de la transfección retrovírica. Los retrovirus recombinantes se utilizan para introducir genes de inmortalización, genes de selección o marcadores, puntos diana para recombinasa y recombinasas. Los retrovirus recombinantes se producen en líneas celulares de empaquetamiento para producir sobrenadantes del cultivo que tengan una titulación de partículas víricas (generalmente de 10^{5} a 10^{6} pfu/mL). Las partículas víricas recombinantes se utilizan para infectar cultivos de células o de su progenie mediante incubación de los cultivos celulares en un medio que contiene las partículas víricas, tal y como se conoce en la materia. Después de la infección retrovírica, las células se lavan y se cultivan en un medio estándar. Las células infectadas se analizan, a continuación, por la respuesta y expresión del DNA extraño. Las células se pueden someter a condiciones selectivas que seleccionen las células que hayan tomado y expresado un gen marcador seleccionable.

En una realización preferida, el vector de clonación es un vector retrovírico, y utiliza repeticiones terminales largas (LTR) según se muestra en las Figuras. Realizaciones alternativas utilizan plásmidos de expresión tradicionales, vectores basados en virus del herpes y vectores basados en adenovirus, así como otros equivalentes bien conocidos por los expertos en la materia.

En otra realización, el DNA extraño se introduce utilizando la técnica de la transfección mediada con fosfato de calcio según se conoce en la materia. Por ejemplo, se prepara un precipitado en fosfato de calcio que contenga las construcciones de inmortalización condicional de la invención utilizando la técnica de Wigler et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373-1376. Los cultivos de células se colocan en placas de cultivos tisulares. Veinticuatro horas de colocar las células en placas, se añade el precipitado de fosfato de calcio que contiene, aproximadamente, 20 \mug/ml de DNA extraño. Las células se incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añade el medio de cultivo tisular que contiene cloroquina 30 \muM y las células se incuban durante toda la noche a 37ºC.

Después de la transfección, se analizan las células por la incorporación y expresión del DNA extraño. Las células se pueden someter a condiciones de selección que seleccionen las células que han incorporado y expresado un gen marcador seleccionable.

Las técnicas anteriores se pueden ejecutar más de una vez en una determinada célula; por ejemplo, estas técnicas se pueden utilizar para introducir el gen de inmortalización con puntos para recombinasa, y, a continuación, introducir ácido nucleico exógeno adicional a las células inmortalizadas, tal como cualquier plásmido de expresión que codifique una

\hbox{recombinasa.}

Como será apreciado por los de la materia, en la invención se pueden utilizar una amplia variedad de promotores adecuados. Los promotores particularmente útiles incluyen, pero no se limitan a, el potenciador del promotor interno de LTR de retrovirus, el promotor de SV40, promotores específicos de tipo celular o tisular, promotores especialmente específicos del tipo celular que no sean para la inmortalización de manera condicional.

Células adecuadas que se puedan utilizar para practicar los procedimientos de inmortalización condicional incluyen cualquier tipo celular que no produzca una recombinasa que reconozca la secuencia diana para recombinasa utilizada en las construcciones de la invención. Preferiblemente, las células se dividen de tal manera que sean capaces de ser infectadas por un vector retrovírico. Las células adecuadas son células de vertebrados, preferiblemente células de mamífero tales como las de primate, ovina, porcina, bovina, canina, felina y equina, por ejemplo, y, más preferiblemente, células humanas. Las células particularmente preferidas son todos los tipos de células madre como las células madre neurales, hematopoyéticas, pancreáticas, hepáticas, epidérmicas, intestinales, osteogénicas y olfatorias, siendo las células madre particularmente preferidas las células madre de la cresta neural y células madre hematopoyéticas. Células no madre adecuadas incluyen las células de islotes pancreáticos, fibroblastos, osteoclastos, osteoblastos, células dérmicas y epidérmicas, y células endoteliales, hepatocitos, eritroblastos, miocitos esqueléticos, miocitos lisos, miocitos cardíacos, melanocitos, linfocitos (B y T), células mieloides y células glial.

En una realización preferida, el fenotipo, crecimiento y duración de una célula desinmortalizada es el mismo que el de las células de partida en ausencia de cualquier manipulación genética; es decir, una célula desinmortalizada es idéntica a las células de partida, antes de la inmortalización. En realizaciones diferentes, las células pueden tener características alteradas.

Se debería reconocer que en algunos casos, las células de partida tienen una duración extensa in vivo; es decir, pueden existir en el animal hospedador, pero son incapaces de crecer de manera indefinida ex vivo. De esta manera, por ejemplo, las células de islotes parecen durar una vida en humanos. Todavía, las células de islotes pueden requerir, la inmortalización para el crecimiento y proliferación ex vivo en un cultivo celular. De manera similar, las células madre como las células madre neurales pueden durar un periodo de tiempo extenso y son capaces de una renovación propia limitada in vitro, pero se deben de inmortalizar con un gen de inmortalización para el crecimiento y proliferación indefinidos en un cultivo celular. La expansión indefinida de las células inmortalizadas puede permitir la generación de "líneas celulares donadoras universales" para el tratamiento de múltiples pacientes.

Se debe entender que a menos que esté sometido a nuevas condiciones de cultivo, la división celular de una célula inmortalizada resulta en dos células hija sustancialmente idénticas; esto es, células inmortalizadas por definición capaces de regenerarse de manera indefinida. De esta manera, por ejemplo, la división celular de células madre inmortalizadas como las células madre de la cresta neural resulta en dos células madre de la cresta neural, ambas igualmente no diferenciadas. Ante la exposición a ciertas condiciones experimentales o fisiológicas, estas células madre llegarán a la diferenciación parcial o completa.

Como es entendido por aquellos expertos en la materia, las condiciones del cultivo adecuadas para las líneas celulares inmortalizadas variarán dependiendo del tipo celular.

Los procedimientos de inmortalización condicional de la invención encuentran uso en numerosas aplicaciones, como será apreciado por aquellos expertos en la materia.

En una realización, las células inmortalizadas de manera condicional son células madre y, en una realización preferida, las células madre son células madre de la cresta neural y células madre neurales multipotenciales como se describe en WO 94/02593. Como será apreciado por los expertos en la materia, las células madre neurales, las cuales llevan a la formación de la glia y neuronas del sistema nervioso central y periférico, se pueden transplantar o implantar para formar nuevas neuronas y glias. Por ejemplo, la sustitución de neuronas motoras y sus células glia asociadas en el cordón espinal para una herida traumática aguda motora o la sustitución de neuronas dopaminérgicas que mueren en el cerebro medio para el tratamiento de la enfermedad del Parkinson, son ambas áreas activas que están siendo buscadas en estudios preclínicos. Una segunda aplicación del transplante de células inmortalizadas manipuladas genéticamente es para terapia génica; las células se pueden manipular genéticamente antes del transplante con el fin de que se exprese un producto de un gen perdido y, a continuación, el transplante de estas células en la región concreta del cerebro liberará el producto del gen en el área del cuerpo donde sea necesario. Prueba del principio de dichas aproximaciones de terapia génica se han demostrado recientemente en modelos animales que utilizan como sistema de ensayo la mucopolisacaridosis hereditaria.

En una realización alternativa, las células diferentes de las células madre se pueden inmortalizar para el crecimiento ex vivo y, a continuación, desinmortalizarlas antes de volverlas a introducir en el cuerpo. Por ejemplo, la patente US Nº 5.387.237 describe un páncreas bioartificial que comprende un cilindro de plástico rellenado con células de islotes pancreáticos. Estas células de islotes pancreáticos se pueden inmortalizar para el crecimiento y proliferación ex vivo, dejando una uniformidad durante todo el tiempo y, a continuación, se desinmortalizan antes de la introducción en el cuerpo. Aquellos expertos en la materia apreciarán que cualquier variedad de dichos sistemas se podría utilizar en la presente invención.

Por ejemplo, estos procedimientos se pueden utilizar en cualquiera de las terapias génicas ex vivo, tal y como se describen, de manera general, en la patente US Nº 5.299.346. De esta manera, cualquier de las células a ser transplantada en un paciente, ya sea humano o animal, se puede someter a los procedimientos de inmortalización condicionales, con la consiguiente desinmortalización antes del transplante. En una realización, las células se extraen del paciente en el que serán transplantadas; en otras realizaciones, las células son de otros pacientes u otros animales. Por ejemplo, las células de islotes de cerdos se pueden inmortalizar y desinmortalizar de manera condicional antes del transplante en un humano, según se describe en la patente US Nº 5.387.237.

De esta manera, se proporcionan procedimientos para introducir o transplantar células desinmortalizadas tales como células madre en un hospedador animal o mamífero. Las técnicas de transplante son bien conocidas en la materia y se pueden realizar con células desinmortalizadas. De esta manera, por ejemplo, las células desinmortalizadas se pueden transplantar en un hospedador para evaluar el potencial terapéutico de las células o para tratar una alteración neurológica del sistema nervioso. En una realización preferida, las células son células madre neurales y la alteración es una enfermedad neurológica del sistema nervioso periférico.

Además, la línea celular inmortalizada se puede utilizar para cribar fármacos que pueden afectar el desarrollo, diferenciación y/o función de las células. Estas incluyen tanto pequeñas moléculas orgánicas farmacéuticas como factores de crecimiento.

Las células desinmortalizadas son particularmente útiles en aplicaciones de transplante o implante, puesto que los oncogenes de inmortalización se eliminan antes de la introducción en el cuerpo, eliminándose, de esta manera, la creación potencial de tumores como resultado del gen de inmortalización. Los procedimientos de la invención se pueden aplicar tanto a terapia humana como a aplicaciones veterinarias, por ejemplo, para la utilización humana de células no humanas. De esta manera, los procedimientos y construcciones de la invención se pueden utilizar con células procedentes de dichos animales como humanos, cerdos, primates, roedores como ratones y ratas, perros, vacas y ovejas.

Lo siguiente se presenta como un ejemplo y que no se interpreta como limitación del ámbito de la invención.

Ejemplos

En este ejemplo, se utilizó y modificó un vector retrovírico del virus de la leucemia murina molaney estándar. Se modificó un vector retrovírico recombinante de replicación incompetente que albergaba el oncogén v-myc con el fin de introducir puntos loxP flanqueando la secuencia codificante de v-myc y para introducir la secuencia codificante de la \beta-galactosidasa en dirección cadena abajo (3') respecto a las secuencias loxP-v-myc-loxP. Experimentos adicionales utilizaron más marcadores de selección, incluyendo la fosfatasa alacalina, la resistencia a neomicina, y tanto la proteína fluorescente verde (GFP) como una versión "humanizada" de GFP, llamada proteína "lantern" verde (GLP) la cual es 10 veces más sensible que la GFP (para permitir la utilización de la clasificación de células activadas con fluorescencia). Estas modificaciones se llevaron a cabo mediante procedimientos biológicos moleculares estándar familiares para aquellos expertos en la materia y que implican enzima de restricción, digestión, ligación, amplificación por PCR, transformación bacteriana, aislamiento del plásmido y una caracterización y secuenciación adicionales.

Para confirmar que esta construcción retrovírica recombinante modificada era, de hecho, capaz de producir partículas víricas infecciosas recombinantes, se llevaron a cabo, primero, los siguientes experimentos. Para producir partículas infecciosas del virus de replicación incompetente, se transfectó la construcción en la línea de empaquetamiento BOSC 23. Después de la transfección temporal de las células BOSC 23, se recogieron tres días después los sobrenadantes procedentes de estas células transfectadas que contenían las partículas retrovíricas. La titulación del virus infeccioso en estos sobrenadantes estaba entre 10^{5} y 10^{6} pfu/ml. Estos sobrenadantes víricos se utilizaron, a continuación, para infectar células NIH 3T3. La tinción de estas células, varios días después de la infección con un anticuerpo contra v-myc aviar confirmó que muchas de estas células expresaban el oncogen v-myc. La fijación y tinción de cultivos hermanos con el reactivo Xgal confirmó que, como se predecía a partir del diseño del vector, ninguna de las células infectadas expresaba la \beta-galactosidasa. Este experimento, por tanto, reveló dos aspectos importantes: 1) que la construcción era capaz de ser empaquetada en el retrovirus infeccioso y 2) que las secuencias codificantes del oncogen v-myc contenidas en ese vector se podían transcribir y traducir a una proteína en células infectadas.

La transfección del enzima cre en estas células infectadas de manera retrovírica resultó en la eliminación de las secuencias codificantes de v-myc y la activación concomitante de la actividad del enzima \beta-galactosidasa. Esto se consiguió mediante la transfección de las células infectadas de manera retrovírica con una construcción de expresión en la que la recombinasa cre estaba bajo control del intensificador de citomegalovirus CMV. Veinticuatro o cuarenta y ocho horas después de su transfección, las células se fijaron y procesaron por tinción con Xgal. Esta tinción reveló que muchas de las células infectadas de manera retrovírica mostraban, ahora, la actividad del enzima \beta-galactosidasa, evidenciada por el producto de reacción azul en sus núcleos. No se observó actividad \beta-galactosidasa en los cultivos control transfectados con el mismo vector de expresión CMV que carecía de las secuencias codificantes cre. La tinción de las células transfectadas cre con el anticuerpo contra el oncogen v-myc confirmaron que estas células tranfectadas no expresaban más el oncogen v-myc, según se esperaba basándose en su eliminación del provirus mediante la recombinasa cre.

Estos experimentos indican, de esta manera, que la recombinasa cre es capaz de extraer la secuencia del oncogen v-myc procedente del provirus integrado en un genoma de células de mamífero y que la extracción del oncogen resulta en la activación concomitante del gen reportero dirección cadena abajo, en este caso la \beta-galactosidasa, como se esperaba basándose en el diseño del vector.

La expresión del oncogen v-myc procedente de la construcción retrovírica producía secuencias funcionales v-myc que eran capaces de inmortalizar un tipo de célula primaria. Esto se realizó utilizando fibroblastos embrionarios de ratón primario. Los fibroblastos se aislaron y cultivaron mediante procedimientos estándar y, a continuación, se infectaron con el vector retrovírico codificante del oncogén v-myc modificado flanqueado por las secuencias loxP que contienen el gen marcador \beta-galactosidasa dirección cadena abajo. Este vector referido como retmycgal y se muestra en la Figura 2C. Las células infectadas se colocaron en placas bajo selección, cultivándolas en presencia de histidina 6mM. El vector retrovírico contiene, también, el gen histidinol deshidrogenasa. Por tanto, las células que expresaban el provirus integrado sobrevivirán en presencia de histidina 6 mM mientras que las células no infectadas morirán. Se llevó una placa control de células no infectadas en ausencia de histidina 6 mM para comparar las velocidades de crecimiento entre células no infectadas e infectadas. Después de 4 a 6 semanas de crecimiento en cultivo que implicó aproximadamente 6 pasos, se observó una clara diferencia entre las células infectadas con myc resistentes a histidina y las células no infectadas. El fibroblasto control no infectado en este tiempo había alcanzado la senescencia y había extendido y parado la división. Al contrario, las células infectadas con la construcción retrovírica retmycgal continuaban exhibiendo una fuerte proliferación en el cultivo. La fijación y tinción de algunas de estas células con anticuerpos contra v-myc revelaron una expresión abundante del oncogen v-myc aviar en los núcleos de estos fibroblastos infectados, confirmando que su estado inmortalizado se debía a la expresión del oncogen v-myc. Como se esperaba, no se detectó la actividad \beta-galactosidasa en las células.

Estos experimentos se repitieron utilizando resistencia al fármaco neomicina como primer marcador seleccionable puesto que el sistema his era demasiado sensible.

Las secuencias codificantes de myc se podían extraer del genoma de las células infectadas establecidas mediante la transfección de una construcción de expresión de cre en las células. La extracción de myc resultó en una activación concomitante del gen de la \beta-galactosidasa, como habíamos mostrado previamente en el caso de células infectadas de manera temporal. Después de la transfección de la construcción CVM cre en estas células, eran detectables muchas células azules por tinción con Xgal. Estos datos demuestran, por tanto, que la recombinasa cre es capaz de extraer las secuencias codificantes de v-myc y activar la expresión del marcador \beta-galactosidasa dirección cadena abajo incluso en células primarias infectadas de manera estable que han pasado por lo menos 6 veces. Más importante, estos indican que la expresión de las secuencias codificantes de v-myc procedentes del provirus integrado es, de hecho, capaz de inmortalizar, de manera funcional, estos fibroblastos primarios de ratón como se esperaba.

Además, mientras los procedimientos convencionales para la introducción de la recombinasa (es decir transferencia del gen mediada por DNA) resultaba en un 5-10% de las células que eran inmortalizadas, la utilización de un vector adenovírico codificante de la recombinasa Cre resultaba en, aproximadamente, un 50% de las células que se habían vuelto desinmortalizadas.

Además, las células madre de la cresta neural de acuerdo con WO 94/02593 se inmortalizaron también utilizando neo como primer marcador seleccionable y el gen de la fosfatasa alcalina como segundo marcador seleccionable.

En resumen, este ejemplo demuestra que utilizando fibroblastos embrionarios de ratón primarios es posible inmortalizar células primarias infectándolas con un vector retrovírico retmycgal y otros vectores para pasar, de manera estable, por lo menos seis generaciones y, a continuación, desinmortalizar las células mediante extracción de las secuencias del oncogen myc de su genoma mediante transfección de estas células con una construcción de expresión cre.

Claims

1. Línea de células inmortalizadas de mamífero que contiene, en el genoma de dicha célula, ácido nucleico exógeno que comprende por lo menos un primer y un segundo punto diana para recombinasa que flanquean un solo gen de inmortalización, en donde dichos puntos diana son capaces de mediar en la eliminación de dicho gen de inmortalización cuando dichos puntos diana se ponen en contacto con una recombinasa.

2. Línea de células inmortalizadas según la reivindicación 1 en donde dicho ácido nucleico exógeno comprende además un gen marcador de selección.

3. Línea de células inmortalizadas según la reivindicación 2 en donde dicho gen marcador de selección es un gen marcador de selección negativo.

4. Línea de células inmortalizadas de acuerdo con la reivindicación 2 en donde dicho ácido nucleico comprende, además, un punto de parada.

5. Línea de células inmortalizadas según la reivindicación 1 en donde dicho ácido nucleico exógeno comprende, además, un primer gen marcador de selección y un segundo gen marcador de selección.

6. Línea de células inmortalizadas según la reivindicación 5 en donde dicho segundo gen marcador de selección no está entre el primer y el segundo punto diana para recombinasa.

7. Procedimiento para crear una célula inmortalizada que contiene puntos diana para recombinasa que flanquean un solo gen de inmortalización en el genoma de dicha célula inmortalizada, comprendiendo dicho procedimiento transformar una célula con un ácido nucleico exógeno que comprende

a) un primer punto para recombinasa;

b) un solo gen de inmortalización; y

c) un segundo punto de recombinasa.

8. Procedimiento según la reivindicación 7 en donde dicho ácido nucleico comprende, además, por lo menos un gen marcador de selección.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 en donde dicho gen marcador de selección es un marcador de selección negativo.

10. Procedimiento para la discriminación de una célula inmortalizada que contiene ácido nucleico exógeno que comprende puntos diana para recombinasa que flanquean un solo gen de inmortalización en el genoma de dicha célula inmortalizada, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dichos puntos diana para recombinasa con una recombinasa.

11. Procedimiento para la desinmortalización de una célula inmortalizada que comprende:

a) incorporar un ácido nucleico exógeno que comprende:

i): un primer punto diana para recombinasa;

ii): un solo gen de inmortalización;

iii): un gen marcador de selección negativo; y

iv): un segundo punto diana para recombinasa;

en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada que contenga un solo gen de inmortalización que se puede extraer en una orientación tal que la extracción de la secuencia entre los puntos diana para recombinasa corta el gen de inmortalización y el marcador de selección negativo; y

b) poner en contacto los puntos diana para recombinación con una recombinasa que reconozca dichos puntos diana para recombinasa de tal manera que se extraen dicho gen de inmortalización y dicho gen marcador de selección negativo.

12. Procedimiento según la reivindicación 11 en donde dicho procedimiento comprende además seleccionar las células desinmortalizadas en presencia de un agente de selección negativo.

13. Procedimiento según la reivindicación 11 en donde dicho ácido nucleico exógeno comprende, además, un gen de selección positivo.

14. Procedimiento para la desinmortalización de una célula inmortalizada que comprende:

a) incorporar ácido nucleico exógeno que comprende:

i): un primer punto diana para recombinasa;

ii): un solo gen de inmortalización;

iii): un segundo punto diana para recombinasa; y

iv): un gen marcador de selección;

en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada que contenga un gen de inmortalización que se puede eliminar en una orientación tal que la extracción de la secuencia entre los puntos diana para recombinasa corta el gen de inmortalización, resultando en la expresión del marcador de selección; y

b) poner en contacto dichos puntos diana para recombinasa con una recombinasa que reconozca dichos puntos diana para recombinasa de tal manera que se extraiga dicho gen de inmortalización.

15. Procedimiento según la reivindicación 14 en donde dicho ácido nucleico comprende además un punto de parada.

16. Procedimiento según la reivindicación 14 en donde dicho procedimiento comprende además seleccionar las células desinmortalizadas que expresan dicho gen marcador de selección.

17. Procedimiento para la desinmortalización de una célula inmortalizada que comprende:

a) incorporar ácido nucleico exógeno que comprende:

i): un primer punto diana para recombinasa;

ii): un solo gen de inmortalización;

iii): un primer gen marcador de selección;

iv): un segundo punto diana para recombinasa; y

v): un gen marcador de selección;

en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada que contiene un gen de inmortalización, que se puede eliminar, en una orientación tal que cuando se expresa el gen de inmortalización, también se expresa el primer marcador de selección y el segundo marcador de selección no se expresa y cuando dicho gen de inmortalización se extrae, dicho segundo marcador de selección se expresa; y

18. Procedimiento según la reivindicación 17 en donde dicho ácido nucleico comprende además un punto de parada.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 en donde dicha puesta en contacto es mediante la transformación de dichas células inmortalizadas con un vector que codifica una recombinasa que reconoce dichos puntos diana para recombinasa bajo condiciones en las que dicha recombinasa se expresa.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 en donde dicho ácido nucleico exógeno comprende además un gen para una recombinasa que reconoce dichos puntos diana para recombinasa, en donde dicho gen recombinasa está unido, de manera operativa, a un promotor inducible y dicha puesta en contacto es mediante crecimiento de dichas células inmortalizadas bajo condiciones en las que dicha recombinasa se expresa.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 20 en donde dicho ácido nucleico comprende además un gen exógeno adicional.