MXPA97009783A - Inmortalizacion y desinmortalizacion de celulas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una célula de mamífero inmortalizada quecontiene en el genoma de la célulaácido nucleico exógeno que comprende por lo menos un primero y un segundo sitios objetivo para recombinasa que flanquean un gen de inmortalización, caracterizada además porque los primero y segundo sitios objetivo median la escisión del gen inmortalizado cuando los primero y segundo sitios objetivo son puestos en contacto con una recombinasa.

Description

pj nBTAT.T7.Aftñw v nrat?JMn t^.t*art-p?r nía r^t.ttt,?fl CMffiQ DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con métodos y composiciones para inmortalización y desinmortalización de células , y en particular con métodos como se aplican a terapia de genes .

La terapia de genes, por la cual se agrega ácido nucleico exógeno a células para corregir defectos genéticos o para tratar desórdenes o enfermedades, es un campo que está surgiendo rápidamente. Con frecuencia, la terapia con genes se lleva a cabo utilizando las células del paciente como el vehículo para el ácido nucleico exógeno, esto es, las células deben ser extraídas del paciente, manipuladas genéticamente y reintroducidas en el paciente. Véase, por ejemplo, la patente norteamericana no. 5,399,346. Un problema con este enfoque es que las células extraídas generalmente tienen una duración de vida finita en cultivo, e impiden una manipulación genética adicional. Por lo tanto, con frecuencia, las líneas de células extraídas se transforman con un gen de inmortalización tal REF: 26347 como un oncogen. Esto permite el crecimiento indefinido y proliferación de las células. Sin embargo, las células inmortalizadas que contienen oncogenes no son candidatos de trasplante adecuados, debido a lo indeseable de introducir oncogenes en un paciente. En consecuencia, es un objetivo de la invención proporcionar métodos y composiciones para la creación de líneas de células inmortalizadas las cuales puedan crecer y parpadearse ex vivo, y posteriormente inducir la desinmortalización, esto es, eliminar los oncogenes, antes« de la introducción en un paciente o animal .

BREVE DES PCTÓN DE IA DTOB CTÓW De acuerdo con los objetivos anteriores, la invención proporciona una célula inmortalizada aislada que contiene sitios objetivos de recombinasa flanqueantes a un gen de inmortalización en el genoma de la célula. Los sitios objetivo son capaces -de mediar el corte del gen de inmortalización cuando los sitios objetivo se ponen en contacto con una recombinasa. En un aspecto adicional, las células inmortalizadas comprenden ácido nucleico exógeno adicional que está constituido de un gen marcador de selección, el cual puede ser un gen de marcador de selección positivo o negativo. Las células también pueden contener un sitio de detección, y un gen marcador de selección adicional. En un aspecto adicional, se proporcionan métodos para producir células inmortalizadas que contengan sitios objetivo de recombinasa flanqueantes a un gen de inmortalización en el genoma de la célula inmortalizada. El método comprende transformar una célula con ácido nucleico exógeno, que comprende: a) un primer sitio objetivo de recombinasa; b) un gen de inmortalización; y c) un segundo sitio objetivo para recombinasa, de manera que, en ausencia» de recombinasa, el ácido nucleico exógeno es incorporado en el genoma de la célula. El ácido nucleico exógeno también puede comprender por lo menos un gen marcador de selección. Se proporcionan métodos adicionales para la desinmortalización de una célula inmortalizada que contiene ácido nucleico exógeno que comprende sitios objetivo para recombinasa que flanquean un gen de inmortalización en el genoma de la célula inmortalizada. El método comprende poner en contacto los sitios objetivo de recombinasa con una recombinasa capaz de reconocer los sitios objetivo para recombinasa. Un aspecto adicional de la invención es proporcionar métodos para la desinmortalización de una célula inmortalizada. El método comprende incorporar ácido nucleico exógeno que comprende un primer sitio objetivo para recombinasa; un gen de inmortalización; un gen marcador de selección negativa; y un segundo sitio objetivo para recombinasa. El ácido nucleico exógeno se incorpora en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada la cual contiene un gen de inmortalización que se puede extraer en una orientación tal que el corte de la secuencia entre los sitios objetivo para recombinasa cortan al gen de inmortalización y al marcador de selección negativa. El método comprende de manera adicional poner en contacto sitios objetivo para recombinasa con una recombinasa la cual* reconoce los sitios objetivo para recombinasa de manera que el gen de inmortalización y el gen marcador de selección negativa son extirpados o cortados. Las células a las cuales no se les ha cortado el gen de inmortalización y el gen de selección negativa se seleccionan por medio del cultivo de las células en presencia de un agente de selección negativo apropiado. Se proporcionan métodos adicionales para la desinmortalización de una célula inmortalizada. El método comprende incorporar ácido nucleico exógeno que comprende un primer sitio objetivo para recombinasa; un gen de inmortalización; un gen marcador de selección positiva; y un segundo sitio objetivo para recombinasa. El ácido nucleico se incorpora en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada la cual contiene un gen de inmortalización que se puede cortar en una orientación tal que el corte de la secuencia entre los sitios objetivo para recombinasa extirpa o corta el gen de inmortalización, lo que resulta en la expresión del marcador de selección. El método proporciona adicionalmente poner en contacto los sitios objetivo para recombinasa con una recombinasa la cual reconoce los sitios objetivo para recombinasa de manera que se corta o se extirpa el gen de inmortalización. Posteriormente las células se aislan utilizando un agente de selección positiva. Las células que no expresan el.* marcador de selección son eliminadas de la selección.

BREVE DESCRIPCl?W DE LOS DIBUJOS Las figuras ÍA, IB, 1C y ID muestran el diseño de cuatro vectores para inmortalización condicional. RTS es un sitio de objetivo de recombinasa. MPCS es un sitio de clonación polienlazador múltiple, en el cual se inserta un gen de inmortalización. STOP es una secuencia de detención de traducción o transcripción. LTR es una secuencia repetida terminal larga viral. SV40 es el promotor de SV40. Las figuras 2A, 2B, 2C, 2D, y 2E muestran las modalidades preferidas. La figura 2 (A) y 2 (B) son dos diseños alternativos para el mismo vector básico. En ambos vectores, el gen de inmortalización (por ejemplo v-myc) se inserta en un sitio de clonación de polienlazante múltiple (MPCS) flanqueado por RTS, es decir, sitios LoxP o sitios FRT. Corriente abajo de MPCS está una secuencia "STOP" tal como TGACTGACCTGA diseñada para evitar la traducción de un marcador seleccionable corriente abajo (fosfatasa alcalina, marcadores de selección de medicamento, proteínas de superficie celular, proteína fluorescente verde, lacZ, etc.). También existe un marcador de selección para medicamento diferente para seleccionar la inmortalización inicial de las células, por ejemplo, histidinol, neomicina.* higomicina, etc. El marcador de selección de medicamento es activado por LTR viral y el oncogene por un promotor y un alargador interno (2A) tal como el alargador SV40 o viceversa (2B) . La figura 2C es el vector retmycgal utilizado en los ejemplos; el gen de inmortalización utilizado es v-myc, el segundo marcador seleccionable es lacZ, y el primer marcador seleccionable es histinol. La figura 2D es el vector rett ne .ap, en el que el gen de inmortalización es v-myc, el promotor interno es tk, el primer marcador seleccionable es neo y el segundo marcador seleccionable es fosfatasa alcalina. La figura 2E es el vector ret.INS.ap, en el que el gen de inmortalización es v-myc, IRES está en un sitio de entrada de ribosoma interno, el primer marcador seleccionable es neo y el segundo marcador seleccionable es fosfatasa alcalina.

Las figuras 3A, 3B y 3C muestran los constructos o p l á s m i d o s r e c o m b i n a n t e s d e inmortalización/desinmortalización utilizando marcadores de selección negativa para asegurar que todas las células han sido desinmortalizadas. La figura 3A utiliza el gen de inmortalización como el marcador de selección para transformación; de manera alternativa, el análisis clonal utilizando exposición ante un agente de selección negativa puede servir como el marcador para transformación. La figura 3B utiliza un marcador de selección positiva como el * marcador para transformación. Los genes marcadores de selección positiva y negativa se pueden localizar en cualquier orden. La figura 3C agrega una recombinasa bajo el control de un promotor inducible; también se puede agregar un gen de selección positiva. Nuevamente, los genes pueden localizarse en cualquier orden. No se muestran los promotores para transcripción de genes diferentes a los de recombinasa, pues se pueden localizar en diversas partes. Las figuras 4A y 4B muestran el uso de dos recombinasas diferentes y RTS. La figura 4 permite la expresión del gen de inmortalizacidn y el primer gen marcador de selección, con el segundo gen de marcador de selección que no se expresa hasta el corte entre los dos RTS1. En el momento en que se realiza el corte de RTS1, se expresa el segundo gen marcador de selección, lo que permite la selección para células desinmortalizadas. Antes del trasplante, la exposición a la recombinasa que reconoce RTS2 corta el segundo marcador de selección, por lo que minimiza el ácido nucleico exógeno. La figura 4B es similar, excepto que se incluye un gen exógeno adicional, por ejemplo, que codifica para un agente terapéutico. Por lo tanto, las células pueden ser trasplantadas con el gen exógeno expresado, y algún tiempo después las células se exponen a la segunda recombinasa para eliminar el gen exógeno. La figura 5 muestra un constructo de» inmortalización condicional el cual impide el uso del sitio STOP al colocar los RTS en la parte media de un gen marcador de selección. Los RTS deben ser incluidos en los exones, pues al momento del corte, uno de los RTS permanecerá en el genoma. Cuando se realiza la transformación de las células con este constructo, se transcriben el gen de inmortalización y el primer marcador de selección, utilizando un segundo promotor. Posteriormente se seleccionan las células inmortalizadas en base al primer marcador de selección. Al exponerlas a una recombinasa que reconoce los RTS, se cortan el gen de inmortalización y el primer marcador de selección, junto con uno de los sitios RTS. Se transcribe el segundo marcador de selección, removiéndose el segundo RTS como resultado de señales de empalme de ARN las cuales son reconocidas por la maquinaria celular de las células huésped. Esto permite que se transcriba el segundo gen marcador de selección. Las figuras 6A y 6B muestran el uso de un promotor inducible con el gen recombinasa. Las figuras 6A y 6B corresponden al constructo mostrado en la figura 1C, pero con un gen para recombinasa bajo el control de un promotor inducible. La figura 6A muestra un constructo el cual abandonará en gen para recombinasa en el genoma después del corte, y la figura 6B muestra un constructo el cual elimina el gen para recombinasa. ß» DESCRIPCIÓN PETATl-ADA DE IA INVENCIÓN La invención está dirigida a métodos y composiciones para la inmortalización condicional de células. Por el término "inmortalización condicional" en la presente se quiere significar un proceso por el cual las células son inmortalizadas de manera que pueden ser desinmortalizadas en un momento posterior. Por lo tanto, bajo ciertas condiciones, las células son inmortalizadas; bajo condiciones diferentes, como se indica abajo, las células no son inmortalizadas más y regresan a su patrón de senescencia normal, y ya no crecen ni proliferan más de manera indefinida en cultivo celular.

Como se comprenderá por aquellos familiarizados con la técnica, mediante el término "inmortalizado" en la presente se quiere significar que las células han sido transformadas con un gen de inmortalización, por ejemplo, la expresión de los genes de inmortalización confiere la capacidad para crecer y proliferar de manera sustancialmente indefinida en cultivo. Mediante el término "gen de inmortalización" se quiere significar en la presente un gen el cual elimina los mecanismos de senescencia de una célula, lo que permite que* la célula sea subcultivada de manera sustancialmente indefinida. Los genes de inmortalización son bien conocidos en la técnica. El gen de inmortalización es en general exógeno a las células utilizadas y generalmente se integra en el genoma de las células. Los ejemplos de genes inmortalizantes incluyen: (1) oncogenes nucleares tales como v-myc, N-myc, antígeno T y oncogen de sarcoma de Ewing (Fredericksen et al . (1988) Neuron 1:439-448; Bartlett, P. et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:3255-3259, y Snyder, E.Y. et al . (1992) Cell 58:33-51), (2) oncogenes citoplás icos tales como bcr-abl y neurofibromina (Solomon E. et al . (1991) Science 254:1153-1160), (3) oncogenes de membrana tales como neu y ret (Aaronson A. S.A (1991) Science 254:1153-1161) , (4) mutaciones dominantes de genes supresores de tumores tales como p53 mutante y Rb mutante (retinoblastomas) (Weinberg, R.A. (1991) Science 254:1138-1146) , y (5) otros genes inmortalizantes tales como el negativo dominante Notch (Coffman, C.R. et al. (1993) Cell 23 :659 - 671 ) ; (5) factores de crecimiento; (6) receptores de factores de crecimiento; y (7) genes contra la muerte celular tal como Bcl2. Los oncogenes particularmente preferidos incluyen v-myc y el antígeno SV40 T. Por "desinmortalización" se quiere significar en la presente un proceso por el cual la totalidad o parte del gen de inmortalización de una célula inmortalizada es» separado físicamente del genoma de la célula, lo que permite a la célula que regrese a un ciclo de senescencia más normal, de manera que no crezca más ni prolifere indefinidamente en cultivo. Una célula desinmortalizada puede tener la totalidad o parte del constructo de inmortalización condicional separado. Por lo tanto, como se apreciará por aquellos expertos familiarizados con la técnica, junto con la descripción en la presente, se pueden elaborar diversos constructos de inmortalización condicionales, lo que resulta en cantidades diferentes de ácido nucleico exógeno que se deja en el genoma celular. En una modalidad preferida, la totalidad del gen de inmortalización se retira de una célula de desinmortalización.

Los métodos de inmortalización condicional y desinmortalización de la invención se llevan a cabo utilizando un sistema de recombinasa específico para el sitio. Se conocen varios de tales sistemas, que incluyen la recombinasa Cre del bacteriófago Pl y la recombinasa FPL ("flip") de Sacc arctp ces cerevisiae. El sistema Cre utiliza la recombinasa Cre, la cual es una proteína de 38 kDa, y dos sitios objetivo de recombinasa de 34 pares de base (RTS) , denominado loxP. La recombinación puede ocurrir entre los sitios loxP repetidos directamente en la misma* molécula para separar el segmento de ADN interpuesto. Véase Sauer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5166 (1988); Sauer et al., Nuc. Acids Res. 17:147 (1989); Lakso et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6232; Hoess et al., J. Mol. Biol. 181:351-362 (1985); Abremski et al., Cell. 32:1301 (1983); Sternberg et al., J. Mol. Biol. 150:467-486 (1981); y Orban et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6861 (1992).

El sistema FLP utiliza la proteína FLP y dos sitios objetivo para recombinación FLP (denominados FRT en la técnica; mostrados en la presente como RTS) que consiste de dos secuencias repetidas de 13 pares de bases invertidas y un separador de 8 pares de bases (véase, por ejemplo, O 'Gorman, Science 251:1351 (1991); Jayaram, PNAS USA 82:5875-5879 (1985); Senecof et al., PNAS USA 82:7270 (1985); y Gronostajski et al., J. Biol. Chem. 260:12320 (1985)). La totalidad de estas referencias se incorporan de manera expresa como referencia. Por "sitio objetivo para recombinasa" (RTS) en la presente se quiere significar una secuencia de ácido nucleico la cual es reconocida por una recombinasa para la separación de la secuencia interpuesta. Debe entenderse que se requiere dos RTS para la separación. Por lo tanto, cuando se utiliza la recombinasa cre, cada RTS comprende un sitio loxP; cuando se utilizan sitios loxP, la recombinasa correspondiente es cre recombinasa. Esto es, la recombinasa debe corresponder a, o reconocer los RTS. Cuando* se utiliza FLP recombinasa, cada RTS comprende un sitio objetivo para recombinación FLP (FRT) ; cuando se utilizan sitios FRT, la recombinasa correspondiente es la FLP recombinasa. Utilizando estos sistemas de recombinasa, los genes de inmortalización insertados en la célula huésped se pueden separar por exposición a la recombinasa apropiada. Por lo tanto, se insertan los constructos de inmortalización condicionales en una célula en una orientación que resulte en la expresión del gen de inmortalización. Para la totalidad de las modalidades, las células huésped no deben expresar ácido nucleico, y de manera preferible no deben contener ácido nucleico que codifica para la recombinasa apropiada antes de la adición del ácido nucleico exógeno de la invención. En un tiempo posterior, la recombinasa se expresa y hace contacto con los sitios objetivo para recombinasa, para cortar el gen de inmortalización interpuesto. De manera preferible, se utilizan genes marcadores de selección para detectar o seleccionar inmortalización y desinmortalización exitosas. Por ejemplo, la expresión de un primer marcador de selección permite la detección de una inmortalización exitosa; esto es, el gen marcador se expresa cuando el gen de inmortalización se ha integrado en el genoma de la célula. La expresión de un segundo marcador de* selección, de manera preferible diferente al primer gen marcador de selección, indica la separación del gen de inmortalización, como se describe de manera más completa abajo. Estos marcadores de selección pueden ser marcadores de selección positivos o negativos. Como se conoce en la técnica "gen marcador de selección" o equivalentes significan genes que permiten la selección o detección de células que contienen el gen. El término "selección positiva" se refiere a un proceso por el cual únicamente las células que contienen el marcador de selección positiva sobrevivirán cuando se dispongan al agente de selección positiva que va a ser marcado o detectado. Por ejemplo, un marcador de selección positivo común es la resistencia a medicamentos; las células que contienen el gen de resistencia al medicamento crecerán en medio que contiene el medicamento, y aquellas células las cuales no contengan el gen de resistencia morirán. Los genes de resistencia adecuados para medicamentos son histidinol deshidrogenasa, resistencia a neomicina, resistencia a higromicina y resistencia a puromicina, entre otros. Otros genes marcadores para selección positiva incluyen genes que permiten la clasificación o examen de las células. Estos genes incluyen el gen para fosfatasa alcalina, el gen la proteína fluorescente verde, el gen lacZ, y marcadores de superficie tales como CD8, entre otros. En una modalidad,* como se describe abajo, el gen de inmortalización en si mismo puede servir como un marcador de selección positivo. En una modalidad adicional, se utilizan marcadores de selección negativos. El término "selección negativa" se refiere a un proceso por el cual las células transfectadas con un marcador de selección negativo son destruidas ante la exposición a un agente de selección negativo apropiado el cual destruye las células que contengan el marcador de selección negativo. Por ejemplo, las células las cuales contienen el gen para timidinacinasa de el virus de herpes simplex (HSV-tk) son sensibles a ganciclovir (GANC5) . De manera similar, el gen para Gpt vuelve a las células sensibles a 6-tioxantina. Cuando se coloca apropiadamente en un constructo de inmortalización condicional, el gen marcador de selección negativa puede ser utilizado para aislar células las cuales han sido desinmortalizadas. Esto es, el marcador de selección negativa se expresa con el gen de inmortalización, de manera que si aún está presente el gen de inmortalización, las células serán destruidas. Generalmente, los vectores y técnicas de inmortalización condicional y de desinmortalización realizan los siguientes pasos. Las construcciones de gen utilizadas para inmortalización se elaboran de manera que una primera transformación con ácido nucleico exógeno resulte en inmortalización. Las células se pueden hacer crecer y se* propagan y se pueden agregar otros genes, como se indica antes. En algunos casos, cuando las células son células pluripotenciales germinales, las células inmortalizadas pueden ser diferenciadas si así se desea. Después, antes del trasplante o en algún momento posterior, las células son manipuladas de manera que se separa el gen de inmortalización, es decir, las células son desinmortalizadas . En una modalidad preferida, el vector de clonación el cual introduce el gen de inmortalización en las células se construye de manera que se integra el gen de inmortalización y cualquier marcador de selección, promotor y RTS dentro del genoma, simultáneamente. Esto es, no se requiere integración adicional del ADN en el genoma para facilitar la desinmortalización. De manera alternativa, el gen de inmortalización se puede introducir en el genoma consecuencias franqueantes suficientes para permitir la construcción de vectores de recombinación homólogos para introducir la secuencias requeridas adicionales. En una modalidad preferida, la desinmortalización se lleva a cabo como resultado de una introducción adicional de ácido nucleico exógeno que codifica para la recombinasa en la célula, como se indica abajo. En una modalidad, la invención proporciona líneas celulares inmortalizadas de manera adicional. Estas líneas* de células inmortalizadas contienen ácido nucleico el cual está constituido por varios constructos de inmortalización condicionales diferentes como se indica abajo. Estas líneas de células inmortalizadas se pueden producir al transformar por lo menos una célula con ácido nucleico que comprende los constructos de la invención. Estas líneas de células inmortalizadas condicionalmente pueden ser utilizadas en diversos métodos para desinmortalización como se indica abajo. En otra modalidad, las líneas de células que contienen ácido nucleico comprenden sitios objetivo para recombinasa que flanquean un gen de inmortalización en el genoma de las células de las líneas celulares. Estos sitios objetivo deben estar en una orientación tal que los RTS sean capaces de mediar la separación del gen de inmortalización cuando los RTS se ponen en contacto con una recombinasa. Esto es, en ausencia de la recombinasa la cual reconoce los RTS, el gen de inmortalización se incorpora en el genoma de la célula y se expresa para crear una línea celular inmortalizada. Cuando los RTS se exponen a la recombinasa correspondiente, se produce la separación de la secuencia entre los RTS. Puesto que esta secuencia contiene el gen de inmortalización, el fenómeno de separación resulta en la pérdida del gen, es decir, la desinmortalización. En una modalidad adicional, la invención,* proporciona líneas de células inmortalizadas que contienen ácido nucleico, que comprenden un primer sitio objetivo para recombinasa, un gen de inmortalización, un gen marcador de selección negativa y un segundo sitio objetivo para recombinasa, como se muestra generalmente en la figura 3A. Como en lo anterior, en ausencia de la recombinasa la cual reconoce los RTS, el gen de inmortalización se incorpora en el genoma de la célula y se expresa para crear una línea celular inmortalizada. Los RTS son capaces de mediar la separación del gen de inmortalización cuando los RTS se ponen en contacto con una recombinasa. En una modalidad preferida, los genes de inmortalización y marcador de selección negativa están flanqueados por RTS. Así, cuando se produce la transformación, el gen de inmortalización y el marcador de selección negativa se expresan, y las células transformadas se pueden seleccionar en base a la inmortalización y expresión del marcador de selección negativa. Ante la exposición o el contacto con una recombinasa que reconoce los RTS, el gen de inmortalización y el marcador de selección negativa son separados, y las células desinmortalización se pueden seleccionar por exposición al agente de selección negativa. Esto es, las células desinmortalización sobrevivirán y aquellas que aún contienen el gen de inmortalización, y el gen marcador de selección negativa morirán. • En una modalidad adicional, la invención proporciona líneas de células inmortalizadas que contienen ácido nucleico que comprende un primer sitio objetivo para recombinasa, un gen de inmortalización, un gen marcador de selección y un segundo sitio objetivo para recombinasa. Como en lo anterior, en ausencia de la recombinasa la cual reconoce los RTS, el gen de inmortalización se incorpora en el genoma de la célula y se expresa, para generar una líneas de células inmortalizadas. Los RTS son capas de mediar la separación del gen inmortalización cuando los RTS se ponen en contacto con una recombinasa. En una modalidad, la orientación del constructo de manera preferible es tal que, en ausencia de una recombinasa, el gen de inmortalización se expresa pero el gen marcador de selección no. Esto se lleva a cabo preferiblemente a través de la adición de un sitio STOP al constructo, tal como se muestra en las figuras 1 a 4, aunque como se muestra en la figura 5, también puede ser acompañado y tener uno de los RTS en la porción media del gen marcador de selección dentro de los intrones. Cuando se expone a una recombinasa la cual reconoce los RTS, la secuencia interpuesta es separada, lo que resulta en una pérdida del gen de inmortalización y la expresión del gen marcador de selección por lo que se permite la selección de células desinmortalización. De manera alternativa, la orientación del constructo es tal que, cuando se produce la*, transformación, se expresan el gen de inmortalización y el gen de selección, por lo tanto se permite la selección para inmortalización. Cuando se expone a una recombinasa que reconoce los RTS, se separan el gen de inmortalización y el gen de selección, y las células resultantes se pueden seleccionar por desinmortalización por pérdida del gen de selección. En una modalidad adicional, la invención proporciona líneas de células inmortalizadas que contienen ácido nucleico que comprende un primer objetivo para recombinasa, un gen de inmortalización, un primer gen marcador de selección, un segundo sitio objetivo para recombinasa y un segundo gen marcador de selección. En esta modalidad, la orientación del constructo es tal que mediante la transformación, se expresan el gen de inmortalización y el primer gen marcador de selección, y el segundo gen marcador de selección no. Esto se lleva a cabo de manera preferible por la adición de un sitio STOP al constructo, aunque, como en lo anterior, puede realizarse de maneras alternativas. Mediante exposición o contacto con una recombinasa que reconozca los RTS, el gen de inmortalización y el primer gen marcador de selección se separan, y se expresa el segundo marcador de selección. Esto permite la selección de células desinmortalizadas en base al segundo gen marcador de selección. » En las figuras se muestran varias modalidades específicas, las cuales utilizan un vector de clonación retroviral preferido con cualquiera de los sistemas de recombinasa Cre/loxP o FLP/FRT. Aquellos familiarizados con la técnica reconocerá que una variedad de construcciones resultarán en la creación de células inmortalizadas las cuales pueden ser desinmortalizadas subsecuentemente, únicamente algunas de las cuales se muestran en las figuras. En una modalidad preferida, los constructos de inmortalización condicionales son como se muestran en las figuras 1 y 2. En primer lugar, se construye un vector de clonación el cual contiene: un primer marcador seleccionado con un primer promotor; un segundo promotor; un sitio de clonación de polienlazador múltiple (MPCS) , flanqueados por los sitios objetivo para recombinasa (RTS) ; y un segundo marcador seleccionable. El gen inmortalización, generalmente un oncogen, se inserta en los MPCS, junto con una secuencia STOP opcional que evita la expresión del segundo marcador seleccionable. Las secuencias STOP tales como TGACTGACCTGA son conocidas en la técnica. Por lo tanto, en ausencia de una recombinasa, el gen inmortalización se expresa utilizando el segundo promotor y se expresa el primer marcador seleccionable utilizando el primer promotor. Esto permite la selección de células transformadas e inmortalizadas, pero la secuencia STOP evita la expresión* del segundo marcador. Por lo tanto, las células inmortalizadas pueden ser clonadas y se puede hacer crecer, y se pueden agregar genes adicionales si así se desea. Para la desinmortalización, se lleva a cabo la expresión (de manera preferible transitoria) de la recombinasa apropiada, utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Esto resulta en la separación de los sitios objetivo para recombinasa, los MPCS que contienen el gen de inmortalización y la secuencia STOP. Por lo tanto, ahora se expresa el segundo gen marcador seleccionable y se pueden seleccionar las células desinmortalizadas en base a este gen marcador. En la figura ÍA, el primer marcador seleccionable es traducido vía el primer promotor (o alternativamente, a partir de un promotor interno para el LTR) , y el gen de inmortalización insertado en MPCS es activado por el segundo promotor. En ausencia de una recombinasa, la secuencia STOP evita la traducción del segundo marcador seleccionable. Ante la exposición de la recombinasa, se separan el gen de inmortalización y la secuencia STOP, lo que permite que el segundo marcador seleccionable desplace al segundo promotor. En la figura IB, se activa la traducción del gen de inmortalización por el promotor LTR interno, el primer marcador seleccionable es traducido por medio del promotor SV40 o equivalentes, pero las secuencias STOP evita la traducción de segundo marcador seleccionable. Cuando se* expone a la recombinasa, el gen de inmortalización y la secuencia STOP, se separan, lo que permite la traducción del segundo marcador seleccionable. En la figura 1C, el primer marcador es seleccionable, y el gen de inmortalización se traduce por medio de primer promotor o el promotor LTR, pero la secuencia STOP evita la traducción del segundo marcador seleccionable. Cuando se expone a la recombinasa, se separan el gen de inmortalización y la secuencia STOP, lo que permite la traducción del segundo marcador seleccionable por medio del promotor o el LTR. En la figura ID, la traducción de la proteína de fluorescencia verde y el gen de inmortalización se llevan a cabo por medio del promotor LTR (u otro promotor) . La proteína fluorescente verde sirve como un marcador de selección. Cuando se expone a la recombinasa, se separan el gen de inmortalización y la secuencia codificante para proteína fluorescente verde. Por lo tanto, las células se pueden seleccionar primero por la presencia de la proteína fluorescente verde y después por su ausencia. Los RTS se exponen o hacen contacto con una recombinasa en muchas formas. Por "expuesto a" o "en contacto con una recombinasa que reconoce los RTS" en la presente se quiere significar que la proteína recombinasa debe interactuar con los RTS de una manera la cual permita la separación de la secuencia entre los RTS. Generalmente, todo lo que se requiere es que la proteína recombinasa esté* presente dentro de la célula que contiene los RTS. Esto se puede llevar a cabo al expresar un gen que codifique para la recombinasa en las células que contienen el constructo de inmortalización condicional, como se indica abajo. En una modalidad preferida, la expresión de la recombinasa es transitoria, puesto que generalmente la recombinación específica de sitio es rápida y eficiente. Se obtiene la expresión transitoria por diversos métodos bien conocidos en la técnica que incluyen, pero que no se limitan a transfección del ADN plásmido por precipitación con fosfato de calcio, electroporación, lipofección u otros métodos fisicoquímicos, transducción utilizando un vector retroviral, o expresión de otro vector viral recombinante tal como un adenovirus. La expresión adenoviral se prefiere particularmente puesto que son comunes su eficiencias de expresión elevadas. En una modalidad alternativa, el gen que codifica para la recombinasa se coloca bajo el control de un promotor inducible y es parte del constructo de inmortalización/desinmortalización. Generalmente, se puede incluir un promotor inducible unido de manera operable al gen para recombinasa en cualquiera de las modalidades escritas en las figuras. Los constructos de este tipo generalmente se muestran en las figuras 6 y 3C. La figura» 6A corresponde a la figura le al cual se ha agregado un gen promotor inducible/recombinasa, el cual se dejará en el genoma. La figura 6B corresponde a la figura 1C cuando se separa la recombinasa. Puesto que únicamente es necesario una cantidad pequeña de recombinasa para que resulte en la separación de las secuencias entre los RTS, es deseable utilizar promotores regulados para evitar eventos de recombinación prematuros. Las señales de detención de transcripción que flanquean a la recombinasa también son deseables. La recombinación y separación del gen de inmortalización, y de manera preferible el gen para recombinasa se llevan a cabo cuando se administran condiciones inductores apropiadas. En una modalidad preferida, se utilizan los marcadores de selección negativa, o una combinación de marcadores de selección positivos y negativos. Los marcadores de selección negativa son útiles particularmente para evitar que las células inmortalizadas sean trasplantadas. Por ejemplo, se pueden expresar marcadores de selección negativa junto con el gen de inmortalización. Después de la desinmortalización, las células se exponen aj. agente de selección negativo, por ejemplo GANC, el cual destruye cualquier célula la cual aún contenga el gen HSV-tk que esté unido estrechamente al gen de inmortalización. En la figura 3 se muestran ejemplos particulares. En la figura» 3A, los RTS flanquean un gen de inmortalización y un gen de selección negativa. Como se describe antes, el gen de inmortalización sirve como el primer marcador de selección. De manera alternativa, se pueden identificar colonias clónales las cuales contienen el gen de selección negativa mediante el uso del marcador de selección negativa; esto es, se utilizan colonias clónales para identificar colonias originales las cuales contienen el gen de selección negativa. Los promotores utilizados para activar la expresión de los genes de inmortalización y de selección negativa se pueden colocar en ambos lados del primer RTS. Cuando se pone en contacto con una recombinasa, se separan el gen de inmortalización y el gen de selección negativa, y las células son desinmortalizadas. Cualquier célula inmortalizada remanente puede ser destruida al exponer las células putativamente desinmortalizadas al agente de selección negativa; en el caso del gen de timidinacinasa de virus del herpes simplex, por ejemplo, las células se pueden exponer a GANC. Esto reduce y elimina potencialmente células inmortalizadas remanentes, lo cual es deseable cuando las células van a ser utilizadas para trasplante. Se prefiere particularmente este constructo puesto que resulta en un ácido nucleico exógeno muy pequeño y permanece en el genoma de la célula, lo cual también es deseable para trasplante. En la figura 3B, existe un gen de selección positiva» incluida en el constructo para seleccionar las células inmortalizadas. En la figura 3C, el sistema es muy similar al de la figura 3A, excepto que se incluye la recombinasa bajo el control de un promotor inducible, lo que elimina la necesidad de manipulación genética adicional. En una modalidad preferida, se utilizan sitios STOP para evitar la traducción de marcadores de selección antes de la desinmortalización, como se indica generalmente en lo anterior para diversos constructos. De manera alternativa, como se muestra en la figura 5, es posible evitar la expresión de marcadores de selección funcionales al colocar los RTS en la parte media de los genes marcadores de selección. Este método se basa en el corte completo de uno de los RTS por la recombinasa y el otro vía procesamiento de ARNm, puesto que cualquier nucleótido remanente muy probablemente resultará en mutaciones de desplazamiento de marco y por lo tanto en un marcador de selección no funcional . En una modalidad adicional, se utiliza más de un conjunto de RTS. Este puede realizarse utilizando conjuntos adicionales de RTS los cuales son reconocidos por la misma recombinasa o, alternativamente, mediante la utilización de los RTS los cuales son reconocidos por una recombinasa diferente. Cuando se utilizan conjuntos adicionales de los* RTS para la misma recombinasa, debe tenerse precaución al diseñar los constructos de manera que un corte entre cualquiera de los dos RTS proporcione un resultado deseado o mensurable. Esto, puesto que la separación puede ocurrir en cualquiera de los RTS, es posible que un solo RTS, con ácido nucleico exógeno flanqueante se deje dentro del genoma . En una modalidad preferida, se utilizan conjuntos de RTS de diferentes recombinasas. Esto puede tener uso particular cuando se incluyen en el genoma genes exógenos adicionales. Por ejemplo, utilizando el constructo mostrado en la figura 4A, se seleccionan células inmortalizadas utilizando el primer marcador de selección. Para desinmortalización, se utiliza la recombinasa la cual reconoce el RTSl, y las células desinmortalizadas se seleccionan utilizando el segundo marcador de selección. El segundo gen de selección puede ser transcrito utilizando el primer promotor, en cuyo caso se activará únicamente por la desinmortalización, o su propio promotor, lo cual permite la transcripción durante los estados inmortalizado y desinmortalizado. Se trasplantan las células desinmortalizadas las cuales expreses la proteína exógena. En algún momento posterior, por ejemplo cuando ya no se requiere más el producto del gen exógeno, la exposición a la segunda recombinasa resulta en la separación del segundo* marcador de selección y del gen exógeno. De manera alternativa, el gen exógeno únicamente puede requerirse ex vivo, en cuyo caso se puede utilizar la segunda recombinasa antes del trasplante. Al igual que para los otros constructos descritos en la presente, aquellos familiarizados con la técnica serán capaces de construir diversos constructos de funcionalidad similar utilizando las enseñanzas en la presente . En una modalidad adicional, se utilizan dos recombinantes para eliminar virtualmente la totalidad del ácido nucleico exógeno antes del trasplante. Por ejemplo, mediante la utilización del constructo que se muestra en el figura 4B, se seleccionan células inmortalizadas utilizando el primer marcador de selección. Para la desinmortalización, la recombinasa la cual corresponde a los sitios RTSl se pone en contacto con el constructo, y las células se seleccionan en base al segundo marcador de selección el cual es transcrito desde el primer promotor. Posteriormente las células se pueden poner en contacto con una segunda recombinasa la cual reconoce los sitios RTS2 antes del trasplante, para eliminar todo menos un sitio RTS único. Aunque el fenómeno de separación es muy eficiente, se puede utilizar para selección una pérdida del marcador de selección utilizando colonias clónales. En una modalidad, el evento de recombinación corta* al primer marcador seleccionable. Esto puede preferirse en situaciones en la que se van a transplantar células desinmortalizadas, y es deseable minimizar la introducción de genes exógenos en un paciente. En una modalidad preferida, el primer marcador seleccionable es un gen con resistencia a medicamentos tal como histidinol deshidrogenasa, resistencia a neomicina, resistencia a higromicina y resistencia a puromicina, entre otros. En esta modalidad, el segundo marcador seleccionable es un gen que permitirá la clasificación o examen de las células, y puede incluir al gen para fosfatasa alcalina, el gen para la proteína fluorescente verde, el gen lacZ, marcadores de superficie tales como CD8, o cualguier gen diseñado para el primer marcador seleccionable, en la medida en que el primero y segundo marcadores sean genes diferentes dentro de cualquier célula única. En algunas modalidades, la frecuencia de transformación puede ser tal elevada que se pueden eliminar el primero o el segundo marcadores seleccionables, aunque generalmente es preferible retener por lo menos el segundo marcador seleccionable si las células desinmortalizadas se destinan para trasplante, puesto que es deseable asegurar que no se trasplantes a un animal células que contengan oncogenes. En una modalidad, se utiliza un solo marcador de selección, por ejemplo, un marcador tal como proteína fluorescente verde la cual* permite la clasificación de células. En esta modalidad, el marcador se expresa cuando se introduce el gen inmortalizante, y las células transformadas se separan de las células no transformadas por clasificación de células. Después de la desinmortalización, el gen marcador se elimina y las células se vuelven a clasificar, con las células desinmortalizadas que carecen del marcador. En una modalidad adicional, se seleccionan las células inmortalizadas en base al fenotipo. Por ejemplo, el gen de inmortalización puede servir como el primer marcador seleccionable, puesto que las células las cuales no contienen el gen no crecerán de manera indefinida en cultivo y pueden ser eliminadas con esta base. De manera alternativa, se pueden detectar marcadores utilizando análisis clonal; por ejemplo, cuando se utiliza el gen HSV-TK, se pueden analizar clonas para detectar actividad TK. Como se utiliza en la presente, el término "célula sometida a ingeniería genética" o "célula recombinante" se refiere a una célula en la cual se ha introducido ácido nucleico extraño (es decir, que no se presenta de manera natural) , por ejemplo, ADN. Por ácido nucleico "extraño" o "heterólogos" o "exógenos" en la presente se quiere significar ácido nucleico el cual normalmente no se encuentra dentro del genoma de la célula, o está en una,* forma que normalmente no se encuentra dentro del genoma. Por lo tanto, los genes de inmortalización tales como oncogenes o sitios objetivo para recombinasa normalmente no se encuentran en el genoma de la célula huésped, y por lo tanto las células inmortalizadas que contienen esas secuencias han sido sometidas a ingeniería genética. En algunas modalidades, las células inmortalizadas condicionalmente se manipulan para expresar uno o más genes exógenos adicionales. Tales genes normalmente estarán contenidos dentro del genoma, es decir, serán homólogos, pero no se expresarán en una medida apreciable, o son heterólogos, es decir, normalmente no se encuentran dentro del genoma. Por ejemplo, se pueden introducir en una célula genes de factor de crecimiento homólogos en una forma que normalmente no se encuentra dentro del genoma; es decir, consecuencias reguladoras tales como promotores los cuales permiten la expresión del factor de crecimiento a concentraciones que normalmente no se observan en la célula, o dentro de tipos de células que normalmente no expresan el factor de crecimiento. De manera alternativa, se pueden introducir genes heterólogos. Por lo tanto, las células inmortalizadas condicionalmente de la invención pueden ser sometidas a ingeniería genética para que contengan más de una secuencia de ácido nucleico exógena. Los constructos de inmortalización condicional y* métodos de la invención también pueden contener genes exógenos adicionales que son terapéuticamente benéficos. Por ejemplo, se pueden introducir genes que codifiquen para factores del crecimiento con el fin de facilitar la supervivencia de células trasplantadas, o para el tratamiento del paciente. Por ejemplo, pueden ser útiles neurotrofinas que incluyen factor de crecimiento de nervios (NGF), neurotrofina-3 (NT3), neurotrofina-4 (NT4) y factor de neurotrofina derivado de cerebro (BDNF) . En el caso en el que se utilice células diferentes a las células neurales, los genes exógenos apropiados incluyen aquéllos que codifican para factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento humano, el factor de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento neural, etc; citocinas; enzimas e inhibidores enzimáticos; interferones tales como interferones a, ß o ?; factores de coagulación (factor VIII) ; ADA; genes que evitan la muerte celular; y otras proteínas. Así, por ejemplo, se pueden inmortalizar células para manipulación ex vivo tales como la introducción de ADN extraño que codifica para agentes terapéuticos, y después se desinmortalizan, lo que permite la introducción en un paciente de células sometidas a ingeniería genética las cuales expresan un agente terapéutico. De manera alternativa, las células en si mismas son del agente/ terapéutico y se trasplantan para sustituir células enfermas o que mueren, por ejemplo, en enfermedad de Parkinson. En una modalidad, se elimina células en un paciente con un defecto genético y se someten a ingeniería para que contengan por lo menos una copia de un gen corregido antes de la reintroducción de las células utilizando las técnicas de la invención. Los trastornos genéticos los cuales pueden ser tratados de esta manera son conocidos en la técnica. Además del gen de inmortalización, las células de la invención tienen ácido nucleico exógeno adicional, como se describe de manera más completa abajo. Este ácido nucleico exógeno incluye por lo menos dos sitios objetivo para recombinasa, y de manera preferible genes de selección (marcadores) , sitios de terminación de transcripción, secuencias enlazadoras y otros genes de interés como se describe antes. El ácido nucleico extraño o el ácido nucleico exógeno se puede introducir por diversas técnicas conocidas en el arte, que incluyen, pero que no se limitan a transcripción mediada por fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE, microinyección, transformación retroviral, transformación adenoviral, transformación viral por herpes, fusión de protoplastos y lipofección. En una modalidad preferida, se introduce ADN» extraño en las células utilizando la técnica de transfección retroviral. Se utilizan retrovirus recombinantes para introducir genes de inmortalización, genes de selección de marcadores, sitios objetivo para recombinasa y recombinasas. Los retrovirus recombinantes se producen en líneas de células de empacado para introducir sobrenadantes de cultivo que tienen un título elevado de partículas de virus (generalmente 105 a 106 ufp/ml) . Las partículas virales recombinantes se utilizan para infectar cultivos de las células o su progenie al incubar los cultivos celulares con medio que contiene las partículas virales como se conoce en la técnica. Después de la infección viral, las células se humedecen y cultivan en medio estándar. Posteriormente las células infectadas se analizan para determinar la captación y expresión del ADN extraño. Las células se pueden someter a condiciones selectivas las cuales se seleccionan para las células que han captado y expresado un gen marcador seleccionable . En una modalidad preferida, el vector de clonación es un vector retroviral, y utiliza secuencias repetidas terminales largas (LTR) como se muestran en las figuras. Las modalidades alternativas utilizan plásmidos de expresión tradicionales, vectores basados en herpes virus y vectores basados en adenovirus, así como otros equivalentes bien conocidos por aquellos familiarizados con la técnica. " En otra modalidad, se introduce el ADN extraño utilizando la técnica de transfección mediada por fosfato de calcio, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, se prepara un precipitado de fosfato de calcio que contiene los constructos de inmortalización condicionales de la invención utilizando la técnica de Wigler et al., (1979) Proc. Nati . Acad. Sci. USA 76: 1373 -1376. Se establecen cultivos de células en los recipientes de cultivo de tejido. 24 horas después de sembrar en placas las células, se agrega precipitado de fosfato de calcio que contiene aproximadamente 20 µg/ml de ADN extraño. Las células se incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se agrega medio de cultivo de tejido que contiene cloroquina 30 µM y las células se incuban durante la noche a 37°C. Después de la transfección, se analizan las células para determinar la captación y expresión de ADN extraño. Las células se pueden someter a condiciones de selección por medio de las cuales se seleccionan las células que han captado y que expresan un gen marcador seleccionable. Las técnicas anteriores se pueden llevar a cabo más de una vez sobre una célula particular; por ejemplo, estas técnicas se pueden utilizar para introducir el gen de inmortalización con sitios de recombinasa, y después introducir ácido nucleico exógeno adicional a las células inmortalizadas, tal como cualquier plásmido de expresión que» codifique para una recombinasa. Como se apreciará por aquellos familiarizados con la técnica, se pueden utilizar en la invención una amplia variedad de promotores adecuados . Los promotores particularmente útiles incluyen, pero no se limitan al alargador promotor interno de LTR de retrovirus, el promotor SV40 y promotores específicos para el tipo de célula o de tejido, especialmente promotores específicos para el tipo de célula los cuales van a ser inmortalizadas condicionalmente. Las células adecuadas las cuales pueden ser utilizadas para lleva a la práctica los métodos de inmortalización condicional de la invención incluyen cualquier tipo de célula la cual no produzca una recombinasa la cual reconozca la secuencia objetivo para recombinasa utilizada en los constructos de la invención. De manera preferible, las células se dividen de manera que sean capaces de ser infectadas por un vector retroviral. Las células adecuadas son células de vertebrado, de manera preferible células de mamífero tal como primate, ovino, porcino, bovino, canino, felino y equino, por ejemplo y de manera más preferible, células humanas. Se prefieren particularmente células de todo tipo de células pluripotenciales o germinales tales como células neurales, hemopoyéticas, pancreáticas, hepáticas, epidérmicas, intestinales, osteogénicas y de células del tallo olfatorio, prefiriéndose particularmente células pluripotenciales que son células pluripotenciales de cresta neural y células pluripotenciales hematopoyéticas. Las células no pluripotenciales o no germinales adecuadas incluyen células de islote pancreático, fibroblastos, osteoclastos, osteoblastos, células epidérmicas y dérmicas y células endoteliales, hapetocitos, eritoblastos, miocitos esqueléticos y micitos lisos, miocitos cardíacos, melanocitos, limfocitos (B, T) , células mieloides y células de glia. En una modalidad preferida, el fenotipo, crecimiento y duración de vida de una célula desinmortalizada es idéntico al mismo tipo de célula en ausencia de cualquier manipulación genética; esto es, una célula desinmortalizada es idéntica a las células iniciales, antes de la inmortalización. En modalidades alternativas, las células pueden tener características alteradas. Debe reconocerse que en algunos casos, las células iniciales tienen una duración de vida extendida in vivo, esto es, pueden existir en el animal huésped, pero son incapaces de crecer indefinidamente ex vivo. Así, por ejemplo, las células de islote parecen durar por lo menos la duración de vida de los humanos . Aunque las células de islote aún pueden requerir inmortalización para crecimiento» y proliferación ex vivo en cultivo celular. De manera similar, células pluripotenciales tales como células pluripotenciales neurales pueden durar durante un período de tiempo extendido, y son capaces de autorrenovación limitada in vitro pero deben ser inmortalizadas con un gen de inmortalización durante el crecimiento y proliferación indefinidos en cultivo celular. La expansión indefinida de células inmortalizadas puede permitir la generación de "líneas de células donadoras universales" para tratamiento de pacientes múltiples. Debe entenderse que a menos que se someta a nuevas condiciones de cultivo, la división celular de una célula inmortalizada resulta en dos células hijas sustancialmente idénticas; esto es, las células inmortalizadas por definición son capaces de regeneración indefinida. Así, por ejemplo, la división celular de células pluripotenciales inmortalizadas tales como células pluripotenciales de la cresta neural resulta en dos células pluripotenciales de la cresta neural, ambas igualmente no diferenciadas. Al exponer a ciertas condiciones experimentales o fisiológicas, estas células pluripotenciales experimentarán diferenciación parcial o completa. Como se comprende por aquellos familiarizados con la técnica, las condiciones de cultivo adecuadas para las líneas de células inmortalizadas variará en base al tipo de/ célula. Los métodos de inmortalización condicional de la invención encuentran uso en muchas aplicaciones, como se apreciará por aquellos familiarizados con la técnica. En una modalidad, las células inmortalizadas condicionalmente son células pluripotenciales, y en una modalidad preferida, las células son células pluripotenciales de la cresta neural y células pluripotenciales neurales multipotentes como se describen en WO 94/02593, incorporada de manera expresa en la presente como referencia. Como se apreciará por aquellos familiarizados con la técnica, las células pluripotenciales neurales, las cuales llevan a la formación de glia y neuronas del sistema nervioso central y periférico se pueden transplantar o implantar a partir de neuronas nuevas y glia.

Por ejemplo, la sustitución de neuronas motoras y sus células de glia asociadas en la médula espinal para daño motor traumático agudo o la sustitución de neuronas dopaminérgicas que mueren en el cerebro medio para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson son áreas activas las cuales están siendo sometidas a estudios preclínicos. Una segunda aplicación del trasplante de células inmortalizadas genéticamente es para terapia de genes; las células pueden ser modificadas genéticamente antes del trasplante de manera que expresen un producto de gen perdido» y después, el trasplante de estas células a la región particular del cerebro suministrará el producto del gen el área del cuerpo en la que se requiere. La prueba del principio de tal enfoque de terapia de genes ya sea ha demostrado en modelos animales utilizando mucopolisacaridosis hereditaria como el sistema de prueba. En una modalidad alternativa, se pueden inmortalizar células diferentes a la células pluripotenciales para crecimiento ex vivo y después se pueden desinmortalizar antes de su reintroducción en el cuerpo. Por ejemplo, la patente norteamericana no. 5,387,237, describe un páncreas bioartificial que comprende un cilindro plástico rellenado con células de islote pancreático porcinas. Estas células islote porcinas pueden ser inmortalizadas para crecimiento y proliferación ex vivo, lo que permite uniformidad con respecto al tiempo, y después se pueden desinmortalizar antes de su introducción en el cuerpo. Aquellos familiarizados con la técnica se darán cuenta que cualquier variedad de tales sistemas puede utilizar la presente invención. Por ejemplo, estos métodos se pueden utilizar para técnicas de terapia de genes ex vivo, tales como las descritas de manera general en la patente norteamericana no. 5,299,346. Por lo tanto, cualquier célula que sea trasplantada a un paciente, ya sea humano o animal, se puede someter a métodos de inmortalización condicionales, con la desinmortalización subsecuente antes del trasplante. En una modalidad, las células se extraen del paciente en el cual van a ser trasplantadas; en otras modalidades, las células son de otros pacientes o de otros animales. Por ejemplo, se pueden inmortalizar condicionalmente células de islote de cerdo que se pueden desinmortalizar antes de su trasplante a un humano, como se describe en la patente norteamericana no. 5,387,237. Por lo tanto, se proporcionan métodos para introducir o transplantar células desinmortalizadas tales como células pluripotenciales en un animal huésped o un mamífero. Las técnicas de trasplante son bien conocidas en la técnica y se pueden realizar con células desinmortalizadas. Así, por ejemplo, las células desinmortalizadas pueden ser trasplantadas en un huésped para evaluar el potencial terapéutico de las células o para tratar un trastorno neurológico del sistema nervioso. En una modalidad preferida, las células son células pluripotenciales neurales y el trastorno es un trastorno neurológico del sistema nerviosos periférico. Además, se puede utilizar la línea de células inmortalizadas para examinar medicamentos los cuales puedan llevar a cabo el desarrollo, diferenciación y/o fusión de las células. Estos incluyen tanto sustancias farmacéuticas/ orgánicas de moléculas pequeñas así como factores de crecimiento. Las células desinmortalizadas son particularmente útiles en aplicaciones de trasplante o de implante, puesto que los oncogenes inmortalizantes se retiran antes de la introducción en el cuerpo, por lo que se elimina la creación potencial de tumores como resultado del gen inmortalizante. Los métodos de la invención son aplicables tanto en terapia de humanos como en aplicaciones veterinarias, por ejemplo, para el uso humano de células no humanas. Así, los métodos y constructos de la invención se pueden utilizar con células de animales como humanos, cerdos, primates, roedores, tales como ratones, ratas, perros, vacas y borregos. Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no se considera como limitación del alcance de la invención.

Además, todas las referencias de las que se hace mención en la misma se incorporan de manera expresa como referencias.

En este ejemplo, se utiliza y modifica un vector retroviral de virus de leucemia de ratón moloney estándar. Se modifica un vector retroviral incompetente de replicación recombinante estándar que alberga el oncogen v-myc de manera que coloque sitios loxP flanqueante a la secuenciai codificante para v-myc y de esta manera coloca la secuencia codificante para ß-galactosidasa corriente abajo (3') respecto a las secuencias loxP-v-myc-loxP. Experimentos adicionales utilizaron marcadores de selección adicionales que incluyen fosfatasa alcalina, resistencia a neomicina y tanto la proteína fluorescente verde (GFP) como una versión "humanizada" de GFP, denominada proteína linterna verde (GLP) la cual es diez veces más sensible que GFP (para permitir el uso de clasificación celular activada por fluorescencia) . Estas modificaciones se llevaron a cabo por medio de procedimientos biológicos moleculares estándar familiares para aquellos familiarizados con la técnica y que involucran enzima de restricción, digestión, ligación, amplificación por PCR, transformación bacteriana, aislamiento de plásmidos y caracterización y secuenciado adicionales. Para confirmar que este constructo retroviral recombinante modificado de hecho es capaz de producir partículas virales infecciosas recombinantes, se llevaron a cabo primeros los siguientes experimentos. Para producir partículas de virus incompetentes de replicación infecciosa, el constructo se transfecta en la línea de empacado BOSC 23. Después de la transfección transitoria de las células BOSC 23, tres días después los sobrenadantes de estas» células transfectadas se recolectan y contienen las partículas retrovirales. El título de virus infeccioso en estos sobrenadantes está entre 105 y 106 ufp/ml. Estos sobrenadantes virales se utilizan posteriormente para infectar células NIH 3T3. La tinción de estas células varios días posteriores de la infección con un anticuerpo de v-myc avian confirma que muchas de estas células expresan el oncogen v-myc. La fijación y teñido de cultivos hermana con el reactivo Xgal se confirma, como se predice a partir del diseño del vector, ninguna de las células infectadas expresa ßgalactosidasa. Por lo tanto, este experimento revela dos cosas importantes: 1) el constructo es capaz de ser empacado en retrovirus infeccioso, 2) el oncogen v-myc que codifica secuencias contenidas en ese vector puede ser transcrito y traducido en proteínas de células infectadas.

La transfección de la enzima cre en estas células infectadas retroviralmente resulta en la separación de las secuencias que codifican para v-myc y la activación concomitante de la actividad de la enzima ßgalactosidasa. Esto se lleva a cabo mediante transfección de la células infectadas retroviralmente con un constructo de expresión en el cual la recombinasa cre está bajo control del alargador de CMV citomegalovirus. 24 horas a 48 horas después de la transfección las células se fijan y procesan para tinción por Xgal. Esta tinción revela que muchas de las* células infectadas retroviralmente ahora muestran actividad de enzima ßgalactosidasa evidenciada por el producto de reacción azul en sus núcleos. No se observó actividad de ßgalactosidasa en cultivos control transfectadas con el mismo vector de expresión CMV que carece de las secuencias que codifican para cre. La tinción de las células transfectadas con cre con anticuerpo para oncogen v-myc confirma que estas células transfectadas no expresan más el oncogen v-myc, como se esperaba en base a su separación del provirus por la recombinasa cre. Por lo tanto, estos experimentos indican que la recombinasa cre es capaz de separar la secuencia del oncogen v-myc de un provirus integrado en un genoma de células de mamífero y que esta separación del oncogen resulta en la activación concomitante del gen indicador corriente abajo, en este caso, ßgalactosidasa, como se espera en base al diseño de este vector. La expresión del oncogen v-myc de este constructo retroviral produce secuencias v-myc funcionales que son capaces de inmortalizar un tipo de célula primaria. Esto se realiza utilizando fibroblastos de embrión de ratón primario. Los fibroblastos se aislan y cultivan por procedimientos estándar y después se infectan con el vector retroviral que codifica para el oncogen v-myc modificado flanqueado por las secuencias loxP que contiene el gen» marcador ßgalactosidasa corriente abajo. Este vector se menciona como retmycgal y se muestra en la figura 2C. Las células infectadas se colocan bajo selección al cultivarlas en presencia de histidina 6 mM. El vector retroviral también contiene el gen histidinol deshidrogenasa. Por lo tanto, las células que expresan el provirus integrado sobrevivirán en presencia de histidina 6 mM mientras que las células no infectadas morirán. Se realiza una placa control de células no infectadas en ausencia de histidina 6 mM para una comparación de las velocidades de crecimiento entre células no infectadas e infectadas. Después de 4 a 5 semanas de crecimiento en cultivo que involucra aproximadamente 6 pasajes, es visible una diferencia clara entre las células infectadas con myc resistentes a histidina y las células no infectadas. Los fibroblastos de control no infectados en este momento han alcanzado senescencia y se han aplanado y han dejado de dividirse. Zn contraste, las células infectadas con el constructo retroviral recmycgal continúan mostrando proliferación robusta en cultivo. La fijación y tinción de algunas de estas células con anticuerpo para v-myc muestra expresión abundante del oncogen v-myc avian en los núcleos de estos fibroblastos infectados, lo que confirma que su estado inmortalizado que se debe a la expresión del oncogen v-myc. Como se esperaba, no se detecta en las células actividad de ßgalactosidasa. . • Se repiten estos experimentos utilizando resistencia al medicamento neomicina como el primer marcador seleccionable, el sistema his es demasiado sensible. Las secuencias que codifican para myc pueden ser separadas del genoma de las células infectadas establecidas por transfección de un constructo de expresión cre dentro de las células. Esta separación de myc resulta en la activación concomitante del gen para ßgalactosidasa, como se ha demostrado previamente en el caso de células infectadas de manera transitoria. Después de la transfección del constructo cre CMV en estas células, muchas células azules fueron detectables por tinción Xgal. Por lo tanto, estos datos demuestran que la recombinasa cre es capaz de separar las secuencias codificantes v-myc y activar la expresión del marcador corriente abajo ß-galactosidasa incluso en células primarias infectadas de manera estable que han sido sometidas a pasaje por lo menos seis veces. Lo que es más importante, indican que la expresión de las secuencias codificantes v-myc del provirus integrado es, de hecho, capaz de inmortalizar funcionalmente estos fibroblastos de ratón primarios, como se esperaba. Además, aunque los métodos convencionales para introducción de la recombinasa (es decir, transferencia de genes mediada por ADN) resulta en 5-10% de las células desinmortalizadas, el uso de un vector adenoviral que» codifica para recombinasa cre resulta en aproximadamente 50% de las células que se desinmortalizan. Además, también se inmortalizan células pluripotenciales de cresta neural, de acuerdo con WO/94/02593, utilizando neo como el primer marcador seleccionable y el gen para fosfatasa alcalina como el segundo marcador seleccionable. En resumen, este ejemplo demuestra que la utilización de fibroblastos de embrión de ratón primarios de manera que es posible inmortalizar células primarias al infectarlas con el vector retroviral retmycgal y otros vectores para someter a pasaje de manera estable estas células inmortalizadas durante por lo menos seis generaciones y después desinmortalizar las células al cortar - SO -las secuencias mys de oncogen de su genoma por transfección de esas células con un constructo de expresión cre. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (27)

BE-L?PPICAIQMBS

1. Una línea inmortalizada de células de mamífero, que contiene en el genoma del ácido nucleico exógeno de la célula caracterizado porque comprende por lo menos un primero y segundo sitios objetivo para recombinasa que flanquean un gen de inmortalización, en el que los sitios objetivo son capaces de mediar la separación o corte del gen de inmortalización cuando los sitios objetivo se ponen en contacto con una recombinasa. *

2 . La línea de células inmortalizadas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico exógeno comprende además un gen marcador de selección.

3. La línea de células inmortalizadas de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el gen marcador de selección es un gen marcador de selección negativa.

4. La línea de células inmortalizadas de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el ácido nucleico comprende además un sitio STOP.

5. La línea de células inmortalizadas de conformidad con la reivindicación l, caracterizada porque el ácido nucleico exógeno comprende además un primer gen marcador de selección y un segundo gen marcador de selección.

6. La línea de células inmortalizadas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el segundo gen marcador de selección no está entre el primero y segundo sitios objetivo para recombinasa. .•

7. Un método para producir una célula inmortalizada que contiene sitios objetivo para recombinasa flanqueantes a un gen de inmortalización en el genoma de las células inmortalizada, el método está caracterizado porque comprende transformar a una célula con ácido nucleico exógeno, que comprende : a) un primer sitio para recombinasa; b) un gen de inmortalización; y c) un segundo sitio para recombinasa; de manera que, en ausencia de una recombinasa, el ácido nucleico exógeno se incorpora en el genoma de la célula.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el ácido nucleico de manera adicional comprende por lo menos un gen marcador de selección.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el gen marcador de selección es un marcador de selección negativa.

10. Un método para desinmortalización de una* célula inmortalizada que contiene ácido nucleico exógeno que comprende sitios objetivo para recombinasa que flanquean un gen de inmortalización en el genoma de la célula inmortalizada, el método está caracterizado porque comprende poner en contacto los sitios objetivo para recombinasa con una recombinasa capaz de reconocer tales sitios objetivo para recombinasa .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el contacto se lleva a cabo al transformar la célula inmortalizada con ácido nucleico de recombinasa que codifica para la recombinasa y mantener las células transformadas bajo condiciones en las que se expresa la recombinasa, y se separa o se desprende el gen de inmortalización.

12. Un método para la desinmortalización de una célula inmortalizada, caracterizado porque comprende: a) incorporar ácido nucleico exógeno, que comprende : i) un primer sitio objetivo para recombinasa; ii) un gen de inmortalización; iii) un gen marcador de selección negativa; y iv) un segundo sitio objetivo para recombinasa; .» en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada la cual contiene uno gen de inmortalización que se puede separar en una orientación tal que la separación de la secuencia entre los sitios objetivo para recombinasa separa o desprende el gen de inmortalización y el marcador de selección negativa; y b) poner en contacto los sitios objetivo para recombinasa con una recombinasa la cual reconoce los sitios objetivo para recombinasa de manera que se separa o desprende el gen de inmortalización y el gen marcador de selección negativa.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el contacto se lleva a cabo al transformar las células inmortalizadas con un vector que codifica para una recombinasa la cual reconoce los sitios objetivo para recombinasa bajo condiciones en las que se expresa recombinasa.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno comprende además un gen para una recombinasa que reconoce los sitios objetivo para recombinasa, en donde el gen de recombinasa está unido de manera operable a un promotor inducible, y el contacto se lleva a cabo al hacer crecer las células* inmortalizadas bajo condiciones en la que se expresa la recombinasa.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el método comprende de manera adicional seleccionar las células desinmortalizadas en presencia de un agente de selección negativa.

16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno comprende de manera adicional un gen de selección positiva.

17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno comprende de manera adicional un gen exógeno adicional.

18. Un método para la desinmortalización de una célula inmortalizada, caracterizado porque comprende: a) incorporar ácido nucleico exógeno que comprende : i) un primer sitio objetivo para recombinasa; ii) un gen de inmortalización; iii) un gen marcador de selección; y iv) un segundo sitio objetivo para recombinasa; en el genoma de una célula para producir una/ célula inmortalizada la cual contiene un gen de inmortalización que se puede separar en una orientación tal que la separación de la secuencia entre los sitios objetivo para recombinasa separa o desprende el gen de inmortalización, que resulta en la expresión del marcador de selección; y b) poner en contacto los sitios objetivo para recombinasa con una recombinasa la cual reconoce los sitios objetivo para recombinasa de manera que se separa el gen de inmortalización.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el ácido nucleico comprende de manera adicional un sitio STOP.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el contacto se obtiene al transformar las células inmortalizadas con vector que codifica para una recombinasa la cual reconoce los sitios objetivo para recombinasa bajo las condiciones en las que se expresa la recombinasa.

21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno comprende de manera adicional un gen para recombinasa que reconoce los» sitios objetivo para recombinasa unidos de manera operable a un promotor inducible, y el contacto se lleva a cabo al hacer crecer las células inmortalizadas bajo condiciones en las que se expresa la recombinasa.

22. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el método comprende de manera adicional seleccionar células desinmortalizadas que expresan el gen marcador de selección.

23. Un método para la desinmortalización de una célula inmortalizada, caracterizado porque comprende: a) incorporar ácido nucleico exógeno que comprende : i) un primer sitio objetivo para recombinasa; ii) un gen de inmortalización; iii) un primer gen marcador de selección; iv) un segundo sitio objetivo para recombinasa; y v) un segundo gen marcador de selección; en el genoma de una célula para producir una célula inmortalizada la cual contiene un gen de inmortalización que se puede separar en una orientación tal que cuando se exprese el gen de inmortalización, también se exprese el primer gen marcador de selección, y no se expresa* el segundo gen marcador de selección, y cuando se separa el gen de inmortalización, se exprese el segundo marcador de selección; y b) poner en contacto los sitios objetivo para recombinasa con una recombinasa la cual reconoce los sitios objetivo para recombinasa de manera que se separa el gen de inmortalización.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el contacto se realiza al transformar las células inmortalizadas con un vector que modifica para una recombinasa la cual reconoce los sitios objetivo para recombinasa bajo condiciones en las que se expresa la recombinasa.

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno comprende de manera adicional un gen para una recombinasa que reconoce los sitios objetivo para recombinasa, en donde el gen de recombinasa está unido de manera operable a un promotor inducible, y el contacto se realiza al hacer crecer las células inmortalizadas bajo condiciones en las que expresa la recombinasa.

26. El método de conformidad con la reivindicación' 24, caracterizado porque el ácido nucleico comprende de manera adicional un gen exógeno adicional.

27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico comprende de manera adicional un sitio STOP. Se proporcionan métodos y composiciones para la inmortalización condicional de células.