PT1638443E

PT1638443E - Isoformas de péptido natriurético cerebral

Info

Publication number: PT1638443E
Application number: PT04754213T
Authority: PT
Inventors: Shuchong Pan; Robert D Simari
Original assignee: Mayo Foundation
Priority date: 2003-06-20
Filing date: 2004-06-02
Publication date: 2011-01-25
Also published as: EP2308889A1; IL172674A; DK1638443T3; WO2005000095A2; CN101208353B; EP1638443A2; ATE485303T1; WO2005000095A3; ES2354881T3; IL172674A0; JP2007525957A; CN101208353A; US20070281887A1; DE602004029680D1; US8912137B2; US8354496B2; EP1638443B1; EP1638443A4; PL1638443T3; JP4881156B2

Description

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DESCRIÇÃO "ISOFORMAS DE PÉPTIDO NATRIURÉTICO CEREBRAL"

Descrição CAMPO TÉCNICO A invenção refere-se a procedimentos e materiais para diagnosticar afecções cardíacas como insuficiência cardíaca e, mais especificamente, para diagnosticar afecções cardíacas através da detecção de isoformas do péptido natriurético cerebral (BNP). A invenção também se refere a procedimentos e materiais para tratar afecções cardíacas (por exemplo, insuficiência cardíaca) e afecções renais (por exemplo, insuficiência renal).

ANTECEDENTES

Os elementos da família do péptido natriurético são hormonas que regulam a homeostase de fluidos corporais. O péptido natriurético auricular (ANP) libertado por miócitos auriculares em resposta a um aumento do volume intravascular. Após o ANP estar na circulação, os seus efeitos localizam-se principalmente no rim, no tecido vascular e na glândula supra-renal, em que as suas acções provocam a excreção do sódio e água pelos rins e uma redução do volume intravascular e da pressão sanguínea. 0 BNP também provém de células miocárdicas e, como o ANP, circula no plasma humano. 0 BNP é natriurético, inibidor de renina, vasodilatador e lusitrópico. A principal forma circulante e de armazenamento do BNP é um péptido de 32 aminoácidos com uma estrutura de anel. As acções fisiológicas do BNP são mediadas por um receptor ligado à guanilato ciclase, ou receptor de péptido natriurético A (NPR-A). A eliminação do BNP realiza-se por um receptor NPR-C que o elimina da circulação. 0 BNP também se degrada por clivagem enzimática através de uma endopeptidase neutra. 0 péptido natriurético de tipo C (CNP) provém de 2 células endoteliais e funciona como um péptido vasodilatador e inibidor do crescimento. 0 péptido natriurético de Dendroaspis (dnp) é semelhante em estrutura ao ANP, BNP e CNP, e isola-se a partir do veneno da serpente Dendroaspis angusticeps ou mamba-verde.

0 ANP e BNP estão aumentados no plasma e coração durante a insuficiência cardíaca congestiva nos seres humanos, e exercem acções protectoras cardio-renais além de servir como marcadores séricos de disfunção ventricular. Os testes epidemiológicos indicam que pelo menos 3% da população adulta com mais de 45 anos pode ter disfunção sistólica ventricular e 52% pode ser assintomático. 0 documento WO 95/24419 descreve procedimentos e materiais para identificar inibidores de transacções moleculares mediadas por domínios SH3. 0 número de registo do EBI EMBL:BQ130005 proporciona uma sequência de ARNm 3' do clone de ADNc de Homo sapiens de insulinoma Humano IMAGE:5777983. 0 número de registo de EBI EMBL:BQ130258 proporciona um clone de ADNc de Homo sapiens de insulinoma Humano IMAGE:5777983 5' semelhante à sequência de ARNc do PRECURSSOR DO PÉPTIDO NATREURÉTICO CEREBRAL SW:ANFB_HUMAN P16860. 0 documento W00071576 refere-se a vectores de adenovírus que codificam péptido natriurético. 0 número de registo de EBI EMBL:M25296 proporciona um ARNm de precursor de péptido natriurético humano, com cds completas. OGAWA et al descrevem a clonagem molecular do ADN complementar e um gene que codifica o péptido natriurético cerebral de ratinho e a criação de ratinhos transgénicos que sobre-expressam o gene do péptido natriurético cerebral (Maio de 1994 (1994-05), THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION MAYO de 1994, VOL. 93, NR. 5, PÁGINA(S) 1911 - 1921). VALLI N et al. proporcionam uma revisão de 10 anos do uso clínico do péptido natriurético cerebral em cardiologia (Novembro de 1999 (1999-11), THE JOURNAL OF LABORATORY AND CLINICAL MEDICINE NOV 1999, VOL. 134, NR. 5, PÁGINA(S) 437 - 444). O 3 documento WO 02/24895 refere-se a FACTORES DE TRANSCRIÇÃO E PROTEÍNAS DO DEDO DO ZINCO.

SUMÁRIO A invenção define-se pelas reivindicações anexas. A invenção baseia-se na identificação de novas formas de BNP criadas pelo corte e junção alternativa (splicing alternativo). Como alternativa, as isoformas de BNP humanas submetidas a corte e junção contêm a estrutura anelar dissulfureto de 17 aminoácidos de BNP, têm terminações carboxilo únicas e resultam de uma variação de corte e junção diferente. Uma das isoformas, BNP2, tem uma única extensão C-terminal de 33 resíduos de aminoácidos unida ao anel. Esta isoforma é o resultado da inclusão do intron 2. O BNP3 contém uma nova extensão C-terminal de 14 resíduos de aminoácidos e é o resultado de um receptor de corte e junção alternativa presente dentro do intron 2. Como é descrito no presente documento, a expressão de BNP2 e BNP3 está aumentada nos cardiomiocitos durante a insuficiência cardíaca. Desta forma, é possível utilizar polipéptidos de BNP2 e BNP3 ou ácidos ribonucleicos que codificam BNP2 ou BNP3 como marcadores para afecções cardíacas. Desta forma, é possível usar a presença, ausência ou nível desses polipéptidos ou ácidos ribonucleicos para diagnosticar afecções cardíacas e supervisionar o tratamento das afecções cardíacas. Além disso, o BNP2 e BNP3 podem ser utilizados como agentes terapêuticos para o tratamento de afecções cardíacas.

Descreve-se um polipéptido purificado e um anticorpo que tem afinidade de união específica pelo polipéptido. O polipéptido inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos das SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 35 ou 36; uma sequência que tem pelo menos 6 resíduos contíguos da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2; uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de 4 sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2; e uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com um fragmento da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 de pelo menos seis resíduos contíguos de comprimento. A sequência de aminoácidos pode ter pelo menos 75% (por exemplo, 80, 90 ou 95%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2, ou pelo menos 75% (por exemplo, 80, 90 ou 95%) de identidade de sequência com um fragmento da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 de pelo menos 6 resíduos contíguos de comprimento. O polipéptido pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 35 ou a SEQ ID N°: 36. As composições farmacêuticas podem incluir um polipéptido e um veículo farmacologicamente aceitável.

Apresenta-se um ácido nucleico isolado que codifica um polipéptido purificado descrito anteriormente, vectores que incluem os ácidos nucleicos e células hospedeiras que incluem os vectores. O polipéptido pode estar codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID N°: 5; a sequência de ácido nucleico dos nucleótidos 383 a 489 da SEQ ID N°: 5; a sequência de ácido nucleico da SEQ ID N°: 6; ou a sequência de ácido nucleico dos nucleótidos 388 a 432 da SEQ ID N°: 6. As células hospedeiras podem ser células hospedeiras eucariotas.

Apresenta-se um polipéptido natriurético quimérico. O polipéptido inclui uma primeira região e uma segunda região, tendo a primeira região uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em a) a sequência dos resíduos 1 a 2 7 da SEQ ID N°: 16; b) â sequência dos resíduos 1 a 2 5 da SEQ ID N° : 17; c) a sequência dos resíduos 1 a 2 3 da SEQ ID N°: 18; d) a sequência dos resíduos 1 a 22 da SEQ ID N °: 19; e e) a sequência de a), b), c) ou d) com uma a cinco substituições de aminoácidos; e tendo a segunda região uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em: f) a 5 sequência da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2; g) uma sequência que tem pelo menos 6 resíduos contíguos da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2; h) uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2; e i) uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com um fragmento da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 de pelo menos 6 resíduos contíguos de comprimento.

Apresenta-se um polipéptido purificado que inclui uma sequência de aminoácidos da fórmula: Gly-Xaai-Xaa2-Xaa3-

Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaaio-Xaaii-Xaai2-Xaai3-Xaai4-Xaai5-Xaai6-Xaai7-Xaai8-Xaai9-Xaa2o-Xaa2i-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa29-Xaa3o-Xaa3i-Xaa32 (SEQ ID N°: 20) , em que Xaai é Glu ou Lys; Xaa2 é Pro, His ou Arg; Xaa3 é Pro ou Leu; Xaa4 é Pro, Leu ou Ser; Xaa5 é Cys ou Pro; Xaa6 é Pro, His, Gin ou Arg; Xaa7 é Arg, Phe ou Leu; Xaa8 é Asp, Gly ou está ausente; Xaa8 é Ser, Pro ou Leu; Xaaio é Pro ou está ausente; Xaan é Ser, Ala ou está ausente; Xaai2 é Pro ou Ala; Xaai3 é Ala, Phe, Ile ou Leu; Xaai4 é Pro, Lys ou

Leu; Xaais é Vai, Leu ou Trp; Xaai6 é Cys, His ou Vai; Xaai7 é Asp, Ala, Ile, Thr, Pro ou Arg; Xaais é Thr, Pro ou His; Xaai9 é Vai, Ile, Pro, Vai, Ser ou Leu; Xaa2o é Arg, Ser, Ile ou Glu; Xaa2i é Vai, Ile, Ala ou Pro; Xaa22 é Thr, Vai ou Leu; Xaa23 é Leu, Ser ou His; Xaa24 é Gly ou Ala; Xaa2s é Phe, Ser, Thr ou Leu; Xaa26 é Vai, Asp ou Leu; Xaa27 é Vai, Leu ou Ser; Xaa28 é Ser, Arg ou Leu; Xaa29 é Asn, Asp, Pro ou Thr; Xaa30 é Hes, Gin, Asn ou Thr; Xaa3i é Thr, Ile ou Ser; e Xaa32 é Pro, Leu ou Glu.

Apresenta-se um procedimento para diagnosticar uma afecção cardíaca num doente. O procedimento inclui proporcionar uma amostra biológica do doente; detectar a presença, ausência ou nível de BNP2 ou BNP3 na amostra biológica; e classificar o doente como um doente que tem a afecção cardíaca ou que não tem a afecção cardíaca com 6 base, pelo menos em parte, na presença de BNP2 ou BNP3, o nível de BNP2 ou BNP3, ou a ausência de BNP2 ou BNP3. A afecção cardíaca pode ser insuficiência cardíaca, angina instável, enfarte agudo de miocárdio ou hipertensão. Pode detectar-se a presença, ausência ou nível de BNP2 ou pode detectar-se a presença, ausência ou nível de BNP3. Nalgumas realizações, detecta-se a presença, ausência ou nível de BNP2 e BNP3.

Também é possível diagnosticar uma afecção cardíaca num doente proporcionando uma amostra biológica do doente; detectando a presença, ausência ou nível de um ácido ribonucleico que codifica BNP2 ou BNP3 na amostra biológica; e classificando o doente como um doente que tem a afecção cardíaca ou que não tem a afecção cardíaca com base, pelo menos em parte, na presença do ácido ribonucleico que codifica BNP2 ou BNP3, o nível do ácido ribonucleico que codifica BNP2 ou BNP3, ou a ausência do ácido ribonucleico que codifica BNP2 ou BNP3. A afecção cardíaca pode ser insuficiência cardíaca, angina instável, enfarte agudo de miocárdio ou hipertensão.

Apresenta-se um procedimento para tratar uma afecção cardíaca num mamífero. 0 procedimento inclui administrar um polipéptido ou um ácido nucleico ao mamífero em condições nas quais se reduz a gravidade de um sintoma da afecção cardíaca. 0 polipéptido inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 35 ou 36; uma sequência que tem pelo menos 6 resíduos contíguos da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2; uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°:2; e uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com um fragmento da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 de pelo menos 6 resíduos contíguos de comprimento. A sequência de aminoácidos pode ter pelo menos 7 75% de identidade de sequência (por exemplo, 80, 90 ou 95%) com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 ou pelo menos 75% (por exemplo, 80, 90 ou 95%) de identidade de sequência com um fragmento da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 de pelo menos 6 resíduos contíguos de comprimento. Nalgumas realizações, o polipéptido pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 35 ou SEQ ID N°: 36. O ácido nucleico contém uma sequência que codifica um polipéptido descrito anteriormente. O polipéptido pode ser codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID N°: 5; a sequência de ácido nucleico dos nucleótidos 383 a 489 da SEQ ID N°:5; a sequência de ácido nucleico da SEQ ID N°: 6; ou a sequência de ácido nucleico dos nucleótidos 388 a 432 da SEQ ID N°: 6. A afecção cardíaca pode ser insuficiência cardíaca, angina instável, enfarte agudo de miocárdio e/ou hipertensão.

Apresenta-se um procedimento para tratar uma afecção renal num mamífero. O procedimento inclui administrar um polipéptido ou um ácido nucleico ao mamífero em condições nas quais se reduz a gravidade de um sintoma da afecção renal. O polipéptido inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada entre o grupo que consiste na sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 35 ou 36; uma sequência que tem pelo menos 6 resíduos contíguos da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2; uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2; e uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com um fragmento da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 de pelo menos 6 resíduos contíguos de comprimento. A sequência de aminoácidos pode ter pelo menos 75% (por exemplo 80, 90 ou 95%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 ou pelo menos 75% (por exemplo 80, 90 ou 95%) de identidade de sequência com um fragmento da SEQ ID N°: 1 ou 8 a SEQ ID N°: 2 de pelo menos 6 resíduos contíguos de comprimento. 0 polipéptido pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 35 ou a SEQ ID N°: 36. 0 ácido nucleico contém uma sequência que codifica um polipéptido descrito anteriormente. 0 polipéptido pode ser codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID N°: 5; a sequência de ácido nucleico dos nucleótidos 383 a 489 da SEQ ID N°: 5; a sequência de ácido nucleico da SEQ ID N°: 6; ou a sequência de ácido nucleico dos nucleótidos 388 a 432 da SEQ ID N°: 6. A afecção renal pode ser insuficiência renal.

Apresenta-se um procedimento para aumentar GMPc num mamífero. 0 procedimento inclui administrar um polipéptido descrito no presente documento ou um ácido nucleico que codifica esse polipéptido ao mamífero em condições nas quais se aumenta o nível de GMPc dentro do mamífero.

Apresenta-se um procedimento para dilatar uma artéria dentro de um mamífero. 0 procedimento inclui administrar um polipéptido descrito no presente documento ou num ácido nucleico que codifica esse polipéptido ao mamífero em condições nas quais essa artéria é dilatada.

Apresenta-se um procedimento para aumentar a diurese e/ou natriurese num mamífero. 0 procedimento inclui administrar um polipéptido descrito no presente documento ou um ácido nucleico que codifica esse polipéptido ao mamífero em condições nas quais aumenta a diurese e/ou natriurese.

Apresenta-se um anticorpo purificado. 0 anticorpo une-se a um polipéptido de BNP2, e não se une a um polipéptido de BNP que consiste na sequência exposta na SEQ ID N°: 16 ou a um polipéptido de BNP 3 que consiste na sequência exposta na SEQ id N°: 4. 0 polipéptido de BNP2 pode conter a sequência exposta na SEQ ID N°: 1. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. 9

Apresenta-se um anticorpo purificado. 0 anticorpo une-se a um polipéptido de BNP 3, e não se une a um polipéptido de BNP que consiste na sequência exposta na SEQ id N°: 16 ou a um polipéptido de BNP 2 que consiste na sequência exposta na SEQ ID N°: 3. 0 polipéptido de BNP3 pode conter a sequência exposta na SEQ ID N°: 2. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal.

Excepto se forem definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que habitualmente lhe é dado por um especialista na matéria à qual pertence a presente invenção. Mesmo que na prática ou verificação da presente invenção possam ser utilizados procedimentos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento, de seguida descrevem-se procedimentos e materiais adequados. Em caso de conflito, regerá a presente memória descritiva, incluindo as definições nela contidas. Por outro lado, os materiais, procedimentos e exemplos são apenas ilustrativos e não devem ser considerados limitadores.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os gráficos IA e 1B são as sequências de nucleótidos e de aminoácidos de BNP2 humano (SEQ ID N°: 3) e de cão (SEQ ID N°: 14), respectivamente. As sequências sublinhadas representam os péptidos maduros. 0 Gráfico 2 é a sequência de nucleótidos e de aminoácidos de BNP-3 humano (SEQ ID N°: 4). A sequência sublinhada representa o péptido maduro. 0 Gráfico 3 é um alinhamento de sequências do polipéptido C-terminal de BNP2 de orangotango (SEQ ID N°: 7); porco (SEQ ID N°: 8); chimpanzé (SEQ ID N°: 9); ovelha (SEQ ID N°: 10); ratinho (SEQ ID N°: 11); humano (SEQ ID N°: 3); gorila (SEQ ID N°: 12); gato (SEQ ID N°: 13); cão (SEQ ID N°: 14) e serpente (SEQ ID N°: 15). 10

O Gráfico 4 contém as sequências de aminoácidos de BNP (SEQ ID N°: 16); DNP (SEQ ID N°: 17); ΆΝΡ (SEQ ID N° : 18) e CNP (SEQ ID N°: 19) .

DESCRIÇÃO DETALHADA

Apresentam-se isoformas de BNP, incluindo polipéptidos de BNP2 e BNP3, e procedimentos de uso das isoformas como marcadores para diversas afecções cardíacas, incluindo insuficiência cardíaca, hipertensão, angina instável, morte súbita cardíaca e enfarte agudo de miocárdio, bem como insuficiência renal. Como se descreve no presente documento, ο BNP2 e ο BNP3 estão presentes em amostras biológicas de doentes com insuficiência cardíaca mas estão ausentes ou em baixos níveis em amostras biológicas de doentes de controlo. Por conseguinte, a presença ou nível de BNP2 ou BNP3 pode ser detectado em amostras biológicas e usar-se para diagnosticar afecções cardíacas, supervisionar o tratamento de afecções cardíacas ou tratar a progressão de doenças cardíacas. A presença ou nível de isoformas de BNP pode ser avaliado medindo polipéptidos de BNP2 ou BNP3 ou ácidos ribonucleicos que codificam BNP2 ou BNP3 como se descreve mais à frente.

Por outro lado, os polipéptidos proporcionados no presente documento (por exemplo, BNP2 e BNP3), bem como os ácidos nucleicos que codificam esses polipéptidos podem ser utilizados como produtos terapêuticos para o tratamento de afecções cardíacas e/ou afecções renais. Os efeitos terapêuticos do BNP2 e o BNP3 podem ser semelhantes aos do BNP, que é um vasodilatador equilibrado sem propriedades inotrópicas nem cronotrópicas. A terapia intravenosa com BNP recombinante (Nesiritide, Natrecor®) reduz de forma significativa a pressão de encravamento capilar pulmonar e a resistência vascular sistémica e aumenta o índice cardíaco. O BNP não é pro-arrítmico e não tem efeito sobre o ritmo cardíaco. Burger e Burger, Curr. Opin. Investig. Drugs 2 (7):929-35 (2001). 11

Os polipéptidos proporcionados no presente documento (por exemplo, BNP2 e BNP3) ou os ácidos nucleicos que codificam esse polipéptidos podem ser utilizados para estimular GMPc e/ou vasodilatar artérias num mamífero. Além disso, os polipéptidos proporcionados no presente documento (por exemplo, BNP2 e BNP3) ou os ácidos nucleicos que codificam esses polipéptidos podem utilizar-se para tratar hipertensão, hipertensão pulmonar e/ou insuficiência cardíaca congestiva. Os polipéptidos proporcionados no presente documento (por exemplo, BNP2 e BNP3) ou os ácidos nucleicos que codificam esse polipéptidos podem ser utilizados para aumentar a diurese e/ou natriurese num mamífero. Por exemplo, pode ser administrado um polipéptido de BNP2 ou BNP3 a um mamífero para aumentar o fluxo de urina e a excreção de sódio na urina. Por outro lado, os polipéptidos proporcionados no presente documento (por exemplo BNP2 e BNP3) ou os ácidos nucleicos que codificam esses polipéptidos podem ser utilizados para tratar um estado de sobrecarga de fluído (por exemplo, insuficiência cardíaca congestiva, insuficiência hepática e insuficiência renal) e/o para tratar um estado de sobrecarga de sódio (por exemplo, insuficiência cardíaca congestiva).

Isoformas de BNP A invenção refere-se a isoformas purificadas de BNP. Como no presente documento é utilizada a expressão "purificado" com referência a uma isoforma de BNP, significa que o polipéptido carece substancialmente de outros polipéptidos, lípidos, carboidratos e ácidos nucleicos com os que está associado de forma natural. Desta forma, um polipéptido purificado é qualquer polipéptido que é retirado do seu meio natural e tem una pureza de pelo menos 60 por cento. Um polipéptido purificado pode ter uma pureza de pelo menos aproximadamente 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 por cento. Tipicamente, um polipéptido 12 purificado produzirá uma banda principal única num gel de poliacrilamida não redutor.

Uma isoforma de BNP refere-se a qualquer polipéptido que (1) tem a sequência de aminoácidos exposta na SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 14, 35 ou 36, (2) contém uma sequência de aminoácidos que tem um comprimento de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais resíduos de aminoácidos com pelo menos aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 por cento de identidade sobre esse comprimento com a sequência de aminoácidos exposta na SEQ ID N°: 1 ou 2, ou (3) contém aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais resíduos de aminoácidos consecutivos codificados por uma sequência de ácido nucleico que híbrida, em condições de hibridação (ver mais à frente) com a cadeia no sentido ou antisentido de um ácido nucleico que codifica a sequência exposta na SEQ ID N°: 1 ou 2. Por exemplo, um polipéptido pode conter uma sequência de aminoácidos de 10, 15, 20, 25, 30 ou mais resíduos de comprimento e ter pelo menos 45% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1, que contém o fragmento C-terminal de 33 aminoácidos do BNP2 humano (ver o gráfico IA) . A sequência de aminoácidos de comprimento completa do BNP2 humano expõe-se na SEQ ID N°: 3 e a sequência do polipéptido de BNP2 maduro expõe-se na SEQ ID N°: 36 (ver a sequência sublinhada no gráfico IA). A SEQ ID N°: 2 contém o fragmento C-terminal de 14 aminoácidos do BNP3 humano (ver o gráfico 2) . A sequência de aminoácidos de comprimento completo do BNP3 humano expõe-se na SEQ ID N°: 4, enquanto a sequência do polipéptido de BNP3 maduro expõe-se na SEQ ID N°: 35 (ver a sequência sublinhada no gráfico 2) .

Os exemplos não limitadores de sequências polipeptídicas que têm pelo menos 45% de identidade com a sequência polipeptídica exposta na SEQ ID N°: 1 incluem as sequências do polipéptido C-terminal de BNP2 representadas 13 no gráfico 3. Por exemplo, as sequências C-terminais de BNP2 de ser humano (SEQ ID N°: 1) e porco (SEQ ID N°: 8) têm aproximadamente 48% de identidade. As sequências C-terminais de BNP2 de humano (SEQ ID N°: 1) e ratinho (SEQ ID N°: 11) têm aproximadamente 67% de identidade. As sequências C-terminais de BNP2 de humano (SEQ ID N°: 1) e orangotango (SEQ ID N°: 7) têm aproximadamente 91% de identidade. As sequências C-terminais de BNP2 de humano (SEQ ID N°: 1), chimpanzé (SEQ ID N°: 9) e gorila (SEQ ID N°: 12) têm aproximadamente 97% de identidade. O comprimento e a percentagem de identidade sobre esse comprimento para qualquer sequência de aminoácidos se determinam como se indica de seguida. Em primeiro lugar, compara-se uma sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos identificada (por exemplo, SEQ ID N°: 1) utilizando o programa BLAST 2 Sequences (B12seq) da versão independente de BLASTZ que contém BLASTN versão 2.0.14 e BLASTP versão 2.0.14. Esta versão independente de BLASTZ pode obter-se na rede mundial (world wide web) no website de Fish & Richardson P.C. ("fr" dot "com/blast/") ou no website do Centro Nacional do Governo dos Estados Unidos para a Informação Biotecnológica ("ncbi" dot "nlm" dot "nih" dot "gov"). A versão independente de BLASTZ também se pode obter a partir da biblioteca na Universidade Estadual de Nova Iorque em Old Westbury, com o número de classificação QH 447.M6714. Podem encontrar-se instruções que explicam como utilizar o programa B12seq no arquivo de leitura que acompanha a BLASTZ. O Bl2seq realiza uma comparação entre duas sequências utilizando o algoritmo BLASTN ou BLASTP. Utiliza-se o BLASTN para comparar sequências de ácido nucleico, no entanto se usa BLASTP para comparar sequências de aminoácidos.

Para comparar duas sequências de aminoácidos, as opções de Bl2seq são as seguintes: -i atribui-se a um arquivo que contém a primeira sequência de aminoácidos a 14 comparar (por exemplo, C:\seql.txt); -j atribui-se a um arquivo que contém a sequnda sequência de aminoácidos a comparar (por exemplo, C:\seq2.txt); -p atribui-se a blastp; -o atribui-se a qualquer nome de arquivo pretendido (por exemplo, C:\output.txt); e todas as outras opções deixam-se seleccionadas por defeito. Por exemplo, pode ser utilizado o seguinte comando para criar um arquivo de saida com uma comparação entre duas sequências de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seql.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Se a sequência diana partilha homologia com qualquer parte da sequência identificada, então o arquivo de saida concebido apresentará essas regiões de homologia como sequências alinhadas. Se a sequência diana não partilha homologia com nenhuma parte da sequência identificada, então o arquivo de saida designado não apresentará sequências alinhadas. Uma vez alinhadas, determina-se o comprimento contando o número de resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência diana apresentada no alinhamento com a sequência da sequência identificada (por exemplo, SEQ ID N°: 1) começando com qualquer posição coincidente e terminando com qualquer outra posição coincidente. Uma posição coincidente é qualquer posição em que está presente um resíduo de aminoácido idêntico tanto na sequência diana como na sequência identificada. As cavidades apresentadas na sequência diana não são consideradas uma vez que as cavidades não são resíduos de aminoácidos. De forma semelhante, as cavidades apresentadas na sequência identificada não são consideradas uma vez que são considerados os resíduos de aminoácidos da sequência diana, não resíduos de aminoácidos da sequência identificada. A percentagem de identidade sobre um comprimento determinado é calculada contando o número de posições coincidentes sobre esse comprimento e dividindo esse número pelo comprimento seguido da multiplicação do valor 15 resultante por 100. Por exemplo, se (1) for comparada uma sequência diana de 50 aminoácidos com a sequência exposta na SEQ N°: 1, (2) o programa Bl2seq apresenta 20 resíduos de aminoácidos da sequência diana alinhados com uma região a sequência exposta na SEQ ID N°: 1 em que o primeiro e o último resíduos de aminoácidos dessa região de 20 aminoácidos são coincidências, e (3) o número de coincidências sobre esses 20 aminoácidos alinhados é 18, então a sequência diana de 50 aminoácidos contém um comprimento de 20 e uma percentagem de identidade sobre esse comprimento de 90 (isto é, 18 1 20 * 100 = 90) .

Apreciar-se-á que apenas uma sequência diana de aminoácidos que se alinha com a sequência exposta na SEQ N°: 1 pode ter muitos comprimentos diferentes, sendo que cada comprimento tem a sua própria percentagem de identidade. Deve considerar-se que o valor de identidade em percentagem se arredonda à dezena mais próxima. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13 e 78,14 se arredonda para abaixo a 78,1, enquanto 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 e 78,19 se arredonda para acima a 78,2. Também deve ter-se em conta que o valor de comprimento sempre será um número inteiro.

As condições de hibridação podem ser condições de hibridação moderadamente ou altamente rigorosas. Para a finalidade da presente invenção, as condições de hibridação moderadamente rigorosas significam que a hibridação se realiza a aproximadamente 42°C numa solução de hibridação que contém KP04 25 mM (pH 7,4), SSC 5X, solução de Denhart 5X, 50 μg/ml de ADN de esperma de salmão sonicado, desnaturado, formamida a 50%, sulfato de dextrano a 10% e 1-15 ng/ml de sonda (aproximadamente 5 x 107 cpm/^g), enquanto as lavagens são realizadas a aproximadamente 50°C com uma solução de lavagem que contém SSC 2x e dodecil sulfato de sódio a 0,1%.

As condições de hibridação altamente rigorosas significam que a hibridação se realiza a aproximadamente a 16 42°C numa solução de hibridação que contém KP04 25 mM (pH 7,4), SSC 5X, solução de Denhart 5X, 50 μς/ιπΐ de ADN de esperma de salmão sonicado, desnaturado, formamida a 50%, sulfato de dextrano a 10% e 1-15 ng/ml de sonda (aproximadamente 5 x ΙΟ7 οριη/μς), enquanto as lavagens realizam-se a aproximadamente 65°C com uma solução de lavagem que contém SSC 0,2X e dodecil sulfato de sódio a 0,1%.

Apresenta-se uma isoforma de BNP que pode estimular a produção de GMPc em células endoteliais humanas do cordão umbilical (HUVEC). A produção de GMPc intracelular pode ensaiar-se utilizando, por exemplo, o kit de imuno-ensaio enzimático BIOTRACK CGMP (Amersham Pharmacia Biotech). A isoforma de BNP pode ser vasoactiva. A vasoactividade pode avaliar-se determinando a resposta de um vaso sanguíneo (por exemplo, uma artéria carótida numa câmara de órgão) à isoforma.

As isoformas de BNP podem ser obtidas por extracção a partir de uma fonte natural (por exemplo, a partir de células isoladas, tecidos ou fluidos corporais), por expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica o polipéptido, ou por síntese química. Por exemplo, pode ser utilizada tecnologia recombinante convencional utilizando vectores de expressão que codificam isoformas de BNP (como se descreve mais à frente). Os polipéptidos resultantes depois podem ser purificados utilizando, por exemplo, técnicas cromatográficas de afinidade e HPLC. O grau de purificação pode ser medido por qualquer procedimento apropriado, incluindo, mas sem limitação: cromatografia em coluna, electroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia liquida de alta resolução. As isoformas de BNP podem "ser alteradas por engenharia genética" para que contenham uma sequência marcadora que permita purificar o polipéptido (por exemplo, recolher numa matriz de afinidade). Por exemplo, pode usar-se um marcador como c- 17 myc, hemaglutinina, polihistidina ou um marcador Flag™ (Kodak) para ajudar à purificação do polipéptido. Estes marcadores podem ser inseridos em qualquer local dentro do polipéptido, incluindo o extremo carboxilo ou amino. Outras fusões que podem ser utilizadas incluem enzimas que ajudam à detecção do polipéptido, como fosfatase alcalina.

Podem produzir-se péptidos natriuréticos quiméricos que contêm duas regiões, uma primeira região que inclui o extremo N e a estrutura de anel de um polipéptido natriurético maduro (por exemplo, BNP, DNP, ANP ou CNP) e uma segunda região que inclui a parte C-terminal de uma isoforma de BNP. 0 extremo N e a estrutura de anel de BNP incluem os resíduos 1 a 27 da SEQ ID N°: 16, enquanto o extremo N e as estruturas de anel de DNP e ANP incluem os resíduos 1 a 23 da SEQ ID N°: 17 e a SEQ ID N°: 18,

respectivamente. As sequências de BNP, DNP, ANP e CNP apresentam-se no gráfico 4. Noutras realizações, a primeira região pode conter o extremo N e a estrutura de anel de um polipéptido natriurético com uma a cinco substituições de aminoácidos. As partes C-terminais adequadas de uma isoforma de BNP têm uma identidade de pelo menos 45% com as sequências de aminoácidos das SEQ ID N°: 1 e 2, como foi analisado anteriormente. A parte C-terminal pode ter a sequência exposta na SEQ ID N°: 20 (descrita mais à frente) . Os polipéptidos quiméricos podem ter actividades biológicas de péptidos natriuréticos, incluindo a capacidade de estimular a produção de GMP cíclico em células ou a vasoactividade.

Apresenta-se um polipéptido que pode ter a sequência disposta na fórmula: Gly-Xaai -Xaa 2 -Xaa3 -Xaa4 -Xaa5 -Xaa6 -Xaa7 — Xaa8 — Xaa9 — Xaa4o —Xaan — Xaa42 —Xaa43 —Xaa44 — Xaa45 —Xaa26 — Xaa47 —Xaa48 — Xaa49 —Xaa2o — Xaa24 — Xaa22 —Xaa23 —Xaa24 —Xaa2s — Xaa26 —Xââ27 — Xââ28 — Gly—Xââ29 —Xââ3o _Xââ34 — Xââ32, (SEQ ID N° 20) , em que Xaa4 é Glu ou Lys; Xaa2 é Pro, His ou Arg; Xaa3 é Pro ou Leu; Xaa4 é Pro, Leu ou Ser; Xaa5 é Cys ou Pro; Xaa 6 é 18

Pro, His, Gin ou Arg; Xaa7 é Arg, Phe ou Leu; Xaa 8 é Asp, Gly ou está ausente; Xaa9 é Ser, Pro ou Leu; Xaaio é Pro ou está ausente; xaan é Ser, Ala ou está ausente; Xaa22 é Pro ou Ala; Xaai3 é Ala, Phe, Ile ou Leu; Xaa^ é Pro, Lys ou Leu; Xaai5 é Vai, Leu ou Trp; Xaai6 é Cys, His ou Vai; Xaai7 é Asp, Ala, Ile, Thr, Pro ou Arg; Xaai8 é Thr, Pro ou His; Xaaig é Vai, Ile, Pro, Vai, Ser ou Leu; Xaa2o é Arg, Ser, Ile ou Glu; Xaa2i é Vai, Ile, Ala ou Pro; Xaa22 é Thr, Vai ou Leu; Xaa23 é Leu, Ser ou His; Xaa24 é Gly ou Ala; Xaa2s é Phe, Ser, Thr ou Leu; Xaa26 é Vai, Asp ou Leu; Xaa27 é Vai, Leu ou Ser; Xaa28 é Ser, Arg ou Leu; Xaa29 é Asn, Asp, Pro ou Thr; Xaa30 é His, Gin, Asn ou Thr; Xaa32 é Thr, Ile ou Ser; e Xaa32 é Pro, Leu ou Glu. Os aminoácidos expostos em cada posição da SEQ ID N°: 20 representam os resíduos que estão presentes nos polipéptidos de BNP2 naturais, incluindo BNP2 de humanos (SEQ ID N°: 3); orangotango (SEQ ID N°: 7), chimpanzé (SEQ ID N°: 9); gorila (SEQ ID N°: 12); gato (SEQ ID N°: 12); cão (SEQ ID N°: 14); ratinho (SEQ ID N°: 11); ovelha (SEQ ID N°: 10); e porco (SEQ ID N°: 8). Um ácido nucleico que codifica esses polipéptidos pode produzir-se como se descreve mais à frente.

Os polipéptidos podem ser formulados como composições farmacêuticas através da mistura com excipientes ou veículos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. Estas composições podem ser administradas a um sujeito que o necessite numa quantidade eficaz para tratar uma afecção cardíaca ou uma afecção renal. As composições farmacêuticas podem ser preparadas para administração parentérica, particularmente em forma de soluções ou suspensões líquidas em soluções aquosas com tampão fisiológico; para administração oral, particularmente em forma de comprimidos ou cápsulas; ou para administração intranasal, particularmente em forma de pós, gotas nasais ou aerossóis. Podem ser preparadas composições para outras vias de 19 administração, quando se pretender, utilizando procedimentos convencionais.

As formulações para administração parentérica podem conter como excipientes comuns água ou solução salina estéril, glicol de polialquilenos como polietilenglicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e semelhantes. Em particular, são exemplos de excipientes para controlar a libertação do polipéptido in vivo polímero de lactida biodegradável, biocompatível, copolímero de lactida/glicolida ou copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno. Outros sistemas de libertação parenteral adequados incluem partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis e lipossomas. As formulações para a administração por inalação podem conter excipientes como lactose, se desejado. As formulações de inalação podem ser soluções aquosas que contêm, por exemplo, polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato e desoxicolato, ou podem ser soluções oleosas para a administração em forma de gotas nasais. Se pretendido, os compostos podem ser formulados como gel para se aplicar por via intranasal. As formulações para administração parentérica também podem incluir glicocolato para administração bucal.

Para a administração oral, podem ser preparados comprimidos ou cápsulas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis como agentes aglutinantes (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou fosfato ácido de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou silício); desagregante (por exemplo, fécula de batata o amidoglicolato de sódio); ou agentes humectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem revestir-se por procedimentos conhecidos na técnica. Também podem formular-se preparações 20 para administração oral para proporcionar a libertação controlada do composto.

As preparações nasais podem apresentar-se em forma liquida ou como um produto seco. As suspensões ou soluções aquosas nebulizadas podem incluir veículos ou excipientes para ajustar o pH e/ou a tonicidade.

Ácidos Nucleicos que Codificam isoformas de BNP A invenção também se refere a ácidos nucleicos isolados que codificam polipéptidos de BNP. O termo "isolado", como é utilizado no presente documento com referência a ácidos nucleicos, refere-se a um ácido nucleico natural que não é imediatamente contíguo às duas sequências com as quais está imediatamente contíguo (uma no extremo 5' e a outra no extremo 3') no genoma natural do organismo de que provém. Por exemplo, um ácido nucleico isolado pode ser, sem limitação, uma molécula de ADN recombinante de qualquer comprimento, sempre que uma das sequências de ácido nucleico normalmente encontrada a flanquear imediatamente essa molécula de ADN recombinante num genoma natural se tenha retirado ou esteja ausente. Desta forma, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, um ADN recombinante que existe como uma molécula separada (por exemplo, um ADNc ou um fragmento de ADN genómico produzido por PCR ou tratamento com endonucleases de restrição) independente de outras sequências, bem como um ADN recombinante que se incorpora num vector, um plasmídeo de replicação autónoma, um vírus (por exemplo, um retrovírus, adenovírus ou herpesvírus) ou no ADN genómico de um procariota ou eucariota. Por outro lado, um ácido nucleico isolado pode incluir uma molécula de ADN recombinante que faz parte de uma sequência de ácido nucleico híbrida ou de fusão. O termo "isolado", como é utilizado no presente documento com referência a um ácido nucleico, também inclui qualquer ácido nucleico não natural, uma vez que as 21 sequências de ácido nucleico não naturais não se encontram na natureza e não têm sequências imediatamente contíguas num genoma natural. Por exemplo, um ácido nucleico não natural como um ácido nucleico modificado por engenharia genética considera-se um ácido nucleico isolado. 0 ácido nucleico obtido por engenharia genética (por exemplo, um ácido nucleico que codifica o polipéptido da SEQ ID N°: 20) pode fabricar-se utilizando clonagem molecular comum ou técnicas químicas de síntese de ácidos nucleicos. O ácido nucleico não natural isolado pode ser independente de outras sequências, ou pode estar incorporado num vector, num plásmídeo de replicação autónoma, num vírus (por exemplo, num retrovírus, adenovírus o herpesvírus) ou no adn genómico de um procariota ou eucariota. Além disso, um ácido nucleico não natural pode incluir uma molécula de ácido nucleico que faz parte de uma sequência de ácido nucleico híbrida ou de fusão. Um ácido nucleico que existe entre centos a milhões de outros ácidos nucleicos dentro de, por exemplo, bibliotecas de ADNc ou bibliotecas genómicas, ou cortes de gel que contêm um produto de digestão de restrição de adn genómico, não se considera um ácido nucleico isolado.

Como é utilizado no presente documento, a expressão "ácido nucleico" refere-se tanto ao ARN como ao ADN, incluindo ARNm, ADNc, ADN genómico, ADN sintético (por exemplo, sintetizado quimicamente) e análogos de ácido nucleico. O ácido nucleico pode ser bicatenário ou monocatenário, e quando é monocatenário, pode ser a cadeia com sentido ou a cadeia antisentido. Por outro lado, o ácido nucleico pode ser circular ou linear. Os análogos de ácido nucleico podem estar modificados no resto da base, o resto do açúcar ou o esqueleto de fosfato para melhorar, por exemplo, a estabilidade, hibridação ou solubilidade de um ácido nucleico. As modificações no resto da base incluem desoxiuridina para desoxitimidina, e 5-metil-2'- 22 desoxicitidina e 5-bromo-2'-desoxicitidina para desoxicitidina. As modificações no resto do açúcar podem incluir modificação do hidroxilo 2' do açúcar de ribose para formar 2'-0-metil ou 2'-0-alil açúcares. 0 esqueleto de desoxirribose fosfato pode modificar-se para produzir ácidos morfolino nucleicos, nos quais cada resto de base está unido a um anel morfolino de seis elementos, ou ácidos péptido nucleicos, nos quais o esqueleto de desoxifosfato está substituído por um esqueleto de pseudopéptido e conservam-se as quatro bases. Ver, por exemplo, Summerton e Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 7:187-195; e Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4: 5-23. Ainda, o esqueleto de desoxifosfato pode substituir-se, por exemplo, por um esqueleto de fosforotioato ou fosforoditioato, uma fosforamidita ou um esqueleto de alquilo fosfotriéster.

Os ácidos nucleicos podem ter a sequência exposta na SEQ ID N°: 5 ou 6 (ver os gráficos 1 e 2) ou ter uma sequência com uma identidade de pelo menos 45% (por exemplo, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 de identidade) com a sequência exposta nos nucleótidos 383 a 489 da SEQ ID N°: 5 ou os nucleótidos 388 a 432 da SEQ ID N°: 6. Os nucleótidos 383 a 489 da SEQ ID N°: 5 codificam a sequência de aminoácidos exposta na SEQ ID N°: 1. Os nucleótidos 388 a 432 da SEQ ID N°: 6 codificam a sequência de aminoácidos exposta na SEQ ID N°: 2. A identidade de sequência pode determinar-se como foi descrito anteriormente. Utiliza-se BLASTN para comparar sequências de ácido nucleico. Para comparar duas sequências de ácido nucleico, as opções são as seguintes: -i atribui-se a um arquivo que contém a primeira sequência de ácido nucleico a comparar (por exemplo, C:\seql.txt); -j atribui-se a um arquivo que contém a segunda sequência de ácido nucleico a comparar (por exemplo, C:\seq2.txt); -p atribui-se a blast; -o atribui-se a qualquer nome de arquivo pretendido (por exemplo, C:\output.txt); -q atribui-se a - 23 1; -r atribui-se a 2; e todas as outras opções ficam por defeito. 0 seguinte comando criará um arquivo de saida que contém uma comparação entre duas sequências: C:\Bl2seq -i c:\seql.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Se a sequência diana partilhar homologia com qualquer parte da sequência identificada, então o arquivo de saida designado apresentará essas regiões de homologia como sequências alinhadas. Se a sequência diana não partilha homologia com nenhuma parte da sequência identificada, então o arquivo de saida atribuído não qpresentará sequências alinhadas.

Uma vez alinhada, determina-se um comprimento contando o número de nucleótidos consecutivos da sequência diana apresentada em alinhamento com a sequência da sequência identificada começando com qualquer posição coincidente e terminando com qualquer outra posição coincidente. Uma posição coincidente é qualquer posição em que estiver presente um nucleótido idêntico tanto na sequência diana como na sequência identificada. As cavidades apresentadas na sequência diana não se contam uma vez que as cavidades não são nucleótidos. De forma semelhante, as cavidades apresentadas na sequência identificada não se contam uma vez que se contam os nucleótidos da sequência diana, não os nucleótidos da sequência identificada.

Tipicamente, os ácidos nucleicos isolados têm pelo menos 10 nucleótidos de comprimento (por exemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400 ou mais nucleótidos de comprimento). As moléculas de ácido nucleico que são menores que o comprimento completo podem ser úteis, por exemplo, como iniciadores ou sondas para fins de diagnóstico. Podem produzir-se moléculas de ácido nucleico isoladas por técnicas convencionais, incluindo, sem limitação, clonagem molecular comum e técnicas químicas de síntese de ácidos nucleicos. Por exemplo, podem utilizar-se técnicas de reacção em cadeia da polimerase (PCR). A PCR 24 refere-se a um procedimento ou técnica em que são aumentados enzimaticamente ácidos nucleicos diana. Tipicamente utiliza-se informação de sequência desde os extremos da região de interesse ou mais além para conceber iniciadores oligonucleotidicos que sejam idênticos em sequência a cadeias opostas do molde a aumentar. Pode utilizar-se a PCR para aumentar sequências específicas a partir do ADN bem como a partir do ARN, incluindo sequências de ADN genómico total ou ARN celular total. Os iniciadores tipicamente têm de 15 a 50 nucleótidos de comprimento, mas podem variar de 10 nucleótidos a centenas de nucleótidos em comprimento. Por exemplo, um iniciador pode ser de 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40 ou 45 nucleótidos de comprimento. Um iniciador pode purificar-se a partir de um produto de digestão de restrição por procedimentos convencionais, ou pode sintetizar-se quimicamente. Os iniciadores são tipicamente monocatenários para conseguir uma eficácia máxima no aumento, mas um iniciador pode ser bicatenário. Os iniciadores bicatenários primeiro desnaturalizam-se (por exemplo, tratam-se com calor) para separar as cadeias antes da utilização no aumento. Descrevem-se técnicas da PCR gerais, por exemplo, na PCR Primeiro: A Laboratory Manual, ed. por Dieffenbach e Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Quando se usa ARN como fonte de molde, pode utilizar-se transcriptase inversa para sintetizar uma cadeia de ADN complementar (ADNc). Também se pode utilizar a reacção em cadeia da ligase, aumento com deslocamento em cadeia, replicação de sequência auto-sostida ou aumento baseado na sequência de ácido nucleico para obter ácidos nucleicos isolados. Ver, por exemplo, Lewis Genetic Engineering News 12 (9): 1 (1992); Guatelli et al. (1990) Proc. Natl Acad. Sei. USA, 87:1874-1878; e Weiss (1991) Science 254:1292. 25

Os ácidos nucleicos isolados também podem sintetizar-se quimicamente, como uma molécula só de ácido nucleico (por exemplo, utilizando síntese de adn automática na direcção 3' a 5' utilizando a tecnologia de fosforamidita) ou como uma série de oligonucleótidos. Por exemplo, podem sintetizar-se um ou mais pares de oligonucleótidos compridos (por exemplo, > 100 nucleótidos) que contenham a sequência pretendida, contendo cada par um segmento curto de complementariedade (por exemplo, de aproximadamente 15 nucleótidos) de tal forma que se forme um par quando se aqueça o par de oligonucleótidos. Utiliza-se ADN polimerase para estender os oligonucleótidos, dando como resultado apenas uma molécula de ácido nucleico bicatenária por par de oligonucleótidos, que depois se pode ligar a um vector.

Também se podem obter ácidos nucleicos isolados por mutagénese. Por exemplo, as sequências representadas nos gráficos 1, 2 ou 3 podem mutar-se utilizando técnicas convencionais como, por exemplo, mutagénese dirigida a oligonucleótido e/ou mutagénese dirigida de um locus através da PCR. Ver, Short Protocols in Molecular Biology, Capítulo 8, Green Publishing Associates e John Wiley & Sons, Editado por Ausubel et al 1992. Podem identificar-se exemplos de posições a modificar a partir do alinhamento de sequências do gráfico 3.

Os ácidos nucleicos que codificam um polipéptido proporcionado na presente invenção podem formular-se como composições farmacêuticas por mistura com excipientes ou veículos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. Estas composições podem administrar-se a um sujeito que o necessite numa quantidade eficaz para tratar uma afecção cardíaca ou uma afecção renal.

Vectores e Células Hospedeiras

Apresentam-se vectores que contêm ácidos nucleicos como os descritos anteriormente. Como é utilizado no presente documento, um "vector" é um replicão, como um 26 plasmideo, fago ou cosmideo, em que pode inserir-se outro segmento de ADN para produzir a replicação do segmento inserido. Os vectores podem ser vectores de expressão. Um "vector de expressão" é um vector que inclui uma ou mais sequências de controlo da expressão e uma "sequência de controlo da expressão" é uma sequência de ADN que controla e regula a transcrição e/ou tradução de outra sequência de ADN.

Nos vectores de expressão, o ácido nucleico está unido operativamente a uma ou mais sequências de controlo da expressão. Como é utilizado no presente documento, "unido operativamente" significa incorporado numa construção genética de forma que as sequências de controlo da expressão controlem eficazmente a expressão de uma sequência codificante de interesse. Os exemplos de sequências de controlo da expressão incluem promotores, potenciadores e regiões terminadoras da transcrição. Um promotor é uma sequência de controlo da expressão composta por uma região de uma molécula de ADN, tipicamente dentro de 100 nucleótidos a montante (upstream) do ponto em que inicia a transcrição (geralmente próximo do sitio de inicio para a ARN polimerase II) . Para ter uma sequência codificante sob o controlo de um promotor, é necessário colocar o sitio de inicio da tradução da fase de leitura de tradução do polipéptido entre um e, aproximadamente, cinquenta nucleótidos a jusante (downstream) do promotor. Os potenciadores proporcionam especificidade de expressão em termos de tempo, localização e nivel. Ao contrário dos promotores, os potenciadores podem funcionar quando estão localizados a diversas distâncias do sitio de transcrição. Um potenciador também pode estar localizado a jusante do sitio de inicio da transcrição. Uma sequência codificante está "unida operativamente" e "sob o controlo" de sequências de controlo da expressão numa célula quando a ARN polimerase pode transcrever a sequência codificante em 27 ARNm, que depois pode ser traduzida na proteína codificada pela sequência codificante.

Os vectores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmídeos e vectores virais provenientes de, por exemplo, bacteriófagos, baculovírus, vírus do mosaico do tabaco, herpesvírus, citomegalovírus, retrovírus, poxvírus, adenovírus e vírus adeno-associados. Inúmeros vectores e sistemas de expressão estão disponíveis no mercado em associações como Novagen (Madison, WI), Clontech (Paio Alto, CA), stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA).

Um vector de expressão pode incluir uma sequência marcadora concebida para facilitar a manipulação posterior da sequência de ácido nucleico expressada (por exemplo, purificação ou localização). As sequências marcadoras, como a proteína fluorescente verde (GFP), glutatião S- transferase (GST), polihistidina, c-myc, hemaglutinina ou o marcador Flag™ (Kodak, New Haven, CT) tipicamente expressam-se como uma fusão com o polipéptido codificado. Estes marcadores podem inserir-se em qualquer sítio dentro do polipéptido, incluindo o extremo carboxilo ou amino.

Apresentam-se células hospedeiras que contêm vectores da invenção. A expressão "célula hospedeira" pretende incluir células procariotas e eucariotas nas quais é possível introduzir um vector. Pode utilizar-se qualquer procedimento para introduzir um vector numa célula. Por exemplo, pode utilizar-se precipitação com fosfato de cálcio, electroporação, choque térmico, lipofecção, micro-injecção e transferência de ácidos nucleicos mediada por vírus para introduzir o ácido nucleico isolado nas células. Além disso, é possível fornecer ADN puro directamente às células in vivo como é descrito noutras partes (Patentes dos Estados Unidos N° 5.580.859 e 5.589.466).

Procedimentos para Utilizar BNP2 ου BNP3 para Diagnosticar Afecções cardíacas 28

Em geral, os procedimentos incluem detectar a presença ou ausência de uma isoforma de BNP numa amostra biológica de um doente (por exemplo, um doente humano) e diagnosticar ao doente com base na presença ou ausência da isoforma de BNP. Noutras realizações, é possível determinar o nível da isoforma de BNP e comparar-se com o nível da isoforma de uma população de controlo (por exemplo, o nível médio de BNP2 de uma pluralidade de sujeitos de controlo sem afecções cardíacas). Desta forma, a presença de uma isoforma de BNP ou um aumento no nível da isoforma respeitante à da população de controlo são indicadores de uma afecção cardíaca. As amostras biológicas adequadas para detectar isoformas de BNP incluem, por exemplo, sangue (incluindo sangue total, plasma e soro), urina, saliva, tecido cardíaco e células circulantes.

Outros factores que se podem considerar quando se diagnosticam afecções cardíacas podem incluir, por exemplo, a história familiar ou outros factores genéticos e os níveis de outros marcadores cardíacos como troponina I ou T, proteína C reactiva de alta sensibilidade (hs-CRP), creatina quinase (CK), CK-MB, creatinina ou mioglobina. Em geral, a mioglobina não é específica do coração, mas é libertada pelo miocárdio enfartado numa fase prematura (aproximadamente 2-3 horas após o enfarte) e volta ao nível normal em aproximadamente 24 horas. As isoformas cardíacas de troponina I e troponina T são específicas, mas aparecem na circulação após a mioglobina (de 5 a 48 horas após o enfarte). 0 tecido miocárdico contém uma isoforma de CK-MB, enquanto o tecido esquelético tem diferentes isoformas. Estão disponíveis no mercado anticorpos que têm afinidade de união específica por esses marcadores cardíacos.

Também é possível utilizar a presença, ausência ou nível de uma isoforma de BNP num sujeito para controlar o tratamento (por exemplo, tratamento com um inibidor de ACE ou um β bloqueante) para uma afecção cardíaca. Por exemplo, 29 o nível basal no sujeito de uma isoforma de BNP antes do tratamento pode ser comparado com o nível da isoforma em diferentes pontos de tempo após o tratamento (por exemplo, uma ou mais horas, dias, semanas ou meses após o tratamento) . Uma redução no nível da isoforma de BNP respeitante ao nivel basal é indicadora de uma resposta positiva ao tratamento. 0 tratamento pode ser controlado com base numa combinação da presença, ausência ou nível da isoforma de BNP e o nível de outros marcadores cardíacos como foi descrito anteriormente.

Detecção de Isoformas de BNP

As isoformas de BNP, como BNP2 ou BNP3, podem detectar-se, por exemplo, imunologicamente utilizando um ou mais anticorpos. Como são utilizados no presente documento, os termos "anticorpo" ou "anticorpos" incluem moléculas intactas bem como fragmentos das mesmas que se podem unir a um determinante epitópico de uma isoforma de BNP. O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigénico num antigénio com o qual se une o parátopo de um anticorpo. Os determinantes epitópicos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente activos de moléculas como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e tipicamente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos geralmente têm, pelo menos, cinco aminoácidos contíguos (um epítopo continuo) ou, como alternativa, podem ser uma série de aminoácidos não contíguos que definem uma estrutura particular (por exemplo, um epítopo conformacional) . Os termos "anticorpo" e "anticorpos" incluem anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados ou quiméricos, fragmentos de anticorpos Fv monocatenários, fragmentos Fab e fragmentos F(ab)2. Os anticorpos policlonais são populações heterogéneas de moléculas de anticorpo que estão contidas nos soros dos animais imunizados. Os anticorpos 30 monoclonais são populações homogéneas de anticorpos contra um epítopo particular de um antigénio.

Podem criar-se fragmentos de anticorpo que têm afinidade de união especifica por uma isoforma de BNP por técnicas conhecidas. Por exemplo, podem produzir-se fragmentos F(ab')2 por digestão com pepsina da molécula de anticorpo; podem criar-se fragmentos Fab por redução das pontes dissulfureto de fragmentos F(ab')2. Como alternativa, podem construir-se bibliotecas de expressão de Fab. Ver, por exemplo, Huse et al., Science 246:1275 (1989). Uma vez produzidos, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos ensaiam-se em relação ao reconhecimento de uma isoforma de BNP por procedimentos de imuno-ensaio convencionais que incluem técnicas ELISA, rádio imuno-ensaios e Transferência de Western. Ver, Short Protocols in Molecular Biology, Capitulo 11, Green Publishing Associates e John Wiley & Sons, Editado por Ausubel, F.M et al., 1992.

Nos ensaios imunológicos, um anticorpo que tem afinidade de união especifica por uma isoforma de BNP ou um anticorpo secundário que se une a esse anticorpo, podem marcar-se, directa ou indirectamente. Os marcadores adequados incluem, sem limitação, radionúclidos (por exemplo, 125I, 131I, 35S, 3H, 32P, 33P ou 14C), restos fluorescentes (por exemplo, fluoresceina, FITC, PerCP, rodamina ou PE), restos luminiscentes (por exemplo, nanoparticulas Qdot™ fornecidas pela Quantum Dot Corporation, Paio Alto, CA), compostos que absorvem luz de um comprimento de onda definido, ou enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano picante) . Os anticorpos podem marcar-se indirectamente por conjugação com biotina e depois detectar-se com avidina ou estreptavidina marcada com uma molécula descrita anteriormente. Os procedimentos para detectar ou quantificar um marcador dependem da natureza do marcador e conhecem-se na técnica. Os exemplos de detectores incluem, 31 sem limitação, películas de raios x, contadores de radiactividade, contadores de cintilação, espectrofotómetros, colorímetros, fluorómetros, luminómetros e densitómetros. Podem utilizar-se combinações destas abordagens (incluindo ensaios "multicamada") com as quais estarão familiarizados os especialistas na matéria, para melhorar a sensibilidade dos ensaios.

Podem realizar-se ensaios imunológicos para detectar uma isoforma de BNP numa diversidade de formatos conhecidos, incluindo ensaios duplos, ensaios de competição (RIA competitivo) ou imuno-ensaios de união. Ver, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos N° 5.296.347; 4.233.402; 4.098.876 e 4.034.074. Os procedimentos para detectar uma isoforma de BNP geralmente incluem pôr em contacto uma amostra biológica com um anticorpo que se une à isoforma de BNP e detectar a união da isoforma de BNP ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpo que tem afinidade de união especifica por uma isoforma de BNP pode imobilizar-se num substrato sólido por qualquer diversidade de procedimentos conhecidos na técnica e depois expor-se à mostra biológica. A união da isoforma de BNP ao anticorpo no substrato sólido pode detectar-se explorando o fenómeno de ressonância de plasmon de superfície, que tem como resultado uma mudança na intensidade de ressonância de plasmon de superfície após a união que se pode detectar qualitativa ou quantitativamente por um instrumento apropriado, por exemplo, um aparelho Biacore (Biacore International AB, Rapsgatan, Suécia). Como alternativa, o anticorpo é marcado e detectado como foi descrito anteriormente. Pode criar-se uma curva padrão utilizando quantidades conhecidas da isoforma para ajudar à quantificação dos níveis da isoforma.

Pode utilizar-se um ensaio tipo "duplo" em que um anticorpo de captura se imobiliza num substrato sólido para detectar a presença, ausência ou nível de uma isoforma de 32 ΒΝΡ. Ο substrato sólido pode pôr-se em contacto com a amostra biológica de tal forma que qualquer BNP2 ou BNP3 na amostra possa unir-se ao anticorpo imobilizado. A presença, ausência ou nivel da isoforma de BNP unida ao anticorpo pode determinar-se utilizando um anticorpo de "detecção" com afinidade de união especifica pela isoforma e os procedimentos descritos anteriormente. Nalgumas realizações, utiliza-se um anticorpo de captura que tem afinidade de união por BNP bem como por BNP2 e BNP3. Nesta realização, é possível usar um anticorpo de detecção com afinidade de união específica por BNP2 ou BNP3. Deve entender-se que nos ensaios tipo duplo, o anticorpo de captura não se deve unir ao mesmo epítopo (ou série de epítopos no caso de um anticorpo policlonal) que o anticorpo de detecção. Desta forma, se for utilizado um anticorpo monoclonal como anticorpo de captura, o anticorpo de detecção pode ser outro anticorpo monoclonal que se una a um epítopo que esteja completamente separado fisicamente ou apenas se sobreponha parcialmente com o epítopo a que se une o anticorpo monoclonal de captura, ou um anticorpo policlonal que se una a epítopos diferentes ou além do epítopo a que se une o anticorpo monoclonal de captura. Se for utilizado um anticorpo policlonal como anticorpo de captura, o anticorpo de detecção pode ser um anticorpo monoclonal que se una a um epítopo que esteja completamente separado fisicamente ou se sobreponha parcialmente com qualquer um dos epítopos aos quais se une o anticorpo policlonal de captura, ou um anticorpo policlonal que se una a epítopos diferentes ou ainda aqueles aos quais se une o anticorpo policlonal de captura. Os ensaios tipo duplo podem realizar-se como ensaios ELISA tipo duplo, ensaio de transferência de Western tipo duplo ou ensaios de detecção imunomagnética tipo duplo.

Os substratos sólidos adequados aos quais se pode unir um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de captura) 33 incluem, sem limitação, placas para microtitulação, tubos, membranas como nylon ou membranas de nitrocelulose, e perlas ou partículas (por exemplo, perlas ou partículas de agarose, celulose, vidro, poliestireno, poliacrilamida, magnéticas ou magnetizáveis). As partículas magnéticas ou magnetizáveis podem ser particularmente úteis quando é utilizado um sistema de imuno-ensaio automático.

Podem produzir-se anticorpos com afinidade de união específica por uma isoforma de BNP por procedimentos convencionais. Em geral, um polipéptido pode produzir-se de forma recombinante como foi descrito anteriormente ou pode purificar-se a partir de uma amostra biológica e utilizar-se para imunizar animais hospedeiros, incluindo coelhos, galinhas, ratinhos, ratinhos-da-índia ou ratos. Por exemplo, pode utilizar-se um polipéptido com a sequência de aminoácidos exposta na SEQ ID N°: 1 ou 2 ou fragmentos do mesmo que tiverem pelo menos seis aminoácidos de comprimento, para imunizar um animal. Diferentes adjuvantes que se podem utilizar para aumentar a resposta imunológica dependem da espécie hospedeira e incluem adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais como hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas como lisolecitina, polioles pluronic, poliânions, péptidos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa californiana e dinitrofenol. Podem preparar-se anticorpos monoclonais utilizando um polipéptido de BNP e a tecnologia convencional de hibridomas. Em particular, podem obter-se anticorpos monoclonais por qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas de celulares continuas em cultura como as descritas por Kohler, G. et al Nature, 256:495 (1975), a técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al, immunology Today, 4:72 (1983); Cole et al, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 80:2026 (1983)) e a técnica de hibridoma-EBV (Cole et al, "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, 34

Inc., págs. 77-96 (1983)). Estes anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo igG, IgM, igE, igA, igD, e qualquer subclasse das mesmas. O hibridoma que produz os anticorpos monoclonais da invenção pode cultivar-se in vitro e in vivo.

As técnicas alternativas para detectar BNP2 e BNP3 incluem técnicas espectrofotométricas de massas como ionização de electronebulização (ESI) e desorção-ionização por láser assistida por matriz (MALDI). Ver, por exemplo, Gevaert et al, Electrophoresis 22 (9): 1645-51, 2001; Chaurand et al, J Am Soc Mass Spectrom 10(2): 91-103, 1999. Estão disponíveis espectrómetros de massas úteis para estas aplicações em Applied Biosystems (Foster City, CA) ; Bruker Daltronics (Billerica, MA) ; e Amersham Pharmacia (Sunnyvale, CA).

Detecção de Ácidos Nucleicos que Codificam Isoformas de BNP

Pode utilizar-se uma qualquer de várias técnicas de diagnóstico clínico para detectar ácidos ribonucleicos que codificam uma isoforma de BNP. A hibridação pode realizar-se num substrato sólido como uma membrana de nylon (por exemplo, uma macromatriz) ou uma micromatriz (por exemplo, uma microplaca) ou em solução (por exemplo, tecnologia ORIGEM). Nalgumas realizações, os procedimentos baseados em ácidos nucleicos podem incluir uma etapa de aumento utilizando, por exemplo, PCR. Não é necessário purificar o ácido nucleico molde para a PCR; pode ser uma fracção minoritária de uma mistura complexa, como um lisato celular. Pode extrair-se ADN ou ARN molde a partir de uma amostra biológica utilizando técnicas rotineiras.

Após a criação do produto de aumento de PCR, pode detectar-se, por exemplo, por hibridação utilizando a tecnologia FRET. a tecnologia fret (ver, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos N° 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 e 6.162.603) baseia-se no conceito de que quando um resto fluorescente dador e um resto fluorescente receptor 35 correspondente colocam-se a uma determinada distância entre si, a transferência de energia que tem lugar entre os dois restos fluorescentes pode visualizar-se ou detectar-se de outra forma e quantificar-se. Duas sondas oligonucleotidicas, contendo cada uma um resto fluorescente, podem hibridar com um produto de aumento em posições particulares determinadas pela complementariedade das sondas oligonucleotidicas com a sequência de ácido nucleico diana. Após a hibridação das sondas oligonucleotidicas com o produto de aumento nas posições apropriadas, cria-se um sinal FRET. As temperaturas e tempos de hibridação podem variar de aproximadamente 35°C a aproximadamente 65°C durante um período de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 minuto. A detecção de FRET pode produzir-se em tempo real, de forma tal que se detecte o aumento num produto de aumento após cada ciclo de um ensaio de PCR e, nalgumas realizações, seja quantificado. A análise fluorescente e a quantificação podem realizar-se utilizando, por exemplo, um sistema de microscópio de epifluorescência com contagem de fotões (que contém o espelho dicróico apropriado e filtros para supervisionar a emissão de fluorescência num intervalo particular de comprimentos de onda), um sistema fotomultiplicador de contagem de fotões ou um fluorómetro. A excitação para iniciar a transferência de energia pode realizar-se com um láser de ião argão, uma lâmpada de arco de mercúrio de alta intensidade, uma fonte luminosa de fibra óptica ou outra fonte luminosa de alta intensidade filtrada de forma apropriada para a excitação no intervalo pretendido.

Os restos fluorescentes podem ser, por exemplo, um resto dador e um resto receptor correspondente. Como se utiliza no presente documento realtivamente a restos dadores e restos fluorescentes receptores correspondentes, "correspondente" refere-se a um resto fluorescente receptor 36 que tem um espectro de emissão que se sobrepõe com o espectro de excitação do resto fluorescente dador. 0 máximo de comprimento de onda do espectro de emissão de um resto fluorescente receptor tipicamente deve ser pelo menos 100 nm maior do que o máximo de comprimento de onda do espectro de excitação do resto fluorescente dador, de forma tal que possa produzir-se uma transferência de energia não radioactiva eficaz entre eles.

Os restos dadores fluorescentes e os restos receptores correspondentes geralmente escolhem-se para que tenham (a) uma elevada eficácia de transferência de energia Fõrster; (b) um grande deslocamento Stokes final (>100 nm); (c) deslocamento da emissão na medida do possível na parte vermelha do espectro visível (>600 nm); e (d) deslocamento da emissão a um comprimento de onda superior à emissão fluorescente de água Raman produzida pela excitação ao comprimento de onda de excitação do dador. Por exemplo, um resto fluorescente dador pode escolher-se com um máximo de excitação cerca de uma linha láser (por exemplo, Helio-Cádmio 442 nm ou Argão 488 nm) , um elevado coeficiente de extinção, um elevado rendimento quântico e uma boa sobreposição da sua emissão fluorescente com o espectro de excitação do resto fluorescente receptor correspondente. Pode escolher-se um resto fluorescente receptor correspondente que tenha um elevado coeficiente de extinção, um elevado rendimento quântico, uma boa sobreposição da sua excitação com a emissão do resto fluorescente dador, e emissão na parte vermelha do espectro visível (>600 nm) .

Os restos fluorescentes dadores representativos que podem utilizar-se com diversos restos fluorescentes receptores na tecnologia FRET incluem fluoresceína, Amarelo Lucifer, B-ficoeritrina, isotiocianato de 9-acridina, Amarelo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-fenil isotiocianato)-4-metilcumarina, 1-pirenobutirato 37 de succinimidilo e derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianato estilbeno-2,2'-dissulfónico. Os restos fluorescentes receptores representativos, consoante o resto fluorescente dador utilizado, incluem LC™-Red 640, LC™-Red 705, Cy5, Cy5.5, sulfonil cloreto de Lisamina rodamina B, isotiacianato de tetrametil rodamina, isotiacianato de rodamina x, isotiacianato de eritrosina, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina e outros quelatos de iões de lantanideos (por exemplo, európio ou térbio). Podem obter-se restos fluorescentes dadores e receptores, por exemplo, em Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) ou Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Podem unir-se restos fluorescentes dadores e receptores para sondar oligonucleótidos através de braços de ligação. O comprimento de cada braço de ligação é importante, uma vez que os braços de ligação afectarão à distância entre os restos fluorescentes dador e receptor. O comprimento de um braço de ligação para a finalidade da presente invenção é a distância em Angstroms (A) a partir da base do nucleótido para o resto fluorescente. Em geral, um braço de ligação tem um comprimento de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 Á. O braço de ligação pode ser do tipo descrito, por exemplo, no documento WO 84/03285. O documento WO 84/03285 também apresenta procedimentos para unir braços de ligação a uma base nucleotídica particular, bem como procedimentos para unir restos fluorescentes a um braço de ligação.

Um resto fluorescente receptor, como um LC™-Red 640-NHS-éster, pode combinar-se com C6-Fosforamiditas (disponível em ABI (Foster City, CA) ou Glen Research (Sterling, VA) ) para produzir, por exemplo, LC™-Red 640-Fosforamidita. As ligações utilizadas com frequência para unir um resto fluorescente dador, como fluoresceína, a um oligonucleótido incluem ligadores de tioureia (derivados de FITC, por exemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research ou ChemGene (Ashland, MA)), ligados de amida (derivados de 38 fluoresceína-NHS-éster, como fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, CA)) ou 3'-amino-CPG que necessitam da ligação de uma fluoresceína-NHS-éster após a sintese do oligonucleótido.

Utilizando a instrumentação de PCR a tempo real disponível no mercado (por exemplo, LightCycler™, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), pode combinar-se o aumento por PCR, a detecção e a quantificação de um produto de aumento apenas numa cuba fechada com um tempo de ciclo reduzido de forma espectacular. Como a detecção e quantificação realizam-se juntamente com o aumento, os procedimentos de PCR em tempo real evitam a necessidade de manipulação do produto de aumento e diminuem o risco de contaminação cruzada entre os produtos de aumento. A PCR em tempo real reduz, em grande medida, o tempo de resposta e é uma alternativa atractiva às técnicas convencionais de PCR no laboratório clinico ou no campo.

Dentro de cada processamento no ponto sobre os ciclos térmicos podem incluir-se amostras de controlo. As amostras de controlo positivo podem aumentar um molde de controlo de ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico diferente de um ácido nucleico diana) utilizando, por exemplo, iniciadores de controlo e sondas de controlo. As amostras de controlo positivo também se podem aumentar, por exemplo, uma construção de plasmídeo que contém um molde de ácido nucleico de controlo. Esse controlo de plasmídeo pode aumentar-se internamente (por exemplo, dentro da amostra) ou num ensaio de amostra diferente em série com as amostras de ensaio. Cada ensaio no ponto sobre os ciclos térmicos também deve incluir um controlo negativo que, por exemplo, careça do ADN molde diana. Estes controlos são indicadores do sucesso ou fracasso do aumento, hibridação e/ou reacção de FRET. Por isso, as reacções de controlo podem determinar facilmente, por exemplo, a capacidade dos iniciadores de hibridar com especificidade de sequência e de iniciar o 39 alongamento, bem como a capacidade das sondas de hibridar com especificidade de sequência e de que se produza FRET.

Um outro formato de FRET utiliza a tecnologia TaqMan® para detectar a presença, ausência ou nivel de um produto de aumento e, por isso, a presença, ausência ou nivel de ácido nucleico que codifica uma isoforma de BNP. A tecnologia TaqMan® utiliza uma sonda de hibridação monocatenária marcada com dois restos fluorescentes. Quando um primeiro resto fluorescente se excita com luz de um comprimento de onda adequada, a energia absorvida transfere-se para um segundo resto fluorescente de acordo com os princípios de FRET. 0 segundo resto fluorescente, em geral, é uma molécula inactivadora. Durante a etapa de aquecimento da reacção de PCR, a sonda de hibridação marcada une-se ao adn diana (isto é, o produto de aumento) e degrada-se pela actividade exonuclease 5' a 3' da Taq Polimerase durante a fase de alongamento posterior. Como resultado, o resto fluorescente excitado e o resto inactivador separam-se espacialmente entre si. Como consequência, depois da excitação do primeiro resto fluorescente em ausência do inactivador, pode detectar-se a emissão de fluorescência a partir do primeiro resto fluorescente. A modo de exemplo, um ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) utiliza a tecnologia TaqMan®, e é adequado para realizar os procedimentos descritos no presente documento para detectar isoformas de BNP. A informação sobre o aumento por PCR e a detecção utilizando o sistema ABI PRISM® 7700 podem encontrar-se no website de Applied Biosystems.

Também podem utilizar-se balizas moleculares junto com FRET para detectar a presença de um produto de aumento utilizando os procedimentos de PCR em tempo real da invenção. A tecnologia de balizas moleculares usa uma sonda de hibridação marcada com um primeiro resto fluorescente e um segundo resto fluorescente. O segundo resto fluorescente geralmente é um inactivador, e os marcadores fluorescentes 40 tipicamente localizam-se em cada extremo da sonda. A tecnologia de balizas moleculares usa um oligonucleótido de sonda que tem sequências que permitem a formação de uma estrutura secundária (por exemplo, uma forquilha). Como resultado da formação de estruturas secundárias dentro da sonda, os dois restos fluorescentes estão em proximidade espacial quando a sonda está em solução. Após a hibridação com os ácidos nucleico diana (isto é, produtos de aumento), a estrutura secundária da sonda rompe-se e os restos fluorescentes separam-se entre si de tal forma que, após a excitação com luz de um comprimento de onda adequada, possa detectar-se a emissão do primeiro resto fluorescente.

Como alternativa a FRET, o produto de aumento pode detectar-se utilizando, por exemplo, um corante fluorescente de união ao ADN (por exemplo, SYBRGreenI® ou SYBRGold® (Molecular Probes)). Após a interacção com um produto de aumento, estes corantes de união ao ADN emitem um sinal fluorescente após a excitação com luz a um comprimento de onda adequada. Também é possível utilizar um corante de união ao ADN bicatenário assim como um corante intermediário de ácido nucleico. Quando se utilizam corantes de união ao ADN bicatenário, normalmente realiza-se uma análise de curva de fusão para a confirmação da presença do produto de aumento.

Artigos de Fabricação

Uma isoforma de BNP, um ácido nucleico que codifica uma isoforma de BNP, ou um anticorpo que tem afinidade de união específica por uma isoforma de BNP (por exemplo, BNP2 ou BNP3) podem combinar-se com material de embalagem e vender-se como um kit. Estes kits podem ser úteis para o diagnóstico de afecções cardíacas, a supervisão do tratamento de afecções cardíacas, a supervisão da evolução de doenças cardíacas ou o tratamento de afecções cardíacas ou renais. As componentes e procedimentos para produzir artigos de fabricação são bem conhecidos. Os artigos de 41 fabricação podem combinar um ou mais polipéptidos, ácidos nucleicos ou anticorpos como se descreve no presente documento. Além disso, os artigos de fabricação podem incluir ainda reactivos como anticorpos secundários, anticorpos anti-BNP, tampões, moléculas indicadoras, fases sólidas (por exemplo, pérolas) e/ou outros agentes úteis para diagnosticar afecções cardíacas, supervisionar o tratamento de afecções cardíacas ou supervisionar a evolução de doenças cardíacas. Um anticorpo pode estar num recipiente como um embalagem de plástico, polietileno, polipropileno, etileno ou propileno que seja um tubo tapado ou um frasco, ou pode incluir-se numa fase sólida, por exemplo, um dispositivo portátil para o ensaio principal que inclui um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-BNP2 ou BNP3). Nesses kits também se podem incluir instruções que descrevem a verdadeira eficácia dos diferentes reactivos para tratar as afecções cardíacas ou renais, supervisionar o tratamento das afecções cardíacas ou supervisionar a evolução da doença cardíaca. A invenção será descrita adicionalmente nos seguintes exemplos, que não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Identificação de Péptido Natriurético Cerebral-2 (BNP 2)

Determinou-se que o intron 2 da sequência genómica de BNP codificava um polipéptido que tinha homologia com o extremo C do polipéptido DNP de serpente. Para determinar se o polipéptido codificado pelo intron 2 se manifestava, realizou-se uma transferência de Northern utilizando ARN celular isolado a partir de tecido de rim, cérebro e coração (ventrículos esquerdos e aurícula) de doentes com e sem insuficiência cardíaca. Submeteram-se a electroforese aproximadamente 5 μρ de ARN através de um gel de agarose a 1% que continha formaldeído e transferiram-se para uma 42 membrana de nylon. Realizou-se uma transferência de Northern utilizando o kit NorthernMax™ de Ambion, Inc. (Austin, TX), de acordo com as instruções do fabricante. As membranas auto-reticularam-se por UV, pré-hibridaram-se a 42 °C durante 1 hora e hibridaram-se a 42 °C durante uma noite com uma sonda marcada que continha a sequência do segundo intron. A sonda marcou-se com 32P utilizando o Random Primers DNA Labeling System (Gibco BRL). As membranas lavaram-se duas vezes em tampão de baixa rigorosidade (proporcionado em NorthernMax™, equivalente a SSC 2X, SDS a 0,1% ou SSPE 2X, SDS a 0,1%) a temperatura ambiente, cinco minutos por lavagem, e depois se lavaram duas vezes num tampão de elevada rigorosidade (proporcionado no kit NorthernMax™, equivalente a SSC 0,IX, SDS a 0,1% ou SSPE IX, SDS a 0,1%) a 42°C, 15 minutos por lavagem. Os sinais de hibridação nas manchas de transferência analisaram-se por auto-radiografia. Detectou-se um mensageiro para o segundo intron na aurícula esquerda dos doentes com insuficiência cardíaca.

Exemplo 2 - Clonagem de BNP-2 Humano isolou-se arn total a partir de tecido de coração humano normal e com insuficiência cardíaca utilizando o Reactivo TRIzol® (Gibco BRL). Produziu-se ADN complementar (ADNc) utilizando um iniciador oligo(dT) e o kit de RT-PCR ThermoScript™ de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Realizou-se RT-PCR utilizando um iniciador directo que tinha a sequência: 5'-AGACATGGATCCCCAGACAG-3' (SEQ ID N°: 21; o códão de início 5' está sublinhado) e um iniciador inverso que tinha a sequência: 5'-CAAGAGGAAGCGATGTCCAG-3' (SEQ ID N°: 22, colocada nos nucleótidos 113 a 133 no segundo intron). Depois de combinar o ADNc e os iniciadores, realizou-se uma desnaturalização inicial a 94°C durante 4 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalização a 94°C durante 30 s, aquecido a 52°C durante 1 min e alongamento a 72°C durante 45 s e 43 depois uma extensão final a 72°C durante 10 min. O produto de PCR resultante (ADNc de hBNP2 de -520 pb) subclonou-se no vector Topo e sequenciou-se para a confirmação. A sequência de ácido nucleico do ADNc de hBNP2 apresenta-se no gráfico IA.

Exemplo 3 - Clonagem de BNP-2 de Cão

Isolou-se ARN total a partir de tecido cardíaco de cão normal e com insuficiência cardíaca e normal utilizando o Reactivo TRIzol® (Gibco BRL). Preparou-se ADNc utilizando um iniciador oligo(dT) e o kit de RT-PCR ThermoScript™ de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A RT-PCR realizou-se utilizando um iniciador directo que tinha a sequência: 5'-TTCTCTCCAGCGACATGGAG-3' (SEQ id N°: 23; o códão de início 5' está sublinhado) e um iniciador inverso que tinha a sequência: 5'- GGACTCTTTCTGCTCCAAGG-3' (SEQ ID N° : 24, localizada nos nucleótidos 228 a 308 no segundo intron). Depois de combinar o ADNc e os iniciadores, realizou-se uma desnaturalização inicial a 94°C durante 4 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalização a 94°C durante 30 s, aquecido a 55°C durante 1 min e alongamento a 72°C durante 45 s e depois uma extensão final a 72°C durante 10 min. O produto de PCR resultante (ADNc de dBNP2 de -520 pb) subclonou-se no vector Topo e sequenciou-se para a confirmação. A sequência de ácido nucleico de ADNc de dBNP2 apresenta-se no gráfico 1B.

Exemplo 4 - Clonagem de BNP-3 Humano

Isolou-se ARN total a partir de tecido cardíaco humano e produziu-se ADNc como se descreve no Exemplo 2. Realizou-se RT-PCR utilizando um iniciador directo que tinha a sequência: 5'-AGACATGGATCCCCAGACAG-3' (SEQ ID N°: 25; o códão de início 5' está sublinhado) e iniciadores inversos que tinham a sequência: 5'-TTTCTGCACCACTTTGCAGC-3' (SEQ ID N°: 26, onde a parte sublinhado do iniciador é a sequência 3' do segundo exão e a parte não sublinhada do iniciador 44 corresponde à posição 289-300 do segundo intron). Depois de combinar o ADNc e os iniciadores, realizou-se uma desnaturalização inicial a 94°C durante 4 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalização a 94°C durante 30 s, aquecido a 60°C durante 1 min e alongamento a 72°C durante 45 s e depois uma extensão final a 72°C durante 10 min. O produto de PCR resultante (ADNc de hBNP3 de -380 pb) subclonou-se no vector Topo e sequenciou-se para a confirmação. A sequência de ácido nucleico de ADNc de hBNP3 apresenta-se no gráfico 2.

Exemplo 5 - Produção de anticorpo anti-BNP2 humano

Sintetizou-se um péptido correspondente aos resíduos 27-60 do péptido de BNP2 humano maduro pelo serviço central de proteínas Maio e utilizou-se para produzir anticorpos policlonais. Inocularam-se dois coelhos inicialmente com 500 μρ do péptido mais adjuvante completo de Freund seguido de três inoculações de reforço de 250 μρ do péptido mais adjuvante incompleto de Freund. Após cada reforço, os soros avaliaram-se por transferência de Western. Um dos coelhos (n° 1105) apresentou uma resposta específica após a imunização e continua a manter um elevado título de anticorpo com reforços periódicos. O anticorpo policlonal anti-BNP2 utilizou-se para detectar BNP2 em tecido cardíaco humano. Desparafinaram-se duas séries de cortes de tecidos de aurícula esquerda de coração humano (normal e com insuficiência cardíaca) incluídos em parafina e trataram-se com tampão de recuperação de antigénio. Uma série de cortes foi incubada com anticorpo policlonal de coelho anti-BNP2 diluído 5 vezes a outra com soro de coelho pré-imune. Utilizou-se um conjunto de biotina anti-coelho e estreptavidina-fosfatase alcalina para o desenvolvimento da cor. Detectou-se BNP2 apenas no tecido cardíaco do doente com insuficiência cardíaca.

Exemplo 6 - Produção de anticorpo anti-BNP3 humano 45

Sintetizou-se um péptido correspondente aos resíduos 27-41 do péptido de BNP3 humano maduro pelo serviço central de proteínas Maio e utilizou-se para produzir anticorpos policlonais. Inocularam-se inicialmente dois coelhos com 500 μς do péptido mais adjuvante completo de Freund seguido de três inoculações de reforço de 250 μς do péptido mais adjuvante incompleto de Freund. Após cada reforço, os soros avaliaram-se por transferência de Western. Um dos coelhos (n° 1403) apresentou uma resposta específica após a imunização e continua a manter um elevado título de anticorpo com reforços periódicos. O anticorpo policlonal anti-BNP3 utilizou-se para detectar BNP3 em tecido cardíaco humano. Desparafinaram-se duas séries de cortes de tecidos de aurícula esquerda de coração humano (normal e com insuficiência cardíaca) incluídos em parafina e trataram-se com tampão de recuperação de antigénio. Uma série de cortes foi incubada com anticorpo policlonal de coelho anti-BNP3 diluído 5 vezes e o outro com soro de coelho pré-imune. Utilizou-se um conjunto de biotina anti-coelho e estreptavidina-fosfatase alcalina para o desenvolvimento da cor. Detectou-se BNP3 apenas no tecido cardíaco do doente com insuficiência cardíaca.

Exemplo 7 - Níveis de expressão de isoformas de BNP em tecido cardíaco humano

Utilizou-se PCR em tempo real para avaliar os níveis de expressão de BNP, BNP2 e BNP3 em tecido de aurícula normal e em tecido de aurícula com insuficiência cardíaca. O nível de GAPDH no ARN utilizou-se como controlo interno. Isolou-se ARN total a partir de tecidos cardíacos como foi descrito anteriormente no Exemplo 2. Sintetizou-se ADNc da primeira cadeia por transcriptase inversa e oligo dT. A PCR realizou-se utilizando um instrumento LightCycler e o Kit FastStart DNA SYBR Green I (Roche). A mistura de reacção de PCR continha 2 μΐ de ADNc, 2 μΐ de FastStart DNA Master 46 SYBR® Green I (Roche), 2,4 μΐ de solução mãe de MgCl2 (25 mM), uma concentração 0,5 μΜ de cada iniciador (ver Tabela 1) e H20 estéril num volume total de 20 μΐ. Todos os iniciadores seleccionaram-se utilizando o software Primer3 (Whitehead Institute). TABELA 1

Sequência (orientação 5' a 3') SEQ ID N°: GADPH Humano Directo GAGTCAACGGATTTGGTCGT 27 Inverso TTGATTTTGGAGGGATCTCG 28 BNP Humano Directo CTTCTTGCATCTGGCTTTCC 29 Inverso AGGGATGTCTGCTCCACCT 30 BNP2 Humano Directo GGACATCGCTTCCTCTTTGTT 31 Inverso GAAGGTATTGTGGGCATGGT 32 BNP3 Humano Directo TCCCACAGGTGGTCTGGAAGT 33 Inverso TTCTGCACCACTTTGCAGC 34

Os produtos aumentaram-se utilizando 45 ciclos de desnaturalização a 95°C durante 10 s, hibridação a 60°C durante 5 s e extensão a 72°C durante 10 s. Mediram-se produtos de PCR purificados de cada reacção e serviram como padrões quantitativos. Todas as quantificações normalizaram-se para o controlo endógeno de GAPDH. Não se utilizaram controlos de molde para determinar se estavam presentes contaminantes fluorescentes na amostra. Para confirmar a especificidade de aumento, os produtos de PCR submeteram-se a uma análise de curva de fusão e a uma electroforese em gel de agarose posterior.

Como é indicado na Tabela 2, não foi encontrado BNP3 em tecido cardíaco normal. O nível de expressão de BNP-2 no tecido com insuficiência cardíaca foi aproximadamente 7 vezes maior do que o nível no tecido cardíaco normal. O ARN 47 mensageiro para BNP2 e BNP3 representa até 5% de todos os ARN de BNP. TABELA 2 BNP BNP 2 BNP 3 Tecido cardíaco normal 58 2025 0, 19 Tecido cardíaco com insuficiência cardíaca 233100 13151 3807

Exemplo 8 - Estimulação da produção de GMPc com isoformas de BNP

Cultivaram-se células endoteliais vasculares de veia umbilical humana (HUVEC) em placas de 96 cavidades utilizando meio de células endoteliais (EGM™-2) complementado com as componentes proporcionadas pelo kit EGM™-2 Bullet (CC-3162) (Clonetics, East Rutherford, NJ) . Após as células alcançarem uma confluência de aproximadamente 80%, as placas lavaram-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois foram incubadas durante 30 minutos com uma concentração 0, 0,1, 1 ou 10 μΜ de péptido maduro sintético de hBNP3 (SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKWQKENQTFPPGFL, SEQ ID N° : 35) dissolvido em EBM-2 que continha suplementos e IBXM 0,5 mM. Após a incubação, o meio de cultura aspirou-se e as células ensaiaram-se relativamente à produção de GMPc intracelular utilizando o kit de imuno-ensaio enzimático de GMPc BIOTRACK (Amersham Pharmacia Biotech). A quantidade de GMPc calculou-se de acordo com a curva padrão que se criou a partir de reacções paralelas dentro da mesma experiência. Como é indicado na Tabela 3, concentrações crescentes de BNP3 deram como resultado uma maior produção de GMPc. TABELA 3

Concentração de BNP3 (M) 0 IO"10 10-9 10"8 GMPc (fmol/cavidade) 0 1 18 26 48

Exemplo 9 - Vasoactividade de isoformas de BNP

Avaliou-se a vasoactividade numa câmara de órgãos utilizando artérias carótidas de Coelhos Brancos New Zealand. Após a eutanásia, as carótidas submergiam-se imediatamente em solução de Krebs fria. Diseccionaram-se anéis arteriais de -4 mm de comprimento (n = 6), ligaram-se a transdutores isométricos de deslocamento de força e suspenderam-se em câmaras de órgãos preenchidas com 25 ml de Krebs (94% de 02, 6% de C02) . Os anéis equilibraram-se durante 1 hora a 37°C e depois foram esticados de forma crescente até 3 g. A viabilidade e a contracção máxima determinaram-se com KC1 60 mM. Após três lavagens com solução de Krebs e um equilíbrio adicional, as artérias puseram-se em contacto previamente com fenilefrina de uma forma titulada para conseguir uma contracção máxima estável de ~80%. Para estudar a vasoactividade, adicionou-se BNP3 (conc. final 10~10 a 10“7 M) ou veículo ao banho de órgãos de uma forma acumulativa. Após três lavagens mais e do equilíbrio, as artérias voltaram-se a pôr em contacto e foi confirmada a viabilidade por avaliação de respostas independentes do endotélio com doses crescentes de nitroprussiato de sódio (de 1CT9 a 1CT5 M), um dador de NÃO exogénio. A vasorrelaxamento a BNP3 começou a 1CT9 M, aumentando a capacidade de resposta dos vasos de uma forma dependente da dose de tal forma que se observou um relaxamento completo de -60% e -95% a dose de 10~8 M e 10“7 M respectivamente. Não se observou resposta em anéis de controlo. Estes dados demonstram que BNP3 é vasoactivo a concentrações semelhantes às notificadas para outros péptidos natriuréticos. Ver Best et al., Cardiovas. Research 55: 375-384 (2002).

Exemplo 10: Infusão intrarrenal de BNP-3 em cães normais

Para determinar os efeitos fisiológicos de BNP-3, libertou-se o péptido sintetizado através de uma infusão 49 directa na artéria intrarrenal (0,03 ng/kg/min) em cães normais. Realizou-se uma avaliação fisiológica depois de um período de ensaio de 15 minutos. A infusão de bnp-3 a esta dose deu como resultado uma elevação de GMPc em plasma. Esta elevação de GMPc associou-se com um aumento do fluxo de urina (6-8 vezes) e um aumento da excreção de sódio em urina. Estes dois aumentos normalizaram-se durante um período de eliminação. 50

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9524419 A [0003] • WO 0071576 A [0003] • WO 0224895 A [0003] • US 5580859 A [0055] • US 5589466 A [0055] • US 5296347 A [0062] • US 4233402 A [0062]

Literatura não relacionada descrição • THE JOURNAL OF CL INICAL INVESTIGATION, May 1994, vol. 93 (5), 1911-1921 [0003] • THE JOURNAL OF LABORAIORY AND CL INICAL MEDICINE, November 1999, vol. 134 (5), 437-444 [0003] • Burger ; Burger. Curr.

Opin. Investig. Drugs, 2001, vol. 2 (7), 929-35 [0022] • Summerton ; Weller.

Antisense Nucleic Acid • US 4098876 A [0062] • US 4034074 A [0062] • US 4996143 A [0068] • US 5565322 A [0068] • US 5849489 A [0068] • US 6162603 A [0068] • WO 8403285 A [0073] com patentes referida na

Drug Dev., 1997, vol. 7, 187-195 [0043] • Hyrup et al. Bioorgan. Med. Chem. 1996, vol. 4, 5-23 [0043] • PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 [0047] • Lewis. Genetíc Engineering News, 1992, vol. 12 (9), 1 [0047] • Guatelli et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, vol. 87, 1874-1878 [0047] 51 • Weiss. Science, 1991, vol. 254, 1292 [0047] • Short Protocols in Molecular Biology. Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, 1992 [0049] [0060] • Huse et al. Science, 1989, vol. 246, 1275 [0060] • Kohler, G et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0065] • Kosbor et al. Immunology Today, 1983, vol. 4, 72 [0065] • Cole et al. Proc. Natl.

Acad. Sei USA, 1983, vol. 80, 2026 [0065] • Cole et al. Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy. Alan R. Liss, Inc, 1983, 77-96 [0065] • Gevaert et al. Electrophoresis, 2001, vol. 22 (9), 1645-51 [0066] • Chaurand et al. J Am Soc

Mass Spectrom, 1999, vol. 10 (2), 91-103 [0066] • Best et al. Cardiovas. Research, 2002, vol. 55, 375-384 [0095]

Lisboa, 19/01/2011

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido purificado que inclui numa sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em: a) a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2, 4 ou 35; e b) uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 2 . 2. 0 polipéptido da reivindicação 1, em que essa sequência de aminoácidos tem pelo menos 75%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2.

3. O polipéptido da reivindicação 1, em que essa sequência de aminoácidos tem pelo menos 75%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com um fragmento da SEQ ID N°: 2 com um comprimento de pelo menos 6 resíduos contíguos.

4. Um ácido nucleico isolado que codifica o polipéptido referido da reivindicação 1.

5. O ácido nucleico isolado da reivindicação 4, em que esse polipéptido é codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID N°: 6, ou a sequência de ácido nucleico dos nucleótidos 388 a 432 da SEQ ID N°: 6.

6. Um vector que inclui o ácido nucleico da reivindicação 5.

7. Células hospedeiras que contêm o vector da reivindicação 6. 2

8. As células hospedeiras da reivindicação 7, em que essas células hospedeiras são células hospedeiras eucariotas.

9. Uma composição farmacêutica que compreende o polipéptido da reivindicação 1 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

10. Um anticorpo que tem afinidade para ligação especifica ao polipéptido da reivindicação 1.

11. Um polipéptido natriurético quimérico que compreende uma primeira região e uma segunda região, tendo essa primeira região uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em: a) a sequência de resíduos 1 a 27 da SEQ H a 2 o 16; b) a sequência de resíduos 1 a 25 da SEQ ID N° : 17; c) a sequência de resíduos 1 a 23 da SEQ ID N° : 18; d) a sequência de resíduos 1 a 22 da SEQ ID N° : 19; tP e) â sequência de a), b), c) ou d) com uma a cinco substituições de aminoácidos; tendo essa segunda região uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em: f) a sequência da SEQ ID N°: 2; e g) uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2.

12. Um procedimento ex vivo para diagnosticar uma afecção cardíaca a um doente, consistindo esse procedimento em: a) detectar a presença, ausência ou nível de um polipéptido de BNP3 que inclui a sequência de 3 aminoácidos da reivindicação 1 numa amostra biológica desse doente; e b) classificar esse doente como um doente que tem essa afecção cardíaca ou que não tem essa afecção cardíaca com base, pelo menos em parte, na presença desse polipéptido de BNP3, o nível desse polipéptido de BNP3 ou a ausência desse polipéptido de BNP3. 13. 0 procedimento da reivindicação 12 ou a reivindicação 14, em que essa afecção cardíaca é seleccionada do grupo que consiste na insuficiência cardíaca, angina instável, enfarte agudo de miocárdio e hipertensão.

14. Um procedimento ex vivo para diagnosticar uma afecção cardíaca a um doente, consistindo esse procedimento em: a) detectar a presença, ausência ou nível de um ácido ribonucleico que codifica um polipéptido de BNP3 que inclui a sequência de aminoácidos da reivindicação 1 numa amostra biológica desse doente; e b) classificar esse doente como um doente que tem essa afecção cardíaca ou que não tem essa afecção cardíaca com base, pelo menos em parte, na presença desse ácido ribonucleico que codifica esse polipéptido de BNP3, o nível desse ácido ribonucleico que codifica esse polipéptido de BNP3, ou a ausência desse ácido ribonucleico que codifica esse polipéptido de BNP3.

15. Utilização de um polipéptido da reivindicação 2 ou um ácido nucleico da reivindicação 4 ou 5 para a preparação de um medicamento para tratar uma afecção cardíaca num mamífero. 4

16. A utilização da reivindicação 15, em que essa afecção cardíaca é seleccionada de entre o grupo que consiste em insuficiência cardíaca, angina instável, enfarte agudo de miocárdio e hipertensão. 17. 0 anticorpo da reivindicação 18, em que esse anticorpo é um anticorpo monoclonal.

18. Um anticorpo purificado, em que esse anticorpo se une a um polipéptido da reivindicação 1 (BNP3), e em que esse anticorpo não se une a um polipéptido de BNP que consiste na sequência exposta na SEQ ID N°: 16 ou a um polipéptido de BNP2 que consiste na sequência exposta na SEQ ID N°: 3. 19. 0 anticorpo da reivindicação 18, em que esse polipéptido da reivindicação 1 consiste na sequência exposta na SEQ ID N°: 2. Lisboa, 19/01/2011 1/4 FIG.l A. BNP2 humana: Sequência de nucieótidos: atggaíccccagacagcaccttcccgggcgctcctgctcctgctcttcttgcatctggctttcctgggaggícgttccca cccgçtgggcagccccggítcagcctcggacttggaaacgtccgggttacaggagcagcgcaaccatttgcagggcaaac tgtcggagctgcaggtggagcagacatccctggagcccçtQcaggagagcccccgteccacaggtgtctggaagtcccgg gaggtagccaccgagggcatccgígggcaccgcaaaátggícctctacaccxtgcgggcaccacgaagccccaagatggt gcaagggtctggcígctttgggaggaagatggaccggatcagctcctccagtggcctgggcígcaaaggtaagcaccccc tgccaccccggccgccttcccccattccagígtgtgacactgttagagtcactítggggíttgttgtctctgggaaccac actctttga (SEQ ID 1N°:5) Sequência de aminoácidos: CFGRKMDRISSSSGLGCKGKHPLPPRPPSPIPVCPTVRVTLGFWSGNHTL (SEQ ID N°:3) GKHPLPPRPPSPIPVCDTVRVTLGFVVSGNHTL (SEQ ID 1S°:1) B. BNP-2DECÂO Sequência de nucieótidos: atggagccctgcgcagcgctgccccgggccctcctgctcctcctgttcttgcacctgtçgccactcggaggccgçcccca cccgctgggcggccgcagccccacctcggaagcctcggaagcctcggaagcctcggggttgtgggccgtgcaggagctgc tgggccgtctgaaggacgcagtttcagagctgcaggcagagcagttggccctggaaccccígcaccggagccacagcccc gcagaagccccggaggccggggaggaacgccccgtgggggtccttgcaccccatgacagtgtcctccaggccctgagaag actacgcagccccaagatgatgcacaagtcagggtgctttggccggaggctggaccggatcggdccctcagtggcctgg gctgcaatggtaagccgcctccetgccaccttggctccccctccccagccccctgggttegacccttggaaccccttctg ggtttgttgtctcgggggatcacactctga Sequência de aminoácidos: MEPCAALPRALLLLLFLHLSPLGGRPHPLGGRSPTSEASEASEASGLWAVQELLGR LKDAVSELQAEQLALEPLHRSHSPAEAPEAGEERPVGVLAPHDSVLQALRRLRSP KMMHKSGCFGRRLDRIGSLSGLGCNGKPPPCHLGSPSPAPWVRPLEPLLGLLSRGI TL 2/4 FIG.2 BNP-3 humano Sequênci3 de nucieotidos: atggatccccagacagcaccttcccgggcgctcctgctcctgctcttcttgcatctggctttcctgggaggtcgttccca cccgctgggcagccccggttcagcctcggacttggaaacgtccgggttacaggagcagcgcaaccatttgcagggcaaac tgtcggagctgcaggtggagcagacatccctggagcccctccaggagagcccccgtcccacaggtgtctggaagtcccgg gaggtagccaccgagggcatccgtgggcaccgcaaaatggtcctctacaccctgcgggcaccacgaagccccaagatggt gcaagggtctggctgctttgggaggaagatggaccggatcagctcctccagtggcctgggctgcaaagtggtgcagaaag agaaccaaacatttcctcctggtttcctctaa (SEQID N°:6) Sequência de aminoácidos: MDPQTAPSRALLLLLFLHLAFLGGRSHPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSE LQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHKKMVLYTLRAPRSPKMVQGSG CFGRKMDRISSSSGLGCKWOKENOTFPPGFL (SEQ ID N°:4) WQKENQTFPPGFL (SEQ ID N°:2) 103/4 pongçglnfron pigSInuon pm2inuan ooísSintran mcuseSlr.iranhumanSinlrongofmstntien fsfís&íntran tiogpintrQr) DNP tíe cobra pia- GÍK' H 4^ίκ/ηΙΓ (/fc H L G^jV.r ffift (ϊΠΓρ M 1' LgjjjjrgS. S *>**<-· Λ i' C H f · - t P.iJ* R V '[‘-S1 P. t, 1>Ί> Ί ir: ii; s i“ V C1JLD pup.nqp PCRL G STr S V 0 E III1 P !> It P V FIG.3

55 GO 40 pongoSintron ptgp.íntron panSínt/an QvfeSfalron rnottSúZlnlton fmmanSMton goríllashtton tsíisSinlron dogSíntron DNPSírurm N H|g|R D Q N Il[l| t) Qjjgjw P ti H K (: H Br ηΓΟιι ! T S sÉíg íi|agu í τ l «y|j ΛΚίΛ CfTTÍS 0 N 1 Kl·' N H 33¾ τ «Ebk@l g l υ&0τ@κΗο itg]s OHIRl IT TU K T L L V L A K m pongoSmiron pígSintron panSintfonvvisZfnirànmoiiseSíniron humandintran gorllIaSlntion tetli$2ln)rm dpgSímron DHPZmiron 60 CSJSE1R !’ R $ λ í L fc K|gNÍgjD $ l-B Mi, o a(§s i ΗϋΜ1)τ 6 R@» i f ΙόΙκΡΜίΙΕίρ * vfffr p k{|[|a b s r 0 Q Η Π C Ρ IUIM. r? so 4/4 FIG.4 ΒΝΡ SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH (SEQ ÍD N° :16) DNP EVKYDPCFGHKIDRINHVSNLGCPSLRDPRPNAPSTSADNP (SEQ II) N° :17) ANP SLRRSSCFGGRMDR1GAQSGLGCNSFRY (SEQ II) N° :18) CNP GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ II) N°: 19)