CN101208353B

CN101208353B - 脑利尿钠肽的同种型

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Publication number: CN101208353B
Application number: CN2004800209647A
Authority: CN
Inventors: S·潘; R·D·西马瑞
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 2003-06-20
Filing date: 2004-06-02
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2024-06-02
Also published as: EP1638443A2; US20070281887A1; JP2007525957A; EP1638443A4; EP2308889B1; IL172674A; DK1638443T3; ATE485303T1; PT1638443E; US8354496B2; DE602004029680D1; EP2308889A1; CN101208353A; PL1638443T3; JP4881156B2; WO2005000095A2; US20130143816A1; ES2354881T3; US8912137B2; EP1638443B1

Abstract

本发明描述了用于诊断心脏疾病(例如，心力衰竭)和肾脏疾病(例如，肾衰竭)的方法和材料。

Description

脑利尿钠肽的同种型

相关申请的交叉参考

本申请要求2003年6月20日提交的美国临时专利申请号60/480,460的优先权。

技术领域

本发明涉及诊断心脏疾病(例如心力衰竭)，更具体地，通过测定脑利尿钠肽(BNP)的同种型来诊断心脏疾病的方法和材料。本发明也涉及治疗心脏疾病(例如，心力衰竭)和肾脏疾病(例如，肾衰竭)的方法和材料。

背景技术

利尿钠肽家族的许多成员是调节体液稳态的激素。心房心肌细胞对血管内容积增加的反应是分泌心房钠尿肽(ANP)。一旦ANP进入循环系统中，其主要作用于肾脏、血管组织和肾上腺，作用是导致肾脏排出钠和水，而降低血管内容积和血压。BNP也来源于心肌细胞，类似于ANP，在人血浆中循环。BNP能促使尿钠排出、抑制肾素、舒张和松弛血管。BNP主要的循环和储存形式是具有环结构的32个氨基酸的肽。BNP的生理作用由连有鸟苷酸环化酶的受体-利尿钠肽受体A(NRP-A)介导。将BNP从循环系统中除去的NRP-C受体促使BNP清除。BNP也通过中性内肽酶的酶切作用被降解。C-型利尿钠肽(CNP)来源于内皮细胞，作用是血管舒张和生长抑制肽。曼巴利尿钠肽(DNP)分离自白唇曼巴蛇(Dendoaspis angusticeps)或绿色曼巴蛇(green mamba snake)的毒液，其结构类似于ANP、BNP和CNP。

在人充血性心力衰竭期间，血浆和心脏中的ANP和BNP增加，并且除了作为心室机能障碍的血浆标志之外还发挥了心肾保护作用。流行病学证据表明至少3％的45岁以上成年人患有心室收缩机能障碍，52％的患者可能无症状。

发明概述

本发明以鉴定到的另路剪接产生的新形式BNP为基础。另路剪接的人BNP同种型含有BNP的17个氨基酸的二硫环结构，具有独特的羧基末端并得自不同的剪接变异。其中一种同种型，BNP2具有和环相连的独特的33个氨基酸残基的C-末端突出端。该同种型是引入内含子2所致。BNP3含有新发现的14个氨基酸残基的C-末端突出端并且是内含子2中存在的另路剪接纳体所致。如文中所述，心力衰竭期间，心肌细胞中的BNP2和BNP3的表达增加。所以，BNP2和BNP3多肽或编码BNP2或BNP3的核糖核酸可用作心脏疾病的标志。如此，这种多肽或核糖核酸的存在、缺乏或水平可用于诊断心脏疾病并监测心脏疾病的治疗效果。此外，BNP2和BNP3可用作治疗心脏疾病的疗剂。

本发明的特征在于一种纯化多肽和对该多肽具有特异性结合亲和力的抗体。该多肽含有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、35或36所示氨基酸序列；具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少6个毗连残基的序列；与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少65％序列相同性的序列；和与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示片段的至少长6个毗连残基具有至少65％序列相同性的序列。该氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列可具有至少75％(例如，80、90或95％)的序列相同性或与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示片段的至少长6个毗连残基具有至少75％(例如，80、90或95％)的序列相同性。在一些实施方案中，该多肽可含有SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36所示氨基酸序列。药物组合物可含有一种多肽和药学上可接受的运载体。

在另一方面，本发明的特征在于编码上述纯化多肽的分离的核酸、包括该核酸的载体和包括该载体的宿主细胞。所述多肽可由以下核酸序列编码：SEQID NO：5所示核酸序列；SEQ ID NO：5所示核苷酸383到489的核酸序列；SEQID NO：6所示核酸序列或SEQ ID NO：6所示核苷酸388到432的核酸序列。宿主细胞可是真核宿主细胞。

本发明的特征也在于嵌合利尿钠多肽。该多肽具有第一区域和第二区域，第一区域具有选自下组的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：16所示残基1到27的序列；b)SEQ ID NO：17所示残基1到25的序列；c)SEQ ID NO：18所示残基1到23的序列；d)SEQ ID NO：19所示残基1到22的序列；和e)具有1到5个氨基酸取代的a)、b)、c)、d)所述序列；而第二区域具有下组下组的氨基酸序列：f)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列；g)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少6个毗连残基的序列；h)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少具有65％序列相同性的序列；和i)与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示片段至少长6个毗连残基具有至少65％序列相同性的序列。

在另一方面，本发明的特征在于含有下式所示氨基酸序列的纯化多肽：Gly-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Xaa₂₁-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Xaa₂₄-Xaa₂₅-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈-Gly-Xaa₂₉-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Xaa₃₂(SEQ ID NO：20)，其中Xaa₁是Glu或Lys；Xaa₂是Pro、His或Arg；Xaa₃是Pro或Leu；Xaa₄是Pro、Leu、或Ser；Xaa₅是Cys或Pro；Xaa₆是Pro、His、Gln或Arg；Xaa₇是Arg、Phe或Leu；Xaa₈是Asp、Gly或不存在；Xaa₉是Ser、Pro或Leu；Xaa₁₀是Pro或不存在；Xaa₁₁是Ser、Ala或不存在；Xaa₁₂是Pro或Ala；Xaa₁₃是Ala、Phe、Ile或Leu；Xaa₁₄是Pro、Lys或Leu；Xaa₁₅是Val、Leu或Trp；Xaa₁₆是Cys、His或Val；Xaa₁₇是Asp、Ala、Ile、Thr、Pro或Arg；Xaa₁₈是Thr、Pro或His；Xaa₁₉是Val、Ile、Pro、Val、Ser或Leu；Xaa₂₀是Arg、Ser、Ile或Glu；Xaa₂₁是Val、Ile、Ala或Pro；Xaa₂₂是Thr、Val或Leu；Xaa₂₃是Leu、Ser或His；Xaa₂₄是Gly或Ala；Xaa₂₅是Phe、Ser、Thr或Leu；Xaa₂₆是Val、Asp或Leu；Xaa₂₇是Val、Leu或Ser；Xaa₂₈是Ser、Arg或Leu；Xaa₂₉是Asn、Asp、Pro或Thr；Xaa₃₀是His、Gln、Asn、或Thr；Xaa₃₁是Thr、Ile或Ser；Xaa₃₂是Pro、Leu或Glu。

在还有另一方面，本发明的特征是诊断患者心脏疾病的方法。该方法包括提供患者的生物样品；检测该生物样品中BNP2或BNP3的存在与否或水平；基于(至少部分基于)BNP2或BNP3的存在、水平或不存在将患者分类为患有或不患有心脏疾病。心脏疾病可是心力衰竭、不稳定心绞痛、急性心肌梗塞或高血压。可检测BNP2或BNP3的存在与否或水平。在一些实施方案中，检测BNP2和BNP3的存在与否或水平。

患者的心脏疾病也可通过以下方法诊断：提供患者的生物样品；检测该生物样品中编码BNP2或BNP3的核糖核酸的存在与否或水平；基于(至少部分基于)编码BNP2或BNP3的核糖核酸的存在、水平或不存在将患者分类为患有或不患有心脏疾病。心脏疾病可是心力衰竭、不稳定心绞痛、急性心肌梗塞或高血压。

在另一方面，本发明的特征在于一种用于治疗哺乳动物的心脏疾病的方法。该方法包括向哺乳动物施用多肽或核酸以降低心脏疾病症状严重性。该多肽含有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、35或36所示氨基酸序列；具有SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少6个毗连残基的序列；与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少65％序列相同性的序列；和与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示片段的至少长6个毗连残基具有至少65％序列相同性的序列。该氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列可具有至少75％(例如，80、90或95％)的序列相同性或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示片段的至少长6个毗连残基具有至少75％(例如，80、90或95％)的序列相同性。在一些实施方案中，所述多肽可含有SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36所示氨基酸序列。该核酸含有编码上述多肽的序列。该多肽可由以下核酸序列编码：SEQ ID：5所示核酸序列；SEQ ID NO：5所示核苷酸383到489的核酸序列；SEQ ID：6所示核酸序列；SEQ ID NO：6所示核苷酸388到432的核酸序列。心脏疾病可是心力衰竭、不稳定心绞痛、急性心肌梗塞或高血压。

在另一方面，本发明的特征在于一种用于治疗哺乳动物的肾脏疾病的方法。该方法包括向哺乳动物施用多肽或核酸以降低肾脏疾病症状严重性。该多肽含有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、35或36所示氨基酸序列；具有SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少6个毗连残基的序列；与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少65％序列相同性的序列；和与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示片段的至少长6个毗连残基具有至少65％ NO：2所示片段的至少长6个毗连残基具有至少75％(例如，80、90或95％)的序列相同性。在一些实施方案中，所述多肽可含有SEQ ID NO：35或SEQ IDNO：36所示氨基酸序列。该核酸含有编码上述多肽的序列。该多肽可由以下核酸序列编码：SEQ ID：5所示核酸序列；SEQ ID NO：5所示核苷酸383到489的核酸序列；SEQ ID：6所示核酸序列；SEQ ID NO：6所示核苷酸388到432的核酸序列。肾脏疾病可是肾衰竭。

在另一方面，本发明的特征在于一种增加哺乳动物的cGMP的方法。该方法包括向哺乳动物施用文中所述的多肽或编码所述多肽的核酸以增加哺乳动物的cGMP水平。

在另一方面，本发明的特征在于一种扩张哺乳动物的动脉的方法。该方法包括向哺乳动物施用文中所述的多肽或编码所述多肽的核酸以扩张所述动脉。

在另一方面，本发明的特征在于一种提高哺乳动物的利尿和/或利尿钠的方法。该方法包括向哺乳动物施用文中所述的多肽或编码所述多肽的核酸以提高利尿和/或利尿钠。

在另一方面，本发明的特征在于一种纯化抗体。该抗体能与BNP2多肽结合，但不与由SEQ ID NO：16所示序列组成的BNP多肽或由SEQ ID NO：4所示序列组成的BNP3多肽结合。BNP2多肽可含有SEQ ID NO：1所示序列。该抗体可是单克隆抗体。

在另一方面，本发明的特征在于一种纯化抗体。该抗体能与BNP3多肽结合，但不与由SEQ ID NO：16所示序列组成的BNP多肽或由SEQ ID NO：3所示序列组成的BNP2多肽结合。BNP3多肽可含有SEQ ID NO：2所示序列。该抗体可是单克隆抗体。

除非另有定义，文中使用的所有技术与科学术语均和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。虽然可使用和文中所述类似或等价的方法与材料来实践或测试本发明，合适的方法与材料仍是以下描述的。文中提及的所有出版物、专利申请和其它参考文献均全文纳入作为参考。万一发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，文中的材料、方法和实施例仅是说明性而非限制性。

版物、专利申请和其它参考文献均全文纳入作为参考。万一发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，文中的材料、方法和实施例仅是说明性而非限制性。

本发明的其它特征和优点将通过以下详细描述和权利要求而明白。

附图说明

图1A和1B是人(分别是SEQ ID NO：3和5)和犬BNP2(分别是SEQ IDNO：38和14)的核苷酸与氨基酸序列。有下划线的序列表示成熟的肽。

图2是人BNP-3(分别是SEQ ID NO：6和4)的核苷酸与氨基酸序列。有下划线的序列表示成熟的肽(SEQ ID NO：35)。

图3是猩猩(SEQ ID NO：7)、猪(SEQ ID NO：8)、黑猩猩(SEQ ID NO：9)、绵羊(SEQ ID NO：10)、小鼠(SEQ ID NO：11)、人(SEQ ID NO：1)、大猩猩(SEQ IDNO：12)、猫(SEQ ID NO：13)、犬(SEQ ID NO：37)和蛇(SEQ ID NO：15)的C-末端BNP2多肽序列的排列对比。

图4显示了BNP(SEQ ID NO：16)、DNP(SEQ ID NO：17)、ANP(SEQ IDNO：18)和CNP(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列。

发明详述

总体上，本发明提供BNP的同种型(包括BNP2和BNP3多肽)以及使用该同种型作为各种心脏疾病(包括心力衰竭、高血压、不稳定心绞痛、心脏性猝死或急性心肌梗塞)以及肾衰竭的标志的方法。如文中所述，BNP2和BNP3存在于心力衰竭患者的生物样品中，而在对照患者的生物样品中不存在或水平低。因此，可检测生物样品中BNP2或BNP3的存在或水平并可用于诊断心脏疾病、监测心脏疾病治疗效果或追踪疾病的发展情况。BNP同种型的存在或水平可通过下述测量BNP2或BNP3多肽或编码BNP2或BNP3的核糖核酸来评价。

此外，文中提供的多肽(例如，BNP2和BNP3)以及编码这种多肽的核酸可用作治疗心脏疾病和/或肾脏疾病的疗剂。BNP2和BNP3的疗效类似于BNP，而BNP是既不影响心肌收缩力又不影响心脏收缩速率的平衡性血管舒张剂。使用重组BNP(Nesiritide，

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)的静脉内治疗显著降低肺毛细管的楔压和全身血管阻力并提高心脏指数。BNP没有促心率失常作用并且对心率无影响。Burger和Burger，Curr.Coin.Investig.Drugs 2(7)：929-35(2001)。

在一些实施方案中，文中提供的多肽(例如，BNP2和BNP3)或编码这种多肽的核酸可用于刺激哺乳动物产生cGMP和/或舒张动脉。此外，文中提供的多肽(例如，BNP2和BNP3)或编码这种多肽的核酸可用于治疗高血压、肺高血压和/或充血性心力衰竭。在其它实施方案中，文中提供的多肽(例如，BNP2和BNP3)或编码这种多肽的核酸可用于提高哺乳动物的利尿和/或利尿钠。例如，BNP2或BNP3多肽可施用于哺乳动物来增加尿液流动和尿钠排出。此外，文中提供的多肽(例如，BNP2和BNP3)或编码这种多肽的核酸可用于治疗体液过度滞留状态(例如，充血性心力衰竭、肝功能衰竭和肾衰竭)和/或治疗钠过度滞留状态(例如，充血性心力衰竭)。

BNP同种型

本发明的特征在于纯化的BNP同种型。文中所用涉及BNP同种型的术语“纯化的”指基本上不含天然与其相关的其它多肽、脂质、糖类和核酸的多肽。所以，纯化的多肽可是从其天然环境分离出的任何多肽并且至少是60％纯。纯化的多肽可是至少约65、70、75、80、85、90、95或99％纯。纯化的多肽通常在非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳中产生单一的主要条带。

BNP的同种型指符合以下条件的任何多肽：(1)具有SEQ IDNO：1、2、3、4、14、35或36所示氨基酸序列，(2)含有长度约为6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个氨基酸残基，同时与SEQ ID NO：1或2所示该长度的氨基酸序列具有至少约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或更高的相同性百分率的氨基酸序列，或(3)含有能在杂交条件下(见下文)与编码SEQ IDNO：1或2所示序列的核酸的有义链或反义链杂交的核酸序列编码的约6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个连续氨基酸残基。例如，多肽可含有长度为10、15、20、25、30或更多个残基的氨基酸序列并与SEQ ID NO：1所示含有人BNP2的33个氨基酸的C-末端片段(参见图1A)的氨基酸序列具有至少45％的相同性。人BNP2的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，成熟的BNP2多肽的序列如SEQ ID NO：36所示(参见图1A有下划线的序列)。SEQ ID NO：2含有人BNP3的14个氨基酸的C-末端片段(参见图2)。人BNP3的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，而成熟的BNP3多肽的序列如SEQ ID NO：35所示(参见图2有下划线的序列)。

与SEQ ID NO：1所示多肽序列具有至少45％相同性的多肽序列的非限制性例子包括图3的C-末端BNP2多肽序列。例如，人(SEQ ID NO：1)和猪(SEQ

ID NO：8)的C-末端BNP2序列具有约48％的相同性。人(SEQ ID NO：1)和小鼠(SEQ ID NO：11)的C-末端BNP2序列具有约67％的相同性。人(SEQ ID NO：1)和猩猩(SEQ ID NO：7)的C-末端BNP2序列具有约91％的相同性。人(SEQ IDNO：1)、黑猩猩(SEQ ID NO：9)和大猩猩(SEQ ID NO：12)的C-末端BNP2序列具有约97％的相同性。

任何氨基酸序列的长度和该长度的相同性百分率按以下方式确定。首先，使用含有BLASTN 2.0.14版和BLASTP 2.0.14版的独立版BLASTZ的BLAST2 Sequences(B 12seq)程序来比较氨基酸序列与已鉴定的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1)。该独立版BLASTZ可得自万维网的Fish&Richardson P.C.′s网址(″fr点″com/blast/″)或美国政府的生物技术信息国家中心(U.S.government′s National Center for Biotechnology Information)的网址(″ncbi″点″nlm″点″nih″点″gov″)。该独立版BLASTZ也可得自Old Westbury的纽约州立大学图书馆，图书编目号码为QH 447.M6714。如何使用B12seq程序的使用说明见BLASTZ附带的自述文件。B12seq程序使用BLASTN或BLASTP算法在两条序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。

为比较两条氨基酸序列，按照以下设置B12seq的选项：-i设置为含有待比较的第一条氨基酸序列的文件(例如，C:\seq1.txt)；j设置为含有待比较的第二条氨基酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任何需要的文件名(例如，C:\output.txt)；所有其它选项为默认设置。例如，可用以下命令产生含有两条氨基酸序列之间的比较结果的输出文件：C:\B12seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastp-o c:\output.txt。如果靶序列与已鉴定序列的任何部分具有同源性，指定的输出文件会提供作为对比序列的那些同源性区域。如果靶序列与已鉴定序列的任何部分无同源性，指定的输出文件不会提供对比序列。对比后，通过计算靶序列中连续氨基酸残基数目与已鉴定的序列(例如，SEQ ID NO：1)的排列对比来确定长度，该长度始于任何匹配的位置终于任何另一个匹配的位置。匹配位置可是靶序列和已鉴定序列中均存在相同的氨基酸序列的任何位置。既然间隔不是氨基酸残基，靶序列中的间隔不计算。类似地，既然靶序列的氨基酸残基不计算，已鉴定序列中的间隔(而非已鉴定序列中的氨基酸残基)不计算。

确定长度的相同性百分比通过计算该长度上匹配位置的数目除以该长度的数目接着乘以100来确定。例如，如果(1)50个氨基酸的靶序列与SEQ IDNO：1所示序列比较，(2)B12seq程序给出靶序列的20个氨基酸残基和SEQ IDNO：1所示序列的区域对比，其中该20个氨基酸的区域的第一个和最后一个的氨基酸残基匹配，和(3)该20个对比氨基酸中匹配的数目是18，那么该50个氨基酸的靶序列含有长度为20并且在该长度上相同性百分比为90(即，18/20×100＝90)。

应该理解的是，与SEQ ID NO：1所示序列对比的单一氨基酸靶序列可产生许多不同的长度，每个长度具有其自身的相同性百分比。要注意的是相同性百分比的值四舍五入至最接近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入至78.2。也要注意的是长度值总是整数。

杂交条件可是中等或高度严谨的杂交条件。出于本发明目的，中等严谨杂交条件指在含有25mM KPO₄(pH7.4)，5×SSC，5×Denhart溶液，50μg/ml超声波处理变性的鲑鱼精子DNA，50％甲酰胺，10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/ml探针(约5×10⁷cpm/μg)的杂交溶液中于42℃进行杂交，而洗涤在约50℃使用含有2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行。

高度严谨的杂交条件指在含有25mM KPO₄(pH7.4)，5×SSC，5×Denhart 溶液，50μg/ml超声波处理变性的鲑鱼精子DNA，50％甲酰胺，10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/ml探针(约5×10⁷cpm/μg)的杂交溶液中于42℃进行杂交，而洗涤在约65℃使用含有0.2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行。

在一些实施方案中，BNP的同种型可刺激人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)产生cGMP。胞内cGMP的生产可使用，例如BIOTRACK cGMP酶免疫测定试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)来测定。在其它实施方案中，BNP的同种型是血管活性的。可通过测定血管(例如在器官测试室(organ chamber)中的颈动脉)对该同种型的反应性来评价血管活性。

BNP同种型可通过天然来源(例如，从分离的细胞、组织或体液)提取、编码该多肽的重组核酸表达或通过化学合成获得。例如，可用编码BNP同种型(如下所述)的表达载体进行标准重组技术。得到的多肽然后可使用，例如亲和层析技术和HPLC纯化。任何合适的方法可用于测定纯度，包括(但不限于)柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。BNP同种型可“工程改造”使之含有得以纯化该多肽(例如，截留在亲和性基质上)的标记序列。例如，c-myc、血凝素、聚组氨酸或Flag^TM标记(Kodak)有助于多肽纯化。这种标记可插入多肽中的任何位置，包括羧基或氨基末端。其它可用的融合体包括有助于检测该多肽的酶，例如碱性磷酸酶。

可生产为含有两个区域的嵌合性利尿钠多肽，第一区域含有成熟利尿钠多肽(例如，BNP、DNP、ANP或CNP)的N-末端和环形结构而第二区域含有BNP同种型的C-末端部分。BNP的N-末端和环形结构含有SEQ ID NO：16所示残基1到27，而DNP和ANP的N-末端和环形结构分别含有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示残基1到23。BNP、DNP、ANP和CNP的序列示于图4。在其它实施方案中，第一区域可含有具1到5个氨基酸取代的利尿钠多肽的N-末端和环形结构。BNP同种型的合适的C-末端部分与上述SEQ ID NO：1和2所示氨基酸序列具有至少45％相同性。C-末端部分可具有SEQ ID NO：20(下述)所示序列。嵌合多肽可具有利尿钠肽的生物活性，包括刺激细胞产生环状GMP或血管活性的能力。

在一些实施方案中，本发明的多肽可具有下式所示序列：Gly-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Xaa₂₁-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Xaa₂₄-Xaa₂₅-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈-Gly-Xaa₂₉-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Xaa₃₂(SEQ ID NO：20)，其中Xaa₁是Glu或Lys；Xaa₂是Pro、His或Arg；Xaa₃是Pro或Leu；Xaa₄是Pro、Leu、或Ser；Xaa₅是Cys或Pro；Xaa₆是Pro、His、Gln或Arg；Xaa₇是Arg、Phe或Leu Xaa₈是Asp、Gly或不存在；Xaa₉是Ser、Pro或Leu；Xaa₁₀是Pro或不存在；Xaa₁₁是Ser、Ala或不存在；Xaa₁₂是Pro或Ala；Xaa₁₃是Ala、Phe、Ile或Leu；Xaa₁₄是Pro、Lys或Leu；Xaa₁₅是Val、Leu或Trp；Xaa₁₆是Cys、His或Val；Xaa₁₇是Asp、Ala、Ile、Thr、Pro或Arg；Xaa₁₈是Thr、Pro或His；Xaa₁₉是Val、Ile、Pro、Val、Ser或Leu；Xaa₂₀是Arg、Ser、Ile或Glu；Xaa₂₁是Val、Ile、Ala或Pro；Xaa₂₂是Thr、Val或Leu；Xaa₂₃是Leu、Ser或His；Xaa₂₄是Gly或Ala；Xaa₂₅是Phe、Ser、Thr或Leu；Xaa₂₆是Val、Asp或Leu；Xaa₂₇是Val、Leu或Ser；Xaa₂₈是Ser、Arg或Leu；Xaa₂₉是Asn、Asp、Pro或Thr；Xaa₃₀是His、Gln、Asn、或Thr；Xaa₃₁是Thr、Ile或Ser；Xaa₃₂是Pro、Leu或Glu。SEQ ID NO：20的每个位置所示的氨基酸代表存在于天然存在的BNP2多肽中的残基，包括人(SEQ ID NO：3)、猩猩(SEQ ID NO：7)、黑猩猩(SEQ ID NO：9)、大猩猩(SEQ ID NO：12)、猫(SEQ ID NO：13)、犬(SEQ ID NO：14)、小鼠(SEQ IDNO：11)、绵羊(SEQ ID NO：10)和猪(SEQ ID NO：8)的BNP2。编码这种多肽的核酸可按下述方式生产。

本发明的多肽可通过与药学上可接受的无毒赋型剂或运载体混合来配制为药物组合物。这种组合物可以治疗心脏疾病或肾脏疾病的有效量施用至需要它的受试对象。药物组合物可制备成胃肠外施用，特别是用水性生理缓冲液配制成液体溶液或悬浮液形式；制备成口服施用，特别是片剂或胶囊的形式；或制备成鼻内施用，特别是粉末、滴鼻液或气溶胶的形式。用于其它施用途径的组合物可使用标准方法按所需剂型制备。

胃肠外施用的制剂可含有作为常规赋型剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇 (例如聚乙二醇)、植物油、氢化萘等。具体说，生物兼容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是用于控制多肽的体内释放的赋型剂的例子。其它合适的胃肠外传递系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。如果需要，用于吸入施用的制剂可含有，例如乳糖赋型剂。吸入制剂可是含有，例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水性溶液，或者吸入制剂可是以滴鼻液形式施用的油性溶液。如果需要，化合物可配制成凝胶鼻内应用。用于胃肠外施用的制剂也可包括用于含服施用的甘胆酸盐。

为口服施用，片剂和胶囊可通过常规方法使用药学上可接受的赋形剂制备，例如粘合剂(例如，预胶凝化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可通过本领域已知的方法包衣。口服施用的制剂可配制成可实现化合物的控释。

鼻用制剂可以是液体形式或干产品。喷雾水性悬浮剂或溶液可含有运载体或赋形剂来调节pH和/或张力。

编码BNP同种型的核酸

本发明的特征也在于编码BNP多肽的分离的核酸。文中提及核酸时使用的术语“分离的”指天然存在的核酸，该核酸不直接与产生它的生物体的天然基因组中直接毗连的两条序列(一条在5’端，一条在3’端)相毗连。例如，分离的核酸可是(不限于)任何长度的重组DNA分子，前提是通常在天然存在的基因组中发现直接位于重组DNA分子两翼的核酸序列之一已被除去或不存在。所以，分离的核酸包括(不限于)作为脱离了其它序列的独立分子(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及引入载体、自我复制质粒、病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或引入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可含有作为杂交或融合核酸序列一部分的重组DNA分子。

既然非天然存在的核酸序列天然不存在并且不直接与天然存在的基因组中的序列毗连，文中提及核酸时使用的术语“分离的”也包括融合非天然存在的核酸。例如，像工程改造的核酸是非天然存在的核酸可认为是分离的核酸。工程改造的核酸(例如，编码SEQ ID NO：20多肽的核酸)可使用常规的分子克隆或化学核酸合成技术制备。分离的非天然存在的核酸可独立于其它序列，或可引入载体、自我复制质粒、病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或引入原核生物或真核生物的基因组DNA中。此外，非天然存在的核酸可含有作为杂交或融合核酸序列一部分的核酸分子。存在于，例如cDNA文库或基因组文库或含有基因组DNA限制性消化产物的凝胶切片内的成百至数百万的核酸分子中的核酸不能视为分离的核酸。

如文中所用，术语“核酸”指RNA或DNA，包括mRNA、cDNA、基因组DNA、合成(例如，化学合成的)DNA和核酸类似物。核酸可是双链或单链的，并且其中单链核酸可是有义链或反义链。此外，核酸可是环形或线形的。核酸类似物可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰来提高，例如核酸的稳定性、杂交能力或溶解性。在碱基部分的修饰包括脱氧尿苷修饰为脱氧胸苷与5-甲基-2’-脱氧胞苷和5-溴-2’-脱氧胞苷修饰为脱氧胞苷。糖部分的修饰包括核糖的2’羟基修饰为2’-O-甲基或2’-O-丙烯基糖。脱氧核糖磷酸骨架可修饰来产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分与六元吗啉环或肽核酸相连，肽核酸中的脱氧磷酸骨架被假肽骨架取代并保留了4个碱基。参见，例如Summerton和Weller(1997)Antisense Nucleic Acid DrugDev.7：187-195和Hyrup等.，(1996)Bioorgan.Med.Chem.4：5-23。此外，脱氧磷酸骨架可用，例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架，或亚磷酰胺或烷基磷酸三酯骨架取代。

本发明的核酸可具有SEQ ID NO：5或6(参见图1和2)所示序列或具有和SEQ ID NO：5所示核苷酸383到489或SEQ ID NO：6所示核苷酸388到432所示序列至少有45％相同性(例如，45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％相同性)的序列。SEQ ID NO：5所示核苷酸383到489编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。SEQ ID NO：6所示核苷酸388到432编码 SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

序列相同性可通过上述方式测定。BLASTN用于比较核酸序列。为比较两条核酸序列，选项设置为：-i设置为含有待比较的第一条核酸序列的文件(例如，C:\seq1.txt)；-j设置为含有待比较的第二条核酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p设置为blastn；-o设置为任何需要的文件名(例如，C:\output.txt)；-q设置为-1；-r设置为2；所有其它选项为默认设置。以下命令可用于产生含有两条序列之间的比较结果的输出文件：C:\B 12seq-i c:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-p blastn-o c:\output.txt-q-1-r-2。如果靶序列与已鉴定序列的任何部分具有同源性，指定的输出文件会提供作为对比序列的那些同源性区域。如果靶序列与已鉴定序列的任何部分无同源性，指定的输出文件不会提供对比序列。

对比后，通过计算靶序列中连续核苷酸数目与已鉴定序列的排列对比来确定长度，该长度始于任何匹配的位置终于任何另一个匹配的位置。匹配位置可是靶序列和已鉴定序列中均存在相同的核苷酸的任何位置。既然间隔不是核苷酸，靶序列中的间隔不计算。类似地，既然计算靶序列的核苷酸，已鉴定序列中的间隔(而非已鉴定序列中的核苷酸)不计算。

分离的核酸通常至少长10个核苷酸(例如，长10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、200、300、350、400或更多个核苷酸)。小于全长的核酸分子，例如可用于诊断目的的引物或探针。分离的核酸分子可通过标准技术生产，包括(不限于)常规的分子克隆和化学核酸合成技术。例如，可使用聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR指对靶核酸进行酶促扩增的方法或技术。一般利用核酸的感兴趣区域或以外的末端序列信息来设计寡核苷酸引物，该引物序列与有待扩增的模板的相反链相同。PCR可用于扩增DNA以及RNA特异序列(包括基因组总DNA或细胞总RNA的序列)。引物长度一般为15到50个核苷酸，但其长度范围也可从10个核苷酸到数百个核苷酸。例如，引物长度可是12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40或45个核苷酸。引物可通过常规方法从限制性消化产物中纯化或可化学合成。为了最大效率扩增，引物一般是单链的，但也可是双链。双链引物在用于扩增前首先要变性(例如，热处理)以分成两条链。通用PCR技术描述于，例如《PCR引物：实验室手册》(PCRPrimer：A Laboratory Manual)，Dieffenbach和Dveksler编，冷泉港实验室出版社，1995。当使用RNA作为模板源时，可使用逆转录酶来合成互补DNA(cDNA)链。连接酶链式反应、链取代扩增、自动维持序列复制或基于核酸序列的扩增也可用于获得分离的核酸。参见，例如，Lewis GeneticEngineering News12(9)：1(1992)；Guatelli等.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.美国，87：1874-1878和Weiss(1991)Science254：1292。

分离的核酸也可被化学合成为单一核酸分子(例如，使用亚磷酰胺技术以3’到5’方向自动合成DNA)或一系列寡核苷酸。例如，可合成含有所需序列的长的一对或多对长寡核苷酸(例如，＞100个核苷酸)，其中每对含有短的互补性区段(例如，约15个核苷酸)，如此当寡核苷酸对退火时可形成双螺旋。DNA聚合酶用于延伸寡核苷酸，得到的每对寡核苷酸的单链、双链核酸分子，然后这些核酸分子可连接进载体。

分离的核酸也可通过诱变获得。例如，图1、2或3所示的序列可使用标准技术(例如，通过PCR的寡核苷酸定向诱变和/或定点诱变)来诱变。参见，《简单的分子生物学方法》(Short Protocols in Molecular Biology)，第八章，Green Publishing Associates and John Wiley&Sons，Ausubel等编，1992。要修饰的位置的例子可从图3所示的序列对比中鉴定。

编码文中提供的多肽的核酸可通过与药学时可接受的无毒赋形剂或运载体混合配制成药物组合物。这种组合物可以有效量施用于需要它的患者来治疗心脏疾病或肾脏疾病受试对象。

载体和宿主细胞

本发明也提供含有例如上述核酸的载体。文中使用的“载体”是其中插入其它DNA片段能复制该插入片段的复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒。本发明的载体可是表达载体。“表达载体”是含有一条或多条表达控制序列的载体，“表达控制序列”是控制与调节其它DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。

在本发明的表达载体中，核酸操作性连接于一条或多条表达控制序列。文中使用的“操作性连接”指引入遗传构建物，从而表达控制序列可有效地控制感兴趣的编码序列的表达。表达控制序列的例子包括启动子、增强子和转录终止区域。启动子是由DNA分子的一个区域组成的表达控制序列，该区域通常在转录起始点(一般接近RNA聚合酶II的起始位点)的上游100个核苷酸内。为使编码序列受控于启动子，需要将多肽翻译读框的翻译起始位点置于启动子下游1到约50个核苷酸之间。增强子能在时间、位置和水平提供表达特异性。与启动子不同，增强子在离转录位点不同距离的位置均可起作用。增强子也可位于转录起始位点的下游。当RNA聚合酶能将编码序列转录为mRNA，然后该mRNA可翻译成由编码序列编码的蛋白质时，该编码序列就是“操作性连接”于并“受控”于细胞的表达控制序列。

合适的表达载体包括(不限于)质粒和病毒载体，例如得自噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、痘病毒、腺病毒和腺相关病毒的载体。许多载体和表达系统可从以下公司市售获得，例如Novagen(Madison，WI)、Clontech(Palo Alto，CA)、Stratagene(La Jolla，CA)和Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad，CA)。

表达载体可含有标记序列，该序列设计为有助于随后对表达的化学序列进行操作(例如，纯化或定位)。标记序列通常和编码的多肽一起作为融合体表达，例如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、聚组氨酸、c-myc、血凝素或Flag标记(Kodak，New Haven，CT)序列。

本发明也提供含有本发明载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”包括可引入载体的原核或真核细胞。任何方法均可用于将载体引入细胞。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移可用于将分离的核酸引入细胞。此外，如其它文献(美国专利号5,580,859和5,589,466)所述，裸DNA可在体内直接传递进细胞。

使用BNP2或BNP3来诊断心脏疾病的方法

总体上，本发明的方法包括检测患者(例如，人类患者)的生物样品中是否存在BNP的同种型并基于是否存在BNP同种型诊断患者。在其它实施方案中，可确定BNP同种型的水平并与来自对照人群的同种型水平(例如，多位未患心脏疾病的对照受试对象的BNP2平均水平)比较。所以，存在BNP同种型或同种型水平相对于对照人群的增加是心脏疾病的征兆。合适的用于测定BNP同种型的生物样品包括，例如，血液(包括全血、血浆和血清)、尿液唾液、心脏组织和循环细胞。

其它诊断心脏疾病时要考虑的因素包括，例如家族史或其它遗传因素和其它心脏标志(例如，肌钙蛋白I或T、高敏感性C-反应蛋白(hs-CRP)、肌酸激酶(CK)、CK-MB、肌酸酐或肌红蛋白)的水平。总体上，肌红蛋白不是心脏特异性的，但其在心肌梗塞的早期(约梗塞后2-3个小时)释放并在约24小时内恢复正常。肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的心脏同种型是特异性的，但在循环系统中晚于肌红蛋白(梗塞后5-48小时)出现。心肌组织含有一种CK-MB的同种型，而骨骼组织具有不同的同种型。与这种心脏标志具有特异性结合亲和力的抗体市售可得。

受试对象中BNP同种型的存在、不存在或水平也可用于监测对心脏疾病的治疗(例如使用ACE抑制剂或β阻断剂治疗)。例如，可比较治疗前受试对象的BNP同种型的基线水平与治疗后不同时间点(例如，治疗后1个或几个小时、几天、几周或几个月)的同种型水平。BNP同种型水平相对于基线水平降低说明对治疗有正面反应。如上所述，基于BNP同种型的存在、不存在或水平和其它心脏标志的水平来监测治疗效果。

检测BNP同种型

BNP同种型(例如BNP2或BNP3)例如可使用一种或多种抗体以免疫方法测定。文中使用的术语“抗体”或“多种抗体”包括能结合BNP同种型的表位决定簇的完整的分子及其片段。术语“表位”指抗原上的能与互补抗体结合的抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖的侧链)组成，一般具有特异性的三维结构特征以及特异性的荷电特征。表位一般具有至少5个毗连氨基酸(连续表位)，或者可是由一系列非毗连氨基酸确定的特定结构(例如，构象表位)。术语“抗体”或“多种抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体、单链Fv抗体片段、Fab片段和F(ab)₂片段。多克隆抗体是存在于免疫底物血清中的异质性抗体分子群。单克隆抗体是针对某特定抗原表位的均质性抗体分子群。

与BNP同种型具有特异性结合亲和力的抗体片段可通过已知技术产生。例如，F(ab’)₂片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子生产；Fab片段可通过还原F(ab’)₂片段的二硫键产生。或者，可构建Fab表达文库。参见，例如Huse等.， Science，246：1275(1989)。产生后，通过标准免疫测定技术测试抗体或其片段识别BNP同种型的能力，所述技术包括ELISA技术、放射性免疫测定和Western印迹。参见，《分子生物学的简单方法》(Short Protocols inMolecular Biology)，第11章，Green Publishing Associates and John Wiley&Sons，Ausubel，F.M等编，1992。

在免疫测定中，可直接或间接标记和BNP同种型具有特异性结合亲和力的抗体或结合这种抗体的二抗。合适的标记包括(不限于)放射性核素(例如， ¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H、³²P、³³P或¹⁴C)、荧光分子(例如，荧光素、FITC、PerCP、罗丹明或PE)、发光分子(例如，Quantum Dot Corporation，Palo Alto，CA提供的Qdot^TM纳米颗粒)、吸收具有确定波长的光的化合物或酶(例如，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)。抗体可通过与生物素偶联来间接标记，然后用以上述分子标记的亲和素或链霉亲和素测定。测定或定量标记的方法取决于标记的性质并且是本领域已知的。检测器的例子包括(不限于)X-射线感光膜、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光计、光度计和密度计。本领域技术人员所熟悉的这些方法的联合使用(包括“多层”测定)可用于提高测定的灵敏性。

用于检测BNP同种型的免疫测定可以各种已知的形式进行，包括夹心试验、竞争性试验(竞争性RIA)或桥连免疫试验。参见，例如，美国专利号5,296,347；4,233,402；4,098,876和4,034,074。检测BNP同种型的方法通常包括将生物样品与结合BNP同种型的抗体接触并检测BNP同种型与该抗体的结合情况。例如，可通过本领域已知的各种方式将和BNP同种型具有特异性结合亲和力的抗体固定在固体基材上，然后与生物样品接触。BNP同种型与固体基材上的抗体的结合情况可利用表面等离子共振的现象来检测，二者的结合导致表面等离子共振强度的变化可通过合适的仪器(例如，Biacore apparatus(Biacore International AB，Rapsgatan，Sweden))定量或定性地检测。或者，可按上述方法标记抗体并检测。使用已知量的同种型得到的标准曲线有助于定量同种型的水平。

在其它实施方案中，将捕捉抗体固定在固体基材上的“夹心”试验用于检测BNP同种型的存在与否或水平。固体基材可与生物样品接触，从而使得样品中的任何BNP2或BNP3能与固定的抗体结合。与抗体结合的BNP同种型的存在与否或水平可使用和同种型具有特异性结合亲和力的“检测”抗体与上述方法来确定。在一些实施方案中，使用对BNP以及BNP2和BNP3具有结合亲和力的捕捉抗体。在本实施方案中，可使用和BNP2或BNP3具有特异性结合亲和力的检测抗体。要理解的是，在夹心试验中，捕捉抗体应不能结合与检测抗体相同的表位(如果是多克隆抗体，则是表位的范围)。所以，如果单克隆抗体用作捕捉抗体，检测抗体可以是其结合的表位与捕捉抗体结合的表位完全在物理上分开的或部分重叠的另一种单克隆抗体，或者是所结合的表位与捕捉单克隆抗体结合的表位不同或除此之外的其它表位的多克隆抗体。如果多克隆抗体用作捕捉抗体，检测抗体可以是其结合的表位与捕捉多克隆抗体结合的表位完全在物理上分开或部分重叠的单克隆抗体，或者是结合的表位与捕捉多克隆抗体结合的表位不同或除此之外的其它表位的多克隆抗体。进行夹心试验可以夹心ELISA测定、夹心Western印迹测定或夹心免疫磁性测定。

抗体(例如，捕捉抗体)可结合的合适的固体基材包括(不限于)微滴定板、试管、膜(例如，尼龙或硝酸纤维素膜)、和珠或颗粒(例如。琼脂糖、纤维素、玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、磁性或能磁化的珠或颗粒)。当使用自动免疫测定系统时，磁性或能磁化的颗粒是特别有用的。

与BNP的同种型具有特异性结合亲和力的抗体可通过标准的方法生产。总体上，多肽可以上述方法重组生产，或可从生物样品中纯化，并可用于免疫宿主动物(包括兔、鸡、小鼠、豚鼠或大鼠)。例如，具有SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列的多肽或其长度至少为6个氨基酸的片段可用于免疫动物。提高免疫应答的各种佐剂的使用取决于宿主的种类，包括弗氏佐剂(完全的或不完全的)，矿物凝胶，例如氢氧化铝，表面活性物质，例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油性乳剂、钥孔血蓝素和二硝基苯酚。多克隆抗体可使用BNP多肽和标准杂交瘤技术来制备。特别是，单克隆抗体可使用连续培养细胞系产生抗体分子的技术获得，例如Kohler，G等(Nature，256：495(1975))所述、人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等.，Immunology Today，4：72(1983)；Cole等.，Proc.Natl.Acad.Sci，美国，80：2026(1983))和EBV-杂交瘤技术(Cole等.，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)，Alan R.Liss，Inc.，77-96页，(1983))。这种抗体可是任何类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚型。生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤可在体内或体外培养。

其它检测BNP2和BNP3的技术包括质谱-分光光度技术，例如电喷雾离子化(ESI)，和衬质辅助激光解吸-电离(MALDI)。参见，例如，Gevaert等.， Electrophoresis22(9)：1645-51，2001；Chaurand等.，J Am Soc Mass Spectrom10(2)：91-103，1999。在这些应用领域有用的质谱分光光度仪得自AppliedBiosystems(Foster City，CA)；Bruker Daltronics(Billerica，MA)和AmershamPharmacia(Sunnyvale，CA)。

检测编码BNP同种型的核酸

许多临床诊断技术可用于检测编码BNP同种型的核糖核酸。可在固体基材上，例如尼龙膜(例如，大阵列(macroarray))或微阵列(例如，微芯片)或在溶液(例如，ORIGEN技术)中进行杂交。在一些实施方案中，基于核酸的方法可包括使用，例如PCR的扩增步骤。PCR的模板核酸无需纯化；它可是复杂混合物(例如细胞裂解物)的微小组分。模板DNA或RNA可使用常规技术提取自生物样品。

PCR扩增产物产生后，其可通过，例如使用FRET技术进行杂交来检测。FRET技术(参见，例如，美国专利号4,996,143；5,565,322；5,849,489和6,162,603)基于以下概念，即当供体的荧光分子和对应的受体荧光分子相互之间有一定距离，可目测或检测到和定量测定两种荧光分子之间发生的能量转移。两个各自含有荧光分子的寡核苷酸探针与扩增产物在特定位置杂交，可用与靶核酸序列互补的寡核苷酸探针测定。核苷酸探针杂交到扩增产物的合适位置后产生FRET信号。杂交温度和时间可从约35℃到65℃，约10秒到1分钟。FRET检测可实时进行，如此可检测每一轮PCR试验后扩增产物的增加，在一些实施方案中可对其定量测定。

可使用，例如光子计数落射荧光显微镜系统(装有用于检测特定波长范围的荧光发射光的合适分色镜和滤镜)、光子计数光电倍增器系统或荧光计进行荧光分析和定量。可使用适当过滤来激发所需范围的氩离子激光、高强度水银弧光灯、光纤光源或另一种高强度光源来激发引起能量转移。

荧光分子可是，例如供体分子和对应的受体分子。如文中所用对于供体和对应受体荧光分子而言，“对应的”指具有和供体荧光分子的激发光谱相重叠的发射光谱的受体荧光分子。受体荧光分子的发射光谱的最大波长通常比供体荧光分子的激发光谱的最大波长至少大100nm，如此在二者之间可产生足够的非放射性能量转移。

通常选择荧光供体和对应的受体分子依据：(a)高效的Forester能量转移；(b)大的Stokes漂移(＞100nm)；(c)发射光谱的漂移尽可能在可见光谱的红光分子(＞600nm)中；和(d)发射光谱漂移至大于供体激发波长激发的Raman水荧光发射光谱的波长。例如，可选择最大激发波长接近激光线(例如，Helium-Cadmium 442nm或氩488nm)、高消光系数、高量子产率和其荧光发射光谱与对应受体荧光分子的激发光谱有良好重叠的供体荧光分子。可选择高消光系数、高量子产率、其激发光谱荧光与供体荧光分子的发射光谱有良好重叠以及发射光谱在可见光谱的红光分子(＞600nm)的对应受体荧光分子。

可与各种受体荧光分子一起用于FRET技术的代表性供体荧光分子包括荧光黄、Lucifer Yellow、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、Lucifer YellowVS、4-乙酰氨基-4′-异硫-氰酸茋-2，2′-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸盐(succinimdyll-pyrene butyrate)和4-乙酰氨基-4′-异硫-氰酸茋-2，2′-二磺酸衍生物。取决于使用的供体荧光分子，代表性受体荧光分子包括LC^TM-Red 640、LC^TM-Red 705、Cy5、Cy5.5、Lissamine罗丹明B磺酰氯、罗丹明异硫氰酸四甲酯(tetramethyl rhodamineisothiocyanate)、罗丹明x异硫氰酸酯(rhodamine x isothiocyanate)、赤藓红异硫氰酸酯(erythrosine isothiocyanate)、荧光黄、五乙酸二亚乙基三胺(diethylenetriamine pentaacetate)和其它镧系离子螯合剂(例如，Europium或Terbium)。供体和受体荧光分子可得自，例如Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。

供体和受体荧光分子可通过连接臂和探针寡核苷酸相连。由于连接臂会影响供体和受体荧光分子之间的距离，其长度很重要。用于本发明的连接臂的长度是以埃(

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000221

)计的从核苷酸碱基到荧光分子的距离。总体上，连接臂的长度约为10到25

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000222

。连接臂的类型可是例如WO 84/03285中所述的类型。WO84/03285也描述了将连接臂与特定的核苷酸碱基相连以及使荧光分子与连接臂相连的方法。

受体荧光分子(例如LCTM-Red 640-NHS-酯)可与C6-亚磷酰胺(得自ABI(Foster City，CA)或Glen Research(Sterling，VA))结合来产生，例如LCTM-Red 640-亚磷酰胺。经常用于偶联供体荧光分子(例如荧光黄)和寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如购自Glen Research或ChemGene(Ashland，MA)荧光黄-CPG′s)、酰胺接头(荧光黄-NHS-酯-衍生的，例如购自BioGenex(San Ramon，CA)荧光黄-CPG)或在寡核苷酸合成后需要偶联荧光黄-NHS-酯的3′-氨基-CPG′s。

使用市售可得的实时PCR仪器(例如，LightCycler^TM，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)，PCR扩增、扩增产物的检测和定量可合并在一个封闭的比色皿中进行，因而极大地减少了循环用时。既然检测和定量可与扩增同时进行，实时PCR方法无需对扩增产物进行操作，减少了扩增产物之间交叉污染的风险。实时PCR极大减少了周转时间因而相比于常规PCR技术是临床实验室或该领域中有吸引力的替代方法。

对照样品可包括在每轮热循环中。阳性对照样品可使用，例如对照引物和对照探针来扩增核酸对照模板(例如，除靶核酸以外的核酸)。阳性对照样品也能扩增，例如含有对照核酸模板的质粒构建物。这种对照质粒可内部扩增(例如，在样品内)或可在与测试样品同时操作的独立样品中扩增。每轮热循环也应包括阴性对照，例如缺乏靶模板DNA的阴性对照。这种对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。因此，对照反应可容易地确定，例如引物与特异性序列退火和引发延伸的能力，以及探针与特异性序列杂交的能力和FRET的发生。

另一种FRET形式利用

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000231

技术来检测扩增产物的存在与否或水平，从而检测编码BNP同种型的核酸的存在与否或水平。

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000232

技术利用以两种荧光分子标记的一条单链杂交探针。当第一荧光分子被合适波长的光激发，吸收的能量按照FRET的原理转移至第二荧光分子。第二荧光分子通常是猝灭分子。在PCR反应的退火步骤中，标记的杂交探针与靶DNA(即，扩增产物)结合并在其后的延伸阶段被Taq聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性所降解。结果受激发的荧光分子和猝灭剂分子在空间上相互分离。无猝灭剂时激发第一荧光分子后，可检测到作为结果的第一荧光分子的荧光发射光谱。举例来说，

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000233

7700序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)使用

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000234

技术，适合于进行文中所述的方法来检测BNP同种型。使用ABI

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000235

7700系统进行PCR扩增和检测的信息可见Applied Biosystems的网址。

也可使用本发明的实时PCR方法与FRET结合的分子信号来检测扩增产物的存在。分子信号技术使用标记有第一荧光分子和第二荧光分子的杂交探针。第二荧光分子通常是一种猝灭剂并且荧光标记一般位于探针的两端。分子信号技术使用具有可形成二级结构(例如，发夹结构)的序列的寡核苷酸探针。探针中形成二级结构的结果是当探针处于溶液中时，两个荧光分子在空间上靠近。与靶核酸(即，扩增产物)杂交后，探针的二级结构遭到破坏并且荧光分子相互分开，从而使得在用合适波长的光激发后可检测第一荧光分子的发射光谱。

作为FRET的替代方案，扩增产物可使用，例如荧光DNA结合染料(例如，

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000241

或

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000242

(Molecular Probes))来检测。与扩增产物相互作用后，这种DNA结合染料在用合适波长的光激发后可发射出荧光信号。也可使用双链DNA结合染料，例如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，经常进行熔解曲线分析来确认扩增产物的存在。

制造的物品

BNP同种型、编码BNP同种型的核酸或与BNP(例如，BNP2或BNP3)同种型具有特异性结合亲和力的抗体可用联合装在包装材料中以试剂盒出售。这种试剂盒可用于诊断心脏疾病、监测心脏疾病的治疗效果、监测心脏疾病的进程或治疗心脏或肾脏疾病。用于生产所制造物品的成分和方法是熟知的。制造的物品可将一种或多种文中所述的多肽、核酸或抗体装在一起。此外，制造的物品还包括试剂，例如二抗、抗BNP的抗体、缓冲液、指示分子、固相物(例如，珠)和/或其它用于诊断心脏疾病、监测心脏疾病的治疗效果、监测心脏疾病的进程的试剂。可将抗体装在容器中，例如塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器，该容器可是有盖试管或瓶子，或者可将抗体包括在固相中，例如含有抗体(例如，抗BNP2或BNP3抗体)的用于枕边测试的便携式装置。描述各种试剂是如何有效地治疗心脏或肾脏疾病、监测心脏疾病的治疗或监测心脏疾病的进程的使用说明书也可包装在这种试剂盒中。

以下实施例将进一步描述本发明，而不是限制权利要求所述本发明的范围。

实施例

实施例1-鉴定脑利尿钠肽-2(BNP-2)

已确定BNP基因组序列的内含子2编码与蛇DNP多肽的C-末端具有同源性的多肽。为确认内含子2编码的多肽是否被表达，使用分离自患或未患心力衰竭患者的肾脏、大脑和心脏(左心室和心房)组织的细胞RNA进行Northern印迹。约5μgRNA经含有甲醛的1％琼脂糖凝胶电泳后转移至尼龙膜。使用购自Ambion，Inc.(Austin，TX)的NorthernMax^TM试剂盒按照生产商的使用说明进行Northern印迹。尼龙膜经紫外自动交联、于42℃预杂交1小时，于42℃和含有第二种内含子序列的标记探针杂交过夜。使用随机引物DNA标记系统(Gibco BRL)以³²P标记该探针。于室温以低严谨缓冲液(NorthernMax^TM试剂盒中提供，等于2×SSC、0.1％SDS或2×SSPE、0.1％SDS)洗涤膜两次，每次5分钟，然后于42℃以高严谨缓冲液(NorthernMax^TM试剂盒中提供，等于0.1×SSC、0.1％SDS或0.1×SSPE、0.1％SDS)洗涤两次，每次15分钟。印迹上的杂交信号通过放射自显影分析。在心力衰竭患者的左心房组织中检测到第二种内含子的信使RNA。

实施例2-克隆人BNP-2

使用

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000251

试剂(Gibco BRL)分离正常人和心力衰竭病人的心脏组织的总RNA。使用寡聚(dT)引物和Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)的ThermoScript^TMRT-PCR试剂盒，按照生产商的使用说明产生互补DNA(cDNA)。使用具有序列：5′-AGACATGGATCCCCAGACAG-3′(SEQ IDNO：21；具有下划线的是5′起始密码子)的正向引物和具有序列：5′-CAAGAGGAAGCGATGTCCAG-3′(SEQ ID NO：22，位于第二种内含子的核苷酸113到133)的反向引物进行RT-PCR。cDNA与引物混合后，在94℃进行4分钟的初始变性，然后进行35轮94℃变性、5秒，在52℃退火1分钟，72℃延伸45秒，然后72℃最终延伸10分钟。得到的PCR产物(～520bphBNP2cDNA)亚克隆进ToPo载体并测序确认。hBNP2cDNA的核酸序列示于图1A。

实施例3-克隆犬BNP-2

使用

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000252

试剂(Gibco BRL)分离正常犬和心力衰竭犬的心脏组织的总RNA。使用寡聚(dT)引物和Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)的ThermoScript^TM RT-PCR试剂盒，按照生产商的使用说明产生cDNA。使用具有序列5′-TTCTCTCCAGCGACATGGAG-3′(SEQ ID NO：23，具有下划线的是5′起始密码子)的正向引物和具有序列：5′GGACTCTTTCTGCTCCAAGG-3′(SEQ ID NO：24，位于第二种内含子的核苷酸288到308)的反向引物进行RT-PCR。cDNA与引物混合后，在94℃进行4分钟的初始变性，然后进行35轮94℃变性、30秒，在55℃退火1分钟，72℃延伸45秒，然后在72℃最终延伸10分钟。得到的PCR产物(～540bp dBNP2cDNA)亚克隆进ToPo载体并测序确认。dBNP2cDNA的核酸序列示于图1B。

实施例4-克隆人BNP-3

从人的心脏组织中分离总RNA并按实施例2所述产生cDNA。使用具有序列：5′-AGACATGGATCCCCAGACAG-3′(SEQ ID NO：25；具有下划线的是5′起始密码子)的正向引物和具有序列：5′TTTCTGCACCACTTTGCAGC-3′(SEQ ID NO：26，其中引物的有下划线的部分是第二种外显子的3’序列，引物的无下划线的部分对应于第二种内含子的289-300位)的反向引物进行RT-PCR。cDNA与引物混合后，在94℃进行4分钟的初始变性，然后进行35轮94℃变性、30秒，在60℃退火1分钟，72℃延伸45秒，然后在72℃最终延伸10分钟。得到的PCR产物(～380bp hBNP3cDNA)亚克隆进ToPo载体并测序确认。HBNP3的核酸序列示于图2。

实施例5-生产抗人BNP2的抗体

通过Mayo蛋白核心设备合成了对应于成熟的人BNP2肽残基27-60的肽，并将其用于生产多克隆抗体。两只家兔先接种500μg的该肽和完全弗氏佐剂，然后加强接种3次250μg的该肽和不完全弗氏佐剂。每次加强接种后，通过Western-印迹评价血清(抗体)。一只家兔(#1105)在免疫接种后表现出特异性应答，定期加强接种使其维持高抗体滴度。

多克隆抗BNP2抗体用于检测人心脏组织中的BNP2。两套人心脏、左心房组织(正常和心力衰竭)的石蜡包埋切片脱石蜡并用抗原恢复缓冲液处理。一套切片用5倍稀释的多克隆兔抗-BNP2抗体培育，另一套用免疫前兔血清培养。抗兔生物素偶联物和链霉亲和素-碱性磷酸酶用于显色。BNP2仅在心力衰竭患者的心脏组织中检测到。

实施例6-生产抗-人BNP3抗体

通过Mayo蛋白核心设备合成了对应于成熟的人BNP3肽残基27-41的肽，并将其用于生产多克隆抗体。两只家兔先接种500μg的该肽和完全弗氏佐剂，然后加强接种3次250μg的该肽和不完全弗氏佐剂。每次加强接种后，通过Western-印迹评价血清(抗体)。一只家兔(#1403)在免疫接种后表现出特异性应答，定期加强接种使其维持高抗体滴度。

多克隆抗BNP3抗体用于检测人心脏组织中的BNP3。两套人心脏、左心房组织(正常和心力衰竭)的石蜡包埋切片脱石蜡并用抗原恢复缓冲液处理。一套切片用5倍稀释的多克隆兔抗-BNP3抗体培育，另一套用免疫前兔血清培育。抗兔生物素偶联物和链霉亲和素-碱性磷酸酶用于显色。BNP3仅在心力衰竭患者的心脏组织中检测到。

实施例7-人心脏组织中BNP同种型的表达水平

用实时PCR评价了BNP、BNP2和BNP3在正常心房组织和心力衰竭心房组织中的表达水平。采用RNA中的GAPDH水平作为内部控制。按以上实施例2所述分离心脏组织的总RNA。通过逆转录酶和寡聚dT合成第一链cDNA。用LightCycler仪器和FastStart DNA SYBR Green I试剂盒(Roche)进行PCR。PCR反应混合物含有2μlcDNA、2μL FastStart DNA Master

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000271

Green I(Roche)、2.4μl MgCl₂储备溶液(25mM)、0.5μM各种引物(参见表1)和无菌水，总体积为20μl。利用Primer3软件选择所有引物(WhiteheadInstitute)。

表1

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000281

采用45轮95℃变性、10秒，60℃退火5秒，72℃延伸10秒来扩增产物。检测每次反应得到的纯化的PCR产物并用作定量测定标准品。所有的定量均标准化为GAPDH内源性对照。不使用模板对照来确定样品中是否存在荧光污染物。为证实扩增的特异性，对PCR产物依次经过熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳。

如表2所示，在正常心脏组织中未发现BNP3。心力衰竭心脏组织BNP2的表达水平比正常心脏组织约高7倍。BNP2和BNP3的信使RNA占总BNPRNA的5％。

表2

	BNP	BNP2	BNP3
				正常心脏组织	58	2025	0.19
心力衰竭心脏组织	233100	13151	3807

实施例8-用BNP同种型刺激cGMP的生产

使用补加了EGM-2Bullet试剂盒(CC-3162)(Clonetics，East Rutherford，NJ)提供的成分的内皮细胞培养基(EGMTM-2)在96-孔板中培养人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)。细胞达到约80％汇合时，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤板，然后与溶解在EBM-2中的0、0.1、1或10μM合成hBNP3成熟肽(SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVVQKENQTFPPGFL，SEQ IDNO：35)孵育30分钟，EMB-2中含有补充物和0.5mM IBXM。孵育后，吸弃培养基用BIOTRACK cGMP酶免疫测定试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)测定细胞产生的胞内cGMP。按照同一实验中平行反应得到的标准曲线计算cGMP的量。如表3所示，BNP3浓度增加导致cGMP产量增加。

表3

Figure DEST_PATH_G200480020964720060209D000291

实施例9-BNP同种型的血管活性

用新西兰白兔颈动脉评价在器官测试室中的血管活性。无痛致死后，立即将颈动脉浸入冷的Krebs溶液中。切下～4mm长的动脉环(n＝6)，连接到等力置换传感器并悬浮于注有25ml Krebs(94％O₂、6％CO₂)的器官测试室中。37℃平衡动脉环1小时，然后递增延伸至3g。用60mM KCl测定活力和最大收缩力。用Krebs溶液洗涤3次，再次平衡，以滴定方式使用去甲肾上腺素使动脉预收缩稳定达到最大收缩的80％。为研究其血管活性，BNP3(终浓度10^-10到10^-7M)或运载体以累积方式加入器官浴中。再洗涤3次并平衡后，通过使用递增剂量的硝普钠(10^-9到10^-5M)，一种外源性NO供体使动脉再次收缩来评价非内皮依赖性应答以证实其活力。

BNP3引起的血管松弛始于10^-9M浓度，血管反应程度以剂量依赖性的方式增加，在剂量10^-8M和10^-7M时分别观察到-60％和-95％的完全松弛。对照动脉环中未见反应。这些数据证实BNP3在类似于其它利尿钠肽所报道的浓度是血管活性。参见，Best等.，Cardiovas.Research 55：375-384(2002)。

实施例10-在正常犬中肾内输注BNP-3

为确定BNP-3的生理作用，将合成的肽通过直接肾内动脉输注(0.03ng/kg/min)传递至正常犬。在15分钟输注期后进行生理评价。以此剂量输注BNP-3导致血浆cGMP上升。这种cGMP的上升与尿流增加(6-8倍)和尿排钠的增加相关。将冲洗期间得到的两种增加值标准化。

其它实施方案

应该理解的是尽管结合本文的详细说明对本发明进行了描述，但以上描述是说明性的并不限制本发明的范围。本发明的其它方面、优点和改进形式均在下述权利要求的范围内。

序列表

<110>S.潘(Pan，Shuchong)

R.D.西马瑞(Simari，Robert D)

<120>脑利尿钠肽的同种型

<130>07039-409WO1

<140>PCT/US2004/017554

<141>2004-06-02

<150>US 60/480,460

<151>2003-06-20

<160>38

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>33

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Gly Lys His Pro Leu Pro Pro Arg Pro Pro Ser Pro Ile Pro Val Cys

1 5 10 15

Asp Thr Val Arg Val Thr Leu Gly Phe Val Val Ser Gly Asn His Thr

20 25 30

Leu

<210>2

<211>14

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Val Val Gln Lys Glu Asn Gln Thr Phe Pro Pro Gly Phe Leu

1 5 10

<210>3

<211>162

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro

20 25 30

Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn

35 40 45

His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu

50 55 60

Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg

65 70 75 80

Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr

85 90 95

Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys

100 105 110

Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys

115 120 125

Lys Gly Lys His Pro Leu Pro Pro Arg Pro Pro Ser Pro Ile Pro Val

130 135 140

Cys Asp Thr Val Arg Val Thr Leu Gly Phe Val Val Ser Gly Asn His

145 150 155 160

Thr Leu

<210>4

<211>143

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro

20 25 30

Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn

35 40 45

His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu

50 55 60

Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg

65 70 75 80

Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr

85 90 95

Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys

100 105 110

Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys

115 120 125

Lys Val Val Gln Lys Glu Asn Gln Thr Phe Pro Pro Gly Phe Leu

130 135 140

<210>5

<211>489

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

atggatcccc agacagcacc ttcccgggcg ctcctgctcc tgctcttctt gcatctggct 60

ttcctgggag gtcgttccca cccgctgggc agccccggtt cagcctcgga cttggaaacg 120

tccgggttac aggagcagcg caaccatttg cagggcaaac tgtcggagct gcaggtggag 180

cagacatccc tggagcccct ccaggagagc ccccgtccca caggtgtctg gaagtcccgg 240

gaggtagcca ccgagggcat ccgtgggcac cgcaaaatgg tcctctacac cctgcgggca 300

ccacgaagcc ccaagatggt gcaagggtct ggctgctttg ggaggaagat ggaccggatc 360

agctcctcca gtggcctggg ctgcaaaggt aagcaccccc tgccaccccg gccgccttcc 420

cccattccag tgtgtgacac tgttagagtc actttggggt ttgttgtctc tgggaaccac 480

actctttga 489

<210>6

<211>432

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

atggatcccc agacagcacc ttcccgggcg ctcctgctcc tgctcttctt gcatctggct 60

ttcctgggag gtcgttccca cccgctgggc agccccggtt cagcctcgga cttggaaacg 120

tccgggttac aggagcagcg caaccatttg cagggcaaac tgtcggagct gcaggtggag 180

cagacatccc tggagcccct ccaggagagc ccccgtccca caggtgtctg gaagtcccgg 240

gaggtagcca ccgagggcat ccgtgggcac cgcaaaatgg tcctctacac cctgcgggca 300

ccacgaagcc ccaagatggt gcaagggtct ggctgctttg ggaggaagat ggaccggatc 360

agctcctcca gtggcctggg ctgcaaagtg gtgcagaaag agaaccaaac atttcctcct 420

ggtttcctct aa 432

<210>7

<211>44

<212>PRT

<213>猩猩(Pongo pygmaeus)

<400>7

Gly Gly His Pro Leu Pro Pro Arg Leu Pro Ala Pro Ile Pro Val Cys

1 5 10 15

Asp Thr Val Arg Val Thr Leu Gly Phe Val Val Ser Gly Asn His Thr

20 25 30

Leu Arg Lys Cys His Leu Asp Ile Thr Ser Ser Cys

35 40

<210>8

<211>58

<212>PRT

<213>猪(Sus scrofa)

<400>8

Gly Glu His Pro Pro Pro Phe Pro Leu His Ala Pro Val Ser Ile Thr

1 5 10 15

Ser Gly Phe Asp Val Ser Gly Asp Gln Thr Pro Arg Lys Gly His Leu

20 25 30

Asp Ile Thr Leu Ser Cys Cys Gln Ser Ser Arg Pro Arg Ser Ala Phe

35 40 45

Leu Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser Ile His

50 55

<210>9

<211>33

<212>PRT

<213>黑猩猩(Pan troglodytes)

<400>9

Gly Glu His Pro Leu Pro Pro Arg Pro Pro Ser Pro Ile Pro Val Cys

1 5 10 15

Asp Thr Val Arg Val Thr Leu Gly Phe Val Val Ser Gly Asn His Thr

20 25 30

Leu

<210>10

<211>78

<212>PRT

<213>绵羊(Ovis aries)

<400>10

Gly Glu Arg Leu Ser Ala Phe Pro Leu His Ile Thr Ile Arg Ala Thr

1 5 10 15

Ser Gly Ser Asp Val Ser Gly Asp Gln Ile Leu Asn Lys Glu His His

20 25 30

Ser Ser Leu Leu Ala Val Leu Arg Ala Lys Ala Cys Leu Ser Gly Asn

35 40 45

Ile Lys Phe Gly Gln His Ser Leu Ser Cys Leu Gly Ala Pro Ser Ile

50 55 60

His Leu Leu Pro Leu Thr Glu Arg Gly Arg Ile Phe Arg Met

65 70 75

<210>11

<211>26

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>11

Gly Glu His Leu Pro Cys His Phe Pro Ala Lys Leu His Thr His Pro

1 5 10 15

Ile Pro Val His Ala Thr Leu Arg Gly Pro

20 25

<210>12

<211>33

<212>PRT

<213>大猩猩(Gorilla gorilla)

<400>12

Gly Glu His Pro Leu Pro Pro Arg Pro Pro Ser Pro Ile Pro Val Cys

1 5 10 15

Asp Thr Val Arg Val Thr Leu Gly Phe Val Val Ser Gly Asn His Thr

20 25 30

Leu

<210>13

<211>86

<212>PRT

<213>猫(Felis catus)

<400>13

Gly Lys Pro Pro Pro Cys 6ln Leu Asp Pro Pro Ala Pro Leu Leu Trp

1 5 10 15

Val Pro Pro Ser Glu Pro Leu Leu Gly Leu Leu Ser Leu Gly Thr Asn

20 25 30

Ser Glu Lys Lys Thr Leu Gly Leu Tyr Ser Leu Leu Leu Thr Val Leu

35 40 45

Lys Ala Lys Gly Arg Leu Ser Gly Asn Ile Lys Cys Gly His His Ser

50 55 60

Leu Leu Cys Pro Pro Arg Val Thr His Leu Leu Leu Pro Leu Trp Pro

65 70 75 80

Lys Gly Ala Glu Ser Pro

85

<210>14

<211>169

<212>PRT

<213>犬(Canis familiaris)

<400>14

Met Glu Pro Cys Ala Ala Leu Pro Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu His Leu Ser Pro Leu Gly Gly Arg Pro His Pro Leu Gly Gly Arg

20 25 30

Ser Pro Thr Ser Glu Ala Ser Glu Ala Ser Glu Ala Ser Gly Leu Trp

35 40 45

Ala Val Gln Glu Leu Leu Gly Arg Leu Lys Asp Ala Val Ser Glu Leu

50 55 60

Gln Ala Glu Gln Leu Ala Leu Glu Pro Leu His Arg Ser His Ser Pro

65 70 75 80

Ala Glu Ala Pro Glu Ala Gly Glu Glu Arg Pro Val Gly Val Leu Ala

85 90 95

Pro His Asp Ser Val Leu Gln Ala Leu Arg Arg Leu Arg Ser Pro Lys

100 105 110

Met Met His Lys Ser Gly Cys Phe Gly Arg Arg Leu Asp Arg Ile Gly

115 120 125

Ser Leu Ser Gly Leu Gly Cys Asn Gly Lys Pro Pro Pro Cys His Leu

130 135 140

Gly Ser Pro Ser Pro Ala Pro Trp Val Arg Pro Leu Glu Pro Leu Leu

145 150 155 160

Gly Leu Leu Ser Arg Gly Ile Thr Leu

165

<210>15

<211>15

<212>PRT

<213>白唇曼巴蛇(Dendoaspis angusticeps)

<400>15

Pro Ser Leu Arg Asp Pro Arg Pro Asn Ala Pro Ser Thr Ser Ala

1 5 10 15

<210>16

<211>32

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>16

Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp

1 5 10 15

Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His

20 25 30

<210>17

<211>41

<212>PRT

<213>白唇曼巴蛇(Dendroaspis angusticeps)

<400>17

Glu Val Lys Tyr Asp Pro Cys Phe Gly His Lys Ile Asp Arg Ile Asn

1 5 10 15

His Val Ser Asn Leu Gly Cys Pro Ser Leu Arg Asp Pro Arg Pro Asn

20 25 30

Ala Pro Ser Thr Ser Ala Asp Asn Pro

35 40

<210>18

<211>28

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>18

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

20 25

<210>19

<211>22

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>19

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

1 5 10 15

Met Ser Gly Leu Gly Cys

20

<210>20

<211>34

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>多肽

<221>VARIANT

<222>2

<223>Xaa＝Glu或Lys

<221>VARIANT

<222>3

<223>Xaa＝Pro、His或Arg

<221>VARIANT

<222>4

<223>Xaa＝Pro或Leu

<221>VARIANT

<222>5

<223>Xaa＝Pro、Leu或Ser

<221>VARIANT

<222>6

<223>Xaa＝Cys或Pro

<221>VARIANT

<222>7

<223>Xaa＝Pro、His、Gln或Arg

<221>VARIANT

<222>8

<223>Xaa＝Arg、Phe或Leu

<221>VARIANT

<222>9

<223>Xaa＝Asp、Gly或不存在

<221>VARIANT

<222>10

<223>Xaa＝Ser、Pro或Leu

<221>VARIANT

<222>11

<223>Xaa＝Pro或不存在

<221>VARIANT

<222>12

<223>Xaa＝Ser、Ala或不存在

<221>VARIANT

<222>13

<223>Xaa＝Pro或Ala

<221>VARIANT

<222>14

<223>Xaa＝Ala、Phe、Ile或Leu

<221>VARIANT

<222>15

<223>Xaa＝Pro、Lys或Leu

<221>VARIANT

<222>16

<223>Xaa＝Val，、Leu或Trp

<221>VARIANT

<222>17

<223>Xaa＝Cys、His或Val

<221>VARIANT

<222>18

<223>Xaa＝Asp、Ala、Ile、Thr、Pro或Arg

<221>VARIANT

<222>19

<223>Xaa＝Thr、Pro或His

<221>VARIANT

<222>20

<223>Xaa＝Val、Ile、Pro、Val、Ser或Leu

<221>VARIANT

<222>21

<223>Xaa＝Arg、Ser、Ile或Glu

<221>VARIANT

<222>22

<223>Xaa＝Val、Ile、Ala或Pro

<221>VARIANT

<222>23

<223>Xaa＝Thr、Val或Leu

<221>VARIANT

<222>24

<223>Xaa＝Leu、Ser或His

<221>VARIANT

<222>25

<223>Xaa＝Gly或Ala

<221>VARIANT

<222>26

<223>Xaa＝Phe、Ser、Thr或Leu

<221>VARIANT

<222>27

<223>Xaa＝Val、Asp或Leu

<221>VARIANT

<222>28

<223>Xaa＝Val、Leu或Ser

<221>VARIANT

<222>29

<223>Xaa＝Ser、Arg或Leu

<221>VARIANT

<222>31

<223>Xaa＝Asn、Asp、Pro或Thr

<221>VARIANT

<222>32

<223>Xaa＝His、Gln、Asn或Thr

<221>VARIANT

<222>33

<223>Xaa＝Thr、Ile或Ser

<221>VARIANT

<222>34

<223>Xaa＝Pro、Leu或Glu

<400>20

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

agacatggat ccccagacag 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

caagaggaag cgatgtccag 20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

ttctctccag cgacatggag 20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

ggactctttc tgctccaagg 20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

agacatggat ccccagacag 20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

tttctgcacc actttgcagc 20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

gagtcaacgg atttggtcgt 20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

ttgattttgg agggatctcg 20

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

cttcttgcat ctggctttcc 20

<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

agggatgtct gctccacct 19

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

ggacatcgct tcctctttgt t 21

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

gaaggtattg tgggcatggt 20

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

tcccacaggt ggtctggaag t 21

<210>34

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

ttctgcacca ctttgcagc 19

<210>35

<211>41

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>35

Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp

1 5 10 15

Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Val Gln Lys Glu

20 25 30

Asn Gln Thr Phe Pro Pro Gly Phe Leu

35 40

<210>36

<211>60

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>36

Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp

1 5 10 15

Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Gly Lys His Pro Leu

20 25 30

Pro Pro Arg Pro Pro Ser Pro Ile Pro Val Cys Asp Thr Val Arg Val

35 40 45

Thr Leu Gly Phe Val Val Ser Gly Asn His Thr Leu

50 55 60

<210>37

<211>32

<212>PRT

<213>犬(Canis familiaris)

<400>37

Gly Lys Pro Pro Pro Cys Arg Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ala Pro Trp

1 5 10 15

Val Arg Pro Leu Glu Pro Leu Leu Gly Leu Leu Ser Arg Gly Ile Thr

20 25 30

<210>38

<211>510

<212>DNA

<213>犬(Canis familiaris)

<400>38

atggagccct gcgcagcgct gccccgggcc ctcctgctcc tcctgttctt gcacctgtcg 60

ccactcggag gccgccccca cccgctgggc ggccgcagcc ccacctcgga agcctcggaa 120

gcctcggaag cctcggggtt gtgggccgtg caggagctgc tgggccgtct gaaggacgca 180

gtttcagagc tgcaggcaga gcagttggcc ctggaacccc tgcaccggag ccacagcccc 240

gcagaagccc cggaggccgg ggaggaacgc cccgtggggg tccttgcacc ccatgacagt 300

gtcctccagg ccctgagaag actacgcagc cccaagatga tgcacaagtc agggtgcttt 360

ggccggaggc tggaccggat cggctccctc agtggcctgg gctgcaatgg taagccgcct 420

ccctgccacc ttggctcccc ctccccagcc ccctgggttc gacccttgga accccttctg 480

ggtttgttgt ctcgggggat cacactctga 510

Claims

1.一种纯化的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成。

2.一种编码如权利要求1所述多肽的分离的核酸。

3.如权利要求2所述的分离的核酸，其特征在于，所述多肽由SEQ ID NO：5的核苷酸307-486的核酸序列编码。

4.含有如权利要求3所述核酸的载体。

5.含有如权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是真核宿主细胞。