CN110499284A - Wnt信号通路激活剂在制备治疗基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种Wnt信号通路激活剂在制备治疗基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常产品中的应用。动物实验揭示ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常主要体现在管间牙本质减少，牙本质矿化程度低，且存在胶原网暴露，采用LiCl腹腔注射牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠，改善了牙硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化能力。

Description

Wnt信号通路激活剂在制备治疗基因ALPL敲除小鼠牙硬组织 矿化异常产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及Wnt信号通路激活剂在制备治疗基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常产品中的应用。

背景技术

组织非特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNAP）是由肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因（ALPL）编码的一种蛋白，其主要功能是通过水解有机和无机焦磷酸盐释放单磷酸与钙离子结合并沉积在细胞外基质上形成钙化结晶，即矿化。临床上由于ALPL基因突变导致的遗传型疾病称为低碱性磷酸酯酶症(Hypophosphatasia，HPP)。HPP患者经常伴有牙齿早脱现象，其主要是由于牙齿及牙周组织矿化异常和牙根发育短小造成。由于遗传因素导致的牙齿早脱，目前临床上常规治疗不能根本上解决HPP患者牙齿早脱这一难题。

牙髓干细胞（Dental pulp stem cells，DPSC）是残留在牙髓组织中的一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，对牙齿发育发挥重要作用。大量实验证实，牙髓干细胞可以分化成成牙本质细胞-牙本质复合体。最近研究临床试验揭示自体牙髓干细胞移植回患者自身死髓牙体中可以再生牙髓组织并伴有神经元再生能力。我们研究团队发现低碱性磷酸酯酶症患者的牙髓干细胞成骨细胞分化能力减弱，其可导致牙齿发育过程中成牙本质细胞矿化缺陷，这与低碱性磷酸酯酶症患者牙本质矿化下降高度吻合。因此，以低碱性磷酸酯酶症患者的牙髓干细胞作为寻找治疗ALPL小鼠牙硬组织矿化异常的细胞模型，筛选出有效改善ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常的药物，为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症患者牙齿矿化不足提供方法。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了Wnt信号通路激活剂在制备治疗基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常产品中的应用。动物实验揭示ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常，采用LiCl治疗牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠，改善了牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠的牙硬组织矿化能力。

为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

本发明第一方面，提供了Wnt信号通路激活剂在制备治疗基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常产品中的应用。

优选地，所述经典Wnt信号通路激活剂为LiCl。

本发明第二方面，提供一种产品，包含治疗有效量的LiCl。

优选地，所述产品为包含10mM LiCl的氯化钠注射液。

本发明第三方面，提供所述的产品在制备改善基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常药物中的应用。

本发明第四方面，提供所述的产品在制备增加基因ALPL敲除小鼠管间牙本质小管数量或管间牙本质矿化强度产品中的应用。

优选地，所述基因ALPL为肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因。

优选地，所述基因ALPL敲除小鼠为杂合型与杂合型小鼠交配繁殖获得的基因ALPL敲除小鼠。

本发明第五方面，提供一种改善ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常的方法，包括以下步骤：

1）购买到的牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠经交配繁育得到牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠；

2）配置LiCl注射液；

3）使用LiCl注射液经腹腔注射入ALPL敲除小鼠体内，采用隔天注射方式，持续给药4周以上。

优选地，所述LiCl注射液的组分包括LiCl和生理盐水，所述LiCl的浓度为10mM，所述LiCl注射液的用量按照LiCl的质量和小鼠的体重配置为100mg/kg。

进一步地，所述步骤1）中，ALPL敲除小鼠为从模式动物中心购买的ALPL敲除小鼠，将ALPL敲除小鼠以杂合型与杂合型进行交配，经繁殖获得一定数量的牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠。

上述牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠可为全基因组敲除ALPL或条件性敲除ALPL。本发明的实施例中，上述所用的牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠为全基因组敲除ALPL。

上述牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠的特征体现在：与正常小鼠相比，管间牙本质小管减少，牙本质矿化不足，且可伴有胶原网暴露。

上述所用小分子化合物LiCl纯度标准要求≥99%，等级要求细胞/组织培养用；

所述与成骨分化能力相关基因为RUNX2、SP7，与经典Wnt信号通路相关基因表达为p-GSK3β、active-β-catenin。

本发明的实验证明，本发明提供了一种改善ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常的方法，ALPL敲除小鼠的牙本质小管减少矿化不足，具体采用LiCl持续注射于牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠，改善了ALPL敲除小鼠牙本质小管数量、矿化强度和减少胶原网的暴露。而且本方法采用了一种常见的成本低廉的小分子化合物，具简单、高效的特点，实现了改善牙硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化能力，为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症患者牙齿矿化异常提供潜在的治疗策略。

附图说明

图1A为显微CT检测正常小鼠下颌三维重建示意图；

图1B为显微CT检测硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠下颌三维重建示意图；

图2A为扫描电镜分析正常小鼠牙本质形态分析示意图；

图2B为扫描电镜分析硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠牙本质形态分析示意图；

图3A 为显微CT检测ALPL敲除小鼠颌骨检测示意图；

图3B 为显微CT检测LiCl对硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠颌骨改善示意图；

图4A为扫描电镜分析ALPL敲除小鼠牙本质示意图；

图4B为扫描电镜分析LiCl对硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠牙本质改善示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例用到的主要试剂如下：

本发明实施例中细胞培养皿购自美国Corning公司。

本发明实施例中的PBS缓冲液购自北京康为世纪生物科技有限公司。

本发明实施例中的细胞培养基(α-MEM培养基)购自美国gibco公司。

本发明实施例中LiCl购自Sigma公司。

下述实施例中显微CT成像采用美国GE公司eXplore Locus SP型显微CT。扫描参数：扫描分辨率8μm，旋转角度360^o，旋转角度增量0.4^o，电压80kV，电流80μA，曝光时间3000ms，帧平均数为3，像素组合为2×2。

下述实施例扫面电镜牙齿样本制备：2.5%戊二醛液中固定后，表面喷金，扫描电镜（SEM,S-3400N, 5.0KV）观察，拍照。

实施例1 ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常能力检测

1.牙硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠的获得

将购买的ALPL敲除小鼠（Jackson lab，维通利华代购）采用2雌性杂合型ALPL敲除小鼠与1雄性杂合型ALPL敲除小鼠合笼繁育，待繁育鼠仔出生后14天进行基因型鉴定，经繁育获得一定数量的杂合型ALPL敲除小鼠备用。

敲除小鼠牙硬组织矿化异常能力检测

1)ALPL敲除小鼠牙周组织及牙槽骨的检测

取相同饲养条件下的 21dpn ALPL敲除小鼠和野生型正常小鼠各 3 只脱颈处死，完整分离下颌骨，并从正中联合处将双侧下颌骨分离，浸于 40g/L 多聚甲醛固定液中4℃固定24h。取右侧下颌骨进行Micro CT扫描，结果如图1A和图1B所述，图1A为显微CT检测正常小鼠下颌三维重建示意图；图1B为显微CT检测硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠下颌三维重建示意图。可以看出，相比野生型，ALPL敲除小鼠的下颌髁突及喙突处骨质存在大面积缺损，牙槽骨存在明显缺损。

2)ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常的检测

取野生型和 ALPL敲除小鼠各3只，使用眼科镊拔下小鼠上颌第一磨牙，敲碎暴露牙本质。2.5%戊二醛液中固定后，表面喷金，扫描电镜观察，拍照。扫描电镜分别从 2 千倍、5 千倍及1 万倍的放大倍数观察，结果如图2A-图2B所示，图2A为扫描电镜分析正常小鼠牙本质形态分析示意图；图2B为扫描电镜分析硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠牙本质形态分析示意图。可以看出，相比野生型，ALPL敲除小鼠的管间牙本质明显减少，牙本质矿化程度低，可见明显的胶原纤维。

实施例2 改善牙硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化能力

1.LiCl治疗牙硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠的策略

取相同饲养条件下的 21dpn ALPL敲除小鼠6只，分为NaCl组和LiCl组。将配制NaCl和LiCl进行无菌处理，采用腹腔注射方式系统给药，注射剂量为100mg/kg。上述方法中，腹腔注射NaCl和LiCl为隔天注射，NaCl和LiCl治疗需持续4周以上。

治疗对牙硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化能力改善的检测

1)LiCl治疗对ALPL敲除小鼠牙周组织及牙槽骨缺损改善的检测

将NaCl和LiCl治疗4周后的ALPL敲除小鼠脱颈处死，完整分离下颌骨，并从正中联合处将双侧下颌骨分离，浸于 40g/L 多聚甲醛固定液中4℃固定 24h。取右侧下颌骨进行MicroCT扫面，三维重建结果参考图3A和图3B，图3A 为显微CT检测ALPL敲除小鼠颌骨检测示意图；图3B 为显微CT检测LiCl对硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠颌骨改善示意图。可以看出，相比NaCl对照组，LiCl治疗组敲除小鼠的下颌骨及牙槽骨缺损得到明显的改善。

2)LiCl治疗对ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化能力改善的检测

NaCl和LiCl治疗4周ALPL敲除小鼠后，使用眼科镊拔下小鼠上颌第一磨牙，敲碎暴露牙本质。2.5%戊二醛液中固定后，表面喷金，扫描电镜观察，拍照。扫描电镜结果参考图4A和图4B，图4A为扫描电镜分析ALPL敲除小鼠牙本质示意图；图4B为扫描电镜分析LiCl对硬组织矿化异常ALPL敲除小鼠牙本质改善示意图。可以看出，相比NaCl组，LiCl治疗组ALPL敲除小鼠的管间牙本质增多，牙本质矿化程度得到明显改善，管间胶原网暴露显著减少。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.Wnt信号通路激活剂在制备治疗基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述经典Wnt信号通路激活剂为LiCl。

3.一种产品，其特征在于，包含治疗有效量的LiCl。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为包含10mM LiCl的氯化钠注射液。

5.如权利要求3所述的产品在制备改善基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常药物中的应用。

6.如权利要求3所述的产品在制备增加基因ALPL敲除小鼠管间牙本质小管数量或管间牙本质矿化强度产品中的应用。

7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述基因ALPL为肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因。

8.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述基因ALPL敲除小鼠为杂合型与杂合型小鼠交配繁殖获得的基因ALPL敲除小鼠。

9.改善ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）购买到的牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠经交配繁育得到牙硬组织矿化异常的ALPL敲除小鼠；

2）配置LiCl注射液；

3）使用LiCl注射液经腹腔注射入ALPL敲除小鼠体内，采用隔天注射方式，持续给药4周以上。

10.根据权利要求9所述的改善ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常的方法，所述LiCl注射液的组分包括LiCl和生理盐水，所述LiCl的浓度为10mM，所述LiCl注射液的用量按照LiCl的质量和小鼠的体重配置为100mg/kg。