WO2012075636A1

WO2012075636A1 - 预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签

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Publication number: WO2012075636A1
Application number: PCT/CN2010/079608
Authority: WO
Inventors: 李红凌; 赵春华
Original assignee: 中国医学科学院基础医学研究所
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2012-06-14
Also published as: WO2012075912A9; AU2011341213B2; CA2820395C; US20140287930A1; US9523074B2; EP2636732A4; EP2636732B1; IN2013MN01005A; WO2012075912A1; EP2636732A1; AU2011341213A1; CA2820395A1

Description

预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签

技术领域

本发明涉及预测干细胞分化潜能的方法及全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途。背景技术

表观遗传修饰通常包括 DNA甲基化、组蛋白修饰及 R A修饰；而组蛋白修饰又包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化；修饰部位大多位于组蛋白 N端，这些修饰可通过影响组蛋白与 DNA的亲和性，从而改变染色质的状态，也可以影响转录因子与 DNA序列的结合，对基因表达调控具有类似 DNA遗传密码的作用，故被称作 "组蛋白密码" 。组蛋白甲基化是指发生在 H3和 H4组蛋白 N端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶介导。组蛋白赖氨酸的甲基化已成为转录的重要调控机制，在异染色质的形成、 X染色体的失活、基因组印迹、 DNA损伤修复及基因转录调控中担任重要角色 [1-5]。组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化（ H3K4me3 ) —般与启动子活化有关 [6]，而组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化 ( H3K27me3 ) 则与启动子的表达沉默相关 [7-8]。基因启动子区 H3K4me3和 H3K27me3两种组蛋白修饰状态同时存在则被称为双价修饰，这种双价修饰使基因保持在相对低的表达水平，维持在一种 "预备转录" 的状态，这种状态可以使基因根据适当的刺激做出迅速的转录活化或抑制等反应 [9-12]。

最近越来越多的研究开始关注组蛋白赖氨酸甲基化在胚胎发育中的作用。对斑马鱼的研究发现，受精后基因组失活，直到母源性向合子转换（maternal- zygotic transition) 完成才重新起始转录 [13- 15]，基因组组蛋白 H3赖氨酸三甲基化的修饰分析结果显示，转换前组蛋白 H3K27me3抑制性修锦及 H3K4me3活化性修饰均未检测到；转换完成，基因组激活后， 80%的基因出现了 H3K4me3修饰，其中未活化的一些发育调控相关基因同时还存在： H3K27_me3修饰。上述结果提示，这种在母源性向合子转换过程中建立起来的染色质组蛋白 H3双价或单价修饰谱很可能与全能性的建立有关 [16]。先前的研究发现，在小鼠胚胎干细胞中， H3K4me3和 H3K27me3 共定位存在与由约 2.5%基因组组成的高度保守的区域，提示这种双价修饰状态在全能性细胞保持这种 "预备"活化的状态中担任重要角色 [9]。对人胚胎干细胞组蛋白修饰的研究发现，在启动子對近， H3K4me3修饰普遍存在，而 H3K27me3仅见于 10%的基因启动子区，而且， H3K27me3修饰存在的区域同时受 H3K4me3修饰，这些受双价修饰的基因在 ESC分化时优先被激活，提示双价修饰的存在可能是维持发育相关基因在一种平衡状态，为以后的活化做准备 [10]; 而那些没有任何修饰的基因则处在抑制状态，完全被沉默。利用 ChlP-seq检测结果建立的数据库对多能性神经祖细胞（multipotent neural progenitor cells ， NPCs)、鼠胚胎纤维母细胞（murine embryonic fibroblasts ， MEFs)及原代人 T细胞中 H3K4me3 和 H3K27me3修饰分析发现，在 NPCs或 MEFs中，受双价修饰的基因数量下降 [5， 12]。由此推测受双价修饰的区域大部分是胚胎干细胞特异性的 [9]。但最近全基因组组蛋白甲基化修饰谱的分析显示，在分化的细胞（如 T细胞和 MEFs) 中也发现有这种受双价修饰的区域，因此双价修饰并不是 ESC特有的 [5， 12， 17]。尽管与 ESC相比，人 T细胞中受双价修饰基因的数量下降，但之前一些没有任何修饰的基因的组蛋白却重新被甲基化修饰，推测组蛋白修饰的这种变化可能与 T细胞的特化及其它谱系的抑制有关 [10]。

尽管研究提示，组蛋白甲基化在异染色质的形成、 X染色体的失活、基因组印迹、 DNA损伤修复及基因转录调控中有重要作用，而且发现组蛋白甲基化位点在不同物种中是高度保守的，在分化能力不同的细胞中存在不同的组蛋白甲基化修饰谱。但迄今为止，组蛋白甲基化修饰在细胞分化中的作用及意义还知之甚少。表观遗传调节是一个动态变化的过程，这使得表观遗传的研究变得复杂。近年来随着测序技术的迅速发展及其成本的降低，染色质免疫共沉淀与测序相结合的技术（ChlP-seq) 得到到了广泛应用 [18， 19]。干细胞移植可以用于治疗帕金森症、心肌病、肝脏疾病、以及诱导成骨治疗骨缺损、大面积烧伤治疗急需的皮肤材料等。成体具有干细胞取自自体、由它诱导分化而来的组织在进行移植时不存在免疫排斥问题，诱导分化的组织类型广泛等优点，具有广阔的应用价值。有望成为未来干细胞移植治疗各种器官终末期疾病的主力军。但是，目前干细胞移植还存在众多的安全性问题，如有报道指出，应用胚胎干细胞植入心脏治疗冠心病时，可能会导致畸胎瘤，应用骨骼肌干细胞则有产生恶性心律失常的危险，还有骨髓细胞移植后出现严重心肌钙化的报告。因此，上述干细胞移植治疗的成功取决于以下两大重要因素：（1 ) 种子干细胞在体外的获取、纯化和扩增；（2) 干细胞在体内按照治疗目的发生专一性有功能的分化。如何使既控制增殖，避免发生肿瘤，又能在适当的时候启动所需要的途径进行分化，对干细胞移植治疗至关重要。但是，获取具有适当分化能力的干细胞，根据治疗目的对其进行鉴定，并进而移植到体内使之适时的发生专一性分化而不发生畸胎瘤等等一系列问题均需要有一套对干细胞分化潜能、分化阶段及干细胞是否在体内发生可控的专一性分化等准确鉴定和评价指标。因此，多能性干细胞在临床上的应用前景依赖于它们的分化潜能，而这种分化潜能携带有表观遗传密码，很可能受表观遗传修饰的调节。因此探讨组蛋白甲基化修饰在干细胞分化中的作用有着及其重要的临床应用价值。

染色质免疫沉淀分析（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP) 是检测组蛋白修饰的最重要的方法。染色质免疫共沉淀技术（ChIP) 也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与 DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。染色质免疫沉淀分析是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质一 DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA相互作用的信息。目的片断可以通过 tiling array或高通量测序的方法来检测，前者称为 ChlP-on-chip而后者称为 ChIP-Seq。将 ChIP与第二代测序技术相结合的 ChlP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等相互作用的 DNA区段。

ChlP-Seq 的原理是，首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP) 特异性地富集目的蛋白结合的 DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的 DNA 片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等相互作用的 DNA区段信息。

由于 ChlP-Seq的数据是 DNA测序的结果，为研究者提供了进一步深入挖掘生物信息的资源，研究者可以在以下几方面展开研究：

( 1 ) 判断 DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；

(2) 检测 R A polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；

(3 ) 研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；

(4) CTCF转录因子研究。

为了进一步揭示 "组蛋白甲基化密码"在细胞分化中的神秘角色，我们利用 ChIP检测与生物信息学分析相结合的方法（ChlP-seq)研究了 ESC (胚胎干细胞）、 aMSC (脂肪来源间充质干细胞）、 HSC (造血干细胞）及 HPC (造血祖细胞）等多种级别干细胞的全基因组组蛋白甲基化修饰谱，试图找到组蛋白甲基化修饰与干细胞分化能力间的关系。图 7显示了本发明的技术示意图。发明内容

因此，本发明的目的在于寻找组蛋白甲基化修饰和干细胞分化能力间的关系，从而为快速、准确地确定干细胞的分化能力提供一种有力的工具。

因此，本发明的第一方面提供了一种预测干细胞分化潜能的方法，其包括下述步骤：

1 ) 获取目标干细胞；

2) 使用特异性抗组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化和抗组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化的抗体以 ChIP技术获得目标干细胞中所有与所述抗体结合的 DNA 样品；

3 )将 ChIP获得的 DNA样品进行高通量测序以获取目标干细胞的全基因组组蛋白甲基化修饰谱和 /或设计特异于目的基因的引物，以上述 DNA样品作为底物，进行 PCR反应以获取目的基因的组蛋白甲基化修饰结果，

其中，目标基因属于组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰或组蛋白 H3第 4 位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰共存则指示目标干细胞具有分化到目的基因所指示的特定细胞类型的能力。

优选地，所述目的基因选自全能基因、神经分化相关基因、成脂性基因、成骨性基因、造血相关基因或肝上皮分化相关基因的一种谱系、多种谱系或包括其他谱系的全部分化相关转录因子，其中全能基因包括 OCT4、 NANOG、 c-MYC、 SALL4、 SOX2、 KLF4，神经分化相关基因包括 TUBB3、 NKX2-2、 SOX1、NEUROG 1、 ASCL1、 BR 2、 MYT1L、 ZIC1、 NEUROG2、 HES1、 DLX1、 PAX6、 TLX2、 MSI1、 GFRA1、 GFRA3、 MAPT、 NES、 OLIG2、 NEURODl、 NEUROD2, 成脂性基因包括 C/EBP α、 PPAR γ、 ERK5、 GSK3 α、 GSK3 β、 C/EBP δ、 C/EBP β，成骨性基因包括 RUNX2 BMP4、 Smad5、 TAZ、 MSX2、 DLX5、 BMPR2、 Wnt5a, 造血相关基因包括 c-Myb、 EGR1、 FOGl、 SCL、 E47、 Ikaros、 GATA1、 BCL-6, 肝上皮分化相关基因包括 Mxill、 GSC、 Soxl7、 PROX1、 HNF1B、丽 F6、 E-cadherin、 Foxa-l、 Foxa-2、 SNAI1、 NEUROD2、 GFRA2。（注：终末分化的标志基因如 AP2、 LPL、 c-Kit、 ALP、 OPN、 CK8、 CK18等不宜作为分化潜能预测的候选基因）本发明的第二方面提供了全能性基因和 /或分化相关基因组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其中通过检测所述全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白甲基化修饰状态预测干细胞的分化潜能。优选地，通过检测特定谱系分化阶段性转录因子及标志基因的组蛋白甲基化修饰状态鉴定该细胞所处的分化阶段。优选地，分析启动非目标谱系分化相关基因的组蛋白修饰状态变化鉴定细胞向目标谱系分化的专一性。

优选地，所述组蛋白甲基化修饰为组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰并存。

优选地，全能性基因和 /或分化相关基因选自全能基因、神经分化相关基因、成脂性基因、成骨性基因、造血相关基因或肝上皮分化相关基因的一种谱系、多种谱系或包括其他谱系的全部分化相关转录因子，其中全能基因包括 OCT4、 NANOG、 c-MYC、 SALL4、 SOX2、 KLF4，神经分化相关基因包括 TUBB3、NKX2-2、 SOXl、 NEUROGK ASCL1、 BRN2、 MYT1L、 ZIC1、 NEUROG2、 HES1、 DLX1、 PAX6、 TLX2、 MSI 1、 GFRA 1、 GFRA3、 MAPT、 NES、 OLIG2、 NEUROD 1、 NEUROD2，成脂性基因包括 C/EBP α、 PPAR γ、 ER 5、 GSK3 α、 GSK3 β、 C/EBP δ、 C/EBP β，成骨性基因包括 RUNX2 BMP4、 Smad5、 TAZ、 MSX2、 DLX5、 BMPR2、 Wnt5a, 造血相关基因包括 c-Myb、 EGR1、 FOGl、 SCL、 E47、 Ikaros、 GATA1、 BCL-6, 肝上皮分化相关基因包括 Mxill、 GSC、 Soxl7、 PROX1 HNF1B、 HNF6、 E-cadherin Foxa-l、 Foxa-2、 SNAI1、 NEUROD2、 GFRA2。（注：终末分化的标志基因如 AP2、 LPL、 c-Kit、 ALP、 OPN、 CK8、 CK18等不宜作为分化潜能预测的候选基因）优选地，检测所述全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白甲基化修饰状态时使用 ChlP-seq或 ChIP-PCR。

优选地，所述全能性基因和 /或分化相关基因的不同组蛋白甲基化状态指示了干细胞的不同分化潜能，某谱系分化相关基因组蛋白甲基化修饰是组蛋白 H3第 4 位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白 H3第 27 位赖氨酸三甲基化修饰并存为主，则指示这种干细胞具有向该谱系分化的潜能，两种或多种干细胞进行比较，则该谱系相关基因总体上受组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰并存的基因所占比例高的干细胞更易于向该谱系分化。

换言之，本发明利用染色质免疫沉淀技术（ChIP) 获得了目标干细胞的与特异性抗组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化和抗组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化的抗体结合的所有 DNA, 然后通过高通量测序技术获得了所述 DNA的序列信息，通过与基因组信息相比对，获得了目标干细胞的全基因组的组蛋白修饰谱，或者通过设计针对特定基因的引物利用 PCR技术获得特定基因的组蛋白修饰状态。其中，目标基因属于组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰（H3K4me3 ) 或组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰 (H3K4me3)和组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰 (H3K27me3)共存则指示目标干细胞具有分化到目的基因所指示的特定细胞类型的能力。某谱系分化相关基因组蛋白甲基化修饰是组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰并存为主，则指示这种干细胞具有向该谱系分化的潜能，两种或多种干细胞进行比较，则该谱系相关基因总体上受组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰并存的基因所占比例高的干细胞更易于向该谱系分化。任何在全能性干细胞或特定分化潜能干细胞内具有全能性或谱系分化标识意义的基因均可用于本发明所述的方法，包括但不限于全能基因 OCT4、 NANOG、 c-MYC、 SALL4、 SOX2、 KLF4, 神经分化相关基因 TUBB3、 NKX2-2、 S0X1、 NEUR0G1、 ASCL1、 BR 2、 MYT1L、 ZIC1、 NEUROG2、 HES1、 DLX1、 PAX6、 TLX2、 MSI1、 GFRA1、 GFRA3、 MAPT、 NES、 OLIG2、 NEUR0D1、 NEUROD2, 成脂性基因 C/EBP a、 PPAR y ERK5、 GSK3 a、 GSK3 β、 C/EBP δ、 C/EBP β，成骨性基因 RUNX2、 BMP4、 Smad5、 TAZ、 MSX2、 DLX5、 BMPR2、 Wnt5a, 造血相关基因 c-Myb、 EGR1、 F0G1、 SCL、 E47、 Ikaros、 GATA1、 BCL-6, 肝上皮分化相关基因 Mxill、 GSC、 Soxl7、 PROX1 HNF1B、 HNF6、 E-cadherin Foxa-l、 Foxa-2、 SNAI1、 NEUROD2、 GFRA2等的一种谱系、多种谱系或包括其他谱系的全部分化相关转录因子。（注：终末分化的标志基因如 AP2、 LPL、 c-Kit、 ALP、 OPN、 CK8、 CK18等不宜作为分化潜能预测的候选基因）

也即，通过对具有不同分化能力的干细胞的组蛋白修饰状态的分析之后发现: 干细胞中全能及各系分化相关基因不同组蛋白 H3K4及 H3K27三甲基化的修饰状态与干细胞的分化能力密切相关，可以用来预测干细胞的分化潜能；不仅如此，干细胞向特定谱系分化启动时，先于基因表达的改变，分化相关基因组蛋白修饰状态将发生重新布局，使得目标谱系相关基因的祖丹修饰状态变得更加活化，而启动其它谱系分化相关基因的组蛋白修饰则变得进一步抑制或沉默，因此，对干细胞向某一谱系分化过程中该谱系及其它非目标谱系分化相关基因组蛋白甲基化修饰状态的动态变化可用来鉴定干细胞干细胞分化的阶段及专一性。一旦向某一谱系分化相关基因的表达已经被激活，这时的细胞已经是发生部分分化了的细胞，因此，如果用谱系分化相关基因的表达量来衡量干细胞的分化潜能会漏掉很多更原始、分化潜能更广泛的干细胞来源，而组蛋白修饰的变化先于基因表达的改变，干细胞中组蛋白 H3上的 K4或 K4和 K27同时被三甲基化后能够维持这些基因在非常低的表达水平，处在一种 "预备"活化或失活的状态，这种组蛋白修饰状态有利于干细胞根据根据微环境或外界条件的改变向不同谱系方向分化，因此分化相关基因组蛋白修饰状态的差异可作为预测和评价不同来源干细胞分化潜能的有力指标。

利用本发明的方法可准确地确定某种干细胞的分化状态及分化潜能，从而为其正确的用于临床提供了至关重要的指导信息。附图说明

图 1 : 显示 aMSC的分化能力。（A) 极限稀释法获得单克隆来源的 aMSCs,

( B ) aMSCs 向成脂和成骨谱系分化，（C ) aMSCs 向造血分化及鉴定（OC : Osteocalcin, BFU-E: 红系爆式集落形成单位， CFU-G: 巨嗜细胞集落形成单位， CFU-MK: 巨核细胞集落形成单位， HPP-CFC: 高增殖潜能细胞集落形成单位），

(D) aMSCs向肝上皮诱导分化及鉴定，（E) aMSCs向神经方向诱导分化及鉴定。

图 2:显示不同级别干细胞全能性及神经分化相关基因的组蛋白甲基化修饰差异谱。（A) aMSC中全基因组组蛋白 H3K4me3和 H3K27me3修饰全景图，（B) 全能性相关基因的组蛋白甲基化修饰，（C) 神经分化相关基因的组蛋白甲基化修饰。

图 3: 显示不同干细胞中成脂（A) 及成骨（B) 分化相关基因甲基化差异修饰谱。

图 4: 显示不同干细胞中肝上皮（A) 及造血（B) 分化相关基因甲基化差异修饰谱。

图 5:显示 aMSC和 bMSC中成脂成骨分化相关基因组蛋白甲基化修饰比较及分化能力比较。（A)ChlP-PCR分析 aMSC和 bMSC中成骨性基因组蛋白甲基化修饰状态，（B)ChlP-PCR分析 aMSC和 bMSC中成脂性基因组蛋白甲基化修饰状态，

(C) aMSC和 bMSC向成骨谱系和成脂谱系分化能力的比较。图 6:显示神经、成脂和成骨分化中的相关基因组蛋白甲基化修饰的动态变化。 (A) real-time PCR测定神经分化前后相关基因的表达，（B) ChlP-PCR检测神经分化前后相关基因的组蛋白甲基化状态，（C) real-time PCR及基因芯片分析成脂分化前后相关基因的表达及组蛋白甲基化状态，（D) real-time PCR及基因芯片分析成骨分化前后相关基因的表达及组蛋白甲基化状态，（E) real-time PCR及基因芯片分析成脂分化或成骨分化中其它谱系相关基因的表达及组蛋白甲基化状态。

图 7: 组蛋白甲基化修饰状态预测干细胞分化潜能示意图。具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例

实施例 1验证单细胞来源 aMSC的分化能力

为了探讨组蛋白甲基化在干细胞分化中的意义，我们首先对单细胞来源 aMSC 的分化能力进行了验证。

成人脂肪样品取自医科院整形医院，成人骨髓样品取自解放军 307 医院。所有样品均签订知情同意书。

成人脂肪源间充质干细胞（aMSCs) 的分离：

成人脂肪组织取自吸脂手术患者（中国医学科学院整形医院），与供者签订知情同意书，供者均为 25〜35 岁的健康女性。从脂肪组织中分离 aMSCs的方法参照 Zuk等 [20]方法，并稍加改动。简述如下：采用吸脂术采集出来的脂肪组织用 D-Hanks 洗去血细胞和麻醉药， 0.2%Π 型胶原酶消化 1小时，之后用 D-Hanks洗涤 2 遍以除去胶原酶。离心收集细胞，细胞以 2x l0⁶/ml 的密度接种于含 58% DMEM/F12 + 40% MCDB-20K 2%胎牛血清（FCS)、 10ng/ml EGF、 10ng/ml PDGF, l x胰岛素 -转铁蛋白-亚硒酸（Insulin-Transferrin- Selenium, ITS)、 l x亚油酸-牛血清白蛋白（linoleic acid-bovine serum albumin, LA-BSA) , 50μΜ β巯基乙醇， 2mM L-谷氨酰胺， 10(^g/ml 青霉素和 100U/ml硫酸链霉素的培养液， 37°C、 5%C02、 95%湿度的培养箱培养。 2d 后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每 3 天半量换液。当细胞达 70%〜80%汇合时， 0.25%胰酶（Gibco 公司）常规消化，细胞按照 1 : 3 进行传代。

成人骨髓源间充质干细胞（bMSCs) 的分离：

( 1 ) 无菌采集健康志愿者的骨髓 5-10 ml 于无菌的肝素管中。

(2)取一无菌的离心管，用 D-Hanks 液适当稀释骨髓后计数，并调整骨髓细胞浓度至 l X 10⁷/ml。

(3 )取一新的离心管，分别加入恢复至室温的淋巴细胞分离液和上述骨髓细胞悬液，加入时仔细操作勿破坏界面，二者的比例为 1 : 1。

(4)将上述离心管配平后放入常温台式离心机中， 20°C以 1800 转 /分钟的速度离心 20 分钟。取出离心管后，无菌操作仔细吸取白膜层即获得了单个核细胞，将单个核细胞用 D-Hanks 液洗涤两次并计数。

(5 )将上述单个核细胞以 l X 10⁶/cm² 的密度接种于 25cm² 的培养瓶中，细胞培养体系均为含 58% DMEM/F12 + 40% MCDB-201、 2%胎牛血清（FCS )、 10ng/mlEGF 、 10ng/ml PDGF ， l 胰岛素 - 转铁蛋白 - 亚硒酸 ( Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、 l x亚油酸-牛血清白蛋白（ linoleic acid-bovine serum albumin, LA-BSA), 50μΜ β巯基乙醇， 2mM L-谷氨酰胺， 10(^g/ml青霉素和 100U/ml硫酸链霉素的培养液， 37°C、 5%C02、 95%湿度的培养箱培养。

( 6) 24 小时后，去除悬浮细胞，补充培养基，细胞每隔三天换液一次，待细胞长至 70-80%汇合时，用 0.05%胰蛋白酶 -0.01%EDTA消化传代。 1-2代的间充质干细胞冻存于液氮罐备用。

通过极限稀释法，我们以 1个细胞 /孔的密度将 aMSC接种与 96孔板中，三周后观察约有 24.55%±0.66%的孔长出了单克隆。将这些单克隆进一步扩增后，每个单克隆来源的细胞分成 6等份，分别向肝上皮、神经、造血、成脂肪及成骨谱系诱导分化，另一份细胞继续扩增后用于各谱系分化的对照（图 1A) 。诱导 14天后，光镜下可见成脂诱导组细胞胞浆内充满了脂肪滴，油红 0染色阳性率达 80%，实时定量 PCR检测显示成脂标志基因 AP2及 LPL高表达（图 1B) ；成骨诱导组 ALP及茜素红染色阳性率达 65%，实时定量 PCR检测显示，成骨标志基因 ALP和 OPN表达较诱导前明显上调（图 IB ) 。 aMSC向造血方向诱导第 3天，造血相关的标志分子 Osteocalcin (OC) 、 c-Kit和 CD34染色阳性，诱导 14天时可见 BFU-E (红系爆式集落形成单位）、 CFU-G (巨嗜细胞集落形成单位）、 CFU-MK (巨核细胞集落形成单位）和 HPP-CFC (高增殖潜能细胞集落形成单位）等各系造血集落的形成（图

IC)。诱导第 21天，肝上皮诱导组细胞 CK8、 CK18和 CK19免疫组化检测阳性（图

ID)。诱导第 12天，神经诱导组细胞 Nestin和 Musashi免疫组化检测阳性（图 1E)。上述结果表明， aMSC在一定的诱导条件下能够向肝上皮、神经、造血及成脂和成骨等不同胚层来源的多谱系方向分化。实施例 2分化相关基因组蛋白 H3K4me3和 H3K27me3的不同修饰状态与干细胞的分化潜能密切相关

验证了 aMSC具有向肝上皮、神经、造血、成脂及成骨等多胚层谱系分化能力后，我们进一步利用 ChIP检测技术与生物信息学分析相结合的方法（ChlP-seq)获得了 aMSC全基因组组蛋白甲基化修饰谱。 H3K4me3 (Abeam 8580)和 H3K27me3 (Upstate 07-449)的 ChlP实验按照 EZ ChlP™ kit (Millipore)的标准操作方法进行

基本过程如下：

1. 染色质样本准备和免疫选择

( 1 ) 培养细胞， 1%甲醛固定，使蛋白和 DNA交联，室温 10分钟，

(2)裂解和超声（Branson 250D 超声仪）处理细胞，染色质片段在 200-1000bp，

(3 )免疫选择；用特异抗体， H3K4me3 (Abeam 8580) 禾 B H3K27me3 (Upstate 07-449)。

2. DNA纯化和检测

(4) 分离纯化 DNA，去除蛋白质， 65摄氏度孵育去除蛋白 -DNA交联，

(5 )针对目的基因设计特异性引物，利用 PCR或 real-time PCR对 DNA序列进行鉴定。

阳性对照；

anti-R A Polymerase II, 所有活化转录的基因启动子区都有结合。

阴性对照；

抗同一种属来源的正常 IgG。

对照引物； GAPDH基因的启动子区。

3. 免疫沉淀（IP) 交联物

开始前准备：将蛋白酶抑制剂 Cocktail II放置室温溶解，该试剂含 DMSO, 在 18.4°C以下时仍处于冰冻状态。

( 6 ) 制备含蛋白酶抑制剂的 Dilution buffer, 放置在冰上。

每个 IP 需要 900 ul Dilution Buffer加 4.5ul PI Cocktail。

样品包括阳性对照（抗 R A polymerase Π)、阴性对照（正常的相同物种 IgG) 和目的蛋白。阴性对照 IgG 建议与目的蛋白抗体来源的物种一致。

(7) 将制备的含 lOOul产物的 EP管放冰上，进行染色质免疫沉淀（IP)。冻存的样品需提前冰上溶解。

如果同一份染色质产物要进行多个 IP，可将产物放在一个大管内（能容纳 1.1ml溶液的 EP管）。

每 lOOul产物需含有大约 2 X 10⁶细胞来源的染色质。

( 8) 每 lOOul染色质产物中加入 900ul含 PI cocktail的 Dilution Buffer。

如果有多分 IP，加入相应数量的 Dilution Buffer。

(9) 每个 IP加入 60ul Protein G Agarose。

Protein G Agarose是 50%浆液，使用前颠倒轻轻混匀。

这一步是 "preclear"染色质，去除非特异结合 Protein G Agarose的蛋白和多分合并处理时加相应数量的 Protein G Agarose。 (10) 4°C旋转孵育 1小时。

(11) 3000-5000g离心 1分钟，沉淀 agarose。

不要高速离心 Protein GAgarose。离心力太大，可能造成 beads粉碎或变形。

(12) 取 lOul (1%) 上清作为 Input, 保存在 4°C，待第 5步进行处理。

多个样本同时处理时，各取 1%的染色质样本做 Input.

(13) 收集上清液 lml转移至新的 EP管。

(14) 在上清液中加入免疫沉淀的抗体。

阳性对照管，力 B l.Oug抗 -R A polymerase抗体。

阴性对照管，加 l.Oug正常的相同物种 IgG。

检测管加 1-lOug抗体。加抗体的量需要根据以往经验确定。

(15) 4°C旋转孵育过夜。 IP的孵育时间可以縮短，主要取决于抗体、靶基因和细胞类型等多个因素。

(16) 加 60ul Protein G Agarose, 4°C旋转孵育 1小时。

(17) 3000-5000g离心 1分钟，沉淀 agarose, 去上清。

( 18) 用以下溶液每个 lml依次洗 Protein G Agarose/染色质复合物，重悬后，旋转孵育 3-5分钟，低速离心 3000-5000g离心 1分钟，小心去除上清。

a. Low salt immune Complex Wash Buffer, 一次；

b. High Salt Immune Complex Wash Buffer, —次；

c. LiCl Immune Complex Wash Buffer, 一次；

d. TE Buffer, 二次。

4. 蛋白 /DNA复合物洗脱

开始前准备：

将 IM NaHC0₃ 放置至室温。可能会有少量沉淀，等恢复到室温后，沉淀可溶解。 1 M NaHC0₃可漩涡混匀。

准备 65 °C水浴。

(1) 为所有 IP管准备 Elution buffer, 包括 Input管 (见节 3，步骤 7)。每管需 200ul Elution buffer,配制方法： lOul 20%SDS, 20ul IM NaHC0₃，加 170ul dH₂0。

(2) 或者可以在大管中一起配制，如有 10个 IP 管，可将 105ul 20%SDS, 210ul IM NaHC0₃，力 B 1.785ul dH20混合.

(3) Input管加入 200 ul Elution buffer后，放置室温第 5步继续处理。

( 4 ) 每管抗体 /agarose复合物中加 100ul Elution buffer, 轻弹混匀。

(5) 室温孵育 15分钟。

(6) 3000-5000g离心 1分钟以沉淀 agarose, 将上清液收集到新的 EP管中。

(7) 重复步骤（4) 到（6)，将洗脱液合并，总体积 200ul。

5. 蛋白 /DNA去交联，获得游离 DNA

(1) 所有管（包括 IPs和 Inputs)加入 8ul 5MNaCl， 65°C孵育 4到 5小时或过夜，以去除 DNA-蛋白交联。完成后样本可储存在 -20°C，隔天继续进行后续实验。

(2) 所有管中加 lulR aseA, 37°C孵育 30分钟。

(3) 力 B 4ul 0.5M EDTA, 8ul 1M Tris-HCl和 lul 蛋白酶 K， 45°C孵育 1-2小时。

6. 用 Spin Columns纯化 DNA

( 1 )每个样品准备一个收集管和一个分离管。将 Spin Column放入收集管中。

(2) 每 200 ul DNA样品加 1ml Bind Reagent A，混匀。

所加 Bind Reagent A的量为样品体积的 5倍。

可见到沉淀，但不会影响本步骤。

( 3 ) 将 600ul样品 / Bind Reagent A混合物加到收集管的 Spin滤器上。

(4) >10，000g离心 30秒。

(5) 移开 Spin滤器，弃去收集管中的液体，保留收集管。

如果步骤 2中见沉淀，本步骤收集管底可见沉淀，但不会影响实验。

(6) 将 Spin滤器重新放入收集管。

(7)将步骤 2中的样品 / Bind Reagent A混合物 600ul加入 Spin滤器，重复步骤（4) 到（6)。

(8) 在收集管的 Spin滤器中加入 500ul Wash Reagent B。

(9) >10，000g离心 30秒。

(10) 从收集管中移出 Spin滤器，弃去收集管中的液体，保留收集管。

(11) 将 Spin滤器重新放入原收集管。

(12) >10，000g离心 30秒。

(13) 弃去收集管和液体。

(14) 将 Spin滤器放入收集管中。

(15) 直接在白色 Spin滤膜的中央，加入 50ul Elution Buffer C。

(16) >10，000g离心 30秒。

(17) 弃去 Spin滤器。洗出液为纯化的 DNA。可立即分析或 -20°C冻存。

7. 对照 PCR

注意：本部分所有枪和枪尖要尽可能避免污染。

(1) 在 0.2ml PCR管上做好标记，放冰上。

使用本试剂盒，至少有 4个 DNA样品要用对照引物进行 PCR分析，包括阳性和阴性对照抗体的 IP物， Input和无 DNA得空管作为有无 DNA污染的对照管。

对照引物是针对特异性人 GAPDH基因。针对其它物质，建议使用者根据经验设计特异的引物。

(2) 每管加 2ul样品，放回冰上。

(3) 每个反应管中加入合适数量的试剂，根据表格 1，依次加入水， Taq酶等。

推荐使用热启动 Taq酶。如果没有使用热启动 Taq酶，建议起始变性步骤后再加入 Taq酶。

8. 将上述 ChiP获得的所有与 H3K4me3和 /H3K27me3抗体结合的 DNA样品进行高通量测序即为 ChlP-Seq技术。

9. 设计针对目的基因特异的引物，以上述 ChiP获得的所有与 H3K4me3和 /H3K27me3抗体结合的 DNA样品作为底物，进行 PCR反应，此为 ChlP-PCR技术。

根据人类基因组数据库（Hgl8)进行校正后得到的 aMSC全基因组组蛋白甲基化 K4和 K27位点修饰全景图（图 2A)。我们选取了 ESC (胚胎干细胞）、 aMSC (脂肪来源间充质干细胞）、 HSC (造血干细胞）和 HPC (造血祖细胞）等具有不同分化潜能的干细胞作为研究对象 [21， 22]，分析比较了这些干细胞中全能性基因和肝上皮、神经、造血、成脂及成骨等谱系分化相关基因的组蛋白甲基化修饰状态。

对全能性基因组蛋白甲基化修饰的分析发现， ESC中全能性基因 OCT4、 NANOG、 c-MYC、 SALL4禾卩 SOX2均为 H3K4me3活化修饰， KLF4为 H3K4me3 和 H3K27me3共存的双价修饰； MSC中 c-MYC和 KLF4为 H3K4me3活化修饰， SALL4 和 SOX2为双价修饰， OCT4和 NANOG基本无修饰信号； HSC和 HPC中除了被认为与细胞周期关系密切的 c-MYC为活化修饰外，其它全能基因均为 H3K27me3抑制修饰或无修饰（图 2B)。目前文献报道与神经分化相关的基因主要有 BRN2、 MYT1L、 ZIC1、 NEUROG2、 HES1、 DLX1、 PAX6、 TLX2、 MSI1、 GFRA1、 GFRA3、 MAPT、 NES和 OLIG2等 22个转录因子 [23-25]。 ChlP-seq数据分析显示，在 ESCs 中有 17个基因表现为 H3K4me3修饰或双价修饰状态；在 aMSC中的分析结果与 ESC 中相似；而且分析结果显示，与神经分化启动相关的三个基因 NES、 MSI1和 HES1 , 它们在 ESC及 aMSC中的组蛋白修饰状态均为 H3K4me3活化状态；但在 HSC和 HPC 中，这些基因一部分表现为 H3K27me3抑制性修饰，其它的均未检测到修饰信号（图 2C) 。

接下来，我们又比较了上述干细胞中中胚层相关谱系成脂、成骨及造血分化相关基因的组蛋白修饰状态。结果显示，成脂性关键转录因子 C/ΕΒΡα和 ΡΡΑΙ γ在 aMSC中是 H3K4me3活化修饰，而在 ESC中是双价修饰；它们上游的调节因子 ERK5、 BMP2、 GSK3a GSK3p C/ΕΒΡδ 禾口 C/ΕΒΡβ在 ESC及 aMSC中的组蛋白修饰相似；同样，在 HSC和 HPC中这些基因的组蛋白修饰亦为 H3K27me3抑制状态或无修饰（图 3A) 。对成骨相关基因的组蛋白甲基化分析得到了类似的结果，即成骨关键转录因子 RUNX2在 aMSC中为 H3K4me3活化修饰，而在 ESC中为双价修饰； RUNX2上游的调控因子 BMP2、 BMP4、 Smad5、 TAZ、 MSX2、 DLX5禾卩 Wnt5a 等在两种细胞中的组蛋白甲基化修饰相似（图 3B) 。造血分化相关基因 c-Myb、 EGR1、 FOG1 (ZFPM1 )、 SCL (TALI )、 E47 (TCF3 )、 Ikaros (IKZF1 )、 GATA1 和 BCL-6等组蛋白甲基化修饰分析显示， c-Myb、 EGR1、 E47和 BCL-6在四种干 / 祖细胞中均为 H3K4me3活化修饰状态； F0G1、 SCL和 Ikaros在 ESC和 MSC中为双价修饰，而在 HSC和 HPC中为 H3K4me3活化性修饰； GATA1在 ESC和 aMSC中显示为抑制性修饰或无修饰，在 HSC和 HPC中则为 H3K4me3活化性修饰（图 4A) 。

进一步对内胚层肝上皮谱系相关基因的分析显示， Mxill、 GSC、 Soxl7

PROX1 HNF1B、 HNF6、 E-cadherin Foxa-1和 Foxa-2等在 ESC中均为活化或双价修饰；其中 Mxill、 GSC、 Soxl7、 HNF6、 PROX1 禾口 Foxa-1在 aMSC中亦为活化或双价修饰，与 Foxa-1作用相似的 Foxa-2为 H3K27me3抑制修饰，上皮性标志分子 E-cadherin 的上游调控因子 SNAI1则为活化信号；在 HSC中除 Mxill有较弱的活化性修饰信号外，其它肝上皮分化相关基因组蛋白均为 H3K27me3抑制信号或无修饰；而在 HPC中，所有肝性基因均为 H3K27me3抑制信号或无修饰（图 4B) 。

全基因组组蛋白修饰的分析比较显示， ESCs中六个全能基因有五个是活化修饰，一个为双价修饰，向各胚层分化的关键转录因子的组蛋白甲基化状态总体上以 H3K4me3活化或双价修饰为主； aMSCs中六个全能基因有两个是活化修饰，四个是双价修饰。 HSCs中几乎所有造血分化相关基因均以活化修饰为主外，其它谱系方向相关基因则以 H3K27me3或无修饰信号为主。 HPCs中其它谱系相关基因均为 H3K27me3抑制修饰或无修饰信号，而造血分化相关基因均为 H3K4me3活化修饰，而且其活化信号较 HSC强；造血谱系定向分化相关因子 GATA1在 ESCs、 aMSCs 和 HSCs中显示为抑制或无修饰，但在造血祖细胞中为 H3K4me3活化修饰。推测它是在多能干细胞向造血分化到造血祖细胞阶段被活化修饰，以利于造血谱系进一步的定向分化。整体上看，从 ESC、 aMSC、 HSC到 HPC，造血分化相关基因组蛋白甲基化修饰状态基本是一个 H3K27me3抑制性修饰逐渐消失、 H3K4me3活化性修饰信号逐渐增强的过程，而其它非造血相关谱系则表现为活化性修饰减弱而抑制性修饰信号（包括 H3K27me3及无修饰，这两种情况都导致基因沉默）增强。

先前已有大量的研究证明， ESCs 具有向所有胚层所有谱系分化的全能性，

HSCs只有向造血相关谱系分化的能力， HPCs是较 HSCs更进一步定向与造血谱系分化的细胞，而我们的实验证明， aMSCs 具有向肝上皮、神经、造血、血管内皮、成脂和成骨等多胚层多谱系分化的亚全能性。结合上述 ESC、 aMSC, HSC和 HPC 中各谱系分化相关基因不同组蛋白修饰状态的分析结果及这些干细胞不同的分化潜能提示我们：随着多能性等级的下降，组蛋白甲基化修饰状态的改变，干细胞逐渐丢失其分化的全能性（ESC) 转变成具有多胚层分化能力（MSC) 或仅具有单一胚层（HSC) 甚至单一谱系分化的能力（祖细胞）的细胞。分化相关基因组蛋白 H3K4me3 和 H3K27me3修饰状态与干细胞的分化潜能密切相关，可作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签。实施例 3谱系分化相关基因组蛋白 H3K4me3和 H3K27me3修饰状态的分析可用来预测干细胞分化潜能

为了进一步验证分化相关基因组蛋白 H3K4me3 和 H3K27me3修饰状态与干细胞的分化潜能的相关性，我们利用 ChlP-PCR进一步对脂肪来源 MSC (aMSC) 和骨髓来源 MSC (bMSC) 的成脂和成骨谱系分化相关基因的组蛋白修饰进行了分析，并与它们向上述两种谱系分化的能力进行了比较。组蛋白甲基化分析的结果显示， aMSC中成骨性基因 RUNX2、 BMP2、 Smad5、 TAZ、 Wnt5a禾 B BMPR2 为活化修饰， MSX2和 BMP4为双价修饰； bMSC中除了 MSX2为 H3K4me3占优势的双价修饰外，其它均为活化修饰（图 5A)。 aMSC中成脂性基因除 C/ΕΒΡ α为双价修饰外， ERK5、 GSK3a GSK3p C/EBPS、 PPARy禾 B C/ΕΒΡβ均为活化性修饰；而 bMSC中则以双价修饰为主（图 5B)。同样诱导条件下，对 aMSC和 bMSC 向成骨和成脂方向分化的比较显示，成骨诱导第 8天， aMSC和 bMSC分化比率分别为 50%和 65%，标志基因 ALP和 OPN表达有统计学差异；成脂诱导第 8天， aMSC和 bMSC分化比率分别为 80%和 27%，标志基因 LPL和 AP2表达有显著差异（图 5C)。

由此可见，尽管两种不同来源的 MSC中成脂和成骨相关基因均为 H3K4me3 或双价修饰，但 aMSC中成脂相关基因 H3K4me3修饰所占比率明显高于 bMSC, 这与 bMSC比 aMSC难于向成脂谱系分化的结果相吻合； bMSC中成骨相关基因组蛋白甲基化活化修饰与 aMSC差别不大，这与我们观察到 bMSC和 aMSC向成骨谱系分化能力相似的结果一致。对不同来源 MSC分化相关基因组蛋白修饰分析及分化能力的比较结果进一步验证了谱系分化相关基因组蛋白 H3K4me3 和 H3K27me3 修饰状态的分析作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的可行性。实施例 4分化阶段相关基因组蛋白 H3K4me3和 H3K27me3修饰状态的动态分析可用来预测细胞的分化程度

验证了组蛋白甲基化分析可作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签之后，我们又利用 ChlP-PCR对 aMSC分化前后相关转录因子组蛋白甲基化修饰的动态变化进行了分析，结果显示， aMSC向神经谱系分化过程中，关键转录因子 PAX6 和 NEUROG2 的组蛋白修饰状态从 H3K27me3 抑制态转变为双价修饰， NEUROD2从 H3K27me3抑制态变为活化态， GFRA2从双价态变为活化态， TLX2 和 MSI1则从双价的 K27修饰占优势变为 K4占优势状态， GFRA1则从无修饰状态变为双价态； NEUROG2、 PAX6、 TLX2、 NEUROD2 禾卩 MSI1 的表达明显上调。 aMSC向成脂谱系分化过程中，伴随早期成脂性转录因子 C/ΕΒΡβ和 C/ΕΒΡδ 表达短暂上调，它们的组蛋白修饰状态从 H3K4me3活化态变成双价态，调节因子 GSK3P表达量升高后维持在较高水平，其组蛋白修饰亦维持 H3K4me3 持续活化态；这些基因的下游效应分子 PPARY保持持续活化态，而 C/ΕΒΡα则从双价态变为激活态，随着 PPAR_Y和 C/EBPct表达持续升高，成脂分化顺利进行，标志基因 LPL和 AP2表达明显增加。 aMSC向成骨谱系分化过程中，伴随早期调控基因组蛋白修饰从 H3K4me3到双价修饰的变化， BMP2、 TAZ、 MSX2、 Smad5和 BMPR2 亦经历了从表达上调到诱导 4到 6天表达达峰值，然后表达下调的动态过程，这种动态表达变化即确保了成骨分化的启动又有利用成骨细胞功能的进一步成熟；成骨关键性基因 RUNX2维持 H3K4me3活化态，表达量持续升高，进一步促进了其下游靶基因 OSX及成骨标志基因 ALP 和 OPN的表达。有趣的是，我们发现 aMSC走向成脂分化时，成骨分化相关转录因子 RUNX2、 TAZ、 MSX2、 Smad5 和 BMPR2的组蛋白修饰从 H3K4me3活化态变为双价修饰， MSX2则从双价修饰变为抑制态，这些基因的表达均下调。而当 aMSC走向成骨分化时，成脂分化的关键转录因子 σΕΒΡβ、 ΟΕΒΡδ、 GSK3P和 ΡΡΑΙ γ等的组蛋白修饰从 H3K4me3活化态变成双价态， C/EBPct则从双价态变为 H3K27me3抑制态，这些基因的表达亦降低。而在 aMSC向成指或成骨谱系分化时，神经分化相关的转录因子 MSI1、TLX2 和 NES等的组蛋白修饰则进一步走向抑制。终末分化的成脂或成骨细胞中该谱系分化相关的转录因子及标志基因的组蛋白修饰以 H3K4me3为主，而其它谱系则表现为 H3K27me3。这些结果提示， MSC向特定谱系分化开始前，某些未知机制使相关基因的组蛋白修饰状态发生改变，以利于该谱系分化所需基因的活化表达，同时抑制或关闭其他谱系相关因子的表达，从而使特定谱系分化得以顺利进行。

由上述组蛋白修饰的动态分析可见， aMSC向神经、成脂及成骨谱系分化后，该谱系相关转录因子组蛋白修饰表现为进一步活化（即从抑制或无修饰到双价、从 K27 占优势的双价态到 K4 占优势的双价态、从双价到活化态或保持持续活化等方式），各种方式的进一步活化的组蛋白修饰变化为特定谱系分化相关基因的活化或表达上调提供了可能性。不仅如此，当 aMSC 向特定谱系分化启动时，该谱系分化相关基因组蛋白修饰进一步转向活化的同时，其它谱系分化相关转录因子的组蛋白则进一步转向抑制性修饰为主，这样就很好的确保了干细胞向特定谱系分化的专一性及分化效率。总之，在细胞向特定谱系分化过程中，组蛋白甲基化修饰亦发生着动态变化，以满足开启不同分化阶段性事件相关基因活化的需要。对未知分化程度的细胞进行分化阶段相关基因的组蛋白甲基化修饰状态进行分析就可评估此细胞所处的分化阶段。因此，组蛋白甲基化修饰状态的分析可作为鉴定细胞分化阶段或成熟度的辅助指标。讨论：

上述的研究结果表明，不同级别干 /祖细胞细胞中各谱系分化关键基因的不同组蛋白修饰状态与这些细胞所具有的分化潜能密切相关。对未知分化潜能的干 /祖细胞中组蛋白甲基化的分析可作为预测此类细胞分化潜能。而且，在特定谱系分化启动前，在某些未知机制的调控下，组蛋白修饰状态会发生重新布局，以利用特定谱系分化相关基因的活化及保持其它谱系分化相关基因不被激活，从而实现了定向分化的特异性。因此，对分化阶段性相关基因的组蛋白甲基化修饰的分析还可以用来鉴定细胞所处的分化阶段及成熟度。因此我们提出，分化相关基因组蛋白 H3K4me3 和 H3K27me3修饰状态与干细胞的分化能力及分化阶段密切相关，可以作为预测不同来源不同级别干细胞分化潜能及细胞分化阶段和成熟度的表观遗传学标签。这一发现为临床上更好的筛选和鉴定各种组织器官再生修复治疗所需种子细胞提供了新的标准。这种组蛋白甲基化标签比较容易得到：首先，利用 ChlP-seq 技术获得未知分化潜能干细胞的全基因组组蛋白甲基化修饰谱，再根据此干细胞应用的目的有针对性的选择分析某一 /些谱系分化相关基因的组蛋白 H3K4me3 禾 B H3K27me3修饰状态，进一步应用 ChlP-PCR技术对 ChlP-seq结果进行验证，即可对此干细胞是否具有向该谱系分化的能力作出预测。另外还可通过目前已经获得人类胚胎干细胞、脂肪来源间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞及成熟 T细胞等不断丰富的网络数据库资源进行比对分析，按照分化能力的差别，将未知分化能力的干细胞在以具有分化全能性的胚胎干细胞为塔尖的干细胞等级金字塔上进行定位。 ChlP-seq技术获得全基因组组蛋白甲基化修饰谱后就可简单快捷的预测此干细胞在适合的外界条件下或体内微环境下是否具有向感兴趣谱系分化潜能。同样，利用 ChlP-seq或 ChlP-PCR技术对干细胞在某一谱系分化过程中相关转录因子及阶段性分化标志基因的组蛋白甲基化修饰状态进行分析，结合这些转录因子及标志基因的实时定量 PCR, 就可很好的对干细胞所处的具体分化阶段进行鉴定（注：因组蛋白甲基化修饰的变化先与基因表达改变，当某一基因的组蛋白甲基化状态变为更加活化，包括双价修饰变成 H3K4me3活化修饰或 H3K27me3抑制修饰变成双价修饰，预示着这个基因将有进一步被活化的可能，而该基因最终表达是否上调或上调程度受控于其上游的活化因子、细胞因子或 miRNA等的调控）。同时，当干细胞向目的谱系分化时，对其它谱系相关基因的组蛋白修饰状态的变化分析还可鉴定干细胞是否专一性的向目的基因分化。

因此，利用全基因组 ChlP-seq技术和 ChlP-seq对相关基因组蛋白 H3K4me3 和 H3K27me3修饰状态进行分析，联合相应的基因芯片结果，针对不同谱系关键转录因子制定组合性表观遗传学检测标签，结合基因及非编码 R A等标志物的联合应用，有望成为临床上各种组织器官再生修复治疗所需种子细胞的筛选及分化阶段和分化专一性鉴定的金标准。参考文献

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Claims

权利要求书

1、一种预测干细胞分化潜能的方法，其包括下述步骤：

1 ) 获取目标干细胞；

2 ) 使用特异性抗组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化和抗组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化的抗体以 CMP技术获得目标干细胞中所有与所述抗体结合的 DNA 样品；

3 )将 CMP获得的 DNA样品进行高通量测序以获取目标干细胞的全基因组组蛋白甲基化修饰谱和 /或设计特异于目的基因的引物，以上述 DNA样品作为底物，进行 PCR反应以获取目的基因的组蛋白甲基化修饰状态，

其中，目标基因属于组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰或组蛋白 H3第 4 位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰共存则指示目标干细胞具有分化到目的基因所指示的特定细胞类型的能力。 2、根据权利要求 1所述的预测干细胞分化潜能的方法，其特征在于所述目的基因选自全能基因、神经分化相关基因、成脂性基因、成骨性基因、造血相关基因或肝上皮分化相关基因的一种谱系、多种谱系或包括其他谱系的全部分化相关转录因子，其中全能基因包括 OCT4、 NANOG、 c-MYC、 SALL4、 SOX2、 KLF4 , 神经分化相关基因包括 TUBB3、 NKX2-2、 S0X1、 NEUR0G1、 ASCL1、 BRN2、 MYT1L、 ZIC1、 NEUROG2、 HES1、 DLX1、 PAX6、 TLX2、 MSI1、 GFRA1、 GFRA3、 MAPT、 NES、 OLIG2 NEUR0D1、 NEUROD2, 成脂性基因包括 C/EBP a、 PPAR Y ERK5、 GSK3 a、 GSK3 β、 C/EBP δ、 C/EBP β , 成骨性基因包括 RUNX2、 BMP4、 Smad5、 TAZ、 MSX2、 DLX5、 BMPR2、 Wnt5a,造血相关基因包括 c-Myb、 EGR1、 F0G1、 SCL、 E47、 Ikaros、 GATA1、 BCL-6 , 肝上皮分化相关基因包括 Mxill、 GSC、 Soxl7、 PROX1、 HNF1B、 HNF6、 E-cadherin、 Foxa- 1、 Foxa-2 SNAI1、 NEUROD2、 GFRA2。

3、全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其中通过检测所述全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白甲基化修饰状态预测干细胞的分化潜能。

4、根据权利要求 3所述的全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其特征在于通过检测特定谱系分化阶段性转录因子及标志基因的组蛋白甲基化修饰状态鉴定该细胞所处的分化阶段。

5、根据权利要求 3所述的全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其特征在于分析启动其它非目标谱系分化相关基因的组蛋白修饰状态变化鉴定细胞向目标谱系分化的专一性。

6、根据权利要求 3至 5任一项所述的全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其特征在于所述组蛋白甲基化修饰为组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰或组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰并存。

7、根据权利要求 3或 6任一项所述的全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其特征在于全能性基因和 /或分化相关基因选自全能基因、神经分化相关基因、成脂性基因、成骨性基因、造血相关基因或肝上皮分化相关基因的一种谱系、多种谱系或包括其他谱系的全部分化相关转录因子，其中全能基因包括 OCT4、 NANOG、 c-MYC、 SALL4、 SOX2、 KLF4，神经分化相关基因包括 TUBB3、 NKX2-2、 SOX1、 NEUROG1、 ASCL1 BRN2、 MYT1L、 ZIC1、 NEUROG2、 HES1、 DLX1、 PAX6、 TLX2、 MSI1、 GFRA1 GFRA3、 MAPT、 NES、 OLIG2、 NEURODl、 NEUROD2, 成脂性基因包括 C/EBP α、 PPAR γ、 ERK5、 GSK3 α、 GSK3 β、 C/EBP δ、 C/EBP β，成骨性基因包括 RUNX2、 BMP4、 Smad5、 TAZ、 MSX2、 DLX5、 BMPR2、 Wnt5a, 造血相关基因包括 c-Myb、 EGR1、 FOGl、 SCL、 E47、 Ikaros、 GATA1、 BCL-6, 肝上皮分化相关基因包括 Mxill、 GSC、 Soxl7、 PROX1、 HNF1B、 HNF6、 E-cadherin、 Foxa-l Foxa-2 SNAI1、 NEUROD2、 GFRA2。

8、根据权利要求 3至 Ί任一项所述的全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其特征在于检测所述全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白甲基化修饰状态时使用 ChlP-seq 或

9、根据权利要求 3至 8任一项所述的全能性基因和 /或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其特征在于所述全能性基因和 /或分化相关基因的不同组蛋白甲基化状态指示了干细胞的不同分化潜能，某谱系分化相关基因组蛋白甲基化修饰是组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰并存为主，则指示这种干细胞具有向该谱系分化的潜能，两种或多种干细胞进行比较，则该谱系相关基因总体上受组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白 H3第 4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白 H3第 27位赖氨酸三甲基化修饰并存的基因所占比例高的干细胞更易于向该谱系分化。