CN103459592B - 亚全能干细胞产品及其表观遗传修饰标签 - Google Patents

Abstract

提供了一种亚全能干细胞产品及其表观遗传修饰标签，诱导生成亚全能干细胞产品的方法以及干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签鉴定。还提供了一种亚全能性基因和/或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传学修饰标签的用途。

Description

亚全能干细胞产品及其表观遗传修饰标签

技术领域

本发明涉及亚全能干细胞产品，诱导生成亚全能干细胞产品的方法及干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签鉴定。本发明还涉及预测干细胞分化潜能的方法及亚全能性基因和/或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途。

背景技术

干细胞是组织再生的源泉，根据个体发育过程中出现的先后次序，干细胞可分为胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)和成体干细胞(adultstemcells，ASCs)；根据分化潜能的不同，又可将其分为全能干细胞(totipotentstemcell)、多潜能干细胞(pluripotentstemcell)、多能干细胞(multipotentstemcell)和单能干细胞(unipotentstemcell)。成体干细胞还可根据组织来源分为造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞等。通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞被诱导重构成为ES细胞样的多潜能干细胞，这种多潜能干细胞被称为诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)[1，2]。因发育阶段、取材及获得方式等不同，胚胎干细胞、成体干细胞及iPS细胞在临床应用上显示出不同的优势和局限性。胚胎干细胞具有分化的全能性，但伦理问题、免疫排异与成瘤性特点严重阻碍了其在临床上的研究与应用。iPS具有与胚胎干细胞类似的分化能力，但其仍具有成瘤性，而且从成体细胞诱导生成iPS的效率极低，诱导生成的iPS癌变率较高，这些因素大大增加了临床应用的不安全性。成体干细胞来源非常广泛，无成瘤性，亦不存在伦理问题。传统的观点认为成体干细胞属多能或单能干细胞。近年来的一些实验证据显示，成体干细胞具有“可塑性”，不仅能分化为特定谱系中的细胞类型，还具有分化为在发育上无关的其他谱系的能力，提示成体干细胞具有比人们以前想象的更大的分化潜能[3-5]。

由于来源较多，目前成体干细胞没有统一的表型、培养条件及鉴定方法。各种组织来源的成体干细胞显示出不同的分化能力。这些因素使得成体干细胞的研究变得复杂混乱，很难建立比较均一的细胞系，因此为进一步的临床应用带来了困难。

表观遗传修饰通常包括DNA甲基化、组蛋白修饰及RNA修饰；而组蛋白修饰又包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化；修饰部位大多位于组蛋白N端，这些修饰可通过影响组蛋白与DNA的亲和性，从而改变染色质的状态，也可以影响转录因子与DNA序列的结合，对基因表达调控具有类似DNA遗传密码的作用，故被称作“组蛋白密码”。组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶介导。组蛋白赖氨酸的甲基化已成为转录的重要调控机制，在异染色质的形成、X染色体的失活、基因组印迹、DNA损伤修复及基因转录调控中担任重要角色[6-10]。组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)一般与启动子活化有关[11]，而组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)则与启动子的表达沉默相关[12，13]。基因启动子区H3K4me3和H3K27me3两种组蛋白修饰状态同时存在则被称为双价修饰，这种双价修饰使基因保持在相对低的表达水平，维持在一种“预备转录”的状态，这种状态可以使基因根据适当的刺激做出迅速的转录活化或抑制等反应[14-17]。

最近越来越多的研究开始关注组蛋白赖氨酸甲基化在胚胎发育中的作用。对斑马鱼的研究发现，受精后基因组失活，直到母源性向合子转换(maternal-zygotictransition)完成才重新起始转录[18-20]，基因组组蛋白H3赖氨酸三甲基化的修饰分析结果显示，转换前组蛋白H3K27me3抑制性修饰及H3K4me3活化性修饰均未检测到；转换完成，基因组激活后，80％的基因出现了H3K4me3修饰，其中未活化的一些发育调控相关基因同时还存在H3K27me3修饰。上述结果提示，这种在母源性向合子转换过程中建立起来的染色质组蛋白H3双价或单价修饰谱很可能与全能性的建立有关[21]。先前的研究发现，在小鼠胚胎干细胞中，H3K4me3和H3K27me3共定位存在与由约2.5％基因组组成的高度保守的区域，提示这种双价修饰状态在干细胞保持这种“预备”活化的状态中担任重要角色[14]。对人胚胎干细胞组蛋白修饰的研究发现，在启动子附近，H3K4me3修饰普遍存在，而H3K27me3仅见于10％的基因启动子区，而且，H3K27me3修饰存在的区域同时受H3K4me3修饰，这些受双价修饰的基因在ESC分化时优先被激活，提示双价修饰的存在可能是维持发育相关基因在一种平衡状态，为以后的活化做准备[15]；而那些没有任何修饰的基因则处在抑制状态，完全被沉默。利用ChIP-seq检测结果建立的数据库对多能性神经祖细胞(multipotentneuralprogenitorcells，NPCs)、鼠胚胎纤维母细胞(murineembryonicfibroblasts，MEFs)及原代人T细胞中H3K4me3和H3K27me3修饰分析发现，在NPCs或MEFs中，受双价修饰的基因数量下降[10，17]。由此推测受双价修饰的区域大部分是胚胎干细胞特异性的[14]。但最近全基因组组蛋白甲基化修饰谱的分析显示，在分化的细胞(如T细胞和MEFs)中也发现有这种受双价修饰的区域，因此双价修饰并不是ESC特有的[10，17，22]。尽管与ESC相比，人T细胞中受双价修饰基因的数量下降，但之前一些没有任何修饰的基因的组蛋白却重新被甲基化修饰，推测组蛋白修饰的这种变化可能与T细胞的特化及其它谱系的抑制有关[15]。

尽管研究提示，组蛋白甲基化在异染色质的形成、X染色体的失活、基因组印迹、DNA损伤修复及基因转录调控中有重要作用，而且发现组蛋白甲基化位点在不同物种中是高度保守的，在分化能力不同的细胞中存在不同的组蛋白甲基化修饰谱。但迄今为止，组蛋白甲基化修饰在细胞分化中的作用及意义还知之甚少。表观遗传调节是一个动态变化的过程，这使得表观遗传的研究变得复杂。近年来随着测序技术的迅速发展及其成本的降低，染色质免疫共沉淀与测序相结合的技术(ChIP-seq)得到到了广泛应用[23，24]。

干细胞移植可以用于治疗帕金森症、心肌病、肝脏疾病、以及诱导成骨治疗骨缺损、大面积烧伤治疗急需的皮肤材料等。成体具有干细胞取自自体、由它诱导分化而来的组织在进行移植时不存在免疫排斥问题，诱导分化的组织类型广泛等优点，具有广阔的应用价值，有望成为未来干细胞移植治疗各种器官终末期疾病的主力军。但是，目前干细胞移植还存在众多的安全性问题，如有报道指出，应用胚胎干细胞植入心脏治疗冠心病时，可能会导致畸胎瘤，应用骨骼肌干细胞则有产生恶性心律失常的危险，还有骨髓细胞移植后出现严重心肌钙化的报告。因此，上述干细胞移植治疗的成功取决于以下两大重要因素：(1)种子干细胞在体外的获取、纯化和扩增；(2)干细胞在体内按照治疗目的发生专一性有功能的分化。如何使既控制增殖，避免发生肿瘤，又能在适当的时候启动所需要的途径进行分化，对干细胞移植治疗至关重要。但是，获取具有适当分化能力的干细胞，根据治疗目的对其进行鉴定，并进而移植到体内使之适时的发生专一性分化而不发生畸胎瘤等等一系列问题均需要有一套对干细胞分化潜能、分化阶段及干细胞是否在体内发生可控的专一性分化等准确鉴定和评价指标。因此，多能性干细胞在临床上的应用前景依赖于它们的分化潜能。现有的验证某种组织来源干细胞分化能力的方法主要还是通过诱导分化，观察其是否能向三胚层尽可能多的谱系分化，这种方法需要很长的时间，要耗费大量人力物力。

染色质免疫沉淀分析(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)是检测组蛋白修饰的最重要的方法。染色质免疫共沉淀技术(ChIP)也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。染色质免疫沉淀分析是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。目的片断可以通过tilingarray或高通量测序的方法来检测，前者称为ChIP-on-chip而后者称为ChIP-Seq。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等相互作用的DNA区段。

ChIP-Seq的原理是，首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等相互作用的DNA区段信息。

由于ChIP-Seq的数据是DNA测序的结果，为研究者提供了进一步深入挖掘生物信息的资源，研究者可以在以下几方面展开研究：

(1)判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；

(2)检测RNApolymeraseII及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；

(3)研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；

(4)CTCF转录因子研究。

因此，如果能利用特定的分离、诱导和筛选体系获得具有适当分化能力的干细胞并利用“组蛋白甲基化密码”在预示细胞分化中的作用以及ChIP检测与生物信息学分析相结合的方法(ChIP-seq)研究多种级别干细胞的全基因组组蛋白甲基化修饰谱，找到组蛋白甲基化修饰与干细胞分化能力间的关系，为成体干细胞建立统一的表型、培养条件及鉴定方法，并进而建立一套对干细胞分化潜能、分化阶段及干细胞是否在体内发生可控的专一性分化等准确鉴定和评价指标，将为干细胞在临床上广泛应用提供最基础的材料和指标。图7显示了本发明的技术示意图。

发明内容

因此，本发明的目的在于诱导获得一种亚全能干细胞，这种细胞呈上皮样形态，具有Flk1阳性的表型，具有三胚层多谱系的分化能力，但不具有成瘤性。这种细胞的获得为临床上再生修复治疗提供理想的种子细胞。

本发明的目的还在于寻找组蛋白甲基化修饰和干细胞分化能力间的关系，从而为快速、准确地确定干细胞的分化能力提供一种有力的工具。

因此，本发明的第一方面提供了一种亚全能干细胞产品，其特征在于其具有上皮样形态、Flk1⁺表型、无成瘤性且单克隆来源的该细胞在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力，优选地，其全能基因包括Oct4、Nanog、c-Myc、Sall4、Sox2、Klf4；外胚层早期分化相关基因包括Hoxa1、Gbx2、Six1和Olig3；中内胚层早期分化相关基因T、Pgdfrα、Eomes、Tbx6和Mixl1；中胚层早期分化相关基因Kdr、Hand1、Gata4和Mesp2；限定性内胚层早期分化相关基因Onecut1、Prox1、Foxa1、Foxa2、Sox7、Sox17、Pdx1和Gsc的甲基化修饰状态以活化或H3K4me3和H3K27me3共存的双价修饰为主。

本发明的第二方面涉及一种产生如上所述的亚全能干细胞产品的方法，具有以下步骤：

A)常规方法分离aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞，

B)以1个细胞/孔的密度将aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞接种于96孔板中，待长出单克隆后，将这些单克隆进一步扩增，

C)将单克隆进一步扩增后的细胞作为种子细胞，4-6h细胞完全贴壁后加入1号诱导培养基诱导1天后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4天，获得亚全能干细胞，即Flk1阳性的MSC，所述1号诱导培养基包含1-100ng/ml活化素A+1-500ng/mlWnt3a+0.1-20％FBS+HG-DMEM，优选地，5-50ng/ml活化素A，更优选地，10-30ng/ml活化素A；优选地，50-300ng/mlWnt3a，更优选地，100-300ng/mlWnt3a；优选地，2-10％FBS，更优选地，5-8％FBS，所述2号诱导培养基包含1-100ng/ml活化素A+1-500μMRA+0.1-50％FBS+HG-DMEM，5-50ng/ml活化素A，更优选地，10-30ng/ml活化素A；优选地，20-400μMRA，更优选地，50-200μMRA，将获得的具有上皮样形态的亚全能干细胞进行RT-PCR检测、免疫细胞荧光染色检测和WesternBlot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括Foxa2、Sox17、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Sox1、Pax6，所述WesternBlot检测的指标包括Foxa2、Sox17、T、Gsc、Epcam、Vimatin，检测获得的干细胞是否具有三胚层分化潜能重要基因表型标志，即限定性的内胚层：Foxa2、Sox17；中内胚层：Gsc、T、Eomes；中胚层：Kdr、Tbx6；外胚层：Sox1、Pax6，并且具有较高的诱导效率，Foxa2、Sox17阳性的限定性内胚层细胞效率达到90％以上。

本发明的第三方面涉及一种检测干细胞产品是否为亚全能干细胞产品的方法，其包括下述步骤：

1)获取目标干细胞，检测其细胞形态是否为上皮样形态；

2)检测其Flk1是否呈阳性；

3)RT-PCR、免疫细胞荧光染色和WesternBlot方法检测其分化能力，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括Foxa2、Sox17、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Sox1、Pax6，所述WesternBlot检测的指标包括Foxa2、Sox17、T、Gsc、Epcam、Vimatin；

4)将其移植入SCID小鼠检测是否导致畸胎瘤；

5)对其进行向三胚层多谱系的诱导分化；神经诱导分化：DMEM/F12(DF12)1∶1基础培养基中加入N2/B27、20ng/mlEGF和50ng/mlIGF-1，诱导两周后加入30ng/mlNT3和10ng/mlbFGF，两周后加入30ng/mlNT3和10ng/mlBDNF再诱导7天；成脂分化：DMEM基础培养基加入10％FCS、1μM地塞米松、0.5mMIBMX、1mM抗坏血酸诱导8天；成骨分化：DMEM基础培养基加入10％FCS、10mMβ-甘油磷酸钠、10nM地塞米松和0.2mM抗坏血酸诱导8天；肝上皮诱导分化：基础培养基中加入20ng/mlHGF、10ng/mlFGF-4、20ng/mlEGF和2％FBS诱导3周；造血细胞诱导分化：基础培养基中加入150ng/mLSCF和200ng/mLG-CSF诱导7天，收集细胞，接种在无血清甲基纤维素半固体培养基中，该培养基含1％BSA，50ng/mLBMP-4，50ng/mLIL-6，50ng/mLSCF，50ng/mLFlt-3L，10ng/mLG-CSF，10ng/mLTPO；10μg/mLEPO，200μg/mL转铁蛋白，2mML-谷氨酰胺，0.1mMβ-mercaptoethanol，1％非必需氨基酸，诱导9天，收集的细胞，洗去甲基纤维素，计数5000个细胞，重新接种在含血清的甲基纤维素半固体培养基中再诱导14天；

6)检测所述干细胞中亚全能及组织分化相关基因组蛋白甲基化状态以预测其分化潜能，方法如下：

①使用特异性抗组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化和抗组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化的抗体以ChIP技术获得所述干细胞中所有与所述抗体结合的DNA样品；

②将ChIP获得的DNA样品进行高通量测序以获取目标干细胞的全基因组组蛋白甲基化修饰谱和/或设计特异于目的基因的引物，以上述DNA样品作为底物，进行PCR反应以获取目的基因的组蛋白甲基化修饰状态，

其中，目标基因属于组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰或组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰共存则指示目标干细胞具有分化到目的基因所指示的特定细胞类型的能力。

优选地，所述目的基因选自亚全能基因、三胚层早期分化基因、神经分化相关基因、成脂性基因、成骨性基因、造血相关基因或肝上皮分化相关基因的一种谱系、多种谱系或包括其他谱系的全部分化相关转录因子，其中全能基因包括Oct4、Nanog、c-Myc、Sall4、Sox2、Klf4；外胚层早期分化相关基因包括Hoxa1、Gbx2、Six1和Olig3；中内胚层早期分化相关基因T、Pgdfrα、Eomes、Tbx6和Mixl1；中胚层早期分化相关基因Kdr、Hand1、Gata4和Mesp2；限定性内胚层早期分化相关基因Onecut1、Prox1、Foxa1、Foxa2、Sox7、Sox17、Pdx1和Gsc，神经分化相关基因包括Tubb3、Nkx2-2、Sox1、Neurog1、Ascl1、Bm2、Myt1l、Zic1、Neurog2、Hes1、Dlx1、Pax6、Tlx2、Msi1、Gfra1、Gfra3、Mapt、Nes、Olig2、Neurod1、Neurod2，成脂性基因包括C/EBPα、PPARγ、ERK5、GSK3α、GSK3β、C/EBPδ、C/EBPβ，成骨性基因包括RUNX2、BMP4、Smad5、TAZ、MSX2、DLX5、BMPR2、Wnt5a，造血相关基因包括c-Myb、EGR1、FOG1、SCL、E47、Ikaros、Gata1、BCL-6，肝上皮分化相关基因包括Mxil1、Gsc、Sox17、Prox1、Hnf1β、Hnf6、E-cadherin、Foxa1、Foxa2、Snai1、Neurog2、Gfra2。

本发明的第四方面涉及一种亚全能性基因和/或分化相关基因的组蛋白修饰状态作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的用途，其中通过检测所述亚全能性基因和/或分化相关基因的组蛋白甲基化修饰状态预测干细胞的分化潜能。

优选地，通过检测特定谱系分化阶段性转录因子及标志基因的组蛋白甲基化修饰状态鉴定该细胞所处的分化阶段。

优选地，分析启动其它非目标谱系分化相关基因的组蛋白修饰状态变化鉴定细胞向目标谱系分化的专一性。

优选地，所述组蛋白甲基化修饰为组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰或组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰并存。

优选地，亚全能性基因和/或分化相关基因选自全能基因、三胚层早期分化相关基因、神经分化相关基因、成脂性基因、成骨性基因、造血相关基因或肝上皮分化相关基因的一种谱系、多种谱系或包括其他谱系的全部分化相关转录因子，其中全能基因包括Oct4、Nanog、c-Myc、Sall4、Sox2、Klf4；外胚层早期分化相关基因包括Hoxa1、Gbx2、Six1和Olig3；中内胚层早期分化相关基因T、Pgdfrα、Eomes、Tbx6和Mixl1；中胚层早期分化相关基因Kdr、Hand1、Gata4和Mesp2；限定性内胚层早期分化相关基因Onecut1、Prox1、Foxa1、Foxa2、Sox7、Sox17、Pdx1和Gsc，神经分化相关基因包括Tubb3、Nkx2-2、Sox1、Neurog1、Ascl1、Bm2、Myt1l、Zic1、Neurog2、Hes1、Dlx1、Pax6、Tlx2、Msi1、Gfra1、Gfra3、Mapt、Nes、Olig2、Neurod1、Neurod2，成脂性基因包括C/EBPα、PPARγ、ERK5、GSK3α、GSK3β、C/EBPδ、C/EBPβ，成骨性基因包括RUNX2、BMP4、Smad5、TAZ、MSX2、DLX5、BMPR2、Wnt5a，造血相关基因包括c-Myb、EGR1、FOG1、SCL、E47、Ikaros、Gata1、BCL-6，肝上皮分化相关基因包括Mxil1、Gsc、Sox17、Prox1、Hnf1β、Hnf6、E-cadherin、Foxa1、Foxa2、Snai1、Neurog2、Gfra2。

优选地，检测所述亚全能性基因和/或分化相关基因的组蛋白甲基化修饰状态时使用ChIP-seq或ChIP-PCR。

优选地，所述亚全能性基因和/或分化相关基因的不同组蛋白甲基化状态指示了干细胞的不同分化潜能，某谱系分化相关基因组蛋白甲基化修饰是组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰并存为主，则指示这种干细胞具有向该谱系分化的潜能，两种或多种干细胞进行比较，则该谱系相关基因总体上受组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰并存的基因所占比例高的干细胞更易于向该谱系分化。

换言之，本发明利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)获得了目标干细胞中与特异性抗组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化和抗组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化的抗体结合的所有DNA，然后通过高通量测序技术获得了所述DNA的序列信息，通过与基因组信息相比对，获得了目标干细胞的全基因组的组蛋白修饰谱，或者通过设计针对特定基因的引物利用PCR技术获得特定基因的组蛋白修饰状态。其中，目标基因属于组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰(H3K4me3)或组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰(H3K4me3)和组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰(H3K27me3)共存则指示目标干细胞具有分化到目的基因所指示的特定细胞类型的能力。某谱系分化相关基因组蛋白甲基化修饰是组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰并存为主，则指示这种干细胞具有向该谱系分化的潜能，两种或多种干细胞进行比较，则该谱系相关基因总体上受组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰和组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰并存的基因所占比例高的干细胞更易于向该谱系分化。任何在干细胞或特定分化潜能干细胞内具有亚全能性或谱系分化标识意义的基因均可用于本发明所述的方法，包括但不限于全能基因包括Oct4、Nanog、c-Myc、Sall4、Sox2、Klf4；外胚层早期分化相关基因包括Hoxa1、Gbx2、Six1和Olig3；中内胚层早期分化相关基因T、Pgdfrα、Eomes、Tbx6和Mixl1；中胚层早期分化相关基因Kdr、Hand1、Gata4和Mesp2；限定性内胚层早期分化相关基因Onecut1、Prox1、Foxa1、Foxa2、Sox7、Sox17、Pdx1和Gsc，神经分化相关基因包括Tubb3、Nkx2-2、Sox1、Neurog1、Ascl1、Bm2、Myt1l、Zic1、Neurog2、Hes1、Dlx1、Pax6、Tlx2、Msi1、Gfra1、Gfra3、Mapt、Nes、Olig2、Neurod1、Neurod2，成脂性基因包括C/EBPα、PPARγ、ERK5、GSK3α、GSK3β、C/EBPδ、C/EBPβ，成骨性基因包括Runx2、BMP4、Smad5、TAZ、MSX2、DLX5、BMPR2、Wnt5a，造血相关基因包括c-Myb、EGR1、FOG1、SCL、E47、Ikaros、Gata1、BCL-6，肝上皮分化相关基因包括Mxil1、Gsc、Sox17、Prox1、Hnf1β、Hnf6、E-cadherin、Foxa1、Foxa2、Snai1、Neurog2、Gfra2等的一种谱系、多种谱系或包括其他谱系的全部分化相关转录因子。(注：终末分化的标志基因如AP2、LPL、c-Kit、ALP、OPN、CK8、CK18等不宜作为分化潜能预测的候选基因)

也即，本申请从胎儿/成体脂肪、骨髓及脐带等多种组织提取间充质干细胞，通过极限稀释法获得单克隆细胞，将单克隆细胞进一步扩增后，通过在恰当的时间加入适量的活化素A和Wnt3a等因子，诱导出一种具有上皮样形态、Flk1阳性的MSC，它在小鼠体内不能形成畸胎瘤。RT-PCR、免疫细胞荧光染色和WesternBlot方法检测显示，这种Flk1阳性的MSC中表达限定性的内胚层标志基因Foxa2、Sox17，中内胚层标志基因Gsc、T、Eomes，中胚层标志基因Kdr、Tbx6，外胚层标志基因Sox1、Pax6等。对Flk1⁺MSC进行体外诱导，发现其能进一步分化成脂肪细胞、骨细胞、肝上皮、神经胶质细胞、胰腺干/祖细胞等三胚层多谱系来源的组织。我们将这种具有分化为三胚层多谱系来源组织细胞的能力，但不具发育为完整的个体的分化能力称为亚全能性，将具有亚全能性的Flk1⁺MSC称为亚全能干细胞。这种亚全能干细胞的获得为再生及转化医学的研究及临床应用提供理想的种子细胞。

通过对具有不同分化能力的干细胞的组蛋白修饰状态的分析之后发现：干细胞中亚全能及各系分化相关基因不同组蛋白H3K4及H3K27三甲基化的修饰状态与干细胞的分化能力密切相关，可以用来预测干细胞的分化潜能；不仅如此，干细胞向特定谱系分化启动时，先于基因表达的改变，分化相关基因组蛋白修饰状态将发生重新布局，使得目标谱系相关基因的组蛋白甲基化修饰状态变得更加活化，而启动其它谱系分化相关基因的组蛋白修饰则变得进一步抑制或沉默，因此，对干细胞向某一谱系分化过程中该谱系及其它非目标谱系分化相关基因组蛋白甲基化修饰状态的动态变化可用来鉴定干细胞干细胞分化的阶段及专一性。一旦向某一谱系分化相关基因的表达已经被激活，这时的细胞已经是发生部分分化了的细胞，因此，如果用谱系分化相关基因的表达量来衡量干细胞的分化潜能会漏掉很多更原始、分化潜能更广泛的干细胞来源，而组蛋白修饰的变化先于基因表达的改变，干细胞中组蛋白H3上的K4或K4和K27同时被三甲基化后能够维持这些基因在非常低的表达水平，处在一种“预备”活化或失活的状态，这种组蛋白修饰状态有利于干细胞根据微环境或外界条件的改变向不同谱系方向分化，因此分化相关基因组蛋白修饰状态的差异可作为预测和评价不同来源干细胞分化潜能的有力指标。即，本说明书中发现“干细胞中亚全能及分化相关基因组蛋白甲基化修饰状态与该干细胞分化能力密切相关，通过干细胞中亚全能及分化相关基因组蛋白甲基化修饰状态的分析可预测该干细胞的分化能力”，也即“特定的亚全能及分化相关基因组蛋白甲基化修饰状态可作为预测某种来源干细胞分化能力的标签”。这种预测干细胞分化能力的方法只需利用ChIP-seq或ChIP-PCR技术对干细胞中亚全能及分化相关基因的组蛋白甲基化状态进行检测，不需要对干细胞进行多谱系的诱导分化，大大节省了时间、人力和试剂耗材。因此组蛋白甲基化修饰状态在预测干细胞分化能力中的作用有着及其重要的临床应用价值。

利用本发明的方法还可通过对亚全能及分化相关基因组蛋白甲基化状态分析，准确地确定某种干细胞的分化状态及分化潜能，从而为其正确的用于临床提供了至关重要的指导信息。

附图说明

图1：显示Flk1⁺MSC的分化能力。(A)极限稀释法获得单克隆来源的aMSCs，(B)Flk1⁺MSC向成脂和成骨谱系分化，(C)Flk1⁺MSC向造血分化及鉴定(OC：Osteocalcin，BFU-E：红系爆式集落形成单位，CFU-G：巨嗜细胞集落形成单位，CFU-MK：巨核细胞集落形成单位，HPP-CFC：高增殖潜能细胞集落形成单位)，(D)Flk1⁺MSC向肝上皮诱导分化及鉴定，(E)Flk1⁺MSC向神经方向诱导分化及鉴定。

图2：显示不同级别干细胞全能基因、三胚层早期分化相关基因及神经分化相关基因的组蛋白甲基化修饰差异谱。(A)全能性相关基因的组蛋白甲基化修饰，(B)外胚层分化相关基因的组蛋白甲基化修饰，(C)中内胚层分化相关基因的组蛋白甲基化修饰，(D)中胚层分化相关基因的甲基化修饰，(E)限定性内胚层分化相关基因组蛋白甲基化修饰(F)神经分化相关基因的组蛋白甲基化修饰。

图3：显示不同干细胞中成脂(A)及成骨(B)分化相关基因甲基化差异修饰谱。

图4：显示不同干细胞中肝上皮(A)及造血(B)分化相关基因甲基化差异修饰谱。

图5：显示aMSC和bMSC中成脂成骨分化相关基因组蛋白甲基化修饰比较及分化能力比较。(A)ChIP-PCR分析aMSC和bMSC中成骨性基因组蛋白甲基化修饰状态，(B)ChIP-PCR分析aMSC和bMSC中成脂性基因组蛋白甲基化修饰状态，(C)aMSC和bMSC向成骨谱系和成脂谱系分化能力的比较。

图6：显示神经、成脂和成骨分化中的相关基因组蛋白甲基化修饰的动态变化。(A)real-timePCR测定神经分化前后相关基因的表达，(B)ChIP-PCR检测神经分化前后相关基因的组蛋白甲基化状态，(C)real-timePCR及基因芯片分析成脂分化前后相关基因的表达及组蛋白甲基化状态，(D)real-timePCR及基因芯片分析成骨分化前后相关基因的表达及组蛋白甲基化状态，(E)real-timePCR及基因芯片分析成脂分化或成骨分化中其它谱系相关基因的表达及组蛋白甲基化状态。

图7：组蛋白甲基化修饰状态预测干细胞分化潜能示意图。

图8：诱导前后细胞形态学变化：左：诱导前细胞呈梭形排列；右：诱导后细胞呈鹅卵石样密集排列。

图9：诱导前后细胞RT-PCR检测结果：从左到右：限定性内胚层标志foxa2、Gsc、T、Eomes(P＜0.05)以及外胚层标志Sox1、Pax6(P＜0.05)的基因表达上调，中胚层标志Kdr、Tbx6基因表达变化不明显(P＞0.05)。

图10：诱导前后细胞行WesternBlot检测：经过诱导后细内胚层标志Foxa2、sox17，中内胚层标志T、Gsc的表达丰度均有明显的增加，上皮细胞标志Epcam的表达丰度也有增加，间质细胞标志Vimantin表达丰度变化不明显。

图11：诱导前后细胞行免疫细胞荧光染色检测：与未诱导的细胞相比，诱导后内胚层标志Foxa2、Sox17阳性的细胞达到90％以上，中内胚层标志T阳性的细胞达到70％以上，外胚层标志Sox1阳性的细胞达到70％以上。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1Flk1⁺MSC获得及分化能力的验证

为了评估Flk1⁺MSC的临床应用价值，我们首先其分化能力进行了验证。

成人脂肪样品取自医科院整形医院，成人骨髓样品取自解放军307医院。所有样品均签订知情同意书。

成人脂肪源间充质干细胞(aMSCs)的分离：

成人脂肪组织取自吸脂手术患者(中国医学科学院整形医院)，与供者签订知情同意书，供者均为25～35岁的健康女性。从脂肪组织中分离aMSCs的方法参照Zuk等[20]方法，并稍加改动。简述如下：采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hanks洗去血细胞和麻醉药，0.2％II型胶原酶消化1小时，之后用D-Hanks洗涤2次以除去胶原酶。离心收集细胞，细胞以2×10⁶/ml的密度接种于含58％DMEM/F12+40％MCDB-201、5％胎牛血清(FCS)、10ng/mlEGF、10ng/mlPDGF，1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleicacid-bovineserumalbumin，LA-BSA)，50μMβ巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素的培养液，37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱培养。2天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天半量换液。当细胞达70％～80％汇合时，0.25％胰酶(Gibco公司)常规消化，细胞按照1∶3进行传代。

成人骨髓源间充质干细胞(bMSCs)的分离：

(1)无菌采集健康志愿者的骨髓5-10ml于无菌的肝素管中。

(2)取一无菌的离心管，用D-Hanks液适当稀释骨髓后计数，并调整骨髓细胞浓度至1×10⁷/ml。

(3)取一新的离心管，分别加入恢复至室温的淋巴细胞分离液和上述骨髓细胞悬液，加入时仔细操作勿破坏界面，二者的比例为1∶1。

(4)将上述离心管配平后放入常温台式离心机中，20℃以1800转/分钟的速度离心20分钟。取出离心管后，无菌操作仔细吸取白膜层即获得了单个核细胞，将单个核细胞用D-Hanks液洗涤两次并计数。

(5)将上述单个核细胞以1×10⁶/cm²的密度接种于25cm²的培养瓶中，细胞培养体系均为含58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％胎牛血清(FCS)、10ng/mlEGF、10ng/mlPDGF，1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleicacid-bovineserumalbumin，LA-BSA)，50μMβ巯基乙醇，2mML-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素的培养液，37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱培养。

(6)24小时后，去除悬浮细胞，补充培养基，细胞每隔三天换液一次，待细胞长至70-80％汇合时，用0.05％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化传代。1-2代的间充质干细胞冻存于液氮罐备用。

通过极限稀释法，以1个细胞/孔的密度将aMSC和bMSC接种于96孔板中，三周后观察约有24.55％±0.66％的孔长出了单克隆。将这些单克隆进一步扩增后作为种子细胞，4-6h细胞完全贴壁后加入1号诱导培养基(20ng/ml活化素A+200ng/mlwnt3a+20％FBS+HG-DMEM)诱导1天后，更换2号诱导培养基(20ng/ml活化素A+100μMRA+20％FBS+HG-DMEM)继续诱导培养4天，获得Flk1⁺MSC。将获得的具有上皮样形态的Flk1⁺MSC进行RT-PCR检测、免疫细胞荧光染色检测(检测Foxa2、Sox17、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Sox1、Pax6)和WesternBlot检测(检测Foxa2、Sox17、T、Gsc、Epcam、Vimatin)，结果表明获得的Flk1⁺MSC具有三胚层分化潜能重要基因表型标志(限定性的内胚层：Foxa2、Sox17；中内胚层：Gsc、T、Eomes；中胚层：KDR、TBX6；外胚层：Sox1、Pax6)，并且具有较高的诱导效率(Foxa2、Sox17阳性的限定性内胚层细胞效率达到90％以上)，结果如图8至图11所示。

将获得的Flk1⁺MSC分成6等份，分别向肝上皮、神经、造血、成脂肪及成骨谱系诱导分化，另一份细胞继续扩增后用于各谱系分化的对照(图1A)。诱导14天后，光镜下可见成脂诱导组细胞胞浆内充满了脂肪滴，油红O染色阳性率达80％，实时定量PCR检测显示成脂标志基因AP2及LPL高表达(图1B)；成骨诱导组ALP及茜素红染色阳性率达65％，实时定量PCR检测显示，成骨标志基因ALP和OPN表达较诱导前明显上调(图1B)。Flk1⁺MSC向造血方向诱导第3天，造血相关的标志分子Osteocalcin(OC)、c-Kit和CD34染色阳性，诱导14天时可见BFU-E(红系爆式集落形成单位)、CFU-G(巨嗜细胞集落形成单位)、CFU-MK(巨核细胞集落形成单位)和HPP-CFC(高增殖潜能细胞集落形成单位)等各系造血集落的形成(图1C)。诱导第21天，肝上皮诱导组细胞CK8、CK18和CK19免疫组化检测阳性(图1D)。诱导第12天，神经诱导组细胞Nestin和Musashi免疫组化检测阳性(图1E)。上述结果表明，Flk1⁺MSC在一定的诱导条件下能够向肝上皮、神经、造血及成脂和成骨等不同胚层来源的多谱系方向分化。

实施例2分化相关基因组蛋白H3K4me3和H3K27me3的不同修饰状态与干细胞的分化潜能密切相关

验证了Flk1⁺MSC具有向肝上皮、神经、造血、成脂及成骨等多胚层谱系分化能力后，我们进一步利用ChIP检测技术与生物信息学分析相结合的方法(ChIP-seq)获得了Flk1⁺MSC全基因组组蛋白甲基化修饰谱。

H3K4me3(Abcam8580)和H3K27me3(Upstate07-449)的ChIP实验按照EZChIP^TMkit(Millipore)的标准操作方法进行

基本过程如下：

1.染色质样本准备和免疫选择

(1)培养细胞，1％甲醛固定，使蛋白和DNA交联，室温10分钟，

(2)裂解和超声(Branson250D超声仪)处理细胞，染色质片段在200-1000bp，

(3)免疫选择；用特异抗体，H3K4me3(Abcam8580)和H3K27me3(Upstate07-449)。

2.DNA纯化和检测

(4)分离纯化DNA，去除蛋白质，65℃孵育去除蛋白-DNA交联，

(5)针对目的基因设计特异性引物，利用PCR或real-timePCR对DNA序列进行鉴定。

阳性对照；

anti-RNAPolymeraseII，所有活化转录的基因启动子区都有结合。

阴性对照；

抗同一种属来源的正常IgG。

对照引物；GAPDH基因的启动子区。

3.免疫沉淀(IP)交联物

开始前准备：将蛋白酶抑制剂CocktailII放置室温溶解，该试剂含DMSO，在18.4℃以下时仍处于冰冻状态。

(6)制备含蛋白酶抑制剂的Dilutionbuffer，放置在冰上。

每个IP需要900ulDilutionBuffer加4.5ulPICocktail。

样品包括阳性对照(抗RNApolymeraseII)、阴性对照(正常的相同物种IgG)和目的蛋白。阴性对照IgG建议与目的蛋白抗体来源的物种一致。

(7)将制备的含100ul产物的EP管放冰上，进行染色质免疫沉淀(IP)。冻存的样品需提前冰上溶解。

如果同一份染色质产物要进行多个IP，可将产物放在一个大管内(能容纳1.1ml溶液的EP管)。

每100ul产物需含有大约2×10⁶细胞来源的染色质。

(8)每100ul染色质产物中加入900ul含PIcocktail的DilutionBuffer。

如果有多分IP，加入相应数量的DilutionBuffer。

(9)每个IP加入60ulProteinGAgarose。

ProteinGAgarose是50％浆液，使用前颠倒轻轻混匀。

这一步是“preclear”染色质，去除非特异结合ProteinGAgarose的蛋白和DNA。

多分合并处理时加相应数量的ProteinGAgarose。

(10)4℃旋转孵育1小时。

(11)3000-5000g离心1分钟，沉淀agarose。

不要高速离心ProteinGAgarose。离心力太大，可能造成beads粉碎或变形。

(12)取10ul(1％)上清作为Input，保存在4℃，待第5步进行处理。

多个样本同时处理时，各取1％的染色质样本做Input.

(13)收集上清液1ml转移至新的EP管。

(14)在上清液中加入免疫沉淀的抗体。

阳性对照管，加1.0ug抗-RNApolymerase抗体。

阴性对照管，加1.0ug正常的相同物种IgG。

检测管加1-10ug抗体。加抗体的量需要根据以往经验确定。

(15)4℃旋转孵育过夜。IP的孵育时间可以缩短，主要取决于抗体、靶基因和细胞类型等多个因素。

(16)加60ulProteinGAgarose，4℃旋转孵育1小时。

(17)3000-5000g离心1分钟，沉淀agarose，去上清。

(18)用以下溶液每个lml依次洗ProteinGAgarose/染色质复合物，重悬后，旋转孵育3-5分钟，低速离心3000-5000g离心1分钟，小心去除上清。

a.LowsaltimmuneComplexWashBuffer，一次；

b.HighSaltImmuneComplexWashBuffer，一次；

c.LiClImmuneComplexWashBuffer，一次；

d.TEBuffer，二次。

4.蛋E/DNA复合物洗脱

开始前准备：

将1MNaHCO₃放置至室温。可能会有少量沉淀，等恢复到室温后，沉淀可溶解。1MNaHCO₃可漩涡混匀。

准备65℃水浴。

(1)为所有IP管准备Elutionbuffer，包括Input管(见节3，步骤7)。每管需200ulElutionbuffer，配制方法：10ul20％SDS，20ul1MNaHCO₃，加170uldH₂O。

(2)或者可以在大管中一起配制，如有10个IP管，可将105ul20％SDS，210ul1MNaHCO₃，加1.785uldH2O混合.

(3)Input管加入200ulElutionbuffer后，放置室温第5步继续处理。

(4)每管抗体/agarose复合物中加100ulElutionbuffer，轻弹混匀。

(5)室温孵育15分钟。

(6)3000-5000g离心1分钟以沉淀agarose，将上清液收集到新的EP管中。

(7)重复步骤(4)到(6)，将洗脱液合并，总体积200ul。

5.蛋白/DNA去交联，获得游离DNA

(1)所有管(包括IPs和Inputs)加入8ul5MNaCl，65℃孵育4到5小时或过夜，以去除DNA-蛋白交联。完成后样本可储存在-20℃，隔天继续进行后续实验。

(2)所有管中加1ulRNaseA，37℃孵育30分钟。

(3)加4ul0.5MEDTA，8ul1MTris-HCl和1ul蛋白酶K，45℃孵育1-2小时。

6.用SpinColumns纯化DNA

(1)每个样品准备一个收集管和一个分离管。将SpinColumn放入收集管中。

(2)每200ulDNA样品加1mlBindReagentA，混匀。

所加BindReagentA的量为样品体积的5倍。

可见到沉淀，但不会影响本步骤。

(3)将600ul样品/BindReagentA混合物加到收集管的Spin滤器上。

(4)＞10,000g离心30秒。

(5)移开Spin滤器，弃去收集管中的液体，保留收集管。

如果步骤2中见沉淀，本步骤收集管底可见沉淀，但不会影响实验。

(6)将Spin滤器重新放入收集管。

(7)将步骤2中的样品/BindReagentA混合物600ul加入Spin滤器，重复步骤(4)到(6)。

(8)在收集管的Spin滤器中加入500ulWashReagentB。

(9)＞10,000g离心30秒。

(10)从收集管中移出Spin滤器，弃去收集管中的液体，保留收集管。

(11)将Spin滤器重新放入原收集管。

(12)＞10,000g离心30秒。

(13)弃去收集管和液体。

(14)将Spin滤器放入收集管中。

(15)直接在白色Spin滤膜的中央，加入50ulElutionBufferC。

(16)＞10,000g离心30秒。

(17)弃去Spin滤器。洗出液为纯化的DNA。可立即分析或-20℃冻存。

7.对照PCR

注意：本部分所有枪和枪尖要尽可能避免污染。

(1)在0.2mlPCR管上做好标记，放冰上。

使用本试剂盒，至少有4个DNA样品要用对照引物进行PCR分析，包括阳性和阴性对照抗体的IP物，Input和无DNA得空管作为有无DNA污染的对照管。

对照引物是针对特异性人GAPDH基因。针对其它物质，建议使用者根据经验设计特异的引物。

(2)每管加2ul样品，放回冰上。

(3)每个反应管中加入合适数量的试剂，根据表格1，依次加入水，Taq酶等。

推荐使用热启动Taq酶。如果没有使用热启动Taq酶，建议起始变性步骤后再加入Taq酶。

8.将上述Chip获得的所有与H3K4me3和/H3K27me3抗体结合的DNA样品进行高通量测序即为ChIP-Seq技术。

9.设计针对目的基因特异的引物，以上述Chip获得的所有与H3K4me3和/H3K27me3抗体结合的DNA样品作为底物，进行PCR反应，此为ChIP-PCR技术。

根据人类基因组数据库(Hg18)进行校正后得到的Flk1⁺MSC全基因组组蛋白K4和K27位点的甲基化修饰状态。我们选取了ESC(胚胎干细胞)、Flk1⁺MSC、HSC(造血干细胞)和HPC(造血祖细胞)等具有不同分化潜能的干细胞作为研究对象[21，22]，分析比较了这些干细胞中亚全能性基因和肝上皮、神经、造血、成脂及成骨等谱系分化相关基因的组蛋白甲基化修饰状态。

对亚全能性基因组蛋白甲基化修饰的分析发现，ESC中Oct4、Nanog、c-Myc、Sall4和Sox2均为H3K4me3活化修饰，Klf4为H3K4me3和H3K27me3共存的双价修饰；Flk1⁺MSC中c-Myc和Klf4为H3K4me3活化修饰，Sall4和Sox2为双价修饰，Oct4和Nanog基本无修饰信号；HSC和HPC中除了被认为与细胞周期关系密切的c-Myc为活化修饰外，其它亚全能基因均为H3K27me3抑制修饰或无修饰(图2A)。外胚层早期分化相关基因包括Hoxa1、Gbx2、Six1和Olig3；中内胚层早期分化相关基因T、Pgdfrα、Eomes、Tbx6和Mixl1，中胚层早期分化相关基因Kdr、Hand1、Gata4和Mesp2，限定性内胚层早期分化相关基因Onecut1、Prox1、Foxa1、Foxa2、Sox7、Sox17、Pdx1和Gsc等在ESC及Flk1⁺MSC中组蛋白甲基化修饰非常相似，大部分均为K4活化或双价修饰状态(图2B，2C，2D和2E)。目前文献报道与神经分化相关的基因主要有Brn2、Myt1L、Zic1、Neurog2、Hes1、Dlx1、Pax6、Tlx2、Msi1、Gfra1、Gfra3、Mapt、Nes和Olig2等22个转录因子[23-25]。ChlP-seq数据分析显示，在ESCs中有17个基因表现为H3K4me3修饰或双价修饰状态；在Flk1⁺MSC中的分析结果与ESC中相似；而且分析结果显示，与神经分化启动相关的三个基因Nes、Msil和Hesl，它们在ESC及Flk1⁺MSC中的组蛋白修饰状态均为H3K4me3活化状态；但在HSC和HPC中，这些基因一部分表现为H3K27me3抑制性修饰，其它的均未检测到修饰信号(图2F)。

接下来，我们又比较了上述干细胞中中胚层相关谱系成脂、成骨及造血分化相关基因的组蛋白修饰状态。结果显示，成脂性关键转录因子C/EBPα和PPARγ在Flk1⁺MSC中是H3K4me3活化修饰，而在ESC中是双价修饰；它们上游的调节因子ERK5、BMP2、GSK3α、GSK3β、C/EBPδ和C/EBPβ在ESC及Flk1⁺MSC中的组蛋白修饰相似；同样，在HSC和HPC中这些基因的组蛋白修饰亦为H3K27me3抑制状态或无修饰(图3A)。对成骨相关基因的组蛋白甲基化分析得到了类似的结果，即成骨关键转录因子RUNX2在Flk1⁺MSC中为H3K4me3活化修饰，而在ESC中为双价修饰；Runx2上游的调控因子BMP2、BMP4、Smad5、TAZ、MSX2、DLX5和Wnt5a等在两种细胞中的组蛋白甲基化修饰相似(图3B)。造血分化相关基因c-Myb、EGR1、FOG1(ZFPM1)、SCL(TAL1)、E47(TCF3)、Ikaros(IKZF1)、Gata1和BCL-6等组蛋白甲基化修饰分析显示，c-Myb、EGR1、E47和BCL-6在四种干/祖细胞中均为H3K4me3活化修饰状态；FOG1、SCL和Ikaros在ESC和Flk1⁺MSC中为双价修饰，而在HSC和HPC中为H3K4me3活化性修饰；Gata1在ESC和Flk1⁺MSC中显示为抑制性修饰或无修饰，在HSC和HPC中则为H3K4me3活化性修饰(图4A)。

进一步对内胚层肝上皮谱系相关基因的分析显示，Mxil1、Gsc、Sox17、Prox1、Hnf1β、Hnf6、E-cadhefin、Foxa1和Foxa2等在ESC中均为活化或双价修饰；其中Mxil1、Gsc、Sox17、Hnf6、Prox1和Foxa1在Flk1⁺MSC中亦为活化或双价修饰，与Foxa1作用相似的Foxa2为H3K27me3抑制修饰，上皮性标志分子E-cadherin的上游调控因子Snai1则为活化信号；在HSC中除Mxil1有较弱的活化性修饰信号外，其它肝上皮分化相关基因组蛋白均为H3K27me3抑制信号或无修饰；而在HPC中，所有肝性基因均为H3K27me3抑制信号或无修饰(图4B)。

全基因组组蛋白修饰的分析比较显示，ESCs中六个基因有五个是活化修饰，一个为双价修饰，向各胚层分化的关键转录因子的组蛋白甲基化状态总体上以H3K4me3活化或双价修饰为主；Flk1⁺MSCs中六个基因有两个是活化修饰，四个是双价修饰。HSCs中几乎所有造血分化相关基因均以活化修饰为主外，其它谱系方向相关基因则以H3K27me3或无修饰信号为主。HPCs中其它谱系相关基因均为H3K27me3抑制修饰或无修饰信号，而造血分化相关基因均为H3K4me3活化修饰，而且其活化信号较HSC强；造血谱系定向分化相关因子Gata1在ESCs、Flk1⁺MSCs和HSCs中显示为抑制或无修饰，但在造血祖细胞中为H3K4me3活化修饰。推测它是在多能干细胞向造血分化到造血祖细胞阶段被活化修饰，以利于造血谱系进一步的定向分化。整体上看，从ESC、Flk1⁺MSC、HSC到HPC，造血分化相关基因组蛋白甲基化修饰状态基本是一个H3K27me3抑制性修饰逐渐消失、H3K4me3活化性修饰信号逐渐增强的过程，而其它非造血相关谱系则表现为活化性修饰减弱而抑制性修饰信号(包括H3K27me3及无修饰，这两种情况都导致基因沉默)增强。先前已有大量的研究证明，ESCs具有向所有胚层所有谱系分化的全能性，而本发明的实验证明，Flk1⁺MSCs具有向肝上皮、神经、造血、血管内皮、成脂和成骨等多胚层多谱系分化的亚全能性。HSCs只有向造血相关谱系分化的能力，HPCs是较HSCs更进一步定向与造血谱系分化的细胞，HSC和HPC中各谱系分化相关基因不同组蛋白修饰状态的分析结果及这些干细胞不同的分化潜能提示我们：随着多能性等级的下降，组蛋白甲基化修饰状态的改变，干细胞逐渐丢失其分化的全能性(ESC)转变成具有亚全能性(Flk1⁺MSCs)或仅具有单一胚层(HSC)甚至单一谱系分化的能力(祖细胞)的细胞。分化相关基因组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰状态与干细胞的分化潜能密切相关，可作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签。

实施例3谱系分化相关基因组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰状态的分析可用来预测干细胞分化潜能

为了进一步验证分化相关基因组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰状态与干细胞的分化潜能的相关性，我们利用ChIP-PCR进一步对脂肪来源MSC(aMSC)和骨髓来源MSC(bMSC)的成脂和成骨谱系分化相关基因的组蛋白修饰进行了分析，并与它们向上述两种谱系分化的能力进行了比较。组蛋白甲基化分析的结果显示，aMSC中成骨性基因RUNX2、BMP2、Smad5、TAZ、Wnt5a和BMPR2为活化修饰，MSX2和BMP4为双价修饰；bMSC中除了MSX2为H3K4me3占优势的双价修饰外，其它均为活化修饰(图5A)。aMSC中成脂性基因除C/EBPα为双价修饰外，ERK5、GSK3α、GSK3β、C/EBPδ、PPARγ和C/EBPβ均为活化性修饰；而bMSC中则以双价修饰为主(图5B)。同样诱导条件下，对aMSC和bMSC向成骨和成脂方向分化的比较显示，成骨诱导第8天，aMSC和bMSC分化比率分别为50％和65％，标志基因ALP和OPN表达有统计学差异；成脂诱导第8天，aMSC和bMSC分化比率分别为80％和27％，标志基因LPL和AP2表达有显著差异(图5C)。

由此可见，尽管两种不同来源的MSC中成脂和成骨相关基因均为H3K4me3或双价修饰，但aMSC中成脂相关基因H3K4me3修饰所占比率明显高于bMSC，这与bMSC比aMSC难于向成脂谱系分化的结果相吻合；bMSC中成骨相关基因组蛋白甲基化活化修饰与aMSC差别不大，这与观察到bMSC和aMSC向成骨谱系分化能力相似的结果一致。对不同来源MSC分化相关基因组蛋白修饰分析及分化能力的比较结果进一步验证了谱系分化相关基因组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰状态的分析作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签的可行性。

实施例4分化阶段相关基因组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰状态的动态分析可用来预测细胞的分化程度

验证了组蛋白甲基化分析可作为预测干细胞分化潜能的表观遗传修饰标签之后，又利用ChIP-PCR对Flk1⁺MSCs分化前后相关转录因子组蛋白甲基化修饰的动态变化进行了分析，结果显示，Flk1⁺MSCs向神经谱系分化过程中，关键转录因子Pax6和Neurog2的组蛋白修饰状态从H3K27me3抑制态转变为双价修饰，Neurod2从H3K27me3抑制态变为活化态，Gfra2从双价态变为活化态，Tlx2和Msi1则从双价的K27修饰占优势变为K4占优势状态，Gfra1则从无修饰状态变为双价态；Neurog2、Pax6、Tlx2、Neurod2和Msi1的表达明显上调。Flk1⁺MSCs向成脂谱系分化过程中，伴随早期成脂性转录因子C/EBPβ和C/EBPδ表达短暂上调，它们的组蛋白修饰状态从H3K4me3活化态变成双价态，调节因子GSK3β表达量升高后维持在较高水平，其组蛋白修饰亦维持H3K4me3持续活化态；这些基因的下游效应分子PPARγ保持持续活化态，而C/EBPα则从双价态变为激活态，随着PPARγ和C/EBPα表达持续升高，成脂分化顺利进行，标志基因LPL和AP2表达明显增加。Flk1⁺MSCs向成骨谱系分化过程中，伴随早期调控基因组蛋白修饰从H3K4me3到双价修饰的变化，BMP2、TAZ、MSX2、Smad5和BMPR2亦经历了从表达上调到诱导4到6天表达达峰值，然后表达下调的动态过程，这种动态表达变化即确保了成骨分化的启动又有利用成骨细胞功能的进一步成熟；成骨关键性基因RUNX2维持H3K4me3活化态，表达量持续升高，进一步促进了其下游靶基因OSX及成骨标志基因ALP和OPN的表达。有趣的是，我们发现Flk1⁺MSCs走向成脂分化时，成骨分化相关转录因子RUNX2、TAZ、MSX2、Smad5和BMPR2的组蛋白修饰从H3K4me3活化态变为双价修饰，MSX2则从双价修饰变为抑制态，这些基因的表达均下调。而当Flk1⁺MSCs走向成骨分化时，成脂分化的关键转录因子C/EBPβ、C/EBPδ、GSK3β和PPARγ等的组蛋白修饰从H3K4me3活化态变成双价态，C/EBPα则从双价态变为H3K27me3抑制态，这些基因的表达亦降低。而在Flk1⁺MSCs向成指或成骨谱系分化时，神经分化相关的转录因子MSI1、TLX2和NES等的组蛋白修饰则进一步走向抑制。终末分化的成脂或成骨细胞中该谱系分化相关的转录因子及标志基因的组蛋白修饰以H3K4me3为主，而其它谱系则表现为H3K27me3。这些结果提示，Flk1⁺MSCs向特定谱系分化开始前，某些未知机制使相关基因的组蛋白修饰状态发生改变，以利于该谱系分化所需基因的活化表达，同时抑制或关闭其他谱系相关因子的表达，从而使特定谱系分化得以顺利进行。

由上述组蛋白修饰的动态分析可见，Flk1⁺MSCs向神经、成脂及成骨谱系分化后，该谱系相关转录因子组蛋白修饰表现为进一步活化(即从抑制或无修饰到双价、从K27占优势的双价态到K4占优势的双价态、从双价到活化态或保持持续活化等方式)，各种方式的进一步活化的组蛋白修饰变化为特定谱系分化相关基因的活化或表达上调提供了可能性。不仅如此，当Flk1⁺MSCs向特定谱系分化启动时，该谱系分化相关基因组蛋白修饰进一步转向活化的同时，其它谱系分化相关转录因子的组蛋白则进一步转向抑制性修饰为主，这样就很好的确保了干细胞向特定谱系分化的专一性及分化效率。总之，在细胞向特定谱系分化过程中，组蛋白甲基化修饰亦发生着动态变化，以满足开启不同分化阶段性事件相关基因活化的需要。对未知分化程度的细胞进行分化阶段相关基因的组蛋白甲基化修饰状态进行分析就可评估此细胞所处的分化阶段。因此，组蛋白甲基化修饰状态的分析可作为鉴定细胞分化阶段或成熟度的辅助指标。

讨论：

上述的研究结果表明，不同级别干/祖细胞细胞中各谱系分化关键基因的不同组蛋白修饰状态与这些细胞所具有的分化潜能密切相关。对未知分化潜能的干/祖细胞中组蛋白甲基化的分析可作为预测此类细胞分化潜能。而且，在特定谱系分化启动前，在某些未知机制的调控下，组蛋白修饰状态会发生重新布局，以利用特定谱系分化相关基因的活化及保持其它谱系分化相关基因不被激活，从而实现了定向分化的特异性。因此，对分化阶段性相关基因的组蛋白甲基化修饰的分析还可以用来鉴定细胞所处的分化阶段及成熟度。因此我们提出，分化相关基因组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰状态与干细胞的分化能力及分化阶段密切相关，可以作为预测不同来源不同级别干细胞分化潜能及细胞分化阶段和成熟度的表观遗传学标签。这一发现为临床上更好的筛选和鉴定各种组织器官再生修复治疗所需种子细胞提供了新的标准。这种组蛋白甲基化标签比较容易得到：首先，利用ChIP-seq技术获得未知分化潜能干细胞的全基因组组蛋白甲基化修饰谱，再根据此干细胞应用的目的有针对性的选择分析某一/些谱系分化相关基因的组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰状态，进一步应用ChIP-PCR技术对ChIP-seq结果进行验证，即可对此干细胞是否具有向该谱系分化的能力作出预测。另外还可通过目前已经获得人类胚胎干细胞、脂肪来源间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞及成熟T细胞等不断丰富的网络数据库资源进行比对分析，按照分化能力的差别，将未知分化能力的干细胞在以具有分化全能性的胚胎干细胞为塔尖的干细胞等级金字塔上进行定位。ChIP-seq技术获得全基因组组蛋白甲基化修饰谱后就可简单快捷的预测此干细胞在适合的外界条件下或体内微环境下是否具有向目的谱系分化的潜能。同样，利用ChIP-seq或ChIP-PCR技术对干细胞在某一谱系分化过程中相关转录因子及阶段性分化标志基因的组蛋白甲基化修饰状态进行分析，结合这些转录因子及标志基因的实时定量PCR，就可很好的对干细胞所处的具体分化阶段进行鉴定(注：因组蛋白甲基化修饰的变化先与基因表达改变，当某一基因的组蛋白甲基化状态变为更加活化，包括双价修饰变成H3K4me3活化修饰或H3K27me3抑制修饰变成双价修饰，预示着这个基因将有进一步被活化的可能，而该基因最终表达是否上调或上调程度受控于其上游的活化因子、细胞因子或miRNA等的调控)。同时，当干细胞向目的谱系分化时，对其它谱系相关基因的组蛋白修饰状态的变化分析还可鉴定干细胞是否专一性的向目的基因分化。

因此，利用全基因组ChIP-seq技术和ChIP-PCR对相关基因组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰状态进行分析，联合相应的基因芯片结果，针对不同谱系关键转录因子制定组合性表观遗传学检测标签，结合基因及非编码RNA等标志物的联合应用，有望成为临床上各种组织器官再生修复治疗所需种子细胞的筛选及分化阶段和分化专一性鉴定的金标准。

参考文献

[1]TakahashiK.YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell，2006，126(4)：663-676.

[2]TakahashiK，TanabeK，OhnukiM，etal.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefnedfactors.Cell，2007，13l(5)：86l-872.

[3]BrazeltonTR，RossiFM，KeshetGI，BlauHM.Frommarrowtobrain：expressionofneuronalphenotypesinadultmice.Science，2000，290(5497)：1775-1779

[4]JiangY，jahagirdarBN，ReinardtRL，etal.Pluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrow.Nature，200，418(6893)：41-49.

[5]JiangY.HendersonD.BlackstadM.etal.Neuroectodermaldifferentiationfrommosusemultipotentadultprogenitorcells.ProcNatlAcadSciUSA，2003，100(supp1)：11854-11860.

[6]Boggs，B.A.，Cheung，P.，Heard，E.，Spector，D.L.，Chinault，A.C.，andAllis，C.D.DifferentiallymethylatedformsofhistoneH3showuniqueassociationpatternsWithinactivehumanXchromosomes.Nat.Genet.2002，30：73-76.

[7]Peters，A.H.，Mermoud，J.E.，O’Carroll，D.，Pagani，M.，Schweizer，D.，Brockdorff，N.，andJenuwein，T.HistoneH3lysine9methylationisanepigeneticimprintoffacultativeheterochromatin.Nat.Genet.2002，30：77-80.

[8]Plath，K.，Fang，J.，Mlynarczyk-Evans，S.K.，Cao，R.，Worringer，K.A.，Wang，H.，delaCruz，C.C.，Otte，A.P.，Panning，B.，andZhang，Y.RoleofhistoneH3lysine27methylationinXinactivation.Science.2003，300：131-135.

[9]Silva，J.，Mak，W.，Zvetkova，I.，Appanah，R.，Nesterova，T.B.，Webster，Z.，Peters，A.H.，Jenuwein，T.，Otte，A.P.，andBrockdorff，N.Establishmentofhistoneh3methylationontheinactiveXchromosomerequirestransientrecruitmentofEed-Enx1polycombgroupcomplexes.Dev.Cell.2003，4：481-495.

[10]Barski，A.，etal.，High-resolutionprofilingofhistonemethylationsinthehumangenome.Cell，2007.129(4)：823-37

[11]Martin，C.，andZhang，Y..Thediversefunctionsofhistonelysinemethylation.Nat.Rev.Mol.CellBiol.2005，6：838-849.

[12]Schneider，R.，Bannister，A.J.，Myers，F.A.，Thorne，A.W.，Crane-Robinson，C.，andKouzarides，T.HistoneH3lysine4methylationpattemsinhighereukaryoticgenes.Nat.CellBiol.2003，6：73-77.

[13]Schubeler，D.，MacAlpine，D.M.，Scalzo，D.，Wirbelauer，C.，Kooperberg，C.，vanLeeuwen，F.，Gottschling，D.E.，O’Neill，L.P.，Turner，B.M.，Delrow，J.，etal.(2004).Thehistonemodificationpatternofactivegenesrevealedthroughgenome-widechromatinanalysisofahighereukaryote.2004，GenesDev.18：1263-1271.

[14]Bemstein，B.E.，etal.，Abivalentchromatinstructuremarkskeydevelopmentalgenesinembryonicstemcells.Cell，2006.125(2)：3l5-26.

[15]XiaoDongZhao，XuHan，JoonLinChew，JunLiu，KuoPingChiu，AndreChoo，YuriyL.Orlov，Wing-KinSung，AtifShahab，VladimirA.Kuznetsov，GuillaumeBourque，SteveOh，YijunRuan，Huck-HuiNg，andChia-LinWei.Whole-GenomeMappingofHistoneH3Lys4and27TrimethylationsRevealsDistinctGenomicCompartmentsinHumanEmbryonicStemCells.Cellstemcell.2007，1：286-298.

[16]Pan，G.，etal.，Whole-genomeanalysisofhistoneH3lysine4andlysine27methylationinhumanembryonicstemcells.CellStemCell，2007.1(3)：299-312.

[17]Mikkelsen，T.S.，etal.，Genome-widemapsofchromatinstateinpluripotentandlineage-committedcells.Nature，2007.448(7153)：553-560.

[18]Newport，J.&Kirschner，M.AmajordevelopmentaltransitioninearlyXenopusembryos：II.Controloftheonsetoftranscription.Cell.1982，30：687-696.

[19]Schier，A.F.Thematernal-zygotietransition：deathandbirthofRNAs.Science.2007，316：406-407.

[20]Tadros，W.&Lipshitz，H.D.Thematernal-to-zygotictransition：aplayintwoacts.Development.2009，136：3033-3042.

[21]NadineL.Vastenhouw，YongZhang，IanG.Woods，FarhadImam，AvivRegev，X.ShirleyLiu，JohnRinn&AlexanderF.Schier.Chromatinsignatureofembryonicpluripotencyisestablishedduringgenomeactivation.2010，464：922-925.

[22]Roh，T.Y.，Cuddapah，S.，Cui，K.，andZhao，K.ThegenomiclandscapeofhistonemodificationsinhumanTcells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006，103，15782-l5787.

[23]Barski，A.andK.Zhao，GenomiclocationanalysisbyChIp-Seq.JCellBiochem，2009.107(1)：11-8.

[24]Park，P.J.，ChIP-seq：advantagesandchallengesofamaturingtechnology.NatRevGenet，2009.10(10)：669-680.

Claims (8)

1.一种亚全能干细胞产品，其中：

所述亚全能干细胞产品具有上皮样形态、Flk1⁺表型、无成瘤性、并且在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织或细胞的能力，

所述亚全能干细胞中c-Myc、Eomes、Foxa1、Foxa2、Gata4、Gbx2、Gsc、Hand1、Hoxa1、Kdr、Klf4、Mesp2、Mixl1、Olig3、Onecut1、Pdx1、Pdgfrα、Prox1、Sall4、Six1、Sox2、Sox7、Sox17、T和Tbx6基因的甲基化修饰状态是：H3K4me3修饰；或者是H3K4me3和H3K27me3双价修饰。

2.一种产生权利要求1所述的亚全能干细胞产品的方法，包括以下步骤：

a)从组织中分离间充质干细胞，

b)以1个细胞/孔的密度将所述间充质干细胞接种于96孔板中，长出单克隆后，将所述单克隆进一步扩增，

c)将扩增后的细胞作为种子细胞，4-6h细胞完全贴壁后加入1号诱导培养基诱导1天后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4天，获得所述的亚全能干细胞，

所述的亚全能干细胞是Flk1阳性的并且具有上皮样形态，

所述1号诱导培养基包含：1-100ng/ml活化素A、1-500ng/mlWnt3a、0.1-20％FBS和HG-DMEM，

所述2号诱导培养基包含：1-100ng/ml活化素A、1-500μMRA、0.1-50％FBS和HG-DMEM，

将所述亚全能干细胞进行RT-PCR检测、免疫细胞荧光染色检测或WesternBlot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括Foxa2、Sox17、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Sox1、Pax6，所述WesternBlot检测的指标包括Foxa2、Sox17、T、Gsc、Epcam、Vimentin，

所述亚全能干细胞中以下标志的表达上调：Foxa2、Sox17、Gsc、T、Eomes、Sox1和Pax6。

3.根据权利要求2所述的方法，其中

所述1号诱导培养基包含：5-50ng/ml活化素A、50-300ng/mlWnt3a、2-10％FBS和HG-DMEM；

所述2号诱导培养基包含：5-50ng/ml活化素A、20-400μMRA、0.1-50％FBS和HG-DMEM。

4.根据权利要求2所述的方法，其中

所述1号诱导培养基包含：10-30ng/ml活化素A、100-300ng/mlWnt3a、5-8％FBS和HG-DMEM；

所述2号诱导培养基包含：10-30ng/ml活化素A、50-200μMRA、0.1-50％FBS和HG-DMEM。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述间充质干细胞是aMSC或bMSC。

6.以下基因的组蛋白修饰状态作为表观遗传修饰标签在预测成体干细胞分化潜能中的用途，其中所述基因包括：

c-Myc、Eomes、Foxa1、Foxa2、Gata4、Gbx2、Gsc、Hand1、Hoxa1、Kdr、Klf4、Mesp2、Mixl1、Olig3、Onecut1、Pdx1、Pdgfrα、Prox1、Sall4、Six1、Sox2、Sox7、Sox17、T和Tbx6，

所述基因的甲基化修饰状态是：H3K4me3修饰、或者H3K4me3和H3K27me3双价修饰，

通过检测所述基因的组蛋白甲基化修饰状态来预测所述成体干细胞的分化潜能，

所述基因的组蛋白甲基化修饰是H3K4me3修饰或者H3K4me3和H3K27me3双价修饰指示所述成体干细胞具有向三胚层分化的能力。

7.根据权利要求6所述的用途，其中

所述H3K4me3修饰表示组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰，

所述H3K4me3和H3K27me3双价修饰表示组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化修饰与组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰并存。

8.根据权利要求6所述的用途，其中使用ChIP-seq或ChIP-PCR进行所述检测。