KR101970642B1 - 줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배지조성물 및 배양방법에 관한 것으로서, 효능을 강화시킨 기능성을 가진 줄기세포 배양용 배지조성물 및 이를 이용한 줄기세포 배양방법으로 유도체(derivative)인 AA2G를 포함한 배양액을 통하여 배아줄기세포의 전분화능/만능성 강화와 역분화 줄기세포 효율 증대를 일차적으로 검증하고, 이를 다양한 성체줄기세포 기능성 강화 배지 개발로 활용하고자 하는 데에 목적이 있다.

Description

줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법{A medium composition for culturing stem cells and a method of culturing stem cells using the same}

배지조성물 및 배양방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 줄기세포 배양용 배지조성물 및 이를 이용한 줄기세포 배양방법에 관한 것이다.

줄기세포는 인체를 구성하는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는 세포로 미분화된 세포를 계속 재생할 수 있는 자가 재생능력 (self-renewal)과 특정 세포로 분화(differentiation)할 수 있는 능력을 동시에 가지고 있는 것이 가장 큰 특징이라 할 수 있다.

상기 줄기세포는 분류 기준에 따라서 다양한 세포군들이 존재하는데, 크게 조직 기원에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 나뉜다. 상기의 배아줄기세포는 우리 인체를 구성하는 260 여 종의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능/만능성(pluripotency)를 가지고 있어서 재생의료(regenerative medicine)에서 가장 중요한 세포로 인식되고 있으며, 전 세계적으로 만능성 강화 및 조절에 관한 핵심 원천 기술 개발 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다(Yoon, B.S. and You, S., J Korean Med Assoc., 54(5):502-510, 2011).

상기 배아줄기세포는 세포학적 특징으로 둥근 돔 구조(round dome)의 군집체(colony)를 형성하면서 배양되고 미분화된 세포일수록 보다 밀도가 높은 조밀하고 깨끗한 경계선을 가진 군집체를 형성한다. 또한, 미분화된 배아 줄기세포 군집체는 알칼라인 포스파타제(AP) 염색이 되며, 따라서 AP 염색은 전분화능/만능성 줄기세포 판별의 주요지표로 사용되고 있다. 또한, 상기 배아줄기세포는 만능성을 유지하기 위하여 특이적인 전자인자(transcription factors)를 발현하고 있으며, OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, CMYC, REX1, TFCP21L 등이 이에 속한다. 이러한 전자 인자들의 중요성은 이들을 과다 발현하여 분화된 세포를 배아줄기세포와 유사한 세포로 역분화 시키는 역분화 줄기세포 확립 기술로 명백하게 증명되어 있다. 특히, 상기 배아줄기세포는 특이적 후성유전체학적(epigenetic) 특징을 나타내고 있는데, 분화를 조절하는 Hox 도메인(domain) 전사인자들의 조절 부위에 두 가지 서로 다른 히스톤 단백질 변형을 동시에 유지하는 이가성 도메인(bivalent domain)이 있으며, DNA 메틸화(DNA methylation) 역시 최소 수준으로 유지되고 있다. 상기 기술한 배아줄기세포 특이적 후성유전체 특성(epigenetic signature)은 배아 줄기세포의 전분화능/만능성 유지와 신속한 계통 분화 결정 및 결정된 세포 운명을 안정적으로 유지하는 분자학적 기전의 근간을 이루며, 이를 통화여 줄기세포의 자가 재생능력과 분화능을 조절하게 된다.

최근 연구를 통하여, 비타민 C(vitamine C, VitC)을 배양액에 처리 할 경우, DNA 탈메틸화(DNA demethayltion)을 촉매하는 TET 효소들을 활성화여 DNA 메틸화를 최소 수준으로 유지하며, 이를 통하여 배아 줄기세포의 전분화능/만능성 강화 및 역분화 줄기세포 확립 효율 증대가 가능함이 입증되었다(Rahul, M. K. and Yi, Z., Nature, 502: 472-479, 2013). 또한, 미국등록특허 US7442548에서는 비타민 및 아미노산을 포함하는 배지에서 인간 배아줄기세포의 배양이 생산성이 높음을 개시하고 있다다. 그러나, VitC는 고농도에서 세포사멸(cell death)을 유도할 수 있으며 쉽게 산화되어 그 안정성(stability)이 저조한 한계점을 가지고 있다.

최근 연구에 의하면, 비타민 C를 배양액에 처리할 경우, 역분화 과정 중에 발생하는 p53 단백질 발현 증가에 의한 세포 노화를 억제하여, 마우스와 인간 세포로부터 역분화 줄기세포 확립 기술의 효율을 증가시킴이 입증되었다(Miguel Angel Esteban, Cell Stem Cell, 71-79, 2010)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 줄기세포의 분화능/만능성을 강화시키고 줄기세포의 수율 증대를 위한 보다 효율적인 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나, 상기 목적에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, 이하, 'AA2G'로 약칭함)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 배아줄기세포를 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G)가 포함된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포의 만능성 강화, 분화능 유지 및 증식능력 강화 배양방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제가 제공된다.

도 1은 마우스 배아줄기세포(mESC, 위)와 인간 배아줄기세포와 유사한 특성을 가진 암세포주인 인간 기형종암 세포주(teratocarcinoam, NTERA2, 아래)를 동일한 농도의 비타민 C와 AA2G를 포함한 배지에서 배양한 후 세포 증식능을 MTT 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 서로 다른 농도의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC의 세포 형태학적 특성을 나타낸 사진들로, 위상차 현미경으로 촬영한 사진(상단 및 중단)과 이들 세포들에 대하여 알칼라인 포스파타제(AP) 염색한 결과를 촬영한 사진(하단)이다.
도 3은 AA2G 포함된 배지에서 배양한 mESC에서 전분화능 관련 단백질의 발현량을 면역블롯팅한 결과를 나타낸 결과들로, 도 3A는 OCT4, NANOG, SOX2, TFCP2L1, Dnmt31, β-actin 전사 단백질들의 발현량을 각각 보여주는 사진이고, 도 3B는 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자들 mRNA의 발현량을 qPCR방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프로 핵심 인자(좌)인 Oct4, Sox2, cMyc 및 신규 상태 인자(우)인 Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt31을 각기 보여준다,
도 4는 DNA 탈메틸화 표식인자 5hmC 수준의 분석결과들로써 도 4A는 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC의 형광도로 DNA 탈메틸화 표식인자인 5 hydroxy methyl Cytosine(5hmC)를 추가한 사진이고, 도 4B는 닷 블랏 분석 사진이고, 도 4C는 면역침강(IP)분석하여 5 mC와 비교한 IP-qPCR 그래프이고, 도 4D는 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 5 hmC를 풍부하게 한 유전자 발현 정도를 나타내는 그래프이고, 도 4E는 Tet DNA 탈메틸화 효소 및 Dnmts의 발현수준에 관한 AA2G의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 재프로그램하는 동안 AA2G 처리한 iPSC 군락의 증가한 수를 관찰한 결과로, 도 5A는 SOKM 및 AA2G와 대조군을 비교한 사진이고, 도 5B는 AP 염색한 군락락을 계수한 그래프이고, 도 5C는 충분히 재프로그램한 GFP⁺ iPSC 군락 형광사진이고, 도 5D는 GFP⁺ iPSC의 군락을 계수한 그래프이다.
도 6은 MSC의 증식에 관한 AA2G의 효과를 나타낸 것으로 도 6A는 AA2G 및 비타민 C의 상대적인 증식을 5일 동안 관찰한 그래프이고, 도 6B는 서로 다른 농도의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC의 세포 형태학적 특성을 나타낸 사진이다.
도 7은 MSC의 표면단백질 표현형에 관한 AA2G의 영향을 나타낸 것으로 도 7A는 MSC 및 혈액마커들의 FACSC 유세포 분석한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7B는 Alizarin Red 염색을 하여 골 분화정도를 관찰한 사진이고, 도 7C는 Alcian Blue을 염색을 하여 연골세포 분화 정도를 관찰한 사진이다,
도 8은 AA2G의 처리로 MSC의 군락 형성 활성을 관찰한 결과들로써, 도 8A는 군락 사진이고 도 8B는 군락의 변화(CFU-F)를 나타낸 그래프이다.
도 9는 AG 보충 배지에서 유지한 MSC의 이동 강화를 나타낸 결과들로 도 9A는이동 정도를 나타낸 사진이고, 도 9B는 폴드 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 PDGF 신호활성을 강화하는 AA2G 처리의 영향을 고찰한 결과로 도 10A는 사이토그램 분석 결과 그래프이고 도 10B는 웨스턴 블랏 결과 사진이다.
도 11은 마우스의 알러지성 천식 모델에서 MSC의 치료효과를 개선하는 AA2G의 영향을 나타낸 조직형상 사진이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 용어 "줄기세포(stem cell)"란 특정 세포로 분화할 수 있는 미분화된 생물학적 세포로서 미분화된 상태로 증식이 될 수 있는 세포를 의미한다. 이들 줄기세포는 다양한 세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotency)을 가지고 있는 것을 특징으로 하며, 개체를 형성할 수 있는 전능성(totipotency)을 가진 배아 유래의 "배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)"와 성체로부터 유래한 "성체줄기세포(adult stem cells, ASC)"로 구분할 수 있다. 상기 "배아줄기세포"는 난자와 정자가 결합하여 수정란이 된 후, 하나의 세포로 시작한 수정란은 세포분열을 통해 여러 개의 세포로 이루어진 배반포가 되며, 상기 배반포의 안쪽에는 형성된 내세포괴로부터 유래한 세포들로서, 혈액, 뼈, 피부, 간 등 한 개체에 있는 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 아울러, 상기 "성체줄기세포"는 발생 이후 죽은 세포를 대체하고 손상된 조직을 재생하기 위해 체세포 분열에 의해 증폭이 가능한 미분화된 세포를 의히하며, 여기에는 신경줄기세포, 조혈모 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 내피 줄기세포 등이 존재한다. 이들 성체줄기세포는 상기 배아 줄기세포보다는 분화능이 한정적이긴 하나, 기원과 다른 계통의 세포로 분화할 수도 있으며, 이를 교차분화(trasndifferentiation) 또는 가소성(plasticity)라고 한다. 성체 줄기세포는 분화가 안정적이어서 암세포 가능성이 없기 때문에, 이미 임상적 적용이 가능한 단계까지 왔으며, 배아줄기세포와는 다르게 수정란에 파괴가 없어서 윤리적으로도 문제가 되지 않는 반면, 얻을 수 있는 줄기세포수가 적고, 배양이 어렵다는 단점을 가지고 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "역분화 줄기세포(dedifferentiation stem cell)"는 이미 분화된 체세포에 외부에서 인위적인 자극을 주어 우리 몸을 이루 는 모든 기관의 세포로 분화 가능한 배아줄기세포와 비슷한 만능성(pluripotency)을 획득한 세포를 의미하며, 이런 취지로 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPCS)라고도 불리운다. 상기 iPSC의 핵심기술은 체세포에 역분화 유전자(Oct4, Sox2, klf4, C-myc, Nanog, 및 Lin28)를 도입하여 세포의 생물학적 특성을 배아줄기세포와 유사하게 만드는데 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "만능성 줄기세포"는 분화 능력에 따라 한 종류의 세포로 분화할 수 있는 단분화능(unipotency), 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다분화능(multipotency), 그리고 모든 조직세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotency) 줄기세포 등으로 나눌 수 있으며, 그 중 대표적인 만능성 줄기세포를 의미하며, 상기 만능성 줄기세포에는 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)와 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)가 있으며 이는 미분화 상태를 유지하면서 무한대로 자가 증식할 수 있는 능력과 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 분화능력을 가지고 있기 때문에 재생 의학적 활용에 있어 그 가치가 높이 인정되고 있다. 또한 상기 유도만능줄기세포가 배아줄기세포의 문제점인 난자 사용의 윤리적 문제 등을 해결하는 최고의 대안으로 떠오름에 따라 만능성 줄기세포 연구의 중요성에 대한 인식이 고조되었다.

본 문서에서 사용되는 용어 "기형종 암세포"는 기형종, 테라토마(teratoma)로 다른 형태로 분화가 가능한(pluripotent) 생식 세포에 의해서 발생하는 종양세포를 의미하며, 보통 남자의 정소, 여자의 난소, 아이의 천골에서 발생한다. 상기 기형종은 주변 세포와 관련없는 조직으로 형성되는 경우가 많은데, 예를 들어 난소에서 발생한 기형종은 체모와 치아로 발달하는 것으로 알려져 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "DNA 메틸화(DNA methylation)"는 고등 생물의 발달에 매우 중요한 생화학적 과정으로 한 메틸기를 시토신의 피리미딘 고리 5번째 위치에 추가하거나 아데닌의 퓨린 고리의 숫자 6 질소에 추가하는 것을 포함하는 것을 의미한다. 상기 변화는 세포 분화를 통해서 유전될 수 있다. 상기 DNA 메틸화는 일반적인 유기체적 진화와 세포적 변이를 위해 결정적 부분이며 안정적으로 세포에서 유전자 표현형을 변화시킴으로써 접합자 생성 과정에서 사라지고, 발현 과정에서 차후의 세포 분화를 통해서 다시 생성된다. 그러나, 가장 최신의 연구는 접합자에서 메틸 그룹이 사라지는 것보다는 수산기화(hydroxylation)가 되는 것을 보인다. 몇몇 유전자 표현형을 제어하는 메틸화 변화들은 유전될 수 있고 후성 유전적 제어라고 불린다. 또한, 상기 DNA 메틸화는 또한 거의 모든 종류의 암의 발현에 매우 중요한 역할을 하며 시토신의 5번 위치에서의 DNA 메틸화는 유전형을 줄이는 특별한 효과를 가지고 있고, 실험된 모든 척추동물에서 발견되어 왔다. 몇몇 성인 체조직(somatic tissue)에서, DNA 메틸화는 전형적으로 CpG 디뉴클레오티드 상태에서 나타나고, non-CpG 메틸화는 태아 줄기 세포에서 주로 나타난다. 아울러, 상기 DNA 메틸화는 박테리아에서 원시적인 면역시스템으로도 쓰이며 자신의 게놈은 메틸화시켜서 제한효소의 의한 인식을 막고 외부에서 침입한 메틸화되지 않은 파지의 DNA는 인식되어 분해된다. 상기 DNA 메틸화의 타겟이 되는 뉴클레오타이드는 싸이토신이며, CpG 디뉴클레오타이드의 싸이토신만이 DNA 메틸화의 타겟이 된다. 또한, DNA 메틸화를 매개하는 효소는 Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b이다. 이 중 Dnmt3a와 3b는 신생메틸화(de novo methylation)을 담당하는 효소이며, Dnmt1은 보존성 메틸화(maintenance methylation)를 담당하는 효소이다. 메틸기의 공여자는 S-adenosyl methionine(SAM)이며, SAM으로부터 메틸기를 받아 싸이토신의 5번 탄소위치에 메틸화를 일으켜 5-메틸 싸이토신을 만든다. 신생 메틸화란 메틸화가 없는 CpG 부위의 싸이토신에 새로이 메틸화를 일으켜 메틸 싸이토신을 만드는 것을 의미한다. DNA 복제시 새로이 형성된 신생 DNA 가닥내의 CpG site들은 메틸화되어 있지 않는데, 기존가닥의 CpG 부위에 메틸화가 있다면, 이에 상응하는 신생가닥의 CpG 부위에 메틸화를 일으키는 것을 보존성 메틸화라고 부른다.

본 문서에서 사용되는 용어 "Tet 효소"는 5mC(5-methylcytosine)을 5hmC(5-hydroxymethylcytosine)으로 전환시킴으로써 DNA 메틸화를 조절하는 효소를 의미한다. 또한 비타민 C는 상기 Tet 계열 효소의 조효소로 작용하며, 비타민 C가 결여된 상황에서 배양이 가능한 생쥐 배아 줄기세포를 이용한 실험을 통해서 Tet 활성에 직접적인 영향을 주는 조절인자라는 사실을 확인할 수 있었다. 비타민 C를 세포 배양액에 첨가하게 되면, 5hmC의 함량이 증가하게 되며, 다양한 유전자 프로모터의 탈메틸화가 일어나게 되었다. DNA 메틸화 및 유전자 발현 패턴의 리모델링은 초기 배아의 내부 세포 집단에서 일어나는 DNA 메틸화와 유사하였다(Kathryn, B., et al., Nature Letter, 500: 222-226, 2013).

본 문서에서 사용되는 용어 "후성유전학적(epigenetics) 특성"은 DNA의 염기서열이 변화하지 않는 상태에서 이루어지는 유전자 발현의 조절인 후생유전적 유전자 발현 조절을 의미한다. 상기 유전자 발현을 매개하는 분자적 수준의 이해는 아직 완벽하지 않지만, 일반적으로 CpG 염기서열 가운데 시토신 염기에 특이적으로 일어나는 DNA 메틸화와 히스톤의 변형에 의해 조절되는 크로마틴 구조의 변화에 두 가지의 기전이 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 후성유전체는 하나의 수정란에서 출발한 개체가 발생 과정을 거쳐 다양한 기능을 갖는 세포로 구성되는 세포 분화와 관련되어 있으며, 후생유전적 유전자 발현 조절을 세포 분화의 기제로 파악하고 있다.

발명의 상세한 설명:

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, 이하, 'AA2G'로 약칭함)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물이 제공된다.

상기 배지 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있고, 상기 성체줄기세포는 조혈모 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 상피 줄기세포, 신경 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 배지 조성물에 있어서, 상기 AA2G는 50 내지 1,000 μg/ml의 농도, 100 내지 750 μg/ml의 농도, 또는 200 내지 500 μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

상기 배지 조성물에 있어서, 상기 줄기세포가 배아줄기세포일 경우, 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산, 0.05 내지 0.2 mM 베타-마캅토에탄올, 10 내지 20% 열불활성화 우태아혈청, 50 내지 150 IU/ml ESGRO/LIF, 항생제 및 0.1 내지 5.0 mM AA2G를 포함하는 고포도당 함유 DMEM 배지일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포이고, 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES(pH 7.3), MEM 비필수 아미노산 용액, 10 내지 20% 열-불활성화된 우태아혈청, 2 내지 8 ng/mL 인간표피성장인자, 5 내지 15 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자, 25 내지 75 μg/mL 인슐린-유사 성장인자-1, 항생제 및 0.1 내지 5 mM의 AA2G를 포함하는 저포도당 DMEM 배지일 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, 이하, 'AA2G'로 약칭함)를 유효성분으로 포함하는 유도분화 만능줄기세포 확립용 배지 조성물이 제공된다.

상기 배지 조성물에 있어서, 상기 AA2G는 50 내지 1,000 μg/ml의 농도, 100 내지 750 μg/ml의 농도, 또는 200 내지 500 μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

상기 배지 조성물에 있어서, 5 내지 15% 열-불활성화 우태아혈청, 항생제, 및 0.1 내지 5 mM의 AA2G를 포함하는 저포도당 DMEM 배지 또는 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산, 0.05 내지 0.2 mM 베타-마캅토에탄올, 10 내지 20% 열불활성화 우태아혈청, 50 내지 150 IU/ml ESGRO/LIF, 항생제 및 0.1 내지 5.0 mM AA2G를 포함하는 고포도당 함유 DMEM 배지일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포를 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G)가 포함된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 줄기세포의 만능성 강화, 분화능 유지 및 증식능력 강화 배양방법을 제공한다.

상기 배양방법에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있고, 상기 성체줄기세포는 조혈모 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 상피 줄기세포, 신경 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 배양방법에 있어서, 상기 AA2G는 상기 배양배지 내에 50 내지 1,000 μg/ml의 농도, 100 내지 750 μg/ml의 농도, 또는 200 내지 500 μg/ml의 농도로 처리될 수 있다.

상기 줄기세포의 분화능 유지 및 증식능력 강화 배양방법에 있어서, Oct4, Sox2, cMyc, Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt31 등의 단백질 전사인자들을 발현하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제가 제공된다.

상기 세포치료제에서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도분화 만능줄기세포일 수 있다.

상기 세포치료제는 천식, 퇴행성 관절염, 류마티스성 질환, 신경손상, 근위축성축삭경화증, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 골다공증, 또는 황반변성과 같은 퇴행성 질환 또는 손상성 질환의 치료에 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통해 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전히 알려주기 위해 제공되는 것이다.

일반실험

줄기세포 배양

마우스 R1 ESCs(인디아나 의과대학의 Broxmeyer 박사 제공)배아줄기세포는 0.1% 젤라틴(Sigma, USA) 코팅된 조직배양접시 상에서 2 mM 엘-글루타민(Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Cellgro, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA), 15% 열-불활성화 FBS(Hyclone, USA) 및 100 IU/ml ESGRO/LIF(Upstae-Millipore, USA)로 보충한 DMEM-고포도당 배지에서 성장시켰다. 인간 기형종양 세포주(NTERA-2)는 2 mM 엘-글루타민, 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린/스트렙토마이신 용액, 및 10% 열-불활성화 FBS로 보충한 DMEM-고포도당 배지에서 배양하였다. 지시한 농도의 AA2G 또는 비타민 C(Vit C)를 처리한 후 세포활성은 제조자의 프로토콜에 따른 MTT 분석 키트(Sigma, USA)로 결정하였다. 상기 MTT 지시약의 환원은 4 시간 이후에 마이크로 플레이트 분광광도계(Molecular Devices, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다.

알칼린 포스페이트(AP) 염색

상기 배양한 줄기 세포의 만능성은 제조자의 지시에 따라서 알칼라인 포스파타제(AP) 검출 키트(Upstate-Millipore, USA)를 사용하여 모니터하였다.

면역염색

지시한 농도의 AA2G로 보충한 배지에서 배아줄기세포를 5회 통과 시킨 후, 세포들은 4% 파라포름알데하이드(Sigma, USA)로 1 시간동안 고정하여 침투시켜, 항-5-하이드록시메틸시토신(5hmC)항체(액티브 모티브, 1:500)로 염색하고, FITC-컨쥬게이트한 항-래빗 IgG 항체를 사용하여 시각화하였다. 핵은 4',6-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 역으로 염색하였다. 상기 염색한 샘플들은 역상 형광 현미경(칼 자이스 현미경, 뮌헨, 독일)을 사용하여 사진을 촬영하였다.

게놈 DNA 제조

DNA는 제조자의 지시에 따라서 Qiagen DNeasy Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 분리하였다.

닷블랏 분석

분리한 DNA(샘플당 1 mg) 95 uC에서 10분간 0.1 M NaOH 내에서 변성하였다. 상기 제조된 샘플들은 얼음 위에서 1 M NH₄OAc로 중화한 다음, 순차적으로 두배 희석하였다. 상기 DNA 샘플들은 바이오-닷 장치(Bio-Rad, USA)를 사용하여 니트로셀룰로오스막상에서 반점을 찍었다. 상기 블랏된 막은 SSC 완충액으로 세척하여 80 uC에서 5 분간 건조하였고 120,000 mJ cm에서 UV 교차연결되었다. 그런 다음, 상기 막은 4℃에서 밤새 인산완충용액과 1:1의 비율로 희석한 Odyssey 완충액(Li-Cor, USA)으로 차단시켰다. Odyssey:PBS에 현탁된 마우스 항-5-메틸시토신 단일클론항체(Active Motif's, USA, 1:500) 또는 래빗 항-5-하이드록시메틸시토신 다클론항체(1:5,000)를 첨가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응된 막은 PBS에서 10 분 동안 3회 세척한 다음 상온에서 3 시간 동안 오디세이:PBS에 현탁된 HRP-결합 양 항-마우스 면역글로불린-G(IgG)(GE, USA; 1:10,000) 또는 HRP-결합 염소 항-래빗 IgG(Abcam, USA; 1:10,000) 이차항체와 반응시켰다. 그런 다음, 상기 막은 10 분 동안 3회 PBS로 세척하여 GE ECL Plus(GE, USAP)로 화학발광에 의해 시각화시켰다.

5hmC DNA 면역침강분석

상기 5hmC로 수식한 DNA를 제조자의 지시에 따라서 Mse I 제한 효소를 사용하여 분절한 게놈 DNA 1 μg을 사용하여 Hydroxymethyl Collector^TM 키트(Active Motif's, USA)로 농축하였다. 상기 개별 좌위(loci)의 DNA 하이드록시메틸화 상태는 iQ™ SYBR Green PCR Master Mix(Bio Rad, USA)와 PikoReal 시스템(Thermo Scientific, USA)을 이용하여 잡아당겨진(pull-downed) 5-하이드록시메틸화된 DNA에 대한 정량적 실시간 PCR(RQ-PCR)을 이용하여 정량화되었다. 상기 농축정도는 비결합 증폭체에 대한 결합 증폭체 분획의 비율로써 계산하였고, 평균ㅁSEM ≥ 4 개의 독립 실험으로써 표현하였다.

RQ-PCR의 유전자 발현분석

표적 유전자의 mRNA 수준의 정량 평가는 종래에 기술된 바대로 수행하였다(Shin et al., Leukemia., 24: 1450-1461, 2009). 총 RNA(50 ng)는 Taqman 역전사 시약(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 역전사시키고, 역치(Ct)는 종래에 기술된 바대로 RQ-PCR를 사용하여 순차적으로 결정하였다(Shin et al., Leukemia., 24: 1450-1461, 2009). 상기 표적 유전자의 상대적 발현 수준은 2^-ΔΔCt 방법을 사용하여 결정하였고, GAPDH는 내인성 대조 유전자로써 사용하였다.

iPSC로 MEF의 재프로그램

종래에 기술된 바와 같이 Oct4(Pou5f1) 유전자의 중지 코돈의 하류에 연결된 IRES-EGFP 융합 카세트를 갖고 있는 Oct4-GFP 마우스로부터 수득된 마우스 배아 섬유세포(MEF, 5,000 cells)를 FUW-SOKM 렌티바이러스(동국대 김종필 교수로부터 제공)로 2계대 상태에서에서 24웰 배양접시에서 형질도입시켰다(Takahashi et al., Nature Protocols, 2: 3081-3089, 2007). 상기 MEF 세포들은 형질도입 0일째 및 1일째까지는 0.74 mM AA2G로 보충한 MEF 배양배지(10% 열불활성화 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Cellgro, USA)을 포함하는 고 포도당 DMEM 배지)로 배양하였고, 형질도입 2일째부터는 배아줄기세포 배양 배지(2 mM 엘-글루타민(Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Cellgro, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA), 15% 열-불활성화 FBS(Hyclone, USA) 및 100 IU/ml ESGRO/LIF(Upstae-Millipore, USA)로 보충한 DMEM-고포도당 배지) 하에서 형질전환 후 2 일동안 유지하였다. 상기 확립된 iPSC 군락의 AP 염색은 형질전환 후 21일째에 수행하였다.

인간 골수유래 중간엽 줄기세포 배양

중간엽 줄기세포(MSC)로부터 유도된 인간 골수(BM)는 상업적으로 구입하였고(Lonza, USA), 37℃에서 5% CO₂로 흡습한 대기 상태에서 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPES(pH 7.3), MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린/스트렙토마이신(Cellgro USA), 1 μg/mL 아스코르빈산(Sigma, USA), 15% 열-불활성화된 FBS(Hyclone, USA), 5 ng/mL 인간표피성장인자, 10 ng/mL 기본 섬유세포 성장인자, 및 50 μg/mL 긴 R3-인슐린-유사 성장인자-1(Prospec, Israel)로 보충한 DMEM-저포도당 배지(Hyclone, USA)에서 성장시켰다. 상기 MSC는 다분화능을 보증하기 위해, 4계대까지만 증식시켜 사용하였다.

표면마커 분석

상기 배양한 세포 표현형의 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 위하여 상기 세포들은 인간 CD14, CD34, CD45, HLA-DR(FITC; BD Biosciences), CD44, CD73, CD105, CD166, 및 PDGFR-A(PE; BD Pharmingen, Los Angeles, CA) 등에 대한 각 항체들로 상온에서 15분 동안 염색하였다. 상응하는 마우스 동족체(isotype) 항체들은 대조군으로 사용되었다. 상기 단일 색으로 염색된 세포들은 PBS로 세척하여 1%(v/v) 파라포름알데하이드로 고정하였다. 상기 MSC 면역형(immunotype)들은 FACSCaliuer(BD Biosciences, USA)상에서 유세포분석을 통해 결정하였고, 상기 발현 세포 표면 항원들의 백분율은 10,000 게이트된 세포 수에 대하여 계산되었다.

시험관내( in vitro ) 분화분석

골원성, 연골원성, 또는 지방조직원성 계열로의 시험관내 분화는 이전에 보고한 바대로 수행하였다(Jin et al., Antioxid Redox Signal, 24(9): 471-485, 2016). 간략하게, 세포들은 정상 성장 배지 하에서 유지하여 지방조직 분화배지(5% FBS, 1 μM 덱사메타손, 10 μM 인슐린, 200 μM 인도메타신, 및 0.5 mM 이소부틸메틸크산틴으로 보충한 DMEM), 골조직 분화배지(5% FBS, 50 μM 엘-아스코르베이트-2-포스페이트, 0.1 μM 덱사메타손, 및 10 mM 글리세로포스페이트로 보충한 DMEM), 또는 StemPro^ㄾ 연골조직 분화배지(Invitrogen, USA)로 배양하였다. 지방조직 분화는 세포간 지질의 축적을 특징으로 하는데, 이는 oil red O 염색으로 시각화될 수 있으며, 골조직 분화는 칼슘에 대하여 특이적인 Alizarin Red 적색 염색시 양성인 것으로 확인이 가능하며, 연골조직 분화는 Alcian Blue 염색으로 조사되었다.

세포증식 및 군락형성 단위-섬유세포(CFU-F)분석

상기 세포증식은 지시된 농도의 AA2G 또는 비타민 C를 처리한 후에 제조자의 프로토콜에 따라서 MTT 분석 키트(Sigma, USA)를 이용하여 결정하였다. 상기 MTT 시약의 환원은 처리 4 시간 경과 후 마이크로플레이트 분광광도계(Molecular Devices, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. 또한 CFU-F 분석을 위하여, 5계대의 MSC에 지시된 농도의 AA2G 또는 비타민 C를 처리하였고 세포들은 6-웰 배양 접시에서 클론의 밀도(각 웰당 60 개의 세포)에 재배치 한 다음, 14 일 동안 hCB-MSC 배지에서 배양하였다. 상기 확립한 군락들은 PBS로 두 번 세척하고 고정하여 0.5% 크리스탈 바이올렛(Sigma, USA)으로 염색하였다.

세포이동 분석

8 ㎛ 두께의 폴리카보네이트 막을 50 μL 1.0% 젤라틴(Sigma, USA)으로 1 시간 동안 코팅하였다. 상기 MSC는 트립신-EDTA로 떼어내어 세척하고 0.5% BSA를 포함하는 DMEM에 재부유한 다음, Transwell inserts(Costar Transwell; Corning Costar, USA)의 상부 챔버에 3×10⁴ cells/well의 밀도로 파종하였다. 하부 챔버는 0.5% BSA DMEM에서 지시한 농도의 PDGF-AA(R&D System, USA)로 채웠다. 24 시간이후에 삽입부는 트란스웰 플레이트로부터 제거하였다. 상기 상부 챔버에 남아 있는 세포들은 탈지면으로 닦아내어 막을 가로질러 이동한 세포들은 4% 파라포름알데하이드(PFA)가 용해된 PBS 용액으로 고정한 후 0.5% 크리스탈 바이올렛(Sigma, USA)으로 염색하였다. 상기 막의 하부면상에 있는 염색된 세포들은 Image Pro 5.0 소프트웨어(Media-Cybernetics, Rockville, MD)를 사용하여 디지털 영상분석으로 정량하였다.

웨스턴 블랏

MSC는 37℃에서 0.5% BSA를 포함하는 DMEM에서 1 일 동안 절식시키고 지시한 농도의 PDGF-AA로 5 분 또는 10 분 동안 자극한 다음, 단백질 분해효소 및 포스파타제 저해제(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 포함하는 RIPA 분해 완충액에 넣고 얼음 위에서 30 분 동안 분해하였다. 상기 세포 추출물(30 μg)은 12% SDS-PAGE 겔을 사용하여 분리하고, MAPKp42/44 및 AKT(Ser473)(Cell Signaling Technology, USA)의 인산화 정도를 분석하였다. 동등한 적재량은 MAPKp44/42 및 총 AKT(Cell Signaling Technology)에 대해서 단일클론 또는 다클론항체를 사용하여 확인하였다.

천식동물모델

모든 동물실험은 울산대학교 의과대학의 동물실험 윤리위원회(IACUC-2015-12-061)에 의해 승인을 받았다. 심각한 천식의 마우스 모델을 제작하기 위하여 6 주령의 BALB/c 마우스(오리엔트바이오, 가평, 경기도, 한국)들은 0, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 22, 및 23 일째에 75 μg OVA(Sigma, USA) 및 10 μg polyI:C(Calbiochem, USA)로 비강내 투여로 감작하여 장애를 일으켰다. 상기 마우스는 15 일째에 정맥내 주사에 의해 3×10⁵ 개의 MSC를 주입하였다. 마지막 면역화 후 24 시간 경과한 마우스로부터 BALF, 림프절, 및 폐조직을 수득하였다. 모노사이트, 호염기성구, 호중성구, 및 림프구의 수와 BALF에서 IL-8 및 IL-10의 농도는 종래에 기술한 바대로 측정하였다(Jin et al., Antioxid Redox Signal, 24(9): 471-485, 2016; Bang et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 50(6): 1021-1030, 2014). 조직병리평가를 위해서, 폐에 대하여 오른쪽 심실을 통해서 5 ml PBS를 관류시키고 기관지를 통하여 1 ml PBS를 투입팽창시켰다. 상기 투입 팽창시킨 폐는 10% 중성 완충 포르말린 용액에서 24 시간 동안 담금으로써 고정하였다. 상기 고정된 폐조직을 파라핀에 포매시키고 4 μm 두께로 절편화하여 기관지 및 혈관 주위 영역에서 염증의 크기를 헤마토실린 및 에오신 염색으로 시험하였다. 주입한 MSC의 생착은 인간 β2-마이크로글로불린(ab15976; Abcam, USA)의 면역형광분석으로 결정하였고, FITC-표지된 이차 항체를 사용하여 시각화하였다. 핵은 4'-6-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI; Sigam, USA)를 사용하여 상대적으로 염색하였다.

실시예 1: 마우스 및 인간 만능 줄기세포의 증식에서 아스코빌 글루코사이드(AG)의 영향

본 발명자들은 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G)가 세포성장에 미치는 영향을 보기 위하여 마우스 배아줄기세포(mESC)와 인간 배아줄기세포와 유사한 특성을 가진 암세포주인 인간 기형암종 세포주(teratocarcinoma, NTERA2)를 상기 지시한 개수의 세포(cells/ml)로 파종 한 후, 마우스 배아줄기세포의 경우 2 mM 엘-글루타민(Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린/스트렙토마이신 용액(Cellgro, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA), 15% 열-불활성화 FBS(Hyclone, USA) 및 100 IU/ml ESGRO/LIF(Upstae-Millipore, USA)로 보충한 DMEM-고포도당 배지, 그리고 인간 기형암종 세포주의 경우 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린/스트렙토마이신 용액, 및 10% 열-불활성화 FBS로 보충한 DMEM-고포도당 배지에 비타민 C와 AA2G를 각각 0, 0.185, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 농도로 처리한 후 5일간 배양하였다. 배양 3일 및 5일 시점에서 세포 증식능을 MTT assay로 분석하였다. 그 결과 도 1에서 MTT 분석한 결과를 나타난 바와 같이, 도 1에서 나타난 바와 같이, 마우스 배아 줄기세포에서 0.37 mM 와 0.74 mM 농도의 AA2G를 포함한 배지에서 3일부터 세포 증식 향상이 관찰되었으며,비타민 C는 마우스 배아 줄기세포의 증식에 거의 영향을 미치지 않았고, 오히려 250 μg/ml이상의 고농도에서는 심각한 세포독성을 나타냈다. 인간 기형암종 세포주에서는 0.37 mM 와 0.74 mM 농도의 AA2G를 포함한 배지에서 3일부터 세포 증식 향상이 관찰되었으며, 5일에는 약 1.5배 이상의 세포 증진 향상이 관찰되었다. 상기 결과는 AA2G 포함 배지의 우수한 줄기세포 증식능을 입증하는 것이다.

실시예 2: 세포 형상에 관한 아스코빌 글루코사이드(AG)의 영향

본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 AA2G 또는 비타민 C가 mESC 배양시 세포형태에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해, 배양중인 mESC 배양액에 AA2G(20 mg/ml)를 0, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 농도별로 각각 처리한 후, 세포형태를 현미경으로 관찰하였다. 준비한 mESC의 세포들을 아세토페논(AP)으로 용매를 첨가한, 염료농도 1×10^-3 M 염액으로 소정시간, 소정온도에서 적외선염색기(BRA-12, Swiss)로 염색한 후 수세, 건조하여 인산염 완충용액을 사용하여 염욕의 pH를 5.5로 일정하게 유지하였다. 아울러, mESC가 줄기세포로서 미분화상태를 유지하고 있는지 확인하기 위해서 알칼라인 포스파타제(AP) 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, AA2G 또는 비타민 C가 포함된 배지에서 배양한 mESC는 일반 배지에서 배양한 세포보다 조밀한 둥근 돔 형태의 군집체를 형성하고 있으며(도 2 상단 참조), 미분화 줄기세포 특이적 마커인 AP 염색 정도 역시 AA2G 미처리시보다 더 강하게 염색이 되고 있음을 확인하였다(도 2 하단 참조). 상기 결과는 AA2G 포함 배지가 mESC의 전분화능 강화를 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 3: 만능성 유전자의 발현 수준

3-1: 웨스턴 블랏 분석에 따른 만능성 유전자의 발현 수준

본 발명자들은 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자 단백질들의 발현량을 측정하기 위하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 각각 0, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G를 각각 처리한 mESC를 5일간 배양한 후, 세포에 트립신을 처리하여 회수한 후, PBS로 세척하고 1 ㎖의 세포파쇄 완충용액(50 mM Tris, pH 7.5, 0.5% NP-40, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF)으로 파쇄하여 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수득한 후, 5분 동안 중탕 후, 10% SDS-PAGE를 시행하였으며, 니트로셀룰로스 막에 25 mV으로 18시간동안 블롯팅하였다. 니트로셀룰로스 막에 5%(w/v) 탈지유가 포함된 TBST 완충용액(Trisbuffered saline-Tween 20)으로 1시간동안 차단한 후 각각의 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자 단백질(Oct4, Sox2, Nanog, Tfcp2l1, Dumt31, βActin)에 각각 특이적인 래빗-항체로 반응시켰다. 반응이 종료된 후, HRP 결합-항-래빗 IgG 2차항체로 반응시키고, TBST 완충용액으로 10분간 3회 세척 후 ECL 키트(Amersham, USA)를 사용하여 O-mat AR 필름(Kodak)으로 현상하였다. 이때, 내재 단백질로는 β-액틴을 사용하였다.

상기 웨스턴 블롯 분석 결과, 도 3A에서 나타난 바와 같이, AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC에서 OCT4, NANOG, SOX2, TFCP2L1, 및 Dumt31 단백질들의 발현량이 재현성 있게 증가함을 확인하였다(두 번의 독립적 실험 결과, 도 3A 참조).

상기 결과는 AA2G 포함 배양액을 통한 mESC의 전분화능 강화에 대한 분자생물학적 수준의 증거이며 본 발명에서 FBS(분화를 촉진하는 인자)가 포함된 배지에서 한 일 실시예로써, 상기에서 언급한 Nature paper(VitC)처럼 FBS를 제거하고 실험을 반복할 경우 더욱 확연한 차이가 관찰될 것이라고 사료된다.

3-2: qPCR 방법에 따른 만능성 유전자의 발현 수준

또한, 본 발명자들은 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자들인 Oct4, Sox2, cMyc(핵심 인자들) 및 Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt3l(신규상태 인자들)에 대한 상대적인 mRNA의 발현량을 qPCR방법으로 측정하였다. 상기 mRNA는 DNase I 처치한 칼럼상에서 Qiagen RNeasy를 사용하여 배양한 세포로부터 분리하여 무작위 헥사머를 사용하여 1 μg의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 상술한 바와 같이 실시간 저량 PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 3B에서 나타난 바와 같이, AA2G 함유 배지에서 mESC를 배양할 경우, 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자들의 발현이 소폭 증가하거나 비슷한 수준으로 유지됨을 확인 할 수 있었다. 상기 결과는 AA2G가 줄기세포의 증식능을 강화시킬 뿐만 아니라, 줄기세포로서의 특징을 유지할 수 있게 함을 의미하는 것이다.

실시예 4: 후성유전체 변이 분석(5 hmC 수준)

4-1: 면역염색

비타민 C(vitamine C, VitC)를 배양액에 처리할 경우, DNA 탈메틸화(DNA demethayltion)을 촉매하는 TET 효소들을 활성화여 DNA 메틸화를 최소 수준으로 유지하며, 이를 통하여 배아 줄기세포의 전분화능/만능성 강화 및 역분화 줄기세포 확립 효율 증대가 가능하다는 연구결과(Rahul, M. K. and Yi, Z., Nature, 502: 472-479, 2013)와 관련하여, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 AA2G의 줄기세포 전분화능/만능성 강화효과가 DNA 탈메틸화 즉, 후성 유전학적 변화를 통해 달성되는 것인지를 상술한 바와 같이 조사하였다.

그 결과, 상기 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC에서는 DNA 탈메틸화 표식인자인 5 hydroxy methyl Cytosine(5hmC)의 양이 0.74 mM의 농도까지는 농도의존적으로 유의하고 재현성 있게 증가됨을 확인하였다(도 4A 참조). 상기 결과는 AA2G 포함 배양액이 VitC의 경우와 유사한 기전으로 줄기세포의 전분화능 강화를 유도할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.

4-2: 닷 블랏 분석

본 발명자들은 상기 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC에서는 DNA 탈메틸화 표식인자인 5 하이드록시메틸 시토신(5hmC)의 양이 증가되는 상기 실시예 4-1의 결과를 정량적으로 검증하기 위하여, 상기 실시예 4-1과 같은 조건의 배지에서 배양한 세포에서 게놈 DNA을 추출한 후 100 ng gDNA으로부터 2배씩 연속 희석한 gDNA를 닷 블랏 기기를 통하여 블랏팅 한 후, 5hmC 특이적인 항체를 이용하여 면역블롯팅을 실시하여 그 양을 두 번의 독립적 시험을 통하여 측정하였다.

그 결과, 도 4B에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 4-1의 결과와 동일하게 AA2G 농도 의존적으로 탈메틸화효소의 활성의 지표인 5 hmC이 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 AA2G는 줄기세포 배양시 줄기세포의 전분화능의 강화를 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.

4-3: DNA 면역침강(IP) 분석

이어 본 발명자들은 상기 5hmC로 수식한 DNA를 제조자의 지시에 따라서 Mse I 제한 효소를 사용하여 분절한 게놈 DNA 1 μg을 사용하여 Hydroxymethyl Collector^TM 키트(Active Motif's, USA)로 농축하였다. 상기 개별 좌위(loci)의 DNA 하이드록시메틸화 상태는 iQ™ SYBR Green PCR Master Mix(Bio Rad, USA)와 PikoReal System(Thermo Scientific, Pittsburgh, PA)을 이용하여 잡아당겨진(pull-downed) 5-하이드록시메틸화된 DNA에 대한 정량적 실시간 PCR(RQ-PCR)을 이용하여 정량화되었다. 상기 농축정도는 비결합 증폭체에 대한 결합 증폭체 분획의 비율로써 계산하였고, 평균±SEM ≥ 4 개의 독립 실험으로써 표현하였다(도 4C 참조).

그 결과, 도 4C에서 나타난 바와 같이, 두 차례의 독립적인 실험에서 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 eESC들은 VitC 표적 유전자 발현 부위에 5 hmC 수준이 높은 후성유전학적 특성을 가지고 있는 것을 확인하였다.

4-4: 비타민 C 표적지향 유전자의 발현 수준

본 발명자들은 마우스 배아줄기세포를 함께 취하여 비타민 C와 유사한 AA2G 보충 배지에서 유지하여 신생 배반포와 같은 단계로 이끄는 비타민 C 표적 유전자(Wfdc15a, Dazl, Gtsf1, Gpx2, Taf7l, Dpep3, Pdha2, Tktl2, Fkbp6)의 발현 수준을 상술한 바와 같이 실시간 RT-PCR로 분석하였다.

도 4D에서 나타난 바와 같이, AA2G가 포함된 배지에서 배양한 eESC에서 미성숙 상태(신생 배반포와 같은 단계)로 이끄는 비타민 C 표적 유전자 발현량 증가가 재현성 있게 관찰되는 것을 확인하였다. 상기 결과는, 비타민 C 뿐만 아니라 AA2G가 비타민 C와 동일한 기전으로 작용함을 시사하는 것이다.

실시예 4-5: DNA 메틸전이제 및 탈메틸화제의 발현 수준

이어 본 발명자들은 AA2G를 처리하고 72시간이 경과한 배아줄기세포에 대하여 qRT-PCR 분석을 통해, AA2G에 의한 DNA에 대한 탈메틸화의 증가가 DNA 탈메틸화를 매개하는 효소인 Tet와 Dnmt의 발현의 증가에 따른 것인지 분석하고자 하였다.

그 결과, 도 4E에서 나타난 바와 같이, AA2G의 처리가 상기 DNA 탈메틸화 효소의 발현을 증가시키지는 않는 것으로 나타났다. 다만, Dnmt3b의 경우 AA2G의 처리에 의해 그 발현정도가 증가되는 것으로 나타났다. 상기 결과는 AA2G가 DNA 탈메틸화 효소의 발현보다는 그 활성을 증가시킴으로써 배아줄기세포의 전분화능/만능성을 강화시킴을 시사하는 것으로서, Vitamin C(VitC)처리가 TET1 DNA 탈메틸화효소의 활성을 증가시켜 배아줄기세포의 전분화능/만능성을 강화시킨다는 내용의 대표적 참고 문헌(Kathryn, B., et al., Nature Letter, 500:222-226, 2013)에서 발표 한 것과 일치하였다.

상기 결과들은 AA2G 포함 배양액을 통한 mESC의 전분화능 강화에 대한 분자생물학적 수준의 증거이며 본 발명에서 FBS(분화를 촉진하는 인자)가 포함된 배지에서 한 일 실시예로써, 상기에서 언급한 Nature paper(VitC)처럼 FBS를 제거하고 실험을 반복할 경우 더욱 확연한 차이가 관찰될 것이라고 사료된다.

실시예 5: 재프로그램시 AA2G 처리에 의한 iPSC 콜로니 형성

아울러, 본 발명자들은 마우스 배아 섬유아세포를 iPSC로 유도하는 과정에서 AA2G 처리에 의한 효과를 관찰하기 위해, iPSC로의 재프로그램화 과정에서 AA2G를 0.74 mM의 농도로 처리한 후, AP 염색으로 생성된 iPSC 군락을 계수하였다. 그 결과, 도 5A에서 나타난 바와 같이, AA2G는 비타민 C와 유사하게 iPSC 재프로그래밍의 효과를 강화하였다(도 5A 참조). 구체적으로 5A에서 보는 바와 같이 SOKM+AA2G(0.74 mM)군락 부분의 변화가 대략적으로 3배 이상 더 강해졌다. 또한 AP 염색한 콜로니를 상대적으로 계수한 그래프에서도 같은 현상을 나타내었다(도 5B 참조).

상기 결과에 따라서 완전히 배아줄기세포와 유사한 상태로 재프로그램하여 GFP를 추가한 iPSC군락을 2회 반복 관찰한 결과, 군락 부분의 변화가 대략 5 배 정도 강해졌다(도 5C 및 도 5D 참조). 뿐만 아니라, GFP가 줄기세포 표지자인 Oct-4와 연결되어 발현되도록 유전자 조작된 마우스 배아 섬유아세포를 iPSC로 유도하면서 AA2G를 처리한 결과, AA2G 미처리 대조군과 비교하여 GFP 발현 세포의 수가 대폭 증가하였다(도 5E 참조). 이러한 결과는 AA2G가 iPSC의 제조 수율을 높이는데 매우 효율적으로 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 6: MSC의 증식에 관한 AA2G의 영향

인간 MSC를 500 또는 1000 cell/ml의 밀도로 파종한 후, 5일 동안 배양하면서 0.185, 0.37, 0.74, 및 1.48 mM 농도의 AA2G 또는 비타민 C를 처리하였다. 이어 MTT 분석를 수행하여 상대적인 세포 증식을 5일 동안 관찰하였다.

그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이, AA2G가 포함된 배지에서 배양된 MSC의 경우 3일째부터 농도의존적인 증식 향상이 나타났다. 반면, 비타민 C는 대조군과 비교하여 아무런 효과가 없거나 오히려 고농도에서는 세포독성이 나타남을 확인할 수 있었다.

실시예 7:MSC에 관한 AA2G 배지의 영향

7-1: MSC의 표면 단백질 표현형에 관한 AA2G의 영향

본 발명자들은 AA2G가 인간 MSC의 표면 단백질 표현형에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, 유세포 분석을 통해, 인간 MSC의 표면 단백질 표현형을 분석하였다.

그 결과, 도 7A에 나타난 것과 같이, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC의 경우 CD29, CD273, CD14, CD45와 같은 표면 마커들의 발현 양상이 비-처리된 MSC의 양상과 유사하였다(도 7A 참조). 이는, AA2G의 처리가 MSC의 특성 자체를 변화시키는 것은 아님을 보여주는 것이다.

실시예 7-2: MSC(I)의 다중 분화성에 AA2G의 영향

본 발명자들은 AA2G가 MSC의 분화능에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, AA2G 처리된 MSC를 시험관 내 조건에서 골세포 및 지방세포로 분화시키는 실험을 수행하였다. 그 결과, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC은 AA2G가 포함되지 않는 세포와 비교하여 유사한 골분화 능력(도 7B)와 연골 분화 능력(도 7C)이 관찰되었다.

이는 AA2G가 포함된 배지가 MSC 다분화능에는 크게 영향이 없음을 보여주는 결과이다.

실시예 8: AA2G가 MSC의 콜로니 형성 능력에 미치는 영향

또한 본 발명자들은 AG 보충 배지내에서 유지된 중간엽 줄기세포(MSC)의 콜로니 형성 단위-섬유세포(CFU)강화를 고찰하기 위하여, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC를 6-웰 배양 플레이트(각 웰당 60 세포)에 동일한 밀도로 재-플레이팅하여 CFU-F 어세이를 실시하였다. 추가적으로 0.37, 0.74 및 1.47 mM의 AA2G가 포함된 배지에 14일 동안 배양하였다. 결과물인 콜로니들을 PBS로 2회 세척하고, 고정한 후, 0.5 % 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

그 결과, 도 8A에서 나타난 바와 같이, AA2G 농도의존적으로 MSC에 대한 클론원성 전구세포(clonogenic progenitor)인 클론원성 CFU-F(fibroblast colony-forming units) 형성능이 증가되었다(도 8A 및 8B).

이러한 결과들은, AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC가 그들의 치료 효능에 매우 중요한 줄기세포성(stemness)을 향상시킨다는 것을 시사한다.

실시예 9: AA2G의 MSC의 이동능에 미치는 영향

또한 본 발명자들은 AG 보충 배지내에서 유지된 중간엽 줄기세포(MSC)의 이동 활성을 고찰하기위하여 AA2G 농도를 0.37, 0.74, 및 1.48 mM로 증가시키면서 Cell Biolabs CytoSelect™ Cell Migration Assay Kit로 조직 배양 용기에서 중간엽줄기세포(MSC)의 이동을 수행한 후, 현미경의 x100 및 x200 배율로 AA2G의 농도별 영향을 고찰하였다(도 9A 참조). 아울러, AA2G 미처리 세포의 이동 정도에 대한 상대적인 이동 정도를 계량하였다(도 9B 참조).

그 결과 도 9A 및 9B에서 나타난 바와 같이, 일반 배양액에서 배양한 세포와 비교하여, 0.37, 0.74, 및 1.48 mM AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC은 PDGF-AA에 대한 세포 이동 활성이 유의하게 크게 증가한다는 것이 관찰되었다. 다만, 저 농도에서 세포 이동활성이 가장 컸고, 농도가 증가함에 따라 세포 이동활성은 떨어지는 것으로 나타났다.

상기 결과는 기능성 강화 성체줄기세포 배양액 개발에도 활용될 수 있는 장점이 있어서, 향후 줄기세포 기반 치료제 개발에 원천 기술로써 산업상 이용가능성이 클 수 있음을 시사한다.

실시예 10: AA2G의 PDGF 신호전달에 미치는 영향

본 발명자들은 상기 실시예 9의 결과로부터 AA2G의 PDGF 신호전달과의 상관관계를 분석하고자, 유세포 분석 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

구체적으로, 2.5 ng/ml의 PDGF-AA를 처리한 인간 MSC에 0, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G를 처리한 후, 항-PDGFRα 항체를 이용하여 PDGFRα에 대하여 게이팅하여 유세포분석을 수행하였다. 대조군으로는 IgG-FITC를 사용하였다. 그 결과, 도 10A에 나타난 바와 같이, 일반 배지에서 배양한 인간 MSC의 경우, 세포 밖 표면으로 PDGFRα를 발현하는 세포의 빈도가 매우 희박한 반면(0.07%), 0.37 mM AA2G가 포함된 배지에서 배양된 인간 MSC는 PDGFRα를 발현하는 세포의 빈도가 전체의 15.9%로 크게 증가하는 것을 확인하였다.

아울러 본 발명자들은 2.5 ng/ml의 PDGF-AA를 처리한 인간 MSC에 0, 0.37 및 0.74 mM의 AA2G를 처리한 후 세포를 파쇄하여, 내부에 존재하는 PDGF 신호전달 단백질들인 p-MAPKp44/p42, MAPKp44/p42, p-Akt 및 Akt의 발현 정도를 웨스턴 블랏 분석으로 분석하였다.

그 결과, 도 10B에 나타난 바와 같이, AA2G의 처리여부 및 농도와 무관하게 MAPKp44/p42나 Akt 자체의 발현은 영향을 받지 않았으나, 이들의 인산화 형태의 경우, AA2G의 처리 여부 및 처리 농도에 따라 증가하는 양상이 나타났다. 이는, AA2G가 PDGF 신호전달을 강화시킬 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 11: 마우스 알러지성 천식모델에서 MSC의 치료효과를 개선하는 AA2G의 영향

본 발명자들은 마우스로 알러지성 천식 모델을 제작하여 AA2G 배지가 MSC의 치료효과를 개선하는지를 고찰하기 위하여 PBS를 대조군으로 하여 Poly IC 유도 천식 동물 모델을 이용하였다.

상술한 바와 같이, 천식 유발 동물에 미접촉 MSC와 AA2G 처리한 MSC를 투여한 후, 폐조직에 대한 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행한 결과, MSC 미처리 동물의 경우 폐 조직 내 세기관지 상피세포층이 손상되고 비후로 인해 기도 면적이 좁아지는 전형적인 천식 동물의 폐 조직의 모습이 나타난 반면, 미접촉(naㅿve) MSC 및 AA2G 처리 MSC는 세기관지 내부 상피세포층 손상과 비후로 인한 기도 면적이 좁아지는 병리 구조적 변화를 유의하게 억제하는 것으로 나타났다. 특히, AA2G 처리 MSC의 경우 미접촉 MSC와 비교하여 증상의 개선 정도가 더 우수한 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 AA2G를 이용하여 증식된 줄기세포가 세포치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (14)

100 내지 750 μg/ml의 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, AA2G)를 유효성분으로 포함하는 분리된 줄기세포 유지용 배지 조성물.

100 내지 750 μg/ml의 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, AA2G)를 유효성분으로 포함하는 유도 만능줄기세포 확립용 배지 조성물.

제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 또는 유도 만능줄기세포인, 조성물.

제3항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포이고, 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산, 0.05 내지 0.2 mM 베타-마캅토에탄올, 10 내지 20% 열불활성화 우태아혈청, 50 내지 150 IU/ml ESGRO/LIF, 항생제 및 100 내지 750 μg/ml의 AA2G를 포함하는 고포도당 함유 DMEM 배지인, 조성물.

제3항에 있어서,
상기 줄기세포는 성체줄기세포이고, 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES(pH 7.3), MEM 비필수 아미노산 용액, 10 내지 20% 열-불활성화된 우태아혈청, 2 내지 8 ng/mL 인간표피성장인자, 5 내지 15 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자, 25 내지 75 μg/mL 인슐린-유사 성장인자-1, 항생제 및 100 내지 750 μg/ml의 AA2G를 포함하는 저포도당 DMEM 배지인, 조성물.

제2항에 있어서,
5 내지 15% 열-불활성화 우태아혈청, 항생제, 및 0.1 내지 5 mM의 AA2G를 포함하는 저포도당 DMEM 배지 또는 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산, 0.05 내지 0.2 mM 베타-마캅토에탄올, 10 내지 20% 열불활성화 우태아혈청, 50 내지 150 IU/ml ESGRO/LIF, 항생제 및 100 내지 750 μg/ml의 AA2G를 포함하는 고포도당 함유 DMEM 배지인, 조성물.

제3항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 조혈모 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 상피 줄기세포, 신경 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포인, 조성물.

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배아줄기세포 및 유도 만능줄기세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 줄기세포를 100 내지 750 μg/ml의 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G)가 포함된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 줄기세포의 만능성 강화, 분화능 유지 및 증식능력 강화 배양방법.

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