WO2017176054A1 - 줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법 - Google Patents

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WO2017176054A1
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신동명
윤태중
손재경
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Definitions

  • the present invention relates to a medium composition and a culture method, and more particularly, to a medium composition for stem cell culture and a stem cell culture method using the same.
  • Stem cells are cells that have the ability to differentiate into the various tissue cells that make up the human body. They are capable of self-renewal, which can continue to regenerate undifferentiated cells, and the ability to differentiate into specific cells. At the same time, the biggest feature is having.
  • the stem cells exist in a variety of cell groups according to the classification criteria, largely divided into embryonic stem cells and adult stem cells according to the tissue origin.
  • the embryonic stem cells are recognized as the most important cells in regenerative medicine because they have pluripotency / pluripotency capable of differentiating into all 260 kinds of cells constituting our human body.
  • Research on the development of core source technologies for strengthening and regulating pluripotency is being actively conducted (Yoon, BS and You, S., J Korean Med Assoc., 54 (5): 502-510, 2011).
  • the embryonic stem cells as a cytological feature, form a colony of round dome structures and form a colony having a denser and clean border with a higher density than cultured and undifferentiated cells.
  • undifferentiated embryonic stem cell populations are alkaline phosphatase (AP) staining, and thus AP staining is used as a major indicator of pluripotency / pluripotent stem cell discrimination.
  • the embryonic stem cells express specific transcription factors to maintain pluripotency, and include OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, CMYC, REX1, TFCP21L, and the like.
  • embryonic stem cells exhibit specific epigenetic characteristics, which are bivalent domains that simultaneously maintain two different histone protein modifications at the regulatory sites of Hox domain transcription factors that control differentiation. bivalent domains, and DNA methylation is also kept to a minimum.
  • Embryonic stem cell-specific epigenetic signatures described above form the basis of molecular mechanisms that maintain pluripotency / pluripotency of embryonic stem cells, determine rapid lineage differentiation, and stably maintain the determined cell fate. By regulating the self-renewal capacity and differentiation of stem cells.
  • the present invention is to solve various problems including the above problems, and to provide a more efficient stem cell culture medium composition for enhancing the differentiation capacity / pluripotency of stem cells and increase the yield of stem cells. .
  • a stem cell culture medium composition comprising ascorbic acid 2-glucoside (hereinafter, abbreviated as 'AA2G') as an active ingredient.
  • the method comprising the step of culturing embryonic stem cells in a culture medium containing ascorbic acid 2-glucoside (AA2G), pluripotency enhancement of embryonic stem cells, maintenance of differentiation capacity and culture capacity enhancement culture method To provide.
  • A2G ascorbic acid 2-glucoside
  • a cell therapy agent comprising stem cells treated with AA2G as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating asthma comprising stem cells treated with AA2G as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating cystitis containing stem cells treated with AA2G as an active ingredient is provided.
  • Stem cell culture medium composition according to an embodiment of the present invention can enhance the pluripotency of the stem cells, maintain the differentiation capacity as well as increase the proliferative capacity of the stem cells, stems in various cell therapy fields using stem cells
  • the therapeutic effect by the cells can be maximized.
  • the present invention is not limited to the above effects.
  • Figure 1a is a graph showing the results of cell proliferation analysis by MTT assay after incubation in a medium containing vitamin C and AA2G of the same concentration in mouse embryonic stem cells (mESC, stomach),
  • Figure 1b is similar to human embryonic stem cells Human teratocarcinoam (NTERA2), a cancer cell line with specific characteristics, was cultured in a medium containing vitamin C and AA2G at the same concentration, and the cell proliferation ability was analyzed by MTT assay.
  • NTERA2 Human teratocarcinoam
  • Figure 2a is a photograph showing the morphological characteristics of mESC cultured in a medium containing different concentrations of AA2G, taken with a phase contrast microscope (top and middle),
  • Figure 2b is the cells of Figure 2a It is photograph (bottom) which photographed result of alkaline phosphatase (AP) staining.
  • AP alkaline phosphatase
  • Figure 3 shows the results of immunoblotting the expression level of the pluripotency-related protein in mESC cultured in AA2G-containing medium
  • Figure 3a is OCT4, NANOG, SOX2, TFCP2L1, Dnmt31, ⁇ -actin transcription proteins
  • Figure 3b is a picture showing the expression level
  • Figure 3b is a graph showing the results of measuring the expression level of pluripotent stem cell specific transcription factor mRNA by qPCR method, the key factors (left) Oct4, Sox2, cMyc and new state factors (Right) shows Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt31, respectively.
  • FIG. 4 is a result of analysis of DNA demethylation marker 5hmC level
  • Figure 4a is a photograph of the addition of 5 hydroxy methyl Cytosine (5hmC) DNA demethylation marker as fluorescence of mESC cultured in a medium containing AA2G
  • Figure 4b 4 shows a dot blot analysis result
  • FIG. 4C is an IP-qPCR graph compared to 5 mC by immunoprecipitation (IP) analysis
  • FIG. 4D shows the expression level of genes enriched in 5 hmC cultured in a medium containing AA2G
  • 4E is a graph showing the effect of AA2G on the expression level of Tet DNA demethylase and Dnmts.
  • FIG. 5 is a result of observing an increased number of AA2G treated iPSC colonies during reprogramming
  • FIG. 5A is a photograph comparing SOKM and AA2G with a control group
  • FIG. 5B is a graph counting AP stained colonies
  • FIG. 5c is a fully reprogrammed GFP + iPSC colony fluorescence
  • FIG. 5D is a graph counting the colony of GFP + iPSC.
  • Figure 6 shows the effect of AA2G on the proliferation of MSC
  • Figure 6a is a graph observing the relative proliferation of AA2G and vitamin C for 5 days
  • Figure 6b is a MSC cultured in a medium containing different concentrations of AA2G Photograph showing cell morphological characteristics.
  • Figure 7 shows the effect of AA2G on the surface protein phenotype of MSC
  • Figure 7a is a histogram showing the results of FACSC flow cytometry analysis of MSC and blood markers
  • Figure 7b is a photograph of observation of the degree of bone differentiation by Alizarin Red staining
  • Figure 7c is a photograph observing the degree of chondrocyte differentiation by staining Alcian Blue
  • FIG. 8 is a result of observing colony forming activity of MSC by treatment with AA2G
  • FIG. 8A is a colony photograph
  • FIG. 8B is a graph showing the change of colony (CFU-F).
  • FIG. 9 is a result showing the enhanced mobility of the MSC maintained in AG supplement medium
  • Figure 9a is a photograph showing the degree of migration
  • Figure 9b is a graph showing the fold change.
  • FIG. 10 is a result of considering the effect of AA2G treatment to enhance PDGF signaling activity
  • Figure 10a is a graph of the cytogram analysis results
  • Figure 10b is a Western blot results photograph.
  • FIG. 11 is a histological picture showing the effect of AA2G improving the therapeutic effect of MSC in an allergic asthma model of mice.
  • FIG. 12 shows the effect of transplanting bone marrow-derived MSC 1 ⁇ 10 5 cells cultured with LPS-induced IC / BPS rat model in normal and AA2G supplemented cultures (Sham: control; LPS: LPS-induced).
  • IVP intravesical pressure
  • IAP intraabdominal pressure
  • urinary volume urinary volume
  • FIG. 12C is a graph showing micturition pressure (MP) measured in each group
  • FIG. 12D is a graph showing a micturition interval (MI) measured in each group
  • 12E shows the micturition volume (MV) measured in each group Is a graph
  • Figure 12f is a graph that represents the bladder capacity (BC, bladder capacity) measurement in each group
  • Figure 12g is a graph showing the non-voiding contractions (NVC, non-voiding contraction) measured in each group.
  • stem cell refers to a cell that can proliferate in an undifferentiated state as an undifferentiated biological cell capable of differentiating into a specific cell. These stem cells are characterized by having a pluripotency capable of differentiating into a variety of cells, embryonic-derived “embryonic stem cells (ESC) with totipotency capable of forming an individual.
  • ESC embryonic-derived embryonic stem cells
  • the "embryonic stem cell” is a fertilized egg combined with an egg and sperm to become a fertilized egg, and the fertilized egg, which starts with one cell, becomes a blastocyst composed of several cells through cell division, and a cell derived from an inner cell mass formed inside the blastocyst. They have the ability to differentiate into cells of all tissues in one individual, such as blood, bones, skin and liver.
  • the "adult stem cells” refers to undifferentiated cells that can be amplified by somatic cell division in order to replace dead cells and regenerate damaged tissues after development, including neural stem cells, hematopoietic stem cells, and mesenchymal stem cells.
  • Endothelial stem cells and the like. These adult stem cells, although more differentiated than the embryonic stem cells, may be differentiated into cells of a different line of origin, which is called trasndifferentiation or plasticity. Since adult stem cells are stable in differentiation and are unlikely to have cancer cells, they have already reached the stage of clinical application, and unlike embryonic stem cells, there is no ethical problem because there is no destruction of fertilized eggs. It has a disadvantage of being difficult to culture.
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • pluripotent stem cell refers to a unipotency that can differentiate into one cell depending on its differentiation capacity, a multipotency that can differentiate into several cell types, and all tissues. It can be divided into pluripotency stem cells that can differentiate into cells, etc. Among them, it refers to representative pluripotent stem cells, which include embryonic stem cells (ESC) and induced pluripotent stem cells. Cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs) are highly valuable for regenerative medicine because they have the ability to proliferate indefinitely and remain differentiated to all cells of the human body while maintaining their undifferentiated state. It is recognized. In addition, as the induced pluripotent stem cells emerge as the best alternative to solve the ethical problem of using the egg, which is a problem of embryonic stem cells, the recognition of the importance of pluripotent stem cell research has been heightened.
  • ESC embryonic stem cells
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • teratoma cancer cell refers to a tumor cell that is caused by a teratoma, pluripotent germ cells that can be differentiated into other forms, usually male testes, female ovaries, Occurs in the child's sacrum.
  • the teratomas are often formed of tissues unrelated to the surrounding cells. For example, teratomas occurring in the ovary are known to develop into hair and teeth.
  • DNA methylation is a biochemical process that is very important for the development of higher organisms.
  • the methyl group is added to the 5th position of the pyrimidine ring of cytosine or to the number 6 nitrogen of the purine ring of adenine. It means to include to do.
  • the change can be inherited through cell differentiation.
  • the DNA methylation is crucial for general organismal evolution and cellular variation, and disappears in the process of zygote production by stably changing the gene phenotype in the cell, and is regenerated through subsequent cell differentiation in the expression process.
  • hydroxylation is more about hydroxylation than the disappearance of methyl groups in the conjugate.
  • DNA methylation changes that control some gene phenotypes can be inherited and are called epigenetic control.
  • DNA methylation also plays a very important role in the expression of almost all types of cancer and DNA methylation at position 5 of cytosine has a particular effect of reducing genotyping and has been found in all vertebrates tested.
  • DNA methylation typically occurs in the CpG dinucleotide state and non-CpG methylation occurs mainly in fetal stem cells.
  • the DNA methylation is also used as a primitive immune system in bacteria, and their genome is methylated to prevent recognition by restriction enzymes, and the DNA of unmethylated phage invaded from the outside is recognized and degraded.
  • the nucleotide that is the target of DNA methylation is cytosine, and only the cytosine of CpG dinucleotide is the target of DNA methylation.
  • enzymes that mediate DNA methylation are Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b. Of these, Dnmt3a and 3b are enzymes responsible for de novo methylation, and Dnmt1 is an enzyme responsible for maintenance methylation.
  • the donor of the methyl group is S-adenosyl methionine (SAM), which receives the methyl group from the SAM and methylates it at the carbon position 5 of the cytosine to form 5-methyl cytosine.
  • SAM S-adenosyl methionine
  • Neonatal methylation refers to new methylation of the cytosine at the CpG site without methylation to form methyl cytosine.
  • CpG sites in newly formed newborn DNA strands are not methylated during DNA replication. If there is methylation at the CpG site of the existing strand, the methylation at the corresponding CpG site of the new strand is called conservative methylation.
  • Tet enzyme refers to an enzyme that regulates DNA methylation by converting 5mC (5-methylcytosine) to 5hmC (5-hydroxymethylcytosine).
  • vitamin C acts as a coenzyme of the Tet-based enzyme, and it was confirmed that it is a regulator that directly affects Tet activity through experiments using mouse embryonic stem cells that can be cultured in the absence of vitamin C. When vitamin C was added to the cell culture, the content of 5hmC was increased and demethylation of various gene promoters occurred. Remodeling of DNA methylation and gene expression patterns was similar to DNA methylation occurring in the inner cell population of early embryos (Kathryn, B., et al., Nature Letter, 500: 222-226, 2013).
  • epigenetics properties refers to the regulation of epigenetic gene expression, which is the regulation of gene expression that occurs without changing the DNA sequence.
  • the molecular level that mediates gene expression is not yet complete, but there are two mechanisms for the change in chromatin structure regulated by DNA methylation and histone modifications that are specific for cytosine bases in the CpG sequence. It is known to play a major role.
  • the epigenetic gene is related to cell differentiation, in which an individual starting from one fertilized egg is composed of cells having various functions through the development process, and understands epigenetic gene expression regulation as a mechanism of cell differentiation.
  • a stem cell culture medium composition comprising ascorbic acid 2-glucoside (hereinafter, abbreviated as 'AA2G') as an active ingredient.
  • the stem cells may be embryonic stem cells or adult stem cells, the adult stem cells are hematopoietic stem cells, mammary stem cells, intestinal stem cells, epithelial stem cells, neural stem cells, or mesenchymal Stem cells.
  • the AA2G may be included in a concentration of 50 to 1,000 ⁇ g / ml, a concentration of 100 to 750 ⁇ g / ml, or a concentration of 200 to 500 ⁇ g / ml.
  • the stem cells are embryonic stem cells, 1 to 3 mM L- glutamine, 10 to 30 mM HEPES, MEM non-essential amino acids, 0.05 to 0.2 mM beta-macaptoethanol, 10 to 20% heat High glucose containing DMEM medium comprising activated fetal calf serum, 50-150 IU / ml ESGRO / LIF, antibiotics and 0.1-5.0 mM AA2G.
  • the stem cells are adult stem cells, 1 to 3 mM L- glutamine, 10 to 30 mM HEPES (pH 7.3), MEM non-essential amino acid solution, 10 to 20% heat-inactivated fetal bovine serum Low, comprising 2-8 ng / mL human epidermal growth factor, 5-15 ng / mL basic fibroblast growth factor, 25-75 ⁇ g / mL insulin-like growth factor-1, antibiotic and 0.1-5 mM AA2G Glucose DMEM medium.
  • a medium composition for inducing differentiated pluripotent stem cells comprising ascorbic acid 2-glucoside (hereinafter, abbreviated as 'AA2G') as an active ingredient.
  • the AA2G may be included in a concentration of 50 to 1,000 ⁇ g / ml, a concentration of 100 to 750 ⁇ g / ml, or a concentration of 200 to 500 ⁇ g / ml.
  • High glucose-containing DMEM medium containing non-essential amino acids, 0.05-0.2 mM beta-macaptoethanol, 10-20% heat-inactivated fetal bovine serum, 50-150 IU / ml ESGRO / LIF, antibiotics and 0.1-5.0 mM AA2G Can be.
  • the method comprising the step of culturing stem cells in a culture medium containing ascorbic acid 2-glucoside (AA2G), the pluripotency of the stem cells, maintaining the differentiation capacity and the proliferation capacity culture method to provide.
  • a culture medium containing ascorbic acid 2-glucoside (AA2G) containing ascorbic acid 2-glucoside (AA2G)
  • the pluripotency of the stem cells maintaining the differentiation capacity and the proliferation capacity culture method to provide.
  • the stem cells may be embryonic stem cells or adult stem cells, the adult stem cells are hematopoietic stem cells, mammary stem cells, intestinal stem cells, epithelial stem cells, neural stem cells Or mesenchymal stem cells.
  • the AA2G may be treated in a concentration of 50 to 1,000 ⁇ g / ml, 100 to 750 ⁇ g / ml, or 200 to 500 ⁇ g / ml in the culture medium.
  • the culture method of maintaining the differentiation capacity and enhanced proliferation capacity of the stem cells it is characterized by expressing protein transcription factors such as Oct4, Sox2, cMyc, Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt31.
  • protein transcription factors such as Oct4, Sox2, cMyc, Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt31.
  • a cell therapy agent comprising stem cells treated with AA2G as an active ingredient.
  • the stem cells may be embryonic stem cells, adult stem cells or induced differentiated pluripotent stem cells.
  • the cell therapy may be used for the treatment of degenerative or damaging diseases such as asthma, degenerative arthritis, rheumatic diseases, neurological damage, muscular dystrophy, stroke, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, osteoporosis, or macular degeneration.
  • degenerative or damaging diseases such as asthma, degenerative arthritis, rheumatic diseases, neurological damage, muscular dystrophy, stroke, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, osteoporosis, or macular degeneration.
  • a pharmaceutical composition for treating asthma comprising stem cells treated with AA2G as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating cystitis containing stem cells treated with AA2G as an active ingredient is provided.
  • composition may further comprise a pharmaceutically acceptable adjuvant, excipient or diluent in addition to the carrier.
  • the term "pharmaceutically acceptable” refers to a physiologically acceptable and, when administered to a human, typically does not cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions according to one embodiment of the invention can be administered by a variety of routes, for example, oral, parenteral, for example suppositories, transdermal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, nasal, intradermal, It may be administered by intrathecal administration and may also be administered using a sustained release or implantable device for continuous or repeated release.
  • the frequency of administration can be administered once a day or divided into several times within the desired range, the administration period is not particularly limited.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention may be administered by general systemic administration or topical administration, such as intramuscular injection or intravenous injection, but most preferably, may be injected using an electroporator.
  • the electroporator may be a commercially available electroporator for injecting DNA drugs, such as Glinporator TM of IGEA, Italy, CUY21EDIT of JCBIO of Korea, SP-4a of Supertech of Switzerland, and the like.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention may be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Such route of administration may be, but is not limited to, parenteral administration, eg, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intravitreal administration.
  • compositions according to one embodiment of the invention may be formulated in a suitable form with a pharmaceutically acceptable carrier generally used.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, water, suitable oils, saline, carriers for parenteral administration such as aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • compositions according to the present invention if necessary according to the administration method or dosage form, suspensions, dissolution aids, stabilizers, isotonic agents, preservatives, adsorption agents, surfactants, diluents, excipients, pH adjusters, analgesics, buffers, Antioxidant etc. can be contained suitably.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition.
  • the dosage of the cell therapy agent or the pharmaceutical composition according to the embodiment of the present invention is 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 109 cells / kg (body weight), more preferably 1.0 ⁇ 10 6 to based on the stem cells. It may be 1.0 ⁇ 10 8 cells / kg body weight.
  • the dosage may be variously prescribed by such factors as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient. If so, these factors can be taken into account to properly adjust the dosage.
  • the number of administrations may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or more than two sites for the administration site.
  • the above dosages are converted to the same dosage as humans per kg, or the volume ratio (for example, average value) of the ischemic organ (heart) between the animal of interest and humans is converted to the above dosage.
  • One dose may be administered.
  • the animal to be treated according to the present invention include humans and mammals for other purposes, and specifically include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, and the like. do.
  • Mouse R1 ESCs (provided by Dr. Broxmeyer of Indiana Medical University) embryonic stem cells were treated with 2 mM el-glutamine (Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM non-essential amino acid solution on a 0.1% gelatin (Sigma, USA) coated tissue culture dish. , 1% penicillin / streptomycin solution (Cellgro, USA), 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol (Sigma, USA), 15% heat-inactivated FBS (Hyclone, USA) and 100 IU / ml ESGRO / LIF (Upstae- Millipore, USA) was grown in DMEM-high glucose medium.
  • NTERA-2 Human teratoma cell line
  • DMEM-high glucose medium supplemented with 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, MEM non-essential amino acid solution, penicillin / streptomycin solution, and 10% heat-inactivated FBS. It was. After treatment with the indicated concentrations of AA2G or vitamin C (Vit C), cell activity was determined by the MTT assay kit (Sigma, USA) according to the manufacturer's protocol. Reduction of the MTT indicator was quantified after 4 hours by measuring absorbance at 570 nm with a microplate spectrophotometer (Molecular Devices, USA).
  • Pluripotency of the cultured stem cells was monitored using an alkaline phosphatase (AP) detection kit (Upstate-Millipore, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • AP alkaline phosphatase
  • DNA (1 mg per sample) was isolated and denatured in 0.1 M NaOH for 10 minutes at 95 uC.
  • the prepared samples were neutralized with 1 M NH 4 OAc on ice and then diluted twice in sequential order.
  • the DNA samples were spotted on nitrocellulose membranes using a Bio-Rad, USA.
  • the blotted membrane was washed with SSC buffer, dried at 80 uC for 5 minutes and UV crosslinked at 120,000 mJ cm. The membrane was then blocked with Odyssey buffer (Li-Cor, USA) diluted overnight at 4 ° C. with phosphate buffer.
  • the 5hmC-modified DNA was concentrated in a Hydroxymethyl Collector TM Kit (Active Motif's, USA) using 1 ⁇ g of genomic DNA segmented using Mse I restriction enzyme according to the manufacturer's instructions.
  • the DNA hydroxymethylation status of the individual loci was pull-downed 5-hydroxymethylation using iQ TM SYBR Green PCR Master Mix (Bio Rad, USA) and PikoReal system (Thermo Scientific, USA).
  • RQ-PCR quantitative real-time PCR
  • RNA levels of target genes were performed as previously described (Shin et al ., Leukemia ., 24: 1450-1461, 2009).
  • Total RNA (50 ng) was reverse transcribed using Taqman reverse transcription reagent (Applied Biosystems, USA) and threshold ( Ct ) was determined sequentially using RQ-PCR as previously described (Shin et al ., Leukemia , 24: 1450-1461, 2009).
  • Relative expression levels of the target genes were determined using the 2 - ⁇ Ct method, and GAPDH was used as an endogenous control gene.
  • Mouse embryonic fibroblasts obtained from Oct4-GFP mice carrying an IRES-EGFP fusion cassette linked downstream of the stop codon of the Oct4 (Pou5f1) gene as described previously were isolated from FUW-SOKM lentiviral ( (Provided by Professor Kim Jong-pil from Dongguk University) was transduced in a 24-well culture dish in two passages (Takahashi et al ., Nature Protocols, 2: 3081-3089, 2007).
  • MEF cells were cultured in MEF culture medium (high glucose DMEM medium containing 10% heat-inactivated FBS and 1% penicillin / streptomycin solution (Cellgro, USA)) supplemented with 0.74 mM AA2G until day 0 and day 1 of transduction.
  • MEF culture medium high glucose DMEM medium containing 10% heat-inactivated FBS and 1% penicillin / streptomycin solution (Cellgro, USA)
  • embryonic stem cell culture medium (2 mM el-glutamine (Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM non-essential amino acid solution, 1% penicillin / streptomycin solution (Cellgro, USA), 0.1 mM ⁇
  • embryonic stem cell culture medium (2 mM el-glutamine (Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM non-essential amino acid solution, 1% penicillin / streptomycin solution (Cellgro, USA), 0.1 mM ⁇
  • FBS Hexe, USA
  • 100 IU / ml ESGRO / LIF DMEM-high glucose medium supplemented with Upstae-Millipore, USA Hold for 2 days.
  • AP staining of the established iPSC colonies was performed 21 days after transformation.
  • BM Human bone marrow (BM) derived from mesenchymal stem cells (MSCs) was purchased commercially (Lonza, USA) and 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES (pH) in an atmosphere that was absorbed with 5% CO 2 at 37 ° C.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • MEM non-essential amino acid solution penicillin / streptomycin (Cellgro USA), 1 ⁇ g / mL ascorbic acid (Sigma, USA), 15% heat-inactivated FBS (Hyclone, USA), 5 ng / mL human Were grown in DMEM-low glucose medium (Hyclone, USA) supplemented with epidermal growth factor, 10 ng / mL basal fibroblast growth factor, and 50 ⁇ g / mL long R3-insulin-like growth factor-1 (Prospec, Israel) .
  • the MSC was used to multiply up to four passages to ensure multipotency.
  • the cells were human CD14, CD34, CD45, HLA-DR (FITC; BD Biosciences), CD44, CD73, CD105, CD166, and PDGFR-A (PE; BD Pharmingen, Los Angeles, CA), etc., each stained for 15 minutes at room temperature.
  • Corresponding mouse isotype antibodies were used as controls.
  • the cells stained with single color were washed with PBS and fixed with 1% (v / v) paraformaldehyde.
  • the MSC immunotypes were determined by flow cytometry on FACSCaliuer (BD Biosciences, USA), and the percentage of expressing cell surface antigens was calculated for 10,000 gated cell numbers.
  • adipose tissue differentiation In vitro differentiation into osteogenic, chondrogenic, or adipose tissue series was performed as previously reported (Jin et al ., Antioxid Redox Signal , 24 (9): 471-485, 2016). Briefly, cells were maintained in normal growth medium to differentiate adipose tissue differentiation (DMEM supplemented with 5% FBS, 1 ⁇ M dexamethasone, 10 ⁇ M insulin, 200 ⁇ M indomethacin, and 0.5 mM isobutylmethylxanthine), bone tissue differentiation It was incubated with - (ascorbate-2-phosphate, 0.1 ⁇ M dexamethasone, and 10 mM glycero-phosphate in a DMEM supplemented with 5% FBS, 50 ⁇ M El), or StemPro ® cartilage differentiation medium (Invitrogen, USA) medium. Adipose tissue differentiation is characterized by the accumulation of intercellular lipids, which can be visualized by oil red
  • the cell proliferation was determined using an MTT assay kit (Sigma, USA) following treatment with AA2G or vitamin C at the indicated concentrations according to the manufacturer's protocol. Reduction of the MTT reagent was quantified by measuring absorbance at 570 nm using a microplate spectrophotometer (Molecular Devices, USA) after 4 hours of treatment. In addition, for CFU-F analysis, five levels of MSC were treated with AA2G or vitamin C concentrations indicated and cells were rearranged in clone density (60 cells per well) in a 6-well culture dish and then for 14 days. The cells were cultured in hCB-MSC medium. The established colonies were washed twice with PBS and fixed and stained with 0.5% crystal violet (Sigma, USA).
  • the cells remaining in the upper chamber were wiped with cotton wool, and the cells migrated across the membrane were fixed with PBS solution in which 4% paraformaldehyde (PFA) was dissolved and stained with 0.5% crystal violet (Sigma, USA). Stained cells on the underside of the membrane were quantified by digital image analysis using Image Pro 5.0 software (Media-Cybernetics, Rockville, MD).
  • MSC was fasted for 1 day in DMEM containing 0.5% BSA at 37 ° C. and stimulated with PDGF-AA at the indicated concentration for 5 or 10 minutes, followed by protease and phosphatase inhibitors (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, It was placed in RIPA digestion buffer containing CA) and digested on ice for 30 minutes.
  • the cell extract (30 ⁇ g) was isolated using a 12% SDS-PAGE gel and analyzed for the degree of phosphorylation of MAPKp42 / 44 and AKT (Ser473) (Cell Signaling Technology, USA). Equivalent loading was confirmed using monoclonal or polyclonal antibodies against MAPKp44 / 42 and total Cell Signaling Technology (AKT).
  • mice 6-week-old BALB / c mice (OientBio, Gapyeong, Gyeonggi-do, Korea) were 75 ⁇ g OVA on days 0, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 22, and 23. (Sigma, USA) and 10 ⁇ g polyI: C (Calbiochem, USA) were sensitized by intranasal administration to cause disorders. The mice received 3 ⁇ 10 5 MSCs by intravenous injection on day 15. BALF, lymph nodes, and lung tissue were obtained from mice 24 hours after the last immunization.
  • the number of monosites, basophils, neutrophils, and lymphocytes and the concentrations of IL-8 and IL-10 in BALF were measured as previously described (Jin et al ., Antioxid Redox Signal , 24 (9): 471-485, 2016; Bang et al ., Am. J. Respir . Cell Mol . Biol . 50 (6): 1021-1030, 2014).
  • 5 ml PBS was perfused through the right ventricle to the lungs and 1 ml PBS was inflated through the bronchus.
  • the injected expanded lungs were fixed by soaking in 10% neutral buffered formalin solution for 24 hours.
  • the immobilized lung tissue was embedded in paraffin and sectioned to 4 ⁇ m thickness to test the magnitude of inflammation in the bronchial and perivascular regions by hematoxylin and eosin staining.
  • Implantation of the injected MSCs was determined by immunofluorescence analysis of human ⁇ 2-microglobulin (ab15976; Abcam, USA) and visualized using FITC-labeled secondary antibody. Nuclei were relatively stained using 4'-6-diamino-2-phenylindole (DAPI; Sigam, USA).
  • LPS lipopolysaccharide
  • IC / BPS interstitial-cystitis / bladder pain syndrome
  • PS / LPS protamine sulfate / lipopoly
  • cystometrogram Bladder breakdown voltage chart
  • Bladder tomography was performed in unanesthetized and unsuppressed rats in metabolic cages. Simultaneous catheterization was performed for 3 days prior to bladder pressure measurement as reported previously for the recording of intravesical pressure (IVP) and intraabdominal pressure (IAP) (Lee, T. & Yoon, SM). Int . Neurourol . J. 17: 44-47, 2013); Jin, LH et al. Int. Neurourol . J. 14: 54-60, 2010).
  • IVP intravesical pressure
  • IAP intraabdominal pressure
  • the bladder is inflated with a PE-50 catheter (Clay Adams, Parsippany,) connected to a pressure grade transducer (Harvard Apparatus, Holliston, Mass., USA) and a microinjection pump (PHD22 / 2000 pump; NJ).
  • the urinary volume (MV) was continuously recorded by a fluid collection tube connected to a Research Grade Isometric Transducer (Harvard Apparatus), where sterile saline was injected into the bladder at about 0.4 ml / min.
  • IVP, IAP and MV were continuously recorded using Acq Knowledge 3.8.1 software and MP150 data acquisition system (Biopac Systems, Goleta, CA, USA) at a sampling rate of 50 Hz.
  • Non-voiding contraction was calculated when the increase in IVP exceeded 2 cm H 2 O from baseline without urination.
  • Bladder basal pressure (BP) is the lowest bladder pressure during bladder filling
  • micturition pressure (MP) is the maximum bladder pressure during the urination cycle
  • MV micturition volume It is the volume of urine
  • RV residual volume
  • BA Bladder capacity
  • MI micturition interval
  • Example 1 In the proliferation of mouse and human pluripotent stem cells Ascoville Effect of Glucosides (AG)
  • NTERA2 human teratocarcinoma
  • mESC mouse embryonic stem cells
  • mice embryonic stem cells 2 mM L-glutamine (Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM non-essential amino acid solution, penicillin / streptomycin solution (Cellgro, USA), DMEM-high glucose supplemented with 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol (Sigma, USA), 15% heat-inactivated FBS (Hyclone, USA) and 100 IU / ml ESGRO / LIF (Upstae-Millipore, USA) Medium, and vitamin C in DMEM-high glucose medium supplemented with 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, MEM non-essential amino acid solution, penicillin / streptomycin solution, and 10% heat-inactivated FBS for human teratocarcinoma cell lines And AA2G at 0, 0.185, 0.37, 0.74 and 1.48 mM, respectively.
  • AA2G 20 mg / ml
  • AA2G 20 mg / ml
  • the cell morphology was observed under a microscope.
  • Prepared mESC cells were stained with infrared dye (BRA-12, Swiss) at a predetermined temperature and temperature for 1 hour with a dye concentration of 1 ⁇ 10 -3 M salt solution, in which a solvent was added to acetophenone (AP).
  • the buffer was used to keep the pH of the salt bath constant at 5.5.
  • alkaline phosphatase (AP) staining was performed to confirm that mESCs remain undifferentiated as stem cells.
  • each pluripotent stem cell specific transcription factor protein (Oct4, Sox2, Nanog, Tfcp2l1, Dumt31, and ⁇ Actin) were reacted with specific rabbit-antibodies, respectively.
  • HRP binding-anti-rabbit IgG secondary antibody washed three times with TBST buffer for 10 minutes and developed with O-mat AR film (Kodak) using ECL kit (Amersham, USA). It was. At this time, ⁇ -actin was used as an endogenous protein.
  • the present inventors expressed mRNA expression relative to pluripotent stem cell specific transcription factors Oct4, Sox2, cMyc (core factors) and Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt3l (new state factors).
  • the amount was measured by qPCR method.
  • the mRNA was isolated from cells cultured using Qiagen RNeasy on a DNase I treated column and cDNA was synthesized from 1 ⁇ g of RNA using random hexamers.
  • the synthesized cDNA as a template was subjected to real-time low amount PCR as described above.
  • Example 4-1 In order to quantitatively verify the result of Example 4-1, the amount of 5 hydroxymethyl cytosine (5hmC), a DNA demethylation marker, is increased in mESC cultured in a medium containing AA2G. After extracting genomic DNA from cells cultured in the medium under the same conditions as in Example 4-1, blotting the serially diluted gDNA from 100 ng gDNA by a dot blot apparatus and immunoblotting using 5hmC specific antibody. The amount was measured through two independent tests.
  • 5hmC 5 hydroxymethyl cytosine
  • AA2G As a result, as shown in Figure 4b, it can be seen that the same as the result of Example 4-1, 5 hmC, which is an indicator of the activity of the demethylase, increased depending on AA2G concentration. Therefore, AA2G according to an embodiment of the present invention suggests that the stem cell culture can induce enhanced pluripotency of stem cells.
  • the inventors concentrated the 5hmC-modified DNA into Hydroxymethyl Collector TM Kit (Active Motif's, USA) using 1 ⁇ g of genomic DNA fragmented using Mse I restriction enzyme according to the manufacturer's instructions.
  • the DNA hydroxymethylation status of the individual loci was pulled down using the iQ TM SYBR Green PCR Master Mix (Bio Rad, USA) and PikoReal System (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA). Quantification using quantitative real time PCR (RQ-PCR) on oxymethylated DNA. The enrichment was calculated as the ratio of bound amplifier fraction to unbound amplifier and expressed as mean ⁇ SEM ⁇ 4 independent experiments (see FIG. 4C).
  • the inventors of the present inventors conducted qRT-PCR analysis on embryonic stem cells treated with AA2G, and the expression of Tet and Dnmt, which are enzymes that mediate DNA demethylation, is increased by demethylation of DNA by AA2G.
  • the purpose of this study was to analyze the increase.
  • AA2G enhanced the effect of iPSC reprogramming similarly to vitamin C (see FIG. 5A).
  • the change in the SOKM + AA2G (0.74 mM) colony portion was approximately three times stronger.
  • the same phenomenon was shown in a graph in which the AP stained colonies were relatively counted (see FIG. 5B).
  • the iPSC colony added with GFP was reprogrammed in a state similar to that of embryonic stem cells twice, and the change in the colony part was approximately 5 times stronger (see FIG. 5C).
  • iPSC-induced mouse embryonic fibroblasts genetically engineered to express GFP in association with Oct-4 a stem cell marker
  • AA2G treatment resulted in a significant increase in the number of GFP-expressing cells compared to untreated AA2G controls ( See FIG. 5D).
  • Human MSCs were seeded at a density of 500 or 1000 cell / ml and then treated with AA2G or vitamin C at concentrations of 0.185, 0.37, 0.74, and 1.48 mM while incubating for 5 days. MTT analysis was then performed to observe relative cell proliferation for 5 days.
  • Example 7 Influence of AA2G Medium on MSC
  • CFU-F assays were performed by re-plating the same density into 6-well culture plates (60 cells per well). Additional culture was carried out for 14 days in medium containing 0.37, 0.74 and 1.47 mM AA2G. The resulting colonies were washed twice with PBS, fixed and stained with 0.5% crystal violet.
  • CFU-F cloned profiitor clonal fibroblast colony-forming units
  • the inventors of the present invention also described tissue culture vessels with Cell Biolabs CytoSelect TM Cell Migration Assay Kit while increasing AA2G concentrations to 0.37, 0.74, and 1.48 mM to investigate the migration activity of mesenchymal stem cells (MSCs) maintained in AG supplement medium.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • FIG. 9A the effect of the concentration of AA2G at the x100 and x200 magnification of the microscope was examined.
  • the degree of migration relative to the degree of migration of AA2G untreated cells was measured (see FIG. 9B).
  • the present inventors performed flow cytometry and Western blot analysis to analyze the correlation between AA2G and PDGF signaling from the results of Example 9.
  • human MSC treated with 2.5 ng / ml PDGF-AA was treated with 0, 0.37, 0.74 and 1.48 mM of AA2G, and then subjected to flow cytometry by gating against PDGFR ⁇ using an anti-PDGFR ⁇ antibody.
  • IgG-FITC was used as a control.
  • Figure 10a in the case of human MSC cultured in a general medium, the frequency of cells expressing PDGFR ⁇ to the extracellular surface is very rare (0.07%), while cultured in a medium containing 0.37 mM AA2G Human MSC confirmed that the frequency of cells expressing PDGFR ⁇ increased significantly to 15.9% of the total.
  • the present inventors treated human MSCs treated with 2.5 ng / ml PDGF-AA with 0, 0.37 and 0.74 mM AA2G, and then disrupted the cells to form p-MAPKp44 / p42, PDGF signaling proteins present therein.
  • the expression levels of MAPKp44 / p42, p-Akt and Akt were analyzed by Western blot analysis.
  • Example 11 Effect of AA2G on improving the therapeutic effect of MSC in mouse allergic asthma model
  • Typical asthma lung tissue shows damage to the endobronchial epithelial layer and narrows the airway area due to thickening
  • naive MSC and AA2G treated MSCs have a narrow airway area due to endobronchial layer damage and thickening in the bronchioles.
  • Loss has been shown to significantly inhibit pathological structural changes.
  • AA2G-treated MSCs showed a better degree of symptom improvement compared to non-contact MSCs. This shows that the stem cells proliferated using AA2G of the present invention can be very useful as a cell therapy.
  • Example 12 M- MSc By IC / BPS and KC In vivo ( in vivo Treatment effect
  • sham rats and the IC / BPS rat model were treated with LPS-treated LPS-treated groups and non-contacted stem cell (MSC) -treated groups treated with 1 ⁇ 10 5 cells of AA2G-treated mesenchymal stem cells (AA2G ( -) 100K) and AA2G stem cells treated with AA2G treated AA2G stem cells treated with 1X10 5 cells (AA2G (+) 100K) was measured over time bladder pressure, intraperitoneal pressure and urination volume, As shown in Figure 12a, the AA2G treated mesenchymal stem cell treated group according to an embodiment of the present invention showed an aspect close to the sham, a non-disease model, while the AA2G untreated mesenchymal
  • the AA2G treated stem cell treated group according to an embodiment of the present invention showed a value close to sham, which is a non-animal model, whereas the AA2G untreated stem cell treated group improved the degree of the present invention. Results below the AA2G treated stem cell treatment group.
  • stem cells cultured with AA2G-added cultures significantly improved various urination activity indexes compared to the stem cells cultured with normal cultures.
  • MSC obtained from the culture medium to which AA2G was added was found to have a remarkable effect in the prevention or treatment of interstitial cystitis induced by LPS injection.
  • Stem cell culture medium composition according to an embodiment of the present invention can be used for the production of a cell therapy and stem cells cultured by the medium composition can be used in medicine. Therefore, the present invention can be utilized in the pharmaceutical industry.

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Abstract

본 발명은 배지조성물 및 배양방법에 관한 것으로서, 효능을 강화시킨 기능성을 가진 줄기세포 배양용 배지조성물 및 이를 이용한 줄기세포 배양방법으로 유도체(derivative)인 AA2G를 포함한 배양액을 통하여 배아줄기세포의 전분화능/만능성 강화와 역분화 줄기세포 효율 증대를 일차적으로 검증하고, 이를 다양한 성체줄기세포 기능성 강화 배지 개발로 활용하고자 하는 데에 목적이 있다.

Description

줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법
배지조성물 및 배양방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 줄기세포 배양용 배지조성물 및 이를 이용한 줄기세포 배양방법에 관한 것이다.
줄기세포는 인체를 구성하는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는 세포로 미분화된 세포를 계속 재생할 수 있는 자가 재생능력(self-renewal)과 특정 세포로 분화(differentiation)할 수 있는 능력을 동시에 가지고 있는 것이 가장 큰 특징이라 할 수 있다.
상기 줄기세포는 분류 기준에 따라서 다양한 세포군들이 존재하는데, 크게 조직 기원에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 나뉜다. 상기의 배아줄기세포는 우리 인체를 구성하는 260 여종의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능/만능성(pluripotency)를 가지고 있어서 재생의료(regenerative medicine)에서 가장 중요한 세포로 인식되고 있으며, 전 세계적으로 만능성 강화 및 조절에 관한 핵심 원천 기술 개발 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다(Yoon, B.S. and You, S., J Korean Med Assoc., 54(5):502-510, 2011).
상기 배아줄기세포는 세포학적 특징으로 둥근 돔 구조(round dome)의 군집체(colony)를 형성하면서 배양되고 미분화된 세포일수록 보다 밀도가 높은 조밀하고 깨끗한 경계선을 가진 군집체를 형성한다. 또한, 미분화된 배아 줄기세포 군집체는 알칼라인 포스파타제(AP) 염색이 되며, 따라서 AP 염색은 전분화능/만능성 줄기세포 판별의 주요지표로 사용되고 있다. 또한, 상기 배아줄기세포는 만능성을 유지하기 위하여 특이적인 전자인자(transcription factors)를 발현하고 있으며, OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, CMYC, REX1, TFCP21L 등이 이에 속한다. 이러한 전자 인자들의 중요성은 이들을 과다 발현하여 분화된 세포를 배아줄기세포와 유사한 세포로 역분화 시키는 역분화 줄기세포 확립 기술로 명백하게 증명되어 있다. 특히, 상기 배아줄기세포는 특이적 후성유전체학적(epigenetic) 특징을 나타내고 있는데, 분화를 조절하는 Hox 도메인(domain) 전사인자들의 조절 부위에 두 가지 서로 다른 히스톤 단백질 변형을 동시에 유지하는 이가성 도메인(bivalent domain)이 있으며, DNA 메틸화(DNA methylation) 역시 최소 수준으로 유지되고 있다. 상기 기술한 배아줄기세포 특이적 후성유전체 특성(epigenetic signature)은 배아 줄기세포의 전분화능/만능성 유지와 신속한 계통 분화 결정 및 결정된 세포 운명을 안정적으로 유지하는 분자학적 기전의 근간을 이루며, 이를 통화여 줄기세포의 자가 재생능력과 분화능을 조절하게 된다.
최근 연구를 통하여, 비타민 C(vitamine C, VitC)을 배양액에 처리 할 경우, DNA 탈메틸화(DNA demethayltion)을 촉매하는 TET 효소들을 활성화여 DNA 메틸화를 최소 수준으로 유지하며, 이를 통하여 배아 줄기세포의 전분화능/만능성 강화 및 역분화 줄기세포 확립 효율 증대가 가능함이 입증되었다(Rahul, M. K. and Yi, Z., Nature, 502: 472-479, 2013). 또한, 미국등록특허 US7442548에서는 비타민 및 아미노산을 포함하는 배지에서 인간 배아줄기세포의 배양이 생산성이 높음을 개시하고 있다다. 그러나, VitC는 고농도에서 세포사멸(cell death)을 유도할 수 있으며 쉽게 산화되어 그 안정성(stability)이 저조한 한계점을 가지고 있다.
최근 연구에 의하면, 비타민 C를 배양액에 처리할 경우, 역분화 과정 중에 발생하는 p53 단백질 발현 증가에 의한 세포 노화를 억제하여, 마우스와 인간 세포로부터 역분화 줄기세포 확립 기술의 효율을 증가시킴이 입증된 바 있다(Miguel Angel Esteban, Cell Stem Cell, 71-79, 2010).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 줄기세포의 분화능/만능성을 강화시키고 줄기세포의 수율 증대를 위한 보다 효율적인 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 상기 목적에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, 이하, 'AA2G'로 약칭함)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 배아줄기세포를 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G)가 포함된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포의 만능성 강화, 분화능 유지 및 증식능력 강화 배양방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 방광염 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포 배양용 배지 조성물은 줄기세포의 만능성을 강화하고, 분화능을 유지할 뿐만 아니라 줄기세포의 증식능력을 증가시킬 수 있어, 줄기세포를 이용한 다양한 세포치료 분야에서 줄기세포에 의한 치료효과를 극대화시킬 수 있다. 그러나, 본 발명이 상술한 효과로 한정되는 것은 아니다.
도 1a는 마우스 배아줄기세포(mESC, 위)에 동일한 농도의 비타민 C와 AA2G를 포함한 배지에서 배양한 후 세포 증식능을 MTT 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 1b는 인간 배아줄기세포와 유사한 특성을 가진 암세포주인 인간 기형종암 세포주(teratocarcinoam, NTERA2)에 동일한 농도의 비타민 C와 AA2G를 포함한 배지에서 배양한 후 세포 증식능을 MTT 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 서로 다른 농도의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC의 세포 형태학적 특성을 나타낸 사진들로, 위상차 현미경으로 촬영한 사진(상단 및 중단)이고, 도 2b는 상기 도 2a의 세포들에 대하여 알칼라인 포스파타제(AP) 염색한 결과를 촬영한 사진(하단)이다.
도 3은 AA2G 포함된 배지에서 배양한 mESC에서 전분화능 관련 단백질의 발현량을 면역블롯팅한 결과를 나타낸 결과들로, 도 3a는 OCT4, NANOG, SOX2, TFCP2L1, Dnmt31, β-actin 전사 단백질들의 발현량을 각각 보여주는 사진이고, 도 3b는 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자들 mRNA의 발현량을 qPCR방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프로 핵심인자(좌)인 Oct4, Sox2, cMyc 및 신규 상태 인자(우)인 Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt31을 각기 보여준다,
도 4는 DNA 탈메틸화 표식인자 5hmC 수준의 분석결과들로써 도 4a는 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC의 형광도로 DNA 탈메틸화 표식인자인 5 hydroxy methyl Cytosine(5hmC)를 추가한 사진이고, 도 4b는 닷 블랏 분석 결과를 나타내며, 도 4c는 면역침강(IP)분석하여 5 mC와 비교한 IP-qPCR 그래프이고, 도 4d는 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 5 hmC를 풍부하게 한 유전자 발현 정도를 나타내는 그래프이며, 도 4e는 Tet DNA 탈메틸화 효소 및 Dnmts의 발현수준에 관한 AA2G의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 재프로그램하는 동안 AA2G 처리한 iPSC 군락의 증가한 수를 관찰한 결과로, 도 5a는 SOKM 및 AA2G와 대조군을 비교한 사진이고, 도 5b는 AP 염색한 군락락을 계수한 그래프이며, 도 5c는 충분히 재프로그램한 GFP+ iPSC 군락 형광사진이고, 도 5D는 GFP+ iPSC의 군락을 계수한 그래프이다.
도 6은 MSC의 증식에 관한 AA2G의 효과를 나타낸 것으로, 도 6a는 AA2G 및 비타민 C의 상대적인 증식을 5일 동안 관찰한 그래프이고, 도 6b는 서로 다른 농도의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC의 세포 형태학적 특성을 나타낸 사진이다.
도 7은 MSC의 표면단백질 표현형에 관한 AA2G의 영향을 나타낸 것으로서, 도 7a는 MSC 및 혈액마커들의 FACSC 유세포 분석한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7b는 Alizarin Red 염색을 하여 골 분화정도를 관찰한 사진이며, 도 7c는 Alcian Blue을 염색을 하여 연골세포 분화 정도를 관찰한 사진이다,
도 8은 AA2G의 처리로 MSC의 군락 형성 활성을 관찰한 결과들로서, 도 8a는 군락 사진이고, 도 8b는 군락의 변화(CFU-F)를 나타낸 그래프이다.
도 9는 AG 보충 배지에서 유지한 MSC의 이동 강화를 나타낸 결과들로서, 도 9a는 이동 정도를 나타낸 사진이고, 도 9b는 폴드 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 PDGF 신호활성을 강화하는 AA2G 처리의 영향을 고찰한 결과로서, 도 10a는 사이토그램 분석 결과 그래프이고, 도 10b는 웨스턴 블랏 결과 사진이다.
도 11은 마우스의 알러지성 천식 모델에서 MSC의 치료효과를 개선하는 AA2G의 영향을 나타낸 조직형상 사진이다.
도 12는 LPS로 유도된 IC/BPS 랫트 모델에 일반 배양액과 AA2G 첨가 배양액으로 배양한 골수 유래 MSC 1×105 세포를 이식한 경우의 효과를 나타낸 것으로서(Sham: 대조군; LPS: LPS로 유도된 IC/BPS 그룹, AA2G(-) 100K: IC/BPS 랫트에 일반 배양한 M-MSC를 주입한 그룹, AA2G(+) 100K: IC/BPS 랫트에 AA2G 첨가하여 배양한 M-MSC를 주입한 그룹), 도 12a는 각 그룹에서의 방광내압(intravesical pressure, IVP), 복강내압(intraabdominal pressure, IAP) 및 배뇨부피(micturition volume)을 측정한 결과이고, 도 12b는 는 각 그룹에서 측정된 최대 압력(Maximum pressure)을 나타내는 그래프이고, 도 12c는 각 그룹에서 측정된 배뇨압(MP, micturition pressure)을 나타내는 그래프이며, 도 12d는 각 그룹에서 측정된 배뇨간격(MI, micturition interval)을 나타내는 그래프이고, 도 12e는 각 그룹에서 측정된 배뇨량(MV, micturition volume)을 나타내는 그래프이며, 도 12f는 각 그룹에서 측정된 방광 용량(BC, bladder capacity)을 나타내는 그래프이고, 도 12g는 각 그룹에서 측정된 비배뇨 수축(NVC, non-voiding contraction)을 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 용어 "줄기세포(stem cell)"란 특정 세포로 분화할 수 있는 미분화된 생물학적 세포로서 미분화된 상태로 증식이 될 수 있는 세포를 의미한다. 이들 줄기세포는 다양한 세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotency)을 가지고 있는 것을 특징으로 하며, 개체를 형성할 수 있는 전능성(totipotency)을 가진 배아 유래의 "배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)"와 성체로부터 유래한 "성체줄기세포(adult stem cells, ASC)"로 구분할 수 있다. 상기 "배아줄기세포"는 난자와 정자가 결합하여 수정란이 된 후, 하나의 세포로 시작한 수정란은 세포분열을 통해 여러 개의 세포로 이루어진 배반포가 되며, 상기 배반포의 안쪽에는 형성된 내세포괴로부터 유래한 세포들로서, 혈액, 뼈, 피부, 간 등 한 개체에 있는 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 아울러, 상기 "성체줄기세포"는 발생 이후 죽은 세포를 대체하고 손상된 조직을 재생하기 위해 체세포 분열에 의해 증폭이 가능한 미분화된 세포를 의히하며, 여기에는 신경줄기세포, 조혈모 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 내피 줄기세포 등이 존재한다. 이들 성체줄기세포는 상기 배아 줄기세포보다는 분화능이 한정적이긴 하나, 기원과 다른 계통의 세포로 분화할 수도 있으며, 이를 교차분화(trasndifferentiation) 또는 가소성(plasticity)라고 한다. 성체 줄기세포는 분화가 안정적이어서 암세포 가능성이 없기 때문에, 이미 임상적 적용이 가능한 단계까지 왔으며, 배아줄기세포와는 다르게 수정란에 파괴가 없어서 윤리적으로도 문제가 되지 않는 반면, 얻을 수 있는 줄기세포수가 적고, 배양이 어렵다는 단점을 가지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "역분화 줄기세포(dedifferentiation stem cell)"는 이미 분화된 체세포에 외부에서 인위적인 자극을 주어 우리 몸을 이루 는 모든 기관의 세포로 분화 가능한 배아줄기세포와 비슷한 만능성(pluripotency)을 획득한 세포를 의미하며, 이런 취지로 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPCS)라고도 불리운다. 상기 iPSC의 핵심기술은 체세포에 역분화 유전자(Oct4, Sox2, klf4, C-myc, Nanog, 및 Lin28)를 도입하여 세포의 생물학적 특성을 배아줄기세포와 유사하게 만드는데 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "만능성 줄기세포"는 분화 능력에 따라 한 종류의 세포로 분화할 수 있는 단분화능(unipotency), 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다분화능(multipotency), 그리고 모든 조직세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotency) 줄기세포 등으로 나눌 수 있으며, 그 중 대표적인 만능성 줄기세포를 의미하며, 상기 만능성 줄기세포에는 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)와 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)가 있으며 이는 미분화 상태를 유지하면서 무한대로 자가 증식할 수 있는 능력과 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 분화능력을 가지고 있기 때문에 재생 의학적 활용에 있어 그 가치가 높이 인정되고 있다. 또한 상기 유도만능줄기세포가 배아줄기세포의 문제점인 난자 사용의 윤리적 문제 등을 해결하는 최고의 대안으로 떠오름에 따라 만능성 줄기세포 연구의 중요성에 대한 인식이 고조되었다.
본 문서에서 사용되는 용어 "기형종 암세포"는 기형종, 테라토마(teratoma)로 다른 형태로 분화가 가능한(pluripotent) 생식 세포에 의해서 발생하는 종양세포를 의미하며, 보통 남자의 정소, 여자의 난소, 아이의 천골에서 발생한다. 상기 기형종은 주변 세포와 관련없는 조직으로 형성되는 경우가 많은데, 예를 들어 난소에서 발생한 기형종은 체모와 치아로 발달하는 것으로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "DNA 메틸화(DNA methylation)"는 고등 생물의 발달에 매우 중요한 생화학적 과정으로 한 메틸기를 시토신의 피리미딘 고리 5번째 위치에 추가하거나 아데닌의 퓨린 고리의 숫자 6 질소에 추가하는 것을 포함하는 것을 의미한다. 상기 변화는 세포 분화를 통해서 유전될 수 있다. 상기 DNA 메틸화는 일반적인 유기체적 진화와 세포적 변이를 위해 결정적 부분이며 안정적으로 세포에서 유전자 표현형을 변화시킴으로써 접합자 생성 과정에서 사라지고, 발현 과정에서 차후의 세포 분화를 통해서 다시 생성된다. 그러나, 가장 최신의 연구는 접합자에서 메틸 그룹이 사라지는 것보다는 수산기화(hydroxylation)가 되는 것을 보인다. 몇몇 유전자 표현형을 제어하는 메틸화 변화들은 유전될 수 있고 후성 유전적 제어라고 불린다. 또한, 상기 DNA 메틸화는 또한 거의 모든 종류의 암의 발현에 매우 중요한 역할을 하며 시토신의 5번 위치에서의 DNA 메틸화는 유전형을 줄이는 특별한 효과를 가지고 있고, 실험된 모든 척추동물에서 발견되어 왔다. 몇몇 성인 체조직(somatic tissue)에서, DNA 메틸화는 전형적으로 CpG 디뉴클레오티드 상태에서 나타나고, non-CpG 메틸화는 태아 줄기 세포에서 주로 나타난다. 아울러, 상기 DNA 메틸화는 박테리아에서 원시적인 면역시스템으로도 쓰이며 자신의 게놈은 메틸화시켜서 제한효소의 의한 인식을 막고 외부에서 침입한 메틸화되지 않은 파지의 DNA는 인식되어 분해된다. 상기 DNA 메틸화의 타겟이 되는 뉴클레오타이드는 싸이토신이며, CpG 디뉴클레오타이드의 싸이토신만이 DNA 메틸화의 타겟이 된다. 또한, DNA 메틸화를 매개하는 효소는 Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b이다. 이 중 Dnmt3a와 3b는 신생메틸화(de novo methylation)을 담당하는 효소이며, Dnmt1은 보존성 메틸화(maintenance methylation)를 담당하는 효소이다. 메틸기의 공여자는 S-adenosyl methionine(SAM)이며, SAM으로부터 메틸기를 받아 싸이토신의 5번 탄소위치에 메틸화를 일으켜 5-메틸 싸이토신을 만든다. 신생 메틸화란 메틸화가 없는 CpG 부위의 싸이토신에 새로이 메틸화를 일으켜 메틸 싸이토신을 만드는 것을 의미한다. DNA 복제시 새로이 형성된 신생 DNA 가닥내의 CpG site들은 메틸화되어 있지 않는데, 기존가닥의 CpG 부위에 메틸화가 있다면, 이에 상응하는 신생가닥의 CpG 부위에 메틸화를 일으키는 것을 보존성 메틸화라고 부른다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Tet 효소"는 5mC(5-methylcytosine)을 5hmC(5-hydroxymethylcytosine)으로 전환시킴으로써 DNA 메틸화를 조절하는 효소를 의미한다. 또한 비타민 C는 상기 Tet 계열 효소의 조효소로 작용하며, 비타민 C가 결여된 상황에서 배양이 가능한 생쥐 배아 줄기세포를 이용한 실험을 통해서 Tet 활성에 직접적인 영향을 주는 조절인자라는 사실을 확인할 수 있었다. 비타민 C를 세포 배양액에 첨가하게 되면, 5hmC의 함량이 증가하게 되며, 다양한 유전자 프로모터의 탈메틸화가 일어나게 되었다. DNA 메틸화 및 유전자 발현 패턴의 리모델링은 초기 배아의 내부 세포 집단에서 일어나는 DNA 메틸화와 유사하였다(Kathryn, B., et al., Nature Letter, 500: 222-226, 2013).
본 문서에서 사용되는 용어 "후성유전학적(epigenetics) 특성"은 DNA의 염기서열이 변화하지 않는 상태에서 이루어지는 유전자 발현의 조절인 후생유전적 유전자 발현 조절을 의미한다. 상기 유전자 발현을 매개하는 분자적 수준의 이해는 아직 완벽하지 않지만, 일반적으로 CpG 염기서열 가운데 시토신 염기에 특이적으로 일어나는 DNA 메틸화와 히스톤의 변형에 의해 조절되는 크로마틴 구조의 변화에 두 가지의 기전이 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 후성유전체는 하나의 수정란에서 출발한 개체가 발생 과정을 거쳐 다양한 기능을 갖는 세포로 구성되는 세포 분화와 관련되어 있으며, 후생유전적 유전자 발현 조절을 세포 분화의 기제로 파악하고 있다.
발명의 상세한 설명:
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, 이하, 'AA2G'로 약칭함)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물이 제공된다.
상기 배지 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있고, 상기 성체줄기세포는 조혈모 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 상피 줄기세포, 신경 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 배지 조성물에 있어서, 상기 AA2G는 50 내지 1,000 μg/ml의 농도, 100 내지 750 μg/ml의 농도, 또는 200 내지 500 μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.
상기 배지 조성물에 있어서, 상기 줄기세포가 배아줄기세포일 경우, 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산, 0.05 내지 0.2 mM 베타-마캅토에탄올, 10 내지 20% 열불활성화 우태아혈청, 50 내지 150 IU/ml ESGRO/LIF, 항생제 및 0.1 내지 5.0 mM AA2G를 포함하는 고포도당 함유 DMEM 배지일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포이고, 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES(pH 7.3), MEM 비필수 아미노산 용액, 10 내지 20% 열-불활성화된 우태아혈청, 2 내지 8 ng/mL 인간표피성장인자, 5 내지 15 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자, 25 내지 75 μg/mL 인슐린-유사 성장인자-1, 항생제 및 0.1 내지 5 mM의 AA2G를 포함하는 저포도당 DMEM 배지일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, 이하, 'AA2G'로 약칭함)를 유효성분으로 포함하는 유도분화 만능줄기세포 확립용 배지 조성물이 제공된다.
상기 배지 조성물에 있어서, 상기 AA2G는 50 내지 1,000 μg/ml의 농도, 100 내지 750 μg/ml의 농도, 또는 200 내지 500 μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.
상기 배지 조성물에 있어서, 5 내지 15% 열-불활성화 우태아혈청, 항생제, 및 0.1 내지 5 mM의 AA2G를 포함하는 저포도당 DMEM 배지 또는 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산, 0.05 내지 0.2 mM 베타-마캅토에탄올, 10 내지 20% 열불활성화 우태아혈청, 50 내지 150 IU/ml ESGRO/LIF, 항생제 및 0.1 내지 5.0 mM AA2G를 포함하는 고포도당 함유 DMEM 배지일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포를 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G)가 포함된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 줄기세포의 만능성 강화, 분화능 유지 및 증식능력 강화 배양방법을 제공한다.
상기 배양방법에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있고, 상기 성체줄기세포는 조혈모 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 상피 줄기세포, 신경 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 배양방법에 있어서, 상기 AA2G는 상기 배양배지 내에 50 내지 1,000 μg/ml의 농도, 100 내지 750 μg/ml의 농도, 또는 200 내지 500 μg/ml의 농도로 처리될 수 있다.
상기 줄기세포의 분화능 유지 및 증식능력 강화 배양방법에 있어서, Oct4, Sox2, cMyc, Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt31 등의 단백질 전사인자들을 발현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제가 제공된다.
상기 세포치료제에서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도분화 만능줄기세포일 수 있다.
상기 세포치료제는 천식, 퇴행성 관절염, 류마티스성 질환, 신경손상, 근위축성축삭경화증, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 골다공증, 또는 황반변성과 같은 퇴행성 질환 또는 손상성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 방광염 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 조성물은 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 피내, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 일반적인 전신성 투여 또는 국소성 투여, 예컨대, 근육내 주사 또는 정맥 주사 방식으로 투여될 수 있으나, 가장 바람직하게는 전기천공기(electroporator)를 이용하여 주입될 수 있다. 상기 전기천공기는 시판 중인 DNA 약물 체내 주입용 전기천공기, 예컨대, 이탈리아의 IGEA 사의 GlinporatorTM, 한국의 JCBIO사의 CUY21EDIT, 스위스의 Supertech사의 SP-4a 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 투여경로는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 활막강 내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 상기 줄기세포를 기준으로 1.0×105 내지 1.0×109 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0×106 내지 1.0×108 세포/kg(체중)일수 있다. 다만, 상기 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
이하, 실시예를 통해 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전히 알려주기 위해 제공되는 것이다.
일반실험
줄기세포 배양
마우스 R1 ESCs(인디아나 의과대학의 Broxmeyer 박사 제공)배아줄기세포는 0.1% 젤라틴(Sigma, USA) 코팅된 조직배양접시 상에서 2 mM 엘-글루타민(Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Cellgro, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA), 15% 열-불활성화 FBS(Hyclone, USA) 및 100 IU/ml ESGRO/LIF(Upstae-Millipore, USA)로 보충한 DMEM-고포도당 배지에서 성장시켰다. 인간 기형종양 세포주(NTERA-2)는 2 mM 엘-글루타민, 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린/스트렙토마이신 용액, 및 10% 열-불활성화 FBS로 보충한 DMEM-고포도당 배지에서 배양하였다. 지시한 농도의 AA2G 또는 비타민 C(Vit C)를 처리한 후 세포활성은 제조자의 프로토콜에 따른 MTT 분석 키트(Sigma, USA)로 결정하였다. 상기 MTT 지시약의 환원은 4 시간 이후에 마이크로 플레이트 분광광도계(Molecular Devices, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다.
알칼린 포스페이트(AP) 염색
상기 배양한 줄기 세포의 만능성은 제조자의 지시에 따라서 알칼라인 포스파타제(AP) 검출 키트(Upstate-Millipore, USA)를 사용하여 모니터하였다.
면역염색
지시한 농도의 AA2G로 보충한 배지에서 배아줄기세포를 5회 통과 시킨 후, 세포들은 4% 파라포름알데하이드(Sigma, USA)로 1 시간동안 고정하여 침투시켜, 항-5-하이드록시메틸시토신(5hmC)항체(액티브 모티브, 1:500)로 염색하고, FITC-컨쥬게이트한 항-래빗 IgG 항체를 사용하여 시각화하였다. 핵은 4',6-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 역으로 염색하였다. 상기 염색한 샘플들은 역상 형광 현미경(칼 자이스 현미경, 뮌헨, 독일)을 사용하여 사진을 촬영하였다.
게놈 DNA 제조
DNA는 제조자의 지시에 따라서 Qiagen DNeasy Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 분리하였다.
닷블랏 분석
분리한 DNA(샘플당 1 mg) 95 uC에서 10분간 0.1 M NaOH 내에서 변성하였다. 상기 제조된 샘플들은 얼음 위에서 1 M NH4OAc로 중화한 다음, 순차적으로 두배 희석하였다. 상기 DNA 샘플들은 바이오-닷 장치(Bio-Rad, USA)를 사용하여 니트로셀룰로오스막상에서 반점을 찍었다. 상기 블랏된 막은 SSC 완충액으로 세척하여 80 uC에서 5 분간 건조하였고 120,000 mJ cm에서 UV 교차연결되었다. 그런 다음, 상기 막은 4℃에서 밤새 인산완충용액과 1:1의 비율로 희석한 Odyssey 완충액(Li-Cor, USA)으로 차단시켰다. Odyssey:PBS에 현탁된 마우스 항-5-메틸시토신 단일클론항체(Active Motif's, USA, 1:500) 또는 래빗 항-5-하이드록시메틸시토신 다클론항체(1:5,000)를 첨가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응된 막은 PBS에서 10 분 동안 3회 세척한 다음 상온에서 3 시간 동안 오디세이:PBS에 현탁된 HRP-결합 양 항-마우스 면역글로불린-G(IgG)(GE, USA; 1:10,000) 또는 HRP-결합 염소 항-래빗 IgG(Abcam, USA; 1:10,000) 이차항체와 반응시켰다. 그런 다음, 상기 막은 10 분 동안 3회 PBS로 세척하여 GE ECL Plus(GE, USAP)로 화학발광에 의해 시각화시켰다.
5hmC DNA 면역침강분석
상기 5hmC로 수식한 DNA를 제조자의 지시에 따라서 Mse I 제한 효소를 사용하여 분절한 게놈 DNA 1 μg을 사용하여 Hydroxymethyl CollectorTM 키트(Active Motif's, USA)로 농축하였다. 상기 개별 좌위(loci)의 DNA 하이드록시메틸화 상태는 iQ™ SYBR Green PCR Master Mix(Bio Rad, USA)와 PikoReal 시스템(Thermo Scientific, USA)을 이용하여 잡아당겨진(pull-downed) 5-하이드록시메틸화된 DNA에 대한 정량적 실시간 PCR(RQ-PCR)을 이용하여 정량화되었다. 상기 농축정도는 비결합 증폭체에 대한 결합 증폭체 분획의 비율로써 계산하였고, 평균±SEM ≥ 4 개의 독립 실험으로써 표현하였다.
RQ-PCR의 유전자 발현분석
표적 유전자의 mRNA 수준의 정량 평가는 종래에 기술된 바대로 수행하였다(Shin et al., Leukemia., 24: 1450-1461, 2009). 총 RNA(50 ng)는 Taqman 역전사 시약(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 역전사시키고, 역치(Ct)는 종래에 기술된 바대로 RQ-PCR를 사용하여 순차적으로 결정하였다(Shin et al., Leukemia., 24: 1450-1461, 2009). 상기 표적 유전자의 상대적 발현 수준은 2- ΔΔCt 방법을 사용하여 결정하였고, GAPDH는 내인성 대조 유전자로써 사용하였다.
iPSC로 MEF의 재프로그램
종래에 기술된 바와 같이 Oct4(Pou5f1) 유전자의 중지 코돈의 하류에 연결된 IRES-EGFP 융합 카세트를 갖고 있는 Oct4-GFP 마우스로부터 수득된 마우스 배아 섬유세포(MEF, 5,000 cells)를 FUW-SOKM 렌티바이러스(동국대 김종필 교수로부터 제공)로 2계대 상태에서에서 24웰 배양접시에서 형질도입시켰다(Takahashi et al., Nature Protocols, 2: 3081-3089, 2007). 상기 MEF 세포들은 형질도입 0일째 및 1일째까지는 0.74 mM AA2G로 보충한 MEF 배양배지(10% 열불활성화 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Cellgro, USA)을 포함하는 고 포도당 DMEM 배지)로 배양하였고, 형질도입 2일째부터는 배아줄기세포 배양 배지(2 mM 엘-글루타민(Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Cellgro, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA), 15% 열-불활성화 FBS(Hyclone, USA) 및 100 IU/ml ESGRO/LIF(Upstae-Millipore, USA)로 보충한 DMEM-고포도당 배지) 하에서 형질전환 후 2 일동안 유지하였다. 상기 확립된 iPSC 군락의 AP 염색은 형질전환 후 21일째에 수행하였다.
인간 골수유래 중간엽 줄기세포 배양
중간엽 줄기세포(MSC)로부터 유도된 인간 골수(BM)는 상업적으로 구입하였고(Lonza, USA), 37℃에서 5% CO2로 흡습한 대기 상태에서 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPES(pH 7.3), MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린/스트렙토마이신(Cellgro USA), 1 μg/mL 아스코르빈산(Sigma, USA), 15% 열-불활성화된 FBS(Hyclone, USA), 5 ng/mL 인간표피성장인자, 10 ng/mL 기본 섬유세포 성장인자, 및 50 μg/mL 긴 R3-인슐린-유사 성장인자-1(Prospec, Israel)로 보충한 DMEM-저포도당 배지(Hyclone, USA)에서 성장시켰다. 상기 MSC는 다분화능을 보증하기 위해, 4계대까지만 증식시켜 사용하였다.
표면마커 분석
상기 배양한 세포 표현형의 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 위하여 상기 세포들은 인간 CD14, CD34, CD45, HLA-DR(FITC; BD Biosciences), CD44, CD73, CD105, CD166, 및 PDGFR-A(PE; BD Pharmingen, Los Angeles, CA) 등에 대한 각 항체들로 상온에서 15분 동안 염색하였다. 상응하는 마우스 동족체(isotype) 항체들은 대조군으로 사용되었다. 상기 단일 색으로 염색된 세포들은 PBS로 세척하여 1%(v/v) 파라포름알데하이드로 고정하였다. 상기 MSC 면역형(immunotype)들은 FACSCaliuer(BD Biosciences, USA)상에서 유세포분석을 통해 결정하였고, 상기 발현 세포 표면 항원들의 백분율은 10,000 게이트된 세포 수에 대하여 계산되었다.
시험관내( in vitro ) 분화분석
골원성, 연골원성, 또는 지방조직원성 계열로의 시험관내 분화는 이전에 보고한 바대로 수행하였다(Jin et al., Antioxid Redox Signal, 24(9): 471-485, 2016). 간략하게, 세포들은 정상 성장 배지 하에서 유지하여 지방조직 분화배지(5% FBS, 1 μM 덱사메타손, 10 μM 인슐린, 200 μM 인도메타신, 및 0.5 mM 이소부틸메틸크산틴으로 보충한 DMEM), 골조직 분화배지(5% FBS, 50 μM 엘-아스코르베이트-2-포스페이트, 0.1 μM 덱사메타손, 및 10 mM 글리세로포스페이트로 보충한 DMEM), 또는 StemPro® 연골조직 분화배지(Invitrogen, USA)로 배양하였다. 지방조직 분화는 세포간 지질의 축적을 특징으로 하는데, 이는 oil red O 염색으로 시각화될 수 있으며, 골조직 분화는 칼슘에 대하여 특이적인 Alizarin Red 적색 염색시 양성인 것으로 확인이 가능하며, 연골조직 분화는 Alcian Blue 염색으로 조사되었다.
세포증식 및 군락형성 단위-섬유세포(CFU-F)분석
상기 세포증식은 지시된 농도의 AA2G 또는 비타민 C를 처리한 후에 제조자의 프로토콜에 따라서 MTT 분석 키트(Sigma, USA)를 이용하여 결정하였다. 상기 MTT 시약의 환원은 처리 4 시간 경과 후 마이크로플레이트 분광광도계(Molecular Devices, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. 또한 CFU-F 분석을 위하여, 5계대의 MSC에 지시된 농도의 AA2G 또는 비타민 C를 처리하였고 세포들은 6-웰 배양 접시에서 클론의 밀도(각 웰당 60 개의 세포)에 재배치 한 다음, 14 일 동안 hCB-MSC 배지에서 배양하였다. 상기 확립한 군락들은 PBS로 두 번 세척하고 고정하여 0.5% 크리스탈 바이올렛(Sigma, USA)으로 염색하였다.
세포이동 분석
8 ㎛ 두께의 폴리카보네이트 막을 50 μL 1.0% 젤라틴(Sigma, USA)으로 1 시간 동안 코팅하였다. 상기 MSC는 트립신-EDTA로 떼어내어 세척하고 0.5% BSA를 포함하는 DMEM에 재부유한 다음, Transwell inserts(Costar Transwell; Corning Costar, USA)의 상부 챔버에 3×104 cells/well의 밀도로 파종하였다. 하부 챔버는 0.5% BSA DMEM에서 지시한 농도의 PDGF-AA(R&D System, USA)로 채웠다. 24 시간이후에 삽입부는 트란스웰 플레이트로부터 제거하였다. 상기 상부 챔버에 남아 있는 세포들은 탈지면으로 닦아내어 막을 가로질러 이동한 세포들은 4% 파라포름알데하이드(PFA)가 용해된 PBS 용액으로 고정한 후 0.5% 크리스탈 바이올렛(Sigma, USA)으로 염색하였다. 상기 막의 하부면상에 있는 염색된 세포들은 Image Pro 5.0 소프트웨어(Media-Cybernetics, Rockville, MD)를 사용하여 디지털 영상분석으로 정량하였다.
웨스턴 블랏
MSC는 37℃에서 0.5% BSA를 포함하는 DMEM에서 1 일 동안 절식시키고 지시한 농도의 PDGF-AA로 5 분 또는 10 분 동안 자극한 다음, 단백질 분해효소 및 포스파타제 저해제(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 포함하는 RIPA 분해 완충액에 넣고 얼음 위에서 30 분 동안 분해하였다. 상기 세포 추출물(30 μg)은 12% SDS-PAGE 겔을 사용하여 분리하고, MAPKp42/44 및 AKT(Ser473)(Cell Signaling Technology, USA)의 인산화 정도를 분석하였다. 동등한 적재량은 MAPKp44/42 및 총 AKT(Cell Signaling Technology)에 대해서 단일클론 또는 다클론항체를 사용하여 확인하였다.
천식동물모델
모든 동물실험은 울산대학교 의과대학의 동물실험 윤리위원회(IACUC-2015-12-061)에 의해 승인을 받았다. 심각한 천식의 마우스 모델을 제작하기 위하여 6 주령의 BALB/c 마우스(오리엔트바이오, 가평, 경기도, 한국)들은 0, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 22, 및 23 일째에 75 μg OVA(Sigma, USA) 및 10 μg polyI:C(Calbiochem, USA)로 비강내 투여로 감작하여 장애를 일으켰다. 상기 마우스는 15 일째에 정맥내 주사에 의해 3×105 개의 MSC를 주입하였다. 마지막 면역화 후 24 시간 경과한 마우스로부터 BALF, 림프절, 및 폐조직을 수득하였다. 모노사이트, 호염기성구, 호중성구, 및 림프구의 수와 BALF에서 IL-8 및 IL-10의 농도는 종래에 기술한 바대로 측정하였다(Jin et al., Antioxid Redox Signal, 24(9): 471-485, 2016; Bang et al., Am. J. Respir . Cell Mol . Biol . 50(6): 1021-1030, 2014). 조직병리평가를 위해서, 폐에 대하여 오른쪽 심실을 통해서 5 ml PBS를 관류시키고 기관지를 통하여 1 ml PBS를 투입팽창시켰다. 상기 투입 팽창시킨 폐는 10% 중성 완충 포르말린 용액에서 24 시간 동안 담금으로써 고정하였다. 상기 고정된 폐조직을 파라핀에 포매시키고 4 μm 두께로 절편화하여 기관지 및 혈관 주위 영역에서 염증의 크기를 헤마토실린 및 에오신 염색으로 시험하였다. 주입한 MSC의 생착은 인간 β2-마이크로글로불린(ab15976; Abcam, USA)의 면역형광분석으로 결정하였고, FITC-표지된 이차 항체를 사용하여 시각화하였다. 핵은 4'-6-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI; Sigam, USA)를 사용하여 상대적으로 염색하였다.
방광염 동물모델
IC/BPS(interstitial-cystitis/bladder pain syndrome) 동물 모델에 LPS(lipopolysaccharide) 점적주사를 위하여, 10주의 암컷 Sprague-Dawley rats (OrientBio, Gapyong, Gyeonggi-do, Korea)에 26-게이지 카테터(angiocatheter)를 이용하여 요도를 통한 방광으로 프로타민 황산염(protamine sulfate)을 점적주사하였고, 이는 요로상피의 디누데이션(삭박, denudation)을 위한 것이다. 45분 후, 방광이 비워지면, PBS(phosphate-buffer saline) 용액으로 씻고, 염증반응을 유도하기 위해 30분 동안 LPS(525 mg/rat, Sigma-Aldrich)로 처리하였다. 5주 이상 매주 PS/LPS(protamine sulfate/lipopolysaccharide)의 점적주사에 의해 요로상피의 만성적 상처를 유도할 수 있었다.
어웨이크 방광내압측정법(awake cystometry)에 의한 방광내압측정도 ( cystometrogram )
방광내압측정도는 대사 케이지에 있는 마취되지 않고 억압되지 않은 랫트에서 수행되었다. 방광내압(intravesical pressure; IVP) 및 복강내압(intraabdominal pressure; IAP)의 기록을 위해서 기존의 보고대로 동시의 도뇨(catheterization)가 방광내압측정 전 3일 동안 수행되었다(Lee, T. & Yoon, S.M. Int . Neurourol . J. 17: 44-47, 2013); Jin, L.H. et al. Int . Neurourol . J. 14: 54-60, 2010). 방광은 압력변환기(Research Grade Blood Pressure Transducer; Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)와 미세주입펌프(microinjection pump, PHD22/2000 pump; Harvard Apparatus)에 연결된 부풀어지는 PE-50 카테터(Clay Adams, Parsippany, NJ)를 사용하여 접근되었다. 배뇨부피(micturition volume; MV)는 물리적 변위변환기(Research Grade Isometric Transducer; Harvard Apparatus)에 연결된 체액집합관에 의해 계속적으로 기록되었고, 이때 멸균된 식염수는 0.4 ml/min 정도로 방광으로 주입되었다. IVP, IAP 및 MV는 50 Hz의 샘플링 레이트로 Acq Knowledge 3.8.1 software와 MP150 data acquisition system(Biopac Systems, Goleta, CA, USA)을 사용하여 계속적으로 기록되었다. 각 그룹에 5 마리의 동물을 사용하여 3번 반복된 배뇨로부터 평균값을 계산하였다 (n=5). NVC(Non-voiding contraction)는 IVP의 증가가 배뇨없이 기준치로부터 2 cm H2O를 초과할 때부터 계산되었다. 방광 기저압(BP, bladder basal pressure)은 방광이 채워지는 동안의 가장 낮은 방광압이며, 배뇨압(MP, micturition pressure)는 배뇨 주기 동안 최대 방광압이고, 배뇨부피(MV, micturition volume)은 배뇨되는 뇨의 부피이며, 잔뇨량(RV, residual volume)은 배뇨 후 잔존하는 뇨의 부피이다. 방광용량(BC, bladder capacity)는 MV와 RV를 합한 값이며, 배뇨간격(MI, micturition interval)은 배뇨 수축 사이의 간격을 의미한다.
실시예 1: 마우스 및 인간 만능 줄기세포의 증식에서 아스코빌 글루코사이드(AG)의 영향
본 발명자들은 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G)가 세포성장에 미치는 영향을 보기 위하여 마우스 배아줄기세포(mESC)와 인간 배아줄기세포와 유사한 특성을 가진 암세포주인 인간 기형암종 세포주(teratocarcinoma, NTERA2)를 상기 지시한 개수의 세포(cells/ml)로 파종 한 후, 마우스 배아줄기세포의 경우 2 mM 엘-글루타민(Hyclone, USA), 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린/스트렙토마이신 용액(Cellgro, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA), 15% 열-불활성화 FBS(Hyclone, USA) 및 100 IU/ml ESGRO/LIF(Upstae-Millipore, USA)로 보충한 DMEM-고포도당 배지, 그리고 인간 기형암종 세포주의 경우 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산 용액, 페니실린/스트렙토마이신 용액, 및 10% 열-불활성화 FBS로 보충한 DMEM-고포도당 배지에 비타민 C와 AA2G를 각각 0, 0.185, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 농도로 처리한 후 5일간 배양하였다. 배양 3일 및 5일 시점에서 세포 증식능을 MTT assay로 분석하였다. 그 결과 도 1a 및 1b에서 나타난 바와 같이, 마우스 배아 줄기세포에서 0.37 mM 와 0.74 mM 농도의 AA2G를 포함한 배지에서 3일부터 세포 증식 향상이 관찰되었으며,비타민 C는 마우스 배아 줄기세포의 증식에 거의 영향을 미치지 않았고, 오히려 250 μg/ml이상의 고농도에서는 심각한 세포독성을 나타냈다. 인간 기형암종 세포주에서는 0.37 mM 와 0.74 mM 농도의 AA2G를 포함한 배지에서 3일부터 세포 증식 향상이 관찰되었으며, 5일에는 약 1.5배 이상의 세포 증진 향상이 관찰되었다. 상기 결과는 AA2G 포함 배지의 우수한 줄기세포 증식능을 입증하는 것이다.
실시예 2: 세포 형상에 관한 아스코빌 글루코사이드(AG)의 영향
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 AA2G 또는 비타민 C가 mESC 배양시 세포형태에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해, 배양중인 mESC 배양액에 AA2G(20 mg/ml)를 0, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 농도별로 각각 처리한 후, 세포형태를 현미경으로 관찰하였다. 준비한 mESC의 세포들을 아세토페논(AP)으로 용매를 첨가한, 염료농도 1×10-3 M 염액으로 소정시간, 소정온도에서 적외선염색기(BRA-12, Swiss)로 염색한 후 수세, 건조하여 인산염 완충용액을 사용하여 염욕의 pH를 5.5로 일정하게 유지하였다. 아울러, mESC가 줄기세포로서 미분화상태를 유지하고 있는지 확인하기 위해서 알칼라인 포스파타제(AP) 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 2a에서 나타난 바와 같이, AA2G 또는 비타민 C가 포함된 배지에서 배양한 mESC는 일반 배지에서 배양한 세포보다 조밀한 둥근 돔 형태의 군집체를 형성하고 있으며, 도 2b에서 나타난 바와 같이, 미분화 줄기세포 특이적 마커인 AP 염색 정도 역시 AA2G 미처리시보다 더 강하게 염색이 되고 있음을 확인하였다. 상기 결과는 AA2G 포함 배지가 mESC의 전분화능 강화를 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 3: 만능성 유전자의 발현 수준
3-1: 웨스턴 블랏 분석에 따른 만능성 유전자의 발현 수준
본 발명자들은 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자 단백질들의 발현량을 측정하기 위하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 각각 0, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G를 각각 처리한 mESC를 5일간 배양한 후, 세포에 트립신을 처리하여 회수한 후, PBS로 세척하고 1 ㎖의 세포파쇄 완충용액(50 mM Tris, pH 7.5, 0.5% NP-40, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF)으로 파쇄하여 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수득한 후, 5분 동안 중탕 후, 10% SDS-PAGE를 시행하였으며, 니트로셀룰로스 막에 25 mV으로 18시간동안 블롯팅하였다. 니트로셀룰로스 막에 5%(w/v) 탈지유가 포함된 TBST 완충용액(Trisbuffered saline-Tween 20)으로 1시간동안 차단한 후 각각의 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자 단백질(Oct4, Sox2, Nanog, Tfcp2l1, Dumt31, βActin)에 각각 특이적인 래빗-항체로 반응시켰다. 반응이 종료된 후, HRP 결합-항-래빗 IgG 2차항체로 반응시키고, TBST 완충용액으로 10분간 3회 세척 후 ECL 키트(Amersham, USA)를 사용하여 O-mat AR 필름(Kodak)으로 현상하였다. 이때, 내재 단백질로는 β-액틴을 사용하였다.
상기 웨스턴 블롯 분석 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이, AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC에서 OCT4, NANOG, SOX2, TFCP2L1, 및 Dumt31 단백질들의 발현량이 재현성 있게 증가함을 확인하였다(두 번의 독립적 실험 결과, 도 3A 참조).
상기 결과는 AA2G 포함 배양액을 통한 mESC의 전분화능 강화에 대한 분자생물학적 수준의 증거이며 본 발명에서 FBS(분화를 촉진하는 인자)가 포함된 배지에서 한 일 실시예로써, 상기에서 언급한 Nature paper(VitC)처럼 FBS를 제거하고 실험을 반복할 경우 더욱 확연한 차이가 관찰될 것이라고 사료된다.
3-2: qPCR 방법에 따른 만능성 유전자의 발현 수준
또한, 본 발명자들은 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자들인 Oct4, Sox2, cMyc(핵심 인자들) 및 Nanog, Esrrb, Tfcp2l1, Zfp143, Klf2, Klf4, Dnmt3l(신규상태 인자들)에 대한 상대적인 mRNA의 발현량을 qPCR방법으로 측정하였다. 상기 mRNA는 DNase I 처치한 칼럼상에서 Qiagen RNeasy를 사용하여 배양한 세포로부터 분리하여 무작위 헥사머를 사용하여 1 μg의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 상술한 바와 같이 실시간 저량 PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 3b에서 나타난 바와 같이, AA2G 함유 배지에서 mESC를 배양할 경우, 전분화능 줄기세포 특이적 전사인자들의 발현이 소폭 증가하거나 비슷한 수준으로 유지됨을 확인 할 수 있었다. 상기 결과는 AA2G가 줄기세포의 증식능을 강화시킬 뿐만 아니라, 줄기세포로서의 특징을 유지할 수 있게 함을 의미하는 것이다.
실시예 4: 후성유전체 변이 분석(5 hmC 수준)
4-1: 면역염색
비타민 C(vitamine C, VitC)를 배양액에 처리할 경우, DNA 탈메틸화(DNA demethayltion)을 촉매하는 TET 효소들을 활성화여 DNA 메틸화를 최소 수준으로 유지하며, 이를 통하여 배아 줄기세포의 전분화능/만능성 강화 및 역분화 줄기세포 확립 효율 증대가 가능하다는 연구결과(Rahul, M. K. and Yi, Z., Nature, 502: 472-479, 2013)와 관련하여, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 AA2G의 줄기세포 전분화능/만능성 강화효과가 DNA 탈메틸화 즉, 후성 유전학적 변화를 통해 달성되는 것인지를 상술한 바와 같이 조사하였다.
그 결과, 상기 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC에서는 DNA 탈메틸화 표식인자인 5 hydroxy methyl Cytosine(5hmC)의 양이 0.74 mM의 농도까지는 농도의존적으로 유의하고 재현성 있게 증가됨을 확인하였다(도 4a 참조). 상기 결과는 AA2G 포함 배양액이 VitC의 경우와 유사한 기전으로 줄기세포의 전분화능 강화를 유도할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
4-2: 닷 블랏 분석
본 발명자들은 상기 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 mESC에서는 DNA 탈메틸화 표식인자인 5 하이드록시메틸 시토신(5hmC)의 양이 증가되는 상기 실시예 4-1의 결과를 정량적으로 검증하기 위하여, 상기 실시예 4-1과 같은 조건의 배지에서 배양한 세포에서 게놈 DNA을 추출한 후 100 ng gDNA으로부터 2배씩 연속 희석한 gDNA를 닷 블랏 기기를 통하여 블랏팅 한 후, 5hmC 특이적인 항체를 이용하여 면역블롯팅을 실시하여 그 양을 두 번의 독립적 시험을 통하여 측정하였다.
그 결과, 도 4b에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 4-1의 결과와 동일하게 AA2G 농도 의존적으로 탈메틸화효소의 활성의 지표인 5 hmC이 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 AA2G는 줄기세포 배양시 줄기세포의 전분화능의 강화를 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.
4-3: DNA 면역침강(IP) 분석
이어 본 발명자들은 상기 5hmC로 수식한 DNA를 제조자의 지시에 따라서 Mse I 제한 효소를 사용하여 분절한 게놈 DNA 1 μg을 사용하여 Hydroxymethyl CollectorTM 키트(Active Motif's, USA)로 농축하였다. 상기 개별 좌위(loci)의 DNA 하이드록시메틸화 상태는 iQ™ SYBR Green PCR Master Mix(Bio Rad, USA)와 PikoReal System(Thermo Scientific, Pittsburgh, PA)을 이용하여 잡아당겨진(pull-downed) 5-하이드록시메틸화된 DNA에 대한 정량적 실시간 PCR(RQ-PCR)을 이용하여 정량화되었다. 상기 농축정도는 비결합 증폭체에 대한 결합 증폭체 분획의 비율로써 계산하였고, 평균±SEM ≥ 4 개의 독립 실험으로써 표현하였다(도 4c 참조).
그 결과, 도 4c에서 나타난 바와 같이, 두 차례의 독립적인 실험에서 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 eESC들은 VitC 표적 유전자 발현 부위에 5 hmC 수준이 높은 후성유전학적 특성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
4-4: 비타민 C 표적지향 유전자의 발현 수준
본 발명자들은 마우스 배아줄기세포를 함께 취하여 비타민 C와 유사한 AA2G 보충 배지에서 유지하여 신생 배반포와 같은 단계로 이끄는 비타민 C 표적 유전자(Wfdc15a, Dazl, Gtsf1, Gpx2, Taf7l, Dpep3, Pdha2, Tktl2, Fkbp6)의 발현 수준을 상술한 바와 같이 실시간 RT-PCR로 분석하였다.
도 4d에서 나타난 바와 같이, AA2G가 포함된 배지에서 배양한 eESC에서 미성숙 상태(신생 배반포와 같은 단계)로 이끄는 비타민 C 표적 유전자 발현량 증가가 재현성 있게 관찰되는 것을 확인하였다. 상기 결과는, 비타민 C 뿐만 아니라 AA2G가 비타민 C와 동일한 기전으로 작용함을 시사하는 것이다.
실시예 4-5: DNA 메틸전이제 및 탈메틸화제의 발현 수준
이어 본 발명자들은 AA2G를 처리하고 72시간이 경과한 배아줄기세포에 대하여 qRT-PCR 분석을 통해, AA2G에 의한 DNA에 대한 탈메틸화의 증가가 DNA 탈메틸화를 매개하는 효소인 Tet와 Dnmt의 발현의 증가에 따른 것인지 분석하고자 하였다.
그 결과, 도 4e에서 나타난 바와 같이, AA2G의 처리가 상기 DNA 탈메틸화 효소의 발현을 증가시키지는 않는 것으로 나타났다. 다만, Dnmt3b의 경우 AA2G의 처리에 의해 그 발현정도가 증가되는 것으로 나타났다. 상기 결과는 AA2G가 DNA 탈메틸화 효소의 발현보다는 그 활성을 증가시킴으로써 배아줄기세포의 전분화능/만능성을 강화시킴을 시사하는 것으로서, Vitamin C(VitC)처리가 TET1 DNA 탈메틸화효소의 활성을 증가시켜 배아줄기세포의 전분화능/만능성을 강화시킨다는 내용의 대표적 참고 문헌(Kathryn, B., et al., Nature Letter, 500:222-226, 2013)에서 발표 한 것과 일치하였다.
상기 결과들은 AA2G 포함 배양액을 통한 mESC의 전분화능 강화에 대한 분자생물학적 수준의 증거이며 본 발명에서 FBS(분화를 촉진하는 인자)가 포함된 배지에서 한 일 실시예로써, 상기에서 언급한 Nature paper(VitC)처럼 FBS를 제거하고 실험을 반복할 경우 더욱 확연한 차이가 관찰될 것이라고 사료된다.
실시예 5: 재프로그램시 AA2G 처리에 의한 iPSC 콜로니 형성
아울러, 본 발명자들은 마우스 배아 섬유아세포를 iPSC로 유도하는 과정에서 AA2G 처리에 의한 효과를 관찰하기 위해, iPSC로의 재프로그램화 과정에서 AA2G를 0.74 mM의 농도로 처리한 후, AP 염색으로 생성된 iPSC 군락을 계수하였다. 그 결과, 도 5A에서 나타난 바와 같이, AA2G는 비타민 C와 유사하게 iPSC 재프로그래밍의 효과를 강화하였다(도 5a 참조). 구체적으로 5A에서 보는 바와 같이 SOKM+AA2G(0.74 mM) 군락 부분의 변화가 대략적으로 3배 이상 더 강해졌다. 또한 AP 염색한 콜로니를 상대적으로 계수한 그래프에서도 같은 현상을 나타내었다(도 5b 참조).
상기 결과에 따라서 완전히 배아줄기세포와 유사한 상태로 재프로그램하여 GFP를 추가한 iPSC군락을 2회 반복 관찰한 결과, 군락 부분의 변화가 대략 5 배 정도 강해졌다(도 5c 참조). 뿐만 아니라, GFP가 줄기세포 표지자인 Oct-4와 연결되어 발현되도록 유전자 조작된 마우스 배아 섬유아세포를 iPSC로 유도하면서 AA2G를 처리한 결과, AA2G 미처리 대조군과 비교하여 GFP 발현 세포의 수가 대폭 증가하였다(도 5d 참조). 이러한 결과는 AA2G가 iPSC의 제조 수율을 높이는데 매우 효율적으로 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 6: MSC의 증식에 관한 AA2G의 영향
인간 MSC를 500 또는 1000 cell/ml의 밀도로 파종한 후, 5일 동안 배양하면서 0.185, 0.37, 0.74, 및 1.48 mM 농도의 AA2G 또는 비타민 C를 처리하였다. 이어 MTT 분석를 수행하여 상대적인 세포 증식을 5일 동안 관찰하였다.
그 결과, 도 6a 및 6b에 나타난 바와 같이, AA2G가 포함된 배지에서 배양된 MSC의 경우 3일째부터 농도 의존적인 증식 향상이 나타났다. 반면, 비타민 C는 대조군과 비교하여 아무런 효과가 없거나 오히려 고농도에서는 세포독성이 나타남을 확인할 수 있었다.
실시예 7:MSC에 관한 AA2G 배지의 영향
7-1: MSC의 표면 단백질 표현형에 관한 AA2G의 영향
본 발명자들은 AA2G가 인간 MSC의 표면 단백질 표현형에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, 유세포 분석을 통해, 인간 MSC의 표면 단백질 표현형을 분석하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 것과 같이, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC의 경우 CD29, CD273, CD14, CD45와 같은 표면 마커들의 발현 양상이 비-처리된 MSC의 양상과 유사하였다(도 7a 참조). 이는, AA2G의 처리가 MSC의 특성 자체를 변화시키는 것은 아님을 보여주는 것이다.
실시예 7-2: MSC(I)의 다중 분화성에 AA2G의 영향
본 발명자들은 AA2G가 MSC의 분화능에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, AA2G 처리된 MSC를 시험관 내 조건에서 골세포 및 지방세포로 분화시키는 실험을 수행하였다. 그 결과, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC은 AA2G가 포함되지 않는 세포와 비교하여 유사한 골분화 능력(도 7b)와 연골 분화 능력(도 7c)이 관찰되었다.
이는 AA2G가 포함된 배지가 MSC 다분화능에는 크게 영향이 없음을 보여주는 결과이다.
실시예 8: AA2G가 MSC의 콜로니 형성 능력에 미치는 영향
또한 본 발명자들은 AG 보충 배지내에서 유지된 중간엽 줄기세포(MSC)의 콜로니 형성 단위-섬유세포(CFU)강화를 고찰하기 위하여, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC를 6-웰 배양 플레이트(각 웰당 60 세포)에 동일한 밀도로 재-플레이팅하여 CFU-F 어세이를 실시하였다. 추가적으로 0.37, 0.74 및 1.47 mM의 AA2G가 포함된 배지에 14일 동안 배양하였다. 결과물인 콜로니들을 PBS로 2회 세척하고, 고정한 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
그 결과, 도 8a 및 8b에서 나타난 바와 같이, AA2G 농도의존적으로 MSC에 대한 클론원성 전구세포(clonogenic progenitor)인 클론원성 CFU-F(fibroblast colony-forming units) 형성능이 증가되었다(도 8a 및 8b 참조).
이러한 결과들은, AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC가 그들의 치료 효능에 매우 중요한 줄기세포성(stemness)을 향상시킨다는 것을 시사한다.
실시예 9: AA2G의 MSC의 이동능에 미치는 영향
또한 본 발명자들은 AG 보충 배지내에서 유지된 중간엽 줄기세포(MSC)의 이동 활성을 고찰하기위하여 AA2G 농도를 0.37, 0.74, 및 1.48 mM로 증가시키면서 Cell Biolabs CytoSelect™ Cell Migration Assay Kit로 조직 배양 용기에서 중간엽줄기세포(MSC)의 이동을 수행한 후, 현미경의 x100 및 x200 배율로 AA2G의 농도별 영향을 고찰하였다(도 9a 참조). 아울러, AA2G 미처리 세포의 이동 정도에 대한 상대적인 이동 정도를 계량하였다(도 9b 참조).
그 결과 도 9a 및 9b에서 나타난 바와 같이, 일반 배양액에서 배양한 세포와 비교하여, 0.37, 0.74, 및 1.48 mM AA2G가 포함된 배지에서 배양한 MSC은 PDGF-AA에 대한 세포 이동 활성이 유의하게 크게 증가한다는 것이 관찰되었다. 다만, 저 농도에서 세포 이동활성이 가장 컸고, 농도가 증가함에 따라 세포 이동활성은 떨어지는 것으로 나타났다.
상기 결과는 기능성 강화 성체줄기세포 배양액 개발에도 활용될 수 있는 장점이 있어서, 향후 줄기세포 기반 치료제 개발에 원천 기술로써 산업상 이용가능성이 클 수 있음을 시사한다.
실시예 10: AA2G의 PDGF 신호전달에 미치는 영향
본 발명자들은 상기 실시예 9의 결과로부터 AA2G의 PDGF 신호전달과의 상관관계를 분석하고자, 유세포 분석 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
구체적으로, 2.5 ng/ml의 PDGF-AA를 처리한 인간 MSC에 0, 0.37, 0.74 및 1.48 mM의 AA2G를 처리한 후, 항-PDGFRα 항체를 이용하여 PDGFRα에 대하여 게이팅하여 유세포분석을 수행하였다. 대조군으로는 IgG-FITC를 사용하였다. 그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, 일반 배지에서 배양한 인간 MSC의 경우, 세포 밖 표면으로 PDGFRα를 발현하는 세포의 빈도가 매우 희박한 반면(0.07%), 0.37 mM AA2G가 포함된 배지에서 배양된 인간 MSC는 PDGFRα를 발현하는 세포의 빈도가 전체의 15.9%로 크게 증가하는 것을 확인하였다.
아울러 본 발명자들은 2.5 ng/ml의 PDGF-AA를 처리한 인간 MSC에 0, 0.37 및 0.74 mM의 AA2G를 처리한 후 세포를 파쇄하여, 내부에 존재하는 PDGF 신호전달 단백질들인 p-MAPKp44/p42, MAPKp44/p42, p-Akt 및 Akt의 발현 정도를 웨스턴 블랏 분석으로 분석하였다.
그 결과, 도 10b에 나타난 바와 같이, AA2G의 처리여부 및 농도와 무관하게 MAPKp44/p42나 Akt 자체의 발현은 영향을 받지 않았으나, 이들의 인산화 형태의 경우, AA2G의 처리 여부 및 처리 농도에 따라 증가하는 양상이 나타났다. 이는, AA2G가 PDGF 신호전달을 강화시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 11: 마우스 알러지성 천식모델에서 MSC의 치료효과를 개선하는 AA2G 의 영향
본 발명자들은 마우스로 알러지성 천식 모델을 제작하여 AA2G 배지가 MSC의 치료효과를 개선하는지를 고찰하기 위하여 PBS를 대조군으로 하여 Poly IC 유도 천식 동물 모델을 이용하였다.
상술한 바와 같이, 천식 유발 동물에 미접촉 MSC와 AA2G 처리한 MSC를 투여한 후, 폐조직에 대한 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행한 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이, MSC 미처리 동물의 경우 폐 조직 내 세기관지 상피세포층이 손상되고 비후로 인해 기도 면적이 좁아지는 전형적인 천식 동물의 폐 조직의 모습이 나타난 반면, 미접촉(naive) MSC 및 AA2G 처리 MSC는 세기관지 내부 상피세포층 손상과 비후로 인한 기도 면적이 좁아지는 병리 구조적 변화를 유의하게 억제하는 것으로 나타났다. 특히, AA2G 처리 MSC의 경우 미접촉 MSC와 비교하여 증상의 개선 정도가 더 우수한 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 AA2G를 이용하여 증식된 줄기세포가 세포치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.
실시예 12: M- MSC에 의한 IC/BPS 및 KC의 생체내 ( in vivo ) 치료효과
HCl-IC 모델의 단점을 보완하기 위하여, 본 발명자들은 LPS의 점적주사에 의한 다른 IC/BPS 랫트 모델을 개발하였다(Stein, P.C. et al. J. Urol . 155: 1133-1138, 1996). 대조군으로서 샴(sham) 래트와 상기 IC/BPS 랫트 모델에 대하여 LPS를 처리한 LPS 처리군, AA2G를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포를 1X105 cell 처리한 미접촉줄기세포(MSC) 처리군(AA2G(-) 100K) 및 AA2G를 처리한 중간엽 줄기세포 1X105 cell을 처리한 AA2G 줄기세포 처리군(AA2G(+) 100K)에서 시간의 경과에 따른 방광내압, 복강내압 및 배뇨부피를 측정한 결과, 도 12a에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 AA2G 처리 중간엽 줄기세포 처리군의 경우 비질병모델인 sham에 근접한 양상을 나타낸 반면, AA2G 미처리 중간엽 줄기세포 처리군의 경우 염증유발 모델인 LPS 처리군과 유사한 양상을 나타냈다. 뿐만 아니라, 이들 모델 동물들에 대하여 최대압력(maximum pressure), 배뇨압(MP), 배뇨간격(MI), 배뇨부피(MV), 방광용량, 및 비배뇨 수축(NVC)를 측정한 결과, 도 12b 내지 12g에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 AA2G 처리 줄기세포 처리군의 경우 비동물모델인 sham에 가까운 수치를 나타낸 반면, AA2G 미처리 줄기세포 처리군의 경우 개선 정도가 본 발명의 AA2G 처리 줄기세포 처리군에 못미치는 결과를 타나냈다.
이는 일반 배양액으로 배양한 줄기세포에 비하여, AA2G를 첨가한 배양액으로 배양한 줄기세포가 다양한, 배뇨활동지표를 유의적으로 개선함을 시시하는 것이다
따라서, 1x105 의 소량 세포를 이식한 경우, AA2G가 첨가된 배양액에서 획득한 MSC는 LPS 점적주사로 유도된 간질성 방광염의 예방 또는 치료에 있어 현저한 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포 배양용 배지 조성물은 세포치료제의 생산에 사용될 수 있고 상기 배지조성물에 의해 배양된 줄기세포는 의약의 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 의약산업에 활용될 수 있다.

Claims (16)

  1. 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, AA2G)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물.
  2. 아스코르브산 2-글루코사이드(ascorbic acid 2-glucoside, AA2G)를 유효성분으로 포함하는 역분화줄기세포 확립용 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 또는 유도분화 만능줄기세포인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포이고, 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산, 0.05 내지 0.2 mM 베타-마캅토에탄올, 10 내지 20% 열불활성화 우태아혈청, 50 내지 150 IU/ml ESGRO/LIF, 항생제 및 0.1 내지 5.0 mM AA2G를 포함하는 고포도당 함유 DMEM 배지인, 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 줄기세포는 성체줄기세포이고, 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES(pH 7.3), MEM 비필수 아미노산 용액, 10 내지 20% 열-불활성화된 우태아혈청, 2 내지 8 ng/mL 인간표피성장인자, 5 내지 15 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자, 25 내지 75 μg/mL 인슐린-유사 성장인자-1, 항생제 및 0.1 내지 5 mM의 AA2G를 포함하는 저포도당 DMEM 배지인, 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    5 내지 15% 열-불활성화 우태아혈청, 항생제, 및 0.1 내지 5 mM의 AA2G를 포함하는 저포도당 DMEM 배지 또는 1 내지 3 mM L-글루타민, 10 내지 30 mM HEPES, MEM 비필수 아미노산, 0.05 내지 0.2 mM 베타-마캅토에탄올, 10 내지 20% 열불활성화 우태아혈청, 50 내지 150 IU/ml ESGRO/LIF, 항생제 및 0.1 내지 5.0 mM AA2G를 포함하는 고포도당 함유 DMEM 배지인, 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 조혈모 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 상피 줄기세포, 신경 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 AA2G는 50 내지 1,000 μg/ml의 농도로 포함되는, 조성물.
  9. 줄기세포를 아스코르브산 2-글루코사이드(AA2G)가 포함된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 줄기세포의 만능성 강화, 분화능 유지 및 증식능력 강화 배양방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 또는 유도분화 만능줄기세포인, 배양방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 AA2G는 상기 배양배지 내에 50 내지 1,000 μg/ml의 농도로 처리되는, 배양방법.
  12. AA2G가 처리된 줄기세포를 포함하는, 세포치료제.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도분화 만능줄기세포인, 세포치료제.
  14. 제12항에 있어서,
    천식, 퇴행성 관절염, 류마티스성 질환, 신경손상, 근위축성축삭경화증, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 골다공증, 또는 황반변성의 치료에 사용되는, 세포치료제.
  15. AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 약학적 조성물.
  16. AA2G가 처리된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 방광염 치료용 약학적 조성물.
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