WO2011159075A2 - 2차원 배양을 이용한 성체줄기세포의 신경전구세포로의 분화방법 및 신경전구세포를 이용한 신경손상 질환 치료용 약학 조성물 - Google Patents

2차원 배양을 이용한 성체줄기세포의 신경전구세포로의 분화방법 및 신경전구세포를 이용한 신경손상 질환 치료용 약학 조성물 Download PDF

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neural progenitor
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문지숙
이현섭
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차의과학대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for differentiating adult stem cells into neural progenitor cells, and more particularly to a method for differentiating adult stem cells into neural progenitor cells through an improved two-dimensional culture method. It is about.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for treating neuroinjury disease using neuroprogenitor cells obtained by the differentiation method.
  • stem cells such as embryonic stem cells, adult stem cells, induced pluripotent stem cells, etc. have been differentiated into various cells, and various studies have been made on the possibility of using them as cell therapy.
  • various studies have been conducted on efficient methods for differentiating stem cells into neural progenitor cells and / or neurons.
  • the neurological diseases ie, nerve injury diseases
  • degenerative neurological diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and cerebral palsy
  • stroke Tramatic brain injury
  • Spinal cord injury and the like.
  • studies are being actively conducted on the differentiation of adult stem cells and pluripotent stem cells without ethical problems.
  • Cell therapy for the treatment of neurological diseases includes, but is not limited to, transplanting differentiated neurons with properties similar to damaged neurons (ie replacement therapy); Methods of improving the environment of diseased areas by releasing neuroprotective factors in transplanted cells (ie neurotrophic factor therapy); And methods of inducing or enhancing neurogenesis of neural progenitor cells inherent in neural stem cell niche (see Documents 1 and 2).
  • ie replacement therapy Methods of improving the environment of diseased areas by releasing neuroprotective factors in transplanted cells
  • ie neurotrophic factor therapy ie neurotrophic factor therapy
  • differentiation-inducing medium is placed in a culture vessel coated with an adhesive protein such as fibronectin, and the adult stem cells are added (by shaking the culture vessel slightly if necessary) to spread evenly on the bottom surface. This induces differentiation into neural progenitor cells.
  • the differentiation method is classified into two-dimensional (2-dimensional) culture by performing the culture in the state that the adult stem cells are evenly spread on the bottom surface of the coating layer is formed.
  • the differentiation method through the three-dimensional culture forms free floating spheres in the culture medium, thereby increasing cell-to-cell interaction, and thus differentiating them through two-dimensional culture.
  • the advantage is high efficiency.
  • the differentiation method through the three-dimensional culture has a problem that not only the processing process is complicated, but also the growth rate is slow, and it is difficult to obtain reproducible neural precursor cells.
  • the size of the cell can not be controlled, the characteristics of the cell change every time. Therefore, the existing three-dimensional culture conditions can not have the same conditions, it is difficult to passaging the same size when subcultured, there is a problem that the experimental results are not uniform, and the proliferative force is low because of the slowing of the growth rate.
  • the present invention provides an efficient method for differentiating stem cells, in particular adult stem cells, which have no ethical problem, efficiently into neural progenitor cells, through two-dimensional culture.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating neurological disorders, such as Parkinson's disease, including neuroprogenitor cells obtained through the differentiation method.
  • an object of the present invention is to provide a method for differentiating adult stem cells into neural progenitor cells through improved two-dimensional culture.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of neurological disorders comprising neuronal progenitor cells obtained through the differentiation method as an active ingredient.
  • an adhesive protein adheresive protein
  • the adhesive protein may be selected from the group consisting of poly-L-ornithine and fibronectin.
  • the dispersion containing the adult stem cells may be preferably used by culturing the adult stem cells in a medium containing fetal bovine serum, heparin, and fibroblast growth factor.
  • the concentration of the dispersion containing the adult stem cells may range from 300,000 to 500,000 cells / ml.
  • the adult stem cells may be stem cells derived from the placenta, bone marrow, umbilical cord blood, fat (or adipose tissue), preferably stem cells derived from the placenta.
  • the medium for differentiation of neural progenitor cells may be preferably used ⁇ -MEM medium containing fetal bovine serum, penicillin-streptomycin, heparin, and fibroblast growth factor.
  • a pharmaceutical composition for treating neuroinjury disease which comprises neuroprogenitor cells obtained according to the differentiation method as an active ingredient.
  • the neurological injury is composed of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, stroke, traumatic brain injury, and spinal cord injury It may be selected from the group, preferably Parkinson's disease.
  • the differentiation method of the present invention is to spotting the dispersion containing adult stem cells on the bottom surface coated with the adhesive protein, the bottom surface of the culture vessel in the form of adult stem cells-containing spheres (adult stem cell-containing spheres) Attachment to induce differentiation through two-dimensional culture. Therefore, the differentiation method according to the present invention can greatly increase the differentiation efficiency by increasing the cell-to-cell interaction. In addition, since the rapid growth time (double time) can be achieved, the obtained neural progenitor cells have high proliferative capacity while maintaining differentiation ability through passage. In addition, the differentiation induction method is not only simple, it is possible to set the differentiation conditions uniformly to achieve a uniform and reproducible differentiation induction.
  • the neural progenitor cells obtained according to the differentiation method according to the present invention are used in cell therapy of various neurological diseases including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, stroke, traumatic brain injury, and spinal cord injury. It can be usefully applied.
  • 1 is a result of analyzing the characteristics of stem cells isolated from the amnion epithelium of the human placenta.
  • Figure 2 is a result of evaluating the proliferation and differentiation of human placental stem cells derived from FGF-4 treatment.
  • Figure 3 is a result of measuring the differentiation ability of the neural precursor cells obtained by the differentiation method of the present invention and the neural precursor cells obtained through the two-dimensional differentiation method to the neurons through nestin expression.
  • Figure 4 is a result of measuring the differentiation capacity of the neural progenitor cells obtained by the differentiation method of the present invention and the neural progenitor cells obtained through the two-dimensional differentiation method through the expression of Tuj1.
  • 5 is a result of evaluating the differentiation capacity of neural progenitor cells obtained by applying various adult stem cells to the differentiation method according to the present invention.
  • Fig. 7 shows the results of the damaged motor function recovery test.
  • 11 is a result of measuring the in vivo neuronal differentiation ability through nestin expression when transplanted neuronal progenitor cells obtained according to the differentiation method of the present invention in rats of Parkinson's model.
  • Figure 13 is a result of measuring the in vivo neuronal differentiation capacity through TH expression when transplanted neuronal progenitor cells obtained according to the differentiation method of the present invention in rats of Parkinson's model.
  • Figure 14 shows the effect of inhibiting the inflammatory response in vivo when the neuronal progenitor cells obtained according to the differentiation method of the present invention in rats of Parkinson's model (Iba1 (microglial cell marker; microglial cell marker) and GFAP ( These results were measured through the expression of astrocyte makers.
  • Parkinson's model Iba1 (microglial cell marker; microglial cell marker)
  • GFAP GFAP
  • adult stem cell refers to stem cells derived from adult cells, for example, placenta-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, fat -Derived stem cells, stillborn fetal brain derived neural stem cells, or mesenchymal stem cells derived from adult cells.
  • neural-impaired diseases refers to diseases caused by nerve damage in the brain, spinal cord, etc., for example, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, etc. Neurodegenerative diseases of; stroke; Tramatic brain injury; Spinal cord injury, and the like.
  • the present invention (a) coating an adhesive protein (adhesive protein) on the bottom surface of the culture vessel; (b) spotting adult stem cell-containing spheres on the bottom surface coated with the adhesive protein obtained in step (a) by spotting a dispersion containing adult stem cells. Attaching to a face; And (c) adding a medium for differentiating neural progenitor cells to the culture vessel obtained in step (b), and culturing the adult stem cells into neural progenitor cells.
  • an adhesive protein adheresive protein
  • Differentiation method of the present invention comprises the step of coating an adhesive protein (adhesive protein) on the bottom surface of the culture vessel (step (a)).
  • the culture vessel may be a conventional cell culture dish, flask (T-25 flask) and the like, but is not limited thereto.
  • the adhesive protein may be proteins that are commonly coated on the basal surface during cell culture, for example, at least one selected from the group consisting of poly-L-ornithine and fibronectin. Can be.
  • poly-L-ornithine and fibronectin may be mixed and used, and the mixing ratio may be, for example, a weight ratio of 3 to 4: 1, but is not limited thereto.
  • the amount of the adhesive protein may be in the range of the amount of the coating layer of about 3 to 5 mm thickness can be formed on the bottom surface of the culture vessel, the coating is performed by adding an aqueous solution of the adhesive protein to the culture vessel, and left for 30 minutes Can be.
  • the differentiation method of the present invention is characterized by spotting the dispersion containing adult stem cells on the bottom surface coated with the adhesive protein obtained above to obtain adult stem cell-containing spheres on the bottom surface. Attaching to it (step (b)).
  • the dispersion containing the adult stem cells those obtained by dispersing the adult stem cells in the medium for neural progenitor cell differentiation can be used.
  • cells obtained by proliferating adult stem cells in a medium containing fetal bovine serum and the like can be prepared by dispersing the cells in a medium for differentiation of neural progenitor cells.
  • FGF4 Fibroblast Growth Factor-4
  • the dispersion containing the adult stem cells is a medium (eg, fetal bovine serum) containing the adult stem cells in fetal bovine serum, heparin, and Fibroblast Growth Factor-4 (FGF4).
  • FGF4 Fibroblast Growth Factor-4
  • Penicillin-streptomycin, heparin, and fibroblast growth factor (Fibroblast Growth Factor-4, FGF4) containing incubated in ⁇ -MEM medium can be used.
  • the dispersion containing the adult stem cells it is preferable to use a dispersion pre-treated to contain cells pre-treated to include cells with increased proliferation and differentiation ability.
  • the culture may be performed by incubating for about 2-3 days at 37 ° C. in a culture medium of CO 2 , and if necessary, the culture medium may be continuously changed once every 2 or 3 days. .
  • the concentration of the dispersion containing the adult stem cells may range from 300,000 to 500,000 cells / ml, preferably from about 400,000 cells / ml, depending on the size of the cells. If the concentration of the dispersion is less than 300,000 cells / ml, spheres (that is, adult stem cell-containing spheres) is not formed to form a layer may lower the differentiation efficiency.
  • the "sphere” includes a variety of spherical forms, including convex semicircular form, or hemisphere form.
  • the spotting can be performed by spotting a dispersion containing adult stem cells on the bottom surface, and left for about 15 minutes at room temperature after spotting, thereby allowing adult stem cell-containing spheres (eg, in the form of hemispheres). Spheres) can be formed and attached.
  • the differentiation method of the present invention includes the step of adding neuronal progenitor cell differentiation medium to the culture vessel obtained in step (b), and culturing [step (c)].
  • the neural progenitor cell differentiation medium may be used without limitation as long as it is a medium known to differentiate adult stem cells into neural progenitor cells.
  • the neural progenitor cell differentiation medium may be ⁇ -MEM medium containing fetal bovine serum, penicillin-streptomycin, heparin, and fibroblast growth factor-4 (FGF-4).
  • the culture may be carried out under 37 ° C., CO 2 culture conditions, for example, by continuously changing the culture solution every two days.
  • the stem cells may be derived from the placenta.
  • the human placenta contains progenitor / stem cells as well as essential roles such as fetal development, nutrition and tolerance.
  • Placental stem cells are divided into (1) human amniotic epithelial cells (hAEC), (2) human amniotic mesenchymal cells (hAMSC), (3) human chorionic mesenchymal cells, hCMSC), (4) human chorionic trophoblastic cells (hCTC), divided into four sites, and the placental stem cells may be hAEC, hAMSC, hCMSC, or hCTC.
  • stem cells obtained from amniotic epithelium can be particularly preferably used.
  • Placenta-derived stem cells, compared with other adult stem cells, can be obtained safely and easily, without the need for invasive procedures, has low ethical limitations, and has the advantage of low immune rejection.
  • the neural progenitor cells obtained by the differentiation method according to the present invention can be differentiated into neural cells as necessary.
  • the neural progenitor cells may comprise a medium comprising human sonic hedgehog (SHH) and fibroblast growth factor 8 (FGF8), such as ITS medium [5 mg / L insulin, 50 mg / L transferrin, 5.19 mg / L selenite] can be differentiated into neurons.
  • SHH human sonic hedgehog
  • FGF8 fibroblast growth factor 8
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating neuroinjury disease, which comprises neuroprogenitor cells obtained according to the differentiation method as an active ingredient.
  • the neural progenitor cells obtained according to the differentiation method according to the present invention differ greatly in activity from the neural progenitor cells obtained according to the differentiation method through the conventional two-dimensional culture.
  • neurotrophic factors such as hGDNF, hBDNF, etc. are caused by cell-to-cell interaction of neuroprogenitor cells obtained by the differentiation method according to the present invention. It is assumed that this is due to the large amount of expression.
  • the neurological injury is composed of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, stroke, traumatic brain injury, and spinal cord injury It may be selected from the group, preferably Parkinson's disease.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, that is, a carrier commonly used in the field of cell therapy, and according to a conventional method, injections, lyophilized preparations, suspensions, etc. It may be formulated in the form of.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include a sterile aqueous solution (eg, saline solution), a non-aqueous solvent, and the like.
  • an appropriate stabilizer, adjuvant eg, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, etc.
  • isotonic agents preservatives, and the like
  • the dosage of the neuronal progenitor cells contained in the pharmaceutical composition of the present invention as an active ingredient varies depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the neural progenitor cells are 1 day. 5 X 10 4 5 x 10 6 cells / kg, which may be administered once or several times a day.
  • the administration may be administered by brain transplantation, intravenous injection or the like.
  • Placenta was obtained from a pregnant woman who delivered her fetus normally. Prior to obtaining placenta samples, all pregnant women received informed consent in advance. In addition, the Institutional Review Board of Cha Hospital has been approved for the collection of placenta samples and their use for research purposes.
  • Placental stem cells were harvested from amnionic epithelium obtained by caesarean section. That is, the cells obtained by scraping off the aniotic epithelium and scraping the inner membrane of the amnion are obtained, and also scraping the cells in the upper portion of the amnion stripped surface (villi). The cells were combined with the cells. The obtained cells were treated with 0.5% collagenase IV and trypsin (Sigma, St.
  • 3-25 alpha-MEM medium containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin, 1 ug / ml heparin and 25 ng / ml Fibroblast Growth Factor-4 (FGF4) was added to the flask, mixed well was added to the cells obtained in (1), and cultured at 37 °C, CO 2 culture conditions. Subcultures were performed approximately three days after the start of the culture, when the cells became 80% confluenced.
  • the cells harvested through the secondary passage were cultured with medium (10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin, 1 ug / ml heparin, 25 ng / ml fibroblast growth factor-). 4, FGF4) containing alpha-MEM medium) to prepare a dispersion of about 400,000 cells / ml concentration.
  • the resulting dispersion was spotted on the coating layer using a micropipette to form convex semisphere spheres, and then left at room temperature for 15 minutes to adhere the spheres.
  • 3 ml of alpha-MEM medium containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin, 1 ug / ml heparin and 25 ng / ml Fibroblast Growth Factor-4 (FGF4) was added. Thereafter, at 37 ° C., under CO 2 culture conditions, the culture medium was changed every two days with the same culture solution, and cultured for 6 days.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Example 2, BM-MCS), cord blood-derived mesenchymal stem cells (Example 3, UCB-MSC), adipose derived stem cells (Example 4, ADSC), and abortion-derived neural stems Using progenitor cells (Example 5, Fetal-NPC), neuroprogenitor cells were obtained in the same manner as in (2) to (4) of Example 1.
  • Example 1 15 ⁇ g / ml of poly-L-ornithine and 4 ⁇ g / ml of fibronectin were added to a 60 mm culture dish to form an adhesive protein coating layer on the bottom surface.
  • Cells harvested through secondary passage in Example 1 (2) were cultured in medium (10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin, 1 ug / ml heparin, 25 ng / ml fibroblast growth factor ( Fibroblast Growth Factor-4 (FGF4) containing alpha-MEM medium) was dispersed to prepare a dispersion of about 400,000 cells / ml concentration.
  • medium 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin, 1 ug / ml heparin, 25 ng / ml fibroblast growth factor ( Fibroblast Growth Factor-4 (FGF4) containing alpha-MEM medium
  • the resulting dispersion was spotted on the coating layer using a micropipette to form convex semisphere spheres, and then left at room temperature for 15 minutes to adhere the spheres.
  • ITS medium containing 200 ng / ml of human sonic hedgehog (SHH) and 25 ng / ml of fibroblast growth factor 8 (FGF8) [5 mg / L insulin, 50 mg / 3 ml of L Transferrin, 5.19 mg / L selenite] was added to the neural progenitor cells obtained above, and then cultured for 14 days at 37 ° C. and CO 2 culture to differentiate into neurons.
  • the obtained nerve cells were carried out in the same manner as in the harvesting method of (4) of Example 1 to harvest differentiated neurons.
  • Example 1 15 ⁇ g / ml of poly-L-ornithine and 4 ⁇ g / ml of fibronectin were added to a 60 mm culture dish to form an adhesive protein coating layer on the bottom surface.
  • FGF4 Fibroblast Growth Factor-4
  • Example 1 (2) a dispersion (about 400,000 cells / ml) of the cells harvested through the secondary passage was added, and the cells were spread evenly with a slight shaking, followed by 37 ° C. and CO 2 culture conditions. The culture was changed for 6 days, changing the culture once every two days.
  • the differentiated neural progenitor cells obtained after the culture were harvested in the same manner as in the separation procedure of Example 3 (3).
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Comparative Example 2, BM-MCS), cord blood-derived mesenchymal stem cells (Comparative Example 3, UCB-MSC), adipose derived stem cells (Comparative Example 4, ADSC), and abortion-derived neural cord Using progenitor cells (Comparative Example 5, Fetal-NPC), nerve precursor cells were obtained in the same manner as in Comparative Example 1. Also in the two-dimensional culture, cells obtained by improving the proliferation and differentiation capacity of each stem cell in the same manner as in Example (2) were used for the culture.
  • Example 1 the dispersion (about 400,000 cells / ml) of the cells harvested through the second subculture was added, and the cells were spread evenly with slight shaking, followed by 2 days at 37 ° C. and CO 2 culture conditions.
  • ITS medium containing 200 ng / ml of human sonic hedgehog (SHH) and 25 ng / ml of fibroblast growth factor 8 (FGF8) [5 mg / L insulin, 50 mg / 3 ml of L Transferrin, 5.19 mg / L selenite] was added to the neural progenitor cells obtained above, and then cultured for 14 days at 37 ° C. and CO 2 culture to differentiate into neurons.
  • the obtained nerve cells were carried out in the same manner as in the harvesting method of (4) of Example 1 to harvest differentiated neurons.
  • Example 1 (1) The characteristics of the amnion epithelial cell-derived stem cells of the placenta obtained in Example 1 (1) were confirmed. That is, the stem cells obtained in Example 1 (1) were observed with an optical microscope, and the results are as shown in a of FIG.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • PCR-reaction was carried out at 45 ° C. for 50 minutes, at 70 ° C. for 10 minutes, and PCR-reaction was carried out for 30 cycles at 95 ° C. for 5 minutes and at 95 ° C. for 30 seconds / 58 ° C. for 40 seconds / 72 ° C. for 30 minutes. After the cycles, the reaction was performed at 72 ° C. for 10 minutes, followed by electrophoresis on 2% agarose. The result is the same as 1b. Primers used in the PCR-reaction are shown in Table 1 below.
  • the amnion epithelial cell-derived stem cells of the placenta obtained in Example 1 (1) were washed with phosphate buffered saline (PBS), and after treatment with trypsin, the cells were collected. And centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, washed with 5% FBS and PBS mixed, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After the supernatant was discarded, the cells were suspended in FACS buffer and 10000 cells were divided by the number of samples.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Each well contains antibodies (FITC-labeled anti-SSEA4, TRA-1-81, CD15, CD45, CD34 and PE-labeled anti-TRA-1-60, CD184, CD9, CD44, CD13). After reacting for 20 minutes at 4 °C was analyzed using a flow cytometer (flow cytometery). The result is shown in FIG. 1C.
  • the obtained cells expressed stem cell markers such as oct4, sox2, nanog, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-81.
  • Example 1 (1) The cells obtained in Example 1 (1) were cultured in the same manner as in Example 1 (2) except that FGF4 was not added to the medium.
  • the obtained cells [(-) FGF4] and the cells [(+) FGF4] obtained in Example (2) were washed three times with PBS and fixed in PBS containing 4% paraformaldehyde for 10 minutes. After washing three times with PBS, and treated with a blocking buffer (5% goat serum) containing 0.3% Triton-X100 for 1 hour at room temperature, the neuronal precursor cell polyclonal antibody nestin (nestin) ) Primary antibody ( rabbit anti-nestin, COVANCE, CA, USA) was diluted 1: 400 in blocking buffer and reacted overnight at 4.
  • a blocking buffer 5% goat serum
  • Triton-X100 0.3% Triton-X100
  • the neuronal differentiation ability of the neural progenitor cells obtained in Example 1 (3) and the neural progenitor cells obtained in Comparative Example 1 was evaluated. Differentiation capacity was evaluated in nestin and Tuj1, which are known as markers of neural progenitor cells.
  • nestin was diluted 1: 400 in rabbit anti-nestin (COVANCE, CA, USA) in blocking buffer and reacted overnight at 4 ° C. Washed three times with PBS and reacted for 1 hour in the dark with anti-rabbit secondary antibody (Alexa Fluor TM 488). After washing three times with PBS, onto the slide glass was performed immunostaining.
  • Tuj1 was diluted 1: 400 in mouse anti-Tuj1 (Millipore, CA.
  • FIGS. 3 and 4 respectively.
  • the '2D-sphere system' shows the immunostaining results of neurons differentiated from the neural precursor cells obtained in (3) of Example 1
  • the '2D-normal system' shows the neural precursors obtained in the comparative example. Immunostaining results of neurons differentiated from cells are shown.
  • the rate of differentiation of neural progenitor cells into neurons obtained by the differentiation method according to the present invention was significantly higher than that of the conventional two-dimensional differentiation method.
  • the neuronal differentiation ability of the neural progenitor cells obtained in Examples 2 to 5 and the neural progenitor cells obtained in Comparative Examples 2 to 5 was evaluated.
  • the neuronal differentiation ability of the neural progenitor cells (neural progenitor cells differentiated from Am-PdMC) obtained in Example 1 and Comparative Example 1 was also evaluated. Differentiation capacity was evaluated by immunostaining in the same manner as in Test Example 2, which is a marker of neural progenitor cells.
  • FIG. 5 it can be seen that the rate of differentiation of neural progenitor cells into neurons obtained by applying the differentiation method according to the present invention to various adult stem cells is significantly higher than that of the conventional two-dimensional differentiation method. .
  • Example 6 and Comparative Example 6 the change in the expression of MAP2, a marker of neurons, was measured through immunostaining for 14 days from the start of differentiation into neurons.
  • the differentiation method according to the present invention when the differentiation method according to the present invention is applied to differentiate neuronal progenitor cells, and then to differentiation into neurons, the neurons are significantly higher in efficiency than the conventional two-dimensional differentiation method. It can be seen that can be obtained.
  • 6-hydroxy dopamine (6-OHDA) was administered to rats to produce a Parkinson's disease model.
  • Each rat was divided into 4 groups, and the first group (Sham Control) treated only phosphate buffered saline, and the second group (PDSC with 2D Sphere Culture) phosphate buffered 1.5 x 10 5 cells obtained in Example 1 Suspended in 3ul of saline and implanted into the brain using a stereosurgery instrument (Stereotaxic, Harvard Appartus, MA.
  • the third group (PDSC with Normal Culture) the neuronal precursor cells 1.5x10 5 cells obtained in Comparative Example 1 Suspended in 3ul of phosphate-buffered saline and implanted into the brain using the brain stereotactic surgical instrument
  • group 4 (PDSC with Non-Expended Cells) was added 1.5x10 5 cells obtained in Comparative Example 1 to 3ul of phosphate-buffered saline It was suspended and implanted into the brain using the stereosurgery instrument.
  • the cylinder test was performed as follows. In other words, after placing rats of each group in a transparent cylinder, the six pantones of spontaneous behavior of rats (front left foot contact, front right foot contact, both left hand contact after front left foot contact, left foot contact after front right foot contact, front both feet) Contact, only the upper body and sitting) was selected for 5 minutes through video shooting. The result of measuring the contact number of the front left foot for 3 minutes among the measurement items is shown in FIG. 8.
  • ACCELER ROTA-ROD for rats
  • ACCELER (ROTA-ROD for rats) was used to evaluate the behavioral ability of rats for long-term memory and motor function. Three weeks after transplantation, rats of each group were placed on the rota-rod rotating cylinder, and then adjusted to the initial 4 rpm for about 3 minutes, the test time was adjusted to 5 minutes, and the rats dropped down while increasing the rotation speed. Long-term memory and motor function was measured by measuring the value three times a day 6 weeks after transplantation in the same manner as the time measured three times a day for three days, the results are shown in FIG.
  • group 2 rats were deeply anesthetized with ether, followed by bleeding of phosphate buffered saline (PBS) through the heart to drain blood, followed by fixation solution (4% paraformaldehyde). After perfusion, the organs in the body were fixed, and the brains were extracted. After extracting the brain and soaked in fixative solution for 2 days, using a freezing microtom (Shandon, England), the whole section of the brain was sliced to a thickness of 40 ⁇ m to take a sample. The striatum of the brain tissue obtained from the sections was extracted, washed twice with phosphate buffered saline, and added to Triton X-100.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIGS. 11 and 12 show that the cells transplanted in vivo have properties as neuroprogenitor cells before they are differentiated into neurons.
  • phosphate buffered saline PBS
  • fixation solution 4% paraformaldehyde-PFA
  • the whole section of the brain was sectioned to a thickness of 40 ⁇ m to take a sample.
  • the striatum of the brain tissue obtained from the sections was extracted, washed twice with phosphate buffered saline, and added to Triton X-100.
  • 13 shows the results of measuring TH expression by photographing and storing the striatum sections of the brain tissues extracted from each group with an optical microscope (Olympus, Japan) and analyzing the images. 13 shows that the cells transplanted in vivo were effectively differentiated into dopamine neurons (neurons).
  • the activity of A microglia activation marker and neuronal B activation of astrocyte activation markers was measured. That is, the activity measurement was performed by deeply anesthetizing rats of group 1 and group 2 using ether, and then bleeding blood by perfusing phosphate buffer saline (PBS) through the heart, and fixing solution (4%). paraformaldehyde-PFA) was used to fix the organs in the body, and then brain was extracted. After extracting the brain and soaked in fixative solution for 2 days, using a freezing microtom (Shandon, England), the whole section of the brain was sectioned to a thickness of 40 ⁇ m to take a sample.
  • PBS phosphate buffer saline
  • the striatum and black matter (substantia nigra) of the brain tissues obtained from the sections were extracted, washed twice with phosphate buffered saline, and added to Triton X-100. After washing twice with phosphate buffered saline, the tissues were reacted with rabbit anti-Iba1 (Abcam, England) and rabbit anti-Glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Chemicon, MA, USA).
  • rabbit anti-Iba1 Abcam, England
  • GFAP rabbit anti-Glial fibrillary acidic protein
  • the difference in activity of the neural progenitor cells obtained in the differentiation method according to the present invention and the conventional two-dimensional culture differentiation method is obtained from the neural progenitor cells obtained by the differentiation method according to the present invention.
  • Cell-to-Cell interaction is thought to be due to increased expression of the neurotrophic factors hGDNF, hBDNF, especially hGDNF, which are known to be effective in the treatment of Parkinson's disease (data not shown). . Therefore, the neural progenitor cells according to the differentiation method of the present invention are expected to be effectively applied to the treatment of various neurological disorders including Parkinson's disease.

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Abstract

본 발명은 (a) 배양용기의 바닥면에 접착 단백질을 코팅하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 접착 단백질이 코팅된 바닥면 상에, 성체줄기세포를 함유하는 분산액을 스팟팅하여 성체줄기세포-함유 구를 상기 바닥면에 부착시키는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 배양용기에 신경전구세포 분화용 배지를 가하고, 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 신경전구세포로의 분화방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

2차원 배양을 이용한 성체줄기세포의 신경전구세포로의 분화방법 및 신경전구세포를 이용한 신경손상 질환 치료용 약학 조성물
본 발명은 성체줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 개선된 2차원(2-dimensional) 배양방법을 통하여 높은 효율로 성체줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 이용한 신경손상 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
배아줄기세포, 성체줄기세포, 역분화 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells) 등의 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킴으로써, 세포치료법(cell therapy)으로서의 활용 가능성에 관한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 특히, 퇴행성 신경질환을 포함한 수많은 난치성 신경손상 질환의 치료를 위하여, 줄기세포를 신경전구세포 및/또는 신경세포로 분화시키는 효율적인 방법에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 상기 신경질환(즉, 신경손상 질환)의 예로는 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환 (Huntington's disease), 뇌성마비 등의 퇴행성 신경질환; 뇌졸중; 외상성 뇌손상 (Tramatic brain injury); 척수 손상 (Spinal cord injury) 등이 열거된다. 또한, 배아줄기세포를 활용하는데 따른 윤리적인 문제점을 회피하기 위하여, 윤리적인 문제가 없는 성체줄기세포 및 역분화 만능줄기세포의 분화에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다.
신경질환을 치료하기 위한 세포치료법은, 손상된 신경세포와 비슷한 특성을 보유한 분화된 신경세포를 이식하는 방법(즉, replacement therapy); 이식된 세포에서 신경보호인자(neuroprotective factor)를 분비함으로써 질환부위의 환경을 개선하는 방법(즉, neurotrophic factor therapy); 및 특정 영역(neural stem cell niche)에 내재되어 있는 신경전구세포(neural progenitor cell)의 신경생성 (neurogenesis)을 유도 또는 향상시키는 방법으로 분류될 수 있다 [문헌 1 및 2 참조]. 현재까지, 성체줄기세포를 이용한 세포 치료방법이 다양한 신경질환 모델에서 시도된 바 있으며, 예를 들어, 척수 손상, 파킨슨 질환, 허혈성 해마(ischemic hippocampus)에 성체줄기세포에서 분화된 신경세포를 이식하였을 때 세포 사멸이 저해되는 결과가 보고된 바 있다 [문헌 3 내지 6 참조]. 그러나 아직 그 기전은 명확하지 않으며, 분화된 신경세포의 직접적인 적응에 의해 것보다는 이식된 세포에서 분비되는 새로운 신경보호인자(neurotrophic factor)에 의한 것이라 추정되고 있다.
줄기세포를 이용하여 퇴행성 신경질환 등을 포함한 신경질환의 치료를 위한 세포치료법 개발을 위해서는, 줄기세포를 신경전구세포 및/또는 신경세포로 분화시킬 수 있는 방법을 확립하는 것이 필수적이다. 특히, 윤리적인 문제가 없는 성체줄기세포로부터 신경전구세포 및/또는 신경세포로 효율적이고, 안정적이며, 또한 재현성 있게 분화시키는 방법을 개발하는 것은 매우 중요하다.
성체줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 방법으로서, 분화유도 배지 중에서 성체줄기세포를 2차원 배양을 통하여 분화시키는 방법이 보고된 바 있다. 예를 들어, 피브로넥틴 등의 접착 단백질이 바닥면에 코팅된 배양용기에 분화유도 배지를 넣고, 성체줄기세포를 가하여(필요할 경우 배양용기를 약간씩 흔들어 줌으로써) 바닥면에 골고루 퍼지게 하도록 한 후, 배양함으로써 신경전구세포로의 분화를 유도한다. 상기 분화방법은 성체줄기세포가 코팅층이 형성된 바닥면에 골고루 퍼져 있는 상태로 배양을 수행함으로써 2차원(2-dimensional) 배양으로 분류된다.
2차원 배양을 통한 분화방법에 대한 개선된 방법으로서, 3차원 (3-dimensional) 배양을 통한 분화방법이 보고된 바 있다. 3차원 배양을 통한 분화방법은 배양액 중에서 부유성 구(free floating sphere)을 형성하여 세포와 세포 사이의 상호작용(cell-to-cell interaction)을 높임으로써, 2차원 배양을 통한 분화방법에 비하여 분화효율이 높다는 장점이 있다. 그러나 3차원 배양을 통한 분화방법은 처리과정이 복잡할 뿐만 아니라, 성장속도가 느리고, 재현성 있는 신경전구세포를 얻기가 곤란하다는 문제점이 있다. 특히, 균일한 부유성 구를 만들 수 없어 조건을 일정하게 유지시키기 어렵다. 즉 구의 크기를 통제할 수 없어 세포의 특징이 매번 바뀌게 된다. 따라서 기존의 3차원 배양 조건은 동일한 조건을 갖출 수 없기 때문에 계대배양 시 동일한 크기로 계대배양이 곤란하여 실험 결과가 균일하지 않고, 또한 성장 속도의 둔화 때문에 증식력이 낮다는 문제점이 있다.
본 발명은 줄기세포 특히 윤리적인 문제가 없는 성체줄기세포를 신경전구세포로 효율적으로 분화시킬 수 있는 개선된 방법으로서, 2-차원 배양을 통한 효율적인 분화방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 분화방법을 통하여 얻어진 신경전구세포를 포함하는 파킨슨 질환 등의 신경손상 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 개선된 2-차원 배양을 통하여 성체줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 분화방법을 통하여 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 신경손상 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 배양용기의 바닥면에 접착 단백질(adhesive protein)을 코팅하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 접착 단백질이 코팅된 바닥면 상에, 성체줄기세포를 함유하는 분산액을 스팟팅(spotting)하여 성체줄기세포-함유 구(adult stem cells-containing spheres)를 상기 바닥면에 부착시키는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 배양용기에 신경전구세포 분화용 배지를 가하고, 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 신경전구세포로의 분화방법이 제공된다.
본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 접착 단백질은 폴리-L-오르니틴(Poly-L-ornithine) 및 피브로넥틴(fibronectin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 상기 성체줄기세포를 함유하는 분산액은 성체줄기세포를 소태아혈청, 헤파린, 및 섬유아세포성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양하여 얻어진 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 성체줄기세포를 함유하는 분산액의 농도는 300,000∼500,000 cells/ml의 범위일 수 있다.
상기 성체줄기세포는 태반, 골수, 제대혈, 지방(또는 지방조직)에서 유래한 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 태반에서 유래한 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 신경전구세포 분화용 배지로는 소태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신, 헤파린, 및 섬유아세포성장인자를 함유하는 α-MEM 배지를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 신경손상 질환 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 신경손상 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 뇌성마비, 뇌졸중, 외상성 뇌손상(Tramatic brain injury), 및 척수 손상(Spinal cord injury)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 파킨슨 질환일 수 있다.
본 발명의 분화방법은 접착 단백질이 코팅된 바닥면 상에 성체줄기세포를 함유하는 분산액을 스팟팅(spotting)하여, 성체줄기세포-함유 구(adult stem cells-containing spheres) 형태로 배양용기 바닥면에 부착시키켜 2차원 배양을 통하여 분화를 유도한다. 따라서 본 발명에 따른 분화방법은 세포 간 상호작용(cell-to -cell interaction)을 높임으로써 분화 효율을 크게 높일 수 있다. 또한, 빠른 성장 속도(double time)를 달성할 수 있기 때문에, 얻어진 신경전구세포가 계대배양을 통하여 분화능을 유지하면서 높은 증식력을 갖는다. 또한, 분화유도 방법이 간단할 뿐만 아니라 분화 조건을 균일하게 설정하는 것이 가능하여 균일하고 재현성있는 분화유도를 달성할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포는 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 뇌성마비, 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 및 척수 손상 등을 포함한 다양한 신경손상 질환의 세포치료법(cell therapy)에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 인간 태반의 양막 상피로부터 분리한 줄기세포의 특성을 분석한 결과이다.
도 2는 인간 태반 유래 줄기세포의 FGF-4 처리에 따른 증식 및 분화능 증가를 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포 및 2차원 분화방법을 통하여 얻어진 신경전구세포의 신경세포로의 분화능력을 nestin 발현을 통하여 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포 및 2차원 분화방법을 통하여 얻어진 신경전구세포의 신경세포로의 분화능력을 Tuj1 발현을 통하여 측정한 결과이다.
도 5는 다양한 성체줄기세포를 본 발명에 따른 분화방법에 적용하여 얻어진 신경전구세포의 분화능력을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 분화방법 및 2차원 분화방법을 이용하여 신경세포로 분화시켰을 때, 신경세포로의 분화효율을 평가한 결과이다.
도 7은 손상된 운동 기능 회복 측정 시험(Rotation test) 결과이다.
도 8는 손상된 운동 기능 회복 측정 시험(Cylinder test) 결과이다.
도 9는 단기 기억 행동 시험(Short term memory rotarod test) 결과이다.
도 10는 장기 기억 및 운동 기능 능력 행동 시험(Long term memory and motor function test) 결과이다.
도 11은 본 발명의 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 파킨슨 모델의 랫트에 이식하였을 때, 생체내(in vivo) 신경세포분화능력을 nestin 발현을 통하여 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 파킨슨 모델의 랫트에 이식하였을 때, 생체내(in vivo) 신경세포분화능력을 Tuj1 발현을 통하여 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 파킨슨 모델의 랫트에 이식하였을 때, 생체내(in vivo) 신경세포분화능력을 TH 발현을 통하여 측정한 결과이다.
도 14는 본 발명의 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 파킨슨 모델의 랫트에 이식하였을 때, 생체내(in vivo)에서 염증반응 억제 효과를 Iba1(microglial cell marker; 미세교세포 표지인자)와 GFAP (astrocyte maker; 성상교세포 표지인자) 발현을 통하여 측정한 결과이다.
본 명세서에서, "성체줄기세포(adult stem cell)"라 함은 성체세포로부터 유래된 줄기세포를 말하며, 예를 들어, 태반-유래 줄기세포, 골수-유래 줄기세포, 제대혈-유래 줄기세포, 지방-유래 줄기세포, 낙태아 전뇌 유래 신경줄기세포(stillborn fetal brain derived neural stem cells), 또는 성체세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells) 등을 포함한다.
또한, "신경손상 질환(neural-impaired diseases)"라 함은 뇌, 척수 등에서 신경이 손상되어 발생하는 질환을 말하며, 예를 들어, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환 (Huntington's disease), 뇌성마비 등의 퇴행성 신경질환; 뇌졸중; 외상성 뇌손상 (Tramatic brain injury); 척수 손상 (Spinal cord injury) 등을 포함한다.
본 발명은 (a) 배양용기의 바닥면에 접착 단백질(adhesive protein)을 코팅하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 접착 단백질이 코팅된 바닥면 상에, 성체줄기세포를 함유하는 분산액을 스팟팅(spotting)하여 성체줄기세포-함유 구(adult stem cells-containing spheres)를 상기 바닥면에 부착시키는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 배양용기에 신경전구세포 분화용 배지를 가하고, 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 신경전구세포로의 분화방법을 제공한다.
본 발명의 분화방법은 배양용기의 바닥면에 접착 단백질(adhesive protein)을 코팅하는 단계[단계(a)]를 포함한다. 상기 배양용기는 통상의 세포배양용 접시, 플라스크 (T-25 플라스크) 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 접착 단백질은 세포배양 시 기저면에 통상적으로 코팅되는 단백질들을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 폴리-L-오르니틴 (Poly-L-ornithine), 피브로넥틴 (Fibronectin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 폴리-L-오르니틴과 피브로넥틴을 혼합하여 사용할 수 있으며, 그 혼합비로는 예를 들어 3∼4 : 1의 중량비일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 접착 단백질의 사용량은 배양용기의 바닥면에 약 3∼5 mm 두께의 코팅층이 형성될 수 있는 양의 범위일 수 있으며, 상기 코팅은 접착단백질 수용액을 배양용기에 가하고, 30분 동안 방치함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 분화방법은 상기에서 얻어진 접착 단백질이 코팅된 바닥면 상에 성체줄기세포를 함유하는 분산액을 스팟팅(spotting)하여 성체줄기세포-함유 구(adult stem cells-containing spheres)를 상기 바닥면에 부착시키는 단계[단계(b)]를 포함한다.
상기 성체줄기세포를 함유하는 분산액은 성체줄기세포를 그대로 신경전구세포 분화용 배지에 분산시켜 얻어진 것을 사용할 수 있다. 또한, 필요할 경우, 성체줄기세포의 양을 늘리기 위하여, 성체줄기세포를 소태아혈청 등을 함유하는 배지 중에서 증식시켜 얻어진 세포를 신경전구세포 분화용 배지에 분산시켜 상기 분산액을 준비할 수 있다. 또한, 필요할 경우, 헤파린 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 배지 중에서 성체줄기세포를 배양함으로써, 신경전구세포로의 분화능을 증가시킨 세포를 상기 배지에 분산시켜 상기 분산액을 준비할 수도 있다.
특히 바람직하게는, 상기 성체줄기세포를 함유하는 분산액은 성체줄기세포를 소태아혈청, 헤파린, 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 포함하는 배지(예를 들어, 소태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신, 헤파린, 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 α-MEM 배지) 중에서 배양하여 얻어진 것을 사용할 수 있다. 즉, 상기 성체줄기세포를 함유하는 분산액은 증식 및 분화능이 증가된 세포를 포함하도록 전처리된 세포를 함유하도록 전처리된 분산액을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 배양은 상기 배지 중에서 약 37℃, CO2 배양 조건에서 약 2∼3일 동안 배양함으로써 수행할 수 있으며, 필요할 경우, 2일 또는 3일에 한번 씩 배양액을 갈아주며 지속적으로 계대배양할 수도 있다.
상기 성체줄기세포를 함유하는 분산액의 농도는 세포의 크기에 따라 300,000∼500,000 cells/ml의 범위, 바람직하게는 약 400,000 cells/ml의 범위일 수 있다. 만약 상기 분산액의 농도가 300,000 cells/ml 미만일 경우, 구(sphere) (즉, 성체줄기세포-함유 구)가 형성되지 않고 층을 이루게 되어 분화효율이 저하될 수 있다. 상기 "구(sphere)"는 볼록한 반원 형태 즉 반구(hemisphere) 형태를 포함한 다양한 구상 형태(spherical forms)를 포함한다. 상기 스팟팅은 바닥면 상에 성체줄기세포를 함유하는 분산액을 스팟팅함으로써, 수행할 수 있으며, 스팟팅 후 실온에서 약 15분간 방치함으로써, 성체줄기세포-함유 구 (예를 들어, 반구 형태의 구)를 형성 및 부착시킬 수 있다.
본 발명의 분화방법은 상기 즉, 단계 (b)에서 얻어진 배양용기에 신경전구세포 분화용 배지를 가하고, 배양하는 단계 [단계 (c)]를 포함한다.
상기 신경전구세포 분화용 배지는 성체줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 배지로 알려져 있는 배지라면, 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 신경전구세포 분화용 배지는 소 태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신, 헤파린, 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4)를 함유하는 α-MEM 배지일 수 있다. 상기 배양은 37℃, CO2 배양 조건하에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 이틀에 한번 씩 배양액을 갈아주며 지속적으로 배양할 수 있다.
본 발명에 따른 분화방법은 다양한 성체세포 유래의 성체줄기세포를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 태반에서 유래한 줄기세포일 수 있다. 인간의 태반은 태아의 발생, 영양공급, 내성과 같은 필수적인 역할 뿐만 아니라, 전구세포/줄기세포도 포함하고 있다. 태반유래 줄기세포는 크게 (1) 양막 상피 세포(human amniotic epithelial cells, hAEC), (2) 양막 중간엽 세포(human amniotic mesenchymal cells, hAMSC), (3) 융모 중간엽 세포(human chorionic mesenchymal cells, hCMSC), (4) 융모 영양 아층 세포 (human chorionic trophoblastic cells, hCTC)로 4가지 부위로 나뉘며, 태반유래 줄기세포는 상기한 hAEC, hAMSC, hCMSC, 또는 hCTC 일 수 있다. 이 중, 양막 상피세포(amniotic epithelium)으로부터 얻어진 줄기세포를 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 태반유래 줄기세포는 다른 성체줄기세포에 비해, 침습적인 시술이 필요 없이 안전하고 용이하게 얻을 수 있으며, 윤리적 제한이 적을 뿐만 아니라, 면역 거부반응이 낮은 장점이 있다.
본 발명에 따른 분화방법에 의해 얻어진 신경전구세포는 필요에 따라 신경세포로 분화시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 신경전구세포는 SHH(human sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 포함하는 배지, 예를 들어 ITS 배지[5mg/L의 인슐린, 50mg/L의 트랜스페린 (Transferrin), 5.19mg/L 의 셀레나이트(selenite)] 중에서 배양함으로써 신경세포로 분화시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 신경손상 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포는 종래의 2차원 배양을 통한 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포와 활성에 있어서 크게 차이가 난다는 것이 밝혀졌다. 아직 구체적인 작용기전은 명확하지 않으나, 본 발명에 따른 분화방법에 의해 얻어진 신경전구세포가 세포와 세포사이의 상호작용 (Cell-to-Cell interaction)에 의한 hGDNF, hBDNF 등의 신경영양인자(neutrophic factor)가 다량으로 발현되는 것에 기인한 것으로 추정된다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 신경손상 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 뇌성마비, 뇌졸중, 외상성 뇌손상(Tramatic brain injury), 및 척수 손상(Spinal cord injury)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 파킨슨 질환일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 즉 세포 치료제(cell therapy) 분야에서 통상적으로 사용되는 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 주사제, 주사용 동결건조제제, 현탁제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균된 수용액(예를 들어, 생리식염수 등), 비수성용제 등을 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 적절한 안정화제, 아주반트(예를 들어, 프로인트 완전 아주반트, 프로인트 불완전 아주반트 등), 등장화제, 보존제 등을 포함할 수도 있다.
본 발명의 약학조성물에 유효성분으로서 함유되는 상기 신경전구세포의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 신경전구세포는 1일 5 X 104 ∼ 5 X 106 cells/kg으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여는 뇌이식, 정맥주사 등에 의해 투여될 수 있다.
이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 태반 상피세포 유래 줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화
(1) 상피세포 유래 줄기세포의 분리 및 배양
정상적으로 태아를 분만한 임산부로부터 태반을 얻었다. 태반 샘플을 얻기 전에, 모든 임산부로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받았다. 또한, 차병원 기관연구윤리위원회로부터, 태반 샘플의 수집 및 연구 목적을 위한 이들의 사용에 관하여 승인을 받았다. 제왕절개를 통하여 얻어진 양막 (amnionic epithelium)으로부터 태반줄기세포를 수확하였다. 즉, 양막(amniotic epithelium)을 벗겨내어 양막의 안쪽막(inner membrane)을 스크래핑(scrapping)하여 세포를 얻고, 또한 양막이 벗겨진 표면(융모막)의 상단 부위(upper portion)에 있는 세포를 스크래핑하여 얻어진 세포를 상기 세포와 합하였다. 얻어진 세포를 0.5% 콜라게나아제 IV 및 트립신(Sigma, St. Louis MO, USA)으로 30분 동안 37 ℃에서 처리하였다. 수확된 세포를 T25 플라스크(2 x 105 cells/mm3, Falcon) 중에서, 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS, (GIBCO)) 및 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO)으로 보충된 Ham's F-12/DMEM 배지 (GIBCO, New York, USA) 중에서 배양하였다.
(2) 상피세포 유래 줄기세포의 증식 및 신경전구세포로의 분화능 증가
10%의 소태아혈청, 1%의 페니실린-스트렙토마이신, 1ug/ml의 헤파린, 25ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 alpha-MEM 배지 3ml를 T-25 플라스크에 가하고, (1)에서 얻어진 세포를 가하여 잘 혼합하여, 37 ℃, CO2 배양 조건에서 배양하였다. 배양시작 후 세포가 80% confluence 해지는 시기인 약 3일후에 계대배양을 실시하였다.
(3) 신경전구세포로의 분화
60mm 배양 디쉬에 15ug/ml의 폴리-L-오르니틴(Poly-L-ornithine)과 4ug/ml의 피브로넥틴를 가하여 바닥면에 접착 단백질 코팅층을 형성시켰다. (2)에서 2차 계대배양을 통하여 수확된 세포를 배지(10%의 소태아혈청, 1%의 페니실린-스트렙토마이신, 1ug/ml의 헤파린, 25ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 alpha-MEM 배지) 중에 분산시켜 약 400,000 cells/ml 농도의 분산액을 조제하였다. 얻어진 분산액을 마이크로피펫을 사용하여 상기 코팅층에 스팟팅하여 볼록한 반원 모양(hemisphere)의 구를 형성시킨 다음, 실온에서 15분 동안 방치하여, 구(sphere)을 부착시켰다. 이후, 10%의 소 태아 혈청, 1%의 페니실린-스트렙토마이신, 1ug/ml의 헤파린, 25ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 alpha-MEM 배지 3ml을 가한 후, 37℃, CO2 배양조건에서, 동일한 배양액으로 이틀에 한번 씩 배양액을 갈아주면서, 6일 동안 배양하였다.
(3) 신경전구세포의 분리
배양용기로부터 배양액을 제거한 후 완충액으로 세척하였다. 0.25%의 트립신/EDTA를 이용해 2분간 효소 처리하여 세포를 분리한 후, 완충액으로 세척하였다. 얻어진 세포를 소 태아 혈청을 가하여 효소반응을 정지시키고, 1000rpm에서 약 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하여, 분화된 신경전구세포를 수확하였다.
실시예 2∼5. 골수, 제대혈, 지방, 및 낙태아 전뇌 유래 줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화
골수 유래 중간엽 줄기세포(실시예 2, BM-MCS), 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(실시예 3, UCB-MSC), 지방 유래 줄기세포(실시예 4, ADSC), 및 낙태아 전뇌 유래 신경줄기세포(실시예 5, Fetal-NPC)를 사용하여, 실시예 1의 (2) 내지 (4)과 동일한 방법으로 신경전구세포를 얻었다.
실시예 6. 신경세포로의 분화 및 분리
60mm 배양 디쉬에 15ug/ml의 폴리-L-오르니틴(Poly-L-ornithine)과 4ug/ml의 피브로넥틴를 가하여 바닥면에 접착 단백질 코팅층을 형성시켰다. 실시예 1의 (2)에서 2차 계대배양을 통하여 수확된 세포를 배지(10%의 소태아혈청, 1%의 페니실린-스트렙토마이신, 1ug/ml의 헤파린, 25ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 alpha-MEM 배지) 중에 분산시켜 약 400,000 cells/ml 농도의 분산액을 조제하였다. 얻어진 분산액을 마이크로피펫을 사용하여 상기 코팅층에 스팟팅하여 볼록한 반원 모양(hemisphere)의 구를 형성시킨 다음, 실온에서 15분 동안 방치하여, 구(sphere)을 부착시켰다. 이후, 10%의 소 태아 혈청, 1%의 페니실린-스트렙토마이신, 1ug/ml의 헤파린, 25ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 alpha-MEM 배지 3ml을 가한 후, 37℃, CO2 배양조건에서 2일 동안 배양하였다. 배양 완료 후 배지를 석션(suction)을 통하여 제거하고, 200ng/ml의 SHH(Human sonic hedgehog) 및 25ng/ml의 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 함유하는 ITS 배지[5mg/L의 인슐린, 50mg/L의 트랜스페린 (Transferrin), 5.19mg/L 의 셀레나이트(selenite)] 3ml을 상기에서 얻어진 신경전구세포에 가한 후, 37℃, CO2 배양조건에서 14일 동안 배양하여 신경세포로 분화시켰다. 얻어진 신경세포는 실시예 1의 (4)의 수확방법과 동일하게 실시하여, 분화된 신경세포를 수확하였다.
비교예 1. 2차원 배양
60mm 배양 디쉬에 15ug/ml의 폴리-L-오르니틴(Poly-L-ornithine)과 4ug/ml의 피브로넥틴을 가하여 바닥면에 접착 단백질 코팅층을 형성시켰다. 10%의 소태아혈청, 1%의 페니실린-스트렙토마이신, 1ug/ml의 헤파린, 25ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 alpha-MEM 배지 3ml을 상기 플라스크에 가하였다. 실시예 1의 (2)에서 2차 계대배양을 통하여 수확된 세포의 분산액(약 400,000 cells/ml)를 가하고, 약간씩 흔들어 주면서 세포를 골고루 퍼지게 한 다음, 37℃, CO2 배양조건에서, 동일한 배양액으로 이틀에 한번 씩 배양액을 갈아주면서, 6일 동안 배양하였다. 배양 후 얻어진 분화된 신경전구세포는 실시예 1의 (3)의 분리과정과 동일한 방법으로 수확하였다.
비교예 2∼5. 2차원 배양
골수 유래 중간엽 줄기세포(비교예 2, BM-MCS), 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(비교예 3, UCB-MSC), 지방 유래 줄기세포(비교예 4, ADSC), 및 낙태아 전뇌 유래 신경줄기세포(비교예 5, Fetal-NPC)를 사용하여, 비교예 1과 동일한 방법으로 신경전구세포를 얻었다. 상기 2차원 배양에 있어서도, 각각의 줄기세포를 실시예 1의 (2)와 동일한 방법으로 증식 및 분화능을 향상시켜 얻어진 세포를 배양에 이용하였다.
비교예 6. 2차원 배양에 의한 신경세포로의 분화 및 분리
60mm 배양 디쉬에 15ug/ml의 폴리-L-오르니틴(Poly-L-ornithine)과 4ug/ml의 피브로넥틴을 가하여 바닥면에 접착 단백질 코팅층을 형성시켰다. 10%의 소태아혈청, 1%의 페니실린-스트렙토마이신, 1ug/ml의 헤파린, 25ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF4)를 함유하는 alpha-MEM 배지 3ml을 상기 플라스크에 가하였다. 실시예 1의 (2)에서 2차 계대배양을 통하여 수확된 세포의 분산액(약 400,000 cells/ml)을 가하고, 약간씩 흔들어 주면서 세포를 골고루 퍼지게 한 다음, 37℃, CO2 배양조건에서 2일 동안 배양하였다. 배양 완료 후 배지를 석션(suction)을 통하여 제거하고, 200ng/ml의 SHH(Human sonic hedgehog) 및 25ng/ml의 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 함유하는 ITS 배지[5mg/L의 인슐린, 50mg/L의 트랜스페린 (Transferrin), 5.19mg/L 의 셀레나이트(selenite)] 3ml을 상기에서 얻어진 신경전구세포에 가한 후, 37℃, CO2 배양조건에서 14일 동안 배양하여 신경세포로 분화시켰다. 얻어진 신경세포는 실시예 1의 (4)의 수확방법과 동일하게 실시하여, 분화된 신경세포를 수확하였다.
시험예 1. 줄기세포의 특성 확인
실시예 1의 (1)에서 얻어진 태반의 양막 상피세포 유래 줄기세포의 특성을 확인하였다. 즉, 실시예 1의 (1)에서 얻어진 줄기세포를 광학현미경으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 1의 a와 같다.
또한, 상기 줄기세포를 역전사 중합연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 Oct4, Sox2, nanog의 발현을 확인하였다. RT-반응은 45℃에서 50분간, 70℃에서 10분간 행하였으며, PCR-반응은 95℃에서 5분간, 그리고 95℃에서 30초/ 58℃에서 40초/72℃에서 1분으로 30회의 사이클(cycles)을 행한 후, 72℃에서 10분간 수행한 다음, 2% 아가로즈(agarose)에 전기영동하였다. 그 결과는 1b와 같다. 상기 PCR-반응에 사용된 프라이머는 다음 표 1과 같다.
표 1
유전자명 프라이머 서열 서열번호 product size
Oct3/4 센스 프라이머 5'-ggacaggggaggggaggagctagg-3' 1 143bp
안티센스 프라이머 5'-cttccctccaaccagttgccccaaac-3' 2
Sox2 센스 프라이머 5'-gccgagtggaaacttttgtc-3' 3 264bp
안티센스 프라이머 5'-gttcatgtgcgcgtaactgt-3' 4
Nanog 센스 프라이머 5'-ttccttcctccatggatctg-3' 5 206bp
안티센스 프라이머 5'-tctgctggaggctgaggtat-3' 6
또한, 상기 줄기세포의 표면항원인자를 분석하기 위하여, 실시예 1의 (1)에서 얻어진 태반의 양막 상피세포 유래 줄기세포를 인산완충식염수(PBS)로 세척하고, 트립신을 처리한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 5% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 세척한 후 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 버린후 세포를 FACS 완충액에 부유시켜 샘플수 만큼 10000 cells을 분주하였다. 각 웰(well)에 항체(FITC-labeled anti- SSEA4, TRA-1-81, CD15, CD45, CD34 and PE-labeled anti- TRA-1-60, CD184, CD9, CD44, CD13)를 각 각 넣고 4℃에서 20분 반응시킨 후 플로우 사이토미터 (flow cytometery)를 이용해 분석하였다. 그 결과는 도 1c와 같다.
도 1의 b 및 c에서 알 수 있는 바와 같이, 얻어진 세포는 oct4, sox2, nanog, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-81 등의 줄기세포 마커들이 발현되었다.
시험예 2. 줄기세포의 증식 및 분화능 증가 평가
배지 중에 FGF4를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 1의 (2)와 동일한 방법으로 실시예 1의 (1)에서 얻어진 세포를 배양하였다. 얻어진 세포[(-)FGF4] 및 실시예 1의 (2)에서 얻어진 세포[(+)FGF4]를 PBS로 세 번 세척하고, 4% 파라포름알데히드를 함유한 PBS로 10분간 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 0.3% 트리톤-X100을 함유한 블록킹 완충액(Blocking buffer)(5% goat serum)를 처리하여 상온에서 한시간 동안 반응시키고, 신경전구세포 마커인 다클론 항체 네스틴(nestin) 일차항체(rabbit anti-nestin, COVANCE, CA, USA)를 블록킹 완충액에 1:400로 희석하여 4에서 하룻밤동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척하고, anti-mouse 이차항체(Alexa FluorTM 488)로 암실에서 1시간동안 반응시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, 슬라이드 글래스에 올렸다. 또한 역전사 중합연쇄반응을 사용하여 FGF4의 농도에 따른 신경전구세포의 마커로 알려져 있는 네스틴(nestin) 유전자발현 양상을 확인하였다. 그 결과는 도 2와 같다. 도 2의 결과로부터, FGF4를 첨가하여 전처리한 세포가 FGF4 미처리 세포에 비하여 신경전구세포의 마커로 알려져 있는 네스틴(nestin)을 높게 발현하는 것을 알 수 있다. 또한 25ng/ml에서 가장 높은 nestin 유전자 발현을 나타내는 것을 알 수 있다.
시험예 3. 신경세포 분화능 평가
실시예 1의 (3)에서 얻어진 신경전구세포와 비교예 1에서 얻어진 신경전구세포의 신경세포 분화능을 평가하였다. 분화능 평가는 신경전구세포의 마커로 알려져 있는 nestin 및 Tuj1을 대상으로 평가하였다. nestin은 rabbit anti-nestin(COVANCE, CA, USA)을 블록킹 완충액에 1:400 희석하여 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척하고, anti-rabbit 이차항체(Alexa FluorTM 488)로 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, 슬라이드 글래스에 올려 면역염색을 수행하였다. Tuj1은 mouse anti-Tuj1(Millipore, CA. USA)을 블록킹 완충액에 1:400 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다 PBS로 3회 세척하고, anti-mouse 이차항체(Alexa FluorTM 594)로 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, 슬라이드 글래스에 올려 면역염색을 수행하였다. 그 결과는 각각 도 3 및 도 4와 같다. 도 3 및 도 4에서 '2D-sphere system'은 실시예 1의 (3)에서 얻어진 신경전구세포로부터 분화된 신경세포의 면역염색 결과를 나타내며, '2D-normal system'은 비교예에서 얻어진 신경전구세포로부터 분화된 신경세포의 면역염색 결과를 나타낸다. 도 3 및 도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포의 신경세포로의 분화율이 종래의 2차원 분화방법에 비해 현저하게 높아졌다.
시험예 4. 신경세포 분화능 평가
실시예 2∼5에서 얻어진 신경전구세포와 비교예 2∼5에서 얻어진 신경전구세포의 신경세포 분화능을 평가하였다. 비교를 위하여, 실시예 1 및 비교예 1에서 각각 얻어진 신경전구세포(Am-PdMC로부터 분화시킨 신경전구세포)의 신경세포 분화능도 함께 평가하였다. 분화능 평가는 신경전구세포의 마커인 시험예 2와 동일한 방법으로 면역염색을 수행하였다. 그 결과는 도 5와 같다. 도 5의 결과로부터, 다양한 성체줄기세포를 대상으로 본 발명에 따른 분화방법을 적용하여 얻어진 신경전구세포의 신경세포로의 분화율이 종래의 2차원 분화방법에 비해 현저하게 높아졌음을 알 수 있다.
시험예 5. 신경세포로의 분화능 평가
실시예 6 및 비교예 6에서, 신경세포로의 분화 시작일로부터 14일 동안 신경세포의 마커인 MAP2의 발현변화를 면역염색을 통하여 측정한 결과는 도 6과 같다. 도 6의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 분화방법을 적용하여 신경전구세포를 분화시키고, 이어서 신경세포로 분화시켰을 경우, 종래의 2차원 분화방법에 비하여 현저하게 높은 효율로 신경세포를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
시험예 6. 파킨슨 질환 치료 활성 평가
(1) 파킨슨 질환 모델 및 신경전구세포 이식
공지의 방법(문헌 7 및 8 참조)에 따라, 6-히드록시 도파민(6-hydroxy dopamine, 6-OHDA)을 랫트에 투여하여 파킨슨 질환 모델을 제작하였다. 각각의 랫트를 4군으로 나누어, 제1군(Sham Control)은 인산완충식염수만을 처리하였고, 제2군(PDSC with 2D Sphere Culture)은 실시예 1에서 얻어진 신경전구세포 1.5x105 cells를 인산완충식염수 3ul에 현탁하여 뇌정위수술 기구(Stereotaxic, Harvard Appartus, MA. USA)를 사용하여 뇌에 이식하였고, 제3군(PDSC with Normal Culture)은 비교예 1에서 얻어진 신경전구세포 1.5x105 cells를 인산완충식염수 3ul에 현탁하여 상기 뇌정위수술 기구를 사용하여 뇌에 이식하였고, 제4군(PDSC with Non-Expended Cells)은 비교예 1에서 얻어진 신경전구세포 1.5x105cells를 인산완충식염수 3ul에 현탁하여 상기 뇌정위수술 기구를 사용하여 뇌에 이식하였다.
(2) 손상된 운동기능 회복 측정
자동 유량계 기기(Automatized rotameter system - Med Asssociate Inc.,, St. Alban, VT. USA)를 이용하여 각 군의 랫트의 복강에 암페타민(Amphetamine)을 5mg/kg 투여한 후, 비대칭적 행동 분석(rotation motor functional recovery test- 도파민 유사물질에 의해 랫트가 한쪽 방향으로만 도는 현상을 측정)을 수행하였으며, 그 결과는 도 7과 같다.
또한, Cylinder Test를 다음과 같이 수행하였다. 즉, 속이 투명하게 보이는 원통 안에 각 군의 랫트를 넣어 놓은 후, 랫트의 자발적인 행동 중 6가지 팬턴 (앞 왼발 접촉, 앞 오른발 접촉, 앞 왼발 접촉 후 양발 접촉, 앞 오른발 접촉 후 왼발 접촉, 앞 양발 접촉, 단지 상체를 일으켰다 앉음)을 선택하여 비디오 촬영을 통해 5분간 측정하였다. 상기 측정 항목 중 3분 동안 앞 왼발의 접촉 수를 측정한 결과는 도 8과 같다.
(3) 단기 기억 행동 능력 시험(Short term memory rotarod test)
ACCELER (ROTA-ROD for rats)을 이용하여 랫트의 단기 기억에 대한 행동 능력을 평가하였다. 이식 후 3주 후에 각 군의 랫트를 rota-rod의 회전 원통에 올려놓은 후 초기 4rpm으로 3분 정도 적응시킨 후 테스트 시간을 5분으로 맞춘 후 회전 속도를 증가시키면서 랫트가 아래로 떨어질 때까지의 시간을 하루에 3번 수치를 측정하였으며, 그 결과는 도 9과 같다.
(4) 장기 기억 및 운동기능 시험(Long term memory and motor function test)
ACCELER (ROTA-ROD for rats)을 이용하여 랫트의 장기 기억 및 운동기능 대한 행동 능력을 평가하였다. 이식 후 3주 후에 각 군의 랫트를 rota-rod의 회전 원통에 올려놓은 후 초기 4rpm으로 3분 정도 적응시킨 후 테스트 시간을 5분으로 맞춘 후 회전 속도를 증가시키면서 랫트가 아래로 떨어질 때까지의 시간을 3일 동안 하루에 3번 측정한 수치와 같은 방식으로 이식 후 6주 후에 하루에 3번 측정한 수치를 통하여 장기 기억 및 운동기능을 측정하였으며, 그 결과는 도 10과 같다.
(5) 신경세포 분화능력 평가
시험 마지막 날, 제2군의 랫트를 에테르를 사용하여 깊게 마취시킨 다음 인산완충식염수(phosphate buffer saline-PBS)를 심장을 통해 관류시켜 혈액을 빼낸 뒤, 고정 용액(4% 파라포름알데티히드)로 관류시켜 몸 안의 장기를 고정한 뒤 뇌를 적출하였다. 뇌를 적출한 뒤 고정 용액에 담가 2일 동안 고정한 뒤, freezing microtom (Shandon, England)을 사용하여 뇌의 전 부분을 40㎛두께로 절편하여 시료를 취하였다. 절편하여 얻은 뇌 조직 중 선조체(striatum 부위)를 추출하여 인산완충식염수에 두 번 씻은 후 트리톤 X-100에 가하였다. 다시 인산완충식염수로 두 번 씻은 후, 조직을 rabbit anti-nestin(Abcam, England) 및 rabbit anti-Tuj1 (COVANCE, CA, USA)에 담가 반응시켰다. 인산완충식염수로 두 번 씻은 후에 인산완충식염수로 희석시킨 anti-rabbit 이차항체(Alexa FluorTM 488)를 한 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 조직들을 젤라틴 코팅된 슬라이드 글래스에 고정한 후 공기 중에서 건조시킨 뒤 커버글라스를 씌웠다. 이 슬라이드를 Zeiss LSM510 confocal imaging system (Oberkochen, Germany)을 이용하여 분석하여, Nestin 및 Tuj1의 발현을 측정한 결과는 도 11 및 도 12와 같다. 도 11 및 12에서 좌측 상단은 확인된 세포 핵을 나타내며, 우측 상단은 신경전구세포 표식인 nestin과 Tuj1을 나타내고, 좌측 하단은 사람 세포의 핵 표식인 Human-Nuleci를 나타내고, 우측 하단은 각 그림을 합친 것을 각각 나타낸다. 도 11 및 12의 결과로부터, 생체 내(in vivo)에서 이식한 세포가 신경세포로 분화되기 전 신경전구세포로서의 성질을 가지고 있다는 결과를 나타낸다.
또한, 제1군 및 제2군의 랫트를 에테르를 사용하여 깊게 마취시킨 다음 인산완충식염수(phosphate buffer saline-PBS)를 심장을 통해 관류시켜 혈액을 빼낸 뒤, 고정 용액(4% paraformaldehyde-PFA)로 관류시켜 몸 안의 장기를 고정한 뒤 뇌를 적출하였다. 뇌를 적출한 뒤 고정 용액에 담가 2일 동안 고정한 뒤, freezing microtom (Shandon, England)을 사용하여 뇌의 전 부분을 40㎛두께로 절편하여 시료를 취하였다. 절편하여 얻은 뇌 조직 중 선조체(striatum 부위)를 추출하여 인산완충식염수에 두 번 씻은 후 트리톤 X-100에 가하였다. 다시 인산완충식염수로 두 번 씻은 후, 조직을 rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Abcam, England)에 반응시켰다. 인산완충식염수로 두 번 씻은 후에 다시 biotinylated anti-rabbit antibody (Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 한 시간 동안 반응시키고, vector Elite ABC kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 이용하여 증폭시킨 뒤, 디아미노벤지딘(diaminobenzidine, DAB)를 이용하여 발색시켰다. 발색이 끝난 조직들을 젤라틴 코팅된 슬라이드 글래스에 고정한 후 공기 중에서 건조시킨 뒤 탈수시키고 커버글라스를 씌워 분석에 사용하였다. 각 군에서 적출한 뇌 조직 중 선조체(striatum 부위) 절편을 광학현미경 (Olympus, Japan)으로 촬영하여 저장하고 이미지 분석을 하여, TH의 발현을 측정한 결과는 도 13과 같다. 도 13의 결과로부터, 생체 내(in vivo)에서 이식한 세포가 도파민 신경세포(뉴런)으로 효과적으로 분화되었음을 알 수 있다.
(6) 신경 염증과 관련된 요소 억제 평가
신경 염증과 관련된 A: 소신경교세포의 활성화 표지(microglia activation marker)의 활성 및 B: 성상 세포의 활성화 표지(astrocyte activation marker)의 활성을 측정하였다. 즉, 상기 활성 측정은 제1군 및 제2군의 랫트를 에테르를 사용하여 깊게 마취시킨 다음 인산완충식염수(phosphate buffer saline-PBS)를 심장을 통해 관류시켜 혈액을 빼낸 뒤, 고정 용액(4% paraformaldehyde-PFA)로 관류시켜 몸 안의 장기를 고정한 뒤 뇌를 적출하였다. 뇌를 적출한 뒤 고정 용액에 담가 2일 동안 고정한 뒤, freezing microtom (Shandon, England)을 사용하여 뇌의 전 부분을 40㎛두께로 절편하여 시료를 취하였다. 절편하여 얻은 뇌 조직 중 선조체(striatum 부위)와 흑질 (substantia nigra 부위)를 추출하여 인산완충식염수에 두 번 씻은 후 트리톤 X-100에 가하였다. 다시 인산완충식염수로 두 번 씻은 후, 조직을 rabbit anti-Iba1(Abcam, England)과 rabbit anti-Glial fibrillary acidic protein (GFAP)(Chemicon, MA, USA)에 반응시켰다. 인산완충식염수로 두 번 씻은 후에 다시 biotinylated anti-rabbit antibody(Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 한 시간 동안 반응시키고, vector Elite ABC kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 이용하여 증폭시킨 뒤, 디아미노벤지딘(diaminobenzidine, DAB)를 이용하여 발색시켰다. 발색이 끝난 조직들을 젤라틴 코팅된 슬라이드 글래스에 고정한 후 공기 중에서 건조시킨 뒤 탈수시키고 커버글라스를 씌워 분석에 사용하였다. 각 군에서 적출한 뇌 조직 중 선조체(striatum 부위)와 흑질(Substantia nigra 부위) 절편을 광학현미경(Olympus, Japan)으로 촬영하여 저장하고 이미지 분석을 하여 측정하였으며, 그 결과는 도 14의 A, B와 같다. 도 14에서 ST는 선조체 (striatum) 부위를 나타내며, SN은 흑질 (Substantia nigra) 부위를 나타낸다. 도 14의 결과로부터 신경염증과 관련된 표지의 활성이 현저하게 억제되었음을 알 수 있다.
(7) 고찰
도 7 내지 도 14의 결과로부터, 본 발명에 따른 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 이식하였을 때, 종래의 2차원 분화방법에 의해 얻어진 신경전구세포를 이식한 경우에 비하여, 손상된 운동기능의 회복이 유의성 있게 증가하였고, 단기 및 장기 기억도 증가하였으며, 신경세포로의 분화능력도 크게 증가하였음을 알 수 있다. 또한, 염증과 관련된 요소들도 효과적으로 억제함을 알 수 있다.
본 발명에 따른 분화방법과 종래의 2차원 배양을 통한 분화방법에서 얻어진 신경전구세포의 활성차이가 어디에서 비롯된 것인지 아직 명확하지는 않으나, 본 발명에 따른 분화방법에 의해 얻어진 신경전구세포가 세포와 세포사이의 상호작용 (Cell-to-Cell interaction)에 의하여 파킨슨 질환의 치료에 유효한 것으로 알려져 있는 신경영양인자(neutrophic factor)인 hGDNF, hBDNF, 특히 hGDNF의 발현이 증가한데 따른 것으로 추정된다(data not shown). 따라서, 본 발명의 분화방법에 따른 신경전구세포는 파킨슨 질환을 포함한 다양한 신경손상 질환의 치료에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
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Claims (10)

  1. (a) 배양용기의 바닥면에 접착 단백질을 코팅하는 단계;
    (b) 단계(a)에서 얻어진 접착 단백질이 코팅된 바닥면 상에, 성체줄기세포를 함유하는 분산액을 스팟팅하여 성체줄기세포-함유 구를 상기 바닥면에 부착시키는 단계; 및
    (c) 단계(b)에서 얻어진 배양용기에 신경전구세포 분화용 배지를 가하고, 배양하는 단계
    를 포함하는, 성체줄기세포의 신경전구세포로의 분화방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 접착 단백질이 폴리-L-오르니틴 및 피브로넥틴으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 성체줄기세포를 함유하는 분산액이 성체줄기세포를 소태아혈청, 헤파린, 및 섬유아세포성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 분화방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 성체줄기세포를 함유하는 분산액의 농도가 300,000∼500,000 cells/ml의 범위인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 성체줄기세포가 태반, 골수, 제대혈, 지방, 또는 지방조직에서 유래한 줄기세포인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 성체줄기세포가 태반으로부터 분리된 양막에서 유래한 줄기세포인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 신경전구세포 분화용 배지가 소태아 혈청, 페니실린-스트렙토마이신, 헤파린, 및 섬유아세포성장인자를 함유하는 α-MEM 배지인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 분화방법에 따라 얻어진 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 신경손상 질환 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 신경손상 질환이 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 뇌성마비, 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 및 척수 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 신경손상 질환이 파킨슨 질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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