KR20080036594A - 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제 - Google Patents

줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제

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KR20080036594A
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Abstract

본 발명은, 재생 의료(regenerative medicine), 특히 자발적 재생(self-regeneration)을 활용하는 재생 의료에 이용 가능하고, 재생 의료가 적용되는 손상된 장기 및/또는 조직의 진행 상태 및 손상 정도에 따라 신속하고 적절하게 작용할 수 있으며, 부작용이 없거나 거의 없는, 트롬빈 유사효소를 포함하는 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제를 제공한다. 본 발명은 또한 동물에게 유효량의 트롬빈 유사효소를 투여하는 단계를 포함하는 동물에 있어서의 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화 방법 및 줄기세포 및/또는 전구세포를 활성화하기 위한 트롬빈 유사효소의 용도를 제공한다.

Description

줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제{ACTIVATING AGENT OF STEM CELLS AND/OR PROGENITOR CELLS}
본 발명은 트롬빈 유사효소(thrombin-like enzyme)를 포함하는 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제, 동물에게 유효량의 트롬빈 유사효소를 투여하는 단계를 포함하는 동물에 있어서의 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화 방법, 및 줄기세포 및/또는 전구세포를 활성화하기 위한 트롬빈 유사효소의 용도에 관한 것이다.
사람에게 생기는 질병은 기질적인 질병과 기능적인 질병으로 크게 분류된다. 종래의 의료에서는, 기능적인 질병에 대해서는 내과 치료가 주로 이용되고, 기질적인 질병에 대해서는 외과 치료 및 내과 치료가 이용되고 있다. 그러나, 대부분의 내과 치료는 대부분의 경우 질병을 근본적으로 치료할 수 없는 증상에 따른 치료이다. 또한, 외과 치료는 손상된 장기의 일부분 혹은 전부를 적출하기 때문에, 장기의 기능을 부분적으로 혹은 완전히 상실시키는 침략적인 치료 방법이다. 한편, 외과 치료에 대한 대체 요법으로서 장기 이식 및 인공 장기를 이용한 치료법도 행해지고 있다. 그렇지만, 장기 이식에는 거절반응을 억제하기 위한 면역 억제제에 의한 부작용과 같은 기술적 과제나, 심각한 기부자 부족 및 의료비 상승 등과 같은 사회적 문제가 존재한다. 또한, 인공 장기를 이용한 치료에 대해서도, 생체 기능 대체성 및 생체 적합성 등의 기술적 과제나, 의료비 상승 등의 사회적 문제가 존재한다.
이러한 문제를 해결하는 새로운 치료법으로서 재생 의료(regenerative medicine)가 주목받고 있다. 재생 의료는 병이나 사고에 의한 기능 장애나 부조화에 빠진 생체 조직 및 장기의 재생 및 기능 회복을 위해 세포를 적극적으로 활용하여 실시하는 치료법이다. 재생 의료는 세포의 활용 형태에 따라 크게 아래와 같은 3개의 형태로 분류된다.
(1) 기증자로부터 배아줄기세포(embryonic stem cells), 제대혈 유래 단핵세포(placental blood-derived mononuclear cells), 혈액 유래 단핵세포(blood-derived mononuclear cells) 혹은 골수 유래 단핵세포(bone marrow-derived mononuclear cells)를 수집하는 단계, 시험관 배양으로 세포 증식 및/또는 분화를 유도하는 단계, 및 선택된 미분화(줄기세포 및/또는 전구세포) 및/또는 분화세포를 착상에 의해 환자의 몸에 도입하는 단계를 포함하는 방법;
(2) 환자 본인으로부터 체성줄기세포(somatic stem cells), 혈액 유래 단핵세포 혹은 골수 유래 단핵세포를 수집하는 단계, 시험관 배양으로 세포 증식 및/또는 분화를 유도하는 단계, 및 선택된 미분화(줄기세포 및/또는 전구세포) 및/또는 분화세포를 착상에 의해 환자 자신의 몸에 도입하는 단계를 포함하는 방법; 및
(3) 시험관 배양으로 줄기세포 및/또는 전구세포의 증식 및/또는 분화를 유도하는 것 없이, 환자의 손상된 장기 또는 조직에 존재하는 줄기세포 및/또는 전구세포(내재성(resident) 줄기세포 및/또는 전구세포라고 함), 및/또는 환자의 혈액 유래 혹은 골수 유래 줄기세포 및/또는 전구세포를 활성화하기 위해 환자의 신체를 (예를 들면, 약물 투여, 육체적인 운동 또는 물리치료 등으로) 자극하는 단계를 포함하는 방법. 이하, 그 방법을 "자발적 재생(self regeneration)"이라고 한다.
현재의 재생 의료의 주류는 환자의 체외로부터 세포를 도입하는 방법(즉, 상기한 (1) 및 (2) 방법)이다.
분화 세포를 체외로부터 도입하는 방법은, 단일 종류 또는 매우 한정된 종류의 세포로부터 구축되는 조직 또는 장기(예를 들면, 피부, 뼈, 연골, 각막 및 근육 조직)을 대상으로 하는 피부과, 안과 및 정형외과 분야에서 이용되고 있다. 그렇지만, 다양한 종류의 세포로부터 구축되는 고형 장기(solid organs)(예를 들면 심장, 간장, 폐, 신장 및 뇌 등)에 대해서는, 이러한 다양한 종류의 분화 세포의 거동을 적절히 제어하는 기술이 아직 충분히 확립되지 않았고, 실용화에는 이르지 않았다.
한편, 미분화 세포를 환자의 체외로부터 도입하는 이하의 방법들이 공지되어 있다.
(1) 중증 허혈성 질환 및 심장혈관계 질환에 대해서, 환자의 체외로부터 줄기세포 및/또는 혈관 내피 전구세포를 도입해 혈관 형성을 촉진하고 새로운 혈관을 형성시키는 혈관 신생 요법(Weissman IL: Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: Barriers and opportunities. Science 287:1442-1446,2000).
(2) 환자의 체외로부터 배아줄기세포(ES 세포)의 도입을 이용한 혈관 형성법 (McClosky KE 등: Use of embryonic stem cell-derived endothelial cells as a cell source to generate vessel structures in vitro. Tissue Eng 11:497-505,2005). 이 방법은, ES 세포의 배양법, 세포의 분화 유도법 및 분화 세포의 취득 방법 등이 충분히 확립되어 있지 않기 때문에, 실용화에는 이르지 않았다.
(3) 환자 자신의 골수로부터 분리한 골수 유래 단핵세포를 치료 부위에 직접 도입해 신생 혈관을 형성시키는 자가 골수 이식법(Sato Y 등: Can a bone marrow cell contribute to organ regeneration? In vivo analysis using transgenic rats with reporter genes. Transplantation Proceedings 37:273-275,2005). 이 방법에서는, 획득할 수 있는 줄기세포의 수가 적은 것, 전신 마취를 통해 다량의 골수를 채취하는 경우 환자의 신체적 부담 및 위험과 같은 문제가 있다. 또한, 이식된 세포의 분화를 제어하는 것이 상당히 곤란하다는 문제도 있다.
또한, 환자의 체외로부터 줄기세포 및/또는 전구세포를 도입하는 방법을 사용하는 재생 의료에서의 공통된 문제로서, 이식된 세포의 과잉 재생 및/또는 과잉 복구에 기인하는 합병증 발생의 위험성이 있다.
이에 대조적으로, "자발적 재생(self-regeneration)"을 이용하는 방법은 환자 자신의 체내에 원래 존재하고 있는 줄기세포 및/또는 전구세포(즉, 내재성 줄기세포 및/또는 전구세포, 및/또는 환자 자신의 혈액 유래 혹은 골수 유래 줄기세포 및/또는 전구세포) 활성화시킴으로써, 손상된 장기 및/또는 조직을 재생시켜 그 기능 회복을 도모하는 것이다.
내재성 줄기세포 및/또는 전구세포는, 재생 능력을 가지는 간에 존재하는 것으로 종래 알려져 있었지만, 근래에는 신경계(특히, 뇌와 같은 중추 신경계), 피부, 지방조직, 망막, 각막 , 골격근 뿐만 아니라, 심장에도 존재하는 것으로 보고되고 있다(Weissman IL: Translating stem and progenitor cell biology to the clinic Barriers and opportunities. Science 287: 1442-1446,2000; Garry DJ 등: Ponce de leon's fountain: stem cells and the regenerating heart. Am J Med Sci 329(4):190-201, 2005).
내재성 줄기세포 및/또는 전구세포, 및/또는, 혈액 유래 혹은 골수 유래 줄기세포 및/또는 전구세포가, 접촉하는 세포의 서로 다른 형태, 세포외 기질의 함량, 시토카인 및 성장인자와 같은 해당 세포가 존재하는 미세 환경에 의존해 여러 가지의 형태의 세포로 분화할 수 있다는 것은, 아래와 같은 문헌 등에 의해 알려져 있다. 예를 들면:
(1) 신경줄기세포를 신경 영양 인자(neurotrophic factor) 또는 성장 인자의 존재하에서 배양하면, 신경구(neurosphere)라고 불리는 단일 세포 유래의 콜로니를 형성하고(즉, 자가 복제), 이러한 신경구는 서로 다른 유도 미세 환경 조건에 따라 신경세포, 성상세포(astrocytes) 및 희소돌기 아교세포(oligodendrocytes)로 분화한다(즉, 다분화능). 또한, 신경구를 시험관에서 계대 배양했을 때, 다른 신경구가 단일 신경구 유래 세포로부터 형성될 수 있다(Reynolds BA and Weiss S: Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 255:1707-1710,1992);
(2) 성체 래트(adult rat)의 척수로부터 획득한 신경 줄기세포를 다른 성체 래트의 척수에 이식하면 글리아세포(gliacyte)로만 분화하지만, 해마 치아이랑(hyppocampus dentate gyrus)에 이식하면 신경세포로 분화한다(Shihabuddin LS 등: Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus. The J Neuroscience 20:8727-8735,2000).
(3) 신경 줄기세포를 혈관내피세포(vascular endothelial cells)와 함께 배양하면, 신경 줄기세포의 증식 및 신경세포로의 분화가 촉진된다(Shen Q 등: Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science 304: 1338-1440,2004).
한편, 자발적 재생을 이용한 재생 의료를 목적으로 하는 경우, 내재성 줄기세포 및/또는 전구세포, 및/또는 혈액 유래 혹은 골수 유래의 줄기세포 및/또는 전구세포를 증가시키는 방법으로서는, 이하의 방법들이 알려져 있다:
(1) EGF를 대뇌허혈(cerebral ischemia) 모델 동물에 투여하면, 신경줄기세포의 증식이 촉진되고, 경색에 의해 잃은 세포의 약 20%가 재생한다(Teramoto T 등: EGF amplifies the replacement of parvalbumin-expressing striatal interneurons after ischemia. The J Clinical Investigation 111:1125-1132,2003).
(2) 고지방 혈증 치료제인, 스타틴(statin)(3-히드록시-3-메틸-글루타릴 코엔자임 A 환원효소 억제제(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A)(HMG-CoA) reductase inhibitor)를 동맥 경화증 환자에게 투여하면, 골수 유래의 혈관모세포 (bone marrow-derived hemangioblasts) 또는 내피전구세포가 혈중에서 증가하였다 (Walter DH 등: Statin therapy accelerates reendothelialization: A novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Circulation 105:3017-3024,2002);
(3) 상기의 EGF에 더하여, VEGF, FGF(b-FGF), PDGF, NGF 및 HGF와 같은 다수의 성장 인자, G-CSF, GM-CSF 및 에리트로포에틴(erythropoietin)(EPO)와 같은 시토카인, 에스트로겐 및 지질과 같은 다른 생활성 물질 등은 줄기세포 및/또는 전구세포의 증가에 유용하다(Takeyama K, Ohto H: PBSC mobilization. Transfus Apher Sci 31 :233-243.2004; Aicher A, Zeiher AM, Dimmeler S: Mobilizing endothelial progenitor cells. Hypertension 45:321-325,2005). 그렇지만, 상기의 물질 중 약제로서 개발할 수 있던 것은 G-CSF 및 b-FGF와 같이 불과 2, 3종류의 물질에 그치고 있다. 더욱이, G-CSF는 발암의 위험성이 있고, b-FGF는 정맥 주입 동안에 혈관 폐쇄와 같은 부작용의 위험성이 있다. 또한, 다양한 종류의 세포를 표적으로 하는 성장 인자에 기인하는 부작용의 다양성을 고려해 볼 때, 표적 세포의 종류가 적은 성장 인자로서 개발된 VEGF 혹은 b-FGF로는, 임상시험에서 충분한 치료 효과를 얻지 못하고 있다. 더욱이, EPO는 혈압 상승 등의 부작용이 있다.
또한, 급성 뇌경색 등의 치료제로서 알려져 있는 바트록소빈(batroxobin)은 래트 뇌의 국소허혈 동안 허혈조직에서 CD34의 발현에 영향을 미쳤다고 아래와 같은 중국 인터넷 홈페이지에서 보고되었다.
저자: Cai Zhenli
제목: 래트 국소 뇌경색/재관류 모델에 있어서의 CD34의 발현 및 바트록소빈의 그 발현에 대한 영향
관련사이트: 중국 학위 논문 데이타베이스(CDDB), 색인 번호 :Y653774
매체의 타입: 온라인
공표자: Wanfang Data
검색일: 2005년 7월 28일
주소: URL: http://www.wanfangdata.com.cn/
상기 보고서에서는, 세포 표면 항원 CD34의 발현은 혈액을 가지지 않는 혈관을 포함한 뇌조직 표본(표본 샘플링 전에 관상동맥 관류를 실시해서 뇌조직 중의 혈액을 제거한 조직 표본)에서 검출되었다. 여기서, CD34는 골수에 존재하는 혈관모세포, 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells), 혈관 EPC 및 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells)나, 혈액 중에 존재하는 혈관 EPC 및 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells)(둘 다 미분화 세포이다) 뿐만 아니라, 혈관벽을 구성하는 성숙한 혈관 내피 세포(분화 세포)에서도 발현한다(Ohsawa T et al. ed.: Encyclopedia of Immunology(제2판), p.327, Tokyo Kagaku Dozin, 2001.12.3.). 따라서, 골수나 혈액을 검사대상으로 했을 경우에는 미분화 세포(줄기세포 및 전구세포)가 CD34 양성 세포가 되지만, 혈액을 가지지 않는 혈관을 포함한 뇌조직 표본을 검사대상의 물체로 했을 경우는, 분화 세포만이 CD34 양성 세포가 된다. 따라서, 상기 보고서에서는, 줄기세포 및/또는 전구세포에 대한 바트록소빈의 작용에 대해서는 아무런 평가를 하고 있지 않다.
한편으로는, 부작용이 적거나 거의 없고, 재생 의료가 적용되는 손상된 장기 및/또는 조직의 진행 상태 및 손상 정도에 따라 신속하게 그리고 적절하게 작용할 수 있는, 자발적 재생을 이용하는 방법에 기초한 재생 의료에 사용 가능한 물질에 대한 임상상의 요구가 있다(Kinnaird T 등: Bone-marrow derived cells for enhancing collateral development: mechanism, animal data, and initial clinical experiences. Cir Res 95(4): 354-363,2004).
도 1은 모델 그룹을 기준으로 한 바트록소빈 그룹에 있어서의 네스틴-양성 세포수의 상대적인 값을 나타내는 막대 그래프,
도 2는 모델 그룹을 기준으로 한 바트록소빈 그룹에 있어서의 BrdU-양성 세포수의 상대적인 값을 나타내는 막대 그래프,
도 3은 모델 그룹을 기준으로 한 바트록소빈 그룹에 있어서의 GFAP-양성 세포수의 상대적인 값을 나타내는 막대 그래프,
도 4는 모델 그룹을 기준으로 한 바트록소빈 그룹의 BrdU-양성 (이동) 세포수의 상대적인 값을 나타내는 막대 그래프,
도 5는 모델 그룹(상) 및 바트록소빈 그룹(하)에 있어서 SVZ 영역중의 BrdU-양성 세포의 분포를 나타내는 사진이다(화살표는 BrdU-양성 세포를 지시한다).
따라서, 본 발명은, 재생 의료, 특히 자발적 재생을 이용하는 재생 의료에 사용할 수 있는 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 일종의 트롬빈 유사 효소인 바트록소빈과 줄기세포 및 전구세포의 활성화와의 관계에 대해 열심히 연구를 실시한 결과, 본 발명의 발명자들은 상기 세포들을 활성화하기 위해서 바트록소빈을 사용함으로써 손상된 장기 및 조직이 재생될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명은, 이러한 발견에 근거해서 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 트롬빈 유사효소(thrombin-like enzyme)를 포함하는 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제, 동물에게 유효량의 트롬빈 유사효소를 투여하는 단계를 포함하는 동물의 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화 방법, 및 줄기세포 및/또는 전구세포를 활성화하기 위한 트롬빈 유사효소의 용도에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제는 트롬빈 유사효소를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
트롬빈 유사효소의 특정예로는 바트록소빈(batroxobin), 앤크로드(ancrod), 크로탈레이즈(crotalase) 등을 들 수 있다(Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p130-131;1990). 바트록소빈은 가장 대표적인 트롬빈 유사효소이며 특히 바람직하다.
바트록소빈은 Bothrops atrox moojeni의 독액에서 유래하는 트롬빈 유사 세린 프로테아제이다. 바트록소빈은 피브리노겐(fibrinogen)으로부터 피브리노펩타이드 A(fibrinopeptide A)만을 유리하여, des A 피브린(즉, 피브린 I)을 생성한다 (Aronson DL: Comparison of the actions of thrombin and the thrombin-like venom enzymes Ancrod and Batroxobin. Thrombos Haemostas(stuttg) 36:9-13,1976). 또한 바트록소빈의 일차 구조는 분자량이 약 36,000 Da이고 231개의 아미노산으로 구성된 단쇄 당단백질로 이미 확인되었다(Itoh N et al.: Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for batroxobin, a thrombin-like snake venom enzyme. J Biol Chem 262:3132-3135,1987).
바트록소빈은 트롬빈과 동일하게 세린 프로테아제이다. 그러나, 바트록소빈은 피브리노겐으로부터 단지 피브리노펩타이드 A만을 유리하여, des A 피브린을 생성하는데 비해, 트롬빈은 피브리노겐으로부터 피브리노펩타이드 A 및 피브리노펩타이드 B 둘 모두를 유리하여, 피브린을 생성한다는 점에서 서로 다르다. 또한, 바트록소빈은 피브리노겐 이외의 혈액 응고 인자에 작용하지 않지만, 트롬빈은 다른 혈액 응고 인자에 작용한다는 점에서도 상위하다.
바트록소빈은 그 자체가 공지 물질이며, 예를 들면, 일본특허공보 제S57-10718호 공보(특허 제1118129호)에 기재된 방법에 따라 조제 가능하다. 선택적으로, 바트록소빈은 도비시 약품공업주식회사(도쿄, 일본) 및 그 자회사인 베이징 도비시 약제공업주식회사(베이징, 중국)로부터 용이하게 입수 가능하다.
앤크로드(ancrod)는 Agkistrodon rhodostoma의 독액에서 유래하는 트롬빈 유사 세린 프로테아제이다. 앤크로드는 분자량이 약 35,400 Da인 당단백질이다. 바트록소빈처럼, 앤크로드는 피브리노겐으로부터 단지 피브리노펩타이드 A만을 유리하여, des A 피브린을 생성한다(Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p130-131;1990).
크로탈레이즈(crotalase)는 Crotalus adamanteus의 독액에서 유래하는 트롬빈 유사 세린 프로테아제이다. 크로탈레이즈는 분자량이 약 32,700 Da인 당단백질이다. 바트록소빈처럼, 크로탈레이즈는 피브리노겐으로부터 단지 피브리노펩타이드 A만을 유리하여, des A 피브린을 생성한다(Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p130-131;1990).
상기한 바트록소빈, 앤크로드 및 크로탈레이즈와 같은 트롬빈 유사효소는 천연물이어도 좋고, 유전자 재조합 제품이어도 좋다.
본 발명에서 대상으로 하는 줄기세포 및 전구세포의 정의는 관련 기술 분야에서 완전하게 표준화되지는 않았지만, 의견 일치가 이루어진 개념(Weissman IL: Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: Barriers and opportunities. Science 287: 1442-1446,2000; McKay R: Sterm cells hype and hope. Nature 406:361-364,2000)에 근거하여, 본 명세서에서는 이하와 같이 정의한다.
줄기세포(stem cell)는 자기 복제능 및 다분화능(multipotency)을 가진 미분화 세포이다. 구체적인 예로서는, 배아줄기세포(ES 세포), 배아생식세포(embryonic germ cell)(EG 세포), 체성줄기세포(성체줄기세포), 혈관모세포, 신경줄기세포, 조혈줄기세포, 중간엽줄기세포 및, 여러 가지의 세포(골세포, 연골세포, 근육세포, 심근세포, 신경세포, 힘줄세포, 지방세포, 췌장세포, 간세포 및 신장세포)의 줄기세포를 들 수 있다.
전구세포(progenitor cell)는 자기 복제능 및 분화능(differentiation potency)을 가진 미분화 세포이지만, 최종적으로 분화하는 세포의 종류가 이미 결정되어 있는 궁극적으로 분화된 세포이다. 구체적인 예로서는, 혈관 내피 전구세포 (EPC), 신경 전구세포나 조혈 전구세포를 들 수 있다.
줄기세포 및 전구세포를 식별하는 기준 중 하나인 자기 복제능은, 5-브로모데옥시우리딘(5-bromodeoxyuridine)(BrdU)을 DNA에 혼합하는 시험을 이용하여 평가할 수 있다(Gould E & Gross CG: Neurogenesis in adult mammals: some progress and problems. The J Neuroscience 22(3): 619-623,2002).
또한, 줄기세포 및 전구세포의 종류의 식별은, 각종 줄기세포 및 전구세포에 고유의 표지(marker)의 발현에 기초하여 실행될 수 있다. 예를 들면, 신경줄기세포에 대한 네스틴(nestin)의 발현(Wiese, C. et al.: Nestin expression-a property of multi-lineage progenitor cells? Cellular and Molecular Life Sciences, 61:2510-2522,2004), 또는 혈관 EPC에 대한 CD34 및 CD31의 발현(Asahara T et al.: Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964-967,1997; Shi Q et al.: Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 92(2):362-367, 1998)에 근거하여 실시할 수 있다.
성체 내에 존재하는 줄기세포 및 전구세포는 그 기원 및 위치에 근거하여, 내재성 세포(즉, 내재성 줄기세포 및 내재성 전구세포), 혈액 유래 세포(즉, 혈액 유래 줄기세포 및 혈액 유래 전구세포) 및 골수 유래 세포(즉, 골수 유래 줄기세포 및 골수 유래 전구세포)로 나눌 수 있다.
내재성 세포(내재성 줄기세포 및/또는 내재성 전구세포)는 특정의 장기 및/또는 조직에 원래 존재하여, 해당 장기 및/또는 조직이 손상을 입었을 경우에 그 조직 및/또는 장기의 재생에 공헌하는, 자기 복제능 및 다분화능을 가진 세포를 말한다. 구체적인 예로서는, 각막줄기세포, 심근줄기세포, 신경줄기세포 및 혈관 EPC 등을 들 수 있다.
혈액 유래 세포(즉, 혈액 유래 줄기세포 및/또는 혈액 유래 전구세포)는 순환하는 혈액 중에 존재하여, 장기 및/또는 조직이 손상을 입었을 경우에 해당 장기 및/또는 조직으로 이동하여 축적됨으로써 그 장기 및/또는 조직의 재생에 공헌하는, 자기 복제능 및 다분화능을 가진 단핵세포를 말한다. 이 경우의 혈액에는, 말초혈액, 태반혈액, 동맥혈액, 정맥혈액, 심장에서 채혈한 혈액, 및 안저(ocular fundus)에서 채혈한 혈액을 포함한다. 혈액 유래 단핵세포의 구체적인 예로서는, 혈관 EPC, 중간엽줄기세포 등을 들 수 있다.
골수 유래 세포(즉, 골수 유래 줄기세포 및 골수 유래 전구세포)는 원래 골수에 존재하고 있지만, 장기 및/또는 조직이 손상을 입었을 경우에 혈액 순환을 경유하여, 해당 장기 및/또는 조직에 축적됨으로써 그 장기 및/또는 조직의 재생에 공헌하는, 자기 복제능 및 다분화능을 가진 단핵세포를 말한다. 구체적인 예로서는 혈관 EPC), 중간엽줄기세포 등을 들 수 있다.
본 발명은, 이러한 내재성 세포, 혈액 유래 세포 및 골수 유래 세포의 어느 쪽도 활성화시킬 수 있다.
또한, 줄기세포 및 전구세포는, 활성화 상태(세포가 증식, 분화 또는 이동하는 상태)의 세포와 비활성화 상태(세포가 증식, 분화 또는 이동하지 않는 상태)의 세포로 나눌 수 있다. 그러나, 본 발명의 활성화제는 활성화 상태 및 비활성화 상태 중 어느 상태의 줄기세포 및 전구세포도 활성화 할 수 있다.
본 발명의 활성화제는 줄기세포 및/또는 전구세포를 활성화 할 수 있다. 여기서, "활성화"란 아래와 같은 3개의 작용을 말한다.
(1) 줄기세포 및/또는 전구세포의 증식을 촉진하는 것.
(2) 줄기세포 및/또는 전구세포의 이동을 촉진하는 것. 이동은 줄기세포 및/또는 전구세포가 골수, 장기 및/또는 조직으로부터 순환하는 혈액으로 유통되고; 순환하는 혈액으로부터 손상된 장기 및/또는 조직에 축적되며; 또는 장기 및/또는 조직의 내부로 움직이는 것을 말한다.
(3) 줄기세포 및/또는 전구세포의 분화를 촉진하는 것.
본 발명의 활성화제의 목표가 되는 줄기세포 및/또는 전구세포는 재생 의료(환자의 체외로부터 세포를 도입하는 재생 의료 및 자발적 재생을 이용하는 재생 의료를 포함한다)에 의해 치료 가능한 질환에 적용되는 줄기세포 및 전구세포이다.
따라서, 본 발명의 활성화제는 자발적 재생을 이용하는 재생 의료에서 사용되는 줄기세포 및/또는 전구세포(즉, 환자가 원래 가지고 있어, 시험관 배양(in vitro culture)으로 증식 및/또는 분화가 유발되지 않은 세포) 뿐만이 아니고, 환자의 체외로부터 세포를 도입하는 재생 의료에서 사용되는 줄기세포 및/또는 전구세포(즉, 환자의 체외로부터 도입되는 세포)에 대해도 사용할 수 있다. 본 발명의 활성화제는 바람직하게는 자발적 재생을 이용하는 재생 의료에서 사용되는 줄기세포 및/또는 전구세포에 대해서 적합하게 사용할 수 있다.
재생 의료가 적용되는 질환(손상된 장기 또는 손상된 조직)의 원인, 종류 또는 정도에 대해서는 특히 한정되지 않는다. 이하에, 구체적인 예를 예시한다.
피부계 질환
상처, 화상, 방사선 장해, 동상, 자외선 장해, 전기충격, 외상, 피부궤양, 욕창, 접촉성 피부염, 수포성 피부염, 아토피성 피부염, 피부건조증, 당뇨병성 피부궤양, 자가민감 피부염, 홍피증, 탈락 피부염, 수포성 표피박리증, 광선피부염, 만성 색소성 자색반증(샴버그 질병(Schamberg's disease)), 구강 점막 손상, 구내염, 구위피부염, 피부의 노화 증상, 탈모증, 조갑주위염, 조갑감입증, 소화관 점막진무름, 소화성 궤장, 각막 진무름, 각막 궤장, 우식, 치수염, 연변성 치주염, 알레르기성 비염, 화분증, 봄철결막염, 치질, 소화관 점막 장해, 소화관 점막 화상, 기관지 천식, 설염, 재발성 아프타, 구강내 아프타, 구취, 구강 이상 감각증, 이빨 성감염증, 구강 점막 교상, 혀의 교상, 구강 점막 화상 및 구강 점막 궤양.
뇌신경계 질환
뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 각종 중추 신경계 질환(예를 들면, 척수염), 각종 말초 신경 질환(예를 들면, 다발 말초 신경병), 척수병증 및 각종 뇌염.
심혈관계 질환
심근경색증, 협심증, 불안정 협심증, 각종 심근염(예를 들면, 바이러스성 심근염), 급성 심부전증, 만성 심부전증, 죽상동맥경화증, 고혈압증, 류마티스성 심장병, 부정맥, 심장 판막증, 감염성 심내막염, 심장막염, 경피적 심장동맥 중재술 (percutaneous coronary artery intervention), 및 PTCA 수술 후의 재협착 및 재폐쇄.
소화기계 질환
식도염, 급성 위염, 만성 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 각종 대장염(예를 들면, 궤양성 대장염), 창자결핵, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 약물성 간염, 지방간, 경화증, 췌장염 및 각종 소화기암(예를 들면, 간암, 대장암, 위암)의 수술에 의한 장기 장해
호흡기계 질환
각종 기관지염(예를 들면, 세균성 기관지염), 감염성 폐렴, 흡입성 폐렴, 폐색전증, 기흉 및 폐기능부전.
비뇨기계 질환
방광염, 각종 신장염(예를 들면, 만성 신장염 증후군, 원발성 사구체 질환 (primary glomerular disease)), 부신염, 요도염, 세균성 및 비세균성의 전립선염, 고혈압성 신장병, 당뇨병성 신장병 및 신장 기능 부전.
운동기관계 질환
각종 관절염(예를 들면, 류마티스 관절염), 근육 위축증, 신경외과에서의 개두 수술 후의 뼈 결손, 정형외과에서의 종양절제수술 후의 뼈 결손, 골절 후의 뼈 결손, 치의학 분야에서의 치주증에 의한 뼈 결손, 연골염, 각종 관절의 연골 결손 및 각종 손상(예를 들면, 외상, 염좌)에 의한 인대 손상.
혈관계 질환
각종 동맥 질환(예를 들면, 폐색성 동맥경화증(ASO), 폐쇄혈전혈관염(TAO) ), 각종 정맥 질환(예를 들면, 혈전성 정맥염), 혈전증, 혈류장해, 깊은정맥혈전증 (deep vein thrombosis : DVT), 말초 순환 장해에 수반하는 각종 질환(예를 들면, 돌발성 난청 및 진동병(vibration disease)) 및 심장동맥성형술 후의 재협착 및 재폐색.
내분비계 질환
당뇨병 및 각종 합병증(예를 들면, 당뇨성 말초 신경증, 당뇨성 족부 (diabetic foot), 당뇨병성 궤양), 고지혈증, 갑상선염 및 비만증.
안과계 질환
각종 각막염(예를 들면, 알칼리성 또는 산성 화합물에 의한 각막염, 외상성 각막염) 및 당뇨병성 망막염.
상기 이외의 질환에 더하여, 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화에 의한 치료(즉, 손상된 장기 및/또는 손상된 조직의 재생)가 가능한 질환의 재생 의료에 사용되는 줄기세포 및/또는 전구세포도 역시 본 발명의 활성화제의 대상이 될 수 있다. 또한, 재생 의료가 적용되는 질환의 진행 단계는 특히 한정되는 것은 아니다.
또, 본 발명의 활성화제는, 재생 의료가 적용되는 손상된 장기 및/또는 손상된 조직의 진행 단계나 손상의 정도 등에 따라 신속하고 적절하게 작용할 수 있다.
본 발명의 활성화제는, 바람직하게는 피부계 질환, 운동기관계 질환, 내분비계 질환, 호흡기계 질환, 비뇨기계 질환, 소화기계 질환, 안과계 질환, 뇌신경계 질환, 심장혈관계 질환 및 혈관계 질환이 있는 환자에게 존재하는 줄기세포 및/또는 전구세포에 적용할 수 있고, 특히 바람직하게는 뇌신경계 질환, 심장혈관계 질환, 피부계 질환 및 혈관계 질환이 있는 환자에게 존재하는 줄기세포 및/또는 전구세포에 적용할 수 있다.
또한, 본 발명의 활성화제는, 부작용이 없거나 또는 거의 없다.
더욱이, 본 발명의 활성화제는, 활성화 효과를 지속적으로 발휘하는 것이 가능하다.
본 발명의 활성화제는, 트롬빈 유사효소(예를 들어, 바트록소빈)만으로 구성되거나, 하나 이상의 트롬빈 유사효소로 구성될 수 있고, 트롬빈 유사효소와 트롬빈 유사효소 이외의 하나 이상의 활성 물질과의 조합으로 구성될 수도 있다.
상기 활성 물질의 예로서는, VEGF, EGF, FGF, PDGF, NGF, HGF 등의 성장인자, G-CSF, GM-CSF, EPO 등의 시토카인, 에스트로겐, 지질, 스타틴(코엔자임 A 환원효소 억제제), 항-성장 인자 항체, 시토카인 및 항-시토카인 항체(Takeyama K, Ohto H: PBSC mobilization. Transfus Apher Sci 31:233-243,2004; Aicher A, Zeiher AM, Dimmeler S: Mobilizing endothelial progenitor cells. Hypertension 45:321-325.2005)를 들 수 있다.
본 발명의 활성화제의 제형으로서는, 일본 제제 총칙(Japaneses Pharmacopoeia General Rules for Preparations)에 있는 어떠한 제형을 적용할 수 있다. 본 발명의 활성화제의 제형의 예로서는 직접 체내에 적용하는 주사제(현탁제 및 유제를 포함한다); 연고제(유지성 연고, 유제성 연고(크림), 수용성 연고 등을 포함한다), 흡입제, 물약(점안제, 세비제(collunarium) 등을 포함한다), 좌약, 부착포, 습포제, 로션 및 다른 외용제; 및 정제(당으로 코팅된 정제, 필름으로 코팅된 정제, 젤라틴으로 코팅된 정제를 포함한다), 물약 , 캡슐, 과립, 분말(세립을 포함한다), 환약, 시럽제, 트로키제(troches) 등을 포함하는 내용제를 들 수 있다. 이러한 제형은, 일본 제제 총칙(Japaneses Pharmacopoeia General Rules for Preparations)에 기재된 방법으로 제재화 할 수 있다.
본 발명의 활성화제는 또한 약제학적으로 허용되는 고상 또는 액상 담체, 또는 중재요업 기제(interventional therapy bases)를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 고상 또는 액상 담체로서는, 용제, 안정화제, 보존제, 가용화제, 유화제, 현탁화제, 완충제, 등장화제(isotonizing agent), 착색제, 기제, 증점제, 부형제, 윤활제, 결합제, 붕괴제, 코팅제, 교정제(corrigent) 등을 들 수 있다.
구체적인 예로서는, 물, 유당, 설탕, 과당, 포도당, 만니톨, 소르비톨 및 다른 당류 및 당 알코올류, 결정성 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 저치환도 히드록시프로필 셀룰로오스(low substituted hydroxypropylcellulose), 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 카멜로오스(carmellose), 카멜로오스칼슘, 카멜로오스 나트륨, 크로스카멜로오스 나트륨, 카르복시메틸에틸세룰로오스, 초산 프탈산 셀룰로오스 등의 셀룰로오스 및 관련 유도체, 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말, 감자 녹말, 덱스트린, 프리젤라틴화 전분(pregelatinized starch), 부분 프리젤라틴화 전분(partly pregelatinized starch), 히드록시프로필 전분, 나트륨 카르복시메틸 전분, 시클로덱스트린, 풀루란(pullulan) 등의 전분 및 관련 유도체, 한천(agar), 알긴산나트륨, 아카시아 (acacia), 젤라틴, 콜라겐, 셸락(shellac), 트래거캔스(tragacanth), 쟁탄검 등의 천연 고분자(해초류, 식물성 점액, 단백질 등), 폴리비닐피롤리돈, 아미노알킬 메트아크릴레이트 코폴리머, 메트아크릴산 코폴리머, 카르복시비닐 폴리머, 폴리비닐알코올, 디메틸폴리실록산 등의 합성 고분자, 올리브유, 카카오 버터, 카나우바 왁스, 우지(beef tallow), 경화유, 대두유, 참기름, 동백유, 파라핀, 액상 파라핀, 황랍(yellow beewax), 백색 비셀린(white petrolatum), 야자유, 미세결정질 왁스 등의 유지류, 스테아린산, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 트리에틸시트레이트, 트리아세틴, 중쇄지방산 트리글리세리드, 경지(hard fat), 이소프로필 미리스테이트 등의 지방산 및 그 유도체, 글리세린, 스테아릴아코올, 세탄올, 프로필렌글리콜, 마크로골(Macrogol) 등의 알코올 및 다가 알코올, 산화 아연, 이염기성인산칼슘(dibasic calcium phosphate), 침강 탄산칼슘, 합성 규산 알루미늄, 무수이산화규소, 카올린, 건조된 수산화알루미늄 겔, 합성 히드로탈시트(synthetic hydrotalcite), 산화 티탄, 활석, 벤토나이트, 알루미노메타실리케이트 마그네슘(magnesium aluminometasilicate), 황산알루미늄칼륨, 비스무트 서브갈레이트(bismuth subgallate), 비스무트 서브살리실레이트(bismuth subsalicylate), 칼슘락테이트, 중탄산나트륨 등의 무기성 물질 및 금속염 화합물, 지방산의 자당에스테르, 스테아린산폴리옥시, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 소르비탄 세스키올레이트(sorbitan sesquioleate), 소르비탄 트리올레이트(sorbitan trioleate), 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 라우릴 황산나트륨, 라우로마크로골(lauromacrogol) 등의 계면활성제, 색소, 향료 등을 들 수 있다.
중재요업 기제(interventional therapy bases)의 예로서는 스텐트(stents), 인공 혈관, 카테터, 풍선 등을 들 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 활성화제는 표 1에 도시한 것처럼, 여러가지 성분들을 전체 1㎖ 중 그 각각의 함량만큼 포함할 수 있다.
바트록소빈 제품의 조성물
성분 함량
바트록소빈(유효성분) 10BU
클로로부탄올(보존제) 3㎎
젤라틴 가수분해물(안정화제) 0.1㎎
염화나트륨(등장화제) 9㎎
염화수소산(pH 조절제) q.s.
주입용 증류수 1㎖까지
전체량 1㎖
본 발명의 활성화제의 투여량은, 통상, 환자의 체중, 질환의 성질 및 상태에 따라 변하지만, 예를 들면, 성인에게 l일 l회 투여하는 경우, 바트록소빈의 0.1 내지 50 바트록소빈 단위(Batroxobin Unit:BU)이고, 바람직하게는 성인에게 격일로 l회 투여하는 경우 바트록소빈의 1 내지 20BU이다.
바트록소빈 단위는 바트록소빈의 효소 활성량을 나타내는 단위이며, 37℃의 온도에서 시트르산을 포함하는 표준 인간 혈장 0.3㎖에 바트록소빈 용액 0.1㎖를 첨가할 때, 그 혈장이 19.0±0.2초 내에 응고하는 활성량을 2 BU로 한다.
본 발명의 활성화제는 바트록소빈을 생리 식염수로 적당히 희석한 후, 손상된 장기 및/또는 조직에 정맥내 점적 주입(intravenous drip), 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 진피내 투여, 심장내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여, 직장내 투여, 설하 투여, 비강 투여, 경피 투여, 흡입 투여 또는 국소 투여로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 활성화제는 100㎖ 이상의 생리 식염수로 희석한 후 1시간 이상 주입하는 것이 바람직하다.
바트록소빈의 마우스, 래트(rats), 토끼 및 개에 대한 급성 독성(LD50 (BU/kg))은 이하의 표 2에 도시된다. 급성 독성 시험은, 문헌(Ozaki M et al.: Toxicity of the defibrase, Defibrinogen Batroxobin(First Report), Pharmacometrics 25:339-346,1983)에 기재된 방법에 따라서, 바트록소빈의 정맥내 투여에 의해 실행되었다.
바트록소빈의 급성 독성(i.v.)
동물종 LD50 값(BU/㎏)
마우스(ddy) 192~210
래트(Wistar) 105~110
토끼(NW) >300
개(잡종) 190~208
본 발명의 활성화제는 줄기세포 및/또는 전구세포를 가진 동물에게 투여될 수 있다. 이러한 동물의 예로서는, 인간, 원숭이, 개, 돼지, 고양이, 토끼, 래트 및 마우스를 들 수 있다. 이러한 동물들 중에서, 인간이 바람직하다.
이하에서는 실시예를 이용하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
탯줄 혈액 유래 CD34-양성 단핵세포의 활성화에 대한 바트록소빈의 영향
본 실시예에서는, 탯줄 혈액 유래 CD34-양성 단핵세포의 활성화에 대한 바트록소빈의 영향을 체외(in vitro)에서 평가하였다.
더욱이, 탯줄 혈액 중에 존재하는 세포 가운데, CD34-양성 단핵세포에 대응하는 세포들은 혈관 EPC 및 중간엽줄기세포로 구성되는 것이 알려져 있다(Murohara T. et al.: Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J Clin Invest 105:1527-1536,2000). 따라서, 본 실시예로 평가되는 인간 탯줄 혈액 유래 CD34-양성 단핵세포는 혈관 EPC 및 중간엽줄기세포를 말한다.
실험방법:
(1) 인간 탯줄 혈액 단핵세포( Human Cord Blood Mononuclear Cells )의 채집
장기간의 정상 임신을 선택하여, 탯줄 및 태반으로부터 항응고제로서 헤파린 (20~30U/㎖)을 이용하여, 40~60㎖의 탯줄 혈액을 채집하였다. 채집된 탯줄 혈액을 하이드로에틸전분(Hydroethylstarch)(Becton Dickinson, NJ, USA)과 5:1의 비율로 혼합하여 30분간 정치한 후, 침전된 적혈구를 제거하였다. 그 다음에, 상층의 액체를 채집하여, 림프구 분리액(상대 밀도:1.077, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China)과 2:1의 비율로 현탁하고, 460xg의 조건하에서 25분간 원심분리하였다. 중간 세포층의 단핵세포를 채집하여, 인산 완충액(PBS)으로 2회 세정한 후에 실험에 제공하였다.
(2) CD34 -양성 단핵세포의 분리 및 확인
상기 실험방법 (1)에서 얻은 인간 탯줄 혈액 유래 단핵세포를, PBS에 현탁하여 2×106 세포/㎖ 농도의 세포 현탁액을 조제하였다. CD34-양성 세포 단일클론 면역자기 비드 분리 키트(MACS, Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하고, 상기 키트의 설명서에 따라서, 인간 탯줄 혈액 유래 단핵세포로부터 CD34-양성 단핵세포를 분리하였다. 획득한 CD34-양성 단핵세포의 품질을 FITC-표지 항-CD34 항체(Becton Dickinson, NJ, USA)를 이용하여 유세포측정법(flow cytometry)(Becton Dickinson FACS Vantage, Becton Dickinson, NJ, USA)으로 평가하였다. 획득한 CD34-양성 세포의 순도는 98.5% 이상이었다.
(3) 세포 이동 시험
상기 시험은, 24-웰 배양플레이트(Corning, NY, USA) 및 5㎛ 트랜스웰 (transwell)(Corning, NY, USA)로 구성된 변형 보이덴 챔버(Boyden's chamber)를 이용하여 실행되었다. 상기의 변형 보이덴 챔버는, 5-㎛(직경)의 기공 크기를 가진 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 의해 2개의 구획으로 분리된다. 상부 구획은 필터 위쪽의 공간이고, 하부 구획은 필터와 웰 사이의 틈으로 구성된다.
0.25% BSA IMDM(Gibco, Los angeles, USA)를 이용하여 제조된 각종 농도(0 BU/㎖(대조군), 0.1BU/㎖ 및 0.2BU/㎖)의 바트록소빈을 각각 600㎕씩 보이덴 챔버의 하부 구획에 첨가하였다. 그 다음에, 인간 탯줄 혈액 유래 CD34-양성 단핵세포 및 IMDM 배지를 이용하여 1×105 세포/㎖의 세포 현탁액을 조제하고, 획득된 세포 현탁액 100㎕를 각 보이덴 챔버의 상부 구획에 첨가하였다. 이러한 시스템을 습한 인큐베이터에서 정치 상태로 6시간 동안, 37℃, 5% CO2/95% 공기의 대기하에서 배양하였다. 배양 종료 후에, 상부 구획으로부터 필터를 통과하여 하부 구획으로 움직인 세포를 이동한 세포라고 하였다. 이동한 세포들을 채집하여 유세포 측정법으로 계수하였다.
획득된 세포수의 결과로부터, 대조군의 이동한 세포수를 100%로 하여 0.1 BU/㎖ 바트록소빈 그룹 및 0.2 BU/㎖ 바트록소빈 그룹의 세포 이동율을 계산하였다. 세포 이동율은 동일한 조건하에서 세 번의 시험을 2회 하여 획득한 측정치에 근거한 평균±표준편차(SD)(%)로서 산출하였다.
결과 및 고찰
대조군(0 BU/㎖)의 CD34-양성 세포의 이동율을 100으로 했을 때, O.1 BU/㎖ 바트록소빈 그룹의 이동율은 149.37±6.82%이고, O.2 BU/㎖ 바트록소빈 그룹의 이동율은 254.26±17.44%이었다. 즉, 바트록소빈을 투여한 두 개의 그룹은, 대조군과 비교해서 현저히 빠른 이동율을 나타냈다.
이러한 결과는 바트록소빈이 인간 탯줄 혈액 유래 CD34-양성 단핵세포(즉, 혈관 EPC 및 중간엽줄기세포)를 현저히 활성화 시켰음을 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 혈관 EPC 및 중간엽줄기세포의 이동을 촉진하는 것이라고 생각된다.
또한, 본 실시예에서는, CD34-양성 단핵세포의 공급원으로서 탯줄 혈액을 사용하였지만, CD34-양성 단핵세포는 또한 성체의 말초 혈액, 성체의 골수 및 태아의 골수 등에도 존재하는 것이 알려져 있다(Michejda M: Which stem cells should be used for transplantation? Fetal Diagn Ther 19:2-8,2000). 따라서, 바트록소빈은 또한 탯줄 혈액 이외의 혈액 및 골수(성체의 말초 혈액, 성체의 골수, 태아의 골수 및 다른 기원의 혈액 등)에 존재하는 CD34-양성 단핵세포를 활성화 할 수 있다.
실시예 2
하지 심정맥 혈전증 환자(Lower Limb Deep Vein Thrombosis Patients)의 말초 혈액 중의 CD34-양성 세포, CD34-양성/CD31-양성 세포 및 VE 카드헤린-양성 세포의 활성화, 및, 하지 심정맥 혈전증 환자의 손상된 조직의 기능 회복에 대한 바트록소빈의 영향
본 실시예에서는, 일종의 혈관계 질환인 하지 심정맥 혈전증(하지 DVT)이 있는 환자에게 바트록소빈을 투여하고, 말초 혈액 중의 CD34-양성 세포, CD34-양성/CD31-양성 세포 및 VE 카드헤린-양성 세포의 활성화에 대한 바트록소빈의 효과, 및, 혈전(thrombi)에 의해 손상된 혈관의 재생에 대한 바트록소빈의 효과를 평가하였다.
더욱이, 말초 혈액 중에 존재하는 세포 가운데, CD34-양성 단핵세포에 해당하는 세포는 혈관 EPC 및 중간엽줄기세포인 것이 알려져 있다(Zhao Y et al.: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 100:2426-31, 2003). 따라서, 본 실시예에서 평가되는 말초 혈액 중의 CD34-양성 단핵세포는 혈관 EPC 및 중간엽줄기세포를 말한다.
또한, 내피전구세포(endothelial progenitor cell)는, 표지(marker)로서 CD34(Michejda M: Which stem cells should be used for transplantation? Fetal Diagn Ther 19:2-8,2004; Fadini GP et al.: Circulating endothelial progenitor cells are reduced in peripheral vascular complications of tape 2 diabetes mellitus. J American College of Cardiology 45:1449-1457,2005; Kuwana M et al.: Human circulating CD14+ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation. J Leukoc Biol 74:833-845,2003), 및 CD31(As ahara T et al.: Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964-967.1997; Hristov M, Weber C:Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J Cell Mol Med 8:498-508,2004)를 발현하는 것이 알려져 있다. 또한, 분화가 진행되어 혈관에 접착할 수 있는 상태에 있는 혈관 EPC는 또한 VE 카드헤린을 발현하는 것이 알려져 있다(Hristov M, Weber C: Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J Cell Mol Med 8:498-508,2004). 따라서, 본 실시예에서 평가되는 말초 혈액 중의 CD34-양성/CD31-양성 세포 및 VE 카드헤린-양성 단핵세포는 혈관 EPC라고 할 수 있다.
실험 방법
(1) 시험 대상자
시험 대상자는 37 내지 80세(평균 연령: 64세)의 남성 11명 및 여성 4명의 하지 DVT 환자로 구성되었다. 각 지험 대상자에게 임상 시험의 취지를 설명하여 동의를 얻은 후에 시험을 실시하였다.
(2) 투여 방법
바트록소빈을, 첫회(오전에 입원한 환자의 경우는 입원 당일날, 또는 오후에 입원한 환자는 입원 다음날)에 10 BU/환자/일, 그리고 그 후에 5BU/환자/일의 투여량으로 연속 14일간, 정맥내 점적 주입(intravenous drip)으로 환자에게 투여하였다.
(3) 채혈
투여 전(최초 투여), 투여 후 7일째, 14일째에, 저분자량 헤파린 항응고제를 이용하여 각각의 환자의 팔뚝의 팔오금 중간 정맥으로부터 5㎖의 말초 혈액을 채집하였다. 채집한 말초 혈액을 즉시 4℃로 보관하였고, 채혈 후 6시간 이내에 측정에 제공하였다. 모든 15명의 하지 DVT 환자 가운데, 투약 전 및 투약 후 7일째에는 모든 환자로부터 채혈을 실시하였고, 투약 후 14일째에는 10명의 환자에 대하여 채혈을 실시하였다.
(4) 말초 혈액 단핵세포의 분리
상기 실험 방법 (3)에서 획득한 혈액 5㎖에, 2.5㎖의 림프구 분리액(Ficoll, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China)를 첨가하여 현탁액을 제조하였다. 획득한 현탁액을 460xg의 조건으로 원심분리한 후에, 중단 세포층을 말초 혈액 유래 단핵세포로서 수거하였다. 획득한 전체 단핵세포의 수는, 환자 l명당 약 5~6×106 세포이었다. 획득한 단핵세포를 인산 완충액(PBS)으로 현탁하여, 2×106 세포/㎖의 세포 현탁액을 제조하였다.
(5) CD34 -양성 단핵세포의 분리
CD34-양성 단핵세포를 유세포 측정법을 이용하여 면역 형광 염색으로 분리하였다. 상기 실험 방법 (4)에서 획득한 단핵세포 현탁액 100㎕에, 피코에리트린 (phycoerythrin)-표지된 항-CD34 항체(Becton Dickinson, NJ, USA) 20㎕를 첨가하여, 4℃ 및 차광하에서 30분간 배양하였다. 그 다음에, CD34-양성 단핵세포를 분리하고 유세포 분석법으로 계수하였다. 단핵세포 중의 CD34-양성 단핵세포의 비율(%)을, 하기의 식에 따라 계산하였다.
CD34-양성 단핵세포(%) = (CD34-양성 단핵세포의 수/총 단핵세포의 수)×100
(6) CD34 -양성/ CD31 -양성 단핵세포의 분리
CD34-양성/CD31-양성 단핵세포를 유세포 측정법을 이용하여 이중 면역 형광 염색으로 분리하였다. 상기 실험 방법 (4)에서 획득한 단핵세포 현탁액 100㎕에, 피코에리트린(phycoerythrin)-표지된 항-CD34 항체(Becton Dickinson, NJ, USA) 20㎕ 및 FITC-표지된 항-CD31 항체(Becton Dickinson, NJ, USA) 20㎕를 첨가하여, 4℃ 및 차광하에서 30분간 배양하였다. 그 다음에, CD34-양성/CD31-양성 단핵세포를 분리하고 유세포 분석법으로 계수하였다. 단핵세포 중의 CD34-양성/CD31-양성 단핵세포의 비율(%)을, 하기의 식에 따라 계산하였다.
CD34-양성/CD31-양성 단핵세포(%) = (CD34-양성/CD31-양성 단핵세포의 수/총 단핵세포의 수)×100
(7) VE 카드헤린 -양성 단핵세포의 분리
VE 카드헤린-양성 단핵세포를 유세포 측정법을 이용하여 면역 형광 염색으로 분리하였다. 상기 실험 방법 (4)에서 획득한 단핵세포 현탁액 100㎕에, FITC-표지된 항-VE 카드헤린 항체(Becton Dickinson, NJ, USA) 20㎕를 첨가하여, 4℃ 및 차광하에서 30분간 배양하였다. 그 다음에, VE 카드헤린-양성 단핵세포를 분리하고 유세포 분석법으로 계수하였다. 단핵세포 중의 VE 카드헤린-양성 단핵세포의 비율 (%)을, 하기의 식에 따라 계산하였다.
VE 카드헤린-양성 단핵세포(%) = (VE 카드헤린-양성 단핵세포의 수/총 단핵세포의 수)×100
(8) 슬상 ( above - knee ) 및 슬하( below - knee )의 둘레의 측정
하지 부종은 하지 DVT의 전형적이고 객관적인 증상이다. 따라서, 전체 15명의 환자에 대해서, 하지의 슬상 20㎝의 둘레와 하지의 슬하 15㎝의 둘레를 지표로 한 하지 부종의 정도를 바트록소빈 투약 전후에 대해 측정하였다.
결과 및 고찰
(1) CD34 -양성 단핵세포의 활성화
하지 DVT 환자의 말초 혈액 중의 CD34-양성 단핵세포의 변화(평균±SD,%)
환자의 수 CD34-양성 단핵세포
투여 전 15 0.39±0.43
투여 후 7일째 15 0.71±0.51＊
투여 후 14일째 10 1.10±0.66＊＊
＊:P<0.05; 및 ＊＊:P<0.01, 대응이 있는 비-파라미터 검정을 이용하는 투여전과의 비교.
바트록소빈 투여에 의해, 말초 혈액 중의 CD34-양성 단핵세포의 비율이 투여 전과 비교해 상당히 증가하였다(표 3).
이러한 결과는 바트록소빈이 하지 DVT 환자의 말초 혈액 중의 CD34-양성 단핵세포(즉, 혈관 EPC 및 중간엽줄기세포)를 활성화 하였다는 것을 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 CD34-양성 단핵세포의 증식 및 이동성을 촉진한 것으로 생각된다.
(2) CD34 -양성/ CD31 -양성 단핵세포의 활성화
하지 DVT 환자의 말초 혈액 중의 CD34-양성/CD31-양성 단핵세포의 변화(평균±SD,%)
환자의 수 CD34-양성/CD31-양성 단핵세포
투여 전 15 0.28±0.30
투여 후 7일째 15 0.69±0.50＊＊
투여 후 14일째 10 1.07±0.66＊＊
＊:P<0.05; 및 ＊＊:P<0.01, 대응이 있는 비-파라미터 검정을 이용하는 투여전과의 비교.
바트록소빈 투여에 의해, 말초 혈액 중의 CD34-양성/CD31-양성 단핵세포의 비율이 투여 전과 비교해 상당히 증가하였다(표 4).
이러한 결과는 바트록소빈이 하지 DVT 환자의 말초 혈액 중의 CD34-양성/CD31-양성 단핵세포(즉, 혈관 EPC 및 중간엽줄기세포)를 활성화 하였다는 것을 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 CD34-양성/CD31-양성 단핵세포의 증식, 이동성 및 분화를 촉진한 것으로 생각된다.
(3) VE 카드헤린 -양성 단핵세포의 활성화
하지 DVT 환자의 말초 혈액 중의 VE 카드헤린-양성 단핵세포의 변화(평균±SD,%)
환자의 수 VE 카드헤린-양성 단핵세포
투여 전 15 0.44±0.75
투여 후 7일째 15 1.25±1.39＊
투여 후 14일째 10 1.61±2.60
＊:P<0.05, 대응이 있는 비-파라미터 검정을 이용하는 투여전과의 비교.
바트록소빈 투여에 의해, 말초 혈액 중의 VE 카드헤린-양성 단핵세포의 비율이 투여 전과 비교해 상당히 증가하였다(표 5).
이러한 결과는 바트록소빈이 하지 DVT 환자의 말초 혈액 중의 VE 카드헤린-양성 단핵세포(즉, 혈관 EPC)를 활성화 하였다는 것을 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 VE 카드헤린-양성 단핵세포의 증식, 이동성 및 분화를 촉진한 것으로 생각된다.
(4) 하지 DVT 의 부종 증상의 개선
하지 DVT 환자의 슬상(above-knee) 및 슬하(below-knee)의 둘레의 변화(평균±SD,%)
환자의 수 슬상(above-knee)의 둘레 슬하(below-knee)의 둘레
투여 전 15 55.7±6.2 38.1±4.2
투여 후 14일째 15 51.8±6.0＊＊ 35.0±2.7＃＃
＊＊:P<0.01, Wilcoxon 테스트를 이용하여 투여 전과의 비교.
# # :P<0.01, 대응이 있는 t-테스트를 이용하여 투여전과의 비교.
하지 부종의 정도는, 하지의 슬상 20㎝의 둘레와 하지의 슬하 15㎝의 둘레를 기초로 하여 평가되었다. 슬상 및 슬하의 둘레는 바트록소빈의 투여에 의해 상당ㅎ히 감소하였다(표 6).
이러한 결과는, 바트록소빈의 투여에 의한 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화에 의해, 줄기세포 및/또는 전구세포의 증식, 이동성 및 분화가 촉진되어, 하지 DVT 환자의 손상된 혈관이 재생하고 부종 증상이 개선하는 것을 나타낸다.
또한, 바트록소빈의 약리 작용의 지표인 혈장 피브리노겐 수치를 측정했을 때, 바트록소빈 투약 후 7일 및 14일째에 피브리노겐의 수치가 현저하게 감소하였다(데이터는 나타내지 않음). 이것은, 투여된 바트록소빈이 체내에서 효과를 발휘하고 있는 것을 나타낸다.
또한, (바트록소빈을 포함한) 혈액 응고 및 섬유소 분해계에 작용하는 제재의 투여시에 나타나는 부작용(출혈 등)의 지표가 되는 인자 APTT, PT 및 TT의 측정을 바트록소빈 투여 전, 투약 후 7일 및 14일째에 실시하였지만, 바트록소빈의 투여 전과 후에 큰 차이가 없었다(데이터는 나타내지 않음). 이것은, 바트록소빈 투여에 의한 부작용이 생기지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 3
뇌경색/ 재관류 손상 모델에 있어서의 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포의 활성화, 및 신경 기능의 회복에 대한 바트록소빈의 영향
본 실시예에서는, 래트(rat)의 뇌경색/재관류 손상 모델을 이용하여, 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포의 활성화, 및 신경 기능 회복에 대한 바트록소빈의 효과를 평가하였다.
실험 방법:
(1) 사용 동물
12주령된 체중 250~280g의 스프래그-돌리(Sprague-Dawley) 수컷 래트 (Shanghai Animal Center, Chinese Academy of Medical Sciences. Shanghai. China)를, 1주간 적응시킨 후에 실험에 사용하였다.
(2) 뇌경색/ 재관류 손상 모델의 제작
우선, Longa EZ 등의 방법(Longa EZ et al.: Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20:84-91,1989)에 따라 중간 대뇌동맥 폐색 모델을 제작하였다. 구체적으로는, 12시간 동안 절식(단, 음수는 자유로움)시킨 래트에, 0.36g/㎏의 10% 포수클로랄(chloral hydrate)(Shencheng Chemical Co., Shanghai, China)을 복강내 투여하여, 래트를 마취시켰다. 그런 다음, 경부의 정중선 절개(midline incision)를 실시하여, 우측 온목동맥(common carotid artery)을 노출시켰다. 다음으로, 속목동맥(internal carotid artery)과 바깥목동맥(external carotid artery)을 분리하고, 바깥목동맥의 가지인 후부목동맥(posterior carotid artery)과 상갑상선동맥(superior thyroid artery)을 응고 절단하며, 그 다음에 혀동맥(lingual artery)과 위턱동맥(maxillary artery)과의 분지부에서 바깥목동맥을 결착하고, 바깥목동맥에 작은 구멍을 만들어, 4-O 나일론사를 구멍으로부터 온목동맥을 통해, 저항이 있을 때까지 서서히 속목동맥에 삽입하였다. 나일론사의 온목동맥의 분지부에서 약 18~20㎜였다. 나일론사로 중간 대뇌동맥을 폐색함으로써, 중간 대뇌동맥 폐색 모델을 제작하기 위해 2시간 동안의 허혈 상태가 적용되었다.
획득한 중간 대뇌동맥 폐색 모델로부터 나일론사를 뽑아 혈액의 재관류를 실시하는 것에 의해 뇌경색/재관류 손상 모델을 확립하였다.
(3) 모델 래트에 바트록소빈의 투여
래트를 3그룹으로 나우어 각각 아래와 같은 처리를 하였다.
1) 거짓 수술 그룹(75마리): 상기한 과정 (2)의 순서 중 속목동맥과 바깥목동맥의 분리까지는 실시하였지만, 이어지는 중간 대뇌동맥의 폐색 및 재관류는 실시하지 않았다. 이 그룹의 래트에게는, 바트록소빈 투여 그룹에서처럼 동일한 투여 시간에 복강내로 바트록소빈 대신에 생리 식염수를 동일한 양으로 투여하였다.
2) 모델 그룹(75마리): 이 그룹의 동물들은 뇌경색/재관류 손상 모델을 만들기 위해 사용되었다. 이 그룹의 래트에게는, 바트록소빈 투여 그룹에서처럼 동일한 투여 시간에 복강내로 바트록소빈 대신에 생리 식염수를 동일한 양으로 투여하였다.
3) 바트록소빈 그룹(75마리): 이 그룹의 동물들로 뇌경색/재관류 손상 모델을 만든 후, 허혈의 발병 30분 후의 시점에 생리 식염수로 희석된 바트록소빈 제제를 20BU/㎏/l0㎖의 투여량으로 복강내 투여하고, 계속하여 1시간 30분 동안 허혈을 실시한 후, 나일론사를 뽑아 재관류를 실시하였다. 뇌경색/재관류 손상 모델이 제작된 후, 2일, 4일, 6일 및 8일째에 20BU/㎏/l0㎖의 투여량으로 바트록소빈을 복강내로 투여하였다.
(4) 신경 기능 스코어의 평가
각 그룹당 15마리의 래트에 대하여, 뇌경색/재관류 손상 모델이 제작된 후 하루에 한 번 신경 기능 스코어를 평가하였다. 신경 기능 장애 스코어의 평가는, Longa EZ의 방법(Longa EZ et al.: Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20:84-91,1989)에 따른 이하의 기준을 이용하여 평가하였다. 결과는 중앙값으로 나타냈다.
0점: 정상
l점: 경색 병소(infarction focus)의 반대측의 사지가 구부러진다.
2점: 꼬리를 뒤로 당기면 경색 병소의 반대측의 사지가 무력 상태가 된다.
3점: 꼬리를 당기면 경색 병소의 반대측으로 선회한다.
4점: 경색 병소의 반대측으로 자발적으로 선회한다.
5점: 자력 운동이 불가능하다.
(5) 네스틴 -양성 세포( Nestin - Positive Cells )의 분석
각 그룹의 10마리의 래트에 대하여, 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째에 각각 부검하였다(전체 동물은 각 그룹에서 30마리이다). 조직 표본을 제작한 후에, 현미경하에서 신경줄기세포를 계수하였다.
보다 구체적으로는, 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째에 래트의 동결 뇌절편을 제작하고, 신경줄기세포에서 발현하는 네스틴 표지를 이용하여 뇌실하 영역 (subventricular zone:SVZ)에서의 네스틴-양성 세포의 존재를 면역 조직화학 염색법으로 측정하였다. 네스틴-양성 세포의 존재는, 마우스 항-래트 네스틴 단일클론 항체(Chemicon, Temecula, USA)를 이용하여 측정하였다.
(6) BrdU -양성 세포 및 BrdU -양성/ 네스틴 -양성 세포의 분석
각 그룹의 30마리의 래트에 대하여, 모델 제작 후 5일, 6일, 12일, 13일, 19일 및 20일째에, 5-브로모데옥시우리딘(BrdU, CalBiochem, San Diego, USA) 50㎎/㎏을 복강내 주사하였다. BrdU는 티미딘의 유사체이므로, 세포 증식 과정(DNA 합성) 동안에 세포의 DNA에 혼합된다. 따라서, 세포내 BrdU량을 검출하는 것에 의해서, 세포 증식을 검출할 수 있다. 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째에 래트를 부검하여, 동결 뇌절편을 제작하였다. 제작한 동결 뇌절편 중의 SVZ 영역에 있어서, BruU 양성 세포의 존재는 면역화학 염색으로, BrdU-양성 세포/네스틴-양성 세포의 존재는 이중 면역 형광 염색으로 분석하였다.
BrdU-양성 세포의 존재는, 마우스 항-래트 BrdU 단일클론 항체(Oncogene, Westhaver, USA)를 이용하여 분석하였다.
BrdU-양성/네스틴-양성 세포의 존재는, 1차 항체로서의 염소 항-래트 BrdU 다클론 항체(Biodesign, Saco, USA)와, 2차 항체로서의 FITC-표지 토끼 항-염소 항체(Pierce, Rockford, USA)와의 조합물, 및 1차 항체로서의 마우스 항-래트 네스틴 단클론 항체와, 2차 항체로서의 Rho-표지 토끼 항-마우스 항체(Pierce, Rockford, USA)와의 조합물을 이용하여 이중 면역 형광 염색으로 분석하였다.
(7) NeuN -양성 세포, GFAP -양성 세포, 및 BrdU -양성/ GFAP 양성 세포의 분석
각 그룹의 30마리의 래트에 대하여, 모델 제작 후 5일, 6일, 12일, 13일, 19일 및 20일째에, BrdU 50㎎/㎏을 복강내 주사하였다. 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째에 래트를 부검하여, 동결 뇌절편을 제작하였다. 동결 뇌절편중의 SVZ 영역에 있어서 NeuN-양성 세포의 존재는 면역 화학 염색으로, 신경교원섬유산 단백질 (glial fibrillory acidic protein(GFAP))의 존재는 면역 화학 염색으로, BrdU-양성/GFAP 양성 세포의 존재는 이중 면역 형광 염색으로 분석하였다. NeuN은 신경줄기세포로부터 분화하는 미성숙 신경세포에서 발현하는 표지(marker)이다. GFAP는 신경줄기세포로부터 분화하는 성상세포에서 발현하는 표지(marker)이다.
NeuN-양성 세포의 존재는, 염소 항-NeuN 단클론 항체(Chemicon, Temecula, USA)를 사용하여 분석하였다. GFAP-양성 세포의 존재는, 염소 항-GFAP 다클론 항체 (Stigma, St.Louis, USA)를 사용하여 분석하였다. BrdU-양성/GFAP-양성 세포의 존재는, 1차 항체로서의 마우스 항-래트 BrdU 단클론 항체와, 2차 항체로서의 Rho-표지 토끼 항-마우스 항체와의 조합물, 및 1차 항체로서의 염소 항-GFAP 다클론 항체와, 2차 항체로서의 FITC-표지 토끼 항-염소 항체와의 조합물을 이용하여 이중 면역 형광 염색으로 분석하였다.
(8) BrdU -양성 (이동) 세포의 분석
각 그룹의 30마리의 래트에 대해서, 모델 제작 후 24시간 이내에 BrdU 50㎎/㎏을 2회에 걸쳐 복강내 주사하였다. 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째에 래트를 부검하여, 동결 뇌절편을 제작하였다. 동결 뇌절편 중의 SVZ 영역에 있어서 BrdU-양성 세포의 존재는 마우스 항-래트 BrdU를 사용하여 면역 화학 염색으로 분석하였다.
결과 및 고찰
(1) 신경 기능의 평가
신경 기능 스코어를 뇌경색/재관류 손상 모델이 제작된 후부터 시작하여 실험이 종료되는 21일째까지 매일 측정하였다.
신경 기능 스코어의 경시 변화(n= 15, 중앙값)
1일 2일 3일 4일 5일 6일 7일 8일 9일 10일
거짓 수술 그룹 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
모델 그룹 3 3 3 2 2 2 2 2 1 1
바트록소빈 그룹 3 3 2 2 1 1 1＊ 0＊ 0＊ 0
11일 12일 13일 14일 15일 16일 17일 18일 19일 20일 21일
거짓 수술 그룹 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
모델 그룹 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1＊＊
바트록소빈 그룹 0 0 0 0 0 0＊ 0 0 0 0 0＊＊
＊P<0.05, 모델 그룹과 비교,
＊＊p<0.05, Kruskal-Wallis 테스트를 이용하여 각 그룹의 1일째를 비교.
거짓 수술 그룹에서는, 신경 기능 장애가 관찰되지 않았다. 다른 두 그룹에서는, 수술 후 l일째와 비교해서 수술 후 21일째에 신경 기능의 상당한 회복이 관찰되었다(p<O. 05).
바트록소빈 투여 그룹에서는, 모델 그룹과 비교하여 더 빠른 신경 기능 회복이 관찰되었다. 특히, 수술 후 7일, 8일, 9일 및 16일째의 바트록소빈 투여 그룹에서는, 모델 그룹과 비교하여 상당한 신경 기능 회복이 관찰되었다.
이러한 결과는, 바트록소빈이 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포를 활성화시켰고, 신경 기능 장애의 회복에 기여하였다는 것을 나타낸다.
(2) 신경줄기세포의 존재의 증명
SYZ 영역에 있어서의 네스틴-양성 세포의 수(평균±SD, 세포수/㎟)
7일 14일 21일
거짓 수술 그룹 42.1±5.86 12.3±1.58 1.97±0.82
모델 그룹 209.5±21.6＊＊ 76.5±12.3＊＊ 45.1±5.60＊＊
바트록소빈 그룹 276.3±28.5＊＊＊ 97.2±13.7 59.2±6.84
＊＊P<0.01, 거짓 수술 그룹과 비교,
＊＊＊P<0.05 Wilcoxon 테스트를 이용하여 동일날에 모델 그룹과 비교.
상기 표 8에 기재된 데이타에 따라서, 모델 그룹을 100%의 값으로 한 경우 바트록소빈 그룹에서 네스틴-양성 세포수의 상대값(%)을 아래와 같은 식에 따라 계산하였다.
BRt(%)= (Bt-St)/(Mt-St)×100
BRt(%): t 시점에서 바트록소빈 그룹의 네스틴-양성 세포의 비율(% )
Bt: t 시점에서 바트록소빈 그룹의 네스틴-양성 세포의 평균값
St: t 시점에서 거짓 수술 그룹의 네스틴-양성 세포의 평균값
Mt: t 시점에서 모델 그룹의 네스틴-양성 세포의 평균값
t : 7일, 14일 또는 21일
결과를 도 1에 나타낸다. 거짓 수술 그룹과 비교한 경우, 네스틴-양성 세포의 수는 모델 그룹에서 증가하였다(표 8). 이는, 동물에 있어서 뇌경색/재관류 손상 장애의 자극에 의해 유발된 보상 반응이 원인이라고 생각된다.
한편, 바트록소빈 투여 그룹은, 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째의 어느 시점에 있어서도, 모델 그룹과 비교하여 증가한 네스틴-양성 세포의 수를 나타냈다(표 8, 도 1).
이러한 결과는, 바트록소빈이 네스틴-양성 세포(즉, 신경줄기세포)를 활성화 시킨 것을 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 신경줄기세포의 증식 및 이동성을 촉진하는 것으로 생각된다.
또한, 모델 제작 후 9일째부터 바트록소빈을 투여하고 있지 않음에도 불구하고, 모델 제작 후 21일째의 시점에 있어서도, 바트록소빈 그룹은 모델 그룹과 비교하여 현저하게 증가한 네스틴-양성 세포수를 나타냈다(도 1). 이것은, 바트록소빈이 신경줄기세포에 지속적인 활성화 작용을 가지는 것을 나타낸다.
(3) 증식하는 신경줄기세포의 존재 및 그것들의 자기 복제능의 증명
1) 증식하는 신경줄기세포의 존재의 증명
증식하는 네스틴-양성/BrdU-양성 세포(즉, 신경줄기세포)의 존재는 바트록소빈 그룹의 SVZ 영역에서 이중 면역 형광 염색으로 확인되었다(데이타는 기술하지 않음). 이것은, 바트록소빈 그룹에서 신경줄기세포가 증식한다는 것을 나타낸다.
2) 신경줄기세포의 자기 복제능의 증명
SYZ 영역에 있어서의 BrdU-양성 세포의 수(평균±SD, 세포수/㎟)
7일 14일 21일
거짓 수술 그룹 51.7±3.76 32.8±2.82 21.9±1.87
모델 그룹 136.45±9.82＊＊ 327.6±12.4＊＊ 277.2±12.5＊＊
바트록소빈 그룹 157.71±11.3 448.2±27.7＊＊＊ 358.2±18.6＊＊＊
＊＊P<0.01, 거짓 수술 그룹과 비교,
＊＊＊P<0.01, Wilcoxon's 테스트를 이용하여 동일날에 모델 그룹과 비교.
상기 표 9에 기재된 데이타에 따라서, 모델 그룹을 100%의 값으로 한 경우 바트록소빈 그룹에서 BrdU-양성 세포수의 상대값(%)을 아래와 같은 식에 따라 계산하였다.
BRt(%)= (Bt-St)/(Mt-St)×100
BRt(%): t 시점에서 바트록소빈 그룹의 BrdU-양성 세포의 비율(% )
Bt: t 시점에서 바트록소빈 그룹의 BrdU-양성 세포의 평균값
St: t 시점에서 거짓 수술 그룹의 BrdU-양성 세포의 평균값
Mt: t 시점에서 모델 그룹의 BrdU-양성 세포의 평균값
t : 7일, 14일 또는 21일
결과를 도 2에 나타낸다. 거짓 수술 그룹과 비교한 경우, BrdU-양성 세포의 수는 모델 그룹에서 증가하였다(BrdU는 증식하는 세포의 표지(marker)이다)(표 9). 이는, 동물에 있어서 뇌경색/재관류 손상 장애의 자극에 의해 유발된 보상 반응이 원인이라고 생각된다.
한편, 바트록소빈 투여 그룹은, 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째의 어느 시점에 있어서도, 모델 그룹과 비교하여 증가한 BrdU-양성 세포의 수를 나타냈다(표 9, 도 2).
뇌 조직에 존재하는 BrdU-양성 세포는 자기 복제능에 기초하여 BrdU를 결합할 수 있는 신경줄기세포 및 신경전구세포만으로 구성된다. 따라서, 이러한 결과는, 바트록소빈이 신경줄기세포 및/또는 신경줄기세포를 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 신경줄기세포 및/또는 신경줄기세포의 증식 및 이동성을 촉진하는 것으로 생각된다.
또한, 모델 제작 후 9일째부터 바트록소빈을 투여하고 있지 않음에도 불구하고, 모델 제작 후 21일째의 시점에 있어서도, 바트록소빈 그룹은 모델 그룹과 비교하여 현저하게 증가한 BrdU-양성 세포수를 나타냈다(도 2). 이것은, 바트록소빈이 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포에 지속적인 활성화 작용을 가지는 것을 나타낸다.
(4) 미성숙 신경세포, 신경줄기세포로부터 분화한 성상세포(Astrocytes) 및 증가한 성상세포의 존재의 증명
1) 미성숙 신경세포의 존재의 증명
NeuN-양성 세포의 존재는 바트록소빈 그룹에서 확인되었다(데이타는 기술하지 않음). NeuN은 신경줄기세포로부터 분화하는 미성숙 신경세포에서 발현하는 표지(marker)이다. 따라서, 이는 신경줄기세포로부터 분화한 미성숙 신경세포가 바트록소빈 그룹에 존재함을 나타낸다.
2) 신경줄기세포로 분화한 성상세포의 존재의 증명
BrdU-양성/GFAP-양성 세포의 존재는 바트록소빈 그룹의 SVZ 영역에서 이중 면역 형광 염색을 사용하여 확인되었다. GFAP는 신경줄기세포로부터 분화하는 성상세포에서 발현하는 표지(marker)이다. 따라서, 이는 신경줄기세포로부터 분화한 성상세포가 바트록소빈 그룹에 존재함을 나타낸다. 그러나, 성상세포는 신경 조직에서 이미 분화한 세포인데, 왜 BrdU가 그 성상세포에 결합하였는가? 이것은 줄기세포 및/또는 전구세포가 성상세포로 분화하기 이전의 상태로 계속적으로 존재할 때, 검출된 BrdU가 그 세포에 결합한 것으로 생각된다.
3) 증가한 성상세포의 존재의 증명
SYZ 영역에 있어서의 GFAP-양성 세포의 수(평균±SD, 세포수/㎟)
7일 14일 21일
거짓 수술 그룹 2.2±0.18 1.3±0 0
모델 그룹 66.4±21.8＊＊ 57.6±16.4＊＊ 27.7±12.5＊＊
바트록소빈 그룹 87.1±26.4＊＊＊ 68.2±17.7 34.9±16.8
＊＊P<0.01, 거짓 수술 그룹과 비교,
＊＊＊P<0.05, Wilcoxon 테스트를 이용하여 동일날에 모델 그룹과 비교.
상기 표 10에 기재된 데이타에 따라서, 모델 그룹을 100%의 값으로 한 경우 바트록소빈 그룹에서 GFAP-양성 세포수의 상대값(%)을 아래와 같은 식에 따라 계산하였다.
BRt(%)= (Bt-St)/(Mt-St)×100
BRt(%): t 시점에서 바트록소빈 그룹의 GFAP-양성 세포의 비율(% )
Bt: t 시점에서 바트록소빈 그룹의 GFAP-양성 세포의 평균값
St: t 시점에서 거짓 수술 그룹의 GFAP-양성 세포의 평균값
Mt: t 시점에서 모델 그룹의 GFAP-양성 세포의 평균값
t : 7일, 14일 또는 21일
결과를 도 3에 나타낸다. 거짓 수술 그룹과 비교한 경우, GFAP-양성 세포의 수는 모델 그룹에서 증가하였다(GFAP는 신경줄기세포로부터 분화한 성상세포에 대한 표지(marker)이다)(표 10). 이는, 동물에 있어서 뇌경색/재관류 손상 장애의 자극에 의해 유발된 보상 반응이 원인이라고 생각된다.
한편, 바트록소빈 투여 그룹은, 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째의 어느 시점에 있어서도, 모델 그룹과 비교하여 증가한 GFAP-양성 세포의 수를 나타냈다(표 10, 도 3).
이러한 결과는, 바트록소빈이 GFAP-양성 세포(즉, 신경줄기세포 및/또는 신경줄기세포)를 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 신경줄기세포 및/또는 신경줄기세포의 증식, 분화 및 이동성을 촉진하고, 특히 상기 세포로부터 성상세포로의 분화를 촉진하는 것으로 생각된다.
또한, 모델 제작 후 9일째부터 바트록소빈을 투여하고 있지 않음에도 불구하고, 모델 제작 후 21일째의 시점에 있어서도, 바트록소빈 그룹은 모델 그룹과 비교하여 현저하게 증가한 GFAP-양성 세포수를 나타냈다(도 3). 이것은, 바트록소빈이 성상세포로 분화하는 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포에 지속적인 활성화 작용을 가지는 것을 나타낸다.
(5) 이동하는 세포의 존재의 증명
SYZ 영역에 있어서의 BrdU-양성 세포의 수(평균±SD, 세포수/㎟)
7일 14일 21일
거짓 수술 그룹 2.25±1.08 3.75±1.33 3.14±1.09
모델 그룹 122.3±14.2＊＊ 78.5±8.3＊＊ 33.6±5.37＊＊
바트록소빈 그룹 136.7±15.3 102.7±11.2＊＊＊ 55.5±8.23
＊＊P<0.01, 거짓 수술 그룹과 비교,
＊＊＊P<0.05, Wilcoxon 테스트를 이용하여 동일날에 모델 그룹과 비교.
상기 표 11에 기재된 데이타에 따라서, 모델 그룹을 100%의 값으로 한 경우 바트록소빈 그룹에서 BrdU-양성 세포수의 상대값(%)을 아래와 같은 식에 따라 계산하였다.
BRt(%)= (Bt-St)/(Mt-St)×100
BRt(%): t 시점에서 바트록소빈 그룹의 BrdU-양성 세포의 비율(% )
Bt: t 시점에서 바트록소빈 그룹의 BrdU-양성 세포의 평균값
St: t 시점에서 거짓 수술 그룹의 BrdU-양성 세포의 평균값
Mt: t 시점에서 모델 그룹의 BrdU-양성 세포의 평균값
t : 7일, 14일 또는 21일
결과를 도 4에 나타낸다. 본 실험에서, BrdU는 모델 제작 후 24시간 이내에 단 2회에 걸쳐 복강내로 투여되었고, 그 이후로 투여되지 않았기 때문에, 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째에 분석된 BrdU-양성 세포는 BrdU-투여 시간에 존재하는 BrdU-양성 세포이다. 따라서, 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째에 SVZ 영역에서 분석된 BrdU-양성 세포의 수의 증가량은 SVZ 영역으로 이동한 BrdU-양성 세포의 수를 반영한다. 더욱이, SVZ 영역에서의 BrdU-양성 세포는 자기 복제능에 기초한 BrdU에 결합할 수 있는 신경줄기세포 및 신경전구세포로만 구성된다. 상기한 내용을 기초로 하여, 표 11 및 도 4는 SVZ 영역으로의 신경줄기세포 및 신경전구세포의 이동 상태를 나타낸다.
거짓 수술 그룹과 비교한 경우, BrdU-양성 세포의 수는 모델 그룹에서 증가하였다(표 11). 이는, 동물에 있어서 뇌경색/재관류 손상 장애의 자극에 의해 유발된 보상 반응이 원인이라고 생각된다.
한편, 바트록소빈 투여 그룹은, 모델 제작 후 7일, 14일 및 21일째의 어느 시점에 있어서도, 모델 그룹과 비교하여 증가한 BrdU-양성 세포의 수를 나타냈다(표 11, 도 4). 이것은, SVZ 영역으로 이동하는 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포의 수가 모델 그룹보다 바트록소빈 그룹에서 더 크다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는, 바트록소빈이 신경줄기세포 및/또는 신경줄기세포를 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 신경줄기세포 및/또는 신경줄기세포의 이동성을 촉진하는 것으로 생각된다.
또한, 모델 제작 후 9일째부터 바트록소빈을 투여하고 있지 않음에도 불구하고, 모델 제작 후 21일째의 시점에 있어서도, 바트록소빈 그룹은 모델 그룹과 비교하여 현저하게 증가한 BrdU-양성 세포수를 나타냈다(도 4). 이것은, 바트록소빈이 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포에 지속적인 활성화 작용을 가지는 것을 나타낸다.
또한, SVZ 영역에서 BrdU-양성 세포의 분포는, 면역 화학 염색을 이용하여 모델 그룹과 바트록소빈 그룹을 비교하였다. 모델 그룹에서, BrdU-양성 세포는 단지 SVZ 영역의 표면에만 분포되었지만(도 5의 위), 바트록소빈 그룹에서 BrdU-양성 세포는 SVZ 영역의 표면에서 내부까지 폭넓게 분포되어 있다(도 5의 아래). 이는, 바트록소빈의 투여의 결과로서, 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포가 SVZ 영역의 표면으로부터 내부로 이동하였다는 것을 나타낸다. 즉, 바트록소빈은 뇌 조직에서 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포의 이동을 촉진하는 것을 나타낸다.
본 실시예 3의 이러한 결과는, 바트록소빈이 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포에 지속적인 활성화 효과를 가진다는 것을 명백히 나타낸다. 바트록소빈의 활성화 효과는 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포의 증식, 이동성 및 분화를 촉진하는 것으로 생각된다.
상기 실시예에서 기술한 것처럼, 본 발명의 활성화제는 줄기세포 및/또는 전구세포를 활성화 시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 재생 의료, 특히 자발적 재생을 활용하는 재생 의료에 이용될 수 있다.
본 발명의 활성화제를 이용하여 실행되는 자발적 재생을 활용한 재생 의료는, 환자의 몸에 존재하는 줄기세포 및/또는 전구세포를 이용하기 때문에, 환자의 신체의 외부로부터 세포를 도입할 필요가 없다. 따라서, 환자의 부담은 줄어들고 세포 이식시에 발생하는 감염과 같은 위험성이 또한 사라지므로, 자발적 재생을 활용하는 재생 의료는 환자의 신체의 외부로부터 세포를 주입하는 재생 의료보다 뛰어나다.
또한, 본 발명의 활성화제를 이용함으로써 실행되는 자발적 재생을 활용한 재생 의료에서, 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화는 환자의 병에 걸린 부위(즉,손상된 장기 및/또는 조직)에 특정적으로 일어나고, 재생은 단지 요구 정도에 따라서 일어난다. 따라서, 자발적 재생을 활용한 재생 의료는, 환자의 신체의 외부로부터 세포를 주입하는 종래의 재생 의료의 주요 방법인 세포 이식에 의한 과도한 재생 및/또는 과도한 복구에 의해 야기되는 합병증의 발생 위험이 없다.
더욱이, 트롬빈 유사효소를 포함하는 본 발명의 활성화제는, 부작용이 없거나 거의 없고, 재생 의료가 적용되는 손상된 장기 및/또는 조직의 진행 상태 및 손상 정도에 따라 신속하고 적절하게 작용할 수 있으며, 지속가능한 활성화 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 활성화제는 바람직하게는 재생 의료에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 재생 의료, 특히 산업상 이용 가능성이 높은 자발적 재생을 활용한 재생 의료에 사용될 수 있다.

Claims (28)

  1. 트롬빈 유사효소(thrombin-like enzyme)를 포함하는 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 트롬빈 유사효소는 바트록소빈(batroxobin), 앤크로드(ancrod) 및 크로탈레이즈(crotalase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 활성화제.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 트롬빈 유사효소는 바트록소빈(batroxobin)인 활성화제.
  4. 제 1 항에 있어서, 트롬빈 유사효소 이외의 하나 이상의 활성 물질을 더 포함하는 활성화제.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 트롬빈 유사효소 이외의 활성 물질은 성장인자, 시토카인, 에스트로겐, 지질, 스타틴(statin), 항-성장 인자 항체, 성장 인자 억제제, 항-성장 인자 억제제 항체 및 항-시토카인 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 활성화제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 재생 의료(regenerative medicine)에 적용되는 세포인 활성화제.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 자발적 재생(self-regeneration)을 이용하는 재생 의료(regenerative medicine)에 적용되는 세포인 활성화제.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 피부계 질환, 뇌신경계 질환, 심혈관계 질환, 소화기계 질환, 호흡기계 질환, 비뇨기계 질환, 운동기관계 질환, 혈관계 질환, 내분비계 질환 및 안과계 질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환을 위한 재생 의료(regenerative medicine)에 적용되는 세포인 활성화제.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 뇌신경계 질환, 심혈관계 질환, 피부계 질환 및 혈관계 질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환을 위한 재생 의료(regenerative medicine)에 적용되는 세포인 활성화제.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 내재성 세포(resident cells), 골수 유래 세포(bone marrow-derived cells) 및 혈액 유래 세포(blood-derived cells)로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포인 활성화제.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성화 효과는 줄기세포 및/또는 전구세포의 증식 촉진, 이동 촉진 및 분화 촉진으로 구성되는 군으로부터 선택되는 작용인 활성화제.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서, 재생 의료가 적용되는 손상된 장기 및/또는 조직의 진행 상태 및 손상 정도에 따라 신속하고 적절하게 작용할 수 있는 활성화제.
  13. 제 12 항에 있어서, 지속가능한 활성화 효과를 가지는 활성화제.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 부작용이 없거나 거의 없는 활성화제.
  15. 제 1 항에 있어서, 혈관 내피 전구세포(vascular endothelial progenitor cells) 및/또는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)의 이동을 촉진하는 활성화제.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 하지 심정맥 혈전증 (lower limb deep vein thrombosis)을 위한 재생 의료에 적용되는 세포인 활성화제.
  17. 제 16 항에 있어서, 혈관 내피 전구세포 및/또는 중간엽 줄기세포의 증식 및/또는 이동을 촉진하는 활성화제.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 허혈성 뇌혈관 질환 (ischemic cerebrovascular diseases)을 위한 재생 의료에 적용되는 세포인 활성화제.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 뇌경색/재관류 손상 (cerebral ischemia/reperfusion injury)을 위한 재생 의료에 적용되는 세포인 활성화제.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포인 활성화제.
  21. 제 20 항에 있어서, 신경줄기세포 및/또는 신경전구세포의 증식 및/또는 이동 및/또는 분화를 촉진하는 활성화제.
  22. 동물에게 치료적으로 유효한 양의 트롬빈 유사효소를 투여하는 단계를 포함하는 동물에 있어서의 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 동물은 인간인 활성화 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 트롬빈 유사효소는 바트록소빈(batroxobin)인 활성화 방법.
  25. 줄기세포 및/또는 전구세포를 활성화하기 위한 트롬빈 유사효소의 용도.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 트롬빈 유사효소는 바트록소빈(batroxobin)인 용도.
  27. 줄기세포 및/또는 전구세포의 활성화제를 제조하기 위한 트롬빈 유사효소의 용도.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 트롬빈 유사효소는 바트록소빈(batroxobin)인 용도.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015088288A1 (ko) * 2013-12-12 2015-06-18 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법
WO2017176054A1 (ko) * 2016-04-06 2017-10-12 주식회사 제이제이메이딘 줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008085221A2 (en) * 2006-10-27 2008-07-17 Caritas St. Elizabeth Medical Center Of Boston, Inc. Therapeutic use of cd31 expressing cells
TWI482629B (zh) 2008-07-01 2015-05-01 Tobishi Pharmaceutical Co 下泌尿道疾病治療劑及下泌尿道症狀改善劑
CN103040860B (zh) 2012-11-29 2018-08-14 刘学武 一种启动哺乳动物干细胞的方法及二氧化氯在制备用于启动哺乳动物干细胞的药物的应用
US20210128699A1 (en) * 2017-01-13 2021-05-06 Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. Neutrophil activation regulator
CN114134108A (zh) * 2021-11-30 2022-03-04 武汉伯韬生物科技有限公司 一种干细胞生物活性组合物及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH626917A5 (ko) * 1976-08-17 1981-12-15 Pentapharm Ag
JP4140981B2 (ja) * 1994-12-26 2008-08-27 東菱薬品工業株式会社 再狭窄症及び動脈硬化症治療薬
JP3742675B2 (ja) * 1995-06-28 2006-02-08 東菱薬品工業株式会社 虚血−再灌流障害の予防および治療薬
JP3866800B2 (ja) * 1996-08-29 2007-01-10 東菱薬品工業株式会社 アポトーシス関連疾患の予防及び／又は治療薬
WO2005045022A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-19 Biobud Co., Ltd. Thrombin-like recombinant batroxobin expressed by pichia sp.and production method thereof
WO2005090550A1 (ja) * 2004-03-18 2005-09-29 Biomaster, Inc. 幹細胞の増殖法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015088288A1 (ko) * 2013-12-12 2015-06-18 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법
US9982233B2 (en) 2013-12-12 2018-05-29 Samsung Life Public Welfare Foundation Method for promoting generation of stem cell-derived exosome by using thrombin
WO2017176054A1 (ko) * 2016-04-06 2017-10-12 주식회사 제이제이메이딘 줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법

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