TWI382090B

TWI382090B - 幹細胞及／或前驅細胞的賦活劑

Info

Publication number: TWI382090B
Application number: TW095136179A
Authority: TW
Inventors: Hirobumi Senga; Zhongchao Han; Dingfang Cai; Li Li
Original assignee: Tobishi Pharmaceutical Co
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2013-01-11
Also published as: TW200801191A

Description

幹細胞及/或前驅細胞的賦活劑

本發明關於含有類凝血酶之幹細胞及或前驅細胞之賦活劑，包括對動物投予有效量之類凝血酶的步驟之於動物中賦活幹細胞及/或前驅細胞之方法，以及類凝血酶用於賦活幹細胞及/或前驅細胞之用途。

發生於人類的疾病大致分為器質性疾病及功能性疾病。在傳統醫學中，內科療法主要用於功能性疾病，而外科療法及內科療法使用於器質性疾病。然而，多數的內科療法為全身性療法，於多數情況中無法徹底地治癒疾病。此外，外科療法為侵害性治療方法，其實施係將損傷器官之全部或部分予以切除，導致器官功能之部分或完全的喪失。另一方面，器官移植及人工器官係作為外科療法之替代醫療方法。然而，器官移植存在為數眾多的問題，例如，用於抑制排斥反應之免疫抑制劑所引起之副作用之技術問題，以及例如捐贈者嚴重短缺與增加的健康照護成本的社會問題。此外，使用人工器官亦存在有為數眾多的問題，該等問題包括例如無法取代器官功能及生體可相容性的技術問題，以及例如增加的健康照護成本的社會問題。

由於為可解決該等問題之新療法，再生醫學(regenerative medicine)目前受到注目。再生醫學意指積極地利用細胞以再生組織與器官的結構(construction)以及恢復組織與器官功能的治療方法，其中該等功能係由於疾病或意外而導致功能失調(functional disorder)或功能障礙(dysfunction)。再生醫學根據細胞利用的方式(mode)大致分為下列三種類型：(1)一種方法包括下列步驟：自捐贈者收集胚胎幹細胞、胎盤血液衍生單核細胞(mononuclear cells)、血液衍生單核細胞或骨髓衍生單核細胞，於體外培養誘導細胞增殖(proliferation)及/或分化(differentiation)，以及經由移植(implantation)將經選擇之未分化(幹細胞及/或前驅細胞)及/或分化之細胞引入患者體內；(2)一種方法包括下列步驟：自該患者收集體幹細胞(somatic stem cells)、血液衍生單核細胞或骨髓衍生單核細胞，於體外培養誘導細胞增殖及/或分化，以及經由移植將經選擇之未分化(幹細胞及/或前驅細胞)及/或分化之細胞引入該患者自體體內；以及(3)一種方法包括下列步驟：刺激患者身體(例如經由藥物投予、身體運動及/或物理治療等)以賦活存在於該患者之損傷器官或組織原位之幹細胞及/或前驅細胞(意指內在幹細胞(resident stem cells)及/或前驅細胞)，及/或該患者之血液衍生或骨髓衍生之幹細胞及/或前驅細胞，而非於體外培養誘導幹細胞及/或前驅細胞之增殖及/或分化。此方法定義為「自體再生」(self－regeneration)。

目前再生醫學的主流係涉及經由移植(亦即，上述(1)及(2)所述之方法)將細胞由外部引入患者體內。

將已分化的細胞由患者體外引入的方法使用於皮膚學、眼科學及整形外科手術的領域，該等學科之目標為由一種類型或極端有限的類型的細胞所建構的組織或器官(例如，皮膚、骨骼、軟骨、角膜及肌肉組織)。然而，由多種類型細胞所建構的實體器官(例如心、肝、肺、腎及腦)而言，合宜地調控該等多類型的已分化細胞之行為的技術仍應更充分地建立，且尚未達到實用階段。

另一方面，已知下列方法用於將未分化細胞由外部引入患者體內。

(1)涉及由患者體外引入幹細胞及/或血管內皮前驅細胞用以於嚴重缺血性疾病與心血管疾病中促進血管新生(angiogenesis)且形成新血管之血管新生治療方法(Weissman IL：Translating stem and progenitor cell biology to the clinic：Barriers and opportunities.Science 287：1442-1446,2000)。

(2)利用由患者體外引入胚胎幹細胞(ES cells)之血管形成(vasculogenesis)方法(McCloskey KE et al.：Use of embryonic stem cell-derived endothelial cells as a cell source to generate vessel structures in vitro.Tissue Eng 11：497-505,2005)。由於用於培養ES細胞的方法、誘導細胞分化的方法以及獲得分化細胞的方法等尚未充份地建立，此方法未達到實際應用。

(3)利用由患者本身之骨髓所單離之骨髓衍生單核細胞，且直接將該細胞引入受影響位置用以形成新血管之自體骨髓移植(autologous bone marrow transplantation)方法(Sato Y et al.：Can a bone marrow cell contribute to organ regeneration？ In vivo analysis using transgenic rats with reporter genes.Transplantation Proceedings 37：273-275,2005)。例如此方法具有可獲得之幹細胞數目少、在全身麻醉下收集大量骨髓時給患者帶來身體負擔(physical burden)與風險等問題。再者，控制移植細胞之分化上亦有相當大的困難性。

此外，於使用有關從患者體外引入幹細胞及/或前驅細胞之方法的再生醫學中，常見的問題為可歸因於移植細胞之過度再生及/或過度修復之併發症發生的風險。

相對地，利用「自體再生」的方法賦活原本存在於患者體內的幹細胞及/或前驅細胞(亦即源自患者本身之內在幹細胞及/或前驅細胞，及/或血液衍生或骨髓衍生之幹細胞及/或前驅細胞)再生損傷器官及/或組織從而可恢復功能(recovery function)。

雖然內在幹細胞及/或前驅細胞已被皆知存在於肝臟(為可再生器官)，該等具有再生能力之細胞最近被報導亦存在於神經系統(特別是例如腦之中樞神經系統)、皮膚、脂肪組織、視網膜、角膜、骨骼肌甚至是心臟(Garry DJ et al.：Ponce de Leon’s fountain：stem cells and the regenerating heart.Am J Med Sci 329(4)：190-201,2005)。目前，被認為內在幹細胞/或前驅細胞存在於所有器官及組織(Weissman IL：Translating stem and progenitor cell biology to the clinic：Barriers and opportunities.Science 287：1442－1446,2000；Garry DJ et al.：Ponce de leon’s fountain：stem cells and the regenerating heart.Am J Med Sci 329(4)：190－201,2005)。

由下述文獻得知內在幹細胞及/或前驅細胞、及/或血液衍生之或骨髓衍生之幹細胞及/或前驅細胞，取決於其所存在之誘導微環境之條件(inducing microenvironment condition)，例如包含於誘導微環境條件之不同類型的接觸細胞、細胞外基質、細胞激素(cytokines)以及生長因子，能夠分化成為不同類型之組織細胞。舉例而言：(1)當神經幹細胞於神經營養性因子(neurotrophic factor)或生長因子存在下培養時，該等神經幹細胞形成稱為神經球體(neurospheres)之單細胞衍生集落(colony)(亦即，自體複製(self－replication))，且該等神經球體根據不同的誘導微環境條件分化為神經元(neuron)、星形膠細胞(astrocyte)與寡突神經膠細胞(oligodendrocyte)(亦即多能性(multipotency))。此外，當神經球體於體外傳代培養(sub－cultured in vitro)時，單一神經球體衍生細胞可形成另外的神經球體(Reynolds BA and Weiss S：Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.Science 255：1707－1710,1992)；(2)將成年老鼠脊髓所取得之神經幹細胞移植至另一成年老鼠的脊髓內時，雖然神經幹細胞僅分化為神經膠狀細胞(gliacytes)，但當移植至海馬區齒狀回(hippocampus dentate gyrus)時，則分化為神經元(Shihabuddin LS et al.：Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus.The J Neuroscience 20：8727－8735,2000)；(3)當神經幹細胞與血管內皮細胞一起培養時，可促進神經幹細胞之增殖及分化為神經元(Shen Q et al.：Endothelial cells stimulate self－renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science 304：1338－1440,2004)。

另一方面，已知的以利用自體再生之再生醫學為目的，用於增加內在幹細胞及/或前驅細胞、及/或血液衍生或骨髓衍生之幹細胞及/或前驅細胞之促進的方法，如下述：(1)當EGF投予腦缺血模式之動物時，可促進神經幹細胞的增殖，且於栓塞區域約20%之損失細胞得到再生(Teramoto T et al.：EGF amplifies the replacement of parvalbumin－expressing striatal interneurons after ischemia.The J Clinical Investigation 111：1125－1132,2003)；(2)當高血脂治療藥物，斯坦丁(statin(3－羥基－3－甲基－戊二基輔酶A(HMG－CoA)還原酶抑制劑))，投予動脈硬化患者時，血液中骨髓衍生之血液血管幹細胞(hemangioblast)或內皮前驅細胞增加(Wal;er DH et al.：Statin therapy accelerates reendothelialization：A novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells.Circulation 105：3017-3024,2002)；(3)除了上述EGF之外，多種生長因子(例如VEGF、FGF(b-FGF)、PDGF、NGF及HGF)、細胞激素(例如G-CSF、GM-CSF、紅血球生成素(erythropoietin；EPO))、以及其他生物活性物質(例如雌激素及脂類等)經報導有用於增加幹細胞及/或前驅細胞(Takeyama K,Ohto H：PBSC mobilization.Transfus Apher Sci 31：233-243,2004；Aicher A,Zeiher AM,Dimmeler S：Mobilizing endothelial progenitor cells.Hypertension 45：321-325,2005)。然而，僅有上述物質之二者或三者已開發為醫藥品，例如G-CSF及b-FGF。再者，G-CSF有致癌(cancerogenesis)風險，同時b-FGF於靜脈內注射過程中有例如血管阻塞之副作用之風險。此外，慮及可歸因於生長因子所靶向多種細胞類型之副作用的多樣性，雖然對於VEGF及b-FGF的臨床研究已獲得充分的臨床功效，但VEGF及b-FGF經開發為具有少數靶細胞類型的生長因子。再者，EPO具有之副作用包括血壓的升高。

此外，皆知作為急性腦中風等治療藥物之巴曲酶(batroxobin)，於下列中國的網際網頁報導於大鼠局部(localized)腦缺血期間，影響缺血組織CD34的表現。

作者：Cai Zhenli

題目：Expression of CD34 in a rat local cerebral ischemia/reperfusion model and effect of batroxobin on its expression

相關網站：Chinese Dissertation Database(CDDB),Index No.Y653774

媒體類型：網上

出版者：Wanfang Data

存取日期：July 28,2005

網址：URL：http：//www.wanfangdata.com.cn/

在此報導中，在含有血管不含血液之腦組織樣本中(組織樣本係在樣本取樣之前進行冠狀動脈灌注而由腦組織去除血液而獲得)檢測細胞表面抗原CD34的表現。此處，CD34不僅表現於存在於骨髓之血液血管幹細胞、造血幹細胞、血管EPCs及間葉幹細胞，以及存在於血液之血管EPCs及間葉幹細胞(二者均為未分化細胞)，亦表現於構成血管壁之成熟血管內皮細胞(已分化的細胞)(Ohsawa T et al.ed.：Encyclopedia of Immunology(2^nd Edition),p.327,Tokyo Kagaku Dozin,December 3,2001)。因此，在使用骨髓及血管作為樣本的情況下，雖然未分化細胞(幹細胞及前趨細胞)為CD34陽性，但是在使用含有血管而不含血液之腦組織樣本之情況下，僅有已分化細胞為CD34陽性。因此，此報導未針對巴曲酶對於幹細胞及/或前驅細胞之作用進行任何評估。

另一方面，臨床上需要能夠基於利用自體再生的方法而使用於再生醫學之物質，該自體再生的副作用很小或沒有，且能夠根據該再生醫學所應用之損傷器官及/組織之進展狀態及程度適時地且適度地發揮作用(Kinnaird T et al.：Bone-marrow derived cells for enhancing collateral development：mechanism,animal data and initial clinical experiences.Cir Res 95(4)：354-363,2004)。

因此，本發明之目的係提供一種可使用於再生醫學之幹細胞及/或前驅細胞之賦活劑，特別是利用自體再生之再生醫學。

為了解決上述問題，本發明之發明者們對巴曲酶(一種類凝血酶)與幹細胞及前驅細胞賦活之間的關係進行了深入的研究，其結果發現，損傷的器官及組織經由使用巴曲酶活化該等細胞而可再生。本發明即根基於此發現而完成。

亦即，本發明關於一種含有類凝血酶之幹細胞及/或前驅細胞之賦活劑；於動物中賦活幹細胞及/或前驅細胞之方法，包括對動物投予有效量之類凝血酶之步驟，以及該類凝血酶用於賦活幹細胞及/或前驅細胞之用途。

以下詳細說明本發明。

本發明之幹細胞及/或前驅細胞之賦活劑之特徵在於含有類凝血酶作為其活性成分。

類凝血酶之具體例包括巴曲酶(batroxobin)、安可洛酶(ancrod)、可洛他酶(crotalase)等(Stocker KF：Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis,inMedical Use of Snake Venom Proteins ,Stocker KF,ed.,CRC Press,Boston,p130-131；1990)。巴曲酶為類凝血酶之最具代表性者且為具體較佳者。

巴曲酶為衍生自矛頭蝮蛇(Bothrops atrox moojeni )蛇毒之類凝血酶絲胺酸蛋白酶。巴曲酶自纖維蛋白原中僅游離纖維蛋白酞A造成Des A纖維蛋白(亦即，纖維蛋白I)之形成(Aronson DL：Comparison of the actions of thrombin and the thrombin-like venom enzymes Ancrod and Batroxobin.Thrombos Haemostas(stuttg)36：9-13,1976)。此外，巴曲酶之一級結構已預先經證實為由231個胺基酸所組成且具有分子量36,000 Da之單鏈糖蛋白(Itoh N et al.：Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for batroxobin,a thrombin-like snake venom enzyme.J Biol Chem 262：3132-3135,1987)。

巴曲酶為與凝血酶相同種類之絲胺酸蛋白酶。然而，相對於巴曲酶自纖維蛋白原中游離出纖維蛋白酞A造成Des A纖維蛋白之形成，凝血酶自纖維蛋白原中釋出纖維蛋白酞A及纖維蛋白酞B造成纖維蛋白之形成，而於此方面有所不同。此外，巴曲酶不作用於纖維蛋白原以外之血液凝固因子，但凝血酶則與其不同，會作用於其他血液凝固因子。

巴曲酶本身為已知物質，且可根據經審查之日本專利申請公開案第S57-10718號(Japan Patent No.1118129)所揭示之方法加以製備。或者，其可容易地由東菱藥品工業有限公司(Tobishi Pharmaceutical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)以及其子公司，北京拖畢西藥業有限公司(Beijing Tobishi Pharmaceutical Co.,Ltd.,Beijing,China)取得。

安可洛酶(ancrod)為衍生自馬來西亞蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma )蛇毒之類凝血酶絲胺酸蛋白酶。安可洛酶為具有分子量35,400 Da之糖蛋白。如同巴曲酶，安可洛酶自纖維蛋白原中僅游離纖維蛋白酞A造成Des A纖維蛋白之形成(Stocker KF：Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis,inMedical Use of Snake Venom Proteins ,Stocker KF,ed.,CRC Press,Boston,p134-135；1990)。

可洛他酶(crotalase)為衍生自東部菱背響尾蛇(Crotalus adamanteus )蛇毒之類凝血酶絲胺酸蛋白酶。可洛他酶為具有分子量32,700 Da之糖蛋白。如同巴曲酶，可洛他酶自纖維蛋白原中僅游離纖維蛋白酞A造成Des A纖維蛋白之形成(Stocker KF：Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis,inMedical Use of Snake Venom Proteins ,Stocker KF,ed.,CRC Press,Boston,p140-141；1990)。

上述例如巴曲酶、安洛可酶及可洛他酶之類凝血酶可為天然物質或基因重組產品。

雖然本發明目標之幹細胞及前驅細胞之定義於相關領域中未完全標準化，但幹細胞及前驅細胞於本說明書中，係基於已獲得共識之概念而以下述方式定義(Weissman IL：Translating stem and progenitor cell biology to the clinic：Barriers and opportunities Science 287：1442-1446,2000；McKay R：Stem cells hype andhope.Nature 406：361-364,2000)。

幹細胞為具有自體複製能力及多能性之未分化細胞。幹細胞之具體例包括胚胎幹細胞(ES細胞)、胚胎生殖細胞(EG細胞)、體幹細胞(成體幹細胞)、血液血管幹細胞(hemangioblast)、神經幹細胞、造血(hematopoietic)幹細胞、間葉(mesenchymal)幹細胞及其他細胞(包括骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、心肌細胞、神經元、肌腱細胞、脂肪細胞、胰細胞(pancreocyte)、肝細胞及腎原細胞)之幹細胞。

前驅細胞為具有自體複製能力及分化潛力之未分化細胞，但最終分化之細胞類型為已經決定者。前驅細胞之具體例包括血管內皮前驅細胞(EPCs)、神經元前驅細胞及造血前驅細胞。

自體複製的能力為鑑定幹細胞及前驅細胞之鑑別標準之一，可使用5-溴去氧尿苷(BrdU)併入DNA之試驗加以評估(Gould E & Gross CG：Neurogenesis in adult mammals：some progress and problems.The J Neuroscience 22(3)：619-623,2002)。

此外，幹細胞及前驅細胞種類之鑑定，可以根據該幹細胞及前驅細胞之特徵標誌物(marker)表現的基礎上進行。例如，神經幹細胞之巢蛋白(nestin)表現(Wiese,C.et al.：Nestin expression-a property of multi-lineage progenitor cells？ Cellular and Molecular Life Science,61：2510-2522,2004)，或血管EPCs之CD34及CD31之表現(Asahara T et al.：Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science 275：964-967,1997；Shi Q et al.：Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.Blood 92(2)：362-367,1998)。

存在於成體體內之幹細胞及前驅細胞，基於其來源及位置可分為內在細胞(resident cells)(亦即內在幹細胞及內在前驅細胞)、血管衍生細胞(亦即血管衍生幹細胞及血管衍生前驅細胞)及骨髓衍生細胞(亦即骨髓衍生幹細胞及骨髓衍生前驅細胞)。

內在細胞(內在幹細胞及/或內在前驅細胞)定義為原本存在於特定器官及/或組織之具有自體複製能力及多能性之細胞，於上述器官及/或組織受到損傷時，對該器官及/或組織之再生有助益。該等內在細胞之具體例包括角膜幹細胞、心臟幹細胞、神經幹細胞及血管EPCs。

血液衍生細胞(亦即血液衍生幹細胞及血液衍生前驅細胞)定義為存在於循環血液中之具有自體複製能力及多能性之單核細胞，於器官及/或組織受到損傷時，經遷移及蓄積至該器官及/或組織，而有助於該器官及/或組織之再生。於此情況中之血液包括末梢血液、胎盤血液、動脈血液、靜脈血液、採自心臟之血液及採自眼底(ocular fundus)之血液。血液衍生單核細胞之具體例包括血管EPCs、間葉幹細胞等。

骨髓衍生細胞(亦即骨髓衍生幹細胞及骨髓衍生前驅細胞)定義為原本存在於骨髓之具有自體複製能力及多能性之細胞，於器官及/或組織受到損傷時，經遷移及蓄積至該器官及/或組織而有助於該器官及/或組織之再生。骨髓衍生細胞之具體例包括血管EPCs、間葉幹細胞等。

本發明可賦活該等各種內在細胞、血液衍生細胞及骨髓衍生細胞。

此外，幹細胞及前驅細胞可分為活性狀態細胞(於此狀態之細胞正在增殖(proliferation)、分化或遷移(migration))及非活性狀態細胞(於此狀態之細胞不增殖、分化或遷移)。但本發明之賦活劑於活性狀態及非活性狀態兩狀態中皆能夠賦活幹細胞及前驅細胞。

本發明賦活劑賦活幹細胞及/或前驅細胞。本文中，「賦活」定義為下述三種作用。

(1)促進幹細胞及/或前驅細胞之增殖(proliferation)。

(2)促進幹細胞及/或前驅細胞之遷移(migration)。遷移定義為幹細胞及/或前驅細胞由骨髓、器官及/或組織移動(mobilized)至循環血液；由循環血液蓄積至損傷的器官及/或組織；或在器官及/或組織內部移動。

(3)促進幹細胞及/或前驅細胞之分化(differentiation)。

本發明賦活劑靶向之幹細胞及/或前驅細胞為應用再生醫學(regenerative medicine)(其中包括細胞由患者體外導入之再生醫學以及利用自體再生(self-regeneration)之再生醫學)可以治療的疾病所應用之幹細胞及/或前驅細胞。

因此，本發明賦活劑不僅可用於利用自體再生之再生醫學(亦即，細胞原本為患者所擁有，且不於體外培養中接受增殖及/或分化之誘導)中所使用之幹細胞及/或前驅細胞，亦可用於其中之細胞是由患者體外導入之再生醫學(亦即，細胞由患者體外導入)中所使用之幹細胞及/或前驅細胞。本發明賦活劑較佳可用於利用自體再生之再生醫學中所使用之幹細胞及/或前驅細胞。

再生醫學所應用之疾病(損傷的器官或損傷的組織)之成因、類型或程度，並無特別限制。下述為該等疾病之具體例。

皮膚疾病

外傷(wound)、燒傷、輻射損傷(radiation injury)、凍傷(frostbite)、紫外線損傷(ultraviolet injury)、電擊、創傷(trauma)、皮膚潰瘍、褥瘡、接觸性皮膚炎、水疱性皮膚炎(bullous dermatitis)、異位性皮膚炎、乾皮症(xeroderma)、糖尿病性皮膚潰瘍(diabetic skin ulcer)、自體過敏性皮膚炎、紅皮症、脫落性皮膚炎(exfoliative dermatitis)、表皮分解性水疱症(epidermolysis bullosa)、光照性皮膚病(photodermatosis)、慢性色素性紫斑(山伯格氏症；Schamberg’s disease)、口腔黏膜之損傷、口炎(stomatitis)、外科造口皮膚炎(peristomal dermatitis)、皮膚老化徵候、禿髮症(alopecia)、甲溝炎(paronychia)、指甲嵌入症(unguis incarnatus)、腸胃道黏膜糜爛(gastrointestinal mucosa erosion)、消化性潰瘍、角膜糜爛(corneal erosion)、角膜潰瘍(corneal ulcer)、齲齒、牙髓炎、邊緣性牙周炎(marginal periodontitis)、過敏性鼻炎、花粉熱、春季型結膜炎、痔瘡、腸胃道黏膜損傷、腸胃道黏膜灼傷、支氣管氣喘、舌炎(glossitis)、復發性口瘡、口內瘡(intraoral aphtha)、口臭、口腔異感症(oral abnormal sensation)、齒科感染、口腔黏膜咬傷、舌咬傷、口腔黏膜灼傷及口腔粘膜潰瘍。

腦神經疾病

中風、阿茲海默疾病、帕金森氏症、各種中樞神經系統疾病(例如脊髓炎)、各種周邊神經疾病(例如多發性周邊神經病變)、脊髓病變(myelopathy)及各種類型之腦炎。

心血管疾病

心肌梗塞、心絞痛、不穩定心絞痛(unstable angina)、各種類型之心肌炎(例如病毒性心肌炎)、急性心功能不全(acute cardiac insufficiency)、慢性心功能不全、動脈硬化、高血壓、類風濕性心臟病、心律不整、瓣膜性心臟病、感染性心內膜炎、心包炎、經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary artery intervention)、及PTCA後之血管再狹窄(resteonsis)及再阻塞(reobstruction)。

消化道疾病

食道炎、急性胃炎、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、各種類型之結腸炎(例如潰瘍性大腸炎)、腸道結核症(intestinal tuberculosis)、病毒性肝炎、酒精性肝炎、藥物誘發性肝炎、脂肪肝、肝硬化、胰臟炎及由各種類型之腸胃道癌症(例如肝癌、大腸癌及胃癌)之手術所引起之器官功能失調。

呼吸道疾病

各種類型之支氣管炎(例如細菌性支氣管炎)、感染性肺炎、吸入性肺炎、肺栓塞、氣胸及肺功能不全。

泌尿性疾病

膀胱炎、各種類型之腎炎(例如慢性腎炎症候群、原發性腎小球疾病)、腎上腺炎、尿道炎、細菌性及非細菌性攝護腺炎、高血壓性腎病變、糖尿病性腎病變及腎功能不全(renal insufficiency)。

運動系統疾病(locomotor diseases)

各種類型之關節炎(例如類風濕性關節炎)、肌肉萎縮症、神經手術期間之顱骨切開術後之骨缺損(bone defect)、骨科手術期間之腫瘤摘除術(tumorectomy)後之骨缺損、骨折後之骨缺損、在牙科領域中由牙周病所引起的骨缺損、軟骨炎、各種關節之軟骨缺損、各種損傷(例如創傷或扭傷)所引起之肌腱損傷。

血管疾病

各種動脈疾病(例如閉塞性動脈硬化症(arteriosclerosis obliterans；ASO)、柏格氏血管疾(Buerger’s disease)(閉塞性血栓血管炎(thromboarteritis obliterans；TAO))、各種類型之靜脈疾病(例如血栓性靜脈炎)、血栓、循環障礙circulatory disorder)、深部靜脈血栓(DVT)、伴隨末梢循環障礙(例如突發性聽力喪失及震動疾病(sudden deafness and vibration disease))之各種類型疾病、及血管成形術後之血管再狹窄及再閉塞。

內分泌疾病糖尿病及其併發症(例如糖尿病性末梢神經病變、糖尿病性足及糖尿病性潰瘍)、高血脂症、甲狀腺炎及肥胖症。

眼科疾病各種類型之角膜炎(例如由鹼性或酸性化合物所引起之角膜炎及創傷性角膜炎)及糖尿病性視網膜炎。

除了上述疾病之外，對於能夠藉由賦活幹細胞及/或前驅細胞而加以治療的疾病之再生醫學(亦即，損傷器官及/或組織之再生)中所使用之幹細胞及/或前驅細胞，亦為本發明賦活劑之目標。再者，對於再生醫學所應用之疾病之進展狀態並無特別限制。

此外，本發明賦活劑能根據再生醫學所應用之損傷器官及/或損傷組織之進展狀態及程度適時而適度地發揮作用。

本發明賦活劑較佳地可應用於具有皮膚疾病、運動系統疾病、內分泌疾病、呼吸疾病、泌尿疾病、腸胃道疾病、眼科疾病、腦神經疾病、心血管疾病及血管疾病之患者所有之幹細胞及/或前驅細胞，特佳地應用於具有腦神經疾病、心血管疾病、皮膚疾病及血管疾病之患者所有之幹細胞及/或前驅細胞。

再者，本發明賦活劑副作用很小或無副作用。

此外，本發明賦活劑具有持續性的賦活效果。

本發明賦活劑可為單獨包括類凝血酶(例如巴曲酶單獨)或者包括一個或多個類凝血酶，以及可為包括類凝血酶與類凝血酶以外之一種或多種其他活性物質之組合。

其他活性物質之示例包括：生長因子，例如VEGF、EGF、FGF、PDGF、NGF及HGF生長因子；細胞激素，例如G-CSF、GM-CSF及EPO；及雌激素、脂類、斯坦丁(輔酶A還原酶抑制劑)、抗生長因子抗體、生長因子抑制劑、抗生長因子抑制劑抗體及抗細胞激素抗體(Takeyama K,Ohto H：PBSC mobilization.Transfus Apher Sci 31：233-243,2004；Aicher A,Zeiher AM,Dimmeler S：Mobilizing endothelial progenitor cells.Hypertension 45：321-325,2005)。

日本藥局方(Japanese Pharmacopoeia)製劑之一般準則(General Rules for Preparations)之任何配方皆可應用於本發明賦活劑之調配物。本發明賦活劑調配物之示例包括用於直接施用至體內之注射劑(包括懸浮劑及乳化劑)；軟膏劑(包括脂肪軟膏、乳化軟膏(乳霜)、水溶性軟膏等)、吸入劑、液體劑(包括滴眼劑(ophthalmic solution)、洗鼻劑(collunarium)等)、栓劑、貼劑、泥膏劑(poultices)、洗液及其他外用調配物；以及內用調配物，包括錠劑(包括糖衣、膜衣、及膠衣)、液體製劑、膠囊劑、粒劑、粉劑(包括晶粒)、丸劑、糖漿、舌下錠劑等。此等配方可由日本藥局方中用於製劑的一般準則所述之方法製備。

此外，本發明賦活劑亦可包括藥學上可接受之固體或液體載體或介入性治療材料(interventional therapy bases)。藥學上可接受之固體或液體載體包括溶劑、安定劑、保存劑、溶解化劑、乳化劑、懸浮劑、緩衝劑、等張劑、著色劑、基劑、增稠劑、賦形劑、潤滑劑、黏結劑、崩解劑、被覆劑、矯味劑等。

具體例包括水、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及其他糖類與糖醇；結晶纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素酞酸酯、羥丙基甲基纖維素乙酸酯琥珀酸酯(hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate)、羧甲基纖維素(carmellose)、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、交聯羧甲基纖維素(croscarmellos)鈉、羧甲基乙基纖維素、纖維素乙酸酯酞酸酯(cellulose acetate phthalate)及其他纖維素及相關衍生物；玉米澱粉、小麥澱粉、稻米澱粉、馬鈴薯澱粉、糊精、預膠化澱粉、部份預膠化澱粉、羥丙基澱粉、羧甲基澱粉納、環糊精、支鏈澱粉(pullulan)及其他澱粉及相關衍生物；瓊脂膠、藻膠鈉、阿拉伯膠、明膠、膠原、蟲膠、黃耆膠、三仙膠及其他天然高分子(海藻(seaweeds)、植物黏質(plant mucilage)、蛋白質等)；聚乙烯吡咯啶酮、胺基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸共聚物、羧乙烯基聚合物、聚乙烯醇、二甲基聚矽氧烷及其他合成聚合物；橄欖油、可可奶油、巴西棕梠蠟(carnauba wax)、牛油、氫化油、大豆油、芝麻油、山茶油(camellia oil)、石蠟、液體石蠟、黃蜂蠟、白色凡士林(white petrolatum)、椰子油、微結晶纖維素蠟及其他油與脂肪；硬脂酸、硬脂酸鋁、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、檸檬酸三乙酯、三醋精(triacetin)、中鏈脂肪酸三酸甘油酯、硬脂肪(hard fat)、肉豆蔻酸異丙酯及其他脂肪酸及其衍生物；甘油、硬脂醇、鯨蠟醇、丙二醇、聚乙二醇(macrogol)及其他醇類及多元醇；氧化鋅、磷酸氫鈣(dibasic calcium phosphate)、沉澱碳酸鈣(precipitated calcium carbonate)、合成矽酸鋁、無水二氧化矽、高嶺土、乾燥氫氧化鋁膠、合成水滑石(synthetic hydrotalcite)、氧化鈦、滑石、膨潤土、偏矽酸鎂鋁(magnesium aluminometasilicate)、硫酸鋁鉀(aluminum potassium sulfate)、次沒食子酸鉍、次水楊酸鉍、乳酸鈣、碳酸氫鈣及其他無機物質及金屬鹽化合物；蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸聚烴氧酯(polyoxyl stearate)、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚(polyoxyethylene hydrogenated castor oil)、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(polyoxyethylene polyoxypropylene glycol)、山梨糖醇酐倍半油酸酯、山梨糖醇酐三油酸酯、山梨糖醇酐單硬脂酸酯、山梨糖醇酐單棕欖酸酯、山梨糖醇酐單月桂酯、聚山梨糖醇、甘油單硬脂酸酯、硫酸月桂酯鈉、聚桂醇(lauromacrogol)及其他界面活性劑、色素、香味劑等。

介入性治療材料之示例包括支架、人工血管、導管、球囊等。

例如，本發明賦活劑產物可包含下列成分且在總體積為1 ml下，該成分之各含量，如下表1所示。

本發明賦活劑之投藥劑量取決於患者體重、疾病性質及狀況而變動，然而例如於成人情況中，每天一次0.1至50巴曲酶單位(BU)的巴曲酶，較佳為每隔一天一次1至20BU巴曲酶。

本文所述巴曲酶單位為代表巴曲酶之酵素活性之單位，當在37℃之溫度下將0.1ml巴曲酶溶液添加至0.3ml含有檸檬酸鈉抗凝之標準人類血漿，於19.0±0.2秒發生血漿凝結之活性定義為2BU。

本發明賦活劑以生理鹽水適當地稀釋巴曲酶後，可經由靜脈點滴、靜脈注射、動脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射、心內注射、腹腔內注射、鞘內注射、直腸投藥、舌下投藥、鼻腔投藥、經皮投藥、吸入或局部投藥至損傷的器官及/或組織。大體而言，本發明之賦活劑較佳在以100ml或以上的生理食鹽水稀釋後，以1小時或以上的時程灌注(infused)巴曲酶在小鼠、大鼠、兔及狗的急性毒性(LD₅ ₀ (BU/kg))示於下表2。急性毒性研究係根據文獻所述方法(Ozaki M et al.：Toxicity of the defibrase,Defibrinogen Batroxobin (First Report),Pharmacometrics 25：339－346,1983)經靜脈投予巴曲酶而進行。

本發明之賦活劑可應用於具有幹細胞及/或前驅細胞之動物。動物之具體例包括人類、猴、狗、豬、貓、兔、大鼠及小鼠。其中較佳為人類。

雖然藉由下述所提供實施例而詳細說明本發明，但本發明不侷限於該等實施例。

實施例1

巴曲酶於臍帶血液衍生之CD34－陽性單核細胞之賦活效果此實施例中，巴曲酶於臍帶血液衍生之CD34陽性單核球細胞活化之效果係於體外(in vitro)評估。

再者，存在於臍帶血液中之對應CD34－陽性單核細胞已知包括血管EPCs及間葉幹細胞(Murohara T et al.：Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization.J Clin Invest 105：1527-1536,2000)。因此，於本實施例中接受評估之人類臍帶血衍生CD34-陽性單核細胞可稱為血管EPCs及間葉幹細胞。

實驗方法： (1)人類臍帶血液單核細胞之收集

選擇孕程正常且足月生產者，由臍帶及胎盤收集40至60ml臍帶血(cord blood)，且使用肝素(20至30U/ml)作為抗凝血劑。所收集的臍帶血以5：1的比例與6%氫乙基澱粉(hydroethylstarch,Becton Dickinson,NJ,USA)混合，使其靜置培養30分鐘後移除沉澱之紅血球。其次，收集上層液體且以2：1的比例懸浮於淋巴球單離液體(相對比重：1.077,Chinese Academy of Medical Science,Tianjin,China)，於460×g條件下離心25分鐘。收集於中間細胞層之單核細胞，在用於試驗前以磷酸緩衝液-生理鹽水(PBS)清洗兩次。

(2)CD34-陽性單核細胞之單離與鑑定

將上述實驗方法(1)所獲得之人類臍帶血液衍生單核細胞，懸浮於PBS以製備具有濃度為每2×10⁶ 個細胞/ml之細胞懸浮液。使用CD34-陽性細胞單株免疫磁性珠單離套組(CD34-Positive Cell Monoclonal Immunomagnetic Bead Separation Kit)(MACS,Milteny Biotech,Bergisch Gladbach,Germany)，根據套組所提供的說明，由人類臍帶血液衍生單核細胞單離出CD34－陽性單核球細胞。所得CD34－陽性單核細胞之品質使用FITC標記之抗CD34抗體(Becton Dickinson,NJ,USA)以流式細胞儀(flow cytometry)(Becton Dickinson FACS Vantage,Becton,NJ,USA)評估。所得CD34－陽性細胞之純度為98.5%或更高。

(3)細胞遷移試驗本試驗係使用由24孔培養板(Corning,NY,USA)及5 μ m嵌套(transwell)所組成之改造的Boyden’s試驗槽而進行。改造的Boyden’s試驗槽藉由具有5－μ m(直徑)孔徑之聚碳酸酯膜濾器分為兩部分。上方部份為濾器之上的空間，以及下方部份為濾器與孔之間的間隙(gap)。

使用0.25%BSA IMDM(Gibco,Los Angelas,USA)製備之各種濃度之巴曲酶(0(對照組)、0.1及0.2 BU/ml)各600 μ l,添加至Boyden’s試驗槽之下方部分。其次，於IMDM培養基中之具有濃度為1×10⁵ 個細胞/ml之人類臍帶血衍生CD34－陽性單核細胞之細胞懸浮液100 μ l，添加至各Boyden’s試驗槽之上方部份。此系統於潮濕培養箱中，在37度、5% CO₂ /95%空氣的氣體環境之恆定狀態培養6小時。培養後，經由濾器由上方部分移動至下方部份之細胞定義為遷移細胞。收集遷移細胞並以流式細胞儀計算細胞數目。

根據所得之遷移細胞之數目，以對照組之遷移細胞數目作為100%值，計算於0.1 BU/ml巴曲酶組及0.2 BU/ml巴曲酶組之細胞遷移率。根據相同條件下進行三重複實驗所獲得之數據，計算細胞遷移率之平均值±標準差(SD)(%)。

結果與討論

當對照組(0 BU/ml)之CD34－陽性細胞遷移率定義為100%，0.1 BU/ml巴曲酶組之細胞遷移率為149.37±6.82%，而0.2 BU/ml巴曲酶組為254.26±17.44%。亦即，相較於對照組，0.1 BU/ml巴曲酶組及0.2 BU/ml巴曲酶組均顯示顯著較高之遷移率。

該等結果顯示巴曲酶顯著地賦活人類臍帶血衍生CD34－陽性單核細胞(亦即血管EPCs及間葉幹細胞)。巴曲酶之賦活效果系認為在於促進血管EPCs及間葉幹細胞之遷移。

再者，於本實施例中雖然使用臍帶血作為CD34－陽性單核細胞之來源，但CD34－陽性單核細胞已知亦存在於成人末梢血液、成人骨髓及胎兒骨髓(Michejda M：Which stem cells should be used for transplantation？Fetal Diagn Ther 19：2－8,2004)。因此，巴曲酶亦能夠賦活存在於臍帶血液以外之血液及骨髓之CD34－陽性單核細胞，例如成人末梢血液、成人骨髓、胎兒骨髓及其他血液來源等。

實施例2

於下肢深部靜脈血栓症患者之末梢血液之CD34－陽性細胞、CD34－陽性/CD31－陽性細胞及血管內皮黏附素(VE Cadherin)－陽性細胞之賦活，以及巴曲酶於下肢深部靜脈血栓患者之受損組織之功能性恢復的效果

本實施例中，巴曲酶投藥於下肢深部靜脈血栓症(下肢DVT)，為一種血管疾病的患者，以評估巴曲酶對於末梢血液中之CD34-陽性細胞、CD34-陽性/CD31-陽性細胞及血管內皮黏附素-陽性細胞之賦活效果，以及巴曲酶對於血栓所造成血管傷害之再生效果。

再者，該等存在於末梢血液之CD34-陽性單核細胞之細胞已被公認為血管EPCs及間葉幹細胞(Zhao Y et al.：A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells.Proc Natl Acad Sci USA 100：2426-2431,2003)。因此，於本實施例中進行評估之末梢血液之CD34-陽性單核細胞可稱為血管EPCs及間葉幹細胞。

此外，內皮前驅細胞已知表現CD34(Michejda M：Which stem cells should be used for transplantation？ Fetal Diagn Ther 19：2-8,2004；Fadini GP et al.：Circulating endothelial progenitor cells are reduced in peripheral vascular complication of tape 2 diabetes mellitus.J American College of Cardiology 45：1449-1457,2005；Kuwana M et al.：Human circulating CD14⁺ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation.J Leukoc Biol 74：833-845,2003)以及CD31(Asahara T et al.：Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science 275：964-967,1997；Hristov M,Weber C：Endothelial progenitor cells：characterization,pathophysiology,and possible clinical relevance.J Cell Mol Med 8：498－508,2004)做為標記物(marker)。再者，血管EPCs，其中已進行分化且於能夠附著至血管之狀態者，亦已知近一步表現VE黏附素(Cadherin)(Hristov M,Weber C：Endothelial progenitor cells：characterization,pathophysiology,and possible clinical relevance.J Cell Mol Med 8：498－508,2004)。因此，於本實施例中接受評估之末梢血液中之CD34－陽性細胞/CD31－陽性細胞可稱為血管EPCs。

試驗方法

(1)試驗對象由年齡37至80歲(平均年齡：64歲)之11位男性及4位女性之下肢DVT患者組成試驗對象。對所有對象解釋臨床試驗之目的，且於進行臨床試驗前獲得其同意。

(2)投藥方法經靜脈點滴對患者進行連續14天投藥巴曲酶，起始劑量為10BU/body/day(若患者是早上住院，則在住院當日給藥，或是患者在下午住院，則在住院的第二天給藥)，之後的劑量為5BU/body/day。

(3)血液採樣使用低分子量肝素抗凝血劑，於投藥前、投藥後第7天及第14天，由各患者之前臂之正中肘靜脈收集末梢血液5ml。所收集的血液立即保存於4度且於收集後6小時內進行測量。血液樣品於投藥前及於投藥後第7天由所有15例下肢DVT患者收集，而投藥後第14天由15例下肢DVT患者中的10例收集。

(4)末梢血液單核細胞之單離於上述試驗方法(3)所獲得之血液5ml中，添加2.5ml之淋巴球單離液體(Ficoll,Chinese Academy of Medical Sciences,Tianjin,China)以製備懸浮液。於460×g的條件下離心該懸浮液後，回收中間細胞層(intermediate cell layer)作為末梢血液衍生單核細胞。所得單核細胞總數為每例患者約5至6×10⁶ 個細胞。所得單核細胞懸浮於經磷酸鹽緩衝之生理鹽水(PBS)，以濃度約2×10⁶ 個細胞/ml製備細胞懸浮液。

(5)CD34－陽性單核細胞之單離以免疫螢光染色使用流式細胞儀單離CD34－陽性單核細胞。20微升之藻紅蛋白(phycoerythrin)標記之抗－CD34抗體(Becton Dickinson,NJ,USA)添加至於上述試驗方法(4)所得之單核細胞懸浮液100微升中，且使其於4度、暗環境下培養30分鐘。其次，單離CD34－陽性單核細胞並經流式細胞儀加以計數。根據下列公式計算單核細胞中CD34－陽性單核細胞之比例(%)。

CD34－陽性單核細胞(%)＝(CD34－陽性單核細胞之數目/單核細胞總數)×100

(6)CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞之單離以雙重免疫螢光染色使用流式細胞儀單離CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞。20微升之藻紅蛋白標記之抗－CD34抗體(Becton Dickinson,NJ,USA)及20微升之FITC－標記之抗－CD31抗體(Becton Dickinson,NJ,USA)，添加至於上述試驗方法(4)所得之單核細胞懸浮液100微升中，且使其於4度、暗環境下培養30分鐘。其次，單離CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞並經流式細胞儀加以計數。根據下列公式計算單核細胞中CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞之比例(%)。

CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞(%)＝(CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞之數目/單核細胞總數)×100

(7)血管內皮黏附素－陽性單核細胞之單離以免疫螢光染色使用流動式細胞計測法單離血管內皮黏附素－陽性單核細胞。20微升之藻紅蛋白(phycoerythrin)標記之抗－VE黏附素抗體(Becton Dickinson,NJ,USA)添加至於上述試驗方法(4)所得之單核細胞懸浮液100微升中，且使其於4度、暗環境下培養30分鐘。其次，單離血管內皮黏附素－陽性單核細胞並經流式細胞儀加以計數。根據下列公式計算單核細胞中血管內皮黏附素－陽性單核細胞之比例(%)。

血管內皮黏附素－陽性單核細胞(%)＝(血管內皮黏附素－陽性單核細胞之數目/單核細胞總數)×100

(8)膝上(above－knee)與膝下(below－knee)圍長(girth)之測量下肢水腫為下肢DVT之典型且客觀之症狀。因此，以15例患者於投藥前與投藥後其於測量其以膝上20公分及膝下15公分之圍長評估下肢水腫的程度。

結果與討論

(1)CD34－陽性單核細胞之賦活

相較於投藥前之數值，巴曲酶投藥的結果為於末梢血液中，CD34－陽性單核細胞之百分比顯著增加(表3)。

此結果顯示巴曲酶於下肢DVT患者之末梢血液中，賦活CD34－陽性單核細胞(亦即血管EPCs及間葉幹細胞)。巴曲酶之賦活效果被認為在於促進該CD34－陽性單核細胞之增殖及遷移。

(2)CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞之賦活 ^＊表示P<0.05；及^＊ ^＊表示P<0.01相較於投藥前(使用配對樣本非參數檢驗)

相較於投藥前之數值，巴曲酶投藥的結果為於末梢血液中，CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞之百分比顯著增加(表4)。

此結果顯示巴曲酶於下肢DVT患者之末梢血液中，賦活CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞(亦即血管EPCs及間葉幹細胞)。巴曲酶之賦活效果被認為在於促進該CD34－陽性/CD31－陽性單核細胞之增殖、遷移及分化。

(3)血管內皮黏附素－陽性單核細胞之賦活

相較於投藥前之數值，巴曲酶投藥結果為於末梢血液中，血管內皮黏附素－陽性單核細胞之百分比顯著增加(表5)。

此結果顯示巴曲酶於下肢DVT患者之末梢血液中，賦活血管內皮黏附素－陽性單核細胞(亦即血管EPCs)。巴曲酶之賦活效果咸認在於促進該血管內皮黏附素-陽性單核細胞之增殖、遷移及分化。

(4)下肢DVT水腫症狀之改善

下肢水腫程度係以膝上20公分及膝下15公分之下肢圍長為基準加以評估。經由投藥巴曲酶顯著減少膝上及膝下圍長(表6)。

此結果顯示，經由投藥巴曲酶賦活幹細胞及/或前驅細胞，被認為係在於促進幹細胞及/或前驅細胞之增殖、遷移及分化，於下肢DVT患者中，使受損傷血管再生及改善水腫症狀。

再者，當分析血漿纖維原濃度作為巴曲酶之藥理作用之指標，於投藥7日及14日後發現纖維蛋白原顯著減少(未顯示數據)。此顯示於活體內(in vivo)所投藥之巴曲酶作用良好。

此外，雖然在投藥前、及投藥巴曲酶後第7日及第14日，對於在製劑投藥期間，作用於血液凝固及纖維蛋白溶解系統(包括巴曲酶)之副作用(例如出血)顯現指標之參數APTT、PT及TT進行分析，但在巴曲酶投藥前後無顯著差異(未顯示數據)。該等結果顯示投藥巴曲酶並無副作用的發生。

實施例3

巴曲酶對於神經幹細胞及/或前驅細胞之賦活效果及腦缺血/再灌注損傷模式中神經功能之恢復之效果於此實施例中，以大鼠腦缺血/再灌注損傷模式，評估巴曲酶對於神經幹細胞及/或神經前驅細胞之賦活效果，以及神經功能恢復之效果。

實驗方法

(1)動物 12周齡且體重250至280克之雄性Sprague－Dawley大鼠(Shanghai Animal Center,Chinese Academy of Medical Science,Shanghai,China)於馴化(acclim ate)1週後使用於實驗。

(2)腦缺血/再灌注損傷模式之建立首先遵循Longa EZ et al.之方法(Longa EZ et al.：Revesible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke 20：84－91,1989)建立大腦中動脈(MCA)阻塞模式。更具體而言，以0.36g/kg之10%水合氯醛(chloral hydrate)(Shencheng Chemical Co.,Shanghai,China)，腹腔內投藥至禁食12小時(但自由攝取水)之大鼠以麻醉大鼠。接著，於頸部進行中線切開，使右頸總動脈曝露。而後，分開頸內動脈及頸外動脈，是頸外動脈之分支的頸後動脈，及甲狀腺上動脈使凝結並切斷(coagulated and severed)，頸外動脈於舌動脈及顳動脈分支處紮緊，於頸外動脈穿刺小孔，由該小孔將4-0尼龍縫合線通入頸總動脈，逐漸插入至頸內動脈直到有阻力為止。自頸總動脈之分支起算，尼龍縫合線之長度約18至20mm。以尼龍縫合線閉塞(occlude)中腦動脈之結果，使缺血狀態持續2小時，以製造大腦中動脈閉塞模式。

腦缺血/再灌注損傷模式係藉由從阻塞模式之大腦中動脈拔出尼龍縫合線並接著再灌注血液而建立。

(3)巴曲酶對模式大鼠之投藥

大鼠分為三組且分別以下述方法加以處理。

1)偽手術組(75隻大鼠)：在上述(2)之步驟僅對大鼠進行頸內動脈與頸外動脈之分離，但不進行後續之大腦中動脈阻塞及再灌注之步驟。本組之大鼠，在與巴曲酶組所示之相同時間，經腹腔內投予相同體積之生理鹽水代替巴曲酶。

2)模式組(75隻大鼠)：動物係用於建立腦缺血/再灌注損傷模式。本組中之模式大鼠，與巴曲酶組所示之相同時間，經腹腔內投予相同體積之生理鹽水代替巴曲酶。

3)巴曲酶組(75隻大鼠)：動物係用於建立腦缺血/再灌注損傷模式，在腦缺血發作30分鐘後，巴曲酶以生理鹽水稀釋，以劑量20BU/kg/10ml經腹腔內投藥，且缺血再持續1小時30分鐘，接著以拔出尼龍縫合線進行再灌注。巴曲酶亦於缺血/再灌注損傷模式建立後第2、4、6及8日進行腹腔內投藥。

(4)神經功能評分神經功能分數在缺血/再灌注損傷模式建立後，對每組15隻大鼠每日評估一次。神經功能異常分數依循Longa EZ的方法(Longa EZ et al.：Revesible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke 20：84－91,1989)，以下列標準進行評估。結果以中位數表示。

0：正常1：梗塞灶對側肢體彎曲(bending)2：當尾巴向後拉時，梗塞灶對側肢體無力(become asthenic state)3：當拉尾巴時，轉向梗塞灶對側4：自發性轉向梗塞灶對側5：喪失自發性動作

(5)巢蛋白－陽性細胞之分析各組中10隻大鼠分別於模式建後之第7、14及21日進行屍體解剖(autopsy)(各組之總動物數為30)。製備組織標本後，於顯微鏡下計數神經幹細胞。

更具體而言，於模式建後之第7、14及21日製備大鼠冷凍腦切片，以於神經幹細胞中表現之巢蛋白標記物之免疫組織染色，測量腦室下區(subventricular zone；SVZ)中巢蛋白－陽性細胞之存在。使用抗－大鼠巢蛋白單株抗體分析巢蛋白－陽性細胞之存在(Chemicon,Temecula,USA)。

(6)BrdD－陽性細胞及BrdU－陽性/巢蛋白－陽性細胞之分析於模式建立後第5、6、12、13、19及20日，將50mg/kg之5－溴去氧尿苷(BrdU,Calbiochem,San Diego,USA)經腹腔內注射至每組30隻大鼠。由於BrdU為胸腺嘧啶類似物，其可於細胞增殖期間併入細胞DNA(DNA合成)。因此，細胞增殖可藉由檢測細胞內BrdU的量而加以分析。大鼠於模式建立後第7、14及21日進行屍體解剖以製備冷凍腦切片。BrdU－陽性細胞的存在藉由免疫化學染色，而BrdU－陽性/巢蛋白－陽性細胞的存在藉由雙免疫－螢光染色於SVZ區域進行分析。

BrdU－陽性細胞的存在係使用小鼠抗大鼠BrdU單株抗體(Oncogens,Westhaver,USA)進行分析。

BrdU－陽性/巢蛋白－陽性細胞之存在係利用山羊抗大鼠BrdU多株抗體(Biodesign,Saco,USA)之初級抗體及FITC標記之兔子抗山羊之抗體(Pierce,Rockford,USA)之二級抗體，以及小鼠抗大鼠之巢蛋白單株抗體之初級抗體與Rho標記之兔子抗小鼠抗體之二級抗體(Pierce,Rockford,USA)之組合之雙重免疫螢光染色進行分析。

(7)NeuN－陽性細胞、GFAP－陽性細胞及BrdU－陽性/GFAP－陽性細胞之分析於模式建立後第5、6、12、13、19及20日將50mg/kg之BrdU注射於各組之30隻大鼠。大鼠於模式建立後第7、14及21日進行屍體解剖以製備冷凍腦切片。NeuN－陽性細胞的存在藉由免疫化學染色，神經膠纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；GFAP)-陽性細胞的存在藉由免疫化學染色，而BrdU-陽性/GFAP-陽性細胞的存在藉由雙免疫-螢光染色於SVZ區域進行分析。NeuN為神經幹細胞所分化之未成熟神經元中所表現之標記物。GFAP為亦由神經幹細胞所分化之星狀細胞中所表現之標記物。

NeuN-陽性細胞的存在係使用山羊抗-NeuN單株抗體(Chemicon,Temecula,USA)進行分析。GFAP-陽性細胞的存在係使用山羊抗-GFAP多株抗體(Sigma,St.Louis,USA)進行分析。BrdU-陽性/GFAP-陽性細胞之存在係利用小鼠抗大鼠BrdU多株抗體之初級抗體及Rho標記之兔子抗小鼠抗體之二級抗體，以及山羊抗GFAP多株抗體之初級抗體與FITC標記之兔子抗山羊抗體之二級抗體之組合之雙重免疫螢光染色進行分析。

(8)BrdU-陽性(遷移)細胞之分析

各組之30隻大鼠於模式建立24小時後，經腹腔內注射50mg/kg BrdU兩次。大鼠於模式建立後第7、14及21日進行屍體解剖以製備冷凍腦切片。BrdU-陽性細胞在SVZ區域之存在係使用小鼠抗大鼠BrdU單株抗體之免疫化學染色進行分析。

結果與討論 (1)神經功能之評估

於缺血/再灌注損傷模式建立後，直到實驗結束之第21日，每日評估分數。

於偽手術組中，未發現神經功能失調。於另外兩組中發現，相較於模式建立後第1日，模式建立後第21日的神經功能回復具有顯著性(p<0.05)。

於巴曲酶組中，發現神經功能回復的發生早於模式組。於巴曲酶組中，相較於模式組，特別是於模式建立後第7、8、9及16日觀察到顯著地神經功能回復。

此結果顯示巴曲酶賦活神經幹細胞及/或前驅細胞，結果有益於神經功能失調之改善。巴曲酶之賦活效果被認為在於促進神經幹細胞及/或前驅細胞之增殖、遷移及分化。

(2)神經幹細胞存在之證明

表8. 巢蛋白-陽性細胞於SVZ區域之數目(mean±SD,No.cells/mm² )

根據示於表8的數據，巢蛋白－陽性細胞於巴曲酶組之數目之相對值(%)係使用下列公式，以模式組之值作為100%而計算出。

BRt(%)＝(Bt－St)/(Mt－St)×100 BRt(%)：於t時間之巴曲酶組之巢蛋白－陽性細胞百分比Bt：於t時間之巴曲酶組之巢蛋白－陽性細胞平均值St：於t時間之偽手術組之巢蛋白－陽性細胞平均值Mt：於t時間之模式組之巢蛋白－陽性細胞平均值t：第7日、第14日或第21日

結果示於第1圖。相較於偽手術組，模式組的巢蛋白－陽性細胞之數目增加(巢蛋白為神經幹細胞之標記物)(表8)。此被認為起因於由動物之腦缺血/再灌注損傷之刺激所誘發之補償反應。

另一方面，相較於模式組，於模式建立後第7、第14及第21日巴曲酶組的巢蛋白－陽性細胞數目增加(表8，第1圖)。

該等結果顯示巴曲酶賦活巢蛋白－陽性細胞(亦即神經幹細胞)。巴曲酶之賦活效果被認為在於促進神經幹細胞之增殖與遷移。

此外，自模式建立後的第9日不投藥巴曲酶，相較於模式組，於模式建立後第21日，巴曲酶組的巢蛋白－陽性細胞數目仍顯著增加(第1圖)。此結果顯示巴曲酶對神經幹細胞具有特續賦活效果。

(3)增殖之神經幹細胞之存在及其自體複製能力之證明 1)增殖神經幹細胞存在之證明於巴曲酶組之SVZ區域之增殖巢蛋白－陽性/BrdU－陽性細胞(亦即神經幹細胞)以雙重免疫螢光染色加以確認(未顯示數據)。此顯示於巴曲酶組之增殖神經幹細胞之存在。

2)神經幹細胞之自體複製能力之證明

根據示於表9的結果，BrdU－陽性細胞於巴曲酶組之數目之相對值(%)係使用下列公式，以模式組之值作為100%而計算出。

BRt(%)＝(Bt－St)/(Mt－St)×100 BRt(%)：於t時間之巴曲酶組之BrdU－陽性細胞百分比Bt：於t時間之巴曲酶組之BrdU－陽性細胞平均值St：於t時間之偽手術組之BrdU－陽性細胞平均值Mt：於t時間之模式組之BrdU－陽性細胞平均值t：第7日、第14日及第21日

結果示於第2圖。相較於偽手術組，模式組之BrdU－陽性細胞之數目增加(BrdU為增殖細胞之標記物)(表9)。此被認為起因於由動物之腦缺血/再灌注損傷之刺激所誘發之補償反應。

另一方面，相較於模式組，於模式建立後第7、第14及第21日巴曲酶組之BrdU－陽性細胞數目增加(表9，第2圖)。

BrdU－陽性細胞存在於僅由基於其自體複製能力可併入BrdU神經幹細胞及神經前驅細胞所組成之腦組織。因此，此等結果顯示巴曲酶賦活神經幹細胞及/或前驅細胞。巴曲酶之賦活效果，被認為在於為促進神經幹細胞及/或前驅細胞之增殖及遷移。

此外，自模式建立之後第9日不投藥巴曲酶，相較於模式組，於模式建立後第21日，巴曲酶組的BrdU－陽性細胞數目仍顯著增加(第2圖)。此結果顯示巴曲酶對神經幹細胞及/或前驅細胞具有持續賦活效果。

(4)未成熟神經元之存在、分化自神經幹細胞之星狀神經膠細胞之存在及增加的星狀神經膠細胞之存在之證明 1)未成熟細胞存在之證明巴曲酶組中，NeuN－陽性細胞之存在經確認(未顯示數據)。NeuN為於由神經幹細胞分化之未成熟神經元中表現之標記物。因此，此結果顯示由神經幹細胞分化之未成熟細胞係存在於巴曲酶組。

2)自神經幹細胞分化之星狀細胞存在之證明巴曲酶組中BrdU－陽性/GFAP－陽性細胞之存在係使用雙重免疫螢光染色於SVZ區域中加以確認(未顯示數據)。GFAP為於由神經幹細胞分化之星狀神經膠細胞中表現之標記物。因此，此結果表示由神經幹細胞分化之星狀神經膠細胞存在於巴曲酶組。然而，星狀神經膠細胞為神經組織中經分化細胞，為何BrdU併入其中？被認為所偵測到的BrdU是在幹細胞及/或前驅細胞分化為星狀神經膠細胞的狀態之前併入細胞，且持續存在。

3)增加的星狀神經膠細胞存在之證明 ^＊ ^＊表示P<0.01相較於偽手術組，^＊ ^＊ ^＊表示P<0.05相較於同日之模式組，使用Wilcoxon’s檢驗

根據示於表10的數據，GFAP－陽性細胞於巴曲酶組之數目之相對值(%)係使用下列公式，以模式組之值作為100%而計算出。

BRt(%)＝(Bt－St)/(Mt－St)×100 BRt(%)：於t時間之巴曲酶組之GFAP－陽性細胞百分比Bt：於t時間之巴曲酶組之GFAP－陽性細胞平均值St：於t時間之偽手術組之GFAP－陽性細胞平均值Mt：於t時間之模式組之GFAP－陽性細胞平均值t：第7日、第14日及第21日

結果示於第3圖。相較於偽手術組，模式組之GFAP－陽性細胞之數目增加(GFAP為由神經幹細胞分化之星狀神經膠細胞之標記物)(表10)。此被認為起因於由動物之腦缺血/再灌注損傷之刺激所誘發之補償反應。

另一方面，相較於模式組，於模式建立後第7、第14及第21日巴曲酶組之GFAP－陽性細胞數目增加(表10，第3圖)。

此等結果顯示巴曲酶賦活GFAP－陽性細胞(亦即神經幹細胞及/或前驅細胞)。巴曲酶之賦活效果，被認為為促進神經幹細胞及/或前驅細胞之增殖、分化及遷移，特別是促進由上述細胞分化為星狀細胞。

此外，自模式建立之後第9日不投藥巴曲酶，相較於模式組，於模式建立後第21日，巴曲酶組之GFAP－陽性細胞數目仍顯著增加(第3圖)。此結果顯示巴曲酶對神經幹細胞及/或前驅細胞分化為星狀神經膠細胞具有持續賦活效果。

(5) 遷移細胞存在之證明

根據示於表11的數據，BrdU－陽性細胞於巴曲酶組之數目之相對值(%)係使用下列公式，以模式組之值作為100%而計算出。

結果示於第4圖。於此實驗中，於模式建立後24小時內BrdU僅經腹腔內投藥兩次，且由於之後未再投藥BrdU，於模式建立後第7、第14及第21日進行分析所存在之BrdU－陽性細胞為該BrdU－投藥時間出現之BrdU－陽性細胞。因此，模式建立後第7、第14及第21日於SVZ區域分析之BrdU－陽性細胞數目增加，反映移動至SVZ區域之BrdU－陽性細胞數目。再者，SVZ區域之BrdU－陽性細胞僅由神經幹細胞及/或神經前驅細胞所組成基於其自體複製能力可將BrdU併入。基於上述基礎，表11及第4圖顯示神經幹細胞及神經前驅細胞在SVZ區域內之遷移狀態。

相較於偽手術組，BrdU－陽性細胞之數目於模式組增加(表11)。此被認為起因於由動物之腦缺血/再灌注損傷之刺激所誘發之補償反應。

另一方面，相較於模式組，於模式建立後第7、第14及第21日巴曲酶組之BrdU－陽性細胞數目增加(表11)。此顯示遷移至SVZ區域之神經幹細胞及/或神經前驅細胞之數目於巴曲酶組大於模式組。

此等結果顯示巴曲酶賦活神經幹細胞及/或神經前驅細胞。巴曲酶之賦活效果，被認為在於促進神經幹細胞及/或神經前驅細胞之遷移。

此外，自模式建立之後第9日後不投藥巴曲酶，相較於模式組，於模式建立後第21日，巴曲酶組的BrdU－陽性細胞數目仍顯著增加(第4圖)。此結果顯示巴曲酶對神經幹細胞及/或神經前驅細胞具有持續賦活效果。

再者，以免疫化學染色比較巴曲酶組與模式組間SVZ區域之BrdU－陽性細胞之分布。於模式組中，BrdU－陽性細胞僅分布於SVZ區域之表面(第5圖左側)，但於巴曲酶組中，BrdU－陽性細胞係廣泛地分布於SVZ區域內(第5圖右側)。此結果顯示，神經幹細胞及/或神經前驅細胞由SVZ區域之表面遷移至內部為巴曲酶投藥的結果，亦即巴曲酶促進神經幹細胞及/或神經前驅細胞於腦組織原位(in situ)之遷移。

實施例3中的結果清楚地顯示巴曲酶對於神經幹細胞及/或神經前驅細胞具有持續地賦活效果。巴曲酶之賦活效果被認為在於促進神經幹細胞及/或神經前驅細胞之增殖、遷移及分化。

產業上可利用性

如上述實施例所述，本發明賦活劑可賦活幹細胞及/或前驅細胞。因此，本發明可有利地使用於再生醫學，且特別是利用自體再生之再生醫學。

由於利用自體再生之再生醫學係經由使用本發明賦活劑用於存在於患者體內之幹細胞及/或前驅細胞而進行，不需要由患者體外導入細胞。因此，對患者之負擔較少，且無例如於細胞移植期間發生感染之風險，因此使利用自體再生之再生醫學優於其中之細胞由患者體外導入之再生醫學。

此外，利用自體再生之再生醫學係經由使用本發明賦活劑而進行，幹細胞及/或前驅細胞之賦活僅發生於患者之患病位置(亦即損傷的器官及/或組織)，以及該再生僅取決於所要求程度而發生。因此，利用自體再生之再生醫學不會發生由患者體外導入細胞之傳統再生醫學(再生醫學的主流)由於細胞移植之過度再生及/或過度修復所引起之出現併發症的風險。

再者，本發明賦活劑含有類凝血酶，副作用小或無副作用，且能根據損傷的器官及/或組織的進展狀態及程度，適時地且適度地作用於再生醫學所應用處，且具有持續性賦活之效果。因此，本發明賦活劑可有益地用於再生醫學。

因此，本發明可用於再生醫學，特別是於利用自體再生之再生醫學具有很高之產業利用性。

第1圖為顯示巴曲酶組相較於模式組之巢蛋白陽性細胞相對數目之長條圖。

第2圖為顯示巴曲酶組相較於模式組之BrdU－陽性細胞相對數目之長條圖。

第3圖為顯示巴曲酶組相較於模式組之GFAP－陽性細胞相對數目之長條圖。

第4圖為顯示巴曲酶組相較於模式組之BrdU－陽性(遷移的(migrated))細胞相對數目之長條圖。

第5圖為顯示於模式組(左)及巴曲酶組(右)之SVZ區域中BrdU－陽性細胞之分布攝影。箭頭指出BrdU－陽性細胞。

Claims

一種賦活劑，其係CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞之賦活劑，該賦活劑包含巴曲酶(batroxobin)，其中該CD34-陽性單核細胞為CD34-陽性幹細胞或CD34-陽性前驅細胞。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，該賦活劑還可含有一種或一種以上由生長因子、細胞激素、雌激素、脂類、斯坦丁(statin)、抗生長因子抗體、生長因子抑制劑、抗生長因子抑制劑抗體及抗細胞激素抗體所成組群中選出之非巴曲酶之活性物質。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，其中，該CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞係應用於再生醫學之細胞。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，其中，該CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞係於利用自體再生(self-regeneration)之再生醫學所應用之細胞。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，其中，該CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞係應用於再生醫學之細胞，且該再生醫學係用於由皮膚疾病、腦神經疾病、心血管疾病、腸胃疾病、呼吸疾病、泌尿疾病、運動系統疾病、血管疾病、內分泌疾病及眼科疾病所成組群中選出者。
根據申請專利範圍第5項之賦活劑，其中，該CD34- 陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞係應用於再生醫學之細胞，且該再生醫學係用於由腦神經疾病、心血管疾病、皮膚疾病及血管疾病所成組群中選出者。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，其中，該CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞係由內在細胞(resident cells)、骨髓衍生細胞及血液衍生細胞所成組群中選出之細胞。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，其中，該賦活效果係由幹細胞及/或前驅細胞之增殖促進作用、遷移促進作用及分化促進作用所成組群中選出者。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，其中，該賦活劑係促進血管內皮前驅細胞及/或間葉(mesenchymal)幹細胞之遷移。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，其中，該CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞係應用於再生醫學之細胞且該再生醫學係用於下肢深部靜脈血栓症(lower limb deep vein thrombosis)。
根據申請專利範圍第10項之賦活劑，其中，該賦活劑促進血管內皮前驅細胞及/或間葉幹細胞之增殖及/或遷移。
根據申請專利範圍第1項之賦活劑，其中，該CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞係應用於再生醫學之細胞，且該再生醫學係用於缺血性腦血管疾病。
根據申請專利範圍第12項之賦活劑，其中，該CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞係應用於再生醫學之細胞，且該再生醫學係用於腦缺血/再灌注之損傷。
根據申請專利範圍第13項之賦活劑，其中，該CD34-陽性單核細胞及/或神經幹細胞及/或神經前驅細胞為神經幹細胞及/或神經前驅細胞。
根據申請專利範圍第14項之賦活劑，其中，該賦活劑促進神經幹細胞及/或神經前驅細胞之增殖及/或遷移及/或分化。