KR20240072071A - 줄기세포 스페로이드를 포함하는 조직 재생 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 스페로이드를 포함하는 조직 재생 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드는 균일한 크기로 제조가 가능하고 표준화된 것으로, 2차원 배양된 줄기세포에 비해 조직 재생 속도가 빠르고, 재생된 조직은 원래 조직과 유사도가 높다. 본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드는 신생혈관 형성 등의 작용을 통해 타액선, 기관, 성대, 근육, 피부, 지방 조직 등 여러 가지 조직의 재생에 뛰어난 효과를 가지는 바, 다양한 조직 질환에 대한 세포 치료제 등으로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

줄기세포 스페로이드를 포함하는 조직 재생 촉진용 조성물 {Composition for enhancement of tissue regeneration comprising stem cell spheroid}

본 발명은 줄기세포 스페로이드를 포함하는 조직 재생 촉진용 조성물에 관한 것이다.

최근 줄기세포를 이용한 기술에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 다양한 기관을 형성할 수 있는 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되고 있다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되고, 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있는 특성이 있으며, 분화 자극에 따라 상이한 세포로도 분화될 수 있는 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency), 전능(Totipotency), 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 세포이며, 일부 줄기세포는 다분화능 또는 단분화능의 잠재력을 지닌다. 줄기세포는 다양한 생체활성인자들의 발현을 통해 주변 세포의 생장 및 분화를 촉진시키는 능력(paracrine effect)을 가져 세포 치료제의 원료로서 난치성, 퇴행성 질환이나 장기 재생 등과 관련이 깊은 재생의학 분야에서 많은 주목을 받고 있다.

이러한 줄기세포들의 분화능을 이용한 세포 치료제(cell therapy)로의 적용과 관련하여 많은 연구 개발이 활발히 진행되어 왔으며, 다양한 연구들을 통하여 세포 치료제를 신경질환, 심장질환, 폐질환, 간질환, 암 절제 등과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필요한 다양한 질환에 적용하여, 세포 및 조직의 기능을 복원시키는 것에 대한 가능성이 많이 제시되고 있다.

일반적으로, 세포 치료제는 세포를 체외(in vitro)에서 배양하거나 선별하는 등 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법으로 조작하여 제조한 의약품으로서, 대부분 세포 치료제는 체외에서 증식배양한 단일 세포들(single cells)을 첨가제에 부유시킨 현탁액 형태로 개발되었다. 하지만 현탁액제제의 단일세포는 이식환경에서의 물리적, 화학적 스트레스 및 세포-기질, 세포-세포의 비부착성 세포사멸(detachment-induced apoptosis)인 아노이키스(anoikis) 등으로 인해 이식한 세포가 직접 재생조직을 형성하지 못하고 세포가 분비하는 물질에 의한 간접효과만을 기대할 수 있다는 제한점이 있다.

이러한 제한적 치료효과를 극복하기 위해 세포를 3차원 배양법으로 다시 응집 재조합하여 만듦으로써 체내에 이식 후 세포 생존율이 높이고 항염, 혈관재생 등 세포 치료제의 치료효과를 높일 수 있는 스페로이드형 세포 치료제의 개발이 활발히 진행되고 있다. 세포 스페로이드의 제조 기술은 통상적인 기술로 특히 항암제 개발 분야에서 많이 활용되고 있으며, 3차원적인 세포 배양이라는 특징 때문에 조직 재생/재건 분야에서도 활용되고 있는 기술이다. 하지만, 조직 재생/재건을 위해서 필요한 생체활성인자들을 발현하는 가장 우수한 조건의 세포 스페로이드에 대한 표준화 및 이를 이용하여 여러 조직에 대한 재생 효과를 확인한 연구는 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 균일한 크기로 제조가 가능하고 표준화된 줄기세포 스페로이드를 제조하여 여러 가지 조직의 재생을 촉진할 수 있는 세포 치료제의 개발에 활용하고자 하였다.

한국등록특허 제10-1669009호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생 촉진용 조성물 또는 세포 치료제를 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포, 및 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조직은 피부, 지방, 타액선, 기관, 기도, 성대, 및 근육으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 조직공학용 지지체를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포 스페로이드는 조직 재생 촉진과 관련된 생체활성인자의 발현이 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 생체활성인자는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 기질 금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs), 섬유아세포 성장인자들(fibroblast growth factors, FGFs), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈소판유래 성장인자들(Platelet-derived growth factors, PDGFs), 태반 성장인자(Placental growth factor, PlGF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 전환성장인자-베타(Transforming growth factor beta, TGF-β, 및 안지오포이에틴(Angiopoietin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 신생혈관 형성을 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 줄기세포 스페로이드는 직경이 100 내지 500 μm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생 촉진용 세포 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 조직 재생 촉진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 조직 재생 촉진 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 조직 재생 촉진용 제제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드는 균일한 크기로 제조가 가능하고 표준화된 것으로서, 2차원 배양된 줄기세포에 비해 조직 재생 속도가 빠르고, 재생된 조직은 원래 조직과 유사도가 높다. 본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드는 신생혈관 형성 등의 작용을 통해 타액선, 기관, 성대, 근육, 피부, 지방 조직 등 여러 가지 조직의 재생에 뛰어난 효과를 가지는 바, 다양한 조직 질환에 대한 세포 치료제 등으로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 수에 따른 줄기세포 스페로이드의 직경을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 단일 세포의 직경, 줄기세포 스페로이드의 직경과 처음 단일 세포수의 상관관계를 로지스틱 회귀분석으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 2의 청색 점선은 회귀선을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 단일 세포의 직경, 줄기세포 스페로이드의 직경과 처음 단일 세포수의 상관관계를 3D 그래프로 나타낸 결과이다. 도 3의 왼쪽 도면은 단일 세포의 직경과 단일 세포의 개수에 따른 줄기세포 스페로이드 직경을 나타내며, 흑색점은 10.4 μm 직경의 단일 세포, 흰색점은 14.0 μm 직경의 단일 세포, 적색점은 15.2 μm 직경의 단일 세포, 녹색점은 21.9 μm 직경의 단일 세포, 노란점은 23.7 μm 직경의 단일 세포를 의미한다. 도 3의 오른쪽 도면은 줄기세포 스페로이드 제조를 위해 필요한 단일 세포의 수(f)를 예측하기 위한 단일 세포의 직경(x)과 스페로이드의 직경(y)을 나타내며, 파란 mesh는 Regression(3D, Gaussian)을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 다양한 배양 용기에서의 단일 세포 필요수 계산 함수를 적용한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드 직경에 따른 스페로이드 내부의 저산소 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드 직경에 따른 세포 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5c는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드 직경에 따른 생체활성인자의 누적 분비량을 ELISA를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5d는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드 처리에 의한 다양한 신생혈관 형성 관련 생체활성인자들의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다(파란색 선: 2차원 배양된 줄기세포가 분비하는 각 생체활성인자의 양을 1로 표준화한 표준선).
도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드와 GFP-HUVEC의 공배양을 통한 줄기세포 스페로이드의 관 형성 유도 효능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 도 6a의 결과를 정량화하여 나타낸 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일 구현예에 따른 방사선 조사 후 줄기세포 스페로이드 주입에 의한 타액선 조직의 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b는 본 발명의 일 구현예에 따른 방사선 조사 후 줄기세포 스페로이드 주입에 의한 타액선의 뮤신 분비 기능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7c는 본 발명의 일 구현예에 따른 방사선 조사 후 줄기세포 스페로이드 주입에 의한 타액선의 기능 및 형태학적 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a는 본 발명의 일 구현예에 따른 기관 지지체 내외부에 도포된 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드의 부착 모습을 나타낸 도면이다.
도 8b는 본 발명의 일 구현예에 따른 기관 부분결손 동물 모델에 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드가 도포된 기관 지지체를 이식한 모습 및 이식 14주 후 이식한 기관 지지체의 모습을 나타낸 도면이다.
도 8c는 본 발명의 일 구현예에 따른 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드가 도포된 기관 지지체의 이식 후 기도 내시경 이미지를 나타낸 도면이다.
도 8d는 본 발명의 일 구현예에 따른 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드가 도포된 기관 지지체의 이식 후 기도 점막 형태 재건 효능을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8e는 본 발명의 일 구현예에 따른 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드가 도포된 기관 지지체의 이식 후 기도 점막 기능 재건 효능을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8f는 본 발명의 일 구현예에 따른 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드가 도포된 기관 지지체의 이식 후 지지체 내부에서 재생된 기도 점막 조직(도 8f의 왼쪽 도면) 및 지지체 외부에서 기관을 덮고 있는 근육층의 신생혈관 형성 효능(도 8f의 오른쪽 도면)을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드의 노화 성대 재건 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a는 본 발명의 일 구현예에 따른 허혈성 하지 질환 동물 모델 제작 후 손상된 혈관 위로 줄기세포 스페로이드가 포접된 마트리겔을 덮은 모습을 나타낸 도면이다.
도 10b는 본 발명의 일 구현예에 따른 허혈성 하지 질환 동물 모델에서 줄기세포 스페로이드 이식을 통한 조직 재생 유도 후 혈류 속도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10c는 본 발명의 일 구현예에 따른 허혈성 하지 질환 동물 모델에서 줄기세포 스페로이드 이식을 통한 조직 재생 유도 후 혈류의 흐름 및 발의 모습을 나타낸 도면이다.
도 10d는 본 발명의 일 구현예에 따른 허혈성 하지 질환 동물 모델에서 줄기세포 스페로이드 이식을 통한 조직 재생 유도 후 넙적다리 근육의 단면을 H&E 염색한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10e는 본 발명의 일 구현예에 따른 허혈성 하지 질환 동물 모델에서 줄기세포 스페로이드 이식을 통한 손상 지연 및 재생된 근육의 근섬유 단면적(CSA)을 확인한 도면이다.
도 10f는 본 발명의 일 구현예에 따른 허혈성 하지 질환 동물 모델에서 줄기세포 스페로이드 이식을 통해 재생된 근육의 혈관 분포를 확인한 도면이다(BF: Bicep Femoris, CF: Caudofemoralis, SM: Semimembranosus).
도 11a는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드를 피부 결손 부위에 치료한 후 모습을 나타낸 도면이다.
도 11b는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드를 피부 결손 부위에 치료한 후 조직의 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 줄기세포 스페로이드를 동물의 지방 패드에 이식한 후 재생된 지방 조직의 H&E 염색 및 Oil red O 염색 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은 균일한 크기로 제조가 가능하고 표준화된 줄기세포 스페로이드를 제조하여 타액선, 기관, 성대, 근육, 피부, 지방 조직 등 여러 가지 조직에 대한 재생 효과를 확인한 결과, 줄기세포 스페로이드가 신생혈관 형성 등의 작용을 통해 상기와 같은 여러 가지 조직들을 재생/재건하는 효과를 가지는 것을 확인하였으며, 2차원 배양된 줄기세포에 비해 조직 재생 속도가 빠르고, 원래 조직과 유사도가 높은 것을 확인하였다. 또한, 줄기세포 스페로이드를 조직공학용 지지체와 혼합하여 사용할 경우 조직 재생을 촉진시키는 생체활성인자 발현 기능이 향상되어 조직 재생 효능이 향상되는 것을 확인하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “줄기세포(stem cell)”는 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.

성체 줄기세포로 분류되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 여러 결합조직의 수선세포(repair cell)로 잘 알려져 있으며, 이들 세포는 중간엽계의 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다. 또한, 획득이 용이하고 임상적용이 가능하다는 이점 때문에, 뇌의 심부에 위치하고 있어 충분한 양을 얻기 어렵고 뇌 손상의 위험성이 존재하는 신경줄기세포의 단점을 보완할 수 있어 신경계질환 치료제의 개발 및 재생의학의 재료로 각광받고 있으며, 골수, 제대혈, 지방조직, 탯줄 등의 조직에서 채취될 수 있고, 혈액 줄기세포와 달리 지방세포, 골세포, 연골세포, 신경세포, 심근세포 등 다양한 인체 조직을 구성하는 세포로의 분화능을 가진다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포, 및 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실험예에 따르면 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 제조한 줄기세포 스페로이드의 조직 재생 효과를 확인하였으나, 줄기세포 스페로이드의 효과는 본 발명의 실험예에 제한되는 것은 아니며, 상기 기재한 다른 종류의 줄기세포에서도 동일한 효과가 발휘될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조직은 피부, 지방, 타액선, 기관, 기도, 성대, 및 근육으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 이때 상기 근육은 하지 근육일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “세포 스페로이드(cell spheroid)”는 3차원 구상체로 배양된 세포를 의미하며, 본래 체내 세포의 형태가 3차원적이기 때문에 monolayer로 배양된 세포 대비, 스페로이드 형태에서 세포 생장이 우수하며 세포 본연의 특성을 잘 유지할 수 있다. 또한, 세포 스페로이드 중심부의 산소 전달 제한에 의하여 저산소 환경이 유도됨에 따라 다양한 약리학적 활성을 나타내는 인자들의 발현이 증가된 3차원의 세포 응집체를 의미한다. 본 발명의 세포 스페로이드는 상기 약리학적 활성을 나타내는 인자들, 즉, 조직 재생을 촉진시키는 것으로 알려져 있는 조직 재생 촉진 인자들인 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 기질 금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs), 섬유아세포 성장인자들(fibroblast growth factors, FGFs), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈소판유래 성장인자들(Platelet-derived growth factors, PDGFs), 태반 성장인자(Placental growth factor, PlGF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 전환성장인자-베타(Transforming growth factor beta, TGF-β, 또는 안지오포이에틴(Angiopoietin) 등 세포의 성장과 분화에 필요한 사이토카인, 그리고 interleukin family와 같은 면역관련 사이토카인들의 분비가 증가되며, 특별히 이 중 VEGF는 신생혈관 형성을 촉진시켜 조직 재생에 필요한 사이토카인 및 면역세포들을 손상된 조직으로 모집시켜 조직 재생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 인자들의 발현이 촉진되어 있는 세포 스페로이드는 조직 재생을 필요로 하는 다양한 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포 스페로이드는 줄기세포의 직경을 측정하는 단계; 상기 줄기세포의 직경이 바람직하게는 1 내지 50 μm일 때, 더욱 바람직하게는 3 내지 30 μm일 때, 바람직하게는 1 x 10³ 내지 1 x 10¹⁰ 개를, 더욱 바람직하게는 3 x 10³ 개 내지 3 x 10⁶ 개의 줄기세포를 배양 용기에 분주하는 단계; 및 상기 줄기세포를 배양하여 줄기세포 스페로이드를 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

이때, 하기 식에 의하여 계산된 초기 단일 세포의 필요수(f) 만큼 세포를 배양 용기에 분주하는 것일 수 있다.

상기 식에서, f는 초기 단일 세포의 필요수(number of single cell), x는 세포의 직경(diameter of single cell), y는 세포 스페로이드의 직경(diameter of cell spheroid)을 의미하며, 바람직하게는 x₀은 8.2775 내지 10.3231, y₀은 624.8576 내지 726.3632, a = 53.0017 내지 89.4827, b = 9.0232 내지 10.2778, 그리고 c = 162.0536 내지 191.5685일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 x₀ = 7 내지 11, y₀ = 650 내지 700, a = 50 내지 90, b = 7 내지 11, 그리고 c = 150 내지 200이나 이에 제한되지는 않는다.

상기 방법 및 함수에 의해 줄기세포 스페로이드를 제조함으로써 원하는 직경을 가지는 줄기세포 스페로이드를 균일하게 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배양하는 단계는 세포를 바람직하게는 2 내지 7일 동안, 더욱 바람직하게는 2 내지 4일 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 조직 재생을 필요로 하는 질환에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이에, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생을 필요로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조직 재생을 필요로 하는 질환은 노화, 손상, 괴사 등에 의하여 조직의 재생이 필요한 모든 질환을 총칭하며, 일례로, 골, 연골, 피부, 고막, 폐, 지방, 연골, 골, 신경, 인대, 건, 성대, 심장, 간, 자궁, 타액선, 기관, 기도, 근육, 식도 등의 조직에서 재생이 필요한 모든 질환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 줄기세포 스페로이드는 허혈성 질환의 손상된 조직을 재생시키는 데도 사용될 수 있다. 또는 암의 절제 수술 등 조직 절제 수술 이후의 조직 재생에도 사용될 수 있다. 그러나 줄기세포를 이용하여 조직을 재생하는 방법으로 치료할 수 있는 질환이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “허혈(Ischemia)”은 신체기관, 조직 또는 부위로 혈액을 공급하는 혈관이 협착 또는 수축하거나, 정상적인 혈관 생성이 충분히 이루어지지 않아 혈액 공급에 문제가 생겨 국부적으로 조직의 괴사가 일어난 상태를 말한다. 특히, 심장, 뇌는 혈류 공급 부족에 가장 민감한 신체 기관으로서, 조직 상에 허혈이 발생하면 허혈성 캐스캐이드라고 불리우는 일련의 과정들이 촉발되어 조직이 영구적으로 손상된다. 상기와 같은 허혈 증상을 나타내는 질환을 “허혈성 질환”이라고 한다. 상기 허혈성 질환에는 허혈성 하지 질환, 심장 협심증, 심근 경색, 뇌경색, 족부궤양 등이 포함될 수 있고, 상기 허혈성 하지 질환에는 하지동맥 폐쇄성 질환, 하지동맥 협착성 질환, 하지동맥 경화증 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여, 상처 부위에 직접 이식 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 조직공학용 지지체(scaffold)를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 조직공학용 지지체의 경우 화상, 암 조직 제거 등의 조직 결손 발생 시, 결손 부위를 대체하기 위해 개발되고 있으나, 조직공학용 지지체의 단독 사용으로는 조직 재생의 속도가 많이 지연될 뿐만 아니라 염증 등 거부반응에 의한 부작용으로 인해 조직 재생에 한계가 있다. 본 발명에서는 줄기세포 스페로이드를 조직공학용 지지체와 혼합하여 사용할 경우 조직 재생 효능이 향상되는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 조직공학용 지지체는 외과적 수술을 통한 이식 또는 주사기 등을 사용하여 이식될 수 있으며, 폴리카프로락톤(poly(caprolactone), PCL) 등을 포함한 생체적합성 또는 생분해성 고분자, 또는 수화젤 등이 포함될 수 있으나, 이의 종류에 제한은 없다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 조직공학용 지지체 및 2차원 배양된 줄기세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 지지체는 내부에 2차원 배양된 줄기세포가 도포되고 외부에 줄기세포 스페로이드가 도포될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 내부에 2차원 배양된 줄기세포가 도포되고 외부에 줄기세포 스페로이드가 도포된 조직공학용 지지체를 포함하는 조직 재생 촉진용 조성물 또는 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, “키트”는 상기 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드가 도포된 조직공학용 지지체를 포함함으로써, 조직 재생을 촉진할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 제제 외에도 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서(설명서); 및 상기 지지체를 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 지지체를 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있으며, 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 지시서를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포 스페로이드는 조직 재생 촉진과 관련된 생체활성인자의 발현이 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 생체활성인자는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 기질 금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs), 섬유아세포 성장인자들(fibroblast growth factors, FGFs), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈소판유래 성장인자들(Platelet-derived growth factors, PDGFs), 태반 성장인자(Placental growth factor, PlGF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 전환성장인자-베타(Transforming growth factor beta, TGF-β, 및 안지오포이에틴(Angiopoietin)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 신생혈관 형성을 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “신생혈관 형성”은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 생리학적 과정으로, 혈관 형성의 초기 단계에서 형성된다. 신생혈관 형성은 주로 돋아나고 갈라지는 과정에 의해 맥관구조의 성장을 지속하지만 유착성 신생혈관 형성, 혈관 신장 및 혈관 결합과 같은 과정도 역할을 한다. 신생혈관 형성은 성장과 발달, 상처 치유 및 육아 조직 형성에서 정상적이고 중요한 과정이다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포 스페로이드는 내부에 저 산소환경이 유도됨으로써 혈관 신생 인자, 세포 성장 인자 등 다양한 약리활성인자의 분비가 촉진되어 조직 재생을 효과적으로 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 스페로이드는 직경이 100 내지 500 μm, 100 내지 450 μm, 100 내지 400 μm, 100 내지 350 μm, 100 내지 300 μm, 100 내지 250 μm, 100 내지 200 μm, 150 내지 500 μm, 150 내지 450 μm, 150 내지 400 μm, 150 내지 350 μm, 150 내지 300 μm, 150 내지 250 μm, 150 내지 200 μm, 200 내지 500 μm, 200 내지 450 μm, 200 내지 400 μm, 200 내지 350 μm, 200 내지 300 μm, 200 내지 250 μm, 250 내지 500 μm, 250 내지 450 μm, 250 내지 400 μm, 250 내지 350 μm, 250 내지 300 μm, 200 μm, 250 μm, 300 μm, 350 μm, 또는 400 μm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생 촉진용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명에 있어서, “세포 치료제(cell therapy)”는 포유동물로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 줄기세포를 이용하여 제조된 줄기세포 스페로이드로서, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 본 발명의 세포 치료제에는 줄기세포 스페로이드에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다. 또한, 투여를 위하여 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 세포 치료제의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 치료제의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다.

본 발명의 줄기세포 치료제는 사용된 세포 치료제의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 줄기세포 스페로이드가 10 개 내지 18,000개, 100개 내지 18,000개, 500개 내지 18,000개, 1000개 내지 18,000개, 5,000개 내지 18,000개, 10,000개 내지 18,000개, 15,000개 내지 18,000개, 15,500개 내지 18,000개, 16,000개 내지 18,000개, 15,000개 내지 17,000개, 15,500개 내지 17,000개, 16,000개 내지 17,000개, 15,000개 내지 16,000개, 15,500개 내지 16,000개, 또는 16,000개의 용량으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여될 수도 있다. 또한, 액제, 현탁액, 에멀젼 등의 액상 단위 제제로 제제화될 경우, 역시 상기 세포 농도로 환자에게 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 조직 재생 촉진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 조직 재생 촉진 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 조직 재생 촉진용 제제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 줄기세포 스페로이드의 제조

줄기세포 스페로이드(stem cell spheroid)의 제조를 위해서 우선 단층(monolayer)으로 배양되어 있는 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells; BM-MSC), 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells; AD-MSC), 및 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(induced pluripotent-derived mesenchymal stem cells; iPS-MSC)들에 각각 trypsin/EDTA를 처리해서 단일 세포로 분리하였다. 그리고 분리된 단일 세포는 다양한 농도로 준비하여 일정한 크기의 35개의 홈이 있는 agar mold에 배양 배지와 함께 50 μL씩 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양에 사용한 줄기세포의 초기 개수는 AD-MSC 는 1 x 10⁴ 내지 30 x 10⁴ cells/well, BM-MSC와 iPS-MSC는 1 x 10⁴ 내지 69 x 10⁴ cells/well이었다. 그리고 단일 세포의 수에 따른 줄기세포 스페로이드의 직경을 1, 3, 및 5일 차에 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 35개의 줄기세포 스페로이드가 제작되었으며, 배양 1일차의 줄기세포 스페로이드 직경은 3일 및 5일 차와 비교하여 큰 반면, 3일 및 5일차로 배양 시간이 경과할수록 그 직경이 감소되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 줄기세포 스페로이드는 시간이 경과할수록 cell-cell interaction, cell-ECM interaction 등의 반응이 진행되면서 직경이 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 직경의 변화는 스페로이드 형성 초기에 눈에 띄게 관찰되고, 그 이후에는 미미한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 줄기세포 스페로이드의 직경에 따른 단일 세포 필요수 측정

줄기세포 스페로이드의 직경에 따른 단일 세포의 필요수를 측정하기 위하여, 3일 후에 형성된 줄기세포 스페로이드의 직경을 측정하였으며, 150 ± 10 μm, 200 ± 10 μm, 및 250 ± 10 μm의 직경을 가지는 각각의 줄기세포 스페로이드의 처음 단일 세포 수와 세포 직경과의 관계를 로지스틱 회귀분석(logistic regression, Polynominal, Linear regression, SigmaPlot12.0)을 통해 분석하였으며, 회귀선을 도출하였다.

단일 세포의 직경은 BM-MSC는 10.4 ± 3.8 μm 및 15.2 ± 8.5 μm, iPS-MSC는 14.0 ± 2.4 μm, AD-MSC는 21.9 ± 7.1 μm 로 확인되었다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 회귀선을 통하여, 각각의 단일 세포 직경을 이용하여, 목표로 하는 직경의 세포 스페로이드를 제조할 때 필요한 단일 세포의 수를 계산할 수 있다는 것을 확인하였다.

그리고 이를 회전 변환 행렬을 이용하여 3D 그래프로 나타내고, 단일 세포의 직경과 세포 스페로이드 직경에 따른 단일 세포의 수의 상관관계를 함수로 표기하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 목표로 하는 직경을 가지는 세포 스페로이드를 제조하기 위해 필요한 단일 세포의 초기 필요수를 구하기 위한 함수는 하기와 같다.

상기 식에서, f는 초기 단일 세포의 필요수(required number of single cell), x는 세포의 직경(diameter of single cell), y는 세포 스페로이드의 직경(diameter of cell spheroid)을 의미하며, x₀은 8.2775 내지 10.3231, y₀은 624.5876 내지 726.3632, a = 53.0017 내지 89.4827, b = 9.0232 내지 10.2778, 그리고 c = 162.0563 내지 191.5685일 때 유의성 있는 결과를 나타내며, 특별히, x₀ = 9.3003, y₀ = 675.4754, a = 71.2422, b = 9.6505, 그리고 c = 176.8124일 때, R² = 0.9631을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 함수를 통하여, 원하는 직경의 세포 스페로이드를 제작할 때의 단일 세포의 초기 필요수를 정량할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 줄기세포의 종류에 상관없이 단일 세포의 직경이 스페로이드 직경을 결정하는데 중요한 인자로 작용한다.

실시예 3: 줄기세포 스페로이드 직경에 따른 단일 세포의 필요수 측정 방법의 확인

다양한 배양 용기에서도 본 발명의 단일 세포 필요수 측정 방법이 적용이 가능한지 확인하기 위하여, 다양한 크기와 형태를 가지는 배양용기를 이용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, 일정한 크기의 원형 홈이 81개 있는 아가 몰드(agar mold) 또는 육각형 홈이 169개 있는 PDMS 몰드에 목적하는 직경의 스페로이드 생성에 필요한 필요수만큼의 AD-MSC 단일세포를 분주하고, 3일 동안 배양하여, 목적하는 직경의 줄기세포 스페로이드가 생성되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 배양 용기의 종류와 관계없이 목적하는 직경의 줄기세포 스페로이드가 제작되었다는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 단일 세포의 초기 필요수 계산을 위한 함수는 배양 용기의 크기 및 형태에 관계없이 적용이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 줄기세포 스페로이드의 특성 확인

4-1. 줄기세포 스페로이드의 직경에 따른 저산소 환경 유도 확인

줄기세포 스페로이드의 직경에 따른 스페로이드 내부의 저산소 환경 유도 정도를 확인하기 위하여, 1일 차 AD-MSC 스페로이드에 저산소(hypoxia) 조건을 확인하는데 사용되는 Lectin-like oxidized low-density lipoprotein(LDL) receptor-1(Lox-1)을 처리하고 1일 동안 추가로 배양하였다. 그리고 형광 현미경을 이용하여 저산소 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 5a에 나타내었다.

도 5a에 나타난 바와 같이, 직경이 186 μm인 줄기세포 스페로이드에서는 적색 형광이 관찰되지 않은 것을 통해 내부에 저산소 조건이 형성되지 않았지만, 200 μm 이상의 줄기세포 스페로이드에서는 적색 형광이 관찰되는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 줄기세포 스페로이드의 직경이 200 μm 이상인 경우에는 내부에 저산소 환경이 유도되며, 이를 통하여 저산소 환경에서 발현되는 생체활성인자의 발현량이 증가될 것이라는 것을 확인할 수 있었다.

4-2. 줄기세포 스페로이드의 직경에 따른 세포 생존율 확인

줄기세포 스페로이드의 직경에 따른 세포 생존율을 확인하기 위하여, 실시예 2에서 확립한, 목표로 하는 직경의 줄기세포 스페로이드를 제작하기 위해 필요한 단일 세포의 초기 필요수를 구하기 위한 함수를 이용하여 배아세포 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 100 내지 300 μm 직경의 줄기세포 스페로이드를 제조한 후에, 이로부터 7일 동안 추가로 배양하며 Alamar Blue assay를 이용하여 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과는 도 5b에 나타내었다.

도 5b에 나타난 바와 같이, 250 μm 이상의 직경을 가지는 세포 스페로이드에서 세포 생존률이 감소되며, 이는 스페로이드 내부에 저산소 환경이 유도되며 이로 인하여 세포 사멸이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

4-3. 줄기세포 스페로이드의 직경에 따른 생체활성인자 분비 정도 확인

줄기세포 스페로이드의 직경에 따른 생체활성인자의 분비 정도를 확인하기 위하여, 각각의 단일 세포 분산액(50 μL)를 일정한 크기의 35개의 홈이 있는 agar mold에 분주 후, 배양 배지 450 μL를 추가 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양에 사용한 줄기세포의 초기 개수는 스페로이드 1개 당 3일차 배양 시 줄기세포 스페로이드의 직경이 150 μm가 되도록 하기 위해서는 AD-MSC는 1.71 x 10³ cells, BM-MSC는 2.57 x 10³ cells를 각각 분주하였으며, 직경 200 μm가 되도록 하기 위해서는 ADMSC는 4.28 x 10³ cells, BM-MSC는 6.00 x 10³ cells를 각각 분주하였으며, 직경 250 μm가 되도록 하기 위해서는 AD-MSC는 8.57 x 10³ cells, BM-MSC는 12.86 x 10³ cells를 각각 분주하였다. 그리고 매일 새로운 배양 배지로 교체하며, 24시간 동안 배양된 배양액은 수거하여 ELISA를 이용하여 생체활성인자의 분비량을 측정하였다. 생체활성인자는 대표적으로 알려져 있는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 섬유아세포증식인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 그리고 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase-1; MMP-1)를 확인하였다. 각각의 몰드에는 35개의 줄기세포 스페로이드를 유지하였으며, 배지의 양은 500 μL를 유지하였다. 약리활성인자의 누적 분비량을 도 5c에 나타내었다.

도 5c에 나타난 바와 같이, 줄기세포 스페로이드의 직경이 증가할수록 생체활성인자의 발현량이 증가되며, 250 μm일 때 생체활성인자의 발현량이 가장 높은 것을 확인하였다. 보다 자세하게는, 신생혈관 형성을 유도하는 것으로 알려져 있는 VEGF는 AD-MSC와 BM-MSC 모두에서 직경이 증가될수록 증가되며, 특별히 250 μm의 직경을 가진 줄기세포 스페로이드는 150 μm의 직경을 가진 줄기세포 스페로이드와 비교하여 최대 8배 이상 발현량이 증가되는 것을 확인하였다. 그리고 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있는 bFGF 또한 직경 250 μm의 줄기세포 스페로이드에서 가장 높은 발현량을 나타내는 것을 확인하였다. 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하여 세포의 이동을 유도하는 MMP-1의 경우에는 BM-MSC의 경우에는 발현량이 적으나, 역시 직경 250 μm의 줄기세포 스페로이드에서 가장 높은 발현량을 보이며, AD-MSC의 경우에도 직경 250 μm의 줄기세포 스페로이드에서 가장 높은 발현량을 보이는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 세포 내부에 저산소 환경에 유도된 직경 200 μm 이상의 줄기세포 스페로이드에서 생체활성인자의 발현량이 증가되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 200 μm 내지 400 μm의 직경을 가지는 줄기세포 스페로이드가 조직 재생 효과가 높을 것을 예측할 수 있었다.

이외에도, 2차원 배양된 줄기세포 대비 줄기세포 스페로이드에서 발현되는 생체활성인자들을 정량 분석하였다. 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 상기 실시예 1 및 2의 방법과 동일한 방법으로 줄기세포 스페로이드를 제조한 후 3일동안 배양한 배양액을 회수하여 Proteome Profiler Human Angiogenesis Array Kit(R&D System)를 이용하여 신생혈관 형성 과정에 관여하는 다양한 생체활성인자들을 확인하였다. 그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이 줄기세포 스페로이드에서 신생혈관 형성 유도 인자들의 발현량이 단일 세포 대비 증가한 것을 확인하였다.

[실험예]

실험예 1. 줄기세포 스페로이드의 신생혈관 형성 촉진인자(VEGF)의 발현 확인 및 이의 검증

줄기세포 스페로이드에서 발현하는 많은 사이토카인 중 VEGF가 신생혈관 형성에 영향을 미치는 것에 대한 검증을 진행하고자, 트랜스웰(transwell) 시스템을 이용하여 줄기세포 스페로이드에 의한 녹색 형광 단백질 발현 인간 제대 정맥 내피세포(green fluorescent protein-expressing human umbilical vein endothelial cells, GFP-HUVECs)의 관 형성(tubule formation)을 확인하였다.

보다 자세하게는, 줄기세포 스페로이드에서 분비되는 VEGF에 의한 관 형성을 확인하기 위하여, 24-웰 플레이트에 성장인자가 제외된 Matrigel^® matrix를 코팅하고 2.6 x 10³ cells/cm²의 HUVECs을 분주하였다. 그리고 트랜스웰 시스템을 이용하여 플레이트의 상부에 줄기세포 스페로이드 20개를 분주하고, 6시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 이때, 상기 줄기세포 스페로이드는 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 상기 실시예 1 및 2의 방법과 동일한 방법으로 제조한 것으로서, 매우 균일하게 제조되었다. 줄기세포 스페로이드는 3일차 배양의 직경 300 μm의 스페로이드를 이용하였다. 6시간 및 24시간 배양 후에, ImageJ angiogenesis analysis를 이용하여 master junction과 master segment를 분석 및 정량하였다.

이때, 줄기세포 스페로이드에서 발현되는 VEGF의 길항제(antagonist)로서 항-VEGF의 유무가 GFP-HUVEC의 관 형성에 영향을 주는지 확인하였다. VEGF를 제거한 배양액을 사용함에 따라 GFP-HUVEC에 영향을 미치는 VEGF는 줄기세포 스페로이드가 발현하는 것으로 한정하였다. 항-VEGF의 양은 직경 300 μm의 줄기세포 스페로이드 20개가 발현하는 양 대비, 절반(0.53 pM)과 동량(1.07 pM)을 사용하였다.

그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 줄기세포 스페로이드 없이 HUVEC만 단일 배양한 대조군과 비교하여, 줄기세포 스페로이드를 함께 배양한 경우 GFP-HUVEC의 관 형성이 활발히 진행되는 것을 확인하였으며, 항-VEGF를 처리한 경우 그 정도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이 이를 정량한 결과에서도 줄기세포 스페로이드와 공배양한 경우 관 형성이 향상되는 것을 확인하였으며, 항-VEGF를 처리한 실험군에서는 증가된 관 형성이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 줄기세포 스페로이드에서 발현하는 VEGF가 혈관내피세포의 혈관 형성에 영향을 미치는 것을 검증하였다.

실험예 2. 방사선 조사에 의한 타액선 손상 예방 효능 검증

방사선 조사에 의한 줄기세포 스페로이드의 타액선 기능 손상 예방 효능을 확인하기 위하여 구강 내 고형암을 가진 구강 건조증 동물 모델을 제작하여 검증하였다. 비임상 효능 평가를 위하여 노화 마우스(Balb.c/nude, 12 months, male)를 사용하였으며, 구강 내 고형암 유도를 위하여 SNU-1041 세포 5 x 10⁵ cells를 20 μl의 PBS에 분산시켜 마취시킨 마우스 혀의 오른쪽 측면에 27 G 인슐린 시린지를 이용하여 주입하였다. 마취약으로는 zoletile/rampun을 1:3으로 희석하여 사용하였다. 주입 1주 경과 후, 마취된 마우스를 바로 누운 자세(supine position)로 둔 다음 침샘 및 혀를 포함하는 영역에 21EX-S 장비로 15 Gy 세기의 방사선을 1회 처리하였다. 방사선 조사 48시간 경과 후, 마취된 마우스를 바로 누운 자세로 취한 후 턱 아래 피부를 1 cm 절개하여 타액선 조직을 노출시키고 23 G 천자침을 이용하여 81개의 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드를 주입하였다. 이때, 줄기세포 스페로이드는 20 μl 용량의 식염수(saline)에 분산하였다. 1주일 간격으로 마우스의 체중, 고형암의 크기 변화를 추적관찰 하였으며, 줄기세포 스페로이드 이식 6주 후 체중이 초기 대비 20 % 이상 감소하여 동물윤리법에 따라 희생시켰다. 그런 다음, 타액선 조직을 회수하여 파라핀블록 절편을 이용하여 분석 수행함으로써 조직병리학적 변화를 관찰하였다.

H&E 염색을 통한 조직병리학적 평가 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이 노화 마우스의 타액선 조직(Normal)과 비교하여 구강암(Tumor), 스페로이드 주입(Tumor/Sphe., Tumor/IR/Sphe.), 및 방사선 조사(Tumor/IR)는 타액선의 조직 모양에는 영향을 미치지 않았다.

또한, Alcian blue 염색(뮤신: 파란색)을 통하여 타액선의 뮤신 분비 기능을 확인한 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이 정상 타액선 대비 구강암(Tumor) 모델의 타액선에서는 뮤신 분비 기능이 저하된 것이 확인된 반면, 스페로이드 주입군(Tumor/Sphe.)에서는 뮤신 분비 기능이 향상된 것을 확인하였다. 특히, 방사선 조사를 한 구강암 모델(Tumor/IR)의 타액선의 경우 방사선 조사에 의해 초기에 종양이 억제되었지만 방사선 조사의 영향으로 타액선이 손상되면서 뮤신 분비 기능이 저하되었으나, 줄기세포 스페로이드를 주입한 경우(Tumor/IR/Sphe.) 타액선이 방사선에 노출되었음에도 줄기세포 스페로이드 주입에 의해 뮤신 분비 기능이 눈에 띄게 향상된 것을 확인하였다.

이에 더하여, 타액선의 분비 기능 및 형태학적 평가를 위하여 면역화학적 염색 방법을 이용하여 타액선을 구성하는 작은 낭상의 팽대부(acini)를 acini에서 발현하는 단백질인 아쿠아포린5(aquaporin 5, APQ5: 시아닌색)로 염색하고, 이를 둘러싸고 있는 근상피세포(myoepithelial cells)를 알파-평활근 액틴(alpha-smooth muscle actin, α-SMA: 붉은색)으로 염색하여 관찰하였다. 그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이 APQ5와 근상피세포는 종양과 방사선 조사에 의해 손상되었고, 줄기세포 스페로이드를 이식한 타액선의 경우 손상이 예방되고 손상된 조직이 재생된 것을 확인하였다. 또한, Normal 군에서는 마우스의 타액선에서 노화에 의해 AQP5 발현이 미약한 반면 줄기세포 스페로이드를 이식한 경우 그 발현량이 증가한 것으로 보아 노화에 의한 타액선의 기능 약화를 회복시키는 데에도 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 3. 기관 부분 결손 재건 효능 검증

3-1. 기관 지지체 이식 결과 확인

줄기세포 스페로이드의 기관 결손 질환 재건 효능을 평가하기 위하여, 모델 조직공학용 지지체로 낙엽적층형 구조의 표면을 가지는 poly(caprolactone)(PCL) 기관 지지체를 임의로 선정하여 사용하였다. 동물 모델은 기관 전결손 또는 부분결손 동물 모델을 사용하였다.

일차적으로 수컷 New Zealand White rabbit의 기관(trachea)에 5 mm x 9 mm의 결손을 만들어 기관 결손 모델을 제조하였다. 그리고 결손된 부분에 기관 지지체로 poly(caprolactone)(PCL) 나노섬유 멤브레인(9 mm x 11.5 mm)을 이용하여 봉합하였다.

식도기관루 동맥(Tracheo-esophageal artery)의 방향을 고려하여 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드는 지지체의 외부에 320개/scaffold를 도포하였으며, 2차원 배양된 줄기세포 1.6 x 10⁶ cells/scaffold를 지지체 내부에 도포하여 기도 점막의 재생 및 신생혈관 형성을 관찰하였다. 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드를 기관 지지체에 도포하기 위하여 한천 겔이 코팅된 거즈를 사용함으로써 사용된 세포들이 온전히 지지체에 부착될 수 있도록 환경을 조성하였다. 그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이 줄기세포의 형태에 상관없이 모든 세포가 기관 지지체로 부착된 것을 확인하였으며, 생존력도 우수한 것을 확인하였다.

또한, 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드가 도포된 기관 부분 결손 재건을 위한 기관 지지체를 토끼의 기관 부분 결손 부위에 이식 14주 경과 후 실험을 종료하였으며, 종료 시까지 모든 토끼가 생존하였다. 기관 지지체 이식 모습 및 14주 후 이식한 기관 지지체의 모습을 도 8b에 나타내었다. 도 8b에 나타낸 바와 같이, 이식 14주 후, 줄기세포 스페로이드를 도포하지 않은 기관 지지체에서는 눈에 띄는 신생혈관 도입이 확인되지 않은 반면, 줄기세포 스페로이드를 도포한 지지체를 이식한 실험군에서는 주변의 굵은 혈관으로부터 신생혈관이 형성되어 기관 지지체로 들어온 것을 확인하였다. 이식한 기관 지지체로 신생혈관이 형성된 모습은 정상 기도에서 공급되는 혈관의 모습과 유사하게 형성되어 조직 재생에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 확인되었다.

3-2. 내시경을 통한 기도 점막 재생 확인

기관 지지체 이식 후 14주 간의 내시경 이미지 확인 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이 줄기세포 스페로이드가 도입된 지지체들의 경우 모든 토끼 모델의 기도에서 기도 점막이 50 % 이상 재생된 것을 확인하였다.

또한, 기관 지지체 내부에 2차원 줄기세포를 도포한 경우에도 신생혈관 형성과 관계없이 기도 점막이 빠르게 재생되고 기도 내경도 잘 확보되는 것을 확인하였다. 본 실험에서 사용된 토끼 모델이 기관 부분 결손인 것을 고려하면, 기관으로 연결된 본래의 혈관이 완전히 제거된 것이 아니기 때문에 주변의 혈관들을 통해서 기관 지지체 내부에 도포된 2차원 줄기세포의 융합이 빠르게 진행된 것으로 추측하였다.

3-3. 조직병리학적 분석 결과

기관 조직을 회수하여 조직병리학적 분석을 진행하였다. 재생된 기관 조직을 면역염색한 결과, 도 8d에 나타낸 바와 같이 모든 실험군에서 기저 세포(basal cells)가 확인됨에 따라 기도 점막으로의 재생 가능성을 확인할 수 있었다. 지지체 단독(Scaffold alone)으로 이식한 경우와 비교하여 2차원 배양된 줄기세포 및 줄기세포 스테로이드를 각각 도포한 경우 재생 효과가 나타나는 것을 확인하였으며, 특히, 2차원 배양된 줄기세포와 줄기세포 스페로이드를 지지체 내외부에 각각 도포해 준 경우, 기도 점막층의 세포까지 재생되는 것을 확인하였다. 또한, 2차원 배양된 줄기세포와 줄기세포 스페로이드를 모두 도포한 경우 다른 실험군에 비해 증식세포(proliferating cells)가 더 많이 확인되었다. 이를 통해 두 가지 형태의 세포를 모두 사용할 경우 시너지 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

또한, 재생된 기도 점막층 세포들의 기능 재생을 확인하기 위하여, alcian blue 염색을 통하여 뮤신을 분비하는 배상세포(goblet cell)를 확인한 결과, 도 8e에 나타낸 바와 같이 2차원 배양된 줄기세포를 지지체 내부에 도포해준 경우 및 2차원 배양된 줄기세포와 줄기세포 스페로이드를 지지체 내외부에 각각 도포해 준 경우 뚜렷한 배상세포를 확인하였다. Cilia 형성 확인을 위한 베타-튜불린(beta-tubulin) 면역염색에서도 유사한 경향의 결과를 확인하였다.

기존 기관 재건 시도에서 가장 큰 걸림돌이 신생혈관의 부재였고, 그에 따른 협착에 의한 낮은 생존율이었다. 이를 극복하기 위해 본 발명에서는 신생혈관형성 유도 인자 발현 기능을 강화시킨 줄기세포 스페로이드를 도입하고 상기 실험예 1에서 그 효능을 확인하였다. 재생된 기관 조직 내에 형성된 신생혈관을 평가하기 위하여 CD31 및 α-SMA 면역염색을 진행하였다. 지지체 내부의 재생된 기도 점막층 하단의 CD31-양성 세포의 분포를 확인한 결과, 도 8f의 왼쪽 도면에 나타낸 바와 같이 2차원 배양된 줄기세포를 지지체 내부에 도포해 준 두 그룹에서 뚜렷한 관 형태의 많은 혈관들을 관찰하였고, 도관형태의 CD31-양성 세포가 확인되지 않은 scaffold alone 대비, 지지체 외부에 줄기세포 스페로이드만 도포해 준 실험군에서도 도관형태의 신생혈관을 관찰하였다. 또한, 발달된 혈관 분포 확인을 위하여 진행한 α-SMA 염색 결과, 2차원 배양된 줄기세포를 지지체 내부에 도포해 준 두 그룹에서 확실하게 관찰됨에 따라, 기도 점막 재생 시 신생혈관 형성 유도를 위해서는 지지체 내부에 줄기세포를 도포하는 것이 중요함을 알 수 있었다. 아울러, 신생혈관형성 유도인자 발현 기능 강화 줄기세포 스페로이드를 지지체 외부에 도포하였으므로, 지지체 외부의 조직 내 형성된 혈관도 관찰하였으며, 그 결과 도 8f의 오른쪽 도면에 나타낸 바와 같이 줄기세포 스페로이드를 지지체 외부에 도포해 준 두 실험군에서 CD31-양성 세포들이 가장 많이 확인되었고, 발달된 혈관을 확인한 α-SMA-양성 세포도 관찰되었으며 뚜렷한 도관형태임을 확인하였다. 상기 결과들을 통해 줄기세포 스페로이드의 신생혈관 형성 유도 효능을 확인하였다.

실험예 4. 노화 성대의 재건 효과 확인

세포 스페로이드의 노화 성대 재건 효과를 확인하기 위하여, 배양 3일차 직경 200 μm인 AD-MSC 스페로이드 35개를 hyaluronic acid hydrogel(HA gel, 1 wt%)에 고르게 혼합한 후, 25G 천자침을 이용하여 18개월의 노화 쥐(Sprague Dawley rat, 수컷)의 성대에 주입하였다. 대조군으로는 HA gel만을 주입(GEL)한 경우와 동일한 수의 단일 세포를 주입(MONO)한 경우를 준비하였다. 그리고 한달 후에 성대의 기능 재건 정도를 확인하였다. 보다 자세하게는, 성대 기능 재건 정도를 확인하기 위하여 high speed camera를 이용하여 성대의 움직임을 영상 촬영한 후 MetaMorph analysis software를 이용하여 kymographic image를 획득한 후 성대가 최대한 닫혔을 때 생기는 gap 면적 및 양쪽 성대의 맞물림(위상차; phase difference) 정도를 평가하였다. 이하, 모든 동물 실험은 서울대학교병원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 진행하였다. 그리고 이후 모든 실험은 최소 세 번 이상 반복하였으며, 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 두 개의 그룹 간에는 Student's t-test로 확인하였고, 세 개 이상의 그룹 간에는 Bonferroni's comparison test 후 one-way ANOVA를 이용하여 확인하였다. *는 P < 0.05, **는 P < 0.01, ***는 P < 0.001을 나타낸다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 줄기세포 스페로이드를 주입한 실험군(SP)에서는 성대가 완전히 닫힌 것을 확인하였으며, 반면, HA gel 또는 단일 세포를 주입한 경우에는 gap이 넓어 성대가 완전히 닫히지 않았다는 것을 확인하였다. 또한, 좌측 및 우측의 성대의 맞물림 정도를 확인한 결과에서도 줄기세포 스페로이드를 주입한 경우에만 양쪽 성대의 맞물림이 일치하는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 줄기세포 스페로이드가 조직 재생을 촉진하여 노화 성대의 기능을 재건하였다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 허혈성 하지 질환 동물 모델을 이용한 조직 손상 지연 효능 검증

허혈성 하지 질환 동물 모델을 이전 연구에서 보고된 바와 같이 제작하였다(Nat Protoc. 2009;4(12):1737-46.). 간략하게, 마우스의 피부를 통해 보이는 혈관 윤곽 바로 옆 서혜부 피부 주름에서 시작하여 외과적 피부 절개(5 mm) 후 대퇴 동맥과 정맥을 무디게 해부 및 분리하였다. 그런 다음 대퇴 동맥 아래 수술용 실을 삽입하고 삼중 수술 매듭으로 깊은 분지 기점에서 먼 대퇴 동맥을 결찰한 후 피부를 봉합하였다.

4-1. 혈관 재생 확인

도 10a에 나타낸 바와 같이 최적화된 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드가 포접된 성장인자가 배제된 마트리겔로 손상된 혈관 부위를 덮어준 다음, 이로 인해 줄기세포 스페로이드가 발현하는 신생혈관 형성 인자들이 혈관의 손상 지연 효능을 나타내는지 검증하였다. 그 결과, 도 10b 및 도 10c에 나타낸 바와 같이 이식 5일 차에는 실험군별 혈류량 측정에서 큰 차이를 보이지 않았지만, 줄기세포 스페로이드를 이식한 실험군을 제외한 모든 실험군의 동물의 발이 손상된 것을 확인하였다. 이식 10일 차에는 줄기세포 스페로이드와 2차원 배양된 줄기세포를 이식한 동물 다리에 혈류가 다시 흐르는 것을 확인하였다. 그러나, 줄기세포 스페로이드를 이식한 경우 발의 형태가 유지되고 혈류의 흐름이 회복된 반면, 2차원 배양된 줄기세포를 이식한 경우는 초기에 손상된 발의 형태가 회복되지 않았다. 이로부터, 줄기세포 스페로이드 이식을 통해 허혈성 하지 질환의 진행이 지연될 뿐만 아니라, 손상된 혈관이 재생되는 것을 확인하였다.

4-2. 근육 손상 지연 및 근육 재생 확인

근육 손상 지연 및 근육 재생 효능을 검증하기 위하여 조직병리학적 평가를 실시하였다. H&E 염색(도 10d) 및 면역염색(도 10e) 결과, 줄기세포 스페로이드를 이식한 실험군에서 아무 처리하지 않은 실험군 대비 전체 근육 단면의 면적이 넓었다. 또한, 근육 다발 하나의 단면적(cross-sectional area, CSA) 도 넓은 것을 확인하였다. 이식한 줄기세포 스페로이드의 개수가 증가할수록 근육의 단면적이 증가하는 것을 확인함에 따라, 이식한 줄기세포 스페로이드가 근육 재생을 촉진한 것을 알 수 있었다.

4-3. 신생혈관 형성 유도 확인

이식한 줄기세포 스페로이드에 의한 신생혈관 형성 유도 효능을 평가하기 위하여 CD31을 면역염색하여 혈관내피세포를 확인하였다. 그 결과, 도 10f에 나타낸 바와 같이 줄기세포 스페로이드를 이식한 실험군에서 줄기세포 스페로이드를 이식하지 않은 실험군 대비 CD31-양성 세포 면적이 넓은 것을 관찰함으로써 신생혈관 분포가 많은 것을 확인하였다. 또한, 정상 조직에 비해서도 많은 것을 고려하면, 조직 재생을 위해서 신생혈관 형성이 촉진되었고, 이는 줄기세포 스페로이드가 분비하는 신생혈관 형성 촉진인자들에 의해서 유도되었음을 알 수 있었다. 아울러, 신생혈관 형성이 촉진됨에 따라, 상기 실험예 4-2에서 확인한 줄기세포 스페로이드 이식 실험군의 근육 재생 향상 효과가 유도되었음을 알 수 있었다.

실험예 5. 피부 결손 재생 효능 검증

줄기세포 스페로이드의 피부 결손 재생 효능 검증을 위하여 Balb/c-nude 마우스(male, 13 months)를 사용하였으며, 노화 동물을 사용함에 따라 노화에 의해 자체 조직 재생 기능이 저하되어 줄기세포 스페로이드가 발현하는 생체활성인자들에 의한 조직 재생 속도 향상을 기대하였다.

노화 마우스의 등쪽 피부에 biopsy punch를 이용하여 직경 4 mm가 되는 피부 결손을 만든 후, 티씰(fibrin sealant, Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL) 처리, 2차원 배양된 줄기세포 도포 후 티씰 처리, 및 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드 도포 후 티씰을 처리하여 결손 부위를 치료해 주었다. 여기서 티씰(Tisseel)은 결손 부위를 수복해주며 결손 부위에 도포한 줄기세포 및 줄기세포 스페로이드를 결손 부위에 고정해주는 역할로 사용하였다. 치료 7일 후, 육안으로 확인한 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이 티씰만 처리한 경우 상처 부위 수축이 확인되었다. 2차원 배양된 줄기세포만 처리해준 경우 치료 7일이 경과하여도 조직이 완전히 재생되지 않음을 확인한 반면, 줄기세포 스페로이드를 처리한 경우, 티씰 실험군 대비 상처의 수축 정도가 현저히 낮았으며, 상처가 완전히 아문 것을 확인하였다. 또한, 치료 7일 후 회수한 재생된 조직을 H&E 염색한 결과, 도 11b에 나타낸 바와 같이 줄기세포 스페로이드를 처리한 경우 표피(epidermis) 층이 완전히 덮히고 두껍게 형성됨을 확인함에 따라 조직 재생의 속도가 향상되었을 뿐만 아니라 재생된 조직이 본래의 조직과 가장 유사하게 재생됨을 확인하였다.

실험예 6. 지방 재건 효능 검증

Balb/c-nude 마우스(male, 13 months)의 지방 패드(fat pad)를 절개하여 마트리겔, 2차원 배양된 줄기세포가 포접된 마트리겔, 및 줄기세포 스페로이드가 포접된 마트리겔을 각각 이식하고, 줄기세포 스페로이드의 지방 재건 효능을 검증하였다. 여기서 마트리겔은 성장인자가 감소된 마트리겔을 사용하여 줄기세포 스페로이드가 발현하는 생체활성인자에 의해 지방 재생이 유도될 수 있도록 하였다. 또한, 지방 재건 및 재생 속도가 늦은 수컷 실험동물을 사용함으로써 줄기세포 스페로이드의 지방 재건/재생 속도를 확인하였다.

마우스의 지방 패드에 각 실험군을 이식하고 14일 경과 후, 이식한 샘플들을 회수하여 조직병리학적 평가를 수행하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이 H&E 염색을 통해 융합(integration)을 확인한 결과, 2차원 배양된 줄기세포가 포접된 마트리겔 실험군에서는 이식한 줄기세포의 확인이 어려운 반면, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드가 포접된 마트리겔 실험군에서는 이식한 줄기세포 스페로이드들의 모습이 확인되었다. 또한, 지방 재건/재생을 위하여 주변 조직으로부터 이식한 각 실험군들로 지방 세포들이 이동하였는지를 Oil red O 염색을 통하여 지방 세포의 oil drop을 염색하여 확인한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 마트리겔 단독 및 2차원 배양된 줄기세포가 포접된 마트리겔을 이식한 경우 oil drop이 확인되지 않은 반면, 줄기세포 스페로이드가 포접된 마트리겔을 이식한 경우 줄기세포 스페로이드 주변에서 붉게 염색된 oil drop이 확인되었다. 이를 통해, 줄기세포 스페로이드가 발현하는 생체활성인자들이 주변의 지방 세포들의 이동을 유도하여 지방 재건/재생 유도 효능을 나타내는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (9)

1. 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생 촉진용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포, 및 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 조직은 피부, 지방, 타액선, 기관, 기도, 성대, 및 근육으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 조직공학용 지지체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포 스페로이드는 조직 재생 촉진과 관련된 생체활성인자의 발현이 향상된 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 생체활성인자는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 기질 금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs), 섬유아세포 성장인자들(fibroblast growth factors, FGFs), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈소판유래 성장인자들(Platelet-derived growth factors, PDGFs), 태반 성장인자(Placental growth factor, PlGF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 전환성장인자-베타(Transforming growth factor beta, TGF-β), 및 안지오포이에틴(Angiopoietin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포는 신생혈관 형성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포 스페로이드는 직경이 100 내지 500 μm인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
9. 줄기세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생 촉진용 세포 치료제.