KR20110029591A

KR20110029591A - 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR20110029591A
Application number: KR1020090087338A
Authority: KR
Inventors: 박경호; 길기철
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2009-09-16
Filing date: 2009-09-16
Publication date: 2011-03-23
Also published as: KR101162415B1

Abstract

본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경성장인자가 포함된 배지에 배양하는 단계를 포함하는 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포와 유모세포를 분화시키는 방법 및 상기 분화된 신경세포 및 유모세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포는 유모세포의 손상으로 야기되는 난청을 치료하기 위한 세포 대체 요법 및 재생의학 분야에 사용될 수 있는 효과가 있으며 난청 치료를 위한 신약개발의 소재로도 사용할 수 있을 뿐만 아니라 난청 치료와 관련된 기초 연구 분야에서도 널리 사용될 수 있는 효과가 있다.

제대혈, 간엽 줄기세포, 신경세포, 유모세포, 난청, 신경성장인자

Description

제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시키는 방법{Method of inducing differentiation of mesenchymal stem cell derived from umbilical cord blood into neuron and hair cell}

본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시키는 방법 및 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 들어 질환에 의해 세포가 파괴되거나 손상 받았을 경우, 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체 요법(cell replacement therapy)이 효과적인 치료법으로 제시되고 있으며, 특히 재생이 필요한 조직으로 증식 및 분화가 가능한 줄기세포(stem cell)가 각광을 받고 있다.

줄기세포란 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하며 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 말한다. 신경 줄기세포 역시 자기복제능력을 가지고 있으며, 뉴론(neuron) 또는 글리아(glia), 예컨대, 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 또는 슈반세포(Schwann cell) 등으 로 분화할 수 있는 다분화 능력을 가진 미분화 세포이며, 신경 줄기세포는 특정한 신경계 세포를 만들어내는 신경전구세포나 글리아전구세포의 단계를 거쳐서 신경세포(neural cell), 예를 들면 뉴론이나 글리아로 분화하게 된다.

한편, 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 골, 연골, 지방조직, 근육, 건, 인대, 신경조직 등으로 분화할 수 있어 세포 치료요법에 적합한 세포로 주목받고 있다. 현재 간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 가장 대표적 기원 조직으로 골수 (bone marrow)를 들 수 있다. 그러나 골수에 존재하는 간엽 줄기세포는 제한적인 분화능과 증식능력으로 인해 그 응용범위가 한정적일 수밖에 없으며, 골수로부터 유래하는 한계로 인해 여러 단계의 시술이 필요하고, 시술 과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적, 정신적 및 육체적 고통을 수반하는 것이 보통이다. 또한, 골수 이식을 위해서는 조직적합항원 비교를 통해 항원 표현형이 일치하여 이식편대 숙주반응을 보이지 않는 공여자를 찾아야 한다는 문제점이 있다.

따라서 최근에는 많은 양의 줄기세포가 제대혈에 존재한다는 사실이 알려지면서 제대혈을 이용한 세포 치료 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 임상적으로 제대혈 이식을 통해 혈액관련 질환을 치료하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있으며, 자가이식 치료를 위하여 제대혈을 냉동시켜 수년 후 사용가능한 상태로 보존하는 제대혈 은행이 국내에서도 활성화되고 있다.

제대혈은 출산시 탯줄에서 나오는 혈액으로 백혈구, 적혈구, 혈소판 등을 만드는 조혈모세포와 연골, 뼈, 근육 ,신경 등을 만들 수 있는 간엽줄기세포가 다량으로 포함되어 있어 임상적으로 그 가치가 높게 평가되고 있다. 특히, 이들 성체줄 기세포는 자가증식과 재생능력을 가지고 있으며, 특정세포로 분화가 가능한 특징을 지니고 있고(Li H, et. al., Nature Med, 9, 1293-1299, 2003, Rask-Andersen H. et al., Hearing Res., 180-191, 2005), 제대혈 이식시 나타날 수 있는 이식편대 숙주반응이 골수이식에 비해 상당히 적어 조혈기계 이상, 선천적 면역 결핍증, 자가 면역 질환 등 다양한 임상분야에서 널리 이용되고 있으며 실제로 이들 질환에 적용하였을 경우 좋은 결과들이 발표되고 있다.

또한, 제대혈 내의 조혈모세포의 경우, 다양한 성장인자를 처리하거나 기질세포와 혼합 배양 방법을 이용함으로써 조혈모세포의 세포수를 유의성 있게 증가시키는 연구결과가 다수 발표되었으나,최근 조혈 줄기세포 이외의 체질 줄기세포인 간엽계 줄기세포가 제대혈로부터 발견되었다. 또한, 지금까지는 간엽계 줄기세포는 골수 중에 존재하는 것으로만 보고되었으나, 간엽 줄기세포가 신경세포와 간세포, 표피세포 등 훨씬 광범위한 범위의 조직을 재생할 수 있어서 세계 각국에서 많은 연구들이 진행 중이다. 또한, 제대혈 유래 간엽줄기세포는 배아줄기세포를 이용한 연구의 윤리적 문제를 피할 수 있으며, 현실적으로 전신마취를 해야 하는 골수 유래 성체줄기세포와 비교하여 획득이 용이한 장점을 가지고 있다.

한편, 인체 감각의 하나인 청각이 소실될 경우, 개인적으로는 일상생활에 장애를 초래하며 사회 경제적으로는 막대한 손실을 초래한다. 난청은 청각장애만을 유발하는 것이 아니라, 언어습득 전에 심각한 난청이 발생할 경우에는 정상적인 언어발달에 지장을 받아 언어장애가 동반되어 문제가 된다. 또한, 최근에는 노인성 인구가 기하급수적으로 증가하면서 노인성 난청 환자들이 급속히 증가하고 있는데 노인성 난청은 고혈압 및 퇴행성 관절염과 함께 3대 노인성 질환 중 하나로서(Cruickshanks et al, 1998) 65세 이상 인구의 25~40%에서 발견되는 질환으로 알려져 있고(Gates et al, 1990), 노인성 난청의 대부분은 청각유모세포와 신경세포(spiral ganglion)의 퇴행성 변화로 유발되는 감각중추(sensory)형과 신경계(neural)형으로 알려져 있다.

일반적으로 포유동물에서의 내이는 이미 손상되었거나 죽은 내이의 감각 유모세포가 재생되지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 감각 유모 세포의 사멸 또는 약화로 인한 청력 이상은 전형적으로 영구 청력 장애를 일으킨다. 또한, 감각뉴론성 난청은 노화-관련 손실(노인성 난청), 소음 노출, 약물 노출(예를 들어, 항생제 및 항-암 치료),감염, 유전적 돌연변이(증후군성 및 비-증후군성) 및 자가면역 질환을 포함하는 다수의 요인들에 의해 야기될 수 있다.

현재, 감각뉴론성 난청을 위한 치료로 외부 보청기의 사용 및 와우각 이식이 사용되고 있는데, 두 가지 방법 모두는 다소 제한된 치료적 가능성만을 가진다. 또한, 최근에는 감각 내이 유모세포를 재생하는 방법이 개발되었는데, 국제특허출원 PCT/US99/24829에는 감각 유모세포를 포함하는 내이세포의 재생을 자극하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기 기술은 내이세포의 재생을 자극할 수 있도록 전사 인자를 암호화하는 내이세포 핵산 분자를 도입하는 단계를 포함하는 등 매우 복잡한 과정 및 오랜 시간이 필요하다. 따라서 신경세포 및 유모세포를 효과적으로 재생하여 난청을 치료할 수 있는 새로운 기술이 요구되고 있다.

그러나 지금까지 난청의 치료를 위해 제대혈 줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화 및 증식시킨 예가 없다.

이에 본 발명자들은 유모세포의 재생을 통해 효과적으로 난청을 치료할 수 있는 방법을 연구하던 중, 난청의 치료에 있어서 중요한 신경세포와 유모세포를 제대혈 유래의 간엽줄기세포로부터 분화시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경성장인자가 포함된 배지(medium)에서 배양하는 단계를 포함하는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포(hair cell)로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경성장인자가 포함된 배지(medium)에서 배양하는 단계를 포함하는, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포(hair cell)로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경성장인자는 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 및 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)으로 이 루어진 군 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 또는 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)은 배지(medium) 총 부피에 대하여 5ng/ml~15ng/ml의 농도로 각각 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 5일 내지 15일 동안 36~38℃의 온도 및 4~6% 이산화탄소 조건에서 수행할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지는 배지 총 부피에 대하여, B-27 첨가물(B-27 supplement) 1~3 중량%(v/v), L-글루타민 1~3mM, 및 페니실린-스트렙토마이신 0.5~2 중량%(v/v)을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 제대혈 유래 간엽 줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경세포 및 유모세포는 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 및 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 신경성장인자가 포함된 배지에서 배양함으로써 분화된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 또는 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)은 배지의 총 부피에 대하여 5ng/ml~15ng/ml의 농도로 각각 포함될 수 있다.

본 발명에 따라 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포는 유모세포의 손상으로 야기되는 난청을 치료하기 위한 세포 대체 요법 및 재생의학 분야에 사용될 수 있는 효과가 있으며, 난청 치료를 위한 신약개발의 소재로도 사용할 수 있을 뿐만 아니라 난청 치료와 관련된 기초 연구 분야에서도 널리 사용될 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경성장인자가 포함된 배지(medium)에서 배양하는 단계를 포함하는, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포(hair cell)로 분화시키는 방법을 제공함에 그 특징이 있다.

일반적으로, 제대혈 유래 단핵구 세포는 혈관내피세포, 간엽줄기세포, 신경세포, 간세포 등 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 것으로 알려졌다. 그러나 이러한 특정 세포로의 분화를 유도하는 인자에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없으며, 정확한 메커니즘도 알려져 있지 않은 상태이다. 한편, 최근 들어 제대혈에 포함되어 있는 줄기세포의 경우, 자가 증식과 재생능력을 가지고 있는 특징을 이용하여 재대혈 유래 간엽줄기세포를 이용한 세포치료 기술이 각광을 받고 있으며, 특히, 자가복제(self-renewal) 및 분화(differentiation)가 가능한 세포를 재생이 필요한 조직 및 장기에 주입하는 방법이 주목받고 있다.

따라서 본 발명자들은 난청과 같은 청각 장애 질환을 치료하기 위한 목적으 로, 지금까지 시도된 바 없는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용하여 이로부터 신경세포 및 내이 감각세포인 유모세포(hair cell)로의 분화를 시도한 결과, 제대혈로부터 분리되는 단핵구 세포 분획으로부터 간엽줄기세포를 분리하였고, 상기 간엽줄기세포를 신경성장인자가 포함된 배지에 배양하였을 경우, 신경세포 및 유모세포로 분화 유도됨을 확인할 수 있었다.

그러므로 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포( hair cell)로 분화시키는 방법을 제공할 수 있으며, 보다 구체적으로는, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경성장인자가 포함된 배지(medium)에서 배양하는 단계를 포함하는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포(hair cell)로 분화시키는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용된 “제대혈”이란 용어는 인간을 포함하는 모든 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대 정맥으로부터 채취된 혈액을 의미하며, 본 발명에서 사용된 “제대혈 유래 간엽줄기세포”는 포유동물, 바람직하게는 인간의 제대혈로부터 분리 및 배양된 간엽줄기세포를 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포( hair cell)로 분화시키는 방법은, 먼저, 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리시키고, 분리된 간엽줄기세포를 세포가 자라는 배양배지에 신경성장인자를 처리함으로써 신경세포 또는 유모세포로 각각 분화시킬 수 있다.

상기 제대혈 유래 간엽줄기세포는 제대혈로부터 간엽줄기세포를 포함하는 단핵구 세포의 분리를 통해 수득할 수 있는데, 이는 당업계에 공지된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리하는 방법이라면 모두 사용 가능하다. 바람직하게는 척추동물로부터 채취한 제대혈 세포를 밀도 구배 원심분리를 수행하여 단핵구 세포 분획을 회수한 후, 상기 단핵구 세포 분획에서 간엽줄기세포만을 분리하여 이를 배양함으로써 제대혈로부터 간엽줄기세포를 수득할 수 있다. 이때 상기 밀도 구배 원심분리는 일정한 비중을 가지는 세포 분획만을 수득할 수 있는 방법으로서, 밀도 구배 원심을 위한 용액, 예를 들면, 피콜(ficol), 퍼콜(percol) 및 히스토페이크(histopaque)와 같은 용액 내에서 세포가 그 비중에 상응한 위치를 차지하는데 충분한 시간동안 일정한 속도로 회전시키는 과정을 말한다.

또한, 상기와 같이 분리된 제대혈 유래 단핵구 세포로부터 간엽 줄기세포를 분리 및 배양하기 위해 상기 단핵구 세포를 5~15 중량%의 FBS를 함유한 동물세포 배양용 배지, 예를 들면, DMEM, 알파-DMEM, 이글스 기본 배지(Eagle's basal mediu,), RPMI 1640 배지 등에 현탁시킨 다음, 이를 적당한 농도로 상기와 동일한 조성의 배지에 분주하여 4~6% 이산화탄소가 공급되는 36~38℃ 세포 배양기에서 배양할 수 있다. 이후 배양된 세포가 단일층을 형성하면 현미경을 이용하여 스핀들(spindle) 모양으로 증폭된 간엽줄기세포를 확인한 다음, 상기 간엽줄기세포가 충분히 증폭될 때까지 계대배양을 반복할 수 있다(Yang SE et. al., Cytotherapy, 6(5), 476~486, 2004).

본 발명의 일실시예에서는, 산모의 동의하에 채취한 제대혈을 히스토페이크(histopaque)와 1:1의 비율로 섞이기 않도록 각 층을 이루게 한 다음, 2500rmp에서 20분 동안 4℃의 온도를 유지하면서 원심분리하여 제대혈로부터 단핵구 세포 분 획을 수득하였다. 이후 상기 단핵구 세포를 10% FBS가 포함된 배지에서 배양하여 부유층은 제거하고 현미경을 이용하여 배양용기의 바닥에 붙은 세포가 스핀들 모양으로 증폭된 간엽 줄기세포인지를 확인한 다음, 이를 배양함으로써 제대혈로부터 간엽줄기세포를 수득하였다.

상기와 같은 방법으로 수득한 제대혈 유래 간엽줄기세포는 이후 세포가 자라는 배양배지에 신경성장인자를 처리하고 배양함으로써 신경세포 또는 유모세포로 각각 분화시킬 수 있다.

상기에서 배양배지는 통상적으로 사용하는 동물세포 배양용 배지라면 모두 사용가능하며, 이에 제한되지는 않으나, DMEM, 알파-DMEM, 이글스 기본 배지(Eagle's basal mediu,), RPMI 1640 배지, NPBM(Neural progenitor cell basal medium: SClonetics)등을 사용할 수 있다.

또한, 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 또는 유모세포로 분화시키기 위해 본 발명에서 사용한 신경성장인자로는, 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 및 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며, 배양배지의 총 부피에 대하여 상기 각 신경성장인자는 5ng/ml~15ng/ml의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 배양은 5일 내지 15일 동안 37℃의 온도 및 5% 이산화탄소 조건에서 수행할 수 있다.

또한, 상기 배지는 배지 총 부피에 대하여, B-27 첨가물(B-27 supplement) 1~3 중량%(v/v), L-글루타민 1~3 mM, 및 페니실린-스트렙토마이신 0.5~2 중량%(v/v)을 추가로 첨가하여 포함할 수 있다.

한편, 상기 신경성장인자들 중에서, 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF)는 뇌에 가장 풍부하게 분포되어 있는 뉴로트로핀(neurotrophin)으로 신경원의 성장을 촉진하는 작용을 하고, 신경전달 물질의 합성, 대사, 유리 및 신경원의 활성을 조절하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

또한, 상기 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF) 및 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)는 아교세포와 별아교세포 및 신경세포의 성장을 촉진시키는 작용을 한다고 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 GDNF, BDNF 및 NT-3의 신경성장인자가 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포의 분화를 유도할 수 있는지 조사한 결과, 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포가 잘 분화되는 것을 확인할 수 있었고, 배양 시간이 길어질수록 분화되는 신경세포 및 유모세포의 수도 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따르면, GDNF, BDNF 및 NT-3의 신경성장인자가 포함된 배지에서 제대혈 유래 간엽줄기세포를 배양함으로써 신경세포 및 유모세포의 분화를 유도하였고, 상기 신경세포 및 유모세포의 분화를 확인하기 위해 특정 분열증식을 확인할 수 있는 Brud5로 세포들을 1차 염색한 다음, 이후 각 특징적으로 분화된 세포 확인을 위해, 아교세포(Glial cells) 표지자로 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)를 , 희돌기교 세포의 표지자로 S-100을, 신경세포의 표지자로 베타 Ⅲ-튜불린, NF(Neurofilamen) 및 MAP2(Microtubul-Associated Protein2)를, 신경계원종 표지자로 네스틴(nestin)을 및 유모세포의 표지자로 미오신(myosin) ⅦA 및 TRPA1을 사용하여 이중 염색을 통한 형광면역분석법을 수행하였다. 그런 뒤, 염색된 각 세포들을 현미경을 통해 확인한 결과, 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 세포들이 아교세포의 표지자인 S100 및 GFAP으로 60%~80%가 염색되었고, 유모세포의 표지자인 미오신 ⅦA 및 TRPA1으로 50%~75%가 염색된 것으로 나타났다(도 2 내지 도 5 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, GDNF, BDNF 및 NT-3의 신경성장인자가 포함된 배지에서 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포의 분화를 유도한 후, 각 특정 세포를 인식하는 표지자에 해당하는 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행함으로써 신경세포 및 유모세포의 분화 및 발현 정도를 조사하였다. 그 결과, 아교세포의 표지자인 S-100 및 GFAP는 배양 후 7일 만에 발현된 것을 확인할 수 있었으며, 배양 시간이 증가될수록 발현양도 증가되는 것으로 나타났다. 또한, 유모세포의 표지자인 미오신 ⅦA 및 TRPA1의 경우도 발현된 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경성장인자가 포함된 배지(medium), 즉, GDNF, BDNF 또는 NT-3가 포함된 배지에서 배양할 경우, 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시킬 수 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경계 세포 전구체 의 분화를 유도하였다. 구체적으로, 상기 신경계 세포 전구체로의 분화는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 상기 세포를 배양하는 배지에 상피세포 성장인자인 EGF 및 기질섬유세포 성장인자인 bFGF를 첨가하고 배양시킴으로써 분화를 유도하였다.

상기 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경계 세포 전구체의 분화를 유도하기 위하여 사용한 성장인자인 상피세포 성장인자(EGF : epidermal growth factor)는 턱밑샘(submaxillary glands)과 브루너선(brunner‘s gland)에서 유래된 것으로서, 간엽줄기세포와 아교세포 등의 분화를 증진시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 인체 내의 대부분에서 얻을 수 있는 기질섬유세포 성장인자인 bFGF는 상처 치유와 세포의 분화를 증진시키는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 통상의 동물세포 배지로 사용되는 DMEM 배지에 10ng/ml의 EGF 및 20ng/ml bFGF를 첨가하여 배양한 다음, 분화된 신경계 세포 전구체를 신경계 원종표지자인 네스틴(nestin)을 사용하여 면역형광 분석을 수행한 결과, 90% 이상이 염색된 것으로 나타났고(도 2 참조), 또한, 신경줄기세포 표지자인 네스틴(nestin), BMP4 및 BMP7의 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용한 RT-PCT 실험을 통해서도 상기 표지자의 유전자들이 분화된 신경계 세포 전구체에서 모두 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

따라서 상기와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 EGF 또는 bFGF이 첨가된 배지에서 배양할 경우, 신경계 세포 전구체로 분화되는 것을 알 수 있었고, 반면, GDNF, BDNF 또는 NT-3가 첨가된 배지에서 배양할 경우에는 신경세포 및 유모세포로 분화되는 것을 알 수 있었다.

한편, 난청은 전 세계적으로 가장 흔한 질환으로서 65세 이후의 노인의 경우, 약 30% 정도는 이러한 난청으로 일상생활에서 많은 어려움을 겪고 있다. 이러한 난청이 발생하게 되면 구심로의 차단에 따른 말초감각신경세포인 유모세포가 소실되고 이와 더불어 청각신경세포와 와우신경절의 세포들도 시간 경과에 따라 소실되는 현상이 나타난다. 이에 난청을 개선 및 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 방법으로는 난청환자에 대해 보청기를 착용하게 하거나 또는 인공와우이식 수술을 통해 환자들로 하여금 도움을 주고 있으나 인공와우이식 대상자 중에서도 와우신경절의 신경원세포의 발달이 저하되어 있거나 장기간의 난청으로 퇴화되어 있는 경우 인공와우이식술을 시행하여도 청력이 완전히 회복되기에는 한계가 있다.

따라서 이러한 한계를 극복하기 위해서 청력 회복을 위한 신경세포 치료 개념이 대두되고 있는데, 특히 난청의 원인이 되는 말초감각신경세포인 유모세포를 재생할 수 있다면 난청을 보다 근원적으로 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포로 분화시키는 방법은 난청의 원인이 되는 청각 감각세포인 유모세포를 분화 및 재생시키는 효과가 있으므로 난청을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있다.

그러므로 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 조성물은 난청의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 “난청”은 청각기관의 장애로 인해 청력이 저하 또는 소실된 상태를 말하는 것으로서, 크게 증후군(syndromic) 및 비증후군(nonsyndromic) 형태를 모두 포함할 수 있다. 상기 증후군 형태는 다시 3 가지로 더 세분화 할 수 있는데, 즉, 1) 청각장애와 관련된 감각신경 성분을 갖거나 갖지 않는 중이 및 외이 결함으로 인한 전음성 난청, 2) 청각장애와 관련된 감각신경 성분을 갖거나 갖지 않는 중이 결함으로 인한 전음성 난청, 및 3) 와우(cochlear) 또는 후미로(retrocochlear) 결함으로 인한 감각신경성 난청으로 나눌 수 있다. 또한, 상기 비증후군은 유전성 난청을 의미하는 것으로서 그들의 유전 양식에 따라 DFN, DFNA 및 DFNB로 분류될 수 있으며, 이들은 각각 X 염색체-연관, 상염색체 우성 및 상염색체 열성 전달 양식을 의미한다.

본 발명에 따른 난청의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 난청을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 난청의 증상 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 난청의 예방 또는 치료용 조성물은 난청을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.

따라서 본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 난청의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

제대혈 유래 간엽줄기세포의 분리 및 배양

본 발명에서 수행한 하기의 실험들은 IRB의 승인(임상 연구 관리의 규정 KC08CIMI0344)을 준수하여 수행하였으며, 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리하기 위해 먼저 산모의 동의하에 채취된 제대혈 (Umbilical Cord Blood)을 헤파린이 처리된 혈액저장용기에 보관하였다. 총 18개의 제대혈 시료 중 16개의 시료에서 간엽줄기세포만을 분리할 수 있었는데, 이를 위해 먼저 히스토페이크(histopaque; 시그마 알드리치, ST Louis, MO)를 이용한 기울기 원심분리(centrifuge gradient)법으로 단핵세포를 추출하였다. 이때 히스토페이크와 제대혈의 비율은 1:1로 하였으며 히스토페이크를 먼저 25㎖ 넣고 그 위에 혈액을 히스토페이크와 섞이지 않게 조심스럽게 띠운 다음 원심분리기를 이용하여 분리하였다. 또한 상기 원심분리는 2500rpm에서 20분 동안 4℃를 유지하며 수행하였다. 이후 원심분리된 튜브에서 혈청부분은 제거하고 혈청부분과 적혈구 층의 중간부분에 뽀얗게 생긴 단핵세포층을 채취하여 56℃에서 30분 동안 불활성 된 10％ 소태아혈청(Fetal Bovine Serum , Invitrogen, Grand Island, NY)과 1％의 페니실린-스트렙토마이신(P/S, Gibco, Grand Island, NY)이 함유된 최소 필수 배지 알파(MEM-alpha, (-)glucose, Gibco)에서 상기 분리된 단핵세포를 배양하였다. 배양 5일 후 부유(suspension)층은 제거하고 배양 디쉬(dish)에 붙은 세포를 현미경을 이용하여 스핀들 모양으로 증폭된 간엽줄기세포를 확인한 다음, 상기 간엽줄기세포만을 세척하여 10％ FBS와 1％의 P/S가 함유된 최소 필수 배지 알파((+)glucose, Gibco)에서 배양하였으며, 배양액은 3일 마다 교체하였고 3세대까지 계대 배양하여 수득한 간엽줄기세포만을 다음의 실험에 사용하였다.

< 실시예 2>

유세포 분석기를 이용한 간엽줄기세포의 확인

상기 실시예 1에서 제대혈로부터 얻어진 세포가 간엽줄기세포임을 확인하기 위하여 인간 간엽줄기세포의 표면 표지자(cell surface maker)를 사용하였다. 조혈모세포의 표지자인 CD34(-)와 CD45(-), 간엽줄기세포의 표면 표지자로 알려진 CD73(+), CD90(+), CD105(+), CD 166(+) 및 조직적합성 항원 HLA 표지자를 사용하여 확인하였다. 먼저 실시예 1에서 3회 계대배양 된 제대혈의 단핵세포를 계수하여 1×10⁶세포수/㎖로 시험관에 분주하고, 세척완충액(0.2% BSA, 0.1% NAN₃, 0.5mM EDTA)으로 3회 세척한 다음, Fluorescein Isothicyanate(FITC)와 Phycoerythrin (PE)가 접합되어 있는 CD34(Serotec Ltd., Station Approach, Kidlington, Oxford, UK), CD45(Serotec Ltd.), CD73, CD90, CD105, CD166(BD Biosceince, San Jose, CA) 항체를 1시간 동안 처리하였고, 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 유세포 분석기(FACS Caliber, Becton Dickson, San Diego, CA) 장비를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 제대혈로부터 유래한 세포가 간엽줄기세포임을 확인하기 위해 세포 표면에 특정 표지자를 붙여 확인한 결과, 조혈모세포의 표지자인 CD34 및 CD45는 거의 100% 음성으로 확인되었고, 간엽줄기세포의 표지자인 CD73의 표면 표지자의 경우는 98.68%, CD90의 표면 표지자에서는 100%, CD105의 표면 표지자는 13.33%, CD166의 표면 표지자는 20.48%로 양성반응을 확인할 수 있었다. 또한 조직 적합성 항원인 HLA 표면 표지자에 대하여 거의 100% 음성을 나타냄으로써 제대혈로부터 유래된 간엽줄기세포가 인체 적합성에 있어서 면역학적인 부분에 문제점이 없다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경계 세포 전구체와 유모세포 및 신경세포로의 분화

상기 실시예 1에서 분리 및 배양한 제대혈 유래의 간엽줄기세포는 하기와 같은 방법으로 신경계 세포 전구체와 유모세포 및 신경세포로 분화시켰다.

<3-1> 신경계 세포 전구체로의 분화

제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경계 세포 전구체로 분화시키기 위해 상기 간엽줄기세포의 배양 배지에 신경성장인자를 처리함으로써 신경계 세포전구체로 분화를 유도하였으며, 이때 신경계 세포전구체로의 분화를 위해 상기 배양배지에 20ng/㎖의 EGF(Invitrogen) 및 10ng/㎖의 bFGF(Invitrogen)를 처리하였고, 상기 인자들이 포함된 배지에서 14일 동안 배양하였으며, 3일 간격으로 10ng/㎖의 bFGF를 배양액에 3회 첨가하여 배앙하였다. 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경계 세포 전구체로의 분화를 위한 배지의 조성은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

<3-2> 유모세포와 신경세포로의 분화

제대혈 유래 간엽줄기세포를 유모세포와 신경세포의 분화로 분화시키기 위해 상기 실시예 <3-1>에서 사용한 신경계 세포전구체 배양배지와는 다르게 조성을 바꾸어 유도하였다. 기본 배지는 당업계에서 사용되는 신경세포 배양배지(neurobasal medium)를 사용하였고, 신경성장인자로는 교아세포유래 신경성장인자(GDNF, Invitrogen), 뇌유래 신경영양인자(BDNF,. Invitrogen) 및 뉴로트로핀-3(NT-3, Invitrogen)의 신경계통 성장인자들을 사용하였으며, 유모세포와 신경세포의 분화를 위해 사용된 배지의 조성은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

신경계 세포 전구체와 유모세포 및 신경세포로의 분화용 배양배지

신경계 세포 전구체 배양배지 (총 부피: 50)	유모세포 및 신경세포 배양배지 (총 부피: 50)
DMEM:F12 (1: 1)	Neurobasal Medium
B-27 supplement 1	B-27 supplement 1
L-Glutamine 2mM	L-Glutamine 2mM
EGF 10ng/	GDNF 10ng/
bFGF 20ng/	BDNF 10ng/
Penicilin-Streptomycin 1%	NT3 10ng/
	Penicilin-Streptomycin 1%

< 실시예 4>

면역형광염색법을 이용한 신경계 세포전구체와 유모세포 및 신경세포로의 발현 분석

상기 실시예 3의 방법으로 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화시켜 수득한 신경계 세포전구체와 유모세포 및 신경세포를 대상으로 분화된 지 7일 및 14일에 각각 면역형광염색법을 수행하여 분화된 세포가 신경계 세포전구체와 유모세포 및 신경세포인지를 확인하였다. 먼저 특정 분열증식을 확인하기 위하여 증식하는 세포의 표지자로 알려진 BrdU(5-Bromo-2'-deoxy-uridine Labeling and Detection Kit, Roche, Indianapolis, IN)를 사용하여 24시간 동안 BrdU를 세포에 표지(labeling) 하였다. 이때 세척용 버퍼로 3%의 BSA(Bovine Serum Albumin, Ogilvie ST Essendon, Australia)가 포함된 PBS 용액을 사용하였으며, 표지된 세포를 3회 세척하였다. 이후 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정시켰고, 0.5% 트리톤 X-100 (Promega Corporation, Medison, WI)으로 상온에서 20분간 처리하였다. 그런 뒤, 1차 항체인 항-BrdU 워킹 용액(1:10)을 12시간 이상 처리하였고, 3% BSA가 포함된 PBS로 다시 3회 세척하였다. 이후, 2차 항체인 항-마우스-Ig-Fluorescein 워킹 용액(1:10)으로 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 다음으로 5% 정상의 염소 혈청으로 블록킹(blocking)을 하고 각각 특징적으로 분화된 세포의 특정 표지자, 즉, 아교세포(Glial cells) 표지자로는 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein, Abcam, Cambridge, UK) 및 S-100 (Abcam), 신경세포의 표지자로는 ßⅢ-tubulin(Abcam), NF (Neurofilamen, Abcam) 및 MAP2(Microtubul-Associated Protein2, Abcam), 신경계원종 표지자로는 nestin(Abcam) 및 유모세포의 표지자로는 myosin ⅦA (Abcam)과 TRPA1 (Tahoe Regional Planning Agency, Abcam)를 사용하여 이중 염색하였다. 이때 이중 염색하는 1차 항체들은 모두 밤새도록 반응시켰고, 3% BSA가 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 2차 항체인 Alexa 555는 1:100의 비율로 상온에서 1시간동안 처리한 후 발현유무를 확인하였다. 또한, 핵의 염색을 위해서는 DAPI가 접합된 마운팅 배지 (Vectashild, Burlingame, CA)로 마운팅(mounting) 하였다. 발현은 형광 부착된 마이크로스코프(Olympus, Japan)을 이용하여 각 세포를 확인하였고, 전체 세포수 당 발현된 세포수로 계수하였으며, 결과는 도 2 내지 도 5에 나타내었다.

그 결과, 신경계 세포 전구체의 경우, 배양 1주가 경과하자 구형의 형상을 띠었고 2주 및 3주가 경과함에 따라 구형의 형상이 점차 커지는 것으로 나타났으며(도 2a 참조), 구형의 크기는 대략 50um~150um의 크기였다. 그러나 신경계 세포 전구체의 크기는 3주가 경과하자 더 이상 크기가 커지지 않는 것으로 나타났다.

또한, 신경계 계통의 특정 표지자인 GFAP, S100, ßⅢ-tubulin, NF, MAP2, nestin, myosin ⅦA, TRPA1를 사용하여 상기 구형의 세포들이 신경계 세포 전구체인지 면역형광 염색법으로 확인한 결과, 신경계 세포 전구체에 대하여 신경계 원종표지자인 nestin에서는 90% 이상이 염색되었으며 아교세포의 표지자인 S100과 GFAP는 60%~80%, 유모세포의 표지자인 myosin ⅦA와 TRPA1에서는 50%~75%의 구형이 염색되었다(도 2b~2v). 반면, 신경세포의 표지자인 ßⅢ-tubulin 에서는 구형의 형상을 확인할 수 없었다(도 2w~2y). 또한 NF와 MAP2도 염색되지 않았다(결과 미도시).

유모세포의 경우, 일반적으로 유모세포는 긴 운동모(kinocilium)와 부동모(stereocilia)를 특징으로 하는데, 배양 후 7일에서는 운동모를 확인할 수 없었으나(도 3a~3h), 14일에서는 긴 운동모와 부동모의 형성을 확인할 수 있었다(도 3i~3p). 또한, 유모세포 표지자인 myosin ⅦA 및 TRPA1을 이용한 이중염색법 결과, 배양 7일에는 유모세포의 특정 표지자를 확인할 수 없었으나(도 3a~3h), 세포의 특정분열이 증식 중이라고 판단되어지는 BrdU는 이중형광염색법으로 확인되어졌다(도 3b 및 3f). 또한, 유모세포는 7일째와는 다르게 14일째에는 유모세포의 형태를 취하는 운동모와 부동모를 확인할 수 있었고(도 3i~3p), 특히 14일에는 유모세포에서 BrdU가 염색되었고(Fig. 3j 및 3n), 유모세포의 표지자인 myosin ⅦA와 TRPA1는 5x10³개의 세포 중에서 250개(±100) 즉, 전체 신경세포 배양 배지 내의 5% 내외로 분화됨을 확인할 수 있었다(도 3i~3p).

또한, 신경세포는 축삭돌기(exon)와 수상돌기(dendrite)의 성장된 모습이 두드러지는 특징을 가지는데 배양 후 7일과 14일 모두에서 축삭돌기 및 수상돌기가 확연하게 발달되어 있는 것으로 나타났으며, 특히 7일과 비교하여 세포의 양이 증가하지는 않았으나 14일의 경우 축삭돌기와 수상돌기가 더욱 발달됨을 확인할 수 있었다 (도 4m~4x). 신경세포는 또한 BrdU가 염색이 되었고(도 4b, 4f, 4j, 4n, 4r, 4v), 신경세포의 특정표지자인 MAP2(도 4c 및 4o), NF (도 4g 및 4s)와 ßⅢ-tubulin (도 4k 및 4w)가 모두 발현되었으며, 축삭돌기와 수상돌기는 7일에 비하여 14일에서 더 많이 발달되었다(도 4m~4x). 또한 배양 후 14일에는 전체 세포 중 신경세포로 분화되어지는 세포는 각 웰 당 5x10³개의 세포 중에서 MAP2는 550개(± 100)인 11%, NF는 650개(±100)인 13%, ßⅢ-tubulin은 600개(±100)인 12%의 비율로 분화 양상을 보였다.

나아가, 아교세포의 경우 축삭(exon) 주변으로 수초(myelin sheath)를 형성하여 신경세포의 생존과 재생을 돕는 것이 특징인데, 이 세포 역시 BrdU로 염색된 것이 확인되었고 (도 5b, 5f, 5j, 5n, 5r, 5v), 신경계원종 표지자인 nestin (도 5a~5d, 5m~5p), 아교세포의 표지자인 S-100(도 5e~5h, 5q~5t), GFAP(도 5i~5l, 5u~5x)도 모두가 발현되었다. 또한, 배양 후 7일에 비하여 14일에는 축삭주변으로 수초가 더 길어진 것을 확인할 수 있었고, 아교세포로의 분화는 유모세포와 신경세포로의 분화보다 큰 폭으로 분화가 이루어 졌음을 확인할 수 있었다. 배양 후 14일의 경우, GFAP는 5x10³개의 세포 중 3000(±100)인 약 60%, S100은 3750개(±100)으로 75% 이상이 발현됨으로써 신경세포 배지 내에서 아교세포가 60%~80% 가까이 분화가 되고 있음을 확인하였다. 또한 신경계 원종표지자인 nestin은 1250개(±100)인 25%로 확인하였다.

따라서 상기와 같은 결과를 통해 본 발명에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경계 세포전구체와 유모세포 및 신경세포가 모두 잘 분화된 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

RT-PCR을 이용한 신경계 세포전구체와 유모세포 및 신경세포로의 발현 확인

상기 실시예 3에서 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 분화시킨 신경계 세포전구체와 유모세포 및 신경세포를 대상으로 RT-PCR을 통해 신경계 세포전구체와 유모세포 및 신경세포로 분화된 세포들이 시간이 경과함에 따라 분화정도가 증가하는지를 확인하였다. 즉, 이를 위해 분화 후 7일 및 14일째의 세포들 각각으로부터 RNA를 추출하고 역전자(Reverse Transcription) 과정을 거쳐 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이를 위해 먼저, 배양된 세포들은 AXYGEN RNA 미니추출 키트(Axygen Scientific, Inc, Union City, CA)를 사용하여 RNA를 분리하였고, 분리한 RNA는 RT 프리믹스 키트(Intron Biotechnology, Sungnam, Korea)를 사용하여 42℃에서 60분간, 95℃에서 5분간 역전사 반응을 거쳐 각각의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 100ng으로 정량한 뒤, RT-PCR 프리믹스(Bioneer, Deajeon, Korea)를 사용하여 GFAP, S100, MAP2, NF, ßⅢ-tubulin, nestin, BMP4(Bone Morphology Protein 4), BMP7, myosin ⅦA, TRPA1의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 94℃에서 5분간 DNA를 변성(denature)시키고 각각의 유전자의 결합온도 (annealing temperature)에서 30초간 반응시킨 다음, 72℃에서 5분간 DNA의 합성 (polymerization)과 신장반응(extension)을 수행하였다. 이때 사용한 상기 프라이머들의 서열은 하기 표 2에 기재하였고, 각 반응에서 대조군으로 house keeping 유전자인 GAPDH(GlycerAldehyde-3-Phosphate DeHydrogenase)를 사용하였다. 이후 2%의 아가로즈 겔을 이용한 전기영동으로 각 유전자의 발현을 확인하였다. 이후 발현된 유전자는 이미지 분석 시스템(Bio-Rad, Herculesus, CA)를 이용하여 증폭된 DNA를 확인하였다.

프라이머의 서열 및 PCT 조건

유전자	서열 (5'-3')		어닐링 온도(℃)	크기 ( bp )	서열번호
GAPDH	F	ctactggcgctgcaaaggctgt	54	357	1
	R	gccatgaggtccaccaccctgt			2
Nestin	F	aacaggaccaagagacattg	56	211	3
	R	tttactgcctctacgctctc			4
S-100	F	ctttaaatgcgttcctcatc	51	156	5
	R	ttctgatggagttgcttttt			6
GFAP	F	tttctaaaggcctcttcctt	56	192	7
	R	ctgggtacattttgtgtgtg			8
BMP4	F	agtgaaaactctgcttttcg	53	217	9
	R	ccagtctcgtgtccagtagt			10
BMP7	F	caacgtcatcctgaagaaat	50.9	217	11
	R	atatgctgctcatgttttct			12
ßⅢ-Tubulin	F	aagttttggagagggaaatc	54.5	188	13
	R	agggaggtagagttggaaag			14
Myosin A	F	tacatcgacatccacttcaa	54.5	154	15
	R	tctgatcctcactcataccc			16
MAP2	F	atttatcaggggagagtggt	53	177	17
	R	cctgatttgtcaccagagat			18
TRPA1	F	ctccatctggcagcaaagaa	56.5	210	19
	R	tgcagtgttcccgtcttcat			20
NF	F	caaagaagaggggaagccac	55	258	21
	R	tttcatctgctgggctcaag			22

그 결과, 줄기세포의 표지자인 nestin, BMP4, BMP7과 아교세포의 표지자인 S-100 및 GFAP가 배양 후 7일에서 구형 및 신경세포 배지 처리군 모두에서 발현된 것으로 나타났으며, 14일에서는 그 발현양이 더 증가된 것으로 나타났다. 또한, 신경계 세포의 표지자인 MAP2, NF, ßⅢ-tubulin과 유모세포의 표지자인 Myosin ⅦA, TRPA1은 배양 후 7일의 경우 신경세포 배지 처리 군에서만 발현되었으나, 14일에는 구형 및 신경세포 배지 처리 군 모두에서 발현되는 것으로 나타났다(도 6 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경계 세포전구체와 유모세포 및 신경세포가 모두 잘 분화된 것을 알 수 있었으며, 또한 시간이 경과할수록 분화 정도가 더 증가한다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1은 세포 표면의 특정 표지자들을 이용한 FACS 분석법을 통하여 제대혈로부터 분리된 세포가 간엽줄기세포인지를 확인한 결과로서, A 및 B는 표지자로 CD34 및 CD45를 사용한 것이고, C 내지 F는 CD90, CD105, CD73 및 CD166을 사용한 것이며, G는 인간의 조직 적합성 항원인 HLA를 사용한 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포의 분화 및 발현을 형광염색법을 통해 확인한 결과로서, A는 정형적인 구형의 콜로니 이미지를 나타낸 것이고, B~D는 형광표지자로 네스틴(nestin)을, E~G는 형광표지자로 GFAP를, H~J는 MBP를, K~M은 S-100을, N~P는 미오신 VIIA를, Q~S는 TRPA1을, T~V는 BrdU를, W~Y는 베타 III-튜불린을 사용한 것이다.

도 3은 유모세포의 발현을 확인하기 위해 BrdU 및 미오신 VIIA와 TRPA1의 표지자를 이용하여 이중-표지 면역형광법을 수행한 결과로서, A~H는 7일간 배양한 것을 나타낸 것이고, I~P는 14일간 배양하여 분화시킨 것을 나타낸 것이다.

도 4는 신경세포의 발현을 확인하기 위해 BrdU, MAP2, NF 및 베타 III-튜불린의 표지자를 이용하여 이중-표지 면역형광법을 수행한 결과로서, A~L은 7일간 배양한 것을 나타낸 것이고, M~X는 14일간 배양하여 분화시킨 것을 나타낸 것이며, A~D 및 M~P는 MAP2를 사용한 것이고, E~H 및 Q~T는 NF를, I~L 및 U~X는 베타 III-튜불린을 사용한 것이다.

도 5는 아교세포의 발현을 확인하기 위해 BrdU, 네스틴, S-100 및 GFAP의 표지자를 이용하여 이중-표지 면역형광법을 수행한 결과로서, A~L은 7일간 배양한 것 을 나타낸 것이고, M~X는 14일간 배양하여 분화시킨 것을 나타낸 것이며, A~D 및 M~P는 네스틴을 사용한 것이고, E~H 및 Q~T는 S-100을 사용한 것이며, I~L 및 U~X는 GFAP를 사용한 것이다.

도 6은 본 발명에 따른 방법으로 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포와 신경계 세포 전구체의 분화 및 발현을 RT-PCR 방법을 수행하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.

Claims

제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경성장인자가 포함된 배지(medium)에서 배양하는 단계를 포함하는, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포(hair cell)로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서,

상기 신경성장인자는 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 및 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포로 분화시키는 방법.
제2항에 있어서,

상기 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 또는 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)은 배지(medium) 총 부피에 대하여 5ng/ml~15ng/ml의 농도로 각각 포함되는 것을 특징으로 하는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서,

상기 배양은 5일 내지 15일 동안 36~38℃의 온도 및 4~6% 이산화탄소 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서,

상기 배지는 배지 총 부피에 대하여 B-27 첨가물(B-27 supplement) 1~3 중량%(v/v), L-글루타민 1~3 mM 및 페니실린-스트렙토마이신 0.5~2 중량%(v/v)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 신경세포 및 유모세포로 분화시키는 방법.
제대혈 유래 간엽 줄기세포로부터 분화된 신경세포 및 유모세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서,

상기 신경세포 및 유모세포는 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 및 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 신경성장인자가 포함된 배지에서 배양함으로써 분화된 것을 특징으로 하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물.
제7항에 있어서,

상기 교아세포유래 신경성장인자(Grial-derived neurotprophin factor: GDNF), 뇌유래 신경영양인자(Brain-derived neutrophin factor: BDNF) 또는 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3: NT-3)은 배지의 총 부피에 대하여 5ng/ml~15ng/ml의 농도로 각각 포함되는 것을 특징으로 하는 난청의 예방 또는 치료용 조성물.