KR20130012552A

KR20130012552A - 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물 및 이의 이식 방법

Info

Publication number: KR20130012552A
Application number: KR1020120077889A
Authority: KR
Inventors: 박경호
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2012-07-17
Publication date: 2013-02-04

Abstract

본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물 및 이의 이식 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 제대혈 또는 태반으로부터 유래된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물 및 줄기세포를 질환 부위와 직접 접촉하지 않는 혈관 내에 주입하는 단계를 포함하는 난청 치료를 위한 세포치료제의 이식 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 난청을 치료 및 예방하기 위한 세포치료제의 이식 방법은 종래 수술적 요법에 의한 이식 과정 없이 단지 혈관 내로 세포치료제를 주입하는 간단한 방법만으로도 줄기세포가 병변 부위로 잘 전달되고 생착되어 난청을 효과적으로 치료 및 개선할 수 있는 효과가 있다.

Description

줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물 및 이의 이식 방법{Cell therapy compisition for treating and preventing hearing loss comprising stem cell and method for implanting thereof}

본 발명은 난청을 치료 및 개선할 수 있는 세포 치료제의 이식 방법에 관한 것으로서, 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물 및 이의 이식 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4~5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.

성체 줄기세포는 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 채취, 줄기세포를 발전시킨 것으로 특정 조직으로만 분화되는 특징이 있다. 그러나 최근에는 성체 줄기세포를 이용, 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다.

특히, 병이나 사고에 의한 기능 장애나 부조화에 빠진 생체 조직 및 장기의 재생 및 기능 회복을 위해 세포를 적극적으로 활용하여 실시하는 치료법인 재생 의료에 있어서, 세포 치료를 이식하는 방법이 많이 이용되고 있다. 한편, 종래 사용되고 있는 세포 이식의 경우, 수술을 통한 방법이 주로 사용되고 있어 환자의 불편함과 많은 비용이 든다는 점을 감안할 때, 수술 방법이 아닌 다른 방법에 의한 이식 기술 개발이 필요하다.

한편, 인체 감각의 하나인 청각이 소실될 경우, 개인적으로는 일상생활에 장애를 초래하며 사회 경제적으로는 막대한 손실을 초래한다. 난청은 청각장애만을 유발하는 것이 아니라, 언어습득 전에 심각한 난청이 발생할 경우에는 정상적인 언어발달에 지장을 받아 언어장애가 동반되어 문제가 된다. 또한, 최근에는 노인성 인구가 기하급수적으로 증가하면서 노인성 난청 환자들이 급속히 증가하고 있는데 노인성 난청은 고혈압 및 퇴행성 관절염과 함께 3대 노인성 질환 중 하나로서(Cruickshanks et al, 1998) 65세 이상 인구의 25~40%에서 발견되는 질환으로 알려져 있고(Gates et al, 1990), 노인성 난청의 대부분은 청각유모세포와 신경세포(spiralg anglion)의 퇴행성 변화로 유발되는 감각중추(sensory)형과 신경계(neural)형으로 알려져 있다.

일반적으로 포유동물에서의 내이는 이미 손상되었거나 죽은 내이의 감각 유모세포가 재생되지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 감각 유모 세포의 사멸 또는 약화로 인한 청력 이상은 전형적으로 영구 청력 장애를 일으킨다. 또한, 감각뉴론성 난청은 노화-관련 손실(노인성 난청), 소음 노출, 약물 노출(예를 들어, 항생제 및 항-암 치료),감염, 유전적 돌연변이(증후군성 및 비-증후군성) 및 자가면역 질환을 포함하는 다수의 요인들에 의해 야기될 수 있다.

현재, 감각뉴론성 난청을 위한 치료로 외부 보청기의 사용 및 와우각 이식이 사용되고 있는데, 두 가지 방법 모두는 다소 제한된 치료적 가능성만을 가진다. 또한, 최근에는 감각 내이 유모세포를 재생하는 방법이 개발되었는데, 국제특허출원 PCT/US99/24829에는 감각 유모세포를 포함하는 내이세포의 재생을 자극하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기 기술은 내이세포의 재생을 자극할 수 있도록 전사 인자를 암호화하는 내이세포 핵산 분자를 도입하는 단계를 포함하는 등 매우 복잡한 과정 및 오랜 시간이 필요하다.

따라서 간편하고 저렴한 비용으로 난청을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 기술이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 난청의 치료 효과를 높이면서 수술 방법 없이도 용이하게 치료할 수 있는 새로운 치료 방법을 고안하던 중, 줄기세포를 혈관 내 주입하는 간단한 방법만으로도 난청을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 목적은 난청 치료를 위한 세포 치료제의 이식 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 제대혈 또는 태반으로부터 유래된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 줄기세포를 질환 부위와 직접 접촉하지 않는 혈관 내에 주입하는 단계를 포함하는 난청 치료를 위한 세포치료제의 이식 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 제대혈 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 제대혈 유래 간엽줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 태반 양막 유래 간엽줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 100,000개 ~ 1,000,000개의 줄기세포를 혈관 내로 주입하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 혈관 내로 주입되면 난청이 유발된 내이에서 청각 재생 작용을 하는 나선신경절(spiral ganglion) 및 코리트기관(organ of corti)에 생착되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 신경세포 및 유모세포(hair cell)로 분화될 수 있다.

또한, 본 발명은 제대혈 또는 태반으로부터 유래된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈관 내에 주입하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 100,000개 ~ 1,000,000개의 줄기세포를 포함하고 있는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 난청을 치료 및 예방하기 위한 세포치료제의 이식 방법은 종래 병변 부위로 수술적 요법에 의한 직접이식 과정 없이 단지 혈관 내로 세포치료제를 주입하는 간단한 방법 만으로도 주입된 줄기세포가 병변 부위로 잘 전달되고 생착되어 난청을 효과적으로 치료 및 개선할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 제대혈로부터 분리된 단핵세포를 배양한 모습을 현미경을 통해 관찰한 사진으로서 계대 배양의 횟수가 증가할수록 세포의 모양이 길어짐을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 유세포 분석기를 사용하여 제대혈로부터 분리 배양한 세포들의 세포 표면 항원을 조사한 결과로서, 간엽줄기세포의 항원인 CD73, CD90에 대해서는 양성반응을 보였고, 조혈모세포의 표지자인 CD34, CD45에 대해서는 표면항원 반응을 보이지 않은 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 3회 계대 배양된 간엽줄기세포를 신경계 세포 전구체로 분화시켰을 경우 세포의 형태 및 신경계 전구 세포 표지자를 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 난청 유도 물질을 동물 모델에 주입하기 이전과 주입 후 ABR 검사로 난청이 잘 유도되었는지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 PHK-26이 표지된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈관 내 주입 후 내이로 전달되었는지를 면역화학염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서 PHK-26이 표지된 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈관 내 주입 후 와우 내에 생착되었는지의 여부를 면역화학염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7A는 양막으로부터 분리된 단핵세포를 배양한 모습을 현미경을 통해 관찰한 사진이며, 도 7B는 제대혈로부터 분리된 단핵세포를 배양한 모습을 현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 8은 유세포분석기를 사용하여 제대혈로부터 분리 배양한 세포들의 세포 표면 항원을 조사한 결과로서, 간엽줄기세포의 항원인 CD73, CD90 및 CD105에 대해서는 양성반응을 보였고, 조혈모세포의 표지자인 CD34, CD14, CD19 및 HLA에 대해서는 표면항원 반응을 보이지 않은 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 제대혈 줄기세포를 마취 유도 후 기니아 피그의 꼬리 정맥 혈관 내에 주입한 뒤 1주 및 3주가 되는 각각의 시기에 ABR을 이용하여 청력 개선 정도를 확인한 결과이다.
도 10은 양막 줄기세포를 마취 유도 후 기니아 피그의 꼬리 정맥 혈관 내에 주입한 뒤 1주 및 3주가 되는 각각의 시기에 ABR을 이용하여 청력 개선 정도를 확인한 결과이다.

본 발명은 난청을 치료하기 위한 새로운 방법을 제공한다는 점에 특징이 있는데, 즉, 줄기세포를 혈관 내에 주입하는 간단한 방법만으로도 난청을 치료할 수 있다는 사실을 확인하였다.

따라서 본 발명은 줄기세포를 질환 부위와 직접 접촉하지 않는 혈관 내에 주입하는 단계를 포함하는 난청 치료를 위한 세포치료제의 이식 방법을 제공할 수 있다.

일반적으로 세포치료제를 이용한 질환의 치료 방법은 대부분 수술에 의해 세포치료제를 이식하는 방법을 사용하고 있다. 그러나 이러한 방법의 경우 수술로 인한 환자의 두려움과 많은 치료비 등에 의한 불편한 점이 있었다.

한편, 본 발명에서는 특별한 수술적 처치 없이 간단하게 줄기세포를 혈관 내에 주입하는 방법에 의해 난청 질환을 치료할 수 있는데, 난청 질환을 치료할 수 있는 대상은 모든 포유동물일 수 있고, 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물일 수 있다.

또한 본 발명에서 난청 치료를 위한 세포치료제로서 유효성분으로 줄기세포를 사용하였는데, 일반적으로 줄기세포란 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하며 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 말한다.

따라서 본 발명에서 난청 치료를 위해 사용할 수 있는 줄기세포는 유래와 상관없이 줄기세포라면 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 또는 태반 유래의 줄기세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 제대혈 또는 태반 양막 유래의 성체줄기세포(간엽줄기세포)를 사용하였다.

또한, 본 발명에서 혈관 내 주입할 수 있는 줄기세포의 양으로는 바람직하게 100,000개 ~ 1,000,000개의 줄기세포를 주입할 수 있다. 난청 치료를 위한 세포치료제로서 주입하는 줄기세포의 양이 100,000개 미만일 경우에는 병변 부위로 이동 및 생착되어 치료 효과를 유도할 수 있는 세포수가 부족하여 목적하는 치료 효과를 얻지 못하는 문제점이 있고, 반면 주입하는 줄기세포의 양이 1,000,000개를 초과하게 되면 치료를 위한 줄기세포의 배양에 한계가 있을 뿐만 아니라 과량의 줄기세포로 인해 다른 부작용도 유발될 수 있어, 상기 범위 내로 세포를 주입하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에서는 혈관 내 주입한 줄기세포가 실제로 병변 부위로 전달 및 생착되어 난청을 치료 및 개선할 수 있는지를 조사하였는데, 이를 위해 본 발명의 일실시예에 따르면 난청을 유발하는 물질인 ouabain 및 neomycin을 동물 모델에 투여하여 난청을 유발시킨 후, 꼬리의 정맥 내로 PKH26이 표지된 줄기세포를 투여한 다음, 와우를 채취하여 생착된 줄기세포를 형광표지를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 주입된 줄기세포는 난청이 유발된 내이에서 청각 재생에 중요한 나선신경절(spiral ganglion) 및 코르티기관(organ of corti)에 생착되어 있는 것을 확인할 수 있었으며(도 5 참조), ABR을 이용하여 청력 검사를 수행한 결과, 청력이 모두 개선되는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 9 및 도 10 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 혈관 내로 주입한 줄기세포는 병변 분위로 잘 이동될 뿐만 아니라 병변 부위에 잘 생착된다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 병변부위로 이동 및 생착된 줄기세포가 신경세포 및 유모세포로 분화되어 청력을 회복시키는 작용을 갖는 다는 사실을 알 수 있었는데, 이를 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에서는 줄기세포를 EGF와 bFGF가 함유된 배지에서 배양 및 분화한 다음, 분화된 세포의 특성을 면역형광염색을 통해 확인하였는데, 분화유도 1주일이 경과된 때에 세포들이 구(sphere)의 형상을 갖는 것을 알 수 있었고, 네스틴(nestin)등 신경계 전구 세포 표지자를 발현하는 것을 관찰할 수 있었다(도 3 참조).

따라서 본 발명에서 사용한 상기 줄기세포는 태만 또는 제대혈로부터 분리된 성체줄기세포, 즉 간엽줄기세포를 사용한 것으로서, 종래 줄기세포를 신경세포 및 유모세포(hair cell)로 분화시킨 후 분화된 세포들을 사용한 방법과는 달리, 태만 또는 제대혈 유래의 성체줄기세포를 직접 세포치료제로 사용하였다는 점에 특징이 있다.

이상과 같이 본 발명에서 제공하는 난청 치료를 위한 새로운 세포 이식 방법은 인체 내 적용시 다른 수술적 요법 없이 치료 용도의 세포치료제를 혈관(정맥) 내 주입하는 방법만으로도 효과적으로 본 발명의 세포치료제를 효과적으로 병변부위로 전달할 수 있고, 병변 부위에 생착되어 치료 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 줄기세포 중, 특히 제대혈 줄기세포는 다른 배아 줄기세포처럼 인체 내에서 기형종이나 기형암을 발생시킬 가능성이 없다는 장점이 있으므로 대중화 요법에도 유리하다.

나아가, 본 발명은 제대혈 또는 태반으로부터 유래된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 세포 치료제 조성물에 포함되는 줄기세포는 앞서 기술된 바와 같으며, 난청을 치료하기 위한 본 발명의 상기 세포 치료제 조성물은 질환 부위와 직접 접촉하지 않는 혈관 내에 주입하는 것일 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 상기 세포 치료제 조성물은 약학적 세포치료제 조성물로서, 유효성분으로서 상기 줄기세포 성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 난청 치료를 위한 세포 치료제 조성물은 난청을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

제대혈의 채취와 간엽줄기세포의 분리배양

제대혈로부터 간엽줄기세포의 분리 및 배양은 IRB의 승인(임상 연구 관리의 규정 KC08CIMI0344)을 준수하여 수행하였으며, 먼저 산모의 동의하에 채취된 제대혈 (Umbilical Cord Blood)을 헤파린이 처리된 혈액저장용기에 보관하였다. 총 18개의 제대혈 시료 중 16개의 시료에서 간엽줄기세포를 분리하였는데, 이를 위해 히스토페이크(histopaque; 시그마 알드리치, ST Louis, MO)를 이용한 기울기 원심분리(centrifuge gradient)법으로 단핵세포를 추출하였다. 이때 히스토페이크와 제대혈의 비율은 1:1로 하였으며 히스토페이크를 먼저 25㎖ 넣고 그 위에 혈액을 히스토페이크와 섞이지 않게 조심스럽게 띠운 다음 원심분리기를 이용하여 분리하였다. 원심분리는 2500rpm에서 20분 동안 4℃를 유지하며 수행하였다. 이후 원심분리된 튜브에서 혈청부분은 제거하고 혈청부분과 적혈구 층의 중간부분에 뽀얗게 생긴 단핵세포층을 채취하여 56℃에서 30분 동안 불활성 된 10％ 소태아혈청(Fetal Bovine Serum , Invitrogen, Grand Island, NY)과 1％의 페니실린-스트렙토마이신(P/S, Gibco, Grand Island, NY)이 함유된 최소 필수 배지 알파(MEM-alpha, (-)glucose, Gibco)에서 상기 분리된 단핵세포를 배양하였다. 배양 5일 후 부유(suspension)층은 제거하고 배양 디쉬(dish)에 붙은 세포를 현미경을 이용하여 구형 모양으로 증폭된 간엽줄기세포를 확인한 다음, 상기 간엽줄기세포만을 세척하여 10％ FBS와 1％의 P/S가 함유된 최소 필수 배지 알파((+)glucose, Gibco)에서 배양하였으며, 배양액은 3일 마다 교체하였고 3세대까지 계대 배양하여 수득한 간엽줄기세포만을 다음의 실험에 사용하였다.

< 실시예 2>

간엽줄기세포의 확인 및 신경계 세포 전구체로의 분화

상기 실시예 1에서 수득한 간엽줄기세포가 실제 간엽줄기세포인지를 확인하기 위하여 인간 간엽줄기세포의 표면 표지자(cell surface maker)를 사용하였는데, 조혈모세포의 표지자인 CD34(-)와 CD45(-), 간엽줄기세포의 표면 표지자로 알려진 CD73(+), CD90(+)를 사용하여 확인하였다. 먼저 실시예 1에서 3회 계대배양 된 제대혈의 단핵세포를 계수하여 1×10세포수/㎖로 시험관에 분주하고, 세척완충액(0.2% BSA, 0.1% NAN₃, 0.5mM EDTA)으로 3회 세척한 다음, Fluorescein Isothicyanate(FITC)와 Phycoerythrin (PE)가 접합되어 있는 CD34(Serotec Ltd., Station Approach, Kidlington, Oxford, UK),CD45(Serotec Ltd.), CD73, CD90, CD105, CD166(BD Biosceince, San Jose, CA) 항체를 1시간 동안 처리하였고, 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 유세포 분석기(FACS Caliber, Becton Dickson, San Diego, CA) 장비를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 방법으로 수득한 제대혈 유래 간엽줄기세포의 경우, 조혈모세포의 표지자인 CD34 및 CD45는 거의 100% 음성으로 확인되었고, 간엽줄기세포의 표지자인 CD73의 표면 표지자는 99.74%, CD90의 표면 표지자에서는 100%의 양성반응으로 나타났음을 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).

나아가 본 발명자들은 분리한 간엽줄기세포가 신경계 세포 전구체로 분화할 수 있는지 확인하기 위해, 제대혈로부터 분리하여 3세대 계대 배양한 간엽줄기세포에 20ng/ml의 EGF(Invitrogen)와 10ng/ml의 bFGF(Invitrogen)가 포함된 배지에서 14일 동안 배양하여 신경계 세포 전구체로 분화 유도하였고, 분화된 세포들을 현미경으로 관찰하였으며, 네스틴(nestin)과 같은 신경계 전구 세포 표지자의 발현 여부를 조사하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 신경계 세포 전구체로 분화 유도한 지 1주일이 경과되자 구(sphere)의 형상을 보였고, 네스틴 등 신경계 전구 세포 표지자를 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

난청 동물 모델의 형성

난청 동물 모델을 만들기 위해 기니아피그를 사용하였으며, 난청 유도물질로서 25mM Ouabain과 neomycin을 고실 내 주입을 통해서 안전하게 난청을 유도하였다. 난청 유발 전에 ABR을 이용하여 난청 유무를 확인하고 난청 유발 약제 투여 후 1주째에 ABR을 이용하여 난청이 잘 유발되었는지를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 기니아피그에게 난청을 유발시킨 결과, ABR 소견에 따라 난청 유도 후 난청이 잘 유도된 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4>

난청 동물 모델에 대한 줄기세포의 혈관 내 주입과 청력 검사

실시예 3을 통하여 난청이 된 기니아피그 5마리에 형광물질(PKH-26)이 부착된 제대혈 줄기세포(5㎕ DMEM-LG) 100,000개를 마취 유도 후 기니아 피그의 꼬리 정맥 혈관 내에 주입하였다. 혈관 내로 줄기세포를 이식한 지, 1주 및 3주가 되는 각각의 시기에 ABR을 이용하여 청력 개선 정도를 확인하였다.

그 결과, 줄기세포를 혈관 내 주입한 경우, 줄기세포 주입 이전에 비해 줄기세포 주입 후, 청력이 개선된 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 제대혈 유래의 성체줄기세포를 혈관 내로 주입하는 간단한 방법에 의해 난청을 치료 및 예방할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

난청 동물 모델을 대상으로 한 줄기세포의 주입 후 와우 내 생착 확인

상기 실시예 4를 통해 성체줄기세포의 주입으로 난청을 치료할 수 있다는 사실을 확인함에 따라 본 발명자들은 이러한 치료 효과가 실제로 주입한 성체줄기세포에 의한 것인지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

즉, 상기 실시예 4에서 난청이 유도된 기니아피그로부터 측두골을 채취하고, 채취 후 와우에 줄기세포의 생착 여부 및 분화를 조사하였는데, 난청이 유발된 기니아피크를 펜토바비탈을 이용하여 마취를 하고 살린펄퓨전(saline perfusion)을 시행하고 이후 4% 파라폴말데하이드(paraformaldehyde)를 0.1M PBS로 탈 석회화 과정을 거쳐 동결(cryostat)상태에서 10㎛ 슬라이드 조직을 만들었다. 줄기세포로부터 분화된 세포들은 βⅢ tubuline, NeuN S-100 GFAP myosin Vlla 등을 이용하여 분화를 확인하며, 이차 항체는 형광을 나타내는 fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated anti-mouse goat lgG나 Alexa-Fluor 488-conjugated goat anti-mouse lgG를 사용하였다. 염색질의 핵 확인을 위해서 DAPI(2㎍/ml PBS)을 이용하여 카운터 스테이닝(counter staining)을 하고 형광현미경 하에서 발현 여부를 확인하였고, 와우의 기저회전(basal turn)부터 120㎛ 간격으로 3개의 슬라이드 섹션을 선택하여 PKH-26에 부착된 줄기세포와 DAPI에 핵이 관찰된 세포 수를 세고 발현된 줄기세포는 와우의 각각 5개의 조직학적 부위 즉, 중간계(scala media), 고실계(scala tympani),전정계(scala vestibuli), 외측벽(lateral wall), modioulus에서 수를 세었다.

그 결과, 내이에 분포된 줄기세포의 개수는 평균 88개(59-123/section)인 것으로 조사되었고, PKH-26를 부착한 제대혈 유래 간엽줄기세포는 주로 와우축(modiolus)과 나선신경절(spiral ganglion)에서 관찰되었고 이는 코르티 기관(organ of corti)으로 이동(migration)하는 양상을 보였다(도 5 참조).

또한, 난청이 유발된 내이에서 청각 재생에 중요한 나선신경절(spiral ganglion)과 코르티 기관(organ of corti)에도 간엽줄기세포가 생착됨을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 난청을 치료할 수 있는 새로운 치료 방법으로 혈관 내 제대혈 유래 성체줄기세포를 주입할 경우, 주입된 성체줄기세포가 병변 부위로 이동 및 이식된 후, 청각 재생을 위한 세포인 신경 및 유모세포로 분화되어 청각 재생 효과를 유도할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

양막의 채취와 간엽줄기세포의 분리배양

양막으로부터 간엽줄기세포의 분리 및 배양은 IRB의 승인(임상 연구 관리의 규정 KC08CIMI0344)을 준수하여 수행하였으며, 실험에 필요한 양막조직은 태반으로부터 분리하였으며, 분리된 조직은 항생제가 포함되어 있는 생리 식염수 또는 DMEM배지에 넣었다. 양막 조직을 5g 정량하여 HBSS로 세척하였다. 양막 상피세포의 안정적인 분리를 위해 일반적인 PBS 보다는 인간 생체구성성분과 더욱 유사한 HBSS 버퍼로 대체하여 세척에 사용하였다. 세척된 양막 조직을 50ml 튜브로 옮겨 10mM DTT를 첨가하였다. 30분간 DTT처리 후 상층액을 버리고 양막 조직을 잘게 자르고, 잘게 자른 양막 조직을 새로운 0.05% 트립신-EDTA에서 37℃에서 교반하면서 42분 동안 트립신 처리하여 화학적 분해작업을 하였다. 화학적 분해된 조직을 1분 동안 vortexing한 후 1mm mesh에 1차 필터링하고 100㎛ mesh에 2차 필터링하여 분해되지 않은 조직을 제거하고 1800rpm에서 10분간 원심분리하였다. 바닥에 있는 펠렛을 단일세포로 잘 부유시켜 양막 상피세포를 수득할 수 있었다.

상기 수득한 양막 상피세포를 56℃에서 30분 동안 불활성 된 10％ 소태아혈청(Fetal Bovine Serum , Invitrogen, Grand Island, NY)과 1％의 페니실린-스트렙토마이신(P/S, Gibco, Grand Island, NY)이 함유된 최소 필수 배지 알파(MEM-alpha, (-)glucose, Gibco)에서 상기 분리된 단핵세포를 배양하였다. 배양 5일 후 부유(suspension)층은 제거하고 배양 배지(dish)에 붙은 세포를 현미경을 이용하여 구형 모양으로 증폭된 간엽줄기세포를 확인한 다음, 상기 간엽줄기세포만을 세척하여 10％ FBS와 1％의 P/S가 함유된 최소 필수 배지 알파((+)glucose, Gibco)에서 배양하였으며, 배양액은 3일 마다 교체하였고 3세대까지 계대 배양하여 수득한 간엽줄기세포만을 다음의 실험에 사용하였다.

< 실시예 7>

간엽줄기세포의 확인

상기 실시예 6에서 분리한 간엽줄기세포가 실제 간엽줄기세포인지를 확인하기 위하여 인간 간엽줄기세포의 표면 표지자(cell surface maker)를 사용하였는데, 조혈모세포의 표지자인 CD34(-), CD14(-), CD19(-) 및 HLA와 간엽줄기세포의 표면 표지자로 알려진 CD73(+), CD91(+) 및 CD105(+)를 사용하여 확인하였다. 먼저 실시예 1 및 6에서 3회 계대배양 된 제대혈 및 양막의 단핵세포를 계수하여 1×10세포수/㎖로 시험관에 분주하고, 세척완충액(0.2% BSA, 0.1% NAN₃, 0.5mM EDTA)으로 3회 세척한 다음, Fluorescein Isothicyanate(FITC)와 Phycoerythrin (PE)가 접합되어 있는 CD34(Serotec Ltd., Station Approach, Kidlington, Oxford, UK),CD45(Serotec Ltd.), CD73, CD90, CD105, CD166(BD Biosceince, San Jose, CA) 항체를 1시간 동안 처리하였고, 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 유세포 분석기(FACS Caliber, Becton Dickson, San Diego, CA) 장비를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 방법으로 수득한 양막 유래 간엽줄기세포의 경우, 조혈모세포의 표지자인 CD34, CD14, CD19 및 HLA은 발현되지 않았고, 간엽줄기세포의 표면 표지자로 알려진 CD73, CD91 및 CD105는 발현됨을 확인할 수 있었다(도 7 및 8 참조).

< 실시예 8>

난청 동물 모델에 대한 제대혈 채취 간엽줄기세포의 혈관 내 주입과 청력 검사

실시예 4를 통하여 난청이 된 기니아피그 5마리를 대상으로 상기 실시예 1에서 분리한 제대혈 유래 간엽줄기세포에 형광물질(PKH-26)을 부착하고 이러한 세포(5㎕ DMEM-LG) 100,000개를 마취 유도시킨 기니아 피그의 꼬리 정맥 혈관 내로 주입하였다. 혈관 내로 간엽줄기세포를 이식한 지, 1주 및 3주가 되는 각각의 시기에 ABR을 이용하여 청력 개선 정도를 확인하였다.

ABR 테스트는 클릭음(고주파수)을 자극음으로 제시하여 나타나는 파형의 진폭과 잠복시간으로 청각 경로 중 뇌간까지 어떠한 병변이 있는지를 평가하는 검사이고, 본 발명에서는 100ms duration, 31Hz의 자극음을 주었으며, ABR 테스트는Intelligent Hearing System (IHS) Smart EP System을 이용하여 실시하였다.

ABR 테스트결과, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈관 내 주입한 경우, 줄기세포 주입 이전에 비해 줄기세포 주입 후, 청력이 개선된 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 제대혈 유래의 간엽줄기세포를 혈관 내로 주입하는 간단한 방법에 의해 난청을 치료 및 예방할 수 있다는 사실을 알 수 있었다(도 9 참조).

< 실시예 9>

난청 동물 모델에 대한 양막 채취 간엽줄기세포의 혈관 내 주입과 청력 검사

실시예 4를 통하여 난청이 된 기니아피그 5마리를 대상으로 실시예 6의 양막에서 분리한 간엽줄기세포에 형광물질(PKH-26)을 부착시키고 이러한 세포(5㎕ DMEM-LG) 100,000개를 마취 유도한 기니아 피그의 꼬리 정맥 혈관 내에 주입하였다. 혈관 내로 줄기세포를 이식한 지, 1주 및 3주가 되는 각각의 시기에 ABR을 이용하여 청력 개선 정도를 확인하였다.

ABR 테스트결과, 줄기세포를 혈관 내 주입한 경우, 줄기세포 주입 이전에 비해 줄기세포 주입 후, 청력이 개선된 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 양막 유래의 성체줄기세포를 혈관 내로 주입하는 간단한 방법에 의해 난청을 치료 및 예방할 수 있다는 사실을 알 수 있었다(도 10 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

줄기세포를 질환 부위와 직접 접촉하지 않는 혈관 내에 주입하는 단계를 포함하는 난청 치료를 위한 세포치료제의 이식 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 제대혈 또는 태반으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 세포치료제의 이식 방법.
제2항에 있어서,
상기 줄기세포는 제대혈 유래 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포치료제의 이식 방법.
제2항에 있어서,
상기 줄기세포는 태반 양막 유래 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포치료제의 이식 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 100,000개 ~ 1,000,000개의 줄기세포를 혈관 내로 주입하는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 이식 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 혈관 내로 주입되면 난청이 유발된 내이에서 청각 재생 작용을 하는 나선신경절(spiral ganglion) 및 코리트기관(organ of corti)에 생착되는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 이식 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 신경세포 및 유모세포(hair cell)로 분화될 수 있는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 이식 방법.
제대혈 또는 태반으로부터 유래된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 및 치료를 위한 세포 치료제 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 혈관 내에 주입하기 위한 것임을 특징으로 하는 세포 치료제 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 100,000개 ~ 1,000,000개의 줄기세포를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 세포 치료제 조성물.