KR101895648B1

KR101895648B1 - 치수줄기세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101895648B1
Application number: KR1020140153829A
Authority: KR
Inventors: 정지은; 현정근; 김종완
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2018-09-05
Also published as: KR20160054336A

Abstract

본 발명은 치수줄기세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 종래의 줄기세포를 이용한 치료제와 달리 동물유래 배양물질을 전혀 사용하지 않아 임상적으로 안정성을 가지면서도 신경질환 환자들에게 적용할 만한 자가 줄기세포를 공급할 수 있어, 난치성 신경질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

치수줄기세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISEASES COMPRSING DENTAL PULP STEM CELL AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 치수줄기세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

난치성 질환을 극복하기 위하여 줄기세포를 통한 치료법의 개발이 활발히 이루어지고 있는 바, 줄기세포는 인간을 포함한 척추동물의 여러 조직에 존재하며, 그 분류에 따라 조혈모계, 생식선, 피부, 신경계 및 치아를 포함한 줄기세포들이 동정되어 보고되어 있다. 특히 중추신경계질환에 적용하기 위해 세포치료제를 개발 하려는 목적으로 이러한 여러 줄기세포들이 연구되고 있는 바, 면역 반응에 대한 우려가 거의 없는 자가 유래 줄기세포를 이용하기 위해 개발된 종래까지의 기술은 크게 두 가지로 나누어 진다. 그 첫째는, 섬유아세포 등에 외래유전자들을 도입하여 유도만능줄기세포(iPSC, induced pluoripotent stem cell)를 만든 후 신경줄기세포로 분화시키는 방법이며, 둘째는 기존에 밝혀진 중배엽성 줄기세포(mesenchymal stem cell)가 신경세포로 분화 가능하다는 가능성을 확인하고 특정 조건을 제시하는 것에 대한 것으로써 신경줄기세포를 구축하지 않고 중배엽성 줄기세포를 그대로 사용하는 것에 대한 방법이다.

하지만, 유도만능줄기세포를 구축하는 과정에서 바이러스벡터시스템(viral vector system) 등을 써서 외래유전자를 도입하여야 하며, 이 경우 도입된 바이러스성 물질이나 외래유전자가 환자의 염색체에 손상을 주거나 종양을 형성할 가능성이 매우 크다는 단점을 가지고 있어 임상 적용 가능한 세포로써는 아직 부적합하다고 알려져 있다. 또한, 유도만능줄기세포를 신경줄기세포로 분화시켜 사용할 경우에도, 신경줄기세포로 분화하지 않고 유도만능줄기세포의 특징을 가지는 미분화 줄기세포가 포함되는 것을 완전히 배제할 수 없어 임상 적용에 아직 해결해야 할 부분이 많은 상태이다.

또한 기존에 밝혀진 중배엽성 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 것에 대한 연구는, 기존 중배엽성 줄기세포의 분화능을 확인한 것일 뿐 그 효율이 매우 낮고 세포기원이 근본적으로 다르다. 사람의 개체발생 과정 중 나타나는 3가지 배엽은 중배엽(mesoderm), 내배엽(endoderm), 외배엽(ectoderm)으로 나누어 지는데, 신경조직(nerve tissue)의 발생은 외배엽으로부터 기원하므로 이를 감안할 때 이렇게 기원이 다른 세포를 사용하여 신경줄기세포를 대체할 수 있을 것인지에 대한 고찰이 필요하다. 최근 인간치아의 치수줄기세포로부터 신경세포로의 분화가 가능하다는 일련의 연구들이 보고된 바 있으나, 이때 사용한 줄기세포 또한 치수 내의 줄기세포 중 주요 군집인 중배엽성 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 이용한 것이다.

상기의 이유로 자가유래의 유효한 신경줄기세포를 얻기가 쉽지 않으므로, 기존의 연구들은 동종이식을 전제로 신경줄기세포를 얻고자 하였으며, 대표적으로는 사산된 태아의 뇌나 척수의 조직으로부터 분리한 신경줄기세포를 이용하는 것에 관한 연구들이 있고, 그 일례로서 대한민국 공개특허 2010-0020445호에서는 인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 중추 또는 말초 신경계 질환 치료용 약학적 조성물을 개시하고 있다. 하지만, 상기 문헌의 경우 신경질환 환자들에게 적용할 만큼의 세포 수를 공급하기 어려운 점 및 윤리적·법적 고찰이 필요함은 물론이고, 동종이식을 이용하는 비자기(non-self) 세포로써 면역거부반응에 대한 깊은 우려가 있으므로 현재까지는 임상적용이 어려운 방법으로 여겨진다.

한편, 종래에 보편적으로 줄기세포를 수집, 배양하는 방법으로는 인위적으로 합성하여 만들어 판매되는 배양배지에 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이나 말혈청(horse serum)을 첨가하여 사용하였으나, 동물 유래의 세균, 바이러스 및 마이코박테리아 뿐 아니라 보체에 의한 면역반응에 대한 우려가 깊고, 또한 소태아혈청에 의해 광우병 전파 위험성에 대해 많은 논란이 있어 임상적용을 목적으로 하는 줄기세포의 배양법으로는 적합하지 않다. 그러나, 대한민국 공개특허 2006-0017543호에서처럼 임상 적용 가능한 신경줄기세포 수립을 표방하여 태아로부터 홍채조직 유래의 신경줄기세포를 얻는 과정에서 조차도 세포의 분리과정에서의 안정화에 8~10%가량의 소태아혈청을 사용하는 등, 현재까지는 인체조직 내에 적은 수로 존재하는 신경줄기세포군을 임상적용 가능한 만큼의 세포수로 확장하거나 적어도 무혈청 배지로 적용하기 전까지의 세포안정화를 하는 데에 효율성을 확보하고자 하는 방법으로 소태아혈청을 사용하여 왔다. 세포배양을 할 때 모든 성분을 알고 있는 화학적으로 정의된 배양배지를 사용하는 것이 가장 좋은 것임을 모두 알고는 있지만, 세포의 생존과 증식에 중요한 역할을 하는 인자들이 아직 모두 파악되지 않은 현재 상태에서 초대배양을 수립할 때 까지는 효율 면에서 매우 유리한 소태아혈청을 사용하여 왔다고 할 수 있다.

치수로부터 분리한 세포군은 내피세포(endothelial cell), 섬유아세포(fibroblast) 외에도 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell), 중배엽성 줄기세포(mesenchymal stem cell) 등의 여러 줄기세포(stem cell)들을 포함하는 등, 여러 형질의 세포군이 모여 있는 비균질의 세포군집(heterogeneous population)이다. 이렇게 이루어진 치수로부터 유래된 세포들을 종래의 방법대로 동물유래 혈청이 포함된 기본배지에 키우게 되면, 당 조건에서 부착 및 증식이 가능한 내피세포 등의 여러 가지 종류의 세포들이 함께 자라게 된다. 이렇게 1차 부착 배양시킨 세포들을 2차로 신경줄기세포 특이적 증식인자 등을 포함하는 동물유래 혈청이 배제된 배지를 이용해 증식시켜 신경줄기세포의 특징을 가지는 줄기세포군을 선별적으로 증식시키는 것도 가능하나, 이 경우 첫째로 앞서 언급한 동물유래 물질이 포함된 상태로의 1차 배양을 거쳤기 때문에 임상적용이 힘들다는 점 이외에, 둘째로 이렇게 1차 접촉배양을 거쳐 2차원 체외배양(2 dimensional cell culture)에 적응(adaptation)한 세포들의 경우에, 배양액 및 공간적 스트레스에 대항할 수 있는 유전자들의 발현 등으로 인해 그 후에 신경줄기세포의 특징을 가지는 줄기세포군을 선별하기 위한 선택배지로 바꾸어 배양하는 환경에서도 이후 자신의 생존을 유지할 가능성을 배제할 수 없기 때문에 고순도의 신경줄기세포의 특징을 가지는 줄기세포군을 선별적으로 증식시키는 것이 어려운 문제점이 있다.

대한민국 공개특허 2010-0020445호 대한민국 공개특허 2006-0017543호

동물성 원료가 함유된 배지를 사용하지 않고도 임상적용이 가능한 신경줄기세포 특성을 가지는 세포군을 제공하고자, 본 발명은 치수줄기세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 치수줄기세포를 포함하며, 상기 치수줄기세포는 동물유래혈청이 배제된 배지에서 배양된 것인 신경질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예는 치수줄기세포가 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-라이신 및 폴리-L-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 코팅된 배양기에서 배양된 후 수득된 것일 수 있다.

다른 일 구현예는 치수줄기세포가 초대배양된 후 계대배양되어 수득된 것으로, 초대배양에서의 배양기는 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-라이신 및 폴리-L-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 코팅되어 있는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 동물유래혈청이 소태아혈청(FBS, fetal bovin serum), 송아지 혈청(calf serum), 및 말 혈청(horse serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 배지가 DMEM/F12, N2 용액, B-27 용액, βFGF, EGF, 페니실린, 및 스트렙토마이신을 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 치수줄기세포가 CD54, CD56, CD95, Nestin, Pax6, 및 A2B5 유전자를 발현하는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 치수줄기세포가 인간의 발치한 치아의 치수(dental pulp)로부터 유래된 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 신경질환이 신경 손상(neural injury), 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 신경손상이 중추신경계 손상 또는 말초신경계 손상인 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 신경 퇴행성 질환이 알츠하이머병, 헌팅톤병, 파킨슨병 및 근위축성 축삭 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 발치한 치아의 치수로부터 치수줄기세포를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 치수줄기세포를 동물유래혈청이 배제된 배지에서 배양하여 수득하는 단계를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공한다.

일 구현예는 배양하여 수득하는 단계는, 분리된 치수줄기세포를 초대 배양한 후 계대배양하여 수득하는 단계로서, 상기 초대배양은 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-라이신 및 폴리-L-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상 이 코팅된 배양기에서 수행되는 것일 수 있다.

다른 일 구현예는 동물유래혈청이 소태아혈청(FBS, fetal bovin serum), 송아지 혈청(calf serum), 및 말 혈청(horse serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 수득된 치수줄기세포가 CD54, CD56, CD95, Nestin, Pax6, 및 A2B5 유전자를 발현하는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 치수줄기세포가 인간의 발치한 치아의 치수로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 종래의 줄기세포를 이용한 치료제와 달리 동물유래 배양물질을 전혀 사용하지 않아 임상적으로 안정성을 가지면서도 신경질환 환자들에게 적용할 만한 자가줄기세포를 공급할 수 있어, 난치성 신경질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 2에서 배양된 세포와 비교예 1에서 배양된 세포에서의 성상을 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 1에 따른 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에 따른 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 1에 따른 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1에 따른 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 2 및 비교예 1에서 배양된 세포에서의 신경줄기세포 특이 마커에 대한 mRNA 발현 정도를 real-time PCR을 통해 비교한 그림이다.
도 7은 실시예 2 및 비교예 1에서 배양된 세포의 신경줄기세포 특이 마커에 관한 면역형광염색에 대한 사진이다.
도 8은 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2에서 배양된 세포의 자가증식능을 MTT법을 통해 나타낸 그래프이다
도 9는 치수줄기세포와 관련하여 치아조직을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 신경줄기세포 특성을 갖는 치수줄기세포의 분리 및 배양을 모식도로 나타낸 것이다.

본 발명은 동물유래혈청을 배제하고 초대배양을 할 경우 세포가 배양기에 부착하지 않고 증식하지 않는 문제점을 코팅(예를 들어, 젤라틴 코팅)을 통해 해결하였으며, 중배엽성 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 이용한 것이 아닌, 처음부터 동물유래혈청이 배제된 배지에 발치한 치아의 치수로부터 유래된 세포를 배양하면서 신경줄기세포 특성을 갖는 줄기세포들을 선택적으로 증식한 것에 특징이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 치수줄기세포를 포함하며, 상기 치수줄기세포는 동물유래혈청이 배제된 배지에서 배양된 것인 신경질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서, '치수'란 치아 내부의 중심부에 있는 연조직성 고유조직을 말하며, 상기 치수는 상아질로 둘러싸여 있고 내부에 신경섬유, 혈관, 림프관을 포함하고 있다.

상기 치수줄기세포는 치수에 존재하는 줄기세포를 말하며, 치아는 배아발생 초기에 신경판(neural plate)이 신경능선(neural crest)으로 되고 이로부터 발생이 기원하는 조직이기 때문에, 치수 내부에는 신경세포를 이룰 수 있는 외배엽성의 줄기세포가 존재할 개연성이 매우 높다. 또한, 치수는 쉽게 접근가능하고, 줄기세포 및 수집된 조직 부피간의 높은 비율을 갖는 생물학적 지위(niche)를 가지므로, 치수줄기세포는 재생 의료를 위한 세포치료제 개발의 세포원천(cell source)으로 매우 유용하다.

상기 치수줄기세포는 인간의 발치한 치아의 치수로부터 유래된 것일 수 있다. 치아는 특별히 한정되지 않으나, 유치 또는 사랑니가 바람직하다. 유치의 발치는 반드시 이루어지는 과정이고, 사랑니의 발치는 매우 흔하며 두 치아 모두 발치 후 대부분 버려지는 기관이므로, 치아줄기세포 수집을 위해 별도의 시술이 필요 없다는 점에서 장점을 갖는다.

상기 치수줄기세포는 젤라틴(gelatin), 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornitin), 폴리-D-라이신(poly-D-lysin) 및 폴리-L-라이신(poly-L-lysin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 코팅된 배양기에서 배양한 후 수득된 것일 수 있다. 예컨대, 치수줄기세포는 젤라틴이 코팅된 배양기(예를 들어, 배양접시)에서 초대배양된 후에 계대배양하여 수득된 것일 수 있다. 상기 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-라이신, 폴리-L-라이신은 신경줄기세포를 배양하는 매질로서, 초대배양 시 동물유래혈청이 없는 경우 세포가 거의 부착되지 않고 증식이 잘 이루어지지 않지만, 상기 매질이 코팅됨에 따라 동물유래혈청이 포함되지 않더라도 치수줄기세포는 부착되어 증식이 잘 이루어질 수 있다.

상기 배지는 신경줄기세포 특성을 갖는 세포를 선택적으로 증식시키기 위한 선택증식배지일 수 있으며, 신경줄기세포 특성을 갖는 세포를 선택적으로 증식시키기 위한 물질들을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 배지는 N2 용액 또는 B-27 용액, 신경줄기세포 증식유발 사이토카인(βFGF, EGF, LIF), 헤파린 및 cAMP로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 N2 용액은 Human Transferrin (Holo), Insulin Recombinant Full Chain, Progesterone, Putrescine, Selenite을 포함하는 용액일 수 있으며, 상기 B-27 용액은 Biotin, DL Alpha Tocopherol Acetate, DL Alpha-Tocopherol, Vitamin A (acetate), BSA(fatty acid free Fraction V), Catalase, Human Recombinant Insulin, Human Transferrin, Superoxide Dismutase, Corticosterone, D-Galactose, Ethanolamine HCl, Glutathione (reduced), L-Carnitine HCl, Linoleic Acid, Linolenic Acid, Progesterone, Putrescine 2HCl, Sodium Selenite, T3 (triodo-I-thyronine)을 포함하는 용액일 수 있다.

상기 치수줄기세포는 신경줄기세포 특성을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 치수줄기세포는 FACS, real-time PCR, 면역형광염색법 등의 분석방법을 통해 신경줄기세포 특성을 나타내는 것으로 공지된 마커들의 발현 측정 시, 상기 마커들이 발현되는 것일 수 있다. 일례로, 상기 치수줄기세포는 CD54, CD56, CD95, Nestin, Pax6 및 A2B5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 발현하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 CD54, CD56, CD95, Nestin, Pax6 및 A2B5 유전자를 모두 발현하는 것일 수 있다.

상기 동물유래혈청이란 포유류 등에서 유래된 혈청으로, 소태아혈청(FBS, fetal bovin serum), 송아지 혈청(calf serum), 및 말 혈청(horse serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다. 상기 동물유래혈청이 배지에 포함되는 경우 동물유래바이러스 등의 오염이 발생하기 때문에, 동물유래혈청이 포함되지 않는 배지에서 배양된 치수줄기세포의 경우 임상적용에 있어 안전한 것이 특징이다 (예컨대, 동물유래혈청은 광우병 바이러스를 포함할 수 있으며, 상기 광우병 바이러스는 신경계 손상에 치명적이다).

한편, 본 발명에서 '치료'는 증상의 완화, 질환(또는 손상) 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화(palliation), (일부 또는 완전한) 완화(remission)를 포함한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 질환의 상태와 비교하여 호전된 상태를 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다. 전형적으로 치료는 손상된 신경계의 재생을 위해 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 경우를 포함한다. 이 때, 본 발명에서의 신경계는 뇌, 중추 또는 말초 신경계일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용되는'이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 원하는 목적, 예를 들면 손상된 신경계의 재생을 위해 표기된 지시에 따라 적당한 용기 내에 포장될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하 주입, 근육 주입, 경피 투여, 관절강내 주사, 척수강내 주사, 정맥주사, 뇌내 주사 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 척수 경막내 주사 및 뇌내 주사로 투여할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 단회투여 또는 반복투여로 주입될 수 있으며, 보다 바람직하게는 반복투여 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 0.001 내지 1000 ㎎이다.

본 발명의 약학 조성물이 적용가능한 신경질환으로 중추 신경계(뇌나 척수) 또는 말초신경계의 신경질환일 수 있다. 예컨대, 신경 손상(neural injury), 신경 퇴행성 질환, 및 허혈 또는 재관류에 의한 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경질환일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 신경 손상은 중추신경계 손상이며, 상기 신경 퇴행성 질환은, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 파킨슨병 및 근위축성 측삭 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경 퇴행성 질환이고, 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중일 수 있으며, 신경세포가 손상되는 질환 또는 병태이면 그 원인(예를 들면, 외상이나 뇌경색 등에 의한 일차적 원인, 감염, 종양 등에 의하는 이차적 원인)은 특히 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 신경세포의 장해를 수반하는 망막 질환에도 적용 가능하다.

상기 치수줄기세포는 인간의 발치한 치아의 치수로부터 유래된 것일 수 있으며, 치아는 특별히 한정되지 않으나, 유치 또는 사랑니가 바람직하다.

상기 분리하는 단계는, 치아의 치수를 분리해 낸 후 절삭(chopping)하여 효수분해용액을(enzyme digestive solution)을 처리한 후 원심분리를 이용하여 치수줄기세포를 분리할 수 있으며, 원심분리 이후 거름 망 등을 통해 세포 응집물, 세포 외 기질 입자 등을 제거할 수 있다.

또한, 상기 방법은 수득된 치수줄기세포를 동결보존하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 치수줄기세포는 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-라이신 및 폴리-L-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 코팅된 배양기에서 배양한 후 수득된 것 일 수 있다. 예컨대, 치수줄기세포는 젤라틴이 코팅된 배양기에서 초대배양된 후에 계대배양하여 수득된 것일 수 있다.

상기 배지는 신경줄기세포 특성을 갖는 세포를 선택적으로 증식시키기 위한 선택증식배지일 수 있으며, 신경줄기세포 특성을 갖는 세포를 선택적으로 증식시키기 위한 물질들을 포함할 수 있다.

상기 치수줄기세포는 신경줄기세포 특성을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 치수줄기세포는 FACS, real-time PCR, 면역형광염색법 등의 분석방법을 통해 신경줄기세포 특성을 나타내는 것으로 공지된 마커들의 발현 측정 시, 상기 마커들이 발현되는 것일 수 있다.

상기 동물유래혈청이란 포유류 등에서 유래된 혈청으로, 소태아혈청(FBS, fetal bovin serum), 송아지 혈청(calf serum), 및 말 혈청(horse serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예, 비교예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예, 실험예, 비교예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예, 실험예, 비교예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

실시예 1. 세포의 분리

치제공에 동의한 환자로부터 치수와 치근단 조직을 채취하였다. 발치는 특별하게 격리된 수술실에서 수행하였으며, 구내외소독 후 하치조신경의 전달마취와 침윤마취를 병행시행 하였다. 접근을 위해 피판과 치조골 삭제를 동반하였으며, 치아의 파절 없이 발거가 이루어지게 수행하였다.

발치된 치아는 치수강이 오염되지 않도록 치근 옆으로 수직구를 형성하였으며, 이 부분에 힘을 가해 치아를 반으로 수직절단하고 치수를 획득하였다. 획득한 치수는 항생제가 포함된 배양액에 담구어 30분 이내에 연구실로 옮겼으며, 초대세포배양을 위해 수집된 치수시료를 멸균된 절삭가위(chopping scissors)를 이용해 작은 조직으로 절삭하였다. 절삭된 시료를 효소분해 용액 (효소분해 용액의 부피는 수집된 치수의 용적에 의존하며, 1 내지 2 ml의 범위에서 진행하였고, DPBS(인산 완충용액 pH 7.4, 1M)에 3mg/ml 콜라게나제 유형 I, 4mg/ml 디스파제를 함유함)에서 37℃에서 1시간 동안 잘 섞이게 하며 침지시켰으며, 1시간 후에, 상기 시료를 탁상형 원심분리기에서 3000~5000rpm으로 1분간 원심분리 한 후 침전된 펠렛(pellet)만을 남기고 효소분해 용액을 제거하였다. 여기에 DMEM/F12(Invitrogen), N2 용액(Invitrogen), B-27 용액(Invitrogen), 20ng/ml의 βFGF, 20ng/ml의 EGF, 100U/ml의 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 37℃의 선택증식배지 1 ml을 넣어 현탁 시켰다. 이후 현탁된 시료는 70-100㎛ Falcon 세포여과기로 여과하여 세포외기질(extracellular matrix) 단편 또는 큰 응집물(aggregate)을 제거하였다.

실시예 2. 세포의 배양

상기 실시예 1에서 분리된 세포를 배양하기 위하여, 30mm 세포배양용 접시를 멸균한 0.1~0.5% 젤라틴 용액(gelatin, Sigma)으로 1~24시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 코팅된 세포배양접시에 상기 실시예 1에서 분리된 세포를 담고, 상기의 배양액을 2 ml 더 첨가한 후 약 1주에서 2주간 37℃에서 5% CO₂로 배양하였으며, 배양배지는 초기 1주일간은 배지의 교환 없이 2~3일에 한번 1 ml씩 첨가하였고, 이후로 부착된 세포들이 적당히 관찰되기 시작하여 2~3일에 한번씩 배지를 교환하였다. 현미경 관찰을 통하여 배양의 첫날부터 세포를 매일 관찰하였으며, 처음 관찰 시에는 부착된 세포들이 거의 관찰되지 않았으나, 1주일쯤 후부터 부착된 세포들이 소량 관찰되고 약 2주 후부터는 바닥에 부착된 다수의 세포를 수득할 수 있었다.

초대배양 된 세포가 배양접시에 60~70%정도를 차지할 정도로 자라게 되면, 계대배양을 실시하였다. 상기 코팅방법으로 준비된 60mm 또는 10mm 크기의 세포배양접시를 1~3개정도 준비하여 계대배양을 실시하였으며, 초대배양된 세포의 배양액을 모두 제거하고 accutase(Invitrogen)를 500㎕정도 첨가한 후 37℃에서 1 내지 2분간 반응시켰다 (보통의 방법처럼 트립신(trypsin)을 이용하지 않는 이유는 그것이 돼지에서 분리한 것이기 때문에 동물유래솔루션의 사용을 배제하기 위한 목적과 더불어 세포손상의 최소화 하고, 트립신에 의한 세포노화의 촉진을 줄이기 위함이다). 분리된 세포를 DPBS을 이용하여 모은 후 1000 내지 1500rpm으로 원심분리 하였고, 이후 PBS를 제거하고 남은 세포 펠렛을 선택증식배지로 현탁하여 코팅하여 준비한 세포배양접시에 담은 후 선택증식배지를 적정량 추가하여 37℃에서 5% CO₂로 배양하였다.

상기와 같이 계대배양 된 세포가 60~70%정도를 차지할 정도로 자라게 되면 세포 수를 확보하거나, 하기의 분석을 위해서 사용할 목적으로 또다시 상기의 방법대로 계대배양을 하여 유지하였으며, 각 계대마다 적어도 하나이상의 동결세포를 보관할 수 있도록 하였다.

비교예 1

동일 개체의 동일 치아의 치수로부터 분리된 세포를 상기 실시예 1과 같이 동일하게 분리한 후, 10% 소태아혈청(FBS), 100U/ml의 페니실린 및 100ug/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12(Dulbecco`s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12, 1:1, Invitrogen) 배지에서 배양하였다.

상기 실시예 2에서 배양된 세포와 비교예 1의 세포의 성상을 광학현미경을 통해 비교하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 실시예 2에서 배양된 세포(DMEM/F12, N2 용액, B-27 용액, 20ng/ml의 βFGF, 20ng/ml의 EGF, 100U/ml의 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유, 이하 NSC media로 기재)와 비교예 1에서 배양된 세포(10% 소태아혈청을 포함한 배지)에서의 성상을 나타낸 것으로, passage 0은 계대배양을 하기 전 초대배양을 의미하고, passage 3은 계대배양 3세대인 passage 3을 의미한다.

도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 2에 의해 배양된 세포에서 특징적으로 세포막의 상태가 깨끗함을 확인하였다.

비교예 2

줄기세포의 특징이 대표적으로 연구된 ATCC로부터 분양받은 골수유래 중간엽줄기세포(BMMSC)를 상기 비교예 1과 동일한 배지에 배양하였다.

실시예 3. 세포의 보관

실시예 2에 따라 배양된 세포를 보관하기 위하여 동물유래혈청이 포함되지 않는 동결배지를 이용하였으며, 상기의 70%의 선택증식배지, 20%의 serum replacement (Invitrogen), 10%의 DMSO를 함유하는 조성으로 하였다. Accutase로 해리한 세포를 PBS를 이용하여 모은 후 1000~1500rpm으로 원심분리 하였다. 이후 PBS를 제거하고 남은 세포 펠렛을 상기의 동결배지 1 ml로 현탁하여 냉동 바이알(freezing vial)에 넣고 세포 냉동용 컨테이너(freezing container)를 이용하여 냉각시켜 얼린 후(-70℃~-80℃ 냉동고에 하루~수일간 냉동) 액체질소가 담긴 세포보관탱크에 장기간 보관 하였다. 이렇게 보관한 세포는 해동 후의 세포상태의 점검과 다음실험을 위하여 해동한 후 다시 배양하여 확인하였으며, 특별한 특징의 변화 없이 보관 전의 상태대로 배양됨을 확인하였다.

실험예 1. 세포의 증식과 특성 규명

1.1. FACS 분석

상기 실시예 1 및 비교예 1에서 배양된 세포의 특성을 규명하기 위하여 2~3 계대의 세포를 사용하였다.

세포자동해석장치(FACS)를 통한 세포 표면의 마커를 분석하기 위해, 상기실시예 2 및 비교예 1의 세포를 배양접시로부터 분리하였고(이때 세포 표면의 마커가 훼손되지 않도록 2mM의 EDTA용액을 첨가하여 약 5분간 37℃에서 반응시켰으며 accutase나 트립신 등의 효소는 사용하지 않았다), 분리된 세포를 PBS을 이용하여 모은 후 1000~1500rpm으로 원심분리 하였다. 이후 PBS를 제거하고 남은 세포 펠렛을 1:100으로 PBS에 5% 소태아혈청을 포함한 용액에 희석한 CD54, CD56, CD95, CD105의 항체용액으로 현탁한 다음 실온에서 1시간 반응시킨다. 이후 PBS를 이용하여 2회 수세한 후 FACSCalliber를 통해 분석하였고, 그 결과를 도 2 내지 도 5에 나타내었고, 사용한 항체정보는 하기 표 1과 같다.

명칭	제조회사	제품번호	희석배율
CD54	BD bioscience	560971	1:100
CD56(NCAM)	BD bioscience	555516	1:100
CD95	BD bioscience	558814	1:100
CD105	R&D system	AF1097	1:100

도 2 내지 도 5는 실시예 2 및 비교예 1에서 배양된 세포에서 CD54, CD56, CD95의 신경줄기세포특이 표면표지자(neural stem cell specific surface markers)와 중배엽성 줄기세포특이 표면표지자인 CD105를 발현하는 세포의 수를 FACS 분석을 통해 나타낸 그림이다(도 2 내지 4와 관련하여, 상단의 %는 전체 1만개의 세포 중 염색된 세포 수(예컨대, CD56으로 염색된)를 %로 나타낸 것이다).

도 2 내지 도 5에 나타난 바와 같이, 비교예 1에서 배양된 세포와 비교하여 실시예 1에서 배양된 세포에서는 신경줄기세포의 특이 마커인 CD54, CD56, CD95를 발현하는 세포의 수가 현저히 증가한 반면, 중배엽성 줄기세포 특이마커인 CD105는 현저히 감소되는 것을 확인하였다.

1.2. real-time PCR 분석

실시예 2 및 비교예 1에서 배양된 세포에 대하여, 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 신경줄기세포 특이 마커의 mRNA 발현 양상을 real-time PCR를 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

명칭	프라이머
hNestin-Forward	5`-CTGGAGCAGGAGAAACAGG-3` (서열번호 1)
hNestin-Reverse	5`-TGGGAGCAAAGATCCAAGAC-3` (서열번호 2)
hPax6-Forward	5`-AACAGACACAGCCCTCACAAACA-3` (서열번호 3)
hPax6-Reverse	5`-CGGGAACTTGAACTGGAACTGAC -3` (서열번호 4)
hSox-1-Forward	5`-CAATGCGGGGAGGAGAAGTC-3` (서열번호 5)
hSox-1-Reverse	5`-CTCTGGACCAAACTGTGGCG-3` (서열번호 6)
hNCAM-Forward	5`-CAGCCAGCAGATTACAATGC-3` (서열번호 7)
hNCAM-Reverse	5`-TGGCTGGGAACAATATCCAC-3` (서열번호 8)

도 6은 실시예 2 및 비교예 1에서 배양된 세포에서의 신경줄기세포 특이 마커(Nestin, Pax6, Sox1, NCAM)에 대한 mRNA 발현 정도(Relative expression, 대조군 기준)를 real-time PCR을 통해 비교한 그림이다.

도 6에 나타난 바와 같이, 비교예 1에서 배양된 세포와 비교하여 실시예 1에서 배양된 세포에서는 Nestin, Pax6, Sox1, NCAM의 발현이 현저한 유의성을 보이며 증가한 것을 확인하였다.

1.3. 면역형광염색법

상기 실시예 2 및 비교예 1에서 배양된 세포를 면역형광염색을 실시하여 세포의 특성을 규명하였다.

PBS 중의 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 상온에서 세포를 30분간 고정하였으며, 이후 세포를 PBS로 5분씩 3회 수세하고, 0.2% 트립톤(tripton) X-100으로 20분간 침투 후, PBS로 5분씩 3회 세척하였다. 또한 염색 시 항체들의 비 특이적 결합을 방지하고자 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 블로킹(blocking)시켰다. 사용된 각각의 일차 항체들과 사용한 희석 농도는 하기 표 3과 같으며, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후 일차 항체를 제거하고, 세포를 PBS로 5분씩 3회 수세한 후, 각 조건에 해당하는 플루오레슨트 라벨 된 (fluorescent labeled)이 부착된 이차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 PBS로 5분씩 3회 수세하고 핵을 DAPI로 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscope, Carl Zeiss Inc)을 통해 세포에서 각 인자들의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

명칭	제조회사	제품번호	희석배율
Nestin	Millipore	MAB5326	1:200
Pax6	Covance	PRB278P	1:200
A2B5	R&D system	MAB1416	1:200
CD56(NCAM)	BD bioscience	555516	1:200

도 7은 실시예 2 및 비교예 1에서 배양된 세포의 신경줄기세포 특이 마커(Nestin, Pax6, A2B5, NCAM)에 관한 면역형광염색에 대한 사진이다.

도 7에 나타난 바와 같이, 비교예 1과 비교하여 실시예 2에서 배양된 세포에서 신경줄기세포 특이 마커인 Nestin, Pax6, A2B5, NCAM 의 발현이 증가한 것을 확인하였다.

1.4. MTT assay

신경줄기세포의 특성을 가지는 치수줄기세포가 자가증식능을 가지는지 및 임상 적용 가능한 정도로 세포수의 확보가 가능한지 등을 검증하기 위하여 MTT법을 이용하여 세포증식능(cell proliferation ability)을 분석하였다.

상기 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2에서 배양된 각 세포를 2x10⁴개씩 96웰 플레이트에 3웰씩에 키워 1일차부터 5일차까지를 살펴보았다. 각 일차에 MTT용액을 0.5mg/ml로 처리하여 2시간동안 인큐베이션 한 후 모두 걷어내고 DMSO용액을 각 웰당 100㎕씩 첨가하였다. 이후 5분간 실온에서 잘 섞이게 흔들며 반응시킨 후 Microplate Reader(Molecular Devices SpectraMax M2)를 이용하여 OD 570nm에서 값을 읽은 후 1일차의 값을 1.0으로 기준하여 fold change로 나타내었고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2에서 배양된 세포의 자가증식능을 MTT법을 통해 나타낸 그래프이다 (*: 골수유래줄기세포와의 비교유의성; #: DPNSC-NSC media에서 키운 세포와의 비교유의성).

도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 배양된 세포의 세포증식속도는 종래의 동물혈청을 이용한 방법으로 수득된 세포보다 조금 낮은 양상을 보이기는 하지만, 골수유래 중간엽 줄기세포를 동물혈청을 이용한 방법으로 배양하여 측정한 세포증식속도보다는 유의하게 빠른 것을 확인하였다.

이러한 세포분열속도를 지속하며 본 발명에서의 세포는 계대 10이상 유지되는 것을 확인하였으며, 임상으로 적용 가능한 숫자의 세포를 획득하는데 문제가 없을 정도로 자가 증식능을 가지는 것으로 확인되었다.

<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISEASES COMPRSING DENTAL PULP STEM CELL AND METHOD FOR PREPARING THE SAM <130> HY141171 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hNestin-Forward primer <400> 1 ctggagcagg agaaacagg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hNestin-Reverse primer <400> 2 tgggagcaaa gatccaagac 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPax6-Forward primer <400> 3 aacagacaca gccctcacaa aca 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPax6-Reverse primer <400> 4 cgggaacttg aactggaact gac 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSox-1-Forward primer <400> 5 caatgcgggg aggagaagtc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSox-1-Reverse primer <400> 6 ctctggacca aactgtggcg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hNCAM-Forward primer <400> 7 cagccagcag attacaatgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hNCAM-Reverse primer <400> 8 tggctgggaa caatatccac 20

Claims

치수줄기세포를 포함하며,
상기 치수줄기세포는 동물유래혈청이 배제된 배지에서 초대배양 및 계대배양되고, 상기 계대배양 시에 동물유래 물질의 사용이 배제된 것인, 중추신경계 손상 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치수줄기세포는 젤라틴(gelatin), 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornitin), 폴리-D-라이신(poly-D-lysin) 및 폴리-L-라이신(poly-L-lysin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 코팅된 배양기에서 배양한 후 수득된 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치수줄기세포는 초대배양된 후 계대배양되어 수득된 것으로, 상기 초대배양에서의 배양기는 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-라이신 및 폴리-L-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 동물유래혈청은 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 송아지 혈청(calf serum), 및 말 혈청(horse serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고,
상기 동물유래 물질은 트립신(trypsin)을 포함하는, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배지는 DMEM/F12, N2 용액, B-27 용액, βFGF, EGF, 페니실린, 및 스트렙토마이신을 포함하는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치수줄기세포는 CD56, Nestin, Pax6, 및 A2B5 유전자를 발현하는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치수줄기세포는 인간의 발치한 치아의 치수(dental pulp)로부터 유래된 것인, 약학 조성물.
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발치한 치아의 치수로부터 치수줄기세포를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 치수줄기세포를 동물유래혈청이 배제된 배지에서 초대배양 및 계대배양하여 수득하는 단계를 포함하되,
상기 계대배양 시 동물유래 물질의 사용이 배제되는, 중추신경계 손상 치료용 약학 조성물의 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 초대배양 및 계대배양하여 수득하는 단계에서,
상기 초대배양 및 계대배양은 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-라이신 및 폴리-L-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 코팅된 배양기에서 수행되는 것인, 약학 조성물의 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 동물유래혈청은 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 송아지 혈청(calf serum), 및 말 혈청(horse serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고,
상기 동물유래 물질은 트립신(trypsin)을 포함하는, 약학 조성물의 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 배지는 DMEM/F12, N2 용액, B-27 용액, βFGF, EGF, 페니실린, 및 스트렙토마이신을 포함하는 것인, 약학 조성물의 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 수득된 치수줄기세포는 CD56, Nestin, Pax6, 및 A2B5 유전자를 발현하는 것인, 약학 조성물의 제조방법.
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제12항에 있어서, 상기 치수줄기세포는 인간의 발치한 치아의 치수(dental pulp)로부터 유래된 것인, 약학 조성물의 제조방법.
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