MX2011005229A

MX2011005229A - Celulas adherentes derivadas del amnios.

Info

Publication number: MX2011005229A
Application number: MX2011005229A
Authority: MX
Inventors: Kristen Labazzo; Jia-Lun Wang; James W Edinger; Stewart Abbot; Aleksandar Francki; Kaplunovsky Aleksandr; Vladimir Jankovic; Eric Law; Neerav D Padliya; Jennifer Paredes
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Priority date: 2008-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2011-06-16
Also published as: AU2009316541A1; IL212765A; RU2015130665A; CA2743566C; BRPI0922184A2; WO2010059828A1; US8367409B2; CN102282252B; CN102282252A; NZ592726A; NZ602455A; US9198938B2; US20100124569A1; US20160361366A1; RU2015130665A3; EP2367932A1; CN107201337A; RU2011124524A; RU2562154C2; JP2012509087A

Abstract

Se proporcionan en la presente células agiogénicas novedosas de amnios referidas como células adherentes derivadas de amnios, y poblaciones de, y composiciones que comprenden, tales células. Además, se proporcionan en la presente métodos para obtener tales células y métodos para utilizar las células en el tratamiento de individuos.

Description

CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL AMNIOS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 61/116,248, presentada el 19 de noviembre del 2009, la descripción de la cual se incorpora para referencia en su totalidad. 1. CAMPO Se proporcionan en la presente células angiogénicas novedosas a partir del amnios, y poblaciones de tales células, referidas en la presente como "células adherentes derivadas del amnios" (AMDACs) . Las células adherentes derivadas del amnios son distintas de las células madres placentarias descritas previamente, incluyendo células madre placentarias adherentes plásticas para cultivo de tejidos. 2. ANTECEDENTES Las composiciones celulares, por ejemplo, composiciones de células madre, se han vuelto una terapia atractiva para una serie de deficiencias fisiológicas, por ejemplo, remplazo de médula ósea. Existe una necesidad para poblaciones adicionales de células, por ejemplo, células madre o células progenitoras que tienen potencial y/o propiedades angiogénicas . 3. COMPENDIO En un aspecto, se proporciona en la presente una célula adherente aislada derivada del amnios, también referida en la presente como una AMDAC, en donde la célula es adherente al plástico para cultivo de tejidos, y en donde tal célula es OCT-4 (negativa para OCT-4, también conocida como P0U5F1 o proteína 4 de unión de octámero) , o como se determina mediante reacción de cadena de transcriptasa-polimerasa inversa (RT-PCR) , por ejemplo, cuando se compara con una línea celular control apropiada, tal como una línea de célula madre derivada de carcinoma embrional (por ejemplo, NTERA-2, por ejemplo, disponible de American Type Culture Collection, ATCC Número CRL-1973), como se determina por RT-PCR durante 30 ciclos. En una modalidad específica, las células son OCT-4, como se determina por RT-PCR y VEGFRl/Flt-1+ (receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular) y/o VEGFR2 /KDR+ (receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular, también conocido como receptor del dominio de inserto de quinasa) , como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad específica, las células son OCT-4, como se determina por RT-PCR, y CD49f+ (integrina" OÍ6+) , como se determina mediante inmunolocalización. En una modalidad específica, tal célula es OCT-4", como se determina por RT-PCR, y HLA-G", como se determina por RT-PCR. En otra modalidad específica, tal célula es OCT-4", como se determina por RT-PCR, y CD90+, CD105+ o CD117" como se determina mediante inmunolocalización . En una modalidad específica, tal célula OCT-4" es CD90+, CD105+ y CD117". En otra modalidad específica, la célula es OCT-4", y no expresa SOX2 , por ejemplo, como se determina por RT-PCR durante 30 ciclos.

En otra modalidad, la célula OCT-4" es una o más de CD29+, CD73+, ABC-p+ y CD38", como se determina mediante inmunolocalización .

En otra modalidad específica, la célula OCT-4" es adicionalmente una o más de CD9+, CD10+, CD44+, CD54+, CD98+ , Tie-2+ (receptor de angiopoyetina) , TEM-7+ (marcador 7 endotelial de tumor), CD31", CD34", CD45", CD133", CD143" (enzima que convierte angiotensina I, ACE) , CD 146" (molécula de adhesión de células de melanona) , CXCR4" (receptor 4 de quimiocina (motivo C-X-C) ) como se determina mediante inmunolocalización. En una modalidad específica, tal célula es CD9+, CD10+, CD44+, CD54\ CD98+, Tie-2+ , TEM-7+, CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146" y CXCR4" como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad específica, la célula adherente derivada del amnios proporcionadas en la presente es OCT-4", como se determina por RT-PCR; VEGFRl/Flt-1+ y/o VEGFR2 /KDR+, como se determina mediante inmunolocalización; y una o más o todas de CD31", CD34", CD45", CD133" y/o Tie-2" como se determina mediante inmunolocalización. En una modalidad específica, la célula adherente derivada del amnios, o una población de células adherentes derivadas del amnios, expresan por lo menos 2 logaritmos menores de ARm amplificados con PCR para OCT-4 en, por ejemplo, >20 ciclos, que una célula NTERA-2 o población de células NTERA-2 que tienen un número equivalente de células. En otra modalidad específica, la célula OCT-4" es adicionalmente VE-caderina" (CD144") como se determina mediante inmunolocalización . En otra modalidad específica, la célula OCT-4" es adicionalmente positiva para CD105+ y CD200+ como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad específica, la célula OCT-4" no expresa CD34 como se detecta mediante inmunolocalización después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) durante 4 a 21 días.

En otro aspecto, se proporciona en la presente una célula adherente aislada, derivada del amnios, en donde la célula es adherente al plástico para cultivo de tejidos, y en donde la célula es OCT-4" y SOX-2", como se determina por RT-PCR; y CD90+, CD105+ y CD117", como se determina mediante citometría de flujo. En modalidades específicas, la célula OCT-4", SOX-2" es adicionalmente HLA-G" o CD271", como se determina mediante citometría de flujo. En una modalidad específica, la célula es OCT-4" y SOX-2", como se determina por RT-PCR; y CD90+, CD105+, CD117", CD271" y HLA-G", como se determina mediante citometría de flujo.

En otro aspecto, se proporciona en la presente una célula adherente aislada, derivada del amnios, en donde la célula es adherente al plástico para cultivo de tejidos, y en donde la célula es positiva para CD309 (también conocida como VEGFR2 /KDR+) .

En otro aspecto, se proporciona en la presente una célula adherente aislada, derivada del amnios, en donde la célula es adherente al plástico del cultivo de tejidos, y en donde la célula es OCT-4", como se determina por RT-PCR, y una o más de VEGFR2/KDR+, CD9+, CD54+, CD105+, CD200+, O VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalización . En una modalidad específica, la célula es OCT-4", como se determina por RT-PCR, en, por ejemplo, >20 ciclos, y VEGFR2 /KDR+, CD9+, CD54+, CD105+, CD200+ y VE-caderina" , como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad específica, la célula no expresa CD34, como se detecta mediante inmunolocalización, después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días.

En otra modalidad, la célula adherente derivada del amnios es OCT-4", CD49f+, HLA-G", CD90+, CD105+ y CD117". En una modalidad específica, la célula es una o más de CD9+, CD10+, CD44+, CD54+, CD98+, Tie-2+, TEM-7+, CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146" (molécula de adhesión de células de melanona) , o CXCR4", como se determina mediante inmunolocalización o citometría de flujo. En una modalidad específica, la célula es CD9+, CD10+, CD44+, CD54+, CD98+ , Tie-2+ , TEM-7+ , CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146", y CXCR4" como se determina mediante inmunolocalizacion. En otra modalidad específica, la célula es adicionalmente VEGFRl/Flt-1+ y/o VEGFR2 /KDR+ , como se determina mediante inmunolocalizacion; y una o más de CD31", CD34", CD45", CD133" y/o Tie-2" como se determina mediante inmunolocalizacion. En otra modalidad específica, la célula es adicionalmente VEGFR1/Flt-1+, VEGFR2 /KDR+ , CD31", CD34", CD45", CD133" y Tie-2" como se determina mediante inmunolocalizacion.

En otra modalidad, se proporciona en la presente una célula adherente aislada, derivada del amnios, en donde la célula no expresa ARNm para FGF4, IFNG, CXCL10, ANGPT4, ANGPTL3, FGA, LEP, PRL, PROKl, TNMD, FLT3 , XLKDl , CDH5, LECTl, PLG, TERT, SOX2, NANOG, MMP-13, DLX5 , o BGLAP, como se determina por RT-PCR, por ejemplo, durante 30 ciclos. En otra modalidad, se proporciona en la presente una célula adherente aislada, derivada del amnios en donde la célula no expresa constitutivamente una o más de la cadena invariante HLA-DR-DP-DQ, CD6, CD271, como se determina mediante citometría de flujo.

Se proporciona además en la presente una población de células aislada que comprende una célula adherente derivada del amnios. En una modalidad específica, por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en la población son células adherentes derivadas del amnios. En una modalidad, la célula es OCT-4", como se determina por RT-PCR, y VEGFRl/Flt-l+ y/o VEGFR2 /KDR+ como se determina mediante inmunolocalización, y en donde la población de células aislada no es un amnios. En otra modalidad se proporciona en la presente una población de células aislada que comprende una célula adherente derivada del amnios que es OCT-4" y HLA-G" , como se determina por RT-PCR, y VEGFR1/Flt-1+ o VEGFR2 /KDR+ como se determina mediante inmunolocalización; y en donde la población de células aislada no es un amnios. En una modalidad específica, por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en tal población son células adherentes derivadas del amnios . En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células aislada que comprende una célula adherente derivada del amnios, en donde la célula es adherente al plástico para el cultivo de tejidos, en donde la célula es OCT-4" , como se determina por RT-PCR, VEGFRl/Flt-l+ y VEGFR2/ DR+ como se determina mediante inmunolocalización, en donde la técnica es adicionalmente una o más de CD9+ , CD10+ , CD44+ , CD54+ , CD98+ , Tie-2+ , TEM-7+ , CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146" o CXCR4", como se determina mediante inmunolocalización, o HLA-G" como se determina por RT-PCR durante, por ejemplo, >20 ciclos, y en donde la población de células aisladas no es un amnios. En una modalidad específica, por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en tal población son células adherentes derivadas del amnios . En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células aislada que comprende una célula adherente derivada del amnios , en donde la célula es adherente para el plástico para el cultivo de tejidos, en donde la célula es OCT-4", como se determina por RT-PCR, VEGFR1/Flt-1+ y/o VEGFR2 /KDR+ como se determina mediante inmunolocalización, en donde la célula no expresa CD34 como se detecta mediante inmunolocalización después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días, y en donde la población de células aislada no es un amnios . En una modalidad específica, por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en tal población son células adherentes derivadas del amnios . En otra modalidad, cualquiera de las poblaciones anteriores de células que comprende células adherentes derivadas del amnios forma brotes o estructuras similares a tubos cuando se cultiva en presencia de factores angiogénicos tal como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento epitelial (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) , por ejemplo, en un sustrato tal como MATRIGEL™, En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células, en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en la población de células aislada son células adherentes derivadas del amnios que son OCT-4", como se determina por RT-PCR, y positiva para VEGFR2/KDR, CD9 , CD54, CD105 o CD200. En una modalidad específica, por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que son OCT-4", como se determina por RT-PCR, y VEGFR2 /KDR+, CD9+ , CD54+, CD105+ y CD200+, como se determina mediante inmunolocalización . En una modalidad específica, las células adherentes derivadas del amnios no expresan CD34, como se detecta mediante inmunolocalización, después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días. En una modalidad específica, las células adherentes derivadas del amnios son adherentes al plástico para el cultivo de tejidos. En otra modalidad específica, la población de células forma brotes o estructuras similares a tubos cuando se cultiva en la presencia de un factor angiogénico tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento epitelial (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) , por ejemplo, en un sustrato tal como MATRIGEL™ .

En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células, por ejemplo, células humanas, en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que expresa ARN durante una o más o todas de ACTA2 , ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPTl , A GPT2, ANGPTLl, ANGPTL2 , ANGPTL4 , BAIl, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1 , COL4A2 , COL4A3 , CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2 , DNMT3B, ECGF1 , EDG1 , EDIL3 , ENPP2 , EPHB2, FBLN5, F2 , FGFl, FGF2 , FIGF, FLT4 , FNl , FST, FOXC2 , GRN, HGF, HEY1, HSPG2 , IFNBl, IL8, IL12A, I GA4 , I GAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1 , NRP2 , PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGKl , PROXl, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINCl, SERPINFl, TIMP2, TIMP3 , TGFA, TGFBl , THBS1, THBS2 , TIEl, TIE2/TEK, TNF , TNNIl, TNFSF15, VASHl , VEGF, VEGFB, VEGFC , VEGFR1/FLT1, O VEGFR2/KDR.

En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células, por ejemplo, una población de células adherentes derivadas del amnios, o una población de células en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que expresa uno o más de, o todos de, CD49d, Conexina-43, HLA-ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDL1, CD106, Galectina-1, precursor ADAM 17 (A desintegrina y dominio 17 de metaloproteinasa) (enzima para convertir TNF-alfa) (TNF-alfa convertasa) , precursor Angiotensinógeno , Filamina A (Alfa-filamina) (Filamina 1) (proteína de unión de actina endotelial) (ABP-280) (filamina no muscular) , Alfa-actinina 1 (isoforma citoesquelética de alfa-actinina) (alfa-actinina 1 no muscular) (proteína de reticulación de F-actina) , precursor de proteína 2 relacionado con el receptor de lipoproteína de baja densidad (Megalina) (Glicoproteína 330) (gp330) , tipos I y II de receptores depuradores de macrofagos (receptor I y II LDL acetilados de macrofagos) , precursor tipo IIB del receptor de activina (ACTR-IIB) , proteína Wnt-9, proteina acídica fibrilar glial, astrocito (GFAP) , proteína C de unión de miosina, tipo cardiaco (MyPB-C cardiaco) (proteína C, isoforma de músculo cardiaco) , o cadena pesada de miocina, no muscular de tipo A (Cadena pesada de miosina celular, tipo A) (Cadena A pesada de miosina no muscular) (NMMHC-A) .

En otro aspecto, se proporciona en la presente una población de células, por ejemplo, una población de células adherentes derivadas del amnios, o una población de células en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que secretan uno o más, o todos, de VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2 , folistatina, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR o galectina-1, por ejemplo, en un medio de cultivo en el cual la célula, o células, se cultivan.

En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células, por ejemplo, una población de células adherentes derivadas del amnios, o una población de células en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que expresan micro ARN angiogénicos (miARN) en un nivel más elevado que células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde tales miARN comprenden uno o más de, o todos de, de miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92 y/o miR-296. En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células, por ejemplo, una población de células adherentes derivadas del amnios , o una población de células en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que expresa uno o más de, o todos de, los micro ARN angiogénicos (miARN) en un nivel más bajos que las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde tales miARN comprenden uno o más o todos de miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b y/o miR-16. En ciertas modalidades, las AMDACs, o poblaciones de AMDAC, expresan uno o más o todos los miARN angiogénicos miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b y/o miR-16.

En otra modalidad específica, se proporciona en la presente una célula angiogénica derivada del amnios, o población de células angiogénicas derivadas del amnios, que expresan niveles incrementados de CD202b, IL-8 y/o VEGF bajo condiciones hipóxicas (por ejemplo, menos de aproximadamente 5% de 02) en comparación con condiciones normóxicas {por ejemplo, aproximadamente 20% o aproximadamente 21% de 02) .

En otra modalidad específica, la población aislada de células adherentes derivadas del amnios adicionalmente comprende un segundo tipo de célula. En modalidades específicas, las AMDACs comprende por lo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o por lo menos 98% de las células en tal población. En una modalidad específica, el segundo tipo de célula se encuentra contenido dentro o aislado de la sangre placentaria, la sangre del cordón umbilical, médula ósea natural u otros tejidos. En una modalidad específica, el segundo tipo de célula es una célula madre embriónica, una célula sanguínea, una célula madre aislada de sangre periférica, una célula madre aislada de la sangre placentaria, una célula madre aislada del perfusado placentario, una célula madre aislada del tejido placentario, una célula madre aislada de sangre del cordón umbilical, una célula madre del cordón umbilical, una célula madre mesenquimal derivada de la médula ósea, una célula del estroma mesenquimal , una célula madre nema opoyética, una célula madre somática, un condrocito, un fibroblasto, una célula muscular, una célula endotelial, una célula progenitora endotelial, un pericito, un miocito, un cardiomiocito, un mioblasto, un angioblasto o un cardiomioblasto . En otra modalidad específica, el segundo tipo de célula es una célula madre hematopoyética o progenitora, por ejemplo, una célula CD34+. En otra modalidad más específica, el segundo tipo de célula comprende por lo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o por lo menos 98% de las células en tal población.

En otra modalidad específica, cualesquiera de las células anteriores son, o han sido, proliferadas en cultivo. En otra modalidad específica, cualquiera de las células anteriores es de un cultivo de las células que han sido pasadas por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 veces, o más. En otra modalidad específica, cualquiera de las célula anteriores es de un cultivo que se ha duplicado en el cultivo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o por lo menos 50 veces o más.

En otro aspecto, se proporciona en la presente una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende cualquiera de las células adherentes derivadas del amnios, o poblaciones de células que comprende las células adherentes derivadas del amnios, proporcionadas en la presente. En una modalidad especifica, la composición es una matriz o soporte, por e emplo, una matriz de tejido o soporte natural, por ejemplo, una matriz o soporte de tejido des-celularizado permanente o degradable; o matriz o soporte sintético. En una modalidad específica, la matriz o soporte se conforma en la forma de un tubo u otra forma tridimensional de un organoide. En otra modalidad más específica, la matriz es una matriz de tejido descelularizada . En otra modalidad específica, la composición comprende una o más de las células adherentes aisladas, derivadas del amnios, proporcionadas en la presente, o población de células que comprende las células adherentes derivadas del amnios, en una solución fisiológicamente aceptable, por ejemplo, una solución salina, un medio de cultivo o similares.

En otro aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, que comprende administrar una o más de las células adherentes derivadas del amnios, descritas en la presente a tal individuo en una cantidad y durante un tiempo suficiente para una mejora detectable de uno o más síntomas de tal enfermedad o trastorno. En otra modalidad, se proporciona en la presente un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, que comprende administrar células adherentes derivadas del amnios a tal individuo en una cantidad y durante un tiempo suficiente para una mejora detectable de uno o más indicios de la función cardiaca, en donde tales indicios de la función cardiaca son el rendimiento cardiaco (CO) en el pecho, índice cardiaco (CI) , presión capilar de arteria pulmonar (PAWP) , índice cardiaco (CI) , % de acortamiento fraccional (%FS) , fracción de eyección (EF) , fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF) , diámetro diastólico final del ventrículo izquierdo (LVEDD) , diámetro sistólico final del ventrículo izquierdo (LVESD) , contractilidad (dP/dt) , una disminución en el funcionamiento atrial o ventricular, un incremento en la eficiencia de bombeo, una disminución en el índice de pérdida de eficiencia de bombeo, una disminución en la pérdida del funcionamiento hemodinámico, o disminución en complicaciones asociadas con cardiomiopatía, en comparación con el individuo antes de la administración de las células adherentes derivadas del amnios .

En una modalidad específica, tal enfermedad o trastorno es infarto al miocardio. En otra modalidad específica, tal enfermedad o trastorno es cardiomiopatía. En otras modalidades específicas, tal enfermedad o trastorno es aneurisma, angina, estenosis aórtica, aortitis, arritmias, arteriosclerosis , arteritis, hipertrofia septal asimétrica (ASH) , aterosclerosis , fibrilación atrial y palpitación, endocarditis bacteriana, Síndrome de Barlow (prolapso de la válvula mitral) , bradicardia, Enfermedad de Buerger ( tromboangeitis obliterante), cardiomegalia, carditis, enfermedad de la arteria carótida, estrechamiento de la aorta, defectos congénitos cardiacos, enfermedad de arteria coronaria, Síndrome de Eisenmenger, embolismo, endocarditis, eritromelalgia, fibrilación, displasia fibromuscular , bloqueo cardiaco, soplo cardiaco, hipertensión, hipotensión, calcificación arterial infantil idiopática, Enfermedad de Kawasaki (síndrome de nodulo linfático mucocutáneo, enfermedad del nodulo linfático mucocutáneo, poliarteritis infantil) , síndrome metabólico, angina microvascular , miocarditis, taquicardia atrial paroxismal ( PAT) , periarteritis nodosa (poliarteritis, poliarteritis nodosa) , pericarditis, enfermedad vascular periférica, isquemia crítica de miembro, flebitis, estenosis de válvula pulmonar (estenosis pulmonar) , Enfermedad de Raynaud, estenosis de arteria renal, hipertensión renovascular , enfermedad reumática del corazón, vasculopatía diabética, defectos septales, isquemia silente, síndrome X, taquicardia, Arteritis de Takayasu, Tetralogía de Fallot, transposición de las grandes arterias, atresia tricúspide, truncus arterioso, enfermedad cardiaca valvular, úlceras varicosas, venas varicosas, vasculitis, defecto de tabique ventricular, Síndrome de Wolff-Parkinson-White, defecto de relieve endocardiaco , fiebre reumática aguda, pericarditis reumática aguda, endocarditis reumática aguda, miocarditis reumática aguda, enfermedades cardiacas reumáticas crónicas, enfermedades de la válvula mitral, estenosis mitral, insuficiencia mitral reumática, enfermedades de la válvula aórtica, enfermedades de otras estructuras endocardiacas , enfermedad cardiaca isquémica (aguda y subaguda) , angina de pecho, enfermedad cardiaca pulmonar aguda, embolismo pulmonar, enfermedad cardiaca pulmonar crónica, enfermedad cardiaca quifoscoliotica, miocarditis, endocarditis, fibrosis endomiocardial , fibroelastosis endocardial, bloqueo atrioventricular, disrritmias cardiacas, degeneración del miocardio, enfermedad cerebrovascular, una enfermedad de las arterias, arterioles y capilares, o una enfermedad de venas y vasos linfáticos.

En otras modalidades específicas, tal enfermedad o trastorno es una oclusión y estenosis de arterias pre-cerebrales, u oclusión de arterias cerebrales. En un aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar un individuo quien tiene una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro del individuo, por ejemplo, quien tiene un síntoma o déficit neurológico atribuible a una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o el sistema nervioso central (CNS) del individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de AMDAC aisladas. En ciertas modalidades, la interrupción del flujo sanguíneo resulta en daño anóxico o daño hipóxico al cerebro o CNS del individuo.

En otras modalidades específicas, tal enfermedad o trastorno es una oclusión o estenosis de las arterias periféricas. En un aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar a un individuo quien tiene una interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor de un miembro, por ejemplo, quien tiene un síntoma de déficit vascular atribuible a una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del sistema vascular periférico del individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de AMDAC aisladas. En ciertas modalidades, la interrupción del flujo sanguíneo resulta en daño anóxico o daño hipóxico a los miembros del individuo y o extremidades.

En otro aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar a un individuo que sufre de una herida o trauma, que comprende administrar una o más de las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente a tal individuo en una cantidad y durante un tiempo suficiente para una mejora detectable de tal herida o trauma.

En otra modalidad específica del método de tratamiento, se administran las células al individuo mediante inyección. En una modalidad más específica, la inyección es una inyección dentro de un área isquémica del corazón del individuo. En otra modalidad específica del método de tratamiento, se administran las células al individuo mediante infusión intravenosa. En otra modalidad específica del método de tratamiento, las células, o una población de tales células, o una población de células que comprende tales células, se administra al individuo mediante implante en el individuo de una matriz o soporte que comprende células adherentes derivadas del amnios, como se describe anteriormente .

Las células adherentes derivadas del amnios y las poblaciones celulares proporcionadas en la presente no son las células madre placentarias aisladas o poblaciones celulares descritas por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 7 , 255 , 879 , o la Publicación de Solicitud de Patente No. 2007 / 0275362 . Las células adherentes aisladas, derivadas del amnios proporcionadas en la presente, tampoco son células progenitoras endoteliales , células epiteliales amnióticas, trofoblastos , citotrofoblastos , células germinales embriónicas, células madre embriónicas, células obtenidas desde la masa celular interna de un embrión, o células obtenidas desde el reborde gonadal de un embrión.

Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" significa, por ejemplo, dentro de 10% de una figura o valor establecido.

Como se utiliza en la presente, el término "angiogénico" con referencia a las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente, significa que las células pueden formar vasos o brotes similares a vasos, o que las células pueden promover angiogénesis (por ejemplo, la formación de vasos o estructuras similares a vasos) en otra población de células, por ejemplo, células endoteliales .

Como se utiliza en la presente, el término "angiogénesis" se refiere al proceso de formación de vasos sanguíneos que incluye, aunque no se limita a, activación de células endoteliales, migración, proliferación, remodelación de matriz y estabilización celular.

Como se utiliza en la presente, el término "célula madre" define las propiedades funcionales de cualquier población celular predeterminada que pueda proliferar ampliamente, aunque no necesariamente de manera infinita, y contribuye a la formación de tejidos múltiples, ya sea durante el desarrollo embriológico o remplazo y reparación de tejido post-natal.

Como se utiliza en la presente, el término "célula progenitora" define las propiedades funcionales de cualquier población celular proporcionada que puede proliferar ampliamente, aunque no necesariamente de manera infinita, y contribuye a la formación de un conjunto restringido de tejidos múltiples en comparación con una célula madre, ya sea durante el desarrollo embriológico o remplazo y reparación del tejido post-natal.

Como se utiliza en la presente, el término "derivado" significa aislado de o de otra manera purificado. Por ejemplo, las células derivadas del amnios se aislan a partir del amnios. El término "derivado" abarca células que se cultivan desde células aisladas directamente de un tejido, por ejemplo, el amnios, y células cultivadas o expandidas desde aislados primarios .

Como se utiliza en la presente, "inmunolocalización" significa la detección de un compuesto, por ejemplo, un marcador celular, utilizando una proteína inmune, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo en, por ejemplo, citometría de flujo, clasificación celular activada por fluorescencia, clasificación celular magnética, hibridación in situ, inmunohistioquímica o similares.

Como se utiliza en la presente, el término "célula aislada" significa una célula que se separa sustancialmente de otras células del tejido, por ejemplo, el amnios o la placenta, a partir de la cual se deriva la célula. Una célula se "aisla" si por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o por lo menos 99% de las células con las cuales la célula madre se asocia naturalmente se remueven desde la célula, por ejemplo, durante la recolección y/o cultivo de la célula.

Como se utiliza en la presente, el término "población de células aislada" significa una población de células que se separa sustancialmente de otras células del tejido, por ejemplo, el amnios o la placenta, a partir de la cual se deriva la población de células. Una célula se "aisla" si por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o por lo menos 99% de las células con las cuales la población de células, o células a partir de las cuales la población se deriva, se asocian naturalmente, se remueven a partir de la célula, por ejemplo, durante la recolección y/o cultivo de células adherentes derivadas del amnios.

Como se utiliza en la presente, una célula es "positiva" para un marcador particular cuando ese marcador es detectable sobre el fondo, por ejemplo, mediante inmunolocalización, por ejemplo, mediante citometría de flujo; o mediante RT-PCR. Por ejemplo, se describe una célula como positiva, para por ejemplo, CD105 si CD105 es detectable en la célula en una cantidad detectablemente mayor que la de fondo (en comparación con por ejemplo, un control de isotipo) . En el contexto, de por ejemplo, detección mediada por anticuerpos, "positivo", como una indicación de que un marcador superficial de célula particular se encuentra presente, significa que el marcador es detectable utilizando un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo etiquetado fluorescentemente, específico para ese marcador; "positivo" también significa que una célula conlleva ese marcador en una cantidad que produce una señal, por ejemplo, en un citómetro, que se encuentra detectablemente sobre el fondo. Por ejemplo, una célula es "CD105" en donde la célula se etiqueta detectablemente con un anticuerpo específico a CD105, y la señal a partir del anticuerpo es detectablemente más elevada que una control (por ejemplo, de fondo) . Por el contrario, "negativo" en el mismo contexto significa que el marcador superficial celular no es detectable utilizando un anticuerpo específico para ese marcador en comparación con el de fondo. Por ejemplo, una célula es "CD34" en donde la célula no se etiqueta detectablemente con un anticuerpo específico a CD34. A menos que se observe de otra manera en la presente, se detecta un conjunto de marcadores de diferenciación ("CD") utilizando anticuerpos. Por ejemplo, el OCT-4 puede determinarse para estar presente, y una célula es OCT-4+, si ARNm para OCT-4 es detectable utilizando RT-PCR, por ejemplo, durante 30 ciclos. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 muestra la expresión de genes relacionados con la célula madre mediante células adherentes derivadas del amnios y las células NTERA-2.

La FIGURA 2 muestra la expresión de TEM-7 en la superficie celular de células adherentes derivadas del amnios (AMDAC) .

La FIGURA 3 muestra la secreción de proteínas angiogénicas seleccionadas mediante células adherentes derivadas del amnios .

La FIGURA 4 muestra el efecto angiogénico de medio condicionado de células adherentes derivadas del amnios en formación de tubos de Células Endoteliales Humanas (HUVEC) .

La FIGURA 5 muestra el efecto angiogénico de medio condicionado de células adherentes derivadas del amnios en migración de células endoteliales humanas .

La FIGURA 6 muestra el efecto del medio condicionado de células adherentes derivadas del amnios en proliferación de Células Endoteliales Humanas.

La FIGURA 7 muestra la incorporación de LDL acetilado mediante las HUVEC y células adherentes derivadas del amnios.

La FIGURA 8 muestra la formación de tubos de las HUVEC y células adherentes derivadas del amnios .

La FIGURA 9 muestra la secreción de VEGF e IL-8 mediante células adherentes derivadas del amnios bajo condiciones hipóxicas y normóxicas .

La FIGURA 10 muestra la expresión del marcador celular Tie2 bajo condiciones normóxicas (aproximadamente 21% de 02) e hipóxicas (menos de aproximadamente 5% de 02) . Eje Y: porcentaje de células positivas para Tie2 mediante citometría de flujo.

La FIGURA 11 muestra la potencia de diferenciación cardiomiocítica de células adherentes derivadas del amnios, en donde AM se refiere a células adherentes derivadas del amnios (AMDAC) , HD se refiere a una gota suspendida sin tratar, HD IND se refiere a una gota suspendida expuesta a condiciones de inducción, y HD IND + 5-AZA se refiere a la inducción en la presencia o ausencia de 5-azacitidina . CTRL se refiere al control de gota suspendida no tratada.

La FIGURA 12 muestra un efecto positivo de las AMDACs en angiogénesis en un modelo de modelo de angiogénesis en membrana corioalantoidea en pollos. Lote 1, Lote 2, Lote 3: AMDAC de tres preparaciones separadas de células. bFGF: factor de crecimiento de fibroblastos básicos (control positivo). MDAMB231: línea celular de cáncer de mama angiogénico (control positivo) . Eje Y: Grado de formación de vaso sanguíneo .

La FIGURA 13 muestra un efecto positivo de medio condicionado por AMDAC en angiogénesis en un modelo de angiogénesis en membrana corioalantoidea en pollos. Lote 1, Lote 2, Lote 3: AMDAC de tres preparaciones celulares separadas. bFGF: factor de crecimiento de fibroblastos básicos (control positivo). MDAMB231: línea celular de cáncer de mama angiogénico (control positivo) . Eje Y: grado de formación de vaso sanguíneo .

Las FIGURAS 14A, 14B: especies de oxígeno reactivo generado por peróxido ácido presente en cultivos de astrocitos, co-cultivos de astrocitos y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BM-MSC) o co-cultivos de astrocitos y AMDAC . 14A: AMDAC , Lote 1; 14B: AMDAC, Lote 2. Las condiciones HA (astrocitos humanos) solos, astrocitos + H202 y astrocitos + BM.MSC + ?202 son los mismos para las FIGURAS 14A y 14B. Actividad RFU ROS: Unidades de fluorescencia relativa para especies reactivas de oxígeno. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA 5.1 CARACTERÍSTICAS DE CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL A NIOS Se proporcionan en la presente células angiogénicas , adherentes únicas, y poblaciones de tales células, aislables a partir del amnios, referidas en la presente como "células adherentes derivadas del amnios" o AMDAC. Las células adherentes derivadas del amnios parecen superficialmente células mesenquimales en apariencia, que tienen una forma generalmente fibroblastoide . Las células se adhieren a una superficie de cultivo celular, por ejemplo, al plástico para cultivo de tejidos.

Las AMDACS despliegan marcadores celulares que las distinguen de otras células derivadas del amnios o derivadas de la placenta. Por ejemplo, en una modalidad, la célula adherente derivada del amnios es OCT-4 (proteína 4 de unión de octámero) , como se determina por RT-PCR. En otra modalidad específica, la célula adherente derivada del amnios OCT-4" es CD49f+, como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad especifica, la célula OCT-4" es HLA-G", como se determina por RT-PCR. En otra modalidad específica, la célula OCT-4" es VEGFR1/Flt-1+ (receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular) y/o VEGFR2 /KDR+ (receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular) , como se determina mediante inmunolocalización. En una modalidad específica, la célula adherente derivada del amnios OCT-4" o una población de células adherentes derivadas del amnios OCT-4" expresa por lo menos 2 logaritmos menos de ARNm amplificado con PCR para OCT-4 en, por ejemplo, 20 ciclos, que una célula NTERA-2, o población de células NTERA-2 teniendo un número equivalente de células y ciclos de amplificación de ARN. En otra modalidad específica, tal célula OCT-4" es CD90+, CD105+ o CD117". En una modalidad específica, la célula OCT-4" es CD90+, CD105+ y CD117". En una modalidad más específica, la célula es OCT-4" o HLA-G", y es adicionalmente CD49f+, CD90+, CD105+ y CD117". En una modalidad más específica, la célula es OCT-4", HLA-G" , CD49f+, CD90+, CD105+ y CD117". En otra modalidad específica, la célula OCT-4" no expresa S0X2, por ejemplo, como se determina por RT-PCR durante 30 ciclos. En una modalidad específica, por lo tanto, la célula es OCT-4", CD49f+, CD90+, CD105+ y CD117", como se determina mediante inmunolocalizacion o citometría de flujo y SOX2", como se determina por RT-PCR, por ejemplo, durante 30 ciclos.

En otra modalidad, la célula OCT-4 es una o más de CD29+, CD73+, ABC-p+ y CD38", como se determina mediante inmunolocalizacion.

En otra modalidad específica, por ejemplo, una AMDAC OCT-4" puede ser adicionalmente, una o más de CD9+, CD10+, CD44+, CD54+, CD98+, TEM-7+ (marcador 7 endotelial de tumor), CD31", CD34", CD45", CD133", CD143" (enzima que convierte angiotensina I, ACE) , CD 146" (molécula de adhesión de célula de melanoma) o CXCR4" (receptor 4 de quimiocina (motivo C-X-C) ) como se determina mediante inmunolocalizacion o HLA-G" como se determina por RT-PCR. En una modalidad más específica, tal célula es CD9+, CD10+, CD44\ CD54+, CD98+, Tie-2+, TEM-7+, CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146" y CXCR4" como se determina mediante inmunolocalizacion, y HLA-G" como se determina por RT-PCR. En una modalidad, la célula adherente derivada del amnios proporcionadas en la presente es una o más de CD31", CD34", CD45" y/o CD 133". En una modalidad específica, la célula adherente derivada del amnios es OCT-4" como se determina por RT-PCR; VEGFR1/Flt-1+ y/o VEGFR2/KDR+, como se determina mediante inmunolocalización; y una o más o todas de CD31", CD34", CD45" y/o CD 133".

En otra modalidad específica, tal célula es adicionalmente VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad específica, tal célula es adicionalmente positiva para CD105+ y CD200+ como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad específica, tal célula no expresa CD34 como se detecta mediante inmunolocalización después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días. En modalidades más específicas, tal célula no expresa CD34 como se detecta mediante inmunolocalización después de 25 a 75 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días, o a 50 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días. En modalidades incluso más específicas, tal célula no expresa CD34 como se determina mediante inmunolocalización después de la exposición a 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 75 ó 100 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días. En modalidades aún más específicas, tal célula no expresa CD34 como se detecta mediante inmunolocalización después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF durante 7 a 12, por ejemplo, 7 días.

En modalidades específicas, la célula adherente derivada del amnios es OCT-4", como se determina por RT-PCR, y una o más de VE-caderina", VEGFR2/KDR+, CD9+ , CD54+, CD105+ y/o CD200+ como se determina mediante inmunolocalización. En una modalidad específica, la célula derivada del amnios es OCT-4", como se determina por RT-PCR, y VE-caderina", VEGFR2/KDR+, CD9+, CD54+, CD105+ y CD200+ como se determina mediante inmunolocalizacion. En otra modalidad específica, tales células no expresan CD34, como se detecta mediante inmunolocalizacion, por ejemplo, después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF durante 4 a 12 días.

En otra modalidad, la célula adherente derivada del amnios es OCT-4", CD49f+, HLA-G, CD90+, CD105+ y CD117". En una modalidad más específica, tal célula es una o más de CD9+ , CD10+, CD44+, CD54+, CD98+, Tie-2+, TEM-7+ , CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146" o CXCR4", como se determina mediante inmunolocalizacion. En una modalidad más específica, tal célula es CD9+, CD10+, CD44+, CD54+, CD98+, Tie-2+, TEM-7+, CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD 146", y CXCR4" como se determina mediante inmunolocalizacion. En otra modalidad específica, tal célula es adicionalmente VEGFR1/Flt-1+ y/o VEGFR2/KDR+, como se determina mediante inmunolocalizacion; y una o más de CD31", CD34", CD45", CD133", y/o Tie-2" como se determina mediante inmunolocalizacion. En otra modalidad específica, la célula es adicionalmente VEGFR1/Flt-1+, VEGFR2/KDR+, CD31", CD34", CD45", CD133" y Tie-2" como se determina mediante inmunolocalizacion.

En otra modalidad, las células adherentes derivadas del amnios OCT-4' son adicionalmente una o más, o todas de CD9\ CD10+, CD44+, CD49f\ CD54\ CD90+, CD98+, CD105+, CD200\ Tie-2+, TEM-7+, VEGFR1/Flt-1+ y/o VEGFR2/KDR+ (CD309+) , como se determina mediante inmunolocalizacion; o adicionalmente una o más, o todas de CD31", CD34", CD38", CD45", CD117", CD133", CD143", CD144", CD146", CD271", CXCR4" , HLA-G" , y/o VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalizacion o S0X2", como se determina mediante RT-PCR.

En ciertas modalidades, las células adherentes derivadas aisladas del amnios, adherentes a plástico para cultivo de tejidos son CD49f+. En una modalidad específica, tales células CD49f+ son adicionalmente una o más, o todas, de CD9+, CD10+, CD44+, CD90+, CD98+, CD105+, CD200+, Tie-2+, TEM-7+ , VEGFR1/Flt-1+ y/o VEGFR2 /KDR+ (CD309+) , como se determina mediante inmunolocalizacion; o adicionalmente uno o más, o todos, de CD31", CD34", CD38", CD45", CD117", CD133", CD143", CD144", CD146", CD271", CXCR4", HLA-G", OCT-4" y/o VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalizacion o SOX2", como se determina por RT-PCR.

En otras ciertas modalidades, las células adherentes derivadas del amnios adherente de plástico de cultivo de tejidos aislados son HLA-G", CD90+ y CD117". En una modalidad específica, tales células HLA-G", CD90+, y CD117" son adicionalmente uno o más, o todos, de CD9+, CD10+, CD44+, CD49f+, CD54+, CD98+, CD105+, CD200+, Tie-2+ , TEM-7+, VEGFR1/Flt-1+ y/o VEGFR2 /KDR+ (CD309+), como se determina mediante inmunolocalización; o adicionalmente uno o más o todos de CD31", CD34", CD38", CD45", CD133", CD143~, CD144", CD146", CD27", CXCR4", OCT-4" y/o Ve-caderina" , como se determina mediante inmunolocalización, o S0X2", como se determina por RP-PCR.

En otra modalidad, las células adherentes aisladas, derivadas del amnios, o población de células angiogénicas derivadas del amnios, no expresan constitutivamente ARNm para el factor 4 de crecimiento de fibroblastos (FGF4), interferón ? (IFNG) , quimiocina (motivo C-X-C) ligando 10 (CXCL10) , angiopoyetina 4 (ANGPT4) , angiopoyetina tipo 3 (ANGPTL3) , cadena de fibrinógeno o¡ (FGA) , leptina (LEP) , prolactina (PRL) , procineticina 1 (PROKI) , tenomodulina (TNMD) , FMS-como tirosina cinasa 3 (FLT3), dominio de enlace extracelular que contiene 1 (XLKDI), caderina 5, tipo 2 (CDH5), quimiocina 1 derivada de células de leucocitos (LECTl) , plasminógeno (PLG) , transcriptasa de telomerasa inversa (TERT) , (región Y que determina el sexo) -caja 2 (SOX2), NANOG, metaloproteasa 13 de matriz (MMP- 13), homeocaja 5 menos distal (DLX5) , y/o proteína de gamma-carboxiglutamato (gla) de hueso (BGLAP) , como se determina por RT-PCR, por ejemplo, durante 30 ciclos bajo condiciones de cultivo estándares. En otras modalidades, las células adherentes aisladas, derivadas del amnios, o población de células angiogénicas derivadas del amnios, expresan ARNm para (ARNT2) , factor de crecimiento del nervio (NGF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , factor neurotrófico derivado de la célula glial (GDNF) , neurotrofina 3 (NT-3), NT-5, Factor la inducible de hipoxia (HIFlA) , proteína 2 inducible de hipoxia (HIG2), heme oxigenasa (desciclización) 1 (HM0X1) , superóxido dismutasa extracelular [Cu-Zn] (S0D3), catalasa (CAT) , factor ß? de crecimiento transformante (TGFBl) , receptor ß? del factor de crecimiento transformante (TGFB1R) y receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR/c-met) .

En otro aspecto, se proporcionan en la presente poblaciones aisladas de células que comprenden las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente. Las poblaciones de células pueden ser poblaciones homogéneas, por ejemplo, una población de células, por lo menos aproximadamente 90%, 95%, 90% o 99% de las cuales son células adherentes derivadas del amnios . Las poblaciones de células pueden ser heterogéneas, por ejemplo, una población de células en donde casi aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de las células en la población son células adherentes derivadas del amnios. Las poblaciones aisladas de células no son, sin embargo de tejido, es decir, membrana amniótica.

En una modalidad, se proporciona en la presente una población de células aislada que comprende las A DAC, por ejemplo, una población de células sustancialmente homogéneas para las AMDAC, en donde tales AMDAC son adherentes al plástico para el cultivo de tejidos, y en donde tales AMDAC son OCT-4", como se determina por RT-PCR. En una modalidad específica, las AMDACs son CD49f+ o HLA-G+, por ejemplo, como se determina mediante inmunolocalización o RT-PCR. En otra modalidad específica, tal población de AMDAC es VEGFR1/Flt-1+ y/o VEGFR2/KDR+ como se determina mediante inmunolocalización, en donde la población de células aislada no es una membrana del amnios o amniótica. En una modalidad más específica, las AMDACs son OCT-4" y/o HLA-G" como se determina por RT-PCR y VEGFR1/Flt-1+ y/o VEGFR2 /KDR+ como se determina mediante inmunolocalización. En una modalidad específica, por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en tal población son células adherentes derivadas del amnios. En otra modalidad específica, tales AMDAC son CD90+, CD105+ o CD117". En una modalidad más específica, tales AMDAC son CD90+, CD105+ y CD117". En una modalidad más específica, las AMDACs son OCT-4" CD49f+, CD90+, CD105+ y CD117". En otra modalidad específica, las AMDACs no expresan SOX2 , por ejemplo, como se determina por RT-PCR durante 30 ciclos. En una modalidad aún más específica, la población comprende AMDAC, en donde tales AMDAC son OCT-4", HLA-G", CD49f\ CD90\ CD105+ y CD 17", como se determina mediante inmunolocalización o citometría de flujo, y SOX2", por ejemplo, como se determina por RT-PCR durante 30 ciclos.

En otra modalidad específica, tales AMDAC en la población de células son CD90+, CD105+ o CD 17", como se determina mediante inmunolocalizacion o citometría de flujo. En una modalidad más específica, las AMDACs son CD90+, CD105+ o CD117", como se determina mediante inmunolocalizacion o citometría de flujo. En una modalidad más específica las AMDACs son OCT-4" y HLA-G" , por ejemplo, como se determina por RT-PCR, y son adicionalmente CD49f+, CD90\ CD105+ y CD117" como se determina mediante inmunolocalizacion o citometría de flujo. En una modalidad más específica, las AMDACs en tal población de células son OCT-4", HLA-G", CD49f", CD90+, CD105+ y CD117". En otra modalidad, las AMDACs no expresan SOX2 , por ejemplo, como se determina por RT-PCR durante 30 ciclos. En una modalidad más específica, por lo tanto, la célula es OCT-4", CD49f+, CD90+, CD105* y CD117", como se determina mediante inmunolocalizacion o citometría de flujo y SOX2", como se determina por RT-PCR, por ejemplo, durante 30 ciclos. En una modalidad aún más específica, las AMDACs son OCT-4" o HLA-G", y son adicionalmente CD49f+, CD90+, CD105+ y CD117". En una modalidad más específica, las AMDACs son OCT-4, HLA-G", CD49f+, CD90+, CD105+ y CD117".

En otra modalidad, las células adherentes derivadas del amnios en tal población de células son adherentes al plástico para cultivo de tejidos, OCT-4" como se determina por RT-PCR y VEGFRl /Flt-l+ y/o VEGFR2 /KDR+ como se determina mediante inmunolocalización, y son adicionalmente una o más de CD9\ CD10\ CD44+, CD54+, CD98+ , Tie-2+ , TEM-7+ , CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146" o CXCR4", como se determina mediante inmunolocalización, o HLA-G" como se determina por RT-PCR, y en donde la población de células aislada no es un amnios . En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células aislada que comprende una célula derivada del amnios , en donde tal célula es adherente al plástico para el cultivo de tejidos, en donde la célula es OCT-4" como se determina por RT-PCR, y VEGFRl /Flt-1+ y/o VEGFR2/KDR+ como se determina mediante inmunolocalización, en donde la célula no expresa CD34 como se detecta mediante inmunolocalización después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días, y en donde tal población de células aislada no es un amnios. En una modalidad específica de cualquiera de las modalidades anteriores, por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en tal población son células adherentes derivadas del amnios.

En otra modalidad, cualquiera de las poblaciones anteriores de células que comprenden células adherentes derivadas del amnios forma brotes o estructuras similares a tubos cuando se cultivan en la presencia de una proteína de matriz extracelular , por ejemplo, como colágeno tipo I y IV, o un factor angiogénico, por ejemplo, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento epitelial (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) , por ejemplo, en o sobre un sustrato tal como colágeno placentario, por ejemplo o MATRIGEL™ durante por lo menos 4 días y hasta 14 días.

Las células adherentes derivadas del amnios, y poblaciones de células adherentes derivadas del amnios, despliegan una expresión característica de proteínas con relación a genes relacionados con angiogénesis y relacionados con cardiomiogénesis . En ciertas modalidades, se proporciona en la presente una célula que expresa, o una población de células, en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que expresa ARN para uno o más de, o todos de, ACTA2 (actina, alfa 2, músculo liso, aorta), ADAMTS1 (ADAM metalopeptidasa con motivo de trombospondina tipo 1, 1), AMGT (angiomotina) , A G (angiogenina) , ANGPTl (angiopoyetina 1), A GPT2 , A GPTLl (angiopoyetina tipo 1), ANGPTL2, ANGPTL4 , BAIl (inhibidor 1 de angiogénesis específico del cerebro), CD44, CD200, CEACAMl (molécula 1 de adhesión celular relacionada con antígenos carcinoembriónicos ) , CHGA ( cromogranina A), COL15A1 (colágeno, tipo XV, alfa 1), COL18A1 (colágeno, tipo XVIII, alfa 1), C0L4A1 (colágeno, tipo IV, alfa 1), COL4A2 (colágeno, tipo IV, alfa 2), COL4A3 (colágeno, tipo IV, alfa 3), CSF3 (factor 3 que estimula la colonia (granulocito) , CTGF (factor de crecimiento de tejido conectivo), CXCL12 (ligando 12 de quimiocina (motivo CXC) (factor I derivado de células estromales) ) , CXCL2, D MT3B (ADN (citosina-5- ) -metiltransferasa 3 beta) , ECGFI (timidina fosforilasa) , EDGl (gen 1 de diferenciación celular endotelial) , EDIL3 (repetición similares a EGF y dominios 3 similares a discoidina I), ENPP2 (ectonucleó ido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 2), EPHB2 (receptor B2 de EPH) , FBLN5 (FIBULIN 5), F2 (factor II de coagulación (trombina) ) , FGFl (factor de crecimiento de fibroblastos acídicos) , FGF2 (factor de crecimiento de fibroblastos básicos), FIGF (factor de crecimiento inducido por c-fos (factor D de crecimiento endotelial vascular)), FLT4 (tirosina cinasa 4 relacionada con fms), FNI ( fibronectina 1), FST (folistatina) , FOXC2 (caja C2 de cabeza de tenedor (MFH-I, cabeza de tenedor I mesenquimal) ) , GR (granulina) , HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) , HEYl (piloso/mejorador de división relacionado con YRPW motivo 1), HSPG2 (sulfato de heparán proteoglicano 2), IFNBI (interferón, beta 1, fibroblasto), IL8 (interleucina 8), IL12A, ITGA4 (integrina, alfa 4; CD49d) , ITGAV (integrina, alfa V), ITGB3 (integrina, beta 3), MDK (midkina) , MMP2 (metaloproteasa 2 de matriz) , MY0Z2 (miozenina 2), NRPI (neuropilina 1), NRP2 , PDGFB (factor ß de crecimiento derivado de plaquetas), PDGFRA (receptor a del factor de crecimiento derivado de plaquetas) , PDGFRB, PECAMl (molécula de adhesión celular, plaquetaria/endotelial ) , PF4 (factor 4 plaquetario) , PGKI ( fosfoglicerato cinasa 1), PROXI (prospero homeocaja 1) , PTN (pleyotrofina) , SEMA3F (semoforina 3F) , SERPINB5 (inhibidor de serpina peptidasa, ciado B (ovalbúmina) , miembro 5), SERPINCI, SERPINFI, TIMP2 (inhibidor de tejido de metaloproteinasas 2), TIMP3 , TGFA (factor de crecimiento transformante, alfa) , TGFBl , THBS1 ( rombospondina 1), THBS2, TIEl (tirosina cinasa con dominios 1 similares a inmunoglobulina y EGF) , TIE2/TEK, TNF (factor de necrosis tumoral) , TNlMIl (troponina I, tipo 1), TNFSF15 (superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando) miembro 15), VASHl (vasohibina 1), VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , VEGFB, VEGFC, VEGFRl/FLTl (receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular) , y/O VEGFR2/KDR.

Cuando se utilizan células humanas, las designaciones genéticas se refieren completamente a secuencias humanas, y, como se conoce bien por personas expertas en la técnica, secuencias representativas pueden encontrarse en la literatura, o en GenBank. Las sondas para las secuencias pueden determinarse mediante secuencias que están públicamente disponibles, o a través de fuentes comerciales, por ejemplo, sondas TAQMA ® específicas, o TAQMA ® Angiogenesis Array (Applied Biosystems, parte no. 4378710) .

Las células adherentes derivadas del amnios, y poblaciones de células adherentes derivadas del amnios, despliegan una expresión característica de proteínas relacionadas con angiogénesis . En ciertas modalidades, se proporciona en la presente una célula que expresa, o una población de células, en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aisladas, son células adherentes derivadas del amnios que expresan CD49d, Conexina-43, HLA-ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDLl, CD106, Galectina-1, precursor ADAM 17 (A desintegrina y dominio 17 de metaloproteinasa) (Enzima de conversión TNF-alfa) (TNF-alfa convertasa) , precursor Angiotensinógeno, Filamina A (Alfa- filamina) (Filamina 1) (proteína de unión de actina endotelina) (ABP-280) (filamina no muscular) , Alfa-actinina 1 (isoforma citoesquelética alfa-actina) (alfa-actinina 1 no muscular) (proteína de reticulación F-actina) , precursor de proteína 2 relacionado con el receptor de lipoproteína de baja densidad (Megalina) (Glicoproteína 330) (gp330) , tipos I y II del receptor de barredores de macrofagos tipos I y II (receptor I y II de LDL acetilado de macrofagos) , precursor tipo IIB del receptor de activina (ACTR-IIB) , proteína Wnt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrocito (GFAP) , proteína C de unión de miosina, tipo cardiaco ( yBP-C cardiaco) (proteína C, isoforma muscular cardiaca) , y/o cadena pesada de miosina, tipo A no muscular (cadena pesada de miosina celular, tipo A) , (cadena A pesada de miosina no muscular) (NMMHC-A) .

Las células adherentes derivadas del amnios proporcionadas en la presente además secretan proteínas que promueven angiogénesis , por ejemplo, en células endoteliales , células progenitoras endoteliales, o similares. En ciertas modalidades, la célula adherente derivada del amnios, población de células adherentes derivadas del amnios, o población de células que comprende células adherentes derivadas del amnios, por ejemplo, por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios, secretan una o más, o todas, de VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2 , Folistatina, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-I, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, Galectina-1, por ejemplo, en un medio de cultivo en el cual la célula o células, se cultivan.

En otra modalidad, cualquiera de las poblaciones anteriores de células que comprende células adherentes derivadas del amnios puede causar la formación de brotes o estructuras similares a tubos en una población de células endoteliales en contacto con tales células adherentes derivadas del amnios . En una modalidad específica, las células angiogénicas derivadas del amnios se co-cultivan con células endoteliales humanas, formando brotes o estructuras similares a tubos, o mantienen los brotes de células endoteliales, por ejemplo, cuando se cultivan en la presencia de proteínas de matriz extracelular tal como colágeno tipo I y IV, y/o factores angiogénicos tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento epitelial (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) , por ejemplo, en o sobre un sustrato tal como colágeno placentario o MATRIGEL™ durante por lo menos 4 días y/o hasta 14 días.

En otra modalidad, cualquiera de las poblaciones anteriores de células que comprende células adherentes derivadas del amnios secreta factores angiogénicos tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento epitelial (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) , o Interleucina-8 (IL-8) y por consiguiente puede inducir células endoteliales humanas para formar brotes o estructuras similares a tubo cuando se cultivan en presencia de proteínas de matriz extracelular tal como colágeno tipo I y IV, por ejemplo, en o sobre un sustrato tal como colágeno placentario o MATRIGEL™.

En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células, por ejemplo, una población de células adherentes derivadas del amnios, o una población de células en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que expresan ARN angiogénicos (miAR ) , en un nivel más elevado que las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde tales miARN comprenden uno o más, o todos de, miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, y/o miR-296. En otra modalidad, se proporciona en la presente una población de células, por ejemplo, una población de células adherentes derivadas del amnios, o una población de células en donde por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las células en tal población de células aislada, son células adherentes derivadas del amnios que expresa uno o más de, o todos de los micro ARN angiogénicos (miARN) en un nivel más bajo que las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea, en donde tales miARN comprenden uno o más, o todos de, miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b y/o miR-16. En ciertas modalidades, las AMDAC, o poblaciones de AMDAC, expresan uno o más, o todos, de los miARN angiogénicos miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b (miembros del miARN angiogénico grupo 17-92), miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, y/o miR-16.

De este modo, en una modalidad, se proporciona en la presente una célula adherente aislada, derivada del amnios, en donde tal célula es adherente al plástico para cultivo de tejidos, y en donde tal célula es OCT-4", como se determina por RT-PCR, y CD49f+, HLA-G", CD90+, CD105+ y CD117", como se determina mediante inmunolocalización, y en donde tal célula: (a) expresa uno o más de CD9 , CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRl/Flt-1 o VEGFR2/KDR (CD309), como se determina mediante inmunolocalización; (b) carece de expresión de CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4 , HLA-G o VE-caderina" , como se determina mediante inmunolocalización, o carece de expresión de SOX2 , como se determina por RT-PCR; (c) expresa mRNA para ACTA2 , ADAMTSl, AMOT, A G, ANGP l , ANGP 2 , ANGPTLl , ANGPTL2 , AGPTL4, BAIl, CD44, CD200, CEACAMl , CHGA, COL15A1, COL18A1, C0L4A1, COL4A2, COL4A3 , CSF3 , CTGF, CXCL12 , CXCL2 , D MT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3 , ENPP2 , EPHB2 , FBLN5 , F2 , FGFl , FGF2 , FIGF, FLT4, FNl , FST, FOXC2 , GRN, HGF, HEY1 , HSPG2 , IFNB1, IL8, IL12A, ITGA4 , ITGAV, ITGB3 , MDK, MMP2 , MYOZ2 , NRPl, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMl , PF4, PGKl , PROXl , PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINCl, SERPINFl, TIMP2 , TIMP3 , TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2 , TIEl, TIE2/TEK, TNF, T I1, TNFSF15, VASH1, VEGF, VEGFB, VEGFC , VEGFRl/FLTl, o VEGFR2/KDR; (d) expresa una o más de las proteínas CD49d, Conexina-43, HLA-ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDLl , CD106, Galectina-1 , ADAM 17, precursor angiotensinógeno, filamina A, alfa-actinina 1, megalina, receptor I y II de LDL acetilado con macrófago, precursor tipo IIB del receptor de activina, proteína Wnt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrocito, proteína C de unión de miosina, o cadena pesada de miosina, tipo A no muscular; (e) secreta VEGF , HGF, IL-8, MCP-3, FGF2 , Folistatina, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-I, PDGF-BB , TIMP-2, uPAR, o Galectina-1 en un medio de cultivo en el cual la célula se desarrolla; (f) expresa micro ARN miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, o miR-296 en un nivel más elevado que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea; (g) expresa micro ARN miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b o miR-16, en un nivel más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea; (h) expresa miARN miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b ó miR-16; y/o (i) expresa niveles incrementados de CD202b, IL-8 o VEGF cuando se cultivan en menos de aproximadamente 5% de 02, en comparación con la expresión de CD202b, IL-8 o VEGF bajo 21% de 02. En una modalidad específica, la célula adherente aislada, derivada del amnios es OCT-4", como se determina por RT-PCR, y CD49f+, HLA-G" , CD90\ CD105+ y CD117", como se determina mediante inmunolocalización, y (a) expresa CD9 , CD10, CD44, CD54, CD90, CD98, CD200, Tie-2, TE -7, VEGFRl/Flt-1, y/o VEGFR2/KDR (CD309) como se determina mediante inmunolocalizacion; (b) carece de expresión de CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G, y/o VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalizacion, o carece de expresión de S0X2, como se determina mediante RT-PCR; (c) expresa ARNm para ACTA2 , ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPTl , ANGPT2 , ANGPTLl , ANGPTL2 , ANGPTL4, BAI1, CD44, CD200, CEACAMl , CHGA, C0L15A1, COL18A1, C0L4A1, COL4A2, COL4A3 , CSF3 , CTGF , CXCL12, CXCL2 , D T3B, ECGFl , EDG1 , EDIL3 , ENPP2 , EPHB2 , FBLN5 , F2 , FGFl , FGF2 , FIGF , FLT4, FNl , FST, FOXC2 , GR , HGF ( HEYl , HSPG2 , IFNBl , IL8, IL12A, ITGA4, ITGAV, ITGB3 , MD , MMP2 , MYOZ2 , NRPl, NRP2, PDGFB , PDGFRA, PDGFRB , PECAMl , PF4 , PGKl , PROXl , PTN, SEMA3F, SERPINB5 , SERPINC1 , SERPINFl , TIMP2 , TIMP3 , TGFA, TGFBl , THBS1 , THBS2 , TIEl , TIE2/TEK, TNF, TN Il, TNFSF15, VASHl, VEGF , VEGFB, VEGFC , VEGFRl/FLTl, y/o VEGFR2 /KDR; (d) expresa una o más de CD49d, Conexina-43, HLA-ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDLl, CD106, Galectina-1, ADAM 17, precursor angiotensinógeno, filamina A, alfa-actinina 1, megalina, receptor I y II de LDL acetilado con macrófago, precursor tipo IIB del receptor de activina, proteína Wnt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrocito, proteína C de unión de miosina, y/o cadena pesada de miosina, tipo A no muscular; (e) secreta VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2 , Folistatina, G-CSF, EGF , ENA-78, GRO, IL-6, CP-1, PDGF-BB, TI P-2, uPAR, y/o Galectina-1, por ejemplo, en un medio de cultivo en el cual la célula se desarrolla; (f) expresa micro ARN miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, y/o miR-296 en un nivel más elevado que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea; (g) expresa micro ARN miR-20aí miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b y/o miR-16, en un nivel más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea; (h) expresa miAR miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b y/o miR-16; y/o (i) expresa niveles incrementados de CD202b, IL-8 y/o VEGF cuando se cultivan en menos de aproximadamente 5% de 02, en comparación con la expresión de CD202b, IL-8 y/o VEGF bajo 21% de 02. Además, se proporcionan en la presente poblaciones de células que comprenden AMDAC, por ejemplo, poblaciones de AMDAC, que tienen una o más de las características citadas anteriormente .

En otra modalidad, cualquiera de las poblaciones anteriores de células que comprenden células adherentes derivadas del amnios secretan factores angiogénicos . En modalidades específicas, la población de células secreta un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento epitelial (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) , y/o interleucina-8 (IL-8). En otras modalidades especificas, la población de células que comprende células angiogénicas derivadas del amnios secreta uno o más factores angiogénicos y por consiguiente induce a células endoteliales humanas que migren en un ensayo de cicatrización de heridas. En otras modalidades específicas, la población de células que comprende células adherentes derivadas del amnios induce maduración, diferenciación o proliferación de células endoteliales humanas, progenitores endoteliales, miocitos o mioblastos.

En otra modalidad, cualquiera de las poblaciones anteriores de células que comprenden células adherentes derivadas del amnios agrupan una lipoproteína de baja densidad (LDL) acetilada cuando se cultivan en la presencia de proteínas de matriz extracelular, por ejemplo, colágeno tipo I ó IV, y/o uno o más factores angiogénicos, por ejemplo, VEGF, EGF, PDGF o bFGF, por ejemplo, en un sustrato tal como colágeno placentario o MATRIGEL™.

En otra modalidad, se proporciona una población de células que comprende células adherentes derivadas del amnios, en donde tales células son adherentes al plástico para el cultivo de tejidos, y en donde tales células son OCT-4", como se determina por RT-PCR y VEGFR2 /KDR+ , CD9+, CD54+, CD 105+, CD200+, o VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalización . En modalidades específicas, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ó 99% de las células en tal población de células son células derivadas del amnios que son OCT-4", como se determina por RT-PCR, y VEGFR2 /KDR+, CD9+ , CD54+, CD105+ , CD200+, O VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalización . En otra modalidad específica, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ó 99% de las células en tal población son células derivadas del amnios que son OCT-4", como se determina por RT-PCR y VEGFR2 /KDR+ , CD9+ , CD54+, CD105+, CD200+ y VE-caderina" , como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad específica, tales células que son OCT-4", como se determina por RT-PCR y VEGFR2 /KDR+ , CD9+, CD54+, CD105+ , CD200+ o VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalización, después de la exposición de 1 a 100 ng/mL de VEGF durante 4 a 21 días. En otra modalidad específica, tales células son también VE-caderina" .

Las poblaciones de células provistas en la presente, que comprenden células adherentes derivadas del amnios, son capaces de formar brotes o estructuras similares a tubo que se asemejan a vasos o vasculatura. En una modalidad, las poblaciones de células que comprenden células adherentes derivadas del amnios forman brotes o estructuras similares a tubo cuando se cultiva en la presencia de una porción angiogénica, por ejemplo, VEGF, EGF, PDGF o bFGF. En una modalidad más específica, tales células derivadas del amnios que son OCT-4", como se determina por RT-PCR, y VEGFR2/KDR+, CD9+, CD54+, CD105+, CD200+ o VE-caderina" , como se determina mediante inmunolocalización, forman brotes o estructuras similares a tubo cuando tal población de células se cultiva en la presencia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) .

Las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente despliegan las características anteriores, por ejemplo, combinaciones de marcadores de superficie celular y/o perfiles de expresión genética, y/o potencia y función angiogénica, en cultivo primario o durante la proliferación en el medio apropiado para el cultivo de células madre. Tal medio incluye, por ejemplo, el medio que comprende 1 a 100% de DMEM-LG (Gibco) , 1 a 100% de MCDB-201 (Sigma) , 1 a 10% de suero de ternera fetal (FCS) (Hyclone Laboratories), 0.1 a 5x de insulina-transferrina'selenio (ITS, Sigma), 0.1 a 5x de ácido linolénico-albúmina de suero de bovino (LA-BSA, Sigma) , 10"5 a 10"15 M de dexametasona (Sigma) , 102 a 10"10 M de 2-fosfato de ácido ascórbico (Sigma) , 1 a 50 ng/ml del factor de crecimiento de epidérmico (EGF) , (R&D Systems) , 1 a 50 ng/ml del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) (R&D Systems) , y 100U de penicilina/lOOOU de estreptomicina. En una modalidad específica, el medio comprende 60% de DMEM-LG (Gibco) , 40% de MCDB-201 (Sigma) , 2% de suero de ternera fetal (FCS) (Hyclone Laboratories), lx de insulina-transíerrina'selenio (ITS9, lx de ácido linolénico-albumina de suero de bovino ( LA-BSA) , 10"9 M dexametasona (Sigma) , 10"4 de 2-fosfato de ácido ascórbico (Sigma) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) 10 de ng/ml (R&D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas ( PDGF-BB ) 10 ng/ml (R&D Systems) y 100U de penicilina/lOOOU de estreptomicina. Otros medios adecuados se describen posteriormente .

Las poblaciones aisladas de células adherentes derivadas del amnios provistas en la presente pueden comprender aproximadamente, por lo menos aproximadamente, o no más de aproximadamente 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más células adherentes derivadas del amnios, por ejemplo, en un recipiente. En varias modalidades, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 99% de las células en las poblaciones de células aisladas provistas en la presente son células adherentes derivadas del amnios. Es decir, una población de células adherentes aisladas, derivadas del amnios puede comprender por ejemplo, tanto como 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sin células madre.

Las células adherentes derivadas del amnios provistas en la presente pueden cultivarse en un sustrato. En varias modalidades, el sustrato puede ser cualquier superficie en la cual el cultivo y/o selección de células adherentes derivadas del amnios, puede completarse. Típicamente, el sustrato es plástico, por ejemplo, un disco de cultivo para tejidos o un plástico de placa de pozos múltiples. El plástico para cultivo de tejidos puede tratarse, recubierto o impreso con una biomolécula o agente mimético sintético, por ejemplo, CELLSTART™, MESENCULT™ ACF-sustrato, ornitina o polilisina o una proteína de matriz extracelular , por ejemplo, colágeno, laminina, fibronectina, vitronectina o similares.

Las células derivadas del amnios, por ejemplo, las células adherentes derivadas del amnios provistas en la presente, y poblaciones de tales células, pueden aislarse de una o más placentas. Por ejemplo, una población aislada de las células derivadas del amnios provistas en la presente puede ser una población de células placentarias que comprenden tales células obtenidas a partir de, o contenidas dentro de un tejido interrumpido del amnios, por ejemplo, el material metabolizado (es decir, la recolección de células obtenidas mediante digestión enzimática de un amnios), en donde tal población de células se enriquece para las células derivadas del amnios, y en donde el te ido es de una placenta sencilla o de dos o más placentas. Las células adherentes aisladas, derivadas del amnios pueden cultivarse y se expandieron para producir poblaciones de tales células. Las poblaciones de células placentarias que comprenden células adherentes derivadas del amnios pueden también pueden cultivarse y expandirse para producir poblaciones de células adherentes derivadas del amnios .

En ciertas modalidades, las AMDACs que despliegan cualquiera de las características marcadoras y/o de expresión genética han sido cambiadas de cultivo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 veces, o más. En ciertas otras modalidades, las AMDACs que despliegan cualquiera de las características marcadoras y/o de expresión genética anterior han sido duplicadas en cultivo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o por lo menos 50 veces, o más. 5.2. POBLACIONES DE CELULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL AMNIOS QUE CONPRENDEN OTROS TIPOS DE CÉLULA Las poblaciones de células aisladas que comprenden células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente pueden comprender un segundo tipo celular, por ejemplo, células placentarias que no son células adherentes derivadas del amnios, o por ejemplo, células que no son células placentarias. Por ejemplo, una población aislada de células adherentes derivadas del amnios puede comprender por ejemplo, por ejemplo, puede combinarse con, una población de un segundo tipo de células, en donde el segundo tipo de célula son, por ejemplo, células madre embriónicas, glóbulos (por ejemplo, sangre placentaria, glóbulos periféricos, sangre de cordón umbilical, glóbulos de cordón umbilical, sangre periférica, glóbulos periféricos, células nucleadas a partir de sangre placentaria, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, y similares) , células madre aisladas de sangre (por ejemplo, células madre aisladas a partir de sangre placentaria, sangre del cordón umbilical o sangre periférica) , células madre placentaria (por ejemplo, las células madre placentaria descritas en la Patente Estadounidense No. 7,468,276, y en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2007/0275362, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades) , células nucleadas de perfusato placentario, por ejemplo, células nucleadas totales de perfusato placentario; células madre del cordón umbilical, poblaciones de células nucleadas derivadas de sangre, células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea, células madre mesenquimales derivadas de médula ósea, células madre hematopoyética derivadas de médula ósea, médula ósea natural, células madre adultas (somáticas), poblaciones de células madre contenidas dentro del tejido, células cultivadas, por ejemplo, células madre cultivadas, poblaciones de células complementa diferenciadas (por ejemplo, condrocitos, fibroblastos, células amnióticas, osteoblastos , células musculares, células cardiacas, etc.) , pericitos, y similares. En una modalidad específica, una población de células que comprende células adherentes derivadas del amnios comprende células madre placentarias o células madre del cordón umbilical. En ciertas modalidades en las cuales el segundo tipo de células es sangre o glóbulos, se han removido los eritrocitos de la población de células.

En una modalidad específica, el segundo tipo de célula es una célula madre hematopoyética . Tales células madre hematopoyéticas pueden estar, por ejemplo, contenidas dentro de la placenta natural, sangre del cordón umbilical o sangre periférica; en células nucleadas totales de sangre placentaria, sangre del cordón umbilical o sangre periférica; en una población aislada de células CD34+ de sangre placentaria, sangre del cordón umbilical o sangre periférica; en médula ósea natural; en células nucleadas totales de médula ósea; en una población aislada de células CD34+ de médula ósea, o similares.

En otra modalidad, una población aislada de células adherentes derivadas del amnios se combina con una pluralidad de células adultas o progenitoras del sistema vascular. En varias modalidades, las células son células endoteliales , células progenitoras endoteliales, miocitos, cardiomiocitos , pericitos, angioblastos , mioblas os o cardiomioblastos .

En otra modalidad, el segundo tipo celular es un tipo de célula no embrionica manipulada en cultivo con el fin de expresar los marcadores de pluripotencia y las funciones asociadas con células madre embriónicas.

En modalidades específicas de las poblaciones aisladas anteriores de células adherentes derivadas del amnios, cualquiera o ambas de las células adherentes derivadas del amnios y células es un segundo tipo, son autólogas o son alogeneicos, a un recipiente pretendido de las células.

Se proporciona además en la presente una composición que comprende células adherentes derivadas del amnios, y una pluralidad de células madre a diferencia de las células adherentes derivadas del amnios. En una modalidad específica, la composición comprende una célula madre que se obtiene de una placenta, es decir, una célula madre placentaria, por ejemplo, las células madre placentarias como se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 7,045,148; 7,255,879; y 7,311,905 y en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2007/0275362, las descripciones de cada una de las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades. En modalidades específicas, tales células madre placentarias son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilita la formación de uno o más cuerpos similares a embrioide en una población de células placentarias que comprenden tal célula madre cuando la población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de un cuerpo similar a embrioide; u 0CT-4+ y facilita la formación de uno o más cuerpos similares a embrioide en una población de células placentarias que comprende la célula madre cuando la población se cultiva bajo condiciones que permitan la formación de cuerpos similares a embrioide; o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad más específica, tal CD200+, las células madre HLA-G+ son CD34", CD38~, CD45~, CD73+ y CD 105+. En otra modalidad más específica, tales células madre CD73+, CD 105+ y CD200+ son CD34", CD38", CD45" y HLA-G+. En otra modalidad más específica, tales células madre CD200+, OCT-4+ son CD34", CD38", CD45", CD73+ , CD 105+ y HLA-G+. En otra modalidad más específica, tales células madre CD73+ , CD 105+ y HLA-G+ son CD34", CD45", OCT-4+ y CD200+. En otra modalidad más específica, tales células madre CD73+ y CD105+ son OCT-4+, CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad más específica, tales células madre OCT-4+ son CD73+ , CD105+, CD200+, CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad más específica, las células madre placentarias son de origen materno (es decir, tienen el genotipo materno) . En otra modalidad más específica, las células madre placentarias son de origen fetal (es decir, tienen el genotipo fetal) .

En otra modalidad específica, la composición comprende células adherentes derivadas del amnios, y células madre embriónicas. En otra modalidad específica la composición comprende células adherentes derivadas del amnios y células estromales o madre mesenquimales derivadas de la médula ósea. En otra modalidad específica, la composición comprende células madre hematopoyéticas derivadas de la médula ósea. En otra modalidad específica, la composición comprende células adherentes derivadas del amnios y células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, células progenitoras hematopoyéticas a partir de médula ósea, sangre fetal, sangre del cordón umbilical, sangre placentaria y/o sangre periférica. En otra modalidad específica, la composición comprende células adherentes derivadas del amnios y células madre somáticas. En una modalidad más específica, tal célula somática es una célula madre neural, una célula madre hepática, una célula madre pancreática, una célula madre endotelial, una célula madre cardiaca o una célula madre muscular.

En otras modalidades específicas, el segundo tipo de células comprende aproximadamente, por lo menos, o no más de 10% , 15% , 20% , 25% , 30% , 35% , 40% , 45% ó 50% de células en tal población. En otras modalidades específicas, las AMDACs en tal composición comprenden por lo menos 50% , 55% , 60% , 65% , 70% , 75% , 80% , 85% ó 90% de células en tal composición.

En otras modalidades específicas, las células adherentes derivadas del amnios comprenden aproximadamente, por lo menos o no más de, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% de células en tal población.

Las células en una población aislada de células adherentes derivadas del amnios pueden combinarse con una pluralidad de células de otro tipo, por ejemplo, con una población de células madre en una relación de aproximadamente 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000; o aproximadamente 1:100,000,000, comparando números de células totales nucleadas en cada población. Las células en una población aislada de células adherentes derivadas del amnios pueden combinarse con una pluralidad de células de una pluralidad de tipos celulares, también. 5.3 CRECIMIENTO EN EL CULTIVO El crecimiento de las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente, con respecto a cualquier célula de mamífero, depende en parte del medio particular seleccionado para el crecimiento. Bajo condiciones óptimas, las células adherentes derivadas del amnios típicamente se duplican en número en aproximadamente 24 horas. Durante el cultivo, las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente se adhieren a un sustrato en el cultivo, por ejemplo, la superficie de un recipiente para el cultivo de tejidos (por ejemplo, una placa de plástico para el cultivo de tejidos, plástico recubierto con fibronectina y similares) y forma una monocapa. Típicamente, las células asentadas en el cultivo en un lapso de 2-7 días alteran la digestión del amnios. Proliferan duplicando la población en aproximadamente 0.4 a 1.2 por día y pueden experimentar por lo menos 30 a 50 duplicados de población. Las células despliegan un fenotipo similar a células mesenquimales/fibroblásticas durante la subconfluencia y expansión, y una apariencia similar a un cubo/adoquín en la confluencia, y la proliferación en cultivo se inhibe fuertemente por contacto. Las poblaciones de las células angiogénicas derivadas del amnios pueden formar cuerpos embrioides durante la expansión en el cultivo. 5.4 MÉTODOS PARA OBTENER CÉLULAS ANGIOGÉNICAS DERIVADAS DEL AMNIOS Las células adherentes derivadas del amnios y poblaciones aisladas de células que comprenden las células ad erentes derivadas del amnios, provistas en la presente pueden producirse por ejemplo, mediante digestión del tejido amniótico seguido mediante selección de células adherentes. En una modalidad, por ejemplo, las células adherentes aisladas, derivadas del amnios, o una población aislada de células que comprende células adherentes derivadas del amnios, pueden producirse (1) digiriendo el tejido amniótico con una primera enzima para disociar células a partir de la capa epitelial del amnios desde las células a partir de la capa mesenquimal del amnios; (2) metabolizar subsiguientemente la capa mesenquimal del amnios con una segunda enzima para formar una suspensión de célula sencilla; (3) cultivar células en tal suspensión de célula sencilla en una superficie de cultivo de tejidos, por ejemplo, plástico para cultivo de tejidos, y (4) seleccionar células que se adhieren a tal superficie después de un cambio de medio, por lo que se produce una población aislada de células que comprende células adherentes derivadas del amnios . En una modalidad específica, tal primera enzima es tripsina. En una modalidad más específica, se utiliza la tripsina en una concentración de 0.25% de tripsina (p/v) en 5-20, por ejemplo, una solución de 10 mililitros por gramo de tejido amniótico que se digiere. En otra modalidad más específica, la digestión con tripsina se deja continuar durante aproximadamente 15 minutos a 37°C y se repite hasta tres ocasiones. En otra modalidad específica, la segunda enzima es colagenasa. En una modalidad más específica, se utiliza la colagenasa en una concentración entre 50 y 500 U/L en 5 mi por gramo del tejido amniótico que se digiere. En otra modalidad más específica, la digestión con colagenasa se deja continuar durante aproximadamente 45-60 minutos a 37°C. En otra modalidad más específica, la suspensión de célula sencilla formada después de la digestión con colagenasa se filtra a través de por ejemplo, de un filtro de 75 µ? - 150 uM entre la etapa (2) y la etapa (3). En otra modalidad específica, la primera enzima es tripsina, y la segunda enzima es colagenasa.

Una población aislada de células que comprende células adherentes derivadas del amnios puede, en otra modalidad, obtenerse seleccionando células a partir del amnios, por ejemplo, células obtenidas digiriendo tejido amniótico como se describe en algún lugar en la presente, es decir despliega una o más características de una célula adherente derivada del amnios. En una modalidad, por ejemplo, una población celular se produce mediante un método que comprende seleccionar las células amnióticas que son (a) negativas para OCT-4, como se determina por RT-PCR, y (b) positivas para uno o más de VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200, como se determina mediante inmunolocalización; y aislando tales células de otras células para formar una población celular. En una modalidad específica, las células amnióticas son adicionalmente VE-caderina. En una modalidad específica, se produce una población celular seleccionando células placentarias que son (a) negativas para OCT-4, como se determina por RT-PCR y VE-caderina", como se determina mediante inmunolocalización, y (b) positivas para cada VEGFR2/KDR, CD9 , CD54, CD 105, CD200, como se determina mediante inmunolocalización; y aislando tales células de otras células para formar una población celular. En ciertas modalidades, la selección mediante inmunolocalización se realiza antes de la selección por RT-PCR. En otra modalidad específica, la selección comprende seleccionar células que no expresan un marcador celular CD34 después del cultivo durante 4 a 21 días en la presencia de 1 a 100 ng/ml de VEGF.

En otra modalidad, por ejemplo, se produce una población celular mediante un método que comprende seleccionar células amnióticas que se adhieren al plástico para cultivo de tejidos y son OCT-4"; como se determina por RT-PCR, y VEGFR1/Flt-1+ y VEGFR2 /KDR+ , como se determina mediante inmunolocalización, y aislando las células de otras células para formar una población celular. En una modalidad específica, se produce una población celular mediante un método que comprende seleccionar células amnióticas que son OCT-4"; como se determina por RT-PCR, y VEGFR1/Flt-1+ , VEGFR2/KDR+ y HLA-G; como se determina mediante inmunolocalización. En otra modalidad especifica, se produce la población celular seleccionando células amnióticas que son adicionalmente una o más o todas de CD9+ , CD10+, CD44+, CD54+, CD98+, Tie-2+, TEM-7+ , CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146" y/o CXCR4" (receptor 4 de quimiocina (motivo C-X-C) ) como se determina mediante inmunolocalización y aislando las células a partir de células que no despliegan una o más de estas características. En otra modalidad específica, la población celular se produce seleccionando células amnióticas que son adicionalmente VE-caderina" como se determina mediante inmunolocalización, y aislando las células a partir de células que son VE-caderina+ . En otra modalidad específica, la población celular se produce seleccionando células amnióticas que son adicionalmente CD105+ y CD200+ como se determina mediante inmunolocalización, y aislando las células de otras células que son CD 105" o CD200". En otra modalidad específica, tal célula no expresa CD34 como se detecta mediante inmunolocalización alternado la exposición de 1 a 100 ng/ml de VEGF durante 4 a 21 días.

En la selección de células, no es necesario probar una población completa de células para características específicas a células adherentes derivadas del amnios . Más bien, una o más alícuotas de células (por ejemplo, aproximadamente 0.5% - 2%) de una población de células puede probarse para tales características, y los resultados pueden atribuirse a las células restantes en la población.

Pueden confirmarse células seleccionadas que son células adherentes derivadas del amnios provistas en la presente cultivando una muestra de las células (por ejemplo, aproximadamente 104 a aproximadamente 105 células) en un sustrato, por ejemplo, MATRIGEL™, durante 4 a 14, por ejemplo, 7 días en la presencia de VEGF (por ejemplo, aproximadamente 50 ng/ml) e inspeccionando visualmente las células de la aparición de brotes y/o redes celulares.

Pueden seleccionarse células adherentes derivadas del amnios mediante los marcadores anteriores utilizando cualquier método conocido en la técnica de selección celular. Por ejemplo, las células adherentes pueden seleccionarse utilizando un anticuerpo o anticuerpos a uno o más marcadores de superficie celular, por ejemplo, en inmunolocalización, por ejemplo, citometría de flujo o FACS . La selección puede lograrse utilizando anticuerpos junto con perlas magnéticas. Los anticuerpos que son específicos para ciertos marcadores se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente, por ejemplo, anticuerpos para CD9 (Abcam) ; CD54 (Abcam) ; CD105 (Abcam; BioDesign International, Saco, ME, etc.); CD200 (Abcam) citoqueratina (SigmaAldrich) . Anticuerpos para otros marcadores están también disponibles comercialmente, por ejemplo, CD34, CD38 y CD45 están disponibles a partir de, por ejemplo, StemCell Technologies or BioDesign International.

Los cebadores para secuencias OCT-4 adecuadas para RT-PCR pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, de illipore o Invitrogen, o pueden derivarse fácilmente de la secuencia humana en GenBank No. de Acceso DQ486513.

Métodos detallados para obtener tejido placentario y amniótico, y para tratar tal tejido con el fin de obtener células adherentes derivadas del amnios , se proporcionan posteriormente . 5.4.1 Composición de Recolección Celular Generalmente, las células pueden obtenerse a partir del amnios o de una placenta de mamífero, por ejemplo, una placenta humana, utilizando una solución fisiológicamente aceptable, por ejemplo, una composición de recolección celular. De preferencia, la composición de recolección celular evita o suprime apoptosis, evita o suprime muerte celular, lisis, descomposición y similares. Una composición de recolección celular se describe en detalle con relación a la Publicación de Patente Estadounidense No. 2007/0190042, intitulada, "Improved Médium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs", la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

La composición de recolección celular puede comprender cualquier solución fisiológicamente aceptable para la recolección y/o el cultivo de células adherentes derivadas del amnios, por ejemplo, una solución salina (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, solución de Kreb, solución modificada de Kreb, Solución de Eagle, 0.9% de NaCl, etc.), un medio de cultivo (por ejemplo, DMEM, H, DMEM, etc.), y similares, con o sin la adición de un componente de tamponación, por ejemplo, ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetansulfónico (HEPES) .

La composición de recolección celular puede comprender uno o más componentes que tienden a conservar células, por ejemplo, células adherentes derivadas del amnios, es decir, evitan que las células se sequen, o se retarde la muerte de las células, reduce el número de células en una población de células que mueren, o similares, a partir del momento de la recolección al momento del cultivo. Tales componentes pueden ser, por ejemplo, un inhibidor de apoptosis (por ejemplo, un inhibidor de caspasa o inhibidor de JNK) ; un vasodilatador (por ejemplo, sulfato de magnesio, un fármaco antihipertenso, péptido natriurético atrial (A P) , adrenocorticotropina, hormona de liberación de corticotropina, nitroprusida sódica, hidralazina, trisfosfato de adenosina, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc.), un inhibidor de necrosis (por ejemplo, 2- (l-H-indol-3-il) -3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina o clonazepam) ; un inhibidor de TNF-a; y/o un perfluorocaburo que tiene oxígeno (por ejemplo, bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).

La composición de recolección celular puede comprender una o más enzimas que degradan el tejido, por ejemplo, una metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutra, un ARNasa, o una ADNasa o similares. Tales enzimas incluyen, aunque no se limitan a colagenasa (por ejemplo, colagenasa I, II, III ó IV, una coleganasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASE™, hialuronidasa, y similares. El uso de las composiciones de recolección celular que comprende enzimas de digestión de tejidos se discute en más detalle posteriormente .

La composición de recolección celular puede comprender una cantidad bacteriocida o bacteriostáticamente efectiva de un antibiótico. En ciertas modalidades no limitantes, el antibiótico es un macrólido (por ejemplo, tobramicina) , una cef losporina (por ejemplo, cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxilo) , una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (por ejemplo, penicilina V) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacina, cirprofloxacino o norfloxacino) , una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En una modalidad particular, el antibiótico es activo contra bacterias Gram(+) y/o Gram(-), por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y similares.

La composición de recolección celular puede también comprender uno o más de los siguientes compuestos: adenosina (aproximadamente 1 inM a aproximadamente 50 mM) ; D-glucosa (aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM) ; iones de magnesio (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM) ; una macromolécula de peso molecular mayor de 20,000 daltons, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y la viabilidad celular (por ejemplo, un coloide sintético o de origen natural, un polisacárido tal como dextrano o un polietilenglicol presente en aproximadamente 25 g/1 a aproximadamente 100 g/1, o aproximadamente 40 g/1 a aproximadamente 60 g/1) ; un antioxidante (por ejemplo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutatión, vitamina C o vitamina E presente en aproximadamente 25 µ? a aproximadamente 100 uM) ; un agente reductor (por ejemplo, N-acetilcisteína presente en aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 5 mM) ; un agente que evita que el calcio entre a las células (por ejemplo, verapamilo presente en aproximadamente 2 uM a aproximadamente 25 µ?) ; nitroglicerina (por ejemplo, aproximadamente 0.05 g/1 a aproximadamente 2 g/1) ; un anticoagulante, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para ayudar a evitar la coagulación de sangre residual (por ejemplo, heparina o hirudina presentes en una concentración de aproximadamente 100 unidades/1 a aproximadamente 100,000 unidades/1) ; o un compuesto que contiene amilorida (por ejemplo, amilorida, etil isopropil amilorida, hexametilen amilorida, dimetil amilorida o isobutil amilorida presente en aproximadamente 1.0 uM a aproximadamente 5 uM.

Las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente también pueden recolectarse, por ejemplo, durante y después de la digestión como se describe pos eriormente, en un tampón fisiológicamente aceptable, simple, por ejemplo, una solución salina tamponada con fosfato, una solución de NaCl al 0.9%, un medio de cultivo celular, o similares. 5.4.2. Recolección y Manejo de la Placenta Generalmente, se recupera una placenta humana en poco tiempo, después de su expulsión después del parto o después, por ejemplo, de una cesárea. En una modalidad preferida, la placenta se recupera de un paciente después del consentimiento informado y después de que se obtiene un historial médico completo del paciente y se asocia con la placenta. De preferencia, el historial médico continúa después del suministro. Tal historial médico puede utilizarse para coordinar el uso subsiguiente de la placenta o las células cosechadas a partir de la misma. Por ejemplo, las células placentarias humanas, por ejemplo, células derivadas del amnios, pueden utilizarse, en vista del historial médico, para medicina personalizada para el infante, o en un paciente cercano, asociado con la placenta, o para padres, hermanos u otros parientes del infante.

Antes de la recuperación de las células adherentes derivadas del amnios, la sangre del cordón umbilical y la sangre placentaria se remueven. En ciertas modalidades, después del suministro, la sangre del cordón en la placenta se recupera. La placenta puede someterse a un proceso de recuperación de sangre del cordón convencional. Típicamente, se utiliza una aguja o cánula, con la ayuda de gravedad, para exsangrar la placenta (por ejemplo, véase Anderson, Patente Estadounidense No. 5,372,581; Hessel et al., Patente Estadounidense No. 5,415,665) . La aguja o cánula se coloca usualmente en la vena umbilical y la placenta puede masajearse suavemente para ayudar a drenar la sangre del cordón desde la placenta. Tal recuperación de sangre del cordón puede realizarse comercialmente, por ejemplo, LifeBank USA, Cedar Knolls, N.J. ViaCord, Cord Blood Registry y Cryocell. De preferencia, la placenta se drena por gravedad sin manipulación adicional de manera que se minimiza la interrupción del tejido durante la recuperación de la sangre del cordón.

Típicamente, una placenta se transforma desde el suministro o sala de parto a otra ubicación, por ejemplo, un laboratorio, para recuperación de la sangre del cordón y la recolección de células por ejemplo, mediante reperfusión o disociación de tejido. La placenta se transporta de preferencia en un dispositivo estéril, térmicamente aislado (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28°C) , por ejemplo, colocando la placenta, con el cordón umbilical próximo asegurado, en una bolsa de plástico tipo ziplock estéril, la cual se coloca entonces en un recipiente aislado. En otra modalidad, la placenta se transporta en un kit de recolección de sangre del cordón sustancialmente como se describe en la Patente Estadounidense No. 7,147,626. De preferencia, la placenta se suministra al laboratorio cuatro a veinticuatro horas después del suministro. En ciertas modalidades, el cordón umbilical próximo se asegura, de preferencia dentro de 4-5 cm (centímetros) de la inserción dentro del disco placentario antes de la recuperación del cordón umbilical. En otras modalidades, el cordón umbilical próximo se asegura después de la recuperación de sangre del cordón aunque antes del procesamiento adicional de la placenta.

La placenta, antes de la recolección celular, puede almacenarse bajo condiciones estériles y a una temperatura de por ejemplo, 4 a 25°C (centígrados), por ejemplo, a temperatura ambiente. La placenta puede almacenarse durante por ejemplo, un periodo de cero a veinticuatro horas, hasta cuarenta y ocho horas, o más de cuarenta y ocho horas, antes de bombear la placenta para remover sangre residual del cordón. En una modalidad, la placenta se cosecha a partir de aproximadamente cero horas a aproximadamente dos horas después de la expulsión. La placenta puede almacenarse en una solución anticoagulante en una temperatura de por ejemplo, 4 a 25°C (centígrados) . Las soluciones anticoagulantes adecuadas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse una solución de citrato de sodio, heparina o warfarina sódica. En una modalidad preferida, la solución anticoagulante comprende una solución de heparina (por ejemplo, 1% p/p en solución de 1:1000). La placenta exsangrada se almacena de preferencia por no más de 36 horas antes de que se recolecten las células. 5.4.3 Interrupción Física y Digestión Enzimática del Tejido Amniótico En una modalidad, se separa el amnios del resto de la placenta, por ejemplo, por disección roma, por ejemplo, utilizando los dedos. El amnios puede diseccionarse por ejemplo, en partes o segmentos del tejido, antes de la digestión enzimática y de la recuperación celular adherente. Pueden obtenerse células adherentes derivadas del amnios a partir del amnios completo, o de un pequeño fragmento del amnios, por ejemplo, un segmento del amnios que es de aproximadamente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 20 , 30 , 40 , 50 , 60 , 70 , 80 , 90 , 100 , 200 , 300 , 400 , 500 , 600 , 700 , 800 , 900 o aproximadamente 1000 milímetros cuadrados en área.

Las células adherentes derivadas del amnios pueden recolectarse generalmente a partir de un amnios placentario o una porción del mismo, en cualquier momento dentro de aproximadamente los primeros tres días después de la expulsión, aunque de preferencia entre aproximadamente 0 horas y 48 horas después de la expulsión, o aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas después de la expulsión.

En una modalidad, las células adherentes derivadas del amnios se extraen desde el tejido amniótico mediante digestión enzimática utilizando una o más enzimas de digestión de tejido. El amnios, o una porción del mismo, pueden, por ejemplo, metabolizarse con una o más enzimas disueltas o mezcladas en una composición de recolección celular como se describe anteriormente.

En ciertas modalidades, la composición de recolección celular comprende una o más enzimas perjudiciales para el tejido. La digestión enzimática utiliza de preferencia una combinación de enzimas, por ejemplo, una combinación de metaloproteasa de matriz y una proteasa neutra, por ejemplo, una combinación de dispasa y colagenasa, por ejemplo, utilizada en orden secuencial. Cuando se utiliza más de una proteasa, las proteasas pueden utilizarse al mismo tiempo para metabolizar el tejido amniótico, o pueden utilizarse serialmente. En una modalidad, por ejemplo, el tejido amniótico se digiere tres veces con tripsina y luego una vez con colagenasa.

En una modalidad, el tejido amniótico se digiere enzimáticamente con una o más de metaloproteasa de matriz, una proteasa neutra, y una enzima mucolítica. En una modalidad específica, el tejido amniótico se digiere con una combinación de coleganasa, dispasa e hialuronidasa . En otra modalidad específica, el tejido amniótico se digiere con una combinación de LIBERASE™ (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis , Ind.) e hialuronidasa. Otras enzimas que pueden ser utilizadas para dañar el tejido amniótico incluyen papaína, desoxiribonucleasas , proteasas de serina, tal como tripsina, quimiotripsina o elastasa. Las proteasas de serina pueden ser inhibidas por alfa 2 microglobulina en suero y por lo tanto el medio utilizado para digestión puede, en ciertas modalidades, estar libre de suero. En ciertas otras modalidades, se utilizan EDTA y DNasa en la digestión del tejido amniótico, por ejemplo, para incrementar la eficiencia de la recuperación celular. En ciertas otras modalidades, el metabolizado se diluye de manea que evita atrapar células dentro de la digestión viscosa.

Concentraciones típicas para enzimas de digestión de tejido incluyen, por ejemplo, 50-200 U/ml para colagenasa I y colagenasa IV, 1-10 U/ml de dispasa, y 10-100 U/ml para elastasa. Las proteasas pueden utilizarse en combinación, es decir, dos o más proteasas en la misma reacción por digestión, o pueden usarse secuencialmente con el fin de aislar células adherentes aisladas, derivadas del amnios . Por ejemplo, en una modalidad, el te ido amniótico, o parte del mismo, se digiere primero con una cantidad apropiada de tripsina, en una concentración de aproximadamente 0.25%, por ejemplo, 15 minutos, a 37 °C, seguida por colagenasa I en aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg/ml durante por ejemplo, 45 minutos.

En una modalidad, las células adherentes derivadas del amnios pueden obtenerse como sigue. La membrana amniótica se corta en segmentos aproximadamente 0.254 cm x 0.254 cm (0.1" x 0.1") a aproximadamente 12.7 cm x 12.7 cm (5" x 5"), por ejemplo, 5.08 cm x 5.08 cm (2" x 2") de tamaño. La monocapa epitelial se remueve desde el lado fetal de la membrana amniótica mediante triple tripsinizacion como sigue. Los segmentos de la membrana amniótica se colocan en un recipiente con una solución caliente (por ejemplo, aproximadamente 20°C a aproximadamente 37°C) de tripsina-EDTA (0.25%). El volumen de tripsina puede variar de aproximadamente 5 mi por gramo del amnios a aproximadamente 50 mi por gramo del amnios. El recipiente se agita durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, por ejemplo, 15 minutos, mientras se mantiene la temperatura constante. Los segmentos de la membrana amniótica se separan entonces desde la solución de neutralización con tripsina como se describe anteriormente, y los segmentos de la membrana amniótica se colocan en el recipiente lleno con PBS caliente, pH 7.2. El recipiente se agita durante aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 30 minutos, y los segmentos de membrana amniótica se separan entonces desde el PBS como se describe anteriormente.

Los segmentos de la membrana amniótica se colocan entonces en el recipiente lleno con una solución de digestión caliente (por ejemplo, aproximadamente 20°C a aproximadamente 37°C) . El volumen de la solución de digestión puede variar de aproximadamente 5 mi por gramo del amnios a aproximadamente 50 mi por gramo del amnios. Las soluciones de digestión comprenden enzimas de digestión en un medio de cultivo apropiado, tal como DMEM. Las soluciones de digestión típicas incluyen colagenasa tipo I (aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 500 U/ml); colagenasa tipo 1 (aproximadamente 50 U/mol a aproximadamente 500 U/mol) más dispasa (aproximadamente 5 U/ml a aproximadamente 100 U/ml) ; y colagenasa tipo I (aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 500 U/ml) , dispasa (aproximadamente 2 u/ml a aproximadamente 50 U/ml) e hialuronidasa (aproximadamente 3 U/ml a aproximadamente 10 U/ml) . El recipiente se agita a 37°C hasta que la digestión del amnios se completa sustancialmente (aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 90 minutos) . FBS caliente/5% de FBS se agrega entonces al recipiente en una relación de aproximadamente 1 mi por gramo de tejido amniótica a aproximadamente 50 mi por gramo de tejido amniótico. El recipiente se agita durante aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 5 minutos. La suspensión celular se filtra entonces para remover cualquier tejido no metabolizado utilizando un filtro de 50 pm a 100 um. Las células se suspenden en PBS caliente (aproximadamente 1 mi a aproximadamente 500 mi) , y luego se centrifuga a 200 x g a aproximadamente x g durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, por ejemplo, 300 x g durante aproximadamente 15 minutos a 20°C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se remueve y las células se vuelven a suspender en un medio de cultivo adecuado. La suspensión celular puede ser filtrada (filtro de 40 pm a 70 um) para remover cualquier tejido no metabolizado restante, produciendo una suspensión de células sencilla.

En esta modalidad, las células en suspensión se recolectan y se cultivan como se describe en algún lado en la presente para producir células adherentes aisladas, derivadas del amnios y poblaciones de tales células . El amnios no metabolizado restante, en esta modalidad, puede desecharse. Las células liberadas a partir del tejido amniótico puede por ejemplo, recolectarse, por ejemplo, mediante centrifugación, y cultivarse en un medio de cultivo celular estándar.

En cualquiera de los protocolos de digestión en la presente, la suspensión celular obtenida mediante digestión puede filtrarse, por ejemplo, a través de un filtro que comprende poros de aproximadamente 50 pm a aproximadamente 150 um, por ejemplo, de aproximadamente 75 pm a aproximadamente 125 um. En una modalidad más especifica, la suspensión celular puede filtrarse a través de dos o más filtros, por ejemplo, un filtro de 125 um y un filtro de 75 pm.

Junto con cualquiera de los métodos descritos en la presente, las AMDACs pueden aislarse de las células liberadas durante la digestión seleccionando células que expresan una o más características de AMDAC, como se describe en la Sección 5.1, anteriormente.

Las AMDACs pueden también, por ejemplo, aislarse utilizando un método de aislamiento de dos etapas específicas que comprende la digestión con tripsina seguida mediante digestión con colagenasa. De este modo, en otro aspecto, se proporciona en la presente un método para aislar células adherentes derivadas del amnios que comprenden metabolizar una membrana amniótica o porción de la misma con tripsina de manera que las células epiteliales se liberan desde la membrana amniótica; removiendo la membrana amniótica o porción de la misma a partir de células epiteliales; digiriendo además la membrana amniótica o porción de la misma con colagenasa de manera que las células adherentes derivadas del amnios se liberan desde la membrana amniótica o porción de la misma, y separando las células adherentes derivas del amnios desde la membrana amniótica. En una modalidad específica, la digestión de la membrana amniótica o porción de la misma se repite por lo menos una vez. En otra modalidad específica, la digestión de la membrana amniótica o porción de la misma con colagenasa se repite por lo menos una vez. En otra modalidad específica, la tripsina es aproximadamente 0.1%-1.0% (concentración final) . En una modalidad más específica, la tripsina es aproximadamente 0.25% (concentración final) . En otra modalidad específica, la colagenasa es aproximadamente 50 U/ml a aproximadamente 1000 U/ml (concentración final) . En una modalidad más específica, la colagenasa es aproximadamente 125 U/ml (concentración final) . En otra modalidad específica, el método de aislamiento comprende adicionalmente cultivar tales células adherentes derivadas del amnios a partir de células no adherentes en tal cultivo para producir una población enriquecida de células adherentes derivadas del amnios . En modalidades más específicas, por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% de células en tal población enriquecida de células adherentes derivadas del amnios son células adherentes derivadas del amnios.

En una modalidad más específica de los métodos anteriores, las células adherentes derivadas del amnios son negativas para OCT-4, como se determina por RT-PCR, y una o más de HLA-G+, CD90+, CD105+ y CD117" como se determina mediante citometría de flujo. 5.4.4 Aislamiento, Clasificación y Caracterización de Células Adherentes Derivadas del Amnios Pueden volverse a suspender gránulos celulares en composición de recolección celular fresca, como se describe anteriormente, o un medio adecuado para mantenimiento celular, por ejemplo, Medio Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM) , Medio de Dulbecco Modificado con Iscove (IMDM) , por ejemplo, medio libre de suero IMDM que contiene 2 u/ml de heparina y 2 mM de EDTA (GibcoBRL, NY) ; una mezcla de tampón (por ejemplo, PBS, HBSS) con FBS (por ejemplo, 2% v/v) ; o similares .

Las células adherentes derivadas del amnios que se han cultivado, por ejemplo, en una superficie, en plástico para cultivo de tejidos, con o sin recubrimiento de matriz extracelular adicional tal como fibronectina, pueden cambiarse de cultivo o aislarse mediante adherencia diferencial. Por ejemplo, una suspensión celular obtenida a partir de digestión de colagenasa del tejido amniótico, realizarse como se describe en la Sección 5.4.3 anterior, pueden cultivarse, por ejemplo, durante 3-7 días en un medio de cultivo en plástico de cultivo de tejidos. Durante el cultivo, una pluralidad de células en la suspensión se adhiere a la superficie de cultivo, y después del cultivo continuo, da lugar a células adherentes derivadas del amnios . Células no adherentes, las cuales no dan lugar a las células adherentes derivadas del amnios, se remueven durante el intercambio de medio.

El número y tipo de células recolectadas a partir del amnios pueden monitorearse, por ejemplo midiendo cambios en morfología y los marcadores de superficie celular utilizando técnicas de detección celular estándares tal como inmunolocalización, por ejemplo, citometría de flujo, clasificación celular, inmunocitoquímica (por ejemplo, tinción con tejido específico o anticuerpos específicos de marcador celular) clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) , clasificación de células activadas magnéticas (MACS) , mediante examen de la morfología de células utilizando microscopía de luz o confocal, y/o midiendo cambios en la expresión genética utilizando técnicas bien conocidas en el arte tal como PCR y un perfil de expresión genética. Estas técnicas, pueden utilizarse, también, para identificar células que son positivas para uno o más marcadores particulares. Por ejemplo, utilizando uno o más anticuerpos para CD34, uno puede determinar al utilizar técnicas anteriores, si una célula comprende una cantidad detectable de CD34; de ser así, la célula es CD34+.

Las células derivadas del amnios, por ejemplo, células que han sido aisladas por separación Ficoll, adherencia diferencial, o una combinación de ambas, puede clasificarse utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) . La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es un método bien conocido para separar partículas, incluyendo células, basadas en las propiedades fluorescentes de las partículas (véase, por ejemplo, Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165) . La activación láser de porciones fluorescentes en las partículas resulta en una pequeña carga eléctrica permitiendo la separación electromagnética de partículas positivas o negativas a partir de una mezcla. En una modalidad, los anticuerpos específicos del marcador de superficie celular o ligandos se etiquetan con distintas etiquetas fluorescentes. Las células se procesan a través del clasificador celular, permitiendo la separación de células con base en su capacidad para unirse a los anticuerpos utilizados. Las partículas clasificadas FACS pueden depositarse directamente en pozos individuales de placas de 96 pozos o 384 pozos para facilitar la separación y clonación.

En un esquema de clasificación, las células de la placenta, por ejemplo, células adherentes derivadas del amnios, pueden clasificarse en la base de expresión de los marcadores CD49f, VEGFR2/KDR, y/o Flt-1/VEGFRl . De preferencia, las células son identificadas como siendo OCT-4, por ejemplo, determinando la expresión de OCT-4 por RT-PCR en una muestra de las células, en donde las células son OCT-4", si las células en la muestra no presentan producción detectable del ARNm para OCT-4 después de 30 ciclos. Por ejemplo, células a partir del amnios que son VEGFR2/KDR+ y VEGFR1/Flt-1+ puede clasificarse a partir de células que son una o más de VEGFR2/KDR", y VEGFR1/Flt-1\ CD9+ , CD54+, CD105+, CD200+, y/o VE-caderina". En una modalidad específica, las células adherentes de plástico para cultivo de tejidos, derivadas del amnios, que son uno o más de CD49f+, VEGFR2/KDR\ CD9+, CD54+, CD105+, CD200+ y/o VE-caderina", o células que son VEGFR2 /KDR+, CD9+, CD54+, CD105+, CD200+ y VE-caderina", se clasifican lejos de las células al no expresar uno o más de tal o tales marcadores y se seleccionan. En otra modalidad específica, células CD9f, VEGFR2 /KDR+ , VEGFRl/Flt-l+ que son adicionalmente uno o más o todos de CD31+, CD34+, CD45+, CD 133", y/o Tie-2+ se clasifican a partir de células que no despliegan una o más o cualquiera de tales características. En otra modalidad específica, células VEGFR2/KDR+, VEGFRI/F1t-l+ que son adicionalmente uno o más, o todos de CD9+, CD 10+, CD44+, CD54+, CD98+, Tie-2+, TEM-7+, CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146", y/o CXCR4" ; se clasifican a partir de células que no despliegan una o más o cualquiera de tales características.

La selección para células adherentes derivas del amnios puede realizarse en una suspensión celular que resulta a partir de la digestión, o en células aisladas recolectadas a partir del metabolizado, por ejemplo, mediante centrif gación o separación utilizando citometría de flujo. La selección por marcadores expresados puede lograrse sola o, por ejemplo, junto con procedimientos para seleccionar células en la base de sus propiedades de adherencia en el cultivo. Por ejemplo, una selección de adherencia puede lograrse antes o después de la clasificación en la base de la expresión marcadora.

Con respecto a la detección y clasificación mediada por anticuerpos de células placentarias , cualquier anticuerpo, específico para un marcador particular, puede utilizarse, en combinación con cualquier fluoróforo u otra etiqueta adecuada para la detección y clasificación de células (por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia) . Las combinaciones de anticuerpos/fluoróforos para marcadores específicos incluyen, aunque no se limitan a, anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) contra CD105 (disponible de R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); ficoeritrina (PE) anticuerpos monoclonales conjugados contra CD200 (BD biosciences Pharmingen) ; VEGR2/KDR-Biotina (CD309, Abcam) y similares. Los anticuerpos a cualquiera de los mercadores descritos en la presente pueden etiquetarse con cualquier etiqueta estándar para anticuerpos que facilitan la detección de los anticuerpos, incluyendo por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, (3-galactosidasa, acetilcolinesterasa estreptavidina/biotina, avidina/biotina, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC) , rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina (PE) , luminol, luciferasa, luciferina y ecuorina y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 1251 , 131I, 35S o 3H.

Las células adherentes derivadas del amnios pueden etiquetarse con un anticuerpo a un marcador sencillo y se detectan y/o clasifican con base en el marcador sencillo, o pueden etiquetarse simultáneamente con múltiples anticuerpos a una pluralidad de diferentes marcadores y clasificarse con base en la pluralidad de marcadores.

En otra modalidad, las perlas magnéticas pueden utilizarse para separar células, por ejemplo, para separar las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente a partir de otras células amnióticas. Las células pueden clasificarse utilizando una técnica de clasificación celular actividad magnética (MACS) , un método para separar partículas con base en su capacidad para unir perlas magnéticas (0.5-100 um de diámetro). Una variedad de modificaciones útiles puede realizarse en las microesferas magnéticas, incluyendo la adición covalente del anticuerpo que específicamente reconoce una molécula de superficie celular particular o hapteno . Las perlas se mezclan entonces con las células para permitir la unión. Las células pasan a través de un campo magnético para separar las células teniendo al marcador superficial celular específico. En una modalidad, estas células pueden aislarse entonces y volverse a mezclar con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores superficiales celulares adicionales . Las células se hacen pasar de nuevo a través de un campo magnético, aislando las células que se unen ambas a los anticuerpos. Tales células pueden entonces diluirse en placas separadas, tal como placas microtituladoras para aislamiento clonal.

Las células adherentes derivadas del amnios pueden evaluarse para viabilidad, potencial de proliferación, y longevidad utilizando técnicas estándares conocidas en el arte, tal como ensayo de exclusión de azul de triptano, ensayo de incorporación de diacetato de fluoresceína, ensayo de incorporación de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad) ; y ensayo de incorporación de timidina o ensayo de proliferación celular MTT (para evaluar la proliferación) . La longevidad puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, tal como determinando el número máximo de duplicación de la población en un cultivo extendido .

Las células adherentes derivadas del amnios, pueden también separarse de otras células placentarias utilizando otras técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, crecimiento selectivo de células deseadas (selección positiva) , destrucción selectiva de células indeseadas (selección negativa) ; separación con base en la capacidad adhesiva celular diferencial en la población mezclada como, por ejemplo, con aglutinina de soya; procedimientos de congelación-descongelación; filtración; centrifugación convencional y zonal; decantación centrífuga (centrifugación contra-corriente) ; separación por gravedad unitaria; distribución contracorriente; electroforesis y similares. 5.5 CULTIVO DE CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL AMNIOS 5.5.1 Medios de Cultivo Células adherentes derivadas del amnios, o poblaciones de tales células pueden utilizarse para iniciar, o sembrar cultivos celulares. Las células se transfieren generalmente a vasos de cultivo para tejido estéril ya sea recubiertos o sin recubrir con matriz extracelular o biomoléculas tal como laminina, colágeno (por ejemplo, nativa o desnaturalizada) , gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina y proteína de membrana extracelular (por ejemplo, MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, Mass)).

Las AMDACs pueden, por ejemplo, asentarse en medios adecuados para el cultivo de células madre. Los medios de asentamiento pueden por ejemplo, incluir un medio EGM-2 (Lonza) , DMEM + 10% de FBS, o medio que comprende 60% de DMEM-LG (Gibco) , 40% de MCDB-201 (Sigma) , 2% de suero de ternera fetal (FCS) (Hyclone Laboratories) , IX de insulina-transferrina'selenio (ITS) , IX de ácido lenolénico-albúmina de suero de bovino (LA-BSA) , 10"9 M de dexametasona (Sigma) , 10~4 de 2-fosfato de ácido ascórbico (Sigma) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , 10 ng/ml (R&D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (R&D Systems), y 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina (referencia en la presente como "medio estándar").

Las células adherentes derivadas del amnios pueden cultivarse en cualquier medio, y bajo cualesquiera condiciones, reconocidas en la técnica como aceptables para el cultivo de células, por ejemplo, células madre placentarias adherentes. De preferencia, el medio de cultivo comprende suero. En varias modalidades, los medios para el cultivo o subcultivo de AMDACs incluye STEMPRO® (Invitrogen) , MSCM-sf (ScienCell, Carlsbad, CA) , medio MESENCULT®-ACF (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá), medio estándar, medio estándar carente de EGF, medio estándar carente de PDGF, DMEM + 10% de FBS, EGM-2 (Lonza) , EGM-2MV (Lonza) , 2%, 10% y 20% de medios ES, medio ES-SSR, o un MEM-20% de FBS. El medio aceptable para el cultivo de células adherentes derivadas del amnios incluye, por ejemplo, DMEM, IMDM, DMEM (glucosa alta o baja) , medio basal de Eagle, medio FIO de Ham (FIO), medio F-12 de Ham (MSCG Lonza) , Medio ADVA CESTEM™ (Hyclone) , K OCKOUT™ DMEM (Invitrogen) , medio L-15 de Leibovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco) , DMEM/MCDB201 (Sigma), y CELL-GRO FREE, o similares. En varias modalidades, por ejemplo, DMEM-LG (Medio Esencial Modificado con Dulbecco, glucosa baja) /MCDB 201 (medio basal de fibroblasto de pollo) , que contiene ITS (insulina-transferrina'selenio) , LA+BSA (ácido linoleico-albúmina de suero de bovino) , dextrosa, ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, IGF-1, y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (glucosa elevada) que comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 20%, por ejemplo, aproximadamente 10%, de suero de bovino fetal (FBS; por ejemplo, suero de bovino fetal definido, Hyclone, Logan Utah) ; DMEM-HG que comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 20%, por ejemplo, aproximadamente 15% de FBS; IMDM (medio de Dulbecco modificado con Iscove) que comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 20%, por ejemplo, aproximadamente 10% de FBS, aproximadamente 2 a aproximadamente 20%, por ejemplo, aproximadamente 10% de suero de caballo, e hidrocortisona; M199 comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 20%, por ejemplo, aproximadamente 10% de FBS, EGF , y heparina; un MEM (medio esencial mínimo) que comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 20%, por ejemplo, aproximadamente 10% de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que comprende 10% de FBS, GLUTAMAX™; y DMEMLG que comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 20%, por ejemplo, aproximadamente 15% (v/v) de suero de bovino fetal (por ejemplo, suero de bovino fetal definido, Hyclone, Logan Utah) , antibióticos/antimicóticos (por ejemplo, penicilina en aproximadamente 100 Unidades/mililitros , estreptomicina en 100 microgramos/mililitros , y/o anfotericina B en 0.25 microgramos/militros (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)) y 0.001% (v/v) (3-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis Mo.), medio basal KNOCKOUT™-DMEM suplementado con 2 a 20% de FBS, aminoácido no esencial (Invitrogen), beta-mercaptoetanol , medio basal KNOCKOUT™ suplementado con Reemplazo de Suero KNOCKOUT™, alfa-MEM que comprende 2 a 20% de FBS, 20% de FBS, medio basal EBM2™ con EGF, VEGF, bFGF, R3-IGF-1, hidrocortisona, heparina, ácido ascórbico, FBS, gentamicina) o similares.

El medio de cultivo puede suplementarse con uno o más componentes incluyendo, por ejemplo, suero (por ejemplo, FCS o FBS, por ejemplo, aproximadamente 2-20% (v/v) ; suero equino (de. caballo) (ES) ; suero humano (HS) ) ; beta-mercaptoetanol (BME) , de preferencia aproximadamente 0.001% (v/v) ; uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) , factor-1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1) , factor inhibidor de leucemia (LIF) , factor de crecimiento endotelial (VEGF) , y eritropoyetina (EPO) ; aminoácidos, incluyendo L-valina, y uno o más agentes antibióticos y/o antimicóticos para controlar contaminación microbiana, tal como por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, amfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sea sola o en combinación.

Las células adherentes derivadas del amnios (AMDACs) pueden cultivarse en condiciones de tejido estándar, por ejemplo, en placas de cultivos de tejidos, o placas de pozos múltiples. Las células pueden también cultivarse utilizando un método de gota suspendida. En este método, las células se suspenden en aproximadamente 1 x 104 células por mi en aproximadamente 5 mi de medio y una o más gotas del medio se colocan en el interior de la tapa de un recipiente de cultivo de tejidos, por ejemplo, una placa Petri de 100 mi. Las gotas pueden ser por ejemplo, gotas sencillas o múltiples gotas, por ejemplo un pipeteador de multicanal. La tapa se invierte cuidadosamente y se coloca arriba del fondo de la placa, la cual contiene un volumen de líquido, por ejemplo, PBS estéril suficiente para mantener el contenido de humedad en la atmósfera de la placa, y las células se cultivan. Las AMDACs pueden también cultivarse en sistemas de cultivo estándar, o de volumen elevado o de rendimiento elevado, tal como matraces asT. Corning HYPERFLASK®, Cell Factories (Nunc) , grupos de celdas de 1-, 2-, 4-, 10 ó 40- bandejas, y similares.

En una modalidad, se cultivan células adherentes derivadas del amnios en la presencia de un compuesto que actúa para mantener un fenotipo no diferenciado en las células. En una modalidad específica, el compuesto es una 3 , 4-dihidropiridimol [4 , 5-d]pirimidina . En una modalidad más específica, el compuesto es un compuesto que tiene la siguiente estructura química: El compuesto puede estar en contacto con una célula adherente derivada del amnios, o población de tales células, en una concentración de por ejemplo, entre aproximadamente 1 uM a aproximadamente 10 uM. 5.5.2 Expansión y Proliferación de Células Adherentes Derivadas del Amnios +++Una vez que una célula adherente derivada del amnios aislado, o población aisladas de tales células (por ejemplo, células adherentes derivadas del amnios, o población de tales células separadas de por lo menos 50% de las células amnióticas con las cuales la célula o población de células se asocia normalmente in vivo) , las células pueden proliferarse y expandirse in vitro. Por ejemplo, una población de células adherentes o células adherentes derivadas del amnios pueden cultivarse en recipientes de cultivo de tejidos, por ejemplo, placas, frascos, placas de pozos múltiples, o similares, durante un tiempo suficiente para que las células proliferen con 40-70% de confluencia, es decir, hasta que las células y su progenie ocupen 40-70% del área superficial de cultivo del recipiente de cultivo de tejidos.

Las células adherentes derivadas del amnios pueden sembrarse en frascos de cultivo en una densidad que permita el crecimiento celular. Por ejemplo, las células pueden sembrarse a baja densidad (por ejemplo, aproximadamente 400 a aproximadamente 600 células/cm2) a densidad elevada (por ejemplo, aproximadamente 20,000 o más células/cm2). En una modalidad preferida, las células se cultivan aproximadamente de 0% a aproximadamente 5% en volumen de C02 en aire. En algunas modalidades preferidas, las células se cultivan en aproximadamente 0.1% a aproximadamente 25% de 02 en aire, de preferencia aproximadamente 5% a aproximadamente 20% de 02 en aire. Las células se cultivan de preferencia de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, de preferencia a aproximadamente 37°C .

Las células se cultivan de preferencia en una incubadora. Durante el cultivo, el medio de cultivo puede ser estático o puede agitarse, por ejemplo, durante el cultivo utilizando un biorreactor. Las células adherentes derivadas del amnios de preferencia se cultivan bajo tensión oxidativa baja (por ejemplo, con la adición de glutatión, ácido ascórbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcisteína o similares) .

Aunque las células angiogénicas derivadas del amnios pueden cultivarse para confluencia, las células no se cultivan de preferencia para confluencia. Por ejemplo, una vez que se obtiene 40%-70% de confluencia, las células pueden cambiar de cultivo. Por ejemplo, las células pueden tratarse enzimá icamente, por ejemplo, someterse a tripsina, utilizando técnicas bien conocidas en el arte, para separarlas desde la superficie de cultivo de tejido. Después de remover las células pipeteando y contando las células, aproximadamente 20,000-100,000 células, de preferencia 50,000 células, o aproximadamente 400 a aproximadamente 6,000 células /cm2, pueden cambiarse a un nuevo recipiente de cultivo que contiene un medio de cultivo fresco. Típicamente, el nuevo medio es el mismo tipo de medio a partir del cual las células se remueven. Las células adherentes derivadas del amnios pueden cambiarse de cultivo por lo menos 1, 2, 3,4 ,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 veces o más. Las AMDACs pueden duplicarse en el cultivo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o por lo menos 50 veces o más. 5.6 CONSERVACIÓN DE CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL AMNIOS Las células adherentes derivadas del amnios pueden conservarse, es decir, colocarse bajo condiciones que permitan un almacenamiento a largo plazo, o condiciones que inhiban muerte celular, por ejemplo, apoptosis o necrosis, por ejemplo, durante la recolección o antes de la producción de las composiciones descritas en la presente, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la presente.

Las células adherentes derivadas del amnios pueden conservarse utilizando, por ejemplo, una composición que comprende un inhibidor de apoptosis, inhibidor de necrosis y/o un perfluorocarbono que contiene oxígeno, como se describe en la Publicación de Solicitud Estadounidense No. 2007/0190042, la descripción de la cual se incorpora por consiguiente para referencia en su totalidad. En una modalidad, un método para conservar tales células, o una población de tales células, comprende poner en contacto células o población de células con una composición de recolección de células que comprende un inhibidor de apoptosis y un perfluorocarbono que contiene oxigeno, en donde tal inhibidor de apoptosis se presenta en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o evitar apoptosis en la población de células, en comparación con una población de células sin contacto con el inhibidor de apoptosis. En una modalidad especifica, tal inhibidor de apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otra modalidad específica, tal inhibidor de apoptosis es un inhibidor de JNK. En una modalidad más específica, tal inhibidor de JNK no modula diferenciación o proliferación de células adherentes derivadas del amnios. En otra modalidad, la composición de recolección celular comprende tal inhibidor de apoptosis y tal perfluorocarbono que contiene oxígeno en una emulsión. En otra modalidad, la composición de recolección celular adicionalmente comprende un emulsionante, por ejemplo, lecitina. En otra modalidad, el inhibidor de apoptosis y el perfluorocarbono están entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25°C al momento de poner en contacto las células. En otra modalidad específica, el inhibidor de apoptosis y el perfluorocarbono están entre aproximadamente 2°C y 10°C, o entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 5°C, al momento de poner en contacto las células. En otra modalidad más específica, el contacto se realiza durante el transporte de tal población de células. En otra modalidad más específica, el contacto se realiza durante el congelamiento y descongelamiento de la población de células .

Las poblaciones de células adherentes derivadas del amnios pueden conservarse, por ejemplo, mediante un método que comprende poner en contacto una población de tales células con un inhibidor de apoptosis y un compuesto conservador de órganos, en donde el inhibidor de apoptosis se presenta en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o prevenir apoptosis en la población de células, en comparación con una población de células sin contacto con el inhibidor de apoptosis. En una modalidad específica, el compuesto conservador de órganos es una solución de UW (descrita en la patente Estadounidense No. 4,798,824; también conocida como ViaSpan; véase también Southard et al. Transplantation 49 (2 ): 251-257 (1990)) o una solución descrita en Stern et al. Patente Estadounidense No. 5,552,267. En otra modalidad, el compuesto conservador de órganos es almidón de hidroxietilo , ácido lactobiónico, rafinosa o una combinación de los mismos. En otra modalidad, la composición de recolección celular adicionalmente comprende un perfluorocarbono que contiene oxígeno, ya sea en dos fases o como una emulsión.

En otra modalidad del método, las células adherentes derivadas del amnios están en contacto con una composición de recolección celular que comprende un inhibidor de apoptosis y perfluorocarbono que contiene oxígeno, el compuesto conservador de órganos o una combinación de los mismos, durante la perfusión. En otra modalidad, las células adherentes derivadas del amnios están en contacto con tal composición de recolección celular durante un proceso de alteración de tejidos, por ejemplo, digestión enzimática del tejido amniótico. En otra modalidad, las células adherentes derivadas del amnios están en contacto con el compuesto de recolección celular mediante alteración de tejidos, por ejemplo, digestión enzimática del tejido amniótico.

Típicamente, durante la recolección de células adherentes derivadas del amnios, el enriquecimiento y el aislamiento, es preferible para minimizar o eliminar la tensión celular debido a hipoxia y tensión mecánica. En otra modalidad del método, por lo tanto, una célula adherente derivada del amnios , o población de células que comprende las células adherentes derivadas del amnios, se expone a una condición hipóxica durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento durante al menos más de seis horas durante la conservación, en donde la condición hipóxica es una concentración de oxígeno es decir, por ejemplo, menor que la concentración de oxígeno atmosférico normal; menor que la concentración de oxígeno sanguíneo normal; o similares. En una modalidad más específica, tales células o población de tales células se exponen a una condición hipoxica durante menos de dos horas durante la conservación. En otra modalidad más específica, las células o población de tales células se exponen a una condición hipoxica menor de una hora, o menor de treinta minutos, o no se expone a una condición hipoxica, durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento. En otra modalidad, la población de células no se expone a esfuerzo cortante durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento .

Las células adherentes derivadas del amnios pueden crioconservarse, en general o mediante los métodos específicos descritos en la presente, por ejemplo, en medio de crioconservación en pequeños recipientes, por ejemplo, ampolletas. El medio de crioconservación adecuado incluye, aunque no se limita a, medio de cultivo incluyendo, por ejemplo, medio de crecimiento, o medio de congelamiento celular, por ejemplo, medio de congelamiento celular, por ejemplo, medio de congelamiento celular comercialmente disponible, por ejemplo, medio de congelamiento celular identificado por los números de catálogo de SigmaAldrich C2695, CD2639 (Medio de Congelamiento Celular libre de Suero IX, que no contiene DMSO) o C6039 (Medio de Congelamiento Celular-Glicerol 1 X conteniendo Medio Esencial Mínimo, glicerol, suero de ternera y suero de bovino), medio Lonza PROFREEZE™ 2x, metilcelulosa, dextrano, albúmina de suero humano, suero de bovino fetal, suero de ternera fetal o Plasmalyte. El medio de crioconservación de preferencia comprende DMSO (dimetilsulfóxido) o glicerol, en una concentración de por ejemplo, aproximadamente 1% a aproximadamente 20%, por ejemplo, aproximadamente 5% a 10% (v/v) , opcionalmente incluyendo suero de bovino fetal o suero humano. El medio de crioconservación puede comprender agentes adicionales, por ejemplo, metilcelulosa y/o glicerol. Las células adherentes aisladas, derivadas del amnios se enfrían de preferencia a aproximadamente l°C/min durante la crioconservación. Una temperatura de crioconservación preferida es aproximadamente -80°C a aproximadamente -180°C, de preferencia aproximadamente -125 °C a aproximadamente -140°C. Las células crioconservadas pueden transferirse a fase de vapor de nitrógeno líquido antes del descongelamiento para su uso. En algunas modalidades, por ejemplo, una vez que las ampollas han alcanzado aproximadamente -80°C, se transfieren a un área de almacenamiento de nitrógeno líquido. La crioconservación puede también hacerse utilizando un área de almacenamiento de nitrógeno líquido. La crioconservación puede también hacerse utilizando un congelador a velocidad controlada. Las células crioconservadas de preferencia se descongelan a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, de preferencia a una temperatura de aproximadamente 37°C. 5.7 PRODUCCIÓN DE UN BANCO DE CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL A IOS Las células adherentes derivadas del amnios pueden cultivarse en un número de diferentes formas para producir un conjunto de lotes, por ejemplo, un conjunto de dosis individualmente administrables de tales células. Los conjuntos de lotes de células amnióticas angiogénicas , obtenidos a partir de una pluralidad de placentas, pueden disponerse en un banco de células, por ejemplo, durante el almacenamiento a largo plazo. Generalmente, las células adherentes derivadas del amnios se obtienen de un cultivo inicial de células para formar un cultivo de semillas, el cual se expande bajo condiciones controladas para formar poblaciones de células de aproximadamente números equivalentes de duplicaciones. Los lotes se derivan de preferencia del tejido de una placenta sencilla, aunque pueden derivarse del tejido de una pluralidad de placentas.

En una modalidad no limitante, lotes o dosis de células adherentes derivadas del amnios se obtienen como sigue. El tejido amniótico se deteriora primero, por ejemplo, metabolizado como se describe en la Sección 5.4.3, anterior utilizando digestiones de tripsina y colagenasa en serie. Las células a partir del tejido metabolizado por colagenasa se cultivan, por ejemplo, durante aproximadamente 1-3 semanas, de preferencia aproximadamente 2 semanas. Después de la remoción de células no adherentes, se recolectan colonias de alta densidad que se forman, por ejemplo, sometiéndose a tripsina. Estas células se recolectan y vuelven a suspender en un volumen conveniente de medio de cultivo, y se define como células de Pasaje 0.

Las células de Pasaje 0 pueden entonces utilizarse para sembrar cultivos de expansión. Los cultivos de expansión pueden ser cualquier disposición de aparatos de cultivo de células separadas, por ejemplo, un CellFactory por células NU C™ en el cultivo de Pasaje 0 pueden subdividirse a cualquier grado de manera que se siembran cultivos de expansión con por ejemplo, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, lxlO4, lxlO4, 4xl04, 5xl04, 6xl04, 7xl04, 8xl04, 9xl04, o 10 x 104 de células adherentes. De preferencia, se utilizan de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 3 x 104 células de Pasaje 0 para sembrar cada cultivo de expansión. El número de cultivos de expansión puede depender del número de células de Pasaje 0, y puede ser mayor de o menor del número dependiendo de la o las placentas particulares a partir de las cuales se obtienen las células adherentes.

Los cultivos de expansión pueden entonces cultivarse hasta que la densidad de las células en el cultivo alcance un cierto valor, por ejemplo, aproximadamente 1 x 105 células/cm2. Las células pueden recolectarse y crioconservarse en este punto, o colocarse en nuevos cultivos de expansión como se describe anteriormente. Las células pueden pasarse por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 veces antes de su uso. Un registro del número acumulado de duplicaciones de población se mantiene preferiblemente durante el o los cultivos de expansión. Las células a partir de un cultivo de Pasaje 0 pueden expandirse durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ó 40 duplicaciones, o hasta 60 duplicaciones. De preferencia, sin embargo, el número de duplicaciones de población, antes de dividir la población de células en dosis individuales, está entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 duplicaciones. Las células pueden cultivarse continuamente en todo el proceso de expansión o pueden congelarse en uno o más puntos durante la expansión.

Las células que se utilizan para dosis individuales pueden congelarse, por ejemplo, crioconservarse para uso posterior. La dosis individual puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 1 millón a aproximadamente 50 millones de células por mi, y puede comprender entre aproximadamente 106 y aproximadamente 1010 células en total.

En una modalidad, por lo tanto, un banco celular que comprende células adherentes derivadas del amnios pueden hacerse mediante un método que comprende: expandir células adherentes derivadas del amnios del cultivo primario a partir de placenta post-parto humana para una pluralidad de duplicaciones de población; crioconservar las células para formar un Banco Celular Maestro; expandir opcionalmente una pluralidad de las células a partir del Banco Celular Maestro para una segunda pluralidad de duplicaciones de población; crioconservando las células expandidas para formar un Banco Celular de Trabajo para una tercera pluralidad de duplicaciones de población; y crioconservando las células expandidas resultantes en dosis individuales, en donde tal dosis individual componen colectivamente un banco celular. El banco puede comprender dosis, o lotes, de únicamente células adherentes derivadas de amnios, o puede comprender una combinación de lotes de células adherentes derivadas del amnios y lotes o dosis de otra clase de célula, por ejemplo, otra clase de células madre o progenitoras . De preferencia, cada dosis individual comprende únicamente células adherentes derivadas del amnios. De preferencia, cada dosis individual comprende únicamente células adherentes derivadas del amnios. En otra modalidad específica, todas las células en el cultivo primario son de la misma placenta. En otra modalidad específica, tales dosis individuales comprenden de aproximadamente 104 a aproximadamente 105 células. En otra modalidad específica, tal dosis individual comprende de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 células. En otra modalidad específica, tal dosis individual comprende de aproximadamente 106 a 107 células. En otra modalidad específica, la dosis individual comprende de aproximadamente 108 a aproximadamente 109 células. En otra modalidad específica, tal dosis individual comprende de aproximadamente 109 a aproximadamente 1010 células.

En ciertas modalidades, las células adherentes derivadas del amnios pueden descongelarse de un Banco Celular de Trabajo y cultivarse para una pluralidad de duplicaciones de población. Cuando se genera un número deseado de células, o un número deseado de duplicaciones de población ha tenido lugar, las células adherentes pueden recolectarse, por ejemplo, mediante centrifugación y volverse a suspender en una solución que comprende por ejemplo, dextrano, por ejemplo, 5% de dextrano. En ciertas modalidades, el dextrano es dextrano-40. En ciertas modalidades, las células se recolectan una segunda vez y se vuelven a suspender en una solución que comprende dextrano y crioconservante por ejemplo, un 5% de solución de dextrano (por ejemplo, dextrano-40) que comprende 10% de HSA y 2%-20% por ejemplo, 5% de DMSO y crioconservarse . Las células adherentes derivadas del amnios crioconservado pueden descongelarse, por ejemplo, inmediatamente antes de su uso.

En una modalidad preferida, el donador a partir del cual se obtiene la placenta (por ejemplo, la madre) se prueba para al menos un patógeno. En ciertas modalidades, si la madre resulta positiva para un patógeno probado, el lote completo desde la placenta se desecha. Tal prueba puede realizarse en cualquier momento durante la producción de lotes de células adherentes derivadas del amnios , incluyendo antes o después del establecimiento de células de Pasaje 0, o durante el cultivo de expansión. Los patógenos para los cuales se prueba la presencia pueden incluir, sin limitación, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, virus de inmunodeficiencia humana (tipos I y II) , citomegalovirus , virus del herpes y similares. 5.8 USO DE CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL AMNIOS Se proporcionan en la presente composiciones que comprenden células adherentes derivadas del amnios. Ejemplos de tales composiciones incluyen composiciones farmacéuticas (véase Sección 5.8.1. posterior); matrices y soportes (véase Sección 5.8.2, posterior), y medios condicionados por células adherentes derivadas del amnios (véase Sección 5.8.3, posterior . 5.8.1. Composiciones que Comprenden células adherentes derivadas del Amnios En ciertas modalidades, las células adherentes derivadas del amnios están contenidas dentro, o son componentes de una composición farmacéutica. Las células pueden prepararse en una forma que es fácilmente administrabie a un individuo, por ejemplo, células adherentes derivadas del amnios que están contenidas dentro de un recipiente que es adecuado para uso médico. Tal recipiente puede ser, por ejemplo, una jeringa, bolsa plástica estéril, frasco, vasija u otro recipiente a partir del cual puede distribuirse fácilmente la población de células angiogénicas derivadas del amnios. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre u otra bolsa médicamente aceptable de plástico adecuada para la administración intravenosa de un líquido a un depósito. El recipiente, en ciertas modalidades es aquel que permita la crioconservación de las células. Las células en las composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, provistas en la presente, pueden comprender células adherentes derivadas del amnios de un donador sencillo, o de múltiples donadores. Las células pueden ser HLA completamente idénticos a un recipiente pretendido, o HLA parcial o completamente desiguales.

De este modo, en una modalidad, las células adherentes derivadas del amnios en las composiciones provistas en la presente se administran a un individuo con necesidad de los mismos en la forma de una composición que comprende células adherentes derivadas del amnios en un recipiente. En otra modalidad específica, el recipiente es una bolsa, frasco o vasija. En la modalidad más específica, la bolsa es una bolsa de plástico estéril. En una modalidad más específica, la bolsa es adecuada para, permitir o facilitar la administración intravenosa de tales células adherentes, por ejemplo, mediante infusión intravenosa, inyección por bolo o similares. La bolsa puede comprender lúmenes o compartimientos que se interconectan para permitir el mezclado de las células y una o más soluciones, por ejemplo, un fármaco, antes de o durante la administración. En otra modalidad específica, antes de la crioconservación, la solución que comprende las células adherentes derivadas del amnios comprende uno o más compuestos que facilitan la crioconservación de las células. En otra modalidad específica, las células adherentes derivadas del amnios están contenidas dentro de una solución acuosa fisiológicamente aceptable es una solución de NaCl al 0.9%. En otra modalidad específica, las células adherentes derivadas del amnios comprenden células placentarias que son HLA idénticas a un receptor de tales células. En otra modalidad específica, las células adherentes derivadas del amnios comprenden células que son por lo menos HLA parcialmente desiguales a un receptor de tales células. En otra modalidad específica, las células adherentes derivadas del amnios se derivan de una pluralidad de donadores. En varias modalidades específicas, el recipiente comprende aproximadamente, por lo menos, o como máximo 1 x 106 células, 5 x 106 células, 1 x 107 células madre, 5 x 107 células, 1 x 108 células, 5 x 108 células, 1 x 109 células, 5 x 109 células o 1 x 1010 células. En otras modalidades de cualquiera de las poblaciones crioconservadas anteriores, las células se han cambiado aproximadamente, por lo menos o no más de 5 veces, no más de 10 veces, no más de 15 veces o no más de 20 veces. En otra modalidad específica de cualquiera de las células crioconservadas anteriores, las células se han expandido dentro del recipiente. En modalidades específicas, una dosis unitaria sencilla de las células adherentes derivadas del amnios puede comprender, en varias modalidades, aproximadamente, por lo menos, o no más de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más células adherentes derivadas del amnios .

En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas provistas en la presente comprenden poblaciones de células adherentes derivadas del amnios, que comprende 50% de células viables o más (es decir, por lo menos 50% de las células en la población son funcionales o vivas) . De preferencia, por lo menos 60% de las células en la población son viables. Más preferiblemente, por lo menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las células en la población en la composición farmacéutica son viables. 5.8.2. Matrices que Comprenden Células Adherentes Derivadas del Amnios Se proporcionan además en la presente composiciones que comprenden matrices, hidrogeles, soportes y similares. Tales composiciones pueden utilizarse en lugar de, o además de tales células en suspensión liquida.

La matriz puede ser, por ejemplo, un tejido des-celularizado permanente o degradable, por ejemplo, una membrana amniótica des-celularizada, o una matriz sintética. La matriz puede ser un soporte tridimensional. En una modalidad más específica, la matriz comprende colágeno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina o vitronectina . En otra modalidad más específica, la matriz es una membrana amniótica o un biomaterial derivado de la membrana amniótica. En otra modalidad más específica, la matriz comprende una proteína de membrana extracelular . En otra modalidad más específica, la matriz comprende un compuesto sintético. En otra modalidad más específica, la matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra modalidad más específica, el compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, una citocina, un anticuerpo, o una molécula orgánica de menos de 5,000 daltons.

Las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente pueden sembrarse sobre una matriz natural, por ejemplo, un biomaterial placentario tal como un material de membrana amniótica. Tal como un material de membrana amniótica puede ser, por ejemplo, una membrana amniótica diseccionada directamente desde una placenta de mamífero; firme o membrana amniótica tratada con calor, membrana amniótica sustancialmente seca (es decir, <20% de H20) , membrana coriónica sustancialmente seca, membrana amniótica y coriónica sustancialmente seca, y similares. Los biomateriales placentarios preferidos en los cuales las células adherentes derivadas de amnios provistas en la presente que pueden sembrarse se describen en Hariri, Publicación de Solicitud Estadounidense No. 2004/0048796, la descripción de la cual se incorpora para referencia en su totalidad.

En otra modalidad específica, la matriz es una composición que comprende una matriz extracelular . En una modalidad más específica, la composición es MATRIGEL™ (BD Biosciences ) .

Las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente pueden suspenderse en una solución de hidrogel adecuada para, por ejemplo, inyección. El hidrogel es, por ejemplo, un polímero orgánico (natural o sintético) es decir, se retícula mediante uniones covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura reticular abierta tridimensional que atrapa moléculas de agua para formar un gel . Los hidrogeles adecuados para tales composiciones incluyen péptidos de auto-ensamble, tal como RAD16. En una modalidad, una solución de hidrogel que comprende las células puede dejarse endurecer, por ejemplo, en un molde, para formar una matriz que tiene células dispersas en la presente para implante. Las células adherentes derivadas del amnios en tal matriz pueden también cultivarse de manera que las células se expanden mitóticamente, por ejemplo, antes del implante. Los materiales que forman hidrogel incluyen polisacáridos tal como alginato y sales de los mismos, péptidos, polifosfazinas y poliacrilatos , los cuales se reticulan iónicamente, o polímeros en bloque tal como copolímeros en bloque de óxido de polietileno-polipropileno los cuales se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. En algunas modalidades, el hidrogel o matriz es biodegradable.

En ciertas modalidades, las composiciones que comprenden células, provistas en la presente, comprenden un gel polimerizable in si tu (véase por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2002/0022676; Anseth et al., J. Control Reléase 78 ( 1-3 ); 199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24 (22 ): 3969-80 (2003). En algunas modalidades, los polímeros están por lo menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tal como agua, soluciones tamponadas de sal, o soluciones acuosas de alcohol, que tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de los mismos. Ejemplos de polímeros que tienen grupos laterales acídicos que pueden ser reactivos con cationes son poli ( fosf cenos ) , poli(ácidos acrílicos) , poli (ácidos metacrílieos ) , copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli (acetato de vinilo) , y polímeros sulfonados tal como poliestireno sulfonado. Los copolímeros que tienen grupos laterales acídicos formados mediante reacción de ácido acrílico o metacrílico y monómeros o polímeros de vinileter pueden también utilizarse. Ejemplos de grupos acídicos son grupos de ácido carboxílico, grupos de ácido sulfónico, grupos de alcohol halogenado, grupos de OH fenólicos y grupos de OH acídicos.

En una modalidad específica, la matriz es un fieltro, el cual puede estar compuesto de un hilo de filamentos múltiples hecho de un material bio-absorbible, por ejemplo, copolímeros de PGA, PLA, PLC o mezclas o ácido hialurónico. El hilo se hace en un fieltro utilizando técnicas de procesamiento textiles estándares que consisten de rizado, corte, cardado e inserción de agujas. En otra modalidad preferida las células de la invención se siembran sobre soportes de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Además, el entramado tridimensional puede ser moldeado en una forma útil, tal como una estructura específica en el cuerpo que se repara, reemplaza o amplía.

Otros ejemplos de soportes que pueden utilizarse incluyen esteras no tejidas, espumas porosas, o péptidos de auto-ensamble. Las esteras no tejidas pueden formarse utilizando fibras comprendidas de copolímero absorbible sintético de ácidos glicólico y láctico (por ejemplo, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). Espumas, compuestas de por ejemplo, copolímero de poli (c-caprolactona) /poli (ácido glicólico) (PCL/PGA) , formado mediante procesos tal como deshidratación por congelación o liofilización (véase por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,355,699), pueden también utilizarse como soportes.

Las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente pueden sembrarse sobre un entramado tridimensional o soporte e implantadas in vivo. Tal entramado puede implantarse en combinación con cualquiera o más factores de crecimiento, células, fármacos u otros componentes que, por ejemplo, estimulan la formación de tejidos, por ejemplo, osificación o formación de vasculatura.

Las células adherentes derivadas del amnios placentario provistas en la presente pueden, en otra modalidad, sembrarse sobre soportes de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Tales soportes de espuma pueden moldearse en una forma útil, tal como aquella de una porción de una estructura específica en el cuerpo que se repara, reemplaza o amplía. En algunas modalidades, el entramado se trata, por ejemplo, con 0.1 M de ácido acético seguido mediante incubación en polilisina, PBS y/o colágeno, antes de la inoculación de las células con el fin de mejorar la unión celular. Las superficies externas de una matriz pueden modificarse para mejorar la unión o el crecimiento de células y la diferenciación del tejido, tal como recubriendo con plasma la matriz, o además de una o más proteínas (por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares) , glicoproteínas , glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatán, sulfato de queratina, etc. , una matriz celular, y/u otros materiales tal como, aunque sin limitarse a gelatina, alginatos, ágar, agarosa y gomas vegetales, y similares .

En algunas modalidades, la matriz comprende, o se trata con materiales que la hace no trombogénica . Estos tratamientos y materiales pueden también promover y sostener el crecimiento endotelial, la migración y la deposición de la matriz extracelular . Ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen aunque no se limitan a materiales naturales tal como proteínas de membrana basal tal como laminina y colágeno Tipo IV, materiales sintéticos tal como EPTFE y siliconas de poliuretanurea segmentadas, tal como PURSPA (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.). La matriz puede también comprender agentes anti- trombóticos tal como heparina; los soportes pueden también tratarse para alterar la carga superficial (por ejemplo, recubriendo con plasma) antes de la siembra con las células adherentes provistas en la presente.

El entramado puede tratarse antes de la inoculación de las células adherentes derivadas del amnios, provistas en la presente con el fin de mejorar la unión celular. Por ejemplo antes de la inoculación con las células de la invención, matrices de nylon podrían ser tratadas con 0.1 molar de ácido acético e incubarse en polilisina, PBS y/o colágeno para recubrir el nylon. El poliestireno puede tratarse de forma similar utilizando ácido sulfúrico.

Además, las superficies externas del entramado tridimensional pueden modificarse para mejorar la unión o crecimiento de células y la diferenciación de tejido, tal como recubriendo con plasma el entramado o además de una o más proteínas (por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares) , glicoproteínas , glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitin-4-sulfato, condroitin-5-sulfato, sulfato de dermatano, sulfato de queratina) , una matriz celular, y/u otro materiales tal como, aunque sin limitarse a gelatina, alginas, ágar, agarosa o gomas vegetales .

En algunas modalidades, la matriz comprende o se trata con materiales que producen la matriz no trombogénica, por ejemplo, materiales naturales tal como proteínas de membrana basal tal como laminina y colágeno del Tipo IV y materiales sintéticos tal como ePTFE o siliconas de poliuretanurea segmentada tal como PURSPA (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif ) . Tales materiales pueden además tratarse para producir el soporte no trombogénico , por ejemplo, con heparina, y tratamientos que alteran la carga superficial del material, tal como recubrimiento de plasma.

Las composiciones celulares terapéuticas que comprenden células adherentes derivadas del amnios pueden también proporcionarse en la forma de un complejo celular de matriz. Las matrices pueden incluir soportes biocompatibles , estructuras auto-ensamblables y similares, ya sea bioabsorbibles o no, líquidas, de gel o sólidas. Tales matrices se conocen en las técnicas de tratamiento celular terapéutico, reparación quirúrgica, ingeniería de tejido, y cicatrización de heridas. En ciertas modalidades, las células se adhieren a la matriz. En otras modalidades, las células son atrapadas o contenidas dentro de espacios de matriz. Los más preferidos son aquellos complejos celulares de matriz los cuales se desarrollan en asociación cercana con la matriz y cuando se utilizan terapéuticamente, estimulan y mantienen la invasión de células en un recipiente, o estimulan o mantienen angiogénesis . Las composiciones de células de matriz pueden introducirse en el cuerpo de un individuo de cualquier manera conocida en la técnica, incluyendo aunque sin limitarse a implante, inyección, unión quirúrgica, trasplante con otro tejido, inyección y similares. En algunas modalidades, las matrices se forman in vivo o in si tu. Por ejemplo, geles polimerizables in situ pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Ejemplos de tales geles se conocen en la técnica.

En algunas modalidades, las células provistas en la presente se siembran sobre tales matrices tridimensionales, tal como soportes y se implantan in vivo, en donde las células sembradas pueden proliferar sobre, o en el entramado o ayuda a establecer el tejido de reemplazo in vivo con o sin la cooperación de otras células . El crecimiento de las células adherentes derivadas del amnios o co-cultivos de las mismas en el entramado tridimensional resulta de preferencia en la formación de un tejido tridimensional, o fundación del mismo, el cual puede utilizarse in vivo, por ejemplo, para reparación o tejido dañado o enfermo. Por ejemplo, los soportes tridimensionales pueden utilizarse para formar estructuras tubulares, por ejemplo, para uso en la reparación de vasos sanguíneos; o aspectos del sistema circulatorio o estructuras coronarias. De acuerdo con un aspecto de la invención, las células adherentes derivadas del amnios o co-cultivos de las mismas, se inoculan, o siembran en un entramado o matriz tridimensional, tal como un soporte, una espuma o un hidrogel . El entramado puede configurarse en varias formas tal como generalmente plana, generalmente cilindrica o tubular, o puede ser una forma completamente libre como puede requerirse o desearse para la estructura correctiva bajo consideración. En algunas modalidades, las células adherentes derivadas del amnios crecen en la estructura tridimensional, mientras en otras modalidades, las células sólo sobreviven, o incluso mueren, aunque estimulan o promueven la invasión de nuevo tejido o vascularización en un recipiente.

Las células de la invención pueden cultivarse libremente en el cultivo, removerse desde el cultivo e inocularse sobre un entramado tridimensional. La inoculación del entramado tridimensional con una concentración de células, por ejemplo, aproximadamente 106 a 5 x 107 células por mililitro, de preferencia resulta en el establecimiento del soporte tridimensional en periodos relativamente más cortos de tiempo. Además, en alguna aplicación puede ser preferible utilizar un número mayor o menor de células dependiendo de los resultados deseados.

En una modalidad específica, la matriz puede cortarse en una tira (por ejemplo, en forma rectangular) de la cual el ancho es aproximadamente igual a la circunferencia interna de un órgano tubular en el cual será insertado finalmente. Las células adherentes derivadas del amnios pueden inocularse en el soporte e incubarse flotando o suspendiendo en medio liquido. En la etapa apropiada de confluencia, el soporte puede enrollarse en un tubo uniendo los extremos largos. La costura puede entonces cerrarse suturando los dos extremos juntos utilizando fibras de un material adecuado de un diámetro apropiado. Con el fin de evitar que las células ocluyan el lumen, uno de los extremos abiertos del entramado tubular puede fijarse a una boquilla. El medio líquido puede forzarse a través de la boquilla desde una cámara de la fuente conectada a la cámara de incubación para crear una corriente a través del interior del entramado tubular. El otro extremo abierto puede fijarse a una abertura de desagüe la cual conduce a una cámara de recolección desde la cual el medio puede volverse a circular a través de la cámara de la fuente. El tubo puede desprenderse desde la boquilla y la abertura de desagüe cuando se completa la incubación, véase por ejemplo, Solicitud Internacional No. WO 94/25584.

En general, pueden combinarse dos entramados tridimensionales en un tubo de acuerdo con la invención utilizando cualquiera de los siguientes métodos. Dos o más entramados planos pueden colocarse uno encima de otro y saturarse juntos. La hoja de doble capa resultante puede entonces enrollarse, y como se describe anteriormente, unirse y asegurarse. En ciertas modalidades, un soporte tubular que sirve como la capa interna, puede inocularse con las células adherentes derivadas del amnios e incubarse. Un segundo soporte puede cultivarse como una tira plana con un ancho ligeramente más grande que la circunferencia externa del entramado tubular. Después que se logra el crecimiento apropiado, el entramado plano se envuelve alrededor del exterior del soporte tubular seguido por el cierre de la costura de los dos extremos del entramado plano y asegurando el entramado plano al tubo interno. En otra modalidad, dos o más mallas tubulares de diámetro ligeramente diferentes pueden cultivarse por separado. El entramado con el diámetro más pequeño puede insertarse dentro del más grande y asegurarse. Para cada uno de estos métodos, más capas pueden agregarse volviendo a aplicar el método al tubo dos veces estratificado. Los soportes pueden combinarse en cualquier etapa de crecimiento de las células adherentes derivadas del amnios, y se puede continuar la incubación de soportes combinados cuando se desee.

Junto con lo anterior, las células y composiciones terapéuticas provistas en la presente pueden utilizarse junto con dispositivos implantables . Por ejemplo, las células adherentes derivadas del amnios pueden co-administrarse con, por ejemplo, stents, válvulas artificiales, dispositivos de asistencia ventricular, bobinas desmontables Guglielmi y similares. Ya que los dispositivos pueden constituir la terapia dominante provista a un individuo con necesidad de tal terapia, las células y similares pueden utilizarse como un soporte o terapia secundaria para ayudar a, estimular o promover la propia cicatrización en el área del dispositivo implantado. Las células y composiciones terapéuticas de la invención pueden también utilizarse para pre-tratar ciertos dispositivos implantables , para minimizar los problemas cuando se utilizan in vivo. Tales dispositivos pre-tratados, incluyendo dispositivos recubiertos, pueden ser tolerados mejor por pacientes que los reciben, con riesgo reducido de infección local o sistémica, o por ejemplo, restenosis u oclusión adicional de vasos sanguíneos. 5.8.3 Medio Condicionado Mediante Células Adherentes Derivadas del Amnios Se proporciona además en la presente un medio que ha sido condicionado mediante células adherentes derivadas del amnios, es decir, un medio que comprende una o más biomoléculas secretadas o excretadas por las células adherentes. En varias modalidades, el medio condicionado comprende un medio en el cual las células se han cultivado por al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más días, o por al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 duplicaciones de población o más. En otras modalidades, el medio condicionado comprende un medio en el cual las células adherentes derivadas del amnios se han cultivado en por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90% de confluencia, o hasta 100% de confluencia. Tal medio condicionado puede utilizarse para mantener el cultivo de una población de células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, células madre placentarias , células madre embriónicas , células germinales embriónicas , células madre adultas, o similares. En otra modalidad, el medio condicionado comprende un medio en el cual las células adherentes derivadas del amnios, y las células que no son • células adherentes derivadas del amnios, se han cultivado juntas .

El medio condicionado puede comprender las células adherentes provistas en la presente. De este modo, se proporciona en la presente un cultivo celular que comprende células adherentes derivadas del amnios. En una modalidad especifica, el medio condicionado comprende una pluralidad, por ejemplo, una población de células adherentes derivadas del amnios . 5.9 CELULAS ADHERENTES MODIFICADAS, DERIVADAS DEL AMNIOS 5.9.1 Células Adherentes Derivadas del Amnios Genéticamente Modificadas En otro aspecto, las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente pueden modificarse genéticamente, por ejemplo, para producir un ácido nucleico o polipéptido de interés, o para producir una célula diferenciada, por ejemplo, una célula osteogénica, célula miocítica, célula pericítica o célula angiogénica, que produce un ácido nucleico o polipéptido de interés . Por ejemplo, las células adherentes derivadas del amnios pueden modificarse para producir factores angiogénicos , tal como moléculas pro-angiogénicas , factores solubles y receptores o moléculas pro-migratorias tal como quimiocinas, por ejemplo, células del estromal derivadas del factor 1 (SDF-1) o receptores de quimiocina. Las modificaciones genéticas pueden lograrse, por ejemplo, utilizando vectores basados en virus incluyendo, aunque sin limitarse a, vectores de replicación no integrantes, por ejemplo, vectores del virus del papiloma, vectores SV40, vectores adenovirales , vectores virales integrantes, por ejemplo, vector de retrovirus o vectores virales adeno-asociados ; o vectores virales de replicación-defectuosos . Otros métodos para introducir ADN en células incluyen el uso de liposomas, electroporación, pistola genética, inyección directa de ADN, o similares.

Las células adherentes provistas en la presente pueden por ejemplo, transformarse o transíectarse con ADN controlado o por, o en asociación operativa con, uno o más elementos de control de expresión apropiado, por ejemplo, secuencias promotoras o me oradoras, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, sitios de acceso ribosomal interno. De preferencia, tal ADN incorpora un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN extraño, las células adherentes diseñadas pueden por ejemplo, cultivarse en medio enriquecido y luego cambiarse a un medio selectivo. En una modalidad, el ADN utilizado para diseñar una célula adherente derivada del amnios comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés, por ejemplo, una citocina, un factor de crecimiento, un agente de diferenciación o un polipéptido terapéutico.

El ADN utilizado para diseñar la célula adherente puede comprender cualquier promotor conocido en la técnica para conducir la expresión de una secuencia de nucleótidos en células de mamíferos, por ejemplo, células humanas. Por ejemplo, el promotor incluye, aunque no se limita a, promotor/me orador de CMV, promotor de SV40, promotor de virus del papiloma, promotor del virus de Epstein-Barr , promotor genético de elastina, y similares. En una modalidad específica, el promotor es regulable de manera que la secuencia de nucleótidos se expresa solamente cuando se desea. El promotor puede ser ya sea inducible (por ejemplo, aquellos asociados con metalotioneina y proteínas de choque térmico) o constitutivo.

En otra modalidad específica, el promotor es específico de tejido o exhibe especificad de tejido. Ejemplos de tales promotores incluyen aunque no se limitan a una región control del gen de cadena 2 ligera de miosina (Shani, 1985 , Nature 314 : 283 ) (músculo esquelético).

Las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente pueden diseñarse o de otra manera seleccionarse para "sacar" o "modificar" la expresión de uno o más genes en tales células. La expresión de un gen nativo a una célula puede disminuirse por ejemplo, mediante inhibición de expresión inactivando el gen completamente, por ejemplo, mediante recombinación homologa. En una modalidad, por ejemplo, un exón que codifica una región importante de la proteína, o un exón 5 ' para esa región, se interrumpe mediante un marcador seleccionable, por ejemplo, nuevo, evitando la producción de ARNm normal desde el gen objetivo y resultando en la inactivación del gen. Un gen puede también ser inactivado creando una eliminación en la parte de un gen o eliminando el gen completo. Al utilizar una construcción con dos regiones de homología al gen objetivo que están distantes en el genoma, las secuencias que intervienen las dos regiones pueden eliminarse (Mombaerts et al., 1991 , Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. A. 88 : 3084 ) . Pueden utilizarse también antisentido, morfolinos, ADNzimas, ARN de pequeña interferencia, ARN de horquilla corta, y moléculas de ribozima que inhiben la expresión del gen objetivo para reducir el nivel de actividad genética objetivo en las células adherentes . Por ejemplo, se ha demostrado que las moléculas de ARN antisentido las cuales inhiben la expresión de complejos genéticos de histocompatibilidad (HLA) mayores son las más versátiles con respecto a las respuestas inmunes. Pueden utilizarse moléculas de triple hélice para reducir el nivel de actividad genética objetivo. Véase por ejemplo, L G. Davis et al. (eds), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2a edición, Appleton & Lange, Norwalk, Conn., la cual se incorpora en la presente para referencia.

En una modalidad específica, las células adherentes derivadas del amnios descritas en la presente pueden modificarse genéticamente con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés, en donde la expresión del polipéptido de interés es controlable mediante un factor exógeno, por ejemplo, un polipéptido, una molécula orgánica pequeña o similares. El polipéptido de interés puede ser un polipéptido terapéutico. En una modalidad más específica, el polipéptido de interés es el antagonista del receptor IL-12 o interleucina-l (IL-lRa) . En otra modalidad más específica, el polipéptido de interés es una fusión del antagonista del receptor de interleucina-l y dihidrofolato reductasa (DHFR) , y el factor de exógeno es un antifolato, por ejemplo, metotrexato. Tal construcción es útil en el diseño de células adherentes derivadas del amnios que expresan IL-1 Ra, o una fusión de IL-1 Ra y DHFR, en contacto con metotrexato . Tal construcción puede utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de artritis reumatoide. En esta modalidad, la fusión de IL-lRa y DHFR, se sobre-regula en forma translacional en la presencia de un factor exógeno. El polipéptido puede expresarse en forma transitoria o a largo plazo (por ejemplo, durante el curso de semanas o meses) . Tal molécula de ácido nucleico puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótidos codificando un polipéptido que permite la selección positiva de células diseñadas, o permite la visualización de las células diseñadas. En otra modalidad más específica, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que es, por ejemplo, fluorescente bajo condiciones de visualización apropiada, por ejemplo, luciferasa (Luc) . En una modalidad más específica, tal molécula de ácido nucleico puede comprender IL-1 Ra-DHFR-IRES-Luc, en donde IL-lRa es un antagonista del receptor de interleucina-1 , IRES es un sitio de acceso ribosomal interno, y DHFR es dihidrofolato reductasa. 5.9.2 Líneas Celulares Adherentes, Derivadas del Amnios Inmortalizado Las células adherentes derivadas del amnios de mamíferos pueden inmortalizarse condicionalmente mediante transíección con cualquier vector adecuado que contiene un gen promotor de crecimiento, es decir, un gen que codifica una proteína que, bajo condiciones apropiadas, promueve el crecimiento de la célula transfectada, de manera que la producción y/o actividad de la proteína que promueve el crecimiento es regulable mediante cualquier factor externo. En una modalidad preferida, el gen que promueve el crecimiento es un oncogén tal como, aunque sin limitarse a, v-myc, N-myc, c-myc, p53 , antígeno T SV40 grande, antígeno T de polioma grande, adenovirus Ela o proteína E7 de virus de papiloma humano. En otra modalidad, las células adherentes derivadas del amnios pueden inmortalizarse utilizando recombinación cre-lox, como se ejemplifica por una línea celular f3 pancreática por Narushima, M. , et al (Nature Biotechnology, 2005, 23(10:1274-1282).

La regulación externa de la proteína que promueve el crecimiento puede lograrse colocando el gen que promueve el crecimiento bajo el control de un promotor externamente regulable, por ejemplo un promotor de actividad el cual puede ser controlado por ejemplo, al modificar la temperatura de las células transfectadas o la composición del medio en contacto con las células. En una modalidad, puede emplearse un sistema de expresión genética controlado por tetraciclina (tet) (veáse Gossen et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 93:1518-1523, 1996). En la ausencia de la tet, un trans- activador controlado por tet (tTA) dentro de este vector activa fuertemente la transcripción a partir de phcMv*-I, un promotor mínimo a partir de citomegalovirus humano combinado con secuencias operadoras tet. tTa es una proteína de fusión del represor (tetR) del operón de resistencia a tet derivado de transposón-10 de Escherichia coli y el dominio acídico de VP16 del virus de herpes simple. Concentraciones no tóxicas, bajas de tet (por ejemplo, 0.01-1.01 µg/ml) para cancelar la transactivación casi completamente por tTA.

En una modalidad, el vector además contiene un gen que codifica un marcador seleccionable, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a fármacos. El gen de resistencia a nemocina bacterial (neoA) es tal marcador que puede emplearse dentro del presente método. Las células que contienen neoA pueden seleccionarse por medios conocidos por aquellos expertos en la técnica, tal como la adición de por ejemplo, 100-200 ug/ml de G418 para el medio de crecimiento.

La transfección puede lograrse por cualquiera de una variedad de medios conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica incluyendo, aunque sin limitarse a infección retroviral. En general, un cultivo celular puede transfectarse mediante incubación con una mezcla de medio condicionado recolectado a partir de la línea celular productora para el vector y DMEM/F12 conteniendo suplementos N2. Por ejemplo, un cultivo celular placentario preparado como se describe anteriormente puede ser infectado después, por ejemplo, cinco días in vi tro mediante incubación durante aproximadamente 20 horas en un volumen de medio condicionado y dos volúmenes de DMEM/F12 conteniendo suplementos N2. Las células transfectadas que contienen un marcador seleccionable pueden entonces seleccionarse como se describe anteriormente.

Después de la transfección, los cultivos se hacen pasar sobre una superficie que permita la proliferación, por ejemplo, permite que se dupliquen por lo menos 30% de las células en un periodo de 24 horas. De preferencia, el sustrato es un sustrato de poliornitina/laminina, que consiste de un plástico para el cultivo de tejidos recubierto con poliornitina (10 µg/ml) y/o laminina (10 ug/ml) , un sustrato de polilisina/laminina o una superficie tratada con fibronectina . Los cultivos se alimentan entonces cada 3-4 días con medio de crecimiento, el cual puede o no ser suplementado con uno o más factores que mejoran la proliferación. Los factores que mejoran la proliferación pueden agregarse al medio de crecimiento cuando los cultivos son 50% menos confluentes.

Las líneas celulares adherentes derivadas del amnios, condicionalmente inmortalizadas, pueden cambiarse utilizando técnicas estándares, tal como tripsinización, cuando son 80-95% confluentes. En aproximadamente el vigésimo pasaje, en algunas modalidades, es benéfico mantener la sección (por ejemplo, mediante la adición de G418 para células que contienen un gen de resistencia a neomicina) . Las células pueden también congelarse en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

Las líneas celulares clónales pueden aislarse de una línea celular adherente condicionalmente inmortalizada preparada como se describe anteriormente. En general, tales líneas celulares clónales pueden aislarse utilizando técnicas estándares, tal como por dilución límite o utilizando anillos de clonación, y líneas celulares clónales expandidas pueden alimentarse generalmente y cambiarse de cultivo como se describe anteriormente.

Las células adherentes derivadas del amnios humano, condicionalmente inmortalizadas, las cuales pueden, aunque no necesariamente, ser clónales, pueden inducirse generalmente para diferenciar suprimiendo la producción y/o actividad de la proteína que promueve el crecimiento bajo condiciones de cultivo que facilitan la diferenciación. Por ejemplo, si el gen que codifica la proteína que promueve el crecimiento está bajo el control de un promotor externamente regulable, las condiciones, por ejemplo, temperatura o composición del medio, pueden modificarse para suprimir la transcripción del gen que promueve el crecimiento. Para el sistema de expresión genética controlado con tetraciclina, discutido anteriormente, la diferenciación puede lograrse mediante la adición de tetraciclina para suprimir la transcripción del gen que promueve el crecimiento. En general, 1 ug/ml de tetraciclina durante 4-5 días es suficiente para iniciar la diferenciación. Para promover diferenciación adicional, pueden incluirse agentes adicionales en el medio de crecimiento . 5.10 MÉTODOS DE TRATAMIENTO UTILIZANDO CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL AMNIOS 5.10.1 Enfermedades del Sistema Circulatorio Las células adherentes derivadas del amnios , poblaciones de tales células y poblaciones de células que comprenden células adherentes derivadas del amnios, provistas en la presente, pueden utilizarse para tratar individuos que exhiben una variedad de estados o condiciones de la enfermedad que podrían beneficiarse de la angiogénesis . Ejemplos de tales estados o condiciones de la enfermedad incluyen infarto al miocardio, apoplejía, insuficiencia cardiaca, enfermedad de arteria periférica, síndrome de ventrículo izquierdo hipoplástico , úlcera diabética, úlcera del decúbito, úlcera venosa, úlcera arterial, quemadura, fractura no consolidada, pérdida ósea asociada con tumor, osteoartritis y reparación ósea maxilofacial . Las células adherentes derivadas del amnios, y poblaciones de tales células, pueden también utilizarse como promotor de angiogénesis en individuos que exhiben pérdida de tejido traumático o para evitar formación de cicatrices, o en un individuo que tiene reemplazo total osteoarticular o prótesis dental .

En una modalidad más específica, las células adherentes derivadas del amnios y poblaciones de tales células, provistas en la presente, pueden utilizarse para tratar a un individuo que tiene una insuficiencia del sistema circulatorio, por ejemplo, un individuo que tiene una enfermedad vascular periférica o enfermedad de arterias coronarias .

En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para tratar a un paciente con una enfermedad o lesión cardiaca que comprende administrar una composición celular terapéutica a un paciente con una enfermedad o lesión del corazón o sistema circulatorio, y evaluar al paciente para mejoras en una función cardiaca, en donde la composición celular comprende células adherentes derivadas del amnios como se describe en la presente. En una modalidad, la enfermedad cardiaca es una cardiomiopatía . En modalidades específicas, la cardiomiopatía es ya sea idiopática o una cardiomiopatía con una causa conocida. En otras modalidades específicas, la cardiomiopatía es ya sea isquémica o no isquémica por naturaleza. En otras modalidades, la enfermedad del corazón o sistema circulatorio comprende una o más de angioplastia, aneurisma, angina (angina de pecho) , estenosis aórtica, aortitis, arritmias, arteriesclerosis, arteritis, hipertrofia del septo asimétrico (ASH) , aterosclerosis , fibrilación atrial y palpitación, endocarditis bacterial, Síndrome de Barlow (desprendimiento de válvula mitral), bradicardia, Enfermedad de Buerger ( thromboangiitis obliterans) , cardiomegalia, cardiomiopatía, carditis, enfermedad de la arteria carótida, estrechamiento de la aorta, enfermedades congénitas cardiacas (defectos congénitos cardiacos), falla cardiaca congestiva (falla cardiaca), enfermedad de arteria coronaria, Síndrome de Eisenmenger, embolismo, endocarditis, eritromelalgia, fibrilación, displasia fibromuscular, bloqueo cardiaco, soplo cardiaco, hipertensión, hipotensión, calcificación arterial infantil idiopática, Enfermedad de Kawasaki (síndrome de nodulo linfático mucocutáneo, enfermedad del nodulo linfático mucocutáneo, poliarteritis infantil) , síndrome metabólico, angina microvascular, infarto al miocardio (ataques cardiacos), miocarditis, taquicardia atrial paroxismal (PAT) , periarteritis nodosa (poliarteritis, poliarteritis nodosa) , pericarditis, enfermedad vascular periférica, isquemia crítica de miembro, vasculopatía diabética, flebitis, estenosis de válvula pulmonar (estenosis pulmonar) , Enfermedad de Raynaud, estenosis de arteria renal, hipertensión renovascular, enfermedad reumática del corazón, defectos septales, isquemia silente, síndrome X, taquicardia, Arteritis de Takayasu, Tetralogía de Fallot, transposición de las grandes arterias, atresia tricúspide, truncus arterioso, enfermedad cardiaca valvular, úlceras varicosas, venas varicosas, vasculitis, defecto de tabique ventricular, Síndrome de Wolff-Parkinson-White, defecto de relieve endocardiaco .

En otras modalidades, la enfermedad del corazón o sistema circulatorio comprende una o más de fiebre reumática aguda, pericarditis reumática aguda, endocarditis reumática aguda, miocarditis reumática aguda, enfermedades cardiacas reumáticas crónicas, enfermedades de la válvula mitral, estenosis mitral, insuficiencia mitral reumática, enfermedades de la válvula aórtica, enfermedades de otras estructuras endocardiacas , enfermedad cardiaca isquémica (aguda y subaguda) , angina de pecho, enfermedades de circulación pulmonar (enfermedad cardiaca pulmonar aguda, embolismo pulmonar, enfermedad cardiaca pulmonar crónica) , enfermedad cardiaca quifoscoliótica, miocarditis, endocarditis, fibrosis endomiocardiaca, fibroelastosis endocardiaca, bloque atrioventricular, disritmias cardiacas, degeneración del miocardio, enfermedades del sistema circulatorio incluyendo enfermedad cerebrovascular, oclusión y estenosis de arterias pre-cerebrales, oclusión de arterias cerebrales, enfermedades de arterias, arterioles y vasos capilares (aterosclerosis , aneurisma) o enfermedades de venas y vasos linfáticos.

En una modalidad, el tratamiento comprende el tratamiento de un paciente con una cardiomiopatía con una composición celular terapéutica que comprende células adherentes derivadas del amnios, ya sea con o sin otro tipo celular. En otras modalidades preferidas, el paciente experimenta beneficios a partir de la terapia, por ejemplo, a partir de la capacidad de las células para mantener el crecimiento de otras células, incluyendo células madre o células progenitoras presentes en el corazón, a partir de la invasión de tejido o vascularización del tejido, y a partir de la presencia de factores celulares benéficos, quimiocinas, citocinas y similares, aunque las células no se integran o multiplican en el paciente. En otra modalidad, el paciente se beneficia a partir del tratamiento terapéutico con las células, aunque las células no sobreviven durante un periodo prolongado en el paciente. En una modalidad, las células gradualmente declinan en número, viabilidad o actividad bioquímica, en otras modalidades, el declive en células puede precederse por un periodo de actividad, por ejemplo, crecimiento, división o actividad bioquímica. En otras modalidades, células envejecidas, no viables o incluso muertas son capaces de tener un efecto terapéutico benéfico.

La mejora en un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, en donde se le administra al individuo las células adherentes derivadas del amnios o composiciones terapéuticas provistas en la presente, puede evaluarse o demostrarse mediante mejora detectable en uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno del sistema circulatorio .

En otra modalidad, la mejora en un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, en donde se le administra al individuo las células adherentes derivadas del amnios o composiciones terapéuticas provistas en la presente, puede evaluarse o demostrarse mediante mejora detectable en uno o más indicios de función cardiaca, por ejemplo, la demostración de una mejora detectable en uno o más rendimientos cardiacos (CO) en el pecho, índice cardiaco (CI) , presiones capilares de arteria pulmonar (PAWP) e índice cardiaco (CI) ; % de acortamiento fraccional (% de FS) fracción de eyección (EF) , fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF) , diámetro diastólico final del ventrículo izquierdo (LVEDD) , diámetro sistólico final del ventrículo izquierdo (LVESD) , contractilidad (por ejemplo, dP/dt) , bucles de presión-volumen, mediciones del trabajo cardiaco, un incremento en el funcionamiento atrial o ventricular ; un incremento en la eficiencia de bombeo, una disminución en el índice de pérdida de eficiencia de bombeo, una disminución en la pérdida del funcionamiento hemodinámico, y una disminución en complicaciones asociadas con cardiomiopatía, en comparación con el individuo antes de la administración de las células adherentes derivadas del amnios .

La mejora en un individuo que recibe las composiciones terapéuticas provistas en la presente puede evaluarse también mediante métrica subjetiva, por ejemplo, la auto-evaluación del individuo acerca de su estado de salud después de la administración.

El éxito de administración de las células, en ciertas modalidades, no se basa en la supervivencia del individuo de las células adherentes administradas, derivadas del amnios. El éxito, más bien, se basa en una o más métricas de mejora en salud cardiaca o circulatoria, como se observa anteriormente. De este modo, las células no necesitan integrarse y mezclarse con el corazón del paciente, o dentro de los vasos sanguíneos .

En ciertas modalidades, los métodos de tratamiento provistos en la presente comprenden inducir células adherentes terapéuticas, derivadas del amnios para diferenciarse a lo largo del linaje mesenquimal, por ejemplo, hacia un fenotipo cardiomiogénico, angiogénico o vasculogénico, o en células tal como miocitos, cardiomiocitos , células endoteliales , células del miocardio, células epiteliales, células endoteliales vasculares, células del músculo liso (por ejemplo, células del músculo liso vasculares) .

La administración de células adherentes derivadas del amnios, o composiciones terapéuticas que comprenden tales células, a un individuo con necesidad de las mismas, puede lograrse, por ejemplo, mediante trasplante, implante (por ejemplo, de las células mismas o las células como parte de una combinación de matriz-células) , inyección (por ejemplo, directamente al sitio de la enfermedad o condición, por ejemplo, directamente a un sitio isquémico en el corazón de un individuo quien ha tenido un infarto al miocardio) , infusión, suministro mediante catéter, o cualquier otro medio conocido en la técnica para proporcionar terapia celular.

En una modalidad, se proporcionan composiciones celulares terapéuticas a un individuo con necesidad de las mismas, por ejemplo, mediante inyección en uno o más sitios en el individuo. En una modalidad especifica, las composiciones celulares terapéuticas se proporcionan mediante inyección intracardiaca, por ejemplo, a un área isquémica en el corazón. En otras modalidades específicas, las células son inyectadas sobre la superficie del corazón, en un área adyacente, o incluso a un área remota. En modalidades preferidas, las células pueden alojarse en el área enferma o dañada .

Un individuo que tiene una enfermedad o condición de los sistemas coronarios o vasculares puede ser administrado con células adherentes derivadas del amnios en cualquier momento en que las células puedan ser terapéuticamente benéficas. En ciertas modalidades, por ejemplo, las células o composiciones terapéuticas de la invención se administran en un lapso de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ó 24 horas, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ó 30 horas días del infarto al miocardio. La administración cercana con el tiempo a un infarto al miocardio, por ejemplo, un lapso de 1-3 ó 1-7 días, es preferible a la administración distal en el momento, por ejemplo, después de 3 a 7 días altera un infarto al miocardio. En otras modalidades, las células o composiciones terapéuticas de la invención se administran en un lapso de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 horas, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ó 30 días del diagnóstico final de la enfermedad o condición.

Se proporcionan también kits para su uso en el tratamiento de infarto al miocardio. Los kits proporcionan la composición celular terapéutico la cual puede prepararse en una forma farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, mezclando con un portador farmacéuticamente aceptable, y un aplicador, junto con instrucciones para su uso. De manera ideal, el kit puede utilizarse en el campo, por ejemplo, un consultorio médico, o por un proveedor de atención de urgencia que es aplicado a un paciente diagnosticado como que ha tenido un infarto al miocardio o evento cardiaco similar.

En modalidades específicas de los métodos de tratamiento provistos en la presente, se administran células adherentes derivadas del amnios con células madre (es decir, células madre que no son células adherentes derivadas del amnios), mioblastos, miocitos, cardiomioblastos , cardiomiocitos , o progenitores de mioblastos, miocitos, cardiomioblatos y/o cardiomiocitos.

En una modalidad específica, los métodos de tratamiento provistos en la presente comprenden administrar células adherentes derivadas del amnios, por ejemplo, una composición terapéutica que comprende las células, a un paciente con una enfermedad del corazón o sistema circulatorio; y evaluar al paciente para mejoras en la función cardiaca, en donde la composición celular terapéutica se administra como un complejo de matriz-células. En ciertas modalidades, la matriz es un soporte, de preferencia bioabsorbible, que comprende por lo menos las células.

Con este fin, se proporcionan en la presente poblaciones de células adherentes derivadas del amnios incubadas en la presencia de uno o más factores los cuales estimulan la diferenciación de células madre o progenitoras a lo largo de una trayectoria cardiogénica, angiogénica, hemangiogénica o vasculogénica . Tales factores se conocen en la técnica; la determinación de condiciones adecuadas para diferenciación puede lograrse con experimentación rutinaria. Tales factores incluyen, aunque no se limitan a factores, tal como factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, productos celulares, agentes de des- etilación, y otros estímulos los cuales se conocen ahora o se determinan posteriormente para estimular diferenciación, por ejemplo, de células madre, a lo largo de trayectorias o linajes cardiogénicos , angiogenicos , hemangiogénicos o vasculogénicos .

Las células adherentes derivadas del amnios pueden diferenciarse a lo largo de trayectorias o linajes cardiogénicos, angiogénicos , hemangiogénicos o vasculogénicos mediante el cultivo de las células en la presencia de factores que comprenden por lo menos uno de un agente de des-metilacion, un BMP, FGF, proteína de factor Wnt, factores Hedgehog y/o anti- nt.

La inclusión de agentes de des-metilación tiende a permitir que las células se diferencien a lo largo de las líneas mesenquimales hacia una trayectoria cardiomiogénica . La diferenciación puede determinarse mediante, por ejemplo, expresión de por lo menos una de cardiomiosina, miosina esquelética o GATA4 ; o mediante la adquisición de un latido, espontáneo o inducido de otra manera; o por la capacidad para integrar por lo menos parcialmente en un músculo cardiaco del paciente sin inducir arritmias. Los agentes de desmetilación que pueden utilizarse para iniciar tal diferenciación incluyen, aunque no se limitan a 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, sulfóxido de dimetilo, cloruro de queleritrina, ácido retinoico o sales de los mismos, ácido 2-amino-4- (etiltio) butírico, procainamida y procaína.

En ciertas modalidades en la presente, las células inducidas con uno o más factores como se identifica anteriormente pueden ser células cardiomiogénicas , angiogénicas , hemangiogénicas o vasculoénicas , o progenitoras . De preferencia, por lo menos algunas de las células, incluyendo, aunque sin limitarse al músculo cardiaco, vascular y otras estructuras del corazón, vasos sanguíneos cardiacos o periféricos, y similares. En ciertas otras modalidades, las células adherentes, diferenciadas derivadas del amnios se diferencian de las células adquiriendo dos o más de los indicios de células cardiomiogénicas o sus progenitoras, y son capaces de integrarse parcial o completamente en un corazón o la vasculatura del receptor. En modalidades específicas, las células, las cuales se administran a un individuo, no resultan en incrementos en arritmias, defectos cardiacos, defectos de los vasos sanguíneos u otras anomalías del sistema circulatorio o salud del individuo. En ciertas modalidades, las células adherentes derivadas del amnios actúan para promover la diferenciación de células madre, presentes en el músculo cardiaco del paciente, los vasos sanguíneos, sangre y similares para diferenciarse en por ejemplo, cardiomiocitos , o por lo menos a lo largo de las líneas cardiomiogénicas , angiogénicas , hemangiogénicas o vasculogénicas .

Las células adherentes derivadas del amnios, y las poblaciones de tales células, pueden proporcionarse terapéutica o profilácticamente a un individuo, por ejemplo, un individuo que tiene una enfermedad, trastorno o condición de, o que tiene afectado el corazón o sistema circulatorio. Tales enfermedades, trastornos o condiciones pueden incluir insuficiencia cardiaca debida a aterosclerosis , cardiomiopatía, o lesión cardiaca, por ejemplo, una lesión isquémica, tal como a partir de un infarto al miocardio o herida (aguda o crónica) .

En ciertas modalidades, se le administra al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de células adherentes derivadas del amnios, por ejemplo, en una población de células que comprende las células adherentes derivadas del amnios. En una modalidad específica, la población comprende aproximadamente 50% de células adherentes derivadas del amnios . En otra modalidad específica, la población es una población sustancialmente homogénea de células adherentes derivadas del amnios . En otras modalidades, la población comprende por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 33%, 40%, 60%, 66%, 70%, 75%, 80% ó 90% de células adherentes derivadas del amnios .

Las células adherentes derivadas del amnios pueden administrarse a un individuo en la forma de una composición terapéutica que comprende las células y otro agente terapéutico, tal como un factor de crecimiento tipo insulina (IGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , factor de crecimiento endotelial (VEGF) , factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , IL-8, un agente antitrombogénico (por ejemplo, heparina, derivados de heparina, urocinasa y Ppack (dextrofenilalanina prolina arginina clorometilcetona) ; compuestos antitrombina, antagonistas del receptor plaquetario, anticuerpos anti-trombina, anticuerpos del receptor anti-plaquetario , aspirina, dipiridamol, protemina, hidurina, inhibidores de prostaglandina y/o inhibidores plaguetarios ) , un agente antiapoptótico (por ejemplo, EPO, derivados y análogos de EPO y sus sales, TPO, IGF-I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , o inhibidores de caspasa) , un agente anti- inflamatorio (por ejemplo, inhibidores de MAP cinasa P38, estatinas, inhibidores IL-6 e IL-1, Pemirolast, Tranilast, Remicade, Sirolimus, compuestos anti-inflamatorios no esteroidales , por ejemplo, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, Tepoxalin, Tolmetin o Suprofen) , un agente inmunosupresor o inmunomodulador (por ejemplo, inhibidores de calcineurina, por ejemplo, ciclosporina, Tacrolimus, inhibidores de mTOR tal como Sirolimus o Everolimus; antiproliferativos tal como azatioprina y micofenolato de mofetilo; corticosteroides , por ejemplo, predinosolona o hidrocortisona; anticuerpos tales como anticuerpos del receptor anti-IL-2Ra monoclonales , Basiliximab, Daclizuma, anticuerpos anti células T policlonales tal como globulina anti-timocitos (ATG) , globulina anti-linfocitos (ALG) y el anticuerpo anti células T monoclonales OKT3 , o células madre placentarias adherentes como se describe en la Patente Estadounidense No. 7,468,276 y la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2007/0275362, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades), y/o un antioxidante (por ejemplo, probucol; vitaminas A, C y E, coenzima Q-10, glutatión, L-cisteína, N-acetilcisteína o derivado antioxidante, análogos o sales de los anteriores). En ciertas modalidades, las composiciones terapéuticas que comprenden las células adherentes derivadas del amnios además comprenden uno o más tipos de células adicionales, por ejemplo, células adultas (por ejemplo, fibroblastos o células endodérmicas) , o células madre o progenitoras . Tales agentes terapéuticos y/o una o más células adicionales, pueden administrarse a un individuo con necesidad de las mismas, individualmente o en combinaciones o dos o más de tales compuestos o agentes.

En ciertas modalidades, el individuo que se trata es un mamífero. En una modalidad específica, el individuo que se trata es un ser humano. En modalidad específica, el individuo es un ganado o un animal doméstico. En otras modalidades específicas, el individuo que se trata es un caballo, oveja, vaca o novillo, puerco, perro o gato. 5.10.2 Apoplejía y Otra Enfermedad Isquémica En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un método para tratar a un individuo que tiene una interrupción del flujo sanguíneo, por ejemplo, en o alrededor del cerebro, o en la vasculatura periférica, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de AMDACs . En ciertas modalidades específicas, la isquemia es una enfermedad arterial periférica (PAD), por ejemplo, es isquemia crítica de miembro (CLI). En otras ciertas modalidades, la isquemia es una isquemia del sistema nervioso central (CNS) . En otras ciertas modalidades, la isquemia es una enfermedad arterial periférica, una enfermedad vascular isquémica, una enfermedad cardiaca isquémica, una enfermedad cerebral isquémica o una enfermedad renal isquémica.

En una modalidad específica, la interrupción del flujo sanguíneo es una apoplejía. En una modalidad más específica, la apoplejía es una apoplejía isquémica. En otra modalidad más específica, la apoplejía es una apoplejía hemorrágica, por ejemplo, una hemorragia cerebral intracraneal o hemorragia subaracnoidea espontánea. En otra modalidad específica, la interrupción es un hematoma. En modalidades más específicas, el hematoma es un hematoma dural, un hematoma subdural o un hematoma sub-aracnoideo . En otra modalidad específica, tal hematoma es causado por fuerzas externas en el cráneo, por ejemplo, lesión en la cabeza. En otra modalidad específica, la interrupción es un Ataque Isquémico Transitorio (TIA) , por ejemplo, TIA recurrente. En otra modalidad específica, la interrupción es un vasoespasmo, por ejemplo, un vasoespasmo después de una apoplejía hemorrágica.

En otra modalidad específica del método, la cantidad terapéuticamente efectiva es un número de AMDACs que resulta en la eliminación de, una mejora detectable en, la reducción de la severidad de, o desaceleración del progreso de uno o más síntomas de, o déficits neurologicos atribuibles a, una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o el CNS exhibido por el individuo, por ejemplo, lesión anóxica o lesión hipóxica. En otra modalidad específica, tal cantidad terapéuticamente efectiva de AMDACs aisladas se administra al individuo profilácticamente, por ejemplo, para reducir o eliminar daño neurológico causado mediante una segunda o subsiguiente interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro o CNS después de la interrupción de flujo sanguíneo.

En otra modalidad específica, tal síntoma de interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro, por ejemplo, apoplejía, lesión anóxica o lesión hipóxica, es uno o más de hemiplejía (parálisis de un lado del cuerpo); hemiparálisis (debilidad en un lado del cuerpo) ; debilidad muscular de la cara; entumecimiento; reducción en la sensación; sentido alterado del olor; sentido del gusto, audición o visión; pérdida del olor, gusto, audición o visión; caída del párpado (ptosis); debilidad detectable de un músculo ocular; reflejo faríngeo reducido; capacidad reducida para tragar; reactividad reducida a la luz de las pupilas; sensación reducida de la cara; equilibrio reducido; movimiento involuntario del glóbulo ocular; ritmo respiratorio alterado; frecuencia cardiaca alterada; debilidad en el músculo esternocleidomastoideo con una capacidad reducida o incapacidad para voltear la cabeza a un lado; debilidad en la lengua; afasia (incapacidad para hablar o entender el idioma) ; apraxia (movimiento voluntarios alterados); un defecto de campo visual; un déficit de memoria; descuido unilateral o descuido hemi-espacial (déficit en atención al espacio en el lado del campo visual opuesto a la lesión) ; raciocinio desorganizado; confusión; desarrollo de gesticulaciones hipersexuales ; anosognosia (negativa persistente de la existencia de un déficit) ; dificultad para andar; coordinación de movimiento alterado; vértigo; desequilibrio; pérdida de conciencia; cefalea; y/o vómito .

En otra modalidad especifica, los métodos de tratamiento descritos anteriormente comprenden administrar un segundo agente terapéutico al individuo. En una modalidad más especifica, el segundo agente terapéutico es un agente neuroprotector . En una modalidad más especifica, el segundo agente terapéutico es NXY-059 (un derivado de disulfonilo de fenilbutilnitrona : N-óxido de 4- ( ( ter-butilimino) -metil ) benceno-1 , 3-disulfonato disódico; o 4- ( (óxido-ter-butil-azaniomilideno)metil) vencen-1, 3-disulfonato disódico; también conocido como disufenton) . En otra modalidad más especifica, el segundo agente terapéutico es un agente trombolitico . En una modalidad más específica, el agente trombolítico es activador del tejido plasminógeno (tPA) . En modalidades en las cuales la interrupción de flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro es una hemorragia, el segundo agente terapéutico puede ser un fármaco anti-hipertensivo, por ejemplo, un bloqueador beta o fármaco diurético, una combinación de un fármaco diurético, y un fármaco diurético que reserva de potasio, una combinación de un bloqueador beta y un fármaco diurético, una combinación de un inhibidor de enzima que convierte la angiotensina (ACE) y un diurético, un antagonista de angiotensina II y un fármaco diurético, y/o un bloqueador del canal de calcio y un inhibidor de ACE. En otra modalidad más específica, el segundo agente terapéutico es un bloqueador del canal de calcio antagonista de glutamato, agonista del ácido gamma aminobutírico (GABA) , un antioxidante o fagocito de radical libre.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, las AMDACs aisladas se administran al individuo en un lapso de 21-30, por ejemplo, 21 días de desarrollo de uno o más síntomas de una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor del cerebro de tal individuo, por ejemplo, en un lapso de 21-30, por ejemplo, 21 días de desarrollo de síntomas de apoplejía, lesión anóxica o lesión hipóxica. En otra modalidad específica del método de tratamiento, las AMDACs aisladas se administran al individuo en un lapso de 14 días de desarrollo de uno o más síntomas de una interrupción del flujo sanguíneo en, o alrededor del cerebro de tal individuo. En otra modalidad específica del método de tratamiento, las AMDACs aisladas se administran al individuo en un lapso de 7 días de desarrollo de uno o más síntomas de una interrupción del flujo sanguíneo en, o alrededor del cerebro de tal individuo. En otra modalidad específica del método de tratamiento, las AMDACs aisladas se administran a tal individuo en un lapso de 48 horas de desarrollo de uno o más síntomas de una interrupción del flujo sanguíneo en, o alrededor del cerebro de tal individuo. En otra modalidad específica, las AMDACs aisladas se administran al individuo en un lapso de 24 horas de desarrollo de uno o más síntomas de una interrupción del flujo de sangre en, o alrededor del cerebro de tal individuo. En otra modalidad específica, tales AMDACs se administran al individuo en un lapso de 12 horas de desarrollo de uno o más síntomas de una interrupción del flujo sanguíneo en, o alrededor del cerebro de tal individuo. En otra modalidad específica, las AMDACs aisladas se administran al individuo en un lapso de 3 horas de desarrollo de uno o más síntomas de una interrupción del flujo sanguíneo en, o alrededor del cerebro de tal individuo.

En una modalidad específica, la interrupción de flujo sanguíneo es isquemia crítica de miembro. En otra modalidad más específica, el CLI es un bloqueo severo en las arterias de las extremidades inferiores, el cual bloquea marcadamente el flujo sanguíneo. En otra modalidad más específica, tal CLI se caracteriza por dolor isquémico durante el reposo, dolor severo en las piernas y pies mientras una persona no se mueve, ulceraciones no cicatrizadas en los pies o piernas, dolor o entumecimiento en los pies, piel brillante, suave, seca de las piernas o pies, engrosamiento de las uñas de los dedos del pie, pulso ausente o reducido en las piernas o pies, ulceraciones abiertas, infecciones o úlceras cutáneas que no cicatrizarán, gangrena seca (piel negra, seca) de las piernas o pies. En otra modalidad específica, CLI puede conducir a pérdida de dedos o miembros completos. En otra modalidad específica del método, tal cantidad terapéuticamente efectiva es un número de AMDACs que resulta en la eliminación de una mejora detectable en la reducción de la severidad de, o desaceleración del progreso de uno o más síntomas de, pérdida de función del miembro y/o carencia de oxígeno (hipoxia/anoxia) atribuible a, una interrupción del flujo sanguíneo en, o alrededor del cerebro o CNS exhibido por tal individuo, por ejemplo, lesión anóxica o lesión hipóxica. En otra modalidad específica, la cantidad terapéuticamente efectiva de AMDACs aisladas se administra al individuo profilácticamente, por ejemplo, para reducir o eliminar daño al tejido causado por una segunda interrupción subsiguiente de flujo sanguíneo en, o alrededor del miembro después de la interrupción del flujo sanguíneo. 5.10.3 Dosis y Rutas de Administración La administración de AMDACs a un individuo con necesidad de la misma, puede ser mediante cualquier ruta médicamente aceptable relevante para la enfermedad o condición que se trata. En otra modalidad especifica de los métodos de tratamiento descritos anteriormente, las AMDACs se administran mediante inyección por bolo. En otra modalidad especifica, las AMDACs aisladas se administran mediante infusión intravenosa. En una modalidad especifica, tal infusión intravenosa es infusión intravenosa durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas . En otra modalidad específica, las AMDACs aisladas se administra intra-cranealmente . En otra modalidad específica, las AMDACs aisladas se administran intramuscularmente . En otra modalidad específica, las AMDACs aisladas se administra intraperitonealmente. En otra modalidad específica, las AMDACs aisladas se administran intra-arterialmente . En una modalidad más específica, las AMDACs aisladas se administran dentro de un área de isquemia. En otra modalidad más específica, las AMDACs aisladas se administran a un área periférica a una isquemia. En otra modalidad específica del método de tratamiento, las AMDACs aisladas se administran intramuscular, intradérmica o subcutáneamente.

En otra modalidad específica de los métodos de tratamiento descritos anteriormente, las AMDACs se administran una vez al individuo. En otra modalidad, las AMDACs aisladas se administran a un individuo en dos o más administraciones separadas. En otra modalidad especifica, la administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 104 y 1 x 105 AMDACs aisladas, por ejemplo, A DACs por kilogramo de tal individuo. En otra modalidad específica, la administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 105 y 1 x 106 AMDACs aisladas por kilogramo de tal individuo. En otra modalidad específica, la administración comprende administrar entre aproximadamente I x l06 y l x l07 AMDACs aisladas por kilogramo de tal individuo. En otra modalidad específica, la administración comprende administrar entre aproximadamente I x l07 y l x l08 AMDACs de células de placenta aisladas por kilogramo de tal individuo. En otras modalidades específicas, la administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 106 y aproximadamente 2 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo; entre aproximadamente 2 x 106 y aproximadamente 3 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo; entre aproximadamente 3 x 106 y aproximadamente 4 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo; entre aproximadamente 4 x 106 y aproximadamente 5 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo; entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 6 x 105 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo; entre aproximadamente 6 x 106 y aproximadamente 7 x 105 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo; entre aproximadamente 7 x 106 y aproximadamente 8 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo; entre aproximadamente 8 x 106 y aproximadamente 9 x 106 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo; o entre aproximadamente 9 x 106 y aproximadamente 1 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo. En otra modalidad especifica, la administración comprende administrar entre aproximadamente 1 x 107 y aproximadamente 2 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo del individuo a tal individuo. En otra modalidad específica, la administración comprende administrar entre aproximadamente 1.3 x 107 y aproximadamente 1.5 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo del individuo a tal individuo. En otra modalidad específica, la administración comprende administrar hasta aproximadamente 3 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo del individuo a tal individuo. En una modalidad específica, la administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 2 x 107 células placentarias aisladas por kilogramo de tal individuo. En otra modalidad específica, la administración comprende administrar aproximadamente 150 x 106 células placentarias aisladas en aproximadamente 20 mililitros de solución a tal individuo.

En una modalidad especifica, la administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 2 x 107 células placentarias aisladas a tal individuo, en donde las células están contenidas en una solución que comprende 10% de dextrano, por ejemplo, dextrano-40, 5% de albúmina de suero humano, y opcionalmente un inmunosupresor . En otra modalidad específica, la administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 107 y 3 x 109 células placentarias aisladas intravenosamente. En modalidades más específicas, la administración comprende administrar aproximadamente 9 x 108 células placentarias aisladas o aproximadamente 1.8 x 109 células placentarias aisladas intravenosamente. En otra modalidad específica, la administración comprende administrar entre aproximadamente 5 x 107 y 1 x 108 células placentarias aisladas intracranealmente. En una modalidad más específica, la administración comprende administrar aproximadamente 9 x 107 células placentarias aisladas intracranealmente. 5.11 DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL AMNIOS Las células adherentes derivadas del amnios provistas en la presente pueden diferenciarse. En una modalidad, la célula se ha diferenciado lo suficiente para que la célula exhiba por lo menos una característica de una célula endotelial, una célula miogénica, o una célula pericítica, por ejemplo, poniendo en contacto la célula con el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , o como se describe en las Secciones 5.11.2, 6.3.3 ó 6.3.4 posteriormente. En modalidades más específicas, la característica de una célula endotelial, célula miogénica o célula pericítica es la expresión de una o más de CD9 , CD31, CD54, CD102, NG2 (antígeno 2 neural/glial ) o actina alfa del músculo liso, la cual se incrementa en comparación con una célula amniótica que es OCT-4", VEGFR2 /KDR+ , CD9+, CD54+, CD105+, CD200+ y VE-caderina" . En otra modalidad más específica, la característica de una célula endotelial, célula miogénica o célula pericítica es la expresión de una o más de CD9 , CD31, CD54, CD102, NG2 (antígeno 2 neural/glial) o alfa actina del músculo liso, la cual se incrementa en comparación con una célula amniótica que es OCT-4", VEGFR2 /KDR+ , y VEGFRl/Flt- . 5.11.1 Inducción de Angiogénesis La angiogénesis a partir de células adherentes derivadas del amnios, provistas en la presente, pueden lograrse como sigue. Las células adherentes derivadas del amnios se cultivan, por ejemplo, en un medio celular endotelial, por ejemplo, EG ®-2 (Lonza) o un medio que comprende 60% de DMEM-LG (Gibco) , 40% de MCDB-201 (Sigma) ; 2% de suero de ternera fetal (Hyclone Labs.); lx de insulina-transferrina'selenio (ITS) ,· lx de albúmina de suero de bovino-ácido linoléico (LA-BSA) ; 5 x 10"9 M de dexametasona (Sigma) ; 10"4 M de 2-fosfato de ácido ascórbico (Sigma) ; 10 ng/mL del factor de crecimiento epidérmico (R&D Systems); y 10 ng/mL del factor de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF-BB) (R&D Systems), al pasaje 3. Las células se colocan entonces sobre MATRIGEL™ o un sustrato que comprende colágeno-1, por ejemplo, en placas de 96 pozos en una densidad de por ejemplo, aproximadamente 1.5 x 104 células por pozo en el mismo medio o DMEM con FBS (0-5% v/v) que comprende el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en, por ejemplo, aproximadamente 10 a 50 ng por mililitro. El medio puede cambiarse aproximadamente dos veces por semana. La angiogénesis se evidencia por inspección visual de las células para la germinación de estructuras similares a vasos y formación de tubos, visible bajo microscopio en una ampliación, por ejemplo, 50X a 100X. 5.11.2 Inducción de Diferenciación en Células Cardiacas La diferenciación miogénica (cardiogénica) de las células adherentes derivadas del amnios provistas en la presente puede lograrse, por ejemplo, colocando las células en condiciones de cultivo celular que inducen diferenciación en cardiomiocitos . Un medio cardiomiocítico preferido comprende DMEM/20% de CBS suplementado con ácido retinoico, 1 µ?; factor de crecimiento de fibroblastos básicos, 10 ng/mL; y factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/mL; y factor de crecimiento epidérmico, 100 ng/mL de Remplazo de Suero Modificado (Invitrogen, Carlsbad, California) pueden utilizarse en vista de CBS. Alternativamente, las células adherentes derivadas del amnios se cultivan en DMEM/20% de CBS suplementado con 1 a 100, por ejemplo, 50 ng/mL de Cardiotropina-1 durante 24 horas. En otra modalidad, las células adherentes derivadas del amnios pueden cultivarse 10-14 días en un medio libre de proteínas durante 5-7 días, luego estimularse con extracto del miocardio humano, por ejemplo, producido al homogenizar el miocardio humano en 1% de tampón HEPES suplementado con 1% del suero de sangre del cordón .

La diferenciación puede confirmarse mediante demostración de la expresión genética de la actina cardiaca, por ejemplo, por RT/PCR, o por mezclado visible de la célula. Una célula adherente se considera que se ha diferenciado en una célula cardiaca cuando la célula despliega una o más de estas características. 6. EJEMPLOS 6.1 EJEMPLO 1: AISLAMIENTO Y EXPANSIÓN DE CÉLULAS ADHERENTES A PARTIR DE LA MEMBRANA AMNIOTICA Este ejemplo demuestra el aislamiento y la expansión de células adherentes derivadas del amnios. 6.1.1 Aislamiento Las células adherentes derivadas del amnios fueron aisladas a partir de una membrana amniótica como sigue. El amnios/corión fueron cortados de la placenta, y el amnios se separó manualmente del corión. El amnios se enjuagó con PBS estéril para remover sangre residual, coágulos de sangre y otro material. Se utilizó una gasa estéril para remover sangre adicional, coágulos de sangre u otro material que no se removió al enjuagar, y se enjuagó el amnios de nuevo con PBS. El exceso de PBS se removió desde la membrana, y el amnios se cortó con un escalpelo en segmentos de 5.08 cm por 5.08 cm (2" x 2"). Para liberación de células epiteliales, se estableció un recipiente de procesamiento conectando un recipiente de procesamiento de vidrio encamisado estéril, en un baño maria circulante a 37°C utilizando tubería y conectores, y colocándolo en una placa de agitación. Se calentó la tripsina (0.25%, 300 mL) a 37°C en el recipiente de procesamiento; se agregaron los segmentos amnióticos, y se agitó la suspensión de amnios/ tripsina, por ejemplo, a 100 RP -150 RPM a 37°C durante 15 minutos. Se integró un sistema de selección estéril colocando un receptáculo estéril en un campo estéril enseguida del recipiente de procesamiento e insertando un tamiz estéril de 75 ]im a 125 µ?? en el receptáculo (Millipore, Billerica, MA) . Después de agitar los segmentos amnióticos durante 15 minutos, los contenidos del recipiente de procesamiento fueron transferidos al tamiz, y los segmentos amnioticos fueron transferidos por ejemplo, utilizando pinzas estériles de vuelta al recipiente de procesamiento; la solución de tripsina que contiene las células epiteliales fue desechada. Los segmentos amnioticos fueron agitados de nuevo con 300 mL de solución de tripsina (0.25%) como se describe anteriormente. Se enjuagó el tamiz con aproximadamente 100-150 mL de PBS y la solución de PBS se desechó. Después de agitar los segmentos amnioticos durante 15 minutos, los contenidos del recipiente de procesamiento fueron transferidos al tamiz. Los segmentos amnioticos fueron transferidos entonces de nuevo al recipiente de procesamiento; la solución de tripsina que contiene las células epiteliales fue desechada. Los segmentos amnioticos fueron agitados de nuevo con 300 mL de solución de tripsina (0.25%) como se describe anteriormente. Se enjuagó el tamiz con aproximadamente 100-150 mL de PBS, y la solución de PBS fue desechada. Después de agitar los segmentos amnióticos durante 15 minutos, los contenidos del recipiente de procesamiento fueron transferidos al tamiz. Los segmentos amnióticos fueron transferidos entonces de nuevo al recipiente de procesamiento, y la solución de tripsina que contiene las células epiteliales fue desechada. Los segmentos amnióticos fueron agitados en PBS/ 5% de FBS (relación 1:1 del amnios a PBS/5% de solución de FBS en volumen) a 37°C durante aproximadamente 2-5 minutos para neutralizar la tripsina. Se integró un sistema de tamiz estéril reciente. Después de neutralizar la tripsina, los contenidos del recipiente de procesamiento fueron transferidos al nuevo tamiz, y los segmentos amnióticos fueron transferidos de nuevo al recipiente de procesamiento. Se agregó PBS estéril a temperatura ambiente (400 mL) al recipiente de procesamiento, y los contenidos del recipiente de procesamiento fueron agitados durante aproximadamente 2-5 minutos. El tamiz se enjuagó con aproximadamente 100-150 mL de PBS. Después de la agitación, los contenidos del recipiente de procesamiento fueron transferidos al tamiz; el matraz de procesamiento fue enjuagado con PBS, y la solución de PBS se desechó. El recipiente de procesamiento se llenó entonces con 300 mL de DMEM pre-calentado, y los segmentos amnióticos fueron transferidos en la solución de DMEM.

Para la liberación de las células adherentes derivadas del amnios, la membrana amniótica tratada fue tratada además con colagenasa como sigue. Se preparó una solución concentrada de colagenasa estéril (500 U/mL) disolviendo la cantidad apropiada de polvo de colagenasa (variada con la actividad del lote de colagenasa recibido del proveedor) en DMEM. Se filtró la solución a través de un filtro de 0.22 um y se distribuyó en recipientes estériles individuales. La solución de CaCl2 (0.5 mL, 600 mM) se agregó a cada dosis de 100 mL, y las dosis fueron congeladas. Se agregó colagenasa (100 mL) a los segmentos amnióticos en el recipiente de procesamiento, y se agitó el recipiente de procesamiento durante 30-50 minutos, o hasta que se completó la digestión amniótica mediante inspección visual. Después que se completó la digestión amniótica, se agregó 100 mL de PBS/5% de FBS estéril precalentado al recipiente de procesamiento, y se agitó el recipiente de procesamiento durante 2-3 minutos. Después de la agitación, los contenidos del matraz fueron transferidos a un tamiz estéril de 60 µ??, y se recolectó el liquido mediante filtración por vacio. Se enjuagó el recipiente de procesamiento con 400 mL de PBS, y la solución de PBS se filtró estéril. La suspensión celular filtrada se centrifugó entonces a 300 x g durante 15 minutos a 20°C, y los granulos celulares se volvieron a suspender en PBS/2% de FBS pre-calentado (aproximadamente 10 mL total) . 6.1.2 Establecimiento Se agregaron células amnióticas angiogénicas recién aisladas al medio de crecimiento conteniendo 60% de DMEM-LG (Gibco) ; 40% de MCDB-201 (Sigma) ; 2% de FBS (Hyclone Labs), 1 x de insulina-transferrina'selenio (ITS) ; 10 ng/mL de ácido linoléico-albúmina de suero de bovino (LA-BSA) ; 1 de n-dexametasona (Sigma) ; 100 µ? de 2-fosfato de ácido ascórbico' (Sigma) ; 10 ng/mL del factor de crecimiento epidérmico (R & D Systems); y 10 ng/mL del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) (R & D Systems) y se formaron en placas en un Matraz en forma de T en una densidad de siembra de 10,000 células por cm2. El o los dispositivos de cultivo se incubaron entonces a 37°C, 5% de C02 con >90% de humedad. La unión celular, crecimiento y morfología fueron monitoreados diariamente. Células no adherentes y los restos fueron removidos mediante intercambio de medios. Se realizó el intercambio de medio, dos veces por semana. Las células adherentes con morfología en forma de fibroblastoide/mandril típica aparecieron varios días después de la formación de placas. Cuando la confluencia alcance 40%-70% (en 4-11 días después de la formación de placas inicial), las células se cosecharon mediante tripsinizacion (0.25% de tripsina - EDTA) durante 5 minutos a temperatura ambiente (37°C) . Después de la neutralización con PBS-5% de FBS, las células fueron centrifugadas a 200-400 g durante 5-15 minutos a temperatura ambiente, y luego se volvieron a suspender en un medio de crecimiento. En este punto, una línea de AMDAC se consideró que se estableció exitosamente en el pasaje inicial. Las células adherentes derivadas del amnios de pasaje inicial fueron, en algunos casos crioconservadas o expandidas. 6.1.3 Procedimiento de Cultivos Se cultivaron células adherentes derivadas del amnios en el medio de crecimiento descrito anteriormente y se sembraron en una densidad de 2000-4000 por cm2 en un cultivo para tejidos apropiado - el o los dispositivos para cultivos tratados. El o los dispositivos para cultivos se incubaron entonces a 37 °C, 5% de C02 con >90% de humedad. Durante el cultivo, las AMDACs pudieron adherirse y proliferar. El crecimiento celular, la morfología y la confluencia fueron monitoreados diariamente. Se realizó el intercambio de medio, dos veces a la semana para rellenar nutrientes recién preparados si el cultivo se extendiera 5 días o más. Cuando la confluencia alcanzó 40%-70% (en 3-7 días después de la siembra) , las células fueron cosechadas mediante tripsinización (0.05%-0.25% de tripsina - EDTA) durante 5 minutos a temperatura ambiente (37°C) . Después de la neutralización con PBS-5% de FBS, las células se centrifugaron a 200-400 g durante 5-15 minutos a temperatura ambiente, luego se volvieron a suspender en medio de crecimiento .

Las AMDACs aisladas y cultivadas de esta manera produjeron típicamente 33530 +/-15090 unidades que forman colonias (fibroblastos) (CFU-F) fuera de las 1 x 106 células formadas en placas. 6.2 EJEMPLO 2: CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DEL AMNIOS 6.2.1 Perfiles de Expresión Genética y de Proteínas Este Ejemplo describe la caracterización fenotípica de células adherentes derivadas del amnios, incluyendo un marcador de superficie celular característico, AR m y expresión proteómica.

Preparación de muestra: Se obtuvieron células adherentes derivadas del amnios como se describe en el Ejemplo 1. Las células en el pasaje 6 fueron cultivadas aproximadamente en 70% de confluencia en un medio de crecimiento como se describe en el Ejemplo 1, anterior, fueron tripsinizadas y se lavaron en PBS . Células NTERA-2 (American Type Culture Collection, Número ATCC CRL-1973) fueron cultivadas en DMEM conteniendo 4.5 g/L de glucosa, 2 mM de glutamina y 10% de FBS. Se realizaron conteos de células nucleadas para obtener un mínimo de 2 x 106 a 1 x 107 células. Las células se lisaron entonces utilizando un kit Qiagen R easy (Qiagen, Valencia, CA) , utilizando un QlAshredder, para obtener los lisatos. Se realizó entonces el aislamiento de ARN utilizando un kit Qiagen RNeasy. La cantidad y calidad de ARN fueron determinadas utilizando un espectrofotómetro Nanodrop ND 1000, 25 ng/yL de ARN/reacción. Se prepararon reacciones de ADNc utilizando un Kit de Archivo de ADNc de Alta Capacidad Applied Biosystems (Foster City, CA) . Se realizaron reacciones de PCR en tiempo real utilizando mezclas maestras de PCR universal TAQMAN® a partir de Applied Biosystems. Las reacciones se activaron en modo estándar en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7300 durante 40 ciclos.

Análisis y resultados de la muestra: Al utilizar la metodología de PCR en tiempo real y sondas de expresión genética TAQMA ® específicas y/o la disposición de angiogénesis humana TAQMAN® (Applied Biosystems) , las células fueron caracterizadas por expresión de marcadores angiogénicos y cardiomiogénicos relacionados con células madre. Los resultados fueron expresados ya sea como la expresión relativa de un gen de interés en comparación con los controles celulares pertinentes, o la expresión relativa (delta Ct) del gen de interés en comparación con un gen de mantenimiento comúnmente expresado (por ejemplo, GAPDH, 18S o GUSB) .

Las células adherentes derivadas del amnios expresan varios genes angiogénicos y cardiomiogénicos relacionados con células madre, y despliegan una ausencia relativa de expresión de OCT-4 en comparación con células NTERA-2. La Tabla 1 resume la expresión de genes angiogénicos, cardiomiogénicos y de células madre.

Tabla 1: Perfil de Expresión Genética de células adherentes derivadas del amnios como se determina por RT-PCR.

Marcador AMDAC Positivo Negativo mRNA ACTA2 X X ACTC1 X X ADAMTS1 X X AMOT X X ANG X X ANGPT1 X X ANGPT2 X X ANGPT4 X X ANGPTL1 X X ANGPTL2 X X ANGPTL3 X X ANGPTL4 X X BAI1 X X BGLAP X X c-myc X X CD31 X X CD34 X X CD44 X X CD140a X X CD140b X X CD200 X X CD202b X X CD304 X X CD309 X (VEGFR2/KDR) X CDH5 X X CEACAM1 X X CHGA X X COL15A1 X X COL18A1 X X COL4A1 X X COL4A2 X X COL4A3 X X Connexin-43 X X CSF3 X X CTGF X X CXCL10 X X CXCL12 X X CXCL2 X X DLX5 X X DNMT3B X X ECGF1 X X EDG1 X X EDIL3 X X ENPP2 X X EPHB2 X X F2 X X FBLN5 X X FGA X X FGF1 X X FGF2 X X FGF4 X X FIGF X X FLT3 X X FLT4 X X FN1 X X FOXC2 X X Folistatina X X Galectin-1 X X GRN X X HEY1 X X HGF X X HLA-G X X HSPG2 X X IFNB1 X X IFNG X X IL-8 X X IL-12A X X ITGA4 X X ITGAV X X ITGB3 X X KLF-4 X X LECT1 X X LEP X X MDK X X MP-13 X X MMP-2 X X MYOZ2 X X NANOG X X NESTIN X X NRP2 X X PDGFB X X PF4 X X PGK1 X X PLG X X POU5F1 (OCT-4) X X PRL X X PROK1 X X PROX1 X X PTN X X SEMA3F X X SERPINB5 X X SERPINC1 X X SERPINF1 X X SOX2 X X TERT X X TGFA X X TGFB1 X X THBS1 X X THBS2 X X TIE1 X X TIMP2 X X TI P3 X X TNF X X TNFSF15 X X TN D X X TNNC1 X X TNNT2 X X VASH1 X X VEGF X X VEGFB X X VEGFC X X VEGFR1/FLT-1 X X XLKD1 X X La columna "AR m" indica que la presencia o ausencia de ARNm para marcadores particulares fueron determinadas en cada caso.

En un experimento separado, se encontró que las AMDACs expresan genes para el desplazador 2 nuclear receptor de hidrocarburo de arilo (ARNT2) , el factor de crecimiento del nervio (NGF) , el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) , el factor neurotrofico derivado de la neuroglia (GDNF) , neurotrofina 3 (NT-3), NT-5, Factor la Inducible de hipoxia (HIFlA) , proteína 2 inducible de hipoxia (HIG2), heme oxigenasa (desciclización) 1 (H OXl), Superóxido dismutasa extracelular [Cu-Zn] (S0D3), catalasa (CAT) , factor de crecimiento transformante ß? (TGFB1), factor de crecimiento transformante (receptor ß? (TGFB1R) y receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR/c-met) . 6.2.2 Citometría de Flujo para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas del Amnios Se utilizó la citometría de flujo como un método para cuantificar marcadores fenotípicos de células adherentes derivadas del amnios para definir la identidad de las células. Se obtuvieron las muestras celulares a partir de reservas congeladas . Antes de descongelar y durante la preparación del reactivo, se mantuvieron los frascos de células en hielo seco. Subsiguientemente, se descongelaron las muestras rápidamente utilizando un baño maría a 37°C. Se utilizaron los conteos celulares pre-congelados para los cálculos para diluciones dependientes del número celular después de descongelar. En pocas palabras, se descongelaron los frascos criogénicos en un baño maría a 37 °C durante aproximadamente 30 segundos con agitación suave. Inmediatamente después de descongelar, aproximadamente 100-200 uL de la solución descongelada, fría (2 a 8°C) (PBS con 2.5% de albúmina y 5% de Gentran 40) se agregó al frasco criogénico y se mezcló. Después del mezclado suave, el volumen total de frascos criogénicos fue transferido en un tubo cónico de 15 mL conteniendo un volumen igual de solución descongelada, fría (2 a 8°C) . Las células fueron centrifugadas en un tubo cónico en 400 g durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de remover el sobrenadante. Se midió el volumen residual con una pipeta (estimación) ; el volumen residual y el gránulo celular se volvieron a suspender a temperatura ambiente en 1% de FBS en PBS para lograr una concentración celular de 250 x 103 células/100 µ? de tampón. Por ejemplo, 1 x 106 células podrían volverse a suspender en 400 pL 1% de FBS. Se colocó la suspensión celular en tubos FACS de 5 mL pre-etiquetados (Becton Dickinson (BD) , Franklin Lakes, NJ) . Para cada isotipo de anticuerpo primario, se tomó una alícuota de 100 pL de suspensión celular en un tubo de control de isotipos. Antes del análisis de fenotipos, las concentraciones de todos los anticuerpos fueron optimizadas para lograr una buena señal para las tasas de ruido y detección adecuada de antígenos CD a través de un potencial de margen dinámico de cuatro logaritmos. El volumen de cada isotipo y anticuerpo de muestra que se utilizó para teñir cada muestra fue determinado. Para estandarizar la cantidad del anticuerpo (en pg) en el isotipo y los tubos de muestra, se calculó la concentración de cada anticuerpo como ( 1 /concentración de anticuerpo actual (pg/pL) ) x (cantidad final deseada del anticuerpo en pg para 2.5 x 105 células) = # pL de anticuerpo agregado. Se hizo una mezcla maestra de anticuerpos tanto para el isotipo como para la muestra con la cantidad apropiada del anticuerpo agregado a cada tubo. Las células fueron teñidas durante 15-20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la tinción, se removió un anticuerpo no unido en cada muestra mediante centrifugación (400 g x 5 minutos) seguida por lavado utilizando 2 mL de 1% de FBS PBS (temperatura ambiente) antes de la resuspensión en 150 pL, de 1% de FBS PBS a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron entonces con citómetros de flujo Becton Dickinson FACSCalibur, FACSCantol o BD FACSCantoll, preparados para su uso por instrucciones del fabricante. Conjuntos de datos de citometria de flujo multi-paramétricos (dispersión lateral (SSC) , dispersión hacia adelante (FSC) y perfiles de fluorescencia integrados (FL) ) fueron adquiridos sin ajustar los parámetros de compensación de instrumentos en la marcha. Los parámetros de compensación fueron determinados para alterar la adquisición utilizando el software FACSDiva de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aplicaron los ajustes del instrumento a cada muestra. Los conjugados de fluoróforos utilizados en estos estudios fueron Aloficocianina (APC) , AlexaFluor 647 (AF647) , isotiocianato de fluoresceina (FITC) , Ficoeritrina (PE) y Proteína de clorofila de peridinina (PerCP), todos de BD Biosciences . La Tabla 2 resume la expresión de marcadores de superficie celular seleccionados, incluyendo marcadores angiogénicos .

Tabla 2 : Expresión de Marcador de Superficie Celular en células adherentes derivadas del amnios como se determina por citometría de flujo Citometria de Flujo de Marcador AMDAC Positivo Negativo Inmunolocalización CD6 X X CD9 X X CD10 X X CD31 X X CD34 X X CD44 X X CD45 X X CD49b X X CD49C X X CD49d X X CD54 X X CD68 X X CD90 X X CD98 X X CD105 X X CD117 X X CD133 X X CD143 X X CD144 X (VE-cadherin) X CD146 X X CD166 X X CD184 X X CD200 X X CD202b X X CD271 X X CD304 X X CD309 X (VEGFR2/KDR) X CD318 X X CD349 X X CytoK X X HLA-ABC+ B2 X Micro+ X X Cadena Invariable* HLA-DR-DP-DQ+ X PDL-1 X X VEGFR1/FLT-1 X X X La columna "Citometría de Flujo mediante Inmunolocalización" que indica que la presencia o ausencia de marcadores particulares fueron determinadas por la inmunolocalización específicamente citometría de flujo.

En otro experimento, las células AMDACs fueron etiquetadas con CD49f anti-humano (Clon GoH3 , conjugado de ficoeritrina; BD Pharmingen parte No. 555736), y fueron analizados mediante citometría de flujo. Aproximadamente 96% de las AMDACs etiquetadas con anti-CD49f (es decir, fueron CD49f ) .

En otros experimentos, las AMDACs fueron adicionalmente encontradas mediante inmunolocalización que expresan CD49a, CD 106, CD119, CD130, c-met (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos; HGFR) , receptor 1 de quimiocina CXC (CXCR1), PDGFRA y PDGFRB mediante inmunolocalización. Se encontró también que las AMDACs mediante inmunolocalización carecen de expresión de CD49e, CD62E, el receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3) , miembro 12A de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF12A) , receptor 1 del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1R), CXCR2, CXCR3, CXCR4 , CXCR6 , receptor 1 de quimiocina (CCRl), CCR2, CCR3, CCR4, CCR5 , CCR6 , CCR7 , CCR8 , CCR9 , el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) , receptor de insulina (CD220) , receptor 4 de interleucina (IL4-R; CD124), IL6-R (CD126), TNF-R la y Ib (CD 120a, b) y erbB2/Her2. 6.2.3 Inmunohistoquimica (IHC) /Inmunofluoroquímica (IFC) para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas del Amnios Las células adherentes derivadas del amnios del pasaje 6 fueron cultivadas en aproximadamente 70% de confluencia en portaobjetos con cámara de 4 pozos y se fijaron con una solución de 5% de formalina durante 30 minutos cada uno. Después de la fijación, se enjuagaron los. portaobjetos con PBS dos veces durante 5 minutos. Los portaobjetos se incubaron entonces con 10% de suero normal a partir del mismo huésped como el anticuerpo secundario, 2 x de caseína, y 0.3% de Tritón X100 en PBS, durante 20 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda. El suero en exceso se elimina y los portaobjetos fueron incubados con un anticuerpo primario (IgG policlonal de cabra (Santa Cruz; Santa Cruz, CA) en una cámara humidificad . El tiempo y la temperatura para las incubaciones fueron determinados seleccionando las condiciones óptimas para el anticuerpo que se utiliza. En general, los tiempos de incubación fueron 1 a 2 horas a 37°C o durante la noche a 4°C. Los portaobjetos se enjuagaron entonces con PBS tres veces durante 5 minutos cada uno y se incubaron durante 20-30 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda con anticuerpo secundario anti- inmunoglobulina conjugada fluorescente dirigida contra el huésped del anticuerpo primario (anticuerpo anti-cabra de conejo (Santa Cruz) ) . Más adelante, los portaobjetos fueron enjuagados con PBS tres veces durante 5 minutos cada uno, montados con un cubreobjetos utilizando una solución de montaje DAPI VECTASHIELD® (Vector Labs) a un núcleo de contra-tinción . La tinción celular se visualizó utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon. Todas las fotos fueron tomadas en tiempo de exposición igual normalizado contra el fondo del isotipo correspondiente (igG de cabra (Santa Cruz)). La Tabla 3 resume el resultado para la expresión de proteínas angiogénicas mediante células adherentes derivadas del amnios .

Tabla 3 : Marcadores angiogénicos presentes o ausentes en las células adherentes derivadas del amnios Las células adherentes derivadas del amnios expresaron el marcador 7 endotelial de tumor del marcador angiogénico (TEM-7), una de las proteínas mostradas en la Tabla 3. Véase la FIGURA 2. 6.2.4 Proteómica de Membrana para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas del Amnios Purificación de Proteínas de Membrana: Las células en el pasaje 6 fueron cultivadas para aproximadamente 70% de confluencia en medio de crecimiento, se tripsinizaron, y se lavaron en PBS . Las células se incubaron entonces durante 15 minutos con una solución que contiene un cóctel inhibidor de proteasas (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) antes de la lisis celular. Las células se lisaron entonces mediante la adición de una solución de 10 mM de HCl (evitando así el uso de detergentes) y se centrifugaron durante 10 minutos a 400 g para granular y remover el núcleo. El sobrenadante post-nuclear fue transferido a un tubo de ultracentrifugación y se centrifugó utilizando una ultracentrifugadora WX80 con un rotor T-1270 (Thermo Fisher Scientific, Asheville, NC) en 100,000 g durante 150 minutos generando un gránulo de proteínas de membrana.

Generación, Inmovilización y Digestión de Proteoliposomas : El gránulo de proteínas de membrana se lavó varias veces utilizando tampón Nanoxis (10 mm de Tris, 300 mM de NaCl, pH 8). Se suspendió el gránulo de proteínas de membrana en 1.5 mL de tampón Nanoxi y luego se sometió a ultrasonido la punta utilizando un procesador ultrasónico VC505 VIBRA-CELL™ (Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT) durante 20 minutos en hielo. El tamaño de los proteoliposomas se determinó tiñendo con tinte FM 1-43 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y visualización con microscopía fluorescente. La concentración de proteínas de la suspensión de proteoliposomas se determinó mediante ensayo BCA (Thermo Scientific) . Los proteoliposomas fueron entonces inyectados sobre una Célula de Flujo LPI™ (Nanoxi AB, Gothenburg, Suecia) utilizando una punta de pipeta estándar y se permite inmovilizar durante 1 hora. Después de la inmovilización, una serie de etapas de lavado se llevaron a cabo y tripsina a 5 µg/mL (Princeton Separations, Adelphi , NJ) se inyectó directamente sobre la Célula de Flujo LPI™. El trozo se incubó durante la noche a 37°C y los péptidos trípticos se eluyeron a partir del trozo de LPI™ y luego se desalaron utilizando un cartucho Sep-Pak (Waters Corporation, Milford, MA) .

Análisis LC/MS/MS de Trampa de Iones Lineal LTQ: Cada muestra de digestión trípica se separó en una columna MAGIC C18 de 0.2 mm x 150 mm 3 um 200 A (Michrom Bioresources , Inc., Auburn, CA) que fue interconectada directamente a un fuente de ionización de electro-rociado nanocapilar asistida por vacío de desolvacion axial (ADVA CE) (Michrom Bioresources, Inc.) utilizando un gradiente de 180 minutos (Tampón A: Agua, 0.1% de Ácido Fórmico; Tampón B: Acetonitrilo, 0.1% de Ácido Fórmico). La fuente ADVA CE logra una sensibilidad que es comparable a nano ESI tradicional mientras se opera en un índice de flujo considerablemente más elevado de 3 pL/min. Los péptidos eluidos fueron analizados en un espectrómetro de masa de trampa iónica lineal LTQ (Thermo Fisher Scientific, San José, CA) que emplea diez barridos de MS/MS dependientes de datos después de cada espectro de masa de barrido total. Siete conjuntos de datos de replicación analíticos fueron recolectados para cada muestra biológica.

Bioinformática : Siete Pilas RAW que corresponden a los conjuntos de bases de replicación analítica que fueron recolectados para cada línea celular fueron investigadas como una investigación sencilla contra la Base de Datos Humana IPI utilizando una implementación del algoritmo SEQUEST en una estación de trabajo Sorcerer Solo™ (Sage-N Research, San José, CA) . Una tolerancia de masa peptídica de 1.2 amu fue especificada, la oxidación de metionina fue especificada como una modificación diferencial, y la carbamidometilación fue especificada como una modificación estática. La implementación de software de soporte de la Tubería Trans-Proteómica (TPP) se utilizó para clasificar y analizar los datos proteómicos de la membrana. Las proteínas fueron consideradas para análisis en caso de que fueran identificadas con una probabilidad pept dica del 95%, la probabilidad de proteínas de 95% y 1 péptido único. Las comparaciones entre conjuntos de datos proteómicos de membrana se hicieron utilizando lenguaje Perl personalizado desarrollado en el interior.

Resultados : Como se muestra en la Tabla 4, las células adherentes derivadas del amnios expresan varios marcadores angiogénicos y cardiomiogénicos .

Tabla 4: Marcadores cardiomiogénicos o angiogénicos expresados mediante células adherentes derivadas del amnios Proteómicos de Membrana de Marcador AMDAC Positivo Negativo Inmunolocalización Proteómicos de Membrana de Marcador AMDAC Positivo Negativo I nm u nolocal izac ión Receptor de Activina tipo IIB X X ADAM 17 X X Alfa-actinina 1 X X Angiotensinógeno X X FilaminaA X X Receptor I y II de LDL acetilado de Macrófago X X Megalina X X Cadena pesada de Miosina sin músculo Tipo A X X Proteína C unida a Miosina Tipo cardiaca X X Wnt-9 X X 6.2.5 Perfil de Secretoma para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas del Amnios Matriz de Proteínas : Las células adherentes derivadas del amnios en el pasaje 6 se forman en placas en iguales números celulares en medio de crecimiento y se recolectaron los medios condicionados después de 4 días . El análisis cualitativo simultáneo de múltiples factores de citocinas angiogénicas/crecimiento en medios condicionados con células se realizó utilizando Matrices de Proteínas de Angiogénesis RayBiotech (Norcross, GA) . En pocas palabras, se incubaron matrices de proteínas con 2 mL de Tampón de Bloqueo IX (Ray Biotech) a temperatura ambiente durante 30 minutos (min) para bloquear las membranas. Subsiguientemente, el Tampón de Bloqueo se decantó y las membranas fueron incubadas con 1 mL de la muestra (medio de crecimiento condicionado por las células respectivas durante 4 días) a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. Las muestras se decantaron entonces y las membranas se lavaron 3 x 5 minutos con 2 mL de Tampón 1 de Lavado IX (Ray Biotech) a temperatura ambiente con agitación. Luego, se lavaron las membranas 2 x 5 minutos con 2 mL de Tampón II de Lavado IX (Ray Biotech) a temperatura ambiente con agitación. Después, 1 mL de anticuerpos conjugados con biotina diluida (Ray Biotech) se agregó a cada membrana y se incubaron a temperatura ambiente durante 1-2 horas y se lavaron con los Tampones de Lavado como se describe anteriormente. La es reptavidina conjugada con HRP diluida (2 mL) se agregó entonces a cada membrana y las membranas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 2 horas. Finalmente, las membranas se lavaron de nuevo, se incubaron con el kit de detección ECL™ (Amersham) de acuerdo con especificaciones y los resultados fueron visualizados y analizados utilizando un Sistema de Proceso de Imágenes Kodak Gel Logic 2200. La secreción de varias proteínas angiogénicas mediante las A DACs se muestra en la FIGURA 3.

ELISAs: Análisis Cuantitativo de factores de citocinas angiogénicas sencillas/de crecimiento en medios condicionados por células se realizaron utilizando kits comercialmente disponibles de R&D Systems (Minneapolis , MN) . En pocas palabras, los ensayos ELISA fueron realizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la cantidad de los factores de crecimiento angiogénicos respectivos en los medios condicionados se normalizó a 1 x 106 células. Las células adherentes derivadas del amnios (n = 6) exhibieron aproximadamente 4500 pg de VEGF por millón de células y aproximadamente 17,200 pg de IL-8 por millón de células.

Tabla 5: Resultados de ELISA para marcadores angiogénicos Análisis ELISA de secretoma, Disposiciones de Marcador AMDAC Positivo Negativo Proteína ANG X X EGF X X ENA-78 X X FGF2 X X Folistatina X X G-CSF X X GRO X X HGF X X IL-6 X X IL-8 X X Leptina X X MCP-1 X X MCP-3 X X PDGFB X X PLGF X X Rantes X X TGFB1 X X Trombopoyetina X X TIMP1 X X TIMP2 X X UPAR X X VEGF X X VEGFD X X En un experimento separado, fueron confirmadas las AMDACs para secretar también angiopoyetina-l , angiopoyetina-2, PECAM-1 (CD31; molécula de adhesión de células endoteliales plaquetaria), laminina y fibronectina . 6 .2 . 6 La Expresión MicroARN de AMDAC Confirma la Actividad Angiogénica Este Ejemplo demuestra que las AMDACs expresan niveles más elevados de ciertos micro-ARN (miAR s) y niveles inferiores de ciertos otros miARNs, cada uno de los cuales se correlaciona con la función angiogénica, que células madre mesenquimales derivadas de médula ósea.

Se sabe que miR-296 pro-angiogénico regula una función angiogénica a través de niveles regulatorios de receptores del factor de crecimiento. Por ejemplo, miR-296 en células endoteliales contribuye significativamente para angiogénesis seleccionando directamente del sustrato de tirosina cinasa regulado por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGS) ARNm, conduciendo a niveles reducidos de HGS y por consiguiente reduciendo la degradación mediada por HGS de los receptores del factor de crecimiento VEGFR2 y PDGFRb. Véase Würdinger et al., Cáncer Cell 14:382-393 (2008) . Además, miR-15b y miR-16 implicados en angiogénesis, y esa reducción inducida por hipoxia de miR-15b y miR-16 contribuye a un incremento en VEGF, una citocina pro-angiogénica. Véase Kuelbacher et al., Trends in Pharmacological Sciences, 29(1):12-15 (2007).

Se prepararon AMDACs como se describe en el Ejemplo 1, anterior. Las AMDACs y células BMMSC (utilizadas como un comparador) se sometieron a preparación de microARN (miR A) utilizando un Equipo de Aislamiento miRNA MIRVA A™ (Ambion, Catálogo* 1560). 0.5 x 106 a 1.5 x 105 células fueron afectadas en un tampón+++ de lisis desnaturalizada. Después, las muestras se sometieron a extracción de acidfenol+cloroformo para aislar ARN altamente enriquecido para especies pequeñas de ARN. Se agregó 100% para llevar las muestras a 25% de etanol . Cuando esta mezcla de lisado/etanol se hizo pasar a través de un filtro de fibra de vidrio, los ARNs grandes fueron inmovilizados, y las especies de ARN pequeñas se inmovilizaron. Este ARN se lavó y se eluyó en una solución de resistencia iónica baja. La concentración y pureza del ARN pequeño recuperado se determinó midiendo su absorbencia a 260 y 280 nm.

Se encontró que las AMDACs expresan el siguiente miARN angiogénico: miR-17-3p, miR-18a, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, (miembros del grupo 17-92 de miRNA angiogénico), miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, miR-16. Se encontró también que las AMDACs expresan niveles más elevados del siguiente miRNA angiogénico cuando se compara a células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSCs) : miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92 (miembros del grupo 17-92 de miRNA angiogénico), miR-296. Estos resultados se correlacionan bien con la observación de que las AMDACs expresan niveles elevados de VEGFR2/KDR (véase lo anterior) . Inversamente, se encontró que las AMDACs expresan niveles inferiores del siguiente miRNA angiogénico cuando se compara con BM-MSCs : miR-20a, miR-20b, (miembros del grupo 17-92 de miran angiogénico), miR-221, miR-222, miR-15b, miR-16. La expresión reducida de miR-15b y miR-16 se correlaciona con los niveles más elevados de expresión de VEGF observada en las AMDAC . 6.3 EJEMPLO 3: CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE CÉLULAS ADHERE TES DERIVADAS DEL AMNIOS Este Ejemplo demuestra diferentes características de AMDACs asociadas con ángiogénesis y capacidad de diferenciación . 6.3.1 Formación Tubular de HUVEC para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas del Amnios Se subcultivaron Células Endoteliales de Vena Umbilical Humana (HUVEC) en el pasaje 3 o menos en el medio EG -2 (Cambrex, East Rutherford, NJ) durante 3 días, y se cosechó en una confluencia de aproximadamente 70%-80%. Se lavaron las HUVEC una vez con medio basal/antibióticos (D EM/F12 (Gibco) ) y se volvieron a suspender en el mismo medio en la concentración deseada. Las HUVEC se utilizaron dentro de 1 hora de preparación. El colágeno placentario humano (HPC) se presentó en una concentración de 1.5 mg/mL en 10 mM de HCl (pH 2.25), fue "neutralizado" con tampón a pH 7.2 y se mantuvo en hielo hasta utilizarse. Se combinó HPC con la suspensión de HUVEC en una concentración celular final de 4000 células /uL. La suspensión de HUVEC/HPC resultante se pipeteo inmediatamente en placas de 96 pozos en 3 uL por pozo (perímetro de placa debe ser pre-llenado con PBS estéril para evitar evaporación, n = 5 por condición) . Las gotas de HUVEC fueron incubadas a 37°C y 5% de CO2 durante 75-90 minutos sin adición de medio para permitir polimerización de colágeno. Una vez terminada la incubación "seca", cada pozo se llenó ligeramente con 200 yL de medio condicionado de AMDAC (n = 5 líneas celulares) o medio control (por ejemplo, DME /F12 como el control negativo, y EGM-2 como el control positivo) y se incubo a 37°C y 5% de C02 durante 20 horas. Se preparó el medio condicionado incubando células adherentes derivadas del amnios en el pasaje 6 en medio de crecimiento durante 4 - 6 horas; se altera la unión y dispersión, se cargó el medio a DMEM/F12 durante 24 horas. Después de la incubación, se removió el medio de los pozos sin alterar las gotas de HUVEC y los pozos se lavaron una vez con PBS. Las gotas de HUVEC se fijaron entonces durante 10 segundos y se tiñeron durante 1 minuto utilizando un equipo de tinción celular Diff-Quik y se enjuagó subsiguientemente 3x veces con agua estéril. Las gotas teñidas se dejaron secar en aire y las imágenes de cada pozo se adquirieron utilizando el microscopio Zeiss SteReo Discovery V8. Las imágenes se analizaron entonces utilizando el paquete informático. "ImageJ" y/o MatLab. Se convirtieron imágenes de color a imágenes a escala de grises de 8 bits y se nivelaron para convertir a una imagen de negro y blanco. La imagen entonces se analizó utilizando características de análisis de partículas, las cuales proporcionan datos de densidad de pixeles, incluyendo conteo (número de partículas individuales), área total, tamaño promedio (de partículas individuales) y fracción del área, la cual iguala a la cantidad de formación tubular endotelial en el ensayo.

El medio acondicionado ejerció un efecto angiogénico en células endoteliales , como se demuestra por la inducción de formación de tubo de proliferación (véase la FIGURA 4) . 6.3.2 Ensayo de Migración de HUVEC Este experimento demostró la capacidad angiogénica de células adherentes derivadas del amnios . Las HUVEC se cultivaron para confluencia en una placa de 12 pozos recubierta con fibronectina (FN) y la monocapa se "debilitó" con la punta de una pipeta de plástico de 1 mL para crear una línea celular a través del pozo. Se probó la migración de HUVEC incubando las células "debilitadas" con medio acondicionado libre de suero (EBM2; Cambrex) obtenido de 5 líneas celulares adherentes derivadas del amnios después de 3 días de crecimiento. Se utilizó el medio EBM2 sin células como el control. Después de 15 horas, se registró la migración celular en el área acelular (n=3) utilizando un microscopio invertido. Las fotografías entonces se analizaron utilizando el programa informativo, "ImageJ" y/o MatLab. Las imágenes se convirtieron de color a imágenes a escala de grises de 8 bits y se nivelaron para convertir a una imagen de negro y blanco. La imagen se analizó entonces utilizando características de análisis de partículas, las cuales proporcionan datos de densidad de pixeles, incluyendo el conteo (número de partículas individuales), área total, tamaño promedio (de partículas individuales) , y fracción del área, la cual se iguala a la cantidad de migración endotelial en el ensayo. El grado de migración celular se evalúo contra el tamaño de la línea debilitada registrada inicialmente y los resultados se normalizaron a 1 x 106 células.

Los factores tróficos secretados por células adherentes derivadas del amnios ejercieron efectos angiogénicos en células endoteliales , como se demuestra por la inducción de migración celular (FIGURA 5) .

En un experimento separado, las HUVEC se cultivaron a sub-confluencia en una placa de 96 pozos recubiertas con FN, y se probó la inducción de proliferación incubando las células con medio condicionado libre de suero a partir de cada una de las 5 líneas de células adherentes derivadas del amnios (medio EBM-2, 3 días). Se utilizó el medio EBM-2 como el control negativo, y se utilizó el EGM-2 como el control positivo. Después de 48 horas, se evalúo la proliferación celular mediante mediciones de contenido de AND utilizando una Concentración Celular Promega 96® AZ Una Solución del Ensayo de Proliferación Celular (Promega, Madison, WI) . Barras de error indican desviaciones estándares de replicados analíticos (n=3) y los resultados se normalizaron a 1 x 106 células .

Los factores trópicos secretados por amnios derivados de las células adherentes resultantes en un incremento en la concentración de ADN, que es indicativa de proliferación HUVEC . Véase FIGURA 6, donde "CM" es el medio acondicionado . 6.3.3 Reincorporación del Lipoproteínas de Baja Densidad Acetilada (AcLDL) para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas Amnios Las células endoteliales y células microgliales en el cultivo pueden identificarse por su capacidad para tomar AcLDL fluorescente. Si los residuos de lisina de apoproteína de LDL se acetilan, el complejo LDL ya no se une al receptor LDL, y en lugar de esto puede tomarse por células endoteliales y macrófagos en forma específica de célula elevada .

Las células adherentes derivadas de amnios crecen ya sea en el medio de crecimiento sin VEGF o en EGM2-VM (Cambrex) con VEGF, para evaluar la potencia angiogénica de las células adherentes derivadas de amnios en general, así como el efecto de VEGF en el potencial de diferenciación de las células adherentes derivadas de amnios . Las células se cultivan en su medio respectivo en placas de 12 pozos durante 4 a 7 días hasta que alcanzan 70-80% de confluencia y subsecuentemente se incuban con un LDL acetilado a 10 ^ig/mL (invitrogen) durante la noche. Las células entonces se contra-tiñen con Calcein AM (Invitrogen) y se evalúan para su incorporación de LDL acetilada utilizando microscopía de fluorescencia. HUVECs como células control para incorporación de LDL acetiladas crecen en EGM2-MV y se analizan como se describe en lo anterior. Las células adherentes derivadas de amnios desplegadas en la incorporación mínima de LDL acetilada bajo condiciones de crecimiento normal, pero se inducen/diferencian para incrementar su incorporación a través de la estimulación con VEGF. Véase FIGURA 7. 6.3.4 Formación de Tubo para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas de Amnios Las células adherentes derivadas de Amnios crecen ya sea en el medio de crecimiento sin VEGF o EGM2-MV con VEGF para evaluar la potencia angiogénica de las células en general, así como el efecto de VEGF en el potencial de diferenciación de las células. HUVECs, como células control para formación de tubo, crecen en EGM2-MV. Las células se cultivan en el medio respectivo durante 4 a 7 días hasta que alcanzan confluencia de 70-80%. La solución MATRIGEL™ enfriada (4°C) (50 ^iL, BD Biosciences) , se distribuye en pozos de placa de 12 pozos y la placa se incuba durante 60 min a 37°C para permitir la solución en gel . Las células AMDACs y HUVEC se tripsinizan, resuspenden en el medio apropiado (con y sin VEGF) y 100 µ? de células diluidas (1 a 3 x 104 células) se agregan para cada uno de los pozos que contienen MATRIGEL™. Las células en el MATRIGEL™ polimerizado, en presencia o ausencia de 0,5 a 100 ng VEGF, se colocan durante 4 a 24 horas en un incubador C02 al 5% a 37 °C. Después de la incubación las células se evalúan para señalización de la formación del tubo utilizando microscopía ligera estándar.

Las células adherentes derivadas de amnios desplegadas en la formación del tubo mínimo en la ausencia de VEGF, pero se incuban y diferencian para formar estructuras similares al tubo a través de la estimulación con VEGF. Véase FIGURA 8. 6.3.5 Sensibilidad Hipoxia para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas de Amnios Para evaluar la funcionalidad angiogénica de las células endoteliales y/o progenitores endoteliales , las células pueden probarse con respecto a su capacidad para secretar factores de crecimiento angiogénico bajo condiciones hipóxicas y normóxicas. El cultivo bajo condiciones hipóxicas normalmente induce a una secreción incrementada de factores de crecimiento angiogénicos por ya sea células endoteliales o células progenitoras endoteliales, que pueden medirse en el medio acondicionado. Las células adherentes derivadas de amnios se colocan en placas en números de células iguales en su medio normal de crecimiento y crece aproximadamente 70-80% de concentración. Subsecuentemente, las células se intercambian en el medio libre de suero (EBM-2) y se incuban bajo condiciones normóxicas (21% 02) o hipóxicas (1% 02) durante 48 h. El medio acondicionado se colectó y la secreción de los factores de crecimiento angiogénicos se analizaron utilizando equipos ELISA comercialmente disponible de R S D Systems. Los ensayos ELISA se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la cantidad de los factores de crecimiento angiogénico respectivo (VEGF e IL-8) en el medio acondicionado se normalizaron a 1 x 106 células.

Las células adherentes derivadas de Amnios mostraron secreción elevada de varios factores de crecimiento angiogénicos bajo condiciones hipóxicas. Véase FIGURA 9.

En un experimento separado, las AMDACs se colocaron en placas en número de células iguales en el medio de crecimiento normal y crecieron aproximadamente 70-80% de concentración. Subsecuentemente, las células se intercambiaron en el medio libre de suero (EBM-2) y se incubaron bajo condiciones normóxicas (21% 02) o hipóxicas (1% 02) durante 48 h. Las células se sometieron a análisis flucitométrico para el marcador CD202b celular (también conocido como Tie2, Tek, o receptor de angiopoyetina-1) , un receptor involucrado en el desarrollo vascular y angiogénesis . El medio acondicionado se colectó y la secreción de los factores de crecimiento angiogénicos se analizaron utilizando equipos ELISA comercialmente disponibles (R & D Systems) . Se realizaron los análisis citométricos de flujo de acuerdo como se describe en lo anterior y los ensayos de ELISA se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La cantidad de los factores de crecimiento angiogénicos respectivos en el medio acondicionado se normalizó a 1 x 106 células. AMDACs mostraron la expresión elevada de CD202b bajo condiciones hepóxicas, como se compararon en condiciones normóxicas. Véase FIGURA 10. 6.3.6 Diferenciación Cardiomiogénica para Evaluación de Potencia Angiogénica de Células Adherentes Derivadas de Amnios Para inducir la diferenciación de las células progenitoras hacia un linaje de cardiomiocito, una combinación del cultivo de gota suspendida (HD, en la proliferación de interrupción de las células e inicio del proceso de diferenciación) con tratamiento subsecuente de las células arrestadas de crecimiento con factores específicos se realizó en diversas etapas. Siguiendo el cultivo de gota suspendido, las células se indujeron con combinaciones de activina A, proteína 4 morfogenética de hueso (BMP4), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF, también conocido como FGF2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, también conocido como VEGF) y homólogo 1 dickkopf (DKKl) durante un período de 16 días. En resumen, las células adherentes derivadas de amnios crecieron a aproximadamente 70% de concentración en el medio de crecimiento estándar. Las células entonces se tripsinizaron, y se lavaron en tampón como se describió previamente. Las gotas de 20 µ? que contiene 700 células se suspendieron en el medio relevante y se colocaron en el lado interno del reborde de un disco Petri de 100 mm utilizando una pipeta de multicanal . El reborde se invirtió cuidadosamente y se colocó en la parte superior del disco, lo cual contuvo 25 mL de PBS estéril para mantener las gotas de que se sequen. Los cultivos de gota suspendidos se incubaron durante 48 h a 37°C en una incubador de 5% C02. Subsecuentemente, los cuerpos agregados de las células se sembraron en placas de cultivo cubiertas con gelatina al 0.1% conteniendo medio de diferenciación específico de linaje para inducción adicional .

Las etapas de estimulación procedieron como sigue: Etapa 1, 4 días BMP4 (0.5 ng/mL) ; Etapa 2, 5 días BMP4 (10 ng/mL) , bFGF (5 ng/mL), activina A (3 ng/mL); Etapa 3, 3 días VEGF (10 ng/mL), DKKl (150 ng/mL), Etapa 4, 4 días VEGF (10 ng/R L) , DKKl (150 ng/mL), bFGF (5 g/mL) (+/-5-10 nM 5-aza-citidina) . Subsecuentemente, RNA total de las células tratadas se prepararon en análisis qRT-PCR y para marcadores cardiomiogénicos que se realizaron como se describió previamente .

Los resultados mostraron que las células adherentes derivadas de Amnios pueden inducidirse/diferenciarse para expresar varios marcadores cardiomiocíticos . Véase FIGURA 11. 6.3.7 Respuesta HUVEC en el Medio Acondicionado por AMDAC AMDACs se cultivaron durante 48 horas en el medio de crecimiento que contiene 60% DMEM-LG (Gibco) , 40% MCBD-201 (Sigma) , 2% SFB (Hyclone Labs) , lx insulina- ransferina-selenio (ITS) ; 10 ng/mL de ácido linoléico albúmina de suero bovino (LA-BSA) ; uno n-dexamethasone (Sigma) ; 2- fosfato de ácido ascórbico a 100 µ? (Sigma) , factor de crecimiento epidermal 10 ng/mL (R & D Systems); y factor de crecimiento derivado por plaqueta 10 ng/mL (PDGF-BB) (R & D Systems), y luego se cultivó durante 48 horas adicionales en el medio libre de suero. El medio acondicionado del cultivo AMDAC se colectó y utilizó para estimular HUVECs privadas de suero durante 5, 15, y 30 minutos. La HUVECs se Usaron subsecuentemente y tiñeron con BD™ CBA (Ensayo de Cuentecilla Citométrica) Equipo Flexible de Señalización de Células (BD Biosciences) para fosfoproteínas conocidas que juegan un papel en la señalización de la trayectoria angiogénica. Las AMDACs se encontró que eran activadores fuertes de AKT-1 (que inhiben los procesos apoptoticos), AKT-2 (que es una proteína de señalización importante en la trayectoria de señalización de insulina, y las trayectorias de proliferación de 1/2 célula ERK en HUVECs . Estos resultados además demuestran la capacidad angiogénica de AMDACs . 6.4 EJEMPLO 4: INDUCCIÓN DE ANGIOGENESIS POR AMDACS Este ejemplo demuestra que las AMDACs promueven angiogénesis en un ensayo in vivo utilizando membrana corioalantóica de pollo (CAM) .

Dos ensayos CAM separados se condujeron. En el primer ensayo CAM, los comprimidos de célula intacta de las preparaciones diferentes de las AMDACs se evaluaron. En el segundo ensayo de CAM, los sobrenadantes de las preparaciones las AMDACs diferentes se evaluaron. El factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF) se utilizó como un control positivo, y células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 como una referencia (control negativo) . El punto extremo del estudio fue para determinar las densidades de los vasos sanguíneos de todos los grupos de tratamiento y control . 6.4.1 Ensayo CAM que Utilizan Células Tres preparaciones de célula las AMDACs, referidas aquí en el Lote 1, Lote 2 y Lote 3, preparados como se describe en lo anterior y crioconservadas , se utilizaron. Las AMDACs se congelaron para dosificar y el número de células dosificadas en el CAM se determinaron.

Diseño del Estudio: El estudio incluyó 7 grupos con 10 embriones en cada grupo. El diseño del estudio se describe en la Tabla 6.

Tabla 6: Grupos de estudio, ensayo de angiogénesis de membrana corioalantoica de pollo.

Procedimiento de Ensayo CAM: se incubaron los huevos fértiles frescos durante 3 días en un incubador de huevo normal a 37°C durante 3 días. En el Día 3, los huevos se fracturaron bajo condiciones estériles y los embriones se colocaron en veinte placas de plástico de 100 mm y se cultivaron a 37°C en un incubador de embrión con un recipiente de agua en el estante inferior. El aire se burbujeo continuamente en el recipiente de agua utilizando una bomba pequeña de modo que la humedad en el incubador se mantuvo constante. En el Día 6, un anillo "O" de silicón estéril se colocó en cada CAM y luego las AMDACs en una densidad de 7.69 x 105 células/40 ^tL de la mezcla del medio/MATRIGEL™ (1:1) se suministró en cada anillo "O" en un extractor estéril. Las Tablas 2A y 2B representan el número de células utilizadas y la cantidad del medio agregado a cada preparación de célula para dosificación. Los embriones de control de vehículo recibieron 40 ^iL de vehículo (PBS/MATRIGEL™, 1:1), controles positivos recibieron 100 ng/ml bFGF en 40 µ? del medio DMEM/mezcla MATRIGEL™ (1:1), y los controles del medio recibieron 40 µ? del medio DMEM solo. Los embriones se regresaron al incubador después de cada dosificación se completó. En el Día 8, los embriones se retiraron del incubador y mantuvieron a temperatura ambiente, mientras la densidad de los vasos sanguíneos se determinó bajo cada anillo "O" utilizando un sistema de captura de imagen en una ampliación de 100 X.

Se midió la densidad de los vasos sanguíneos mediante un sistema de puntuación de angiogénesis que utilizó números aritméticos 0 a 5 , o números exponenciales 1 a 32 , para indicar el número de vasos sanguíneos presentes en los sitios de tratamiento en el CAM. Los números con puntuación más elevada representaron densidad del vaso mayor, mientras 0 representó no angiogénesis. El porcentaje de inhibición en cada sitio de dosificación se calculó utilizando el registro registrado para ese sitio, dividido por la puntuación media obtenida de las muestras control para cada experimento individual. El porcentaje de inhibición para cada dosis de un compuesto dado se calculó agrupando todos los resultados obtenidos para esa dosis desde 8-10 embriones.

Tabla 7 : Cantidad del medio agregado a cada preparación celular para la normalización de la suspensión de célula fina para dosificación Línea Tamaño de Normalización con Volumen Final Celular comprimido DMEM y MATRIGEL™ de Suspensión Celular las AMDACS 260 µL 0 µ?, + 260 µ?? 520 µ?? Lote 1 MATRIGEL™ las AMDACS 170 µ?? 90 ^lL + 260 µL 520 µ?? Lote 2 MATRIGEL™ las AMDACS 170 µ?. 90 µ?, + 260 µ?? 520 µ?, Lote 3 MATRIGEL™ MDA-MB-231 40 nL 220 µL + 260 µL 520 µL MATRIGEL™ Todas las células se utilizaron en el pasaje 6.

Resultados Los resultados de las puntuaciones de densidad de los vasos sanguíneos se presentaron en la FIGURA 12. Los resultados claramente indicaron que las puntuaciones de densidad de los vasos sanguíneos de las membranas corioalantóicas de pollo se trataron con cada una de las suspensiones de células madre, o 100 ng/ml de bFGF, o suspensiones de célula de cáncer de mama MDAMB231 se compararon en forma estadística y significativamente más elevada en aquellos del vehículo control de las CAMs (P <0.001, Prueba "t" del estudiante). El medio utilizado para cultivar las células madre no tuvo ningún efecto en la densidad de los vasos sanguíneos. Además, la inducción de la densidad de los vasos sanguíneos dé las preparaciones, las AMDACs mostraron alguna variación, pero las variaciones no fueron estadísticamente significativas. Se concluye que la potencia de inducción de cada uno de las preparaciones de células madre fue de aproximadamente el mismo. 6.4.2 Ensayo CAM Utilizando Sobrenadantes de Célula de las AMDACs Las muestras del sobrenadante de las células MDA-MB-231 y de cada una de preparaciones de célula madre diferente descritas en el ensayo, las AMDACs CAM anteriores se utilizan en un segundo ensayo CAM. Como con el ensayo las AMDACs CAM, las células bFGF y MDA-MB-231 se utilizan como controles positivos.

Diseño del Estudio: El estudio incluyó 7 grupos con 10 embriones en cada grupo. El diseño del estudio se describe en la Tabla 8.

Tabla 8: Diseño del Estudio - ensayo CAM utilizando sobrenadantes de célula Grupo # de No. Embriones Tratamiento Punto Final 1 10 Control de vehículo Puntuación de (40 µ?, de mezcla densidad de los PBS /MATRIGEL™, 1:1 vasos sanguíneos por volumen 2 10 Control positivo, Muestra como grupo 1 tratado con bFGF (100 ng/CAM en 40 µS, de mezcla DMEM/MATRIGEL™ 1:1) 3 10 Control del medio (40 Muestra como grupo 1 ih de DME ) 4 10 Sobrenadante de las Muestra como grupo 1 AMDACs Lote 1 5 10 Sobrenadante de las Muestra como grupo 1 AMDACs Lote 2 6 10 Sobrenadante de las Muestra como grupo 1 AMDACs Lote 3 7 10 Sobrenadante de Muestra como grupo 1 células MDAMB231 (P34) Las células AMDACs se utilizaron como Pasaje 6.

Procedimiento de Ensayo CAM: El procedimiento de ensayo fue el mismo como se describe en lo anterior en el ensayo las AMDACs CAM. La única diferencia fue que el sobrenadante de cada preparación de células madre o de células MDA-MB-231 se utilizó como material de prueba. Para la dosificación, cada sobrenadante se mezcló con MATRIGEL™ (1:1 por volumen) y 40 µ?, de la mezcla se dosifico en cada embrión .

Resul tados Las puntuaciones de densidad de los vasos sanguíneos (Véase FIGURA 13.) Indican que la inducción de la formación de los vasos sanguíneos por el sobrenadante de cada preparación de célula madre difiere. Las muestras del sobrenadante de los tres lotes de las AMDACs mostraron efecto significativo en la inducción de los vasos sanguíneos con P <0.01, P <0,001 y P <0.02 (prueba "t" del Estudiante), respectivamente. Como se esperaba, el control positivo bFGF también mostró inducción potente de la formación de los vasos sanguíneos como se ve en lo anterior en el ensayo CAM no. 1 (P <0,001, Prueba "t" del estudiante). Sin embargo, el sobrenadante de las células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 no mostraron inducción significante en la formación de los vasos sanguíneos comparado con los controles del vehículo. Como se muestra previamente, el medio de cultivo solo no tuvo ningún efecto. 6.5 EJEMPLO 5: LAS AMDACS MOSTRARON EFECTO NEUROPROTECTOR Este Ejemplo demostró que las AMDACs tienen un efecto neuroprotector en condiciones de bajo oxígeno y baja glucosa utilizando un ensayo ofensivo de carencia de oxígeno-glucosa (OGD) y reduce la especie de oxígeno reactivo. Como tal, estos resultados indican que las AMDACs deben ser útiles al tratar las condiciones isquémicas tal como enfermedad vascular periférica, y debe protegerse contra las lesiones de reperfusión que resulten de las condiciones isquémicas.

Neuronas Humanas (ScienCell, catálogo # 1520) se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En resumen, los vasos de cultivo se recubrieron con poli-L-Lisina (2^ig/mL) en agua destilada estéril durante 1 hora a 37 °C. El recipiente se lavó con doble H20 destilada tres veces. El medio de neurona (ScienCell) se agregó al recipiente y se equilibró a 37°C en un incubador. Las neuronas se descongelaron y se agregaron directamente en el recipiente sin centrifugación. Durante el cultivo subsiguiente, el medio se cambió al día siguiente de la iniciación del cultivo, y cada siguiente día después de esto las neuronas estuvieron listas para ofensivas para el día 4.

El medio OGD (Libre de Glucosa del Medio de Eagle modificado por Dulbecco) se preparó primero calentando el medio en un baño de agua, en parte para reducir la solubilidad del oxígeno en el medio líquido. 100% de nitrógeno se burbujeo durante 30 minutos a través del medio utilizando piedra de difusión de 0.5 ym para remover el oxígeno disuelto. El regulador de HEPES se agregó a la concentración final de 1 mM. El medio se agregó directamente a las neuronas al término del rocío. Una muestra pequeña del medio se sometió a alícuota para la confirmación de los niveles de oxígeno utilizando un sensor de oxígeno tipo inmersión. Los niveles de oxígeno se redujeron típicamente a 0.9% a aproximadamente 5.0% de oxígeno.

Una cámara hipoxia se preparó colocando la cámara en una incubadora a 37°C durante al menos 4 horas (de manera preferible durante la noche) previo a la gasificación. El medio en los recipientes de cultivo se eliminó y se colocó con el medio desgaseado, y los recipientes de cultivo se colocaron en la cámara hipoxia. Entonces se enjuagó con gas a N2 al 95%/C02 al 5% a través del sistema a una velocidad de 20-25 Lpm durante al menos 5 minutos. El sistema se incubó en la incubadora a 37 °C durante 4 horas, con la desgasificación de la cámara una vez más después de una hora .

En la conclusión del procedimiento inofensivo, el medio OGD se aspiró y el medio de calentamiento se agregó a las neuronas. 24-28 horas después, las AMDACs y las neuronas se colocaron en los números iguales a 100,000 células cada una por pozo de una placa de 6 pozos suspendida en el Medio Neuronal se agregó a las neuronas y se co-cultivó durante 6 días .

Se tomaron las fotomicrografías de los campos aleatorios en una placa de 6 pozos para cada condición. Las células que tienen una morfología neuronal típica se identificaron, y las longitudes de neuritas se registraron. La longitud promedio de las neuritas se correlaciona en forma positiva para salud neuronal, y fueron más largas en los co-cultivos de neuronas y las AMDACs, indicando que las AMDACs protegieron las células de ser ofensivas.

Ensayos de Especies de Oxígeno Reactivo Las AMDACs se determinaron para expresar superoxido dismutasa, catalasa y gen heme oxigenasa durante hipoxia. La capacidad de las AMDACs para barrer la especie del oxígeno reactivo, y proteger las células de tal especie, se determinó en un ensayo utilizando peróxido de hidrógeno como un generador de especie de oxígeno reactivo.

Descripción del ensayo: las células de selección (Astrocitos, ScienCell Research Laboratories) se sembraron en placas de pozo negro de 96 pozos pre-recubiertos con poli-L-lisina a 6000/cm2. Los astrocitos se dejan unir durante la noche en el medio de crecimiento a 37 °C con dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente, el medio de cultivo se eliminó y las células se incubaron con tinte permeable de célula DCFH-DA (diacetato de Diclorofluorescina) , la cual es una sonda fluorogénica . El exceso de tinte se eliminó lavando con Solución Salina Regulada de Hank o Solución Salina Regulada de Fosfato de Dulbecco. Las células entonces se aislaron con especie de oxígeno reactivo mediante adición de peróxido de hidrógeno de 1000 µ? durante 30-60 minutos. El medio que contiene peróxido de hidrógeno, entonces se eliminó, y colocó con un medio de crecimiento libre de glucosa, libre de suero. Las AMDACs (ya células designadas como Lote 1 o Lote 2), o MSC-BM, se agregaron a 6000/cm2, y las células se cultivaron durante otras 24 horas. Las células entonces se leyeron en un lector de placa de fluorescencia estándar a 480Ex y 530Em. El contenido de especie de oxígeno reactivo del medio fue directamente proporcional a los niveles de DCFH-DA en el citosol celular. El contenido de especie de oxígeno reactivo se midió por comparación en la curva estándar DCF predeterminada. Todos los experimentos se hicieron con N = 24.

Para el ensayo, IX DCFH-DA se preparó inmediatamente previo al uso diluyendo una solución de reserva 20 X DCFH-DA en el medio de cultivo celular sin suero bovino fetal, y se agitó para homogeneidad. Las diluciones de Peróxido de Hidrógeno (H202) se prepararon en DMEM o DPBS como sea necesario. Una curva estándar se preparó como una serie de diluciones de 1:10 en el margen de concentración de 0 yM a 10 µ? diluyendo de 1 M DCF estándar en el medio de cultivo celular, transfiriendo 100 µ? de DCF estándar a una placa de 96 pozos en forma adecuada para medida fluorescente y agregando 100 µ?? de regulador de lisis celular. La fluorescencia se leyó a 480Ex y 530Em.

Resultados: Tanto los lotes de las AMDACs utilizadas redujeron significativamente la concentración de especie de oxígeno reactivo en los co-cultivos de astrocitos. Véase las figuras. 14A y 14B. En contraste, BM-MSC fracasadas redujeron significativamente la especie de oxígeno reactivo en los co-cultivos de astrocitos. 6.6 MÉTODOS PARA TRATAMIENTO UTILIZANDO CÉLULAS ADHERENTES DERIVADAS DE AMNIOS 6.6.1 Tratamiento de infarto del Miocardio Un individuo macho en sus 50 años promedio se presentó con dolor de pecho radiado en el brazo izquierdo durante más de 20 minutos, falta de aliento, náuseas, palpitaciones, sudoración. Con los resultados del electrocardiograma y un ascenso y caída de los niveles sanguíneos de creatina cinasa, un diagnóstico diferencial del infarto del miocardio (transmural) de la pared anterior del corazón se hizo. Después de la estabilización del individuo con nitroglicerina y estreptoquinasa, al individuo se le administró 1 x 108 a 5 x 108 de las AMDACs en solución de solución salina al 0.9% directamente al área afectada utilizando una jeringa cardiaca con anestesia local. El individuo se monitoreo en una base de emergencia durante las siguientes 72 horas. El individuo además se monitoreo sobre los siguientes tres meses pos-tratamiento mediante electrocardiograma y/o técnicas de visualización de tinción para valorar el rango revascularización del área infartada. La efectividad terapéutica se estableció si los resultados del electrocardiograma fueron discerniblemente más cercanos a lo normal que antes de la administración de la las AMDACs, o si el área infartada, como se visualizo, se revasculariza en forma discernible. 6.6.2 Tratamiento de la Cardiomiopatía Un individuo se presenta con desaliento, hinchazón de las piernas y tobillos, y latidos irregulares. Después de excluir otras causas, y con un electrocardiograma confirmatorio, se hace un diagnóstico de cardiomiopatía. Una ecografía confirma que el individuo tiene cardiomiopatía congestiva. Al individuo se le administró 1 x 108 a 5 x 108 de las AMDACs al 0.9% de solución salina directamente a la arteria cardiaca utilizando una jeringa cardiaca con anestesia local. El individuo se monitoreo durante los siguientes tres meses para cambios en las lecturas del sonograma indicando más flujo sanguíneo normal, y mejorar en • la sensación de desaliento o reducción en la hinchazón de las piernas y tobillos. La eficacia terapéutica se estableció para el individuo si cualquiera de estas señales mostró mejora durante el período de monitoreo. 6.6.3 Tratamiento de Enfermedad Vascular Periférica Un individuo se presenta con frío, pie con hormigueo que se vuelve rojizo al oscilar, y dolor, debilidad y cansancio en las piernas. Después de excluir la diabetes, un diagnóstico de enfermedad de arteria periférica se hace. Al individuo se le administra 1 x 109 a 5 x 109 de las AMDACs intravenosamente en 450 mi de 0.9% de solución salina, y se monitorea quincenalmente durante los siguientes tres meses. La eficacia terapéutica se establece si cualquiera de los síntomas descritos en lo anterior mejora durante el período de monitoreo. 6.6.4 Tratamiento de Enfermedad Vascular Periférica Un individuo se presenta con frío, pie con hormigueo que se vuelve rojizo al oscilar, y dolor, debilidad y cansancio en las piernas. Después de excluir la diabetes, un diagnóstico de enfermedad de arteria periférica se hace.

Al individuo se le administra 1 x 108 a 5 x 10a de las AMDACs intravenosamente en 5 mi al 0.9% de solución salina, y/o una cantidad equivalente intravenosa o intra-arterial , localmente entre los dedos del pie, y se monitorea quincenalmente durante los siguientes tres meses. La efectividad terapéutica se establece si cualquiera de los síntomas descritos en lo anterior mejora durante el período de monitoreo. 6.6.5 Tratamiento de Combinado de la Enfermedad Vascular Periférica Un individuo se presenta con frío, pie con hormigueo que se vuelve rojizo al oscilar, y dolor, debilidad y cansancio en las piernas. Después de excluir la diabetes, un diagnóstico de enfermedad de arteria periférica se hace. Al individuo se le administra 1 x 109 a 5 x 109 de las AMDACs intravenosamente en 450 mi de 0.9% de solución salina, y se monitorea quincenalmente durante los siguientes tres meses. Al individuo también se prescribe con cilostazol, 100 mg, para tomarse dos veces diariamente. La efectividad terapéutica se establece si cualquiera de los síntomas descritos en lo anterior mejora durante el período de monitoreo . 6.6.6 Tratamiento de Combinado de la Enfermedad Vascular Periférica Un individuo se presenta con frío, pie con hormigueo que se vuelve rojizo al oscilar, y dolor, debilidad y cansancio en las piernas. Después de excluir la diabetes, un diagnóstico de enfermedad de arteria periférica se hace. Al individuo se le administra en forma individual experimentando angioplastia y cirugía para implantar un stent en la arteria femoral. Al paciente se le administra subsecuentemente 1 x 109 a 5 x 109 de las AMDACs en forma intravenosa en 450 mi de 0.9% de solución salina y se monitorea quincenalmente durante los siguientes tres meses. La efectividad terapéutica se establece si cualquiera de los síntomas descritos en lo anterior mejora durante el período del monitoreo. 6.6.7 Tratamiento del Ataque Utilizando las AMDACs Un hombre de edad avanzada de 52 años se presenta con hemiplejía en el lado izquierdo del cuerpo, y afasia parcial. Un diagnóstico de ataque isquémico se hace. Después de colocar en el área de isquemia utilizando imagen de resonancia magnética nuclear, el individuo se prepara para cirugía para crear una abertura en el cráneo en el lado afectado. Una vez que la abertura se hace, 5 x 107 a 1 x 108 de las AMDACs en 1-2 mL de 0/9% de solución salina se administra intravenosamente. El individuo se monitorea durante los siguientes 7-14 días para señalización de la mejora en cualquier síntoma de ataque, particularmente hemiplejía o afasia. La efectividad terapéutica se establece si cualquiera de los síntomas descritos en lo anterior mejora durante el período de monitoreo. 6.6.8 Tratamiento del Derrame Cerebral Utilizando las AMDACs Un hombre de edad avanzada de 52 años se presenta con hemiplejía en el lado izquierdo del cuerpo, y afasia parcial. Un diagnóstico de ataque isquémico se hace. Después de colocar en el área de isquemia utilizando imagen de resonancia magnética nuclear, el individuo se prepara para cirugía para crear una abertura en el cráneo del lado afectado. Una vez que la apertura se hace, 5 x 109 a 1 x 109 de las AMDACs en 450 mL 0.9% de solución salina se administra intravenosamente. El individuo se monitorea durante los siguientes 7-14 días para señalización de la mejora en cualquier síntoma de ataque, particularmente hemiplejía o afasia. La efectividad terapéutica se establece si cualquiera de los síntomas descritos en lo anterior mejora durante el período de monitoreo.

Equivalentes : La presente invención no se limita al alcance por las modalidades específicas descritas aquí. En lugar de esto, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas llegarán a ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior, y las figuras anexas. Tales modificaciones se pretenden para caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas Varias publicaciones, patentes y solicitudes de patente se citan aquí, las descripciones de las cuales se incorporan para referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un amnios aislado derivado de célula adherente, en donde la célula se adhiere al plástico de cultivo de tejido, y en donde la célula es OCT-4" (proteína 4 de enlace octámero) según se determina por RT-PCR.

2. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula es HLA-G, según se determina por RT-PCR.

3. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula es adicionalmente CD49f+, según se determina por la citometría de flujo.

4. La célula aislada de la reivindicación 3, en donde la célula es OCT-4" HLA-G" y CD49f+.

5. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula es CD90+, CD105+, o CD117" según se determina por la citometría de flujo.

6. La célula aislada de la reivindicación 5, en donde la célula es CD90+, CD105+ y CD117".

7. La célula aislada de la reivindicación 6, en donde la célula es OCT-4" y HLA-G", según se determina por RT-PCR, y CD49f+, CD90+, CD105+ y CD117" según se determina por la citometría de flujo.

8. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula es VEGFR1/Flt-1+ (receptor 1 de factor de crecimiento endotelial vascular) y VEGFR2 /KDR+ (receptor 2 de factor de crecimiento endotelial vascular) , según se determina por inmunolocalizacion.

9. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula es una o más de CD9+ CD10\ CD44\ CD54\ CD98+, Tie-2+ (receptor angiopoyetina) , TEM-7+ (marcador 7 endotelial de tumor), CD31", CD34", CD45", CD133", CD143" (enzima angiotensina-I-conversión, ACE) , CD146" (molécula de adhesión celular de melanoma) , o CXCR4 (receptor 4 de quimioquina (motivo C-X-C) según se determina por inmunolocalizacion .

10. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula es CD9+ CD10+, CD44\ CD54\ CD98\ Tie-2+ (receptor angiopoyetina) , TEM-7+ (marcador 7 endotelial de tumor), CD31", CD34", CD45", CD133", CD143", CD146" y CXCR4 según se determinó por inmunolocalizacion.

11. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula es VE-cadherina" según se determinó por inmunolocalizacion .

12. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula es adicionalmente positiva para CD105+ y CD200+ según se determinó por inmunolocalizacion.

13. La célula aislada de la reivindicación 1, en donde la célula no expresa CD34 como detecta por inmunolocalizacion después de la exposición a 50 ng/mL de VEGF durante 7 días .

14. Una población aislada de células que comprende la célula de la reivindicación 1.

15. La población aislada de células de la reivindicación 14, en donde al menos el 50% de las células en la población son células de la reivindicación 1.

16. La población aislada de células de la reivindicación 14, en donde al menos el 90% de las células en la población son células de la reivindicación 1.

17. Una población aislada de células que comprenden la célula de la reivindicación 7.

18. La población aislada de células de la reivindicación 17, en donde al menos el 50% de las células en la población son células de la reivindicación 7.

19. La población aislada de células de la reivindicación 11, en donde al menos el 90% de las células en la población son células de la reivindicación 7.

20. Una población aislada de células que comprenden la célula de la reivindicación 4, en donde la población aislada de células no es un Amnios.

21. La población aislada de células de la reivindicación 14, en donde al menos el 50% de las células en la población son células de la reivindicación 4.

22. La población aislada de células de la reivindicación 14, en donde al menos el 90% de las células en la población son células de la reivindicación 4.

23. Una composición que comprende el amnios aislado derivado de la célula adherente de la reivindicación 1 o reivindicación 7.

24. La población aislada de células de la reivindicación 14, en donde el segundo tipo de célula es una célula madre embriónica, célula sanguínea, una célula madre aislada de la sangre periférica, una célula madre aislada de la sangre placentaria, una célula madre aislada del perfusato placentario, una célula madre aislada del tejido placentario, una célula madre aislada de la sangre del cordón umbilical, una célula madre del cordón umbilical, una célula madre mesenquimal derivada de la médula espinal, una célula estromal mesenquimal derivada de la médula espinal, una célula madre hematopoyética, una célula madre somática, un condorcito, un fibroblasto, unas células de músculo, una célula endotelial, un angioblasto, una célula progenitora endotelial, un pericito, un cardiomiocito, un miocito, un cardiomioblastoma, un mioblastoma, una célula madre embriónica o un célula manipulada para parecerse a una célula madre embriónica.

25. La población aislada de células de la reivindicación 24, en donde el segundo tipo de células comprende al menos 10% de células en la población.

26. La población aislada de células de la reivindicación 24, en donde el segundo tipo de células comprende al menos 25% de células en la población.

27. La población aislada de células de la reivindicación 24, en donde el segundo tipo de células es una célula madre hematopoyetica o progenitora.

28. La población aislada de la reivindicación 27, en donde la célula madre hematopoyética o progenitora es una célula CD34+.

29. Una célula adherente derivada de amnios aislada, en donde la célula es adherente al plástico del cultivo de tejido y donde la célula es OCT-4" según se determina por RT-PCR, y CD49f+, HLA-G', CD90+, CD105+ y CD117", según se determina por inmunolocalizacion y en donde la célula : (a) expresa uno o más de CD , CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRl /Flt-1 , o VEGFR2/KDR (CD309), según se determina por inmunolocalizacion; (b) carece de expresión de CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR , HLA-G O VE-cadherina, según se determina por inmunolocalizacion o carece de expresión de SOX2, según se determina por RT-PCR; (c) expresa ARNm para ACTA2 , ADAM S1 , AMOT, A G, A GPT1, ANGPT2, ANGPTLl , ANGPTL2 , ANGPTL4 , BAIl, CD44, CD200, CEACAMl , CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1 , COL4A2 , COL4A3 , CSF3, CTGF , CXCL12, CXCL2 , DNMT3B, ECGFl , EDG1 , EDIL3 , ENPP2 , EPHB2, FBLN5, F2 , FGF1, FGF2 , FIGF , FLT4 , FN1 , FST, FOXC2 , GRN, HGF, HEY1 , HSPG2, IFNBl , IL8 , IL12A, I GA4 , ITGB3 , MDK, MMP2, MY0Z2, NRPl , NRP2 , PDGFB , PDGFRA, PDGFRB , PECAMl , PF4, PGK1, PROXl, PTN, SEMA3F, SERPINB5 , SERPINC1 , SERPINF1 , TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1 , THBS1 , THBS2 , TIE1, TIE2/TEK, TNF, TNNI1, TNFSF15, VASHl , VEGF , VEGFB , VEGFC , VEGFRl/FLTl o VEGFR2/KDR; d) expresa una o más de las proteínas CD49d, Conexina-43, HLA-ABC , Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDL1, CD106, Galectina-1, ADAM 17, precursor de angiotensinógeno, filamina A, alfa-actinina 1, megalina, receptor i y II de LDL macrófago acetilado, precursor del tipo IIB del receptor activina, proteína Wnt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrocito, proteína C de enlace con miosina o cadena pesada de miosina, tipo A no muscular; (e) secreta VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2 , Folistatina, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TI P-2, uPAR, o Galectina-1 en el medio de cultivo en el cual crece la célula; (f) expresa micro ARNs miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, o miR-296 a un nivel más elevado que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula espinal; (g) expresa micro ARNs, miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-15b, o miR-16 a un nivel más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula espinal; (h) expresa miAR s miR-17-.3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR222, miR-15b, o miR-16; o (i) expresa niveles incrementados de CD202b, IL-8 o VEGF cuando se cultiva en menos de aproximadamente 5% de 02, comparado para la expresión de CD202b, IL-8 o VEGF bajo 21% de 02.

30. La célula adherente derivada de amnios aislada de la reivindicación 29, en donde la célula es OCT-4" según se determina por RT-PCR, y CD49f\ HLA-G", CD90+, CD105+ y CD117", según se determina por inmunolocalización y en donde la célula: (a) expresa CD9 , CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRl/Flt-1, y/o VEGFR2/KDR (CD309), según se determina por inmunolocalización; (b) carece de expresión de CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD144, CD146, CD271, CXCR4 , HLA-G y/O VE-cadherina, según se determinar por inmunolocalización y/o carece de expresión de SOX2, según se determina por RT-PCR; (c) expresa ARNm para ACTA2 , ADAMTS1, AMOT, ANG, A GPT1, A GPT2, ANGPTL1, A GPTL2 , ANGPTL4 , BAI1, CD44, CD200, CEACAM1, CHGA, COL15A1, COL18A1, COL4A1 , COL4A2 , COL4A3 , CSF3, CTGF , CXCL12, CXCL2 , DNMT3B, ECGFl , EDG1 , EDIL3 , ENPP2 , EPHB2, FBLN5, F2 , FGFl , FGF2 , FIGF, FLT4 , FNl , FST, FOXC2 , GR , HGF , HEY1 , HSPG2 , IFNBl , IL8 , IL12A, ITGA4 , ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MY0Z2 , NRPl, NRP2 , PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAM1, PF4, PGK1, PROXl, PTN, SEMA3F, SERPINB5 , SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3 , TGFA, TGFBl , THBS1 , THBS2, TIEl , TIE2/TEK, TNF , TMNIl , TNFSF15, VASHl , VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1 y/o VEGFR2/KDR; (d) expresa una o más de CD49d, Conexina-43, HLA-ABC , Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDLl , CD106, Galectina-1, ADAM 17, precursor de angiotensinogeno, filamina A, alfa-actinina 1, megalina, receptor I y II de LDL macrófago acetilado, precursor del tipo IIB del receptor activina, proteína nt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrocito, proteína C de enlace con miosina y/o cadena pesada de miosina, tipo A no muscular; (e) secreta uno o más de VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, Folistatina, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TI P-2, uPAR, y Galectina-1 en el medio de cultivo en el cual crecen la células; (f) expresa micro ARNs miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, y/o miR-296 a un nivel más elevado que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula espinal; (g) expresa micro ARNs, miR-20a, miR-20b, miR-221, miR-222, miR-15b, y/o miR-16 a un nivel más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula espinal; y (h) expresa miAR s miR-17-3p, miR-18a, miR-18b, miR-19b, miR-92, miR-20a, miR-20b, miR-296, miR-221, miR-222, miR-15b, y/o miR-16; y/o (i) expresa niveles incrementados de CD202b, IL-8 y/o VEGF cuando se cultiva en menos de aproximadamente 5% de 02, comparado para la expresión de CD202b, IL-8 y/o VEGF bajo 21% de 02.

31. Una población aislada de las células de la reivindicación 29.

32. Una población aislada de las células de la reivindicación 30.

33. Una matriz sintética o descelularizada permanente o degradable o matriz o soporte que comprende las células de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 ó 9.

34. La matriz o soporte de la reivindicación 33, en donde la matriz o soporte es una membrana amniótica; una matriz extracelular deshidratada; colágeno placentario, o membrana extracelular placentaria.

35. Un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, que comprende administrar una población de células de la reivindicación 1 o reivindicación 7, en el individuo en una cantidad y durante un tiempo suficiente para detectar mejora de uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno.

36. Un método para tratar a un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, que comprende administrar una población de células de la reivindicación 1 o reivindicación 7, en el individuo en una cantidad y durante un tiempo suficiente para detectar mejora de uno o más indicios de función cardiaca, donde los indicios de función cardiaca son el rendimiento cardiaco (CO) en el pecho, índice cardiaco (CI), presión capilar de arteria pulmonar, índice cardiaco (CI), % de acotamiento fraccional (%FS) , fracción de expulsión (EF) , fracción de la expulsión ventricular izquierda (LVEF) ; diámetro diastólico final ventricular izquierdo (LVEDD) , diámetro sistólico final ventricular izquierdo (LVESD) , contractilidad (dP/dt) , una disminución en la funcionalidad atrial o ventricular, un incremento en la eficacia del bombeo, una disminución en la proporción de pérdida de eficiencia de bombeo, una disminución en la pérdida de funcionalizacion hemodinámica o disminución en complicaciones asociadas con la cardiomiopatía cuando se compara con el individuo previo a la administración de amnios derivado de las células adherentes .

37. Un método para tratar a un individuo que tiene una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor de CNS, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del amnios derivado de las células adherentes de la reivindicación 1 o la reivindicación 7.

38. Un método para tratar a un individuo que tiene una interrupción del flujo sanguíneo en o alrededor de la extremidad que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de las células adherentes derivadas de amnios de la reivindicación 1 o la reivindicación 7. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan en la presente células agiogénicas novedosas de amnios referidas como células adherentes derivadas de amnios, y poblaciones de, y composiciones que comprenden, tales células. Además, se proporcionan en la presente métodos para obtener tales células y métodos para utilizar las células en el tratamiento de individuos.