JP2014520857A - 羊膜由来接着細胞を使用する放射線障害の治療 - Google Patents

羊膜由来接着細胞を使用する放射線障害の治療 Download PDF

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Abstract

放射線に被曝した個体、例えば、放射線障害を有する個体を治療する方法であって、該個体に、羊膜由来接着細胞と称される、羊膜由来の血管新生細胞、又はそのような細胞の集団、及びそのような細胞を含む組成物を投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【選択図】図１

Description

本願は、米国仮特許出願第61/508,553号の優先権を主張するものであり、該出願の開示はその全体として引用により本明細書中に組み込まれている。
（1. 分野）
放射線障害を有する個体を治療する方法であって、該個体に、治療上有効な量の、本明細書で「羊膜由来接着細胞(AMDAC)」と称される羊膜から得た血管新生細胞を投与することを含む方法が本明細書に提供される。羊膜由来接着細胞は、従来記載されている組織培養表面接着胎盤幹細胞とは異なる。
（2. 背景）
放射線の被曝から生じる肉体の障害を含む、放射線の被曝の生理学的効果を改善できるか又は軽減できる療法の必要性が存在する。治療上有効な量（数）のAMDACの投与を含む、放射線に被曝した個体を治療する方法が本明細書に提供される。
（３. 概要）
一態様において、放射線に被曝した個体、例えば、放射線障害を有する個体を治療する方法であって、該個体に、治療上有効な量の単離された羊膜由来接着細胞(AMDAC)を投与することを含み、前記細胞が組織培養表面に接着し、前記細胞がRT-PCRにより決定可能なOCT-4-(オクタマー結合タンパク質4)である方法が本明細書に提供される。特定の実施態様において、AMDACはOCT-4-及びCD49f+である。特定の実施態様において、前記放射線は電離放射線である。具体的な実施態様において、該電離放射線は、β線、γ線、又はX-線である。他の実施態様において、前記放射線はα線である。他の実施態様において、前記放射線は中性子線である。
具体的な実施態様において、前記放射線は、急性の、例えば、0.01ミリシーベルト(mSv)〜0.1mSv(0.001レム〜0.01レム)の単一線量であり;急性の、例えば、1mSv〜10mSv(0.1レム〜1.0レム)(0.001グレイ(Gy)〜0.01Gy)の単一線量であり;急性の、例えば、10mSv〜100mSv(1レム〜10レム)(0.01Gy〜0.1Gy)の単一線量であり;急性の、例えば、100mSv〜1000mSv(10レム〜100レム)(0.1Gy〜1.0Gy)の単一線量であり;急性の、例えば、1000mSv〜2000mSv(100レム〜200レム)(1Gy〜2Gy)の単一線量であり;急性の、例えば、2000mSv〜3000mSv(200レム〜300レム)(2Gy〜3Gy)の単一線量であり;急性の、例えば、3000mSv〜4000mSv(300レム〜400レム)(3Gy〜4Gy)の単一線量であり;急性の、例えば、4000mSv〜5000mSv(400レム〜500レム)の単一線量であり、又は急性の、例えば、5000mSv〜10000mSv(500レム〜1000レム)(5Gy〜10Gy)の単一線量である。
他の具体的な実施態様において、前記放射線は、0.01mSv〜0.1mSv(0.001レム〜0.01レム)の慢性被曝、又は実質的に慢性な被曝であり;1mSv〜10mSv(0.1レム〜1.0レム)(0.001Gy〜0.01Gy)の慢性被曝であり;10mSv〜100mSv(1レム〜10レム)(0.01Gy〜0.1Gy)の慢性被曝であり;100mSv〜1000mSv(10レム〜100レム)(0.1Gy〜1.0Gy)の慢性被曝であり;1000mSv〜2000mSv(100レム〜200レム)(1Gy〜2Gy)の慢性被曝であり;2000mSv〜3000mSv(200レム〜300レム)(2Gy〜3Gy)の慢性被曝であり;3000mSv〜4000mSv(300レム〜400レム)(3Gy〜4Gy)の慢性被曝であり;4000mSv〜5000mSv(400レム〜500レム)(4Gy〜5Gy)の慢性被曝であり、5000mSv〜10000mSv(500レム〜1000レム)(5Gy〜10Gy)の慢性被曝であり;又は10000mSv〜100000mSv(1000レム〜10000レム)(10Gy〜100Gy)の慢性被曝である。特定の具体的な実施態様において、前記慢性被曝は1〜6日にわたり;7〜13日にわたり;14〜27日にわたり;28〜56日にわたり;又は56日よりも長期にわたる。「実質的に慢性な被曝」は、例えば、被曝が連続的ではないが慢性である、例えば、放射線源から風向が変わる時の特定の場所における被曝など、数日、数週間、又は数か月の長期にわたる被曝を含み得る。
具体的な実施態様において、個体は、医療現場において前記放射線に被曝した。より具体的な実施態様において、前記個体は、骨髄破壊の目的で前記放射線に被曝した。より具体的な実施態様において、前記骨髄破壊は、部分的(すなわち、個体の骨髄細胞の少なくとも一部分は放射線治療に耐え、又は線量がそのようになるように計算されている)、又は完全(すなわち、放射線被曝が、個体の骨髄細胞を実質的にすべて破壊するように設計されており;又は、個体の生命を維持するために、放射線被曝が幹細胞移植、例えば、骨髄移植を必要とする)である。他の実施態様において、個体は、医療現場以外、例えば、職場において被曝した。
特定の実施態様において、前記個体は、前記投与の時点で、急性放射線症候群の１つ以上の症状をまだ発していない。他の実施態様において、前記個体は、前記放射線の被曝の結果として急性放射線症候群又は急性放射線症候群の症状を発したか、又は発しそうである。具体的な実施態様において、前記１つ以上の症状は、悪心、嘔吐、下痢、発熱、及び/又は頭痛の１つ以上を含む。他の具体的な実施態様において、前記１つ以上の症状は、紫斑病（purpuria）、衰弱、疲労、感染症、脱毛症、被曝した組織の水泡形成若しくは壊死、及び/又は出血を含む。他の具体的な実施態様において、前記１つ以上の症状は、神経障害、認知機能障害、失調、振戦、及び/又は発作を含む。他の具体的な実施態様において、前記1つ以上の症状は白血球減少症を含む。
他の実施態様において、前記個体は、個体の体に接触しない源からの放射線に被曝する。他の実施態様において、前記個体は、個体の体に接触する放射線源の結果として放射線に被曝する。具体的な実施態様において、前記個体は、該個体が放射線源を吸入又は摂取した結果として放射線に被曝する。
特定の具体的な実施形態において、前記投与は、前記被曝の96時間以内に；前記被曝の72時間以内に；前記被曝の48時間以内に;又は前記被曝の24時間以内に行われる。
他の態様において、造血再構成(例えば、部分的又は完全な造血再構成)を、その必要のある対象に誘導する方法であって、該対象に、治療上有効な量の単離されたAMDACを投与することを含む方法が本明細書に提供される。このように、AMDACは、造血再構成から利益を得るだろう疾患/障害を治療する方法に利用できる。
本明細書では、造血再構成は、造血系統の１つ以上の細胞、例えば、１つ以上の造血幹細胞の数及び/又は種類が、対象中で増加し、例えば、AMDACによる治療の結果として、そのような治療のない場合の数及び/又は種類に比べて増加する現象を意味する。理論に拘束されることは望まないが、AMDACによる治療の結果としての造血系統の細胞の数及び/又は種類の増加は、そのような細胞に対するAMDACの直接又は間接的な効果から生じ得る。造血再構成の現象は、当業者に公知である方法、例えば、FACS分析並びに血液学的分析、例えば、赤血球数、ヘマトクリット値、及びヘモグロビンレベル(例えば、以下の実施例4参照)を利用して評価できる。
具体的な実施態様において、造血再構成が必要とされる対象は、放射線(例えば、致死線量又は亜致死線量の放射線)に被曝した。他の具体的な実施態様において、対象は、放射線に被曝しなかった。特定の実施態様において、対象は、骨髄破壊、例えば、癌の療法(例えば、化学療法、免疫療法)又は他の療法の一部として骨髄破壊を受けた。
具体的な実施態様において、AMDACを使用して、骨髄機能不全又は１つ以上の主造血系統の産生の遺伝性若しくは先天性の減少を有する対象の造血系を再構築できる。この実施態様に従って治療できる骨髄機能不全に関連する疾患には、再生不良性貧血、例えば、遺伝性再生不良性貧血(ファンコニー貧血及び骨髄異形成症候群など)、並びに放射線、薬物、及び/又は化学薬品(例えば、ベンゼン)への曝露による貧血などの後天性再生不良性貧血があるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、後天性貧血は放射線の被曝によるものではない。
他の具体的な実施態様において、AMDACを使用して、慢性腎疾患又は肝疾患などの慢性疾患の貧血;自己免疫性溶血性貧血;ヘモグロビン異常症、及び鎌状赤血球症若しくはα-サラセミア若しくはβ-サラセミアなどのサラセミアを含むがこれらに限定されない貧血を有する対象の造血系を再構築できる。
他の具体的な実施態様において、AMDACを使用して、赤芽球ろう、例えば、自己免疫赤血球形成不全又は全白血病赤血球形成不全などの原発性疾患として存在する赤芽球ろう;又は血液悪性腫瘍、例えば、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、骨髄線維症、本態性血小板症、若しくは急性リンパ芽球性白血病などの疾患に関連する続発性疾患として存在する赤芽球ろう;固形腫瘍、例えば、胃の癌腫、乳房若しくは胆管の腺癌、肺の扁平上皮癌、甲状腺の癌腫、腎細胞癌腫、又はカポジ肉腫;慢性リンパ性貧血（chronic lymphocytic anemias）;薬物及び化学薬品、例えば、アロプリノール、アザチオプリニ（azathioprinie）、セファロチン、エストロゲン、フェヌプロフェン（fenuprofen）、ハロセン、イソニアジド、フェノバルビタール、スルファチアゾール、若しくはリファンピシン;又は重度腎不全を有する対象の造血系を再構築できる。
特定の実施態様において、前記OCT-4-AMDACは、RT-PCRにより決定可能なHLA-G-である。特定の他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、さらに免疫局在化により決定可能なCD49f+であり、すなわち該AMDACは、OCT-4-、CD49f+である。特定の他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、OCT-4-、HLA-G-、及びD49f+である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、免疫局在化により決定可能なCD90+、CD105+、又はCD117-である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、フローサイトメトリーにより決定可能なCD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的な実施態様において、前記AMDACは、RT-PCRにより決定されるOCT-4-及びHLA-G-であり、且つ免疫局在化により決定可能なCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、免疫局在化により決定可能なVEGFR1/Flt-1+(血管内皮細胞成長因子受容体1)及びVEGFR2/KDR+(血管内皮細胞成長因子受容体2)である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、免疫局在化により決定可能なCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(アンジオテンシン-I-変換酵素、ACE)、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の１つ以上である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、免疫局在化により決定可能なCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。上記実施態様のいずれかの他の具体的な実施態様において、AMDACは、免疫局在化により決定可能なVE-カドヘリン-である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、免疫局在化により決定可能なCD105+及びCD200+に対してさらに陽性である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、7日間50ng/mLのVEGFに曝露された後で、免疫局在化により決定可能なCD34を発現しない。
他の具体的な実施態様において、放射線障害の治療に有用な、放射線障害を有する個体の治療に有用な、且つ/又は造血再構成の方法に有用な(例えば、造血再構成から利益を得るだろう疾患の治療に有用な)AMDACは、組織培養表面に接着し;前記AMDACは、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定可能なCD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり;前記AMDACは:(a)免疫局在化により決定可能なCD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、若しくはVEGFR2/KDR(CD309)の１つ以上を発現し;(b)免疫局在化により決定可能なCD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、若しくはVE-カドヘリンの発現を欠き、又はRT-PCRにより決定可能なSOX2の発現を欠き;(c)ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、若しくはVEGFR2/KDRのmRNAを発現し;(d)タンパク質類CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-マイクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM17、アンジオテンシノゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、アクチビン受容体IIB型前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、星状細胞、ミオシン結合タンパク質C、若しくはミオシン重鎖、非筋細胞A型の１つ以上を発現し;(e)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、若しくはガレクチン-1を、AMDACが培養されている培地に分泌し;(f)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、若しくはmiR-296を、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞より高レベルで発現し;(g)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、若しくはmiR-16を、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞より低レベルで発現し;(h)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、若しくはmiR-16を発現し;且つ/或いは、(i)21%のO2下でのCD202b、IL-8、若しくはVEGFの発現に比べて、約5%未満のO2中で培養された場合にCD202b、IL-8、若しくはVEGFを増加したレベルで発現する。
本明細書に提供される、放射線に被曝した個体、例えば、放射線障害を有する個体を治療する方法及び/又は造血再構成から利益を得るだろう疾患を治療する方法は、本明細書に記載のAMDACのいずれかを含む細胞の集団を使用できるが、前記集団中の少なくとも50%の細胞、前記集団中の少なくとも80%の細胞、又は前記集団中の少なくとも90%の細胞がAMDACである。具体的な実施態様において、前記集団は単離された第二の種類の細胞をさらに含み、前記集団は、羊膜、羊膜の一部、又は羊膜のホモジネートでない。具体的な実施態様において、前記第二の種類の細胞は、造血幹細胞又は始原細胞、例えば、CD34+細胞である。他のより具体的な実施形態において、前記第二の種類の細胞は、胚性幹細胞、血球、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨髄由来の間葉系間質細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、軟骨細胞、神経芽細胞、筋細胞、内皮細胞、血管芽細胞、内皮始原細胞、周皮細胞、心筋細胞、筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、又は胚性幹細胞に似るように操作された細胞である。特定のより具体的な実施態様において、前記第二の種類の細胞は、前記集団の少なくとも10%の細胞、又は少なくとも25%の細胞を構成する。
本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞及び細胞集団は、例えば、米国特許第7,255,879号又は米国特許出願公開第2007/0275362号に記載される単離された胎盤幹細胞又は細胞集団ではない。本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞は、内皮始原細胞、羊膜上皮細胞、栄養芽細胞、細胞栄養芽層、胚性生殖細胞、胚性幹細胞、胚の内部細胞塊から得た細胞、又は胚の生殖堤から得られた細胞でもない。
本明細書では、「約」という用語は、例えば、記述された数字又は値の10％以内を意味する。
本明細書では、「幹細胞」という用語は、大規模だが必ずしも無限にではなく増殖することができ、且つ、発生学的な発達又は出生後の組織交換及び修復のいずれかの間で、複数の組織の形成に寄与する、いずれか所定の細胞集団の機能特性を定義している。
本明細書では、「始原細胞」という用語は、大規模だが必ずしも無限にではなく増殖することができ、且つ、発生学的な発達又は出生後の組織交換及び修復のいずれかの間で、幹細胞と比べて限定された組の複数の組織の形成に寄与する、いずれか所定の細胞集団の機能特性を定義している。
本明細書では、「由来した」という用語は、単離されているか、又は別の形で純化されていることを意味する。例えば、羊膜由来接着細胞は、羊膜から単離されている。「由来した」という用語は、組織、例えば、羊膜から直接単離された細胞から培養される細胞、及び初代単離株から培養又は拡大された細胞を包含する。
本明細書では、「免疫局在化」は、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、磁気細胞選別、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学などにおいて、免疫タンパク質、例えば、抗体又はその断片を用いる、化合物、例えば、細胞マーカーの検出を意味する。
本明細書では、「単離された細胞」という用語は、該単離された細胞が由来する組織、例えば羊膜又は胎盤の他の細胞から実質的に分離されている細胞を意味する。該単離された細胞が天然に関連している細胞の少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも99％が、例えば、該細胞の回収及び/又は培養時に、該細胞から取り除かれる場合、該細胞は「単離され」ている。本明細書では、「単離された細胞集団」という用語は、該細胞集団が由来する組織、例えば、羊膜の他の細胞から実質的に分離されている細胞の集団を意味する。
本明細書では、細胞は、例えば、免疫局在化、例えば、フローサイトメトリーにより；又は、RT-PCRにより、特定のマーカーがバックグラウンドを上回り検出可能である場合、特定のマーカーについて「陽性」である。例えば、CD105が、バックグラウンドよりも(例えばアイソタイプ対照と比べて)検出可能に多い量で細胞上で検出可能である場合、該細胞は、例えばCD105について陽性と説明される。例えば、抗体-媒介性検出の文脈において、特定の細胞表面マーカーが存在することの指標としての「陽性」は、該マーカーが、そのマーカーに対して特異的な抗体、例えば蛍光標識抗体を用いて検出可能であることを意味し；「陽性」はまた、細胞が、例えばフローサイトメーターにおいて、バックグラウンドを上回り、又はアイソタイプ対照を上回る量で検出可能であるシグナルを発生する量で、そのマーカーを有することも意味する。例えば、細胞が、CD105に特異的な抗体により検出可能に標識され、且つ該抗体からのシグナルが対照(例えば、バックグラウンド)よりも検出可能に高い場合に、該細胞は「CD105+」である。対照的に、同じ文脈で「陰性」とは、細胞表面マーカーが、該マーカーに特異的な抗体を用い、バックグラウンドと比べ、検出可能でないことを意味する。例えば、細胞がCD34に特異的な抗体で検出可能に標識されない場合、該細胞は「CD34-」である。本明細書において特記されない限りは、分化抗原分類(「CD」)マーカーは、抗体を用いて検出される。例えば、OCT-4のmRNAが、例えば30サイクルのRT-PCRを用い検出可能である場合に、OCT-4が存在し、且つ細胞がOCT-4+であると決定することができる。
(4. 図面の簡単な説明)
図1は、羊膜由来接着細胞及びNTERA-2細胞による幹細胞関連遺伝子の発現を示す。
図2は、羊膜由来接着細胞(AMDAC)の細胞表面上のTEM-7の発現を示す。
図3は、羊膜由来接着細胞による選択された血管新生タンパク質の分泌を示す。3A: TIMP1、TIMP2、トロンボポエチン、VEGF、及びVEGF-Dの分泌。3B: アンジオゲニン、EGF、ENA-78、bFGF、及びGROの分泌。3C: インターフェロンγ、IGF-1、IL-6、IL-8、及びレプチンの分泌。3D: MCP-1、PDGF-BB、PlGF、RANTES、及びTGFβ1の分泌。P6: 継代数6でのAMDAC。対照:抗体なし。多くの対照値は基本的に零であった。密度値: Kodak Gel Logic 2200 Imaging Systemからの出力。
図4は、放射線に被曝してビヒクル対照を投与されたか、放射線に被曝してAMDAC又はNeupogen(登録商標)を投与されたか、又はビヒクル対照のみを投与されたかのいずれかのマウスの群の生存曲線を示す。
図5は、ビヒクル対照のみを投与されたか(A群)、放射線に被曝してビヒクル対照を投与されたか(B群)、又は放射線に被曝して特定の投与量のAMDACを投与された(C群及びD群)いずれかのマウスの群の生存曲線を示す。
図6は、ビヒクル対照のみを投与されたか、放射線に被曝してビヒクル対照を投与されたか、又は放射線に被曝して特定の投与量のAMDACを投与されたいずれかのマウスから得られた特定の血液学的分析の比較の結果を示す。P値は、放射線に被曝してビヒクル対照により処置されたマウス(左から２番目のバー)の間の有意な差を示す。A:ヘマトクリット値(HCT)の比較。B:ヘモグロビン(HGB)の比較。C:赤血球数(RBC)の比較。
図7は、FACS分析の結果を与える。A:ビヒクル対照のみを投与されたか、放射線に被曝してビヒクル対照を投与されたか、又は放射線に被曝して特定の投与量のAMDACを投与されたマウスから得られた骨髄由来細胞でのc-kit及びsca-1発現のプロット。B:放射線に被曝してビヒクル対照を投与されたか、又は放射線に被曝して特定の投与量のAMDACを投与されたマウスにおける造血幹細胞及び始原細胞の頻度。
（5. 詳細な説明）
（5.1 放射線障害の治療）
一態様において、放射線に被曝した個体、例えば、放射線障害を有する個体を治療する方法であって、該個体に、本明細書の他の場所に記載される、治療上有効な量の単離された羊膜由来接着細胞(AMDAC)を投与することを含み、前記細胞が組織培養表面に接着し、前記細胞がRT-PCRにより決定可能なOCT-4-(POU5F1;オクタマー結合タンパク質4)である方法が本明細書に提供される。治療上有効な量は、放射線障害の1つ以上の症状の排除、検出可能な改善、重症度の軽減、進行の緩徐化、出現の低減、又は出現の予防をもたらすAMDACの数である。具体的な実施態様において、前記1つ以上の症状は、悪心、嘔吐、下痢、発熱、及び/又は頭痛の1つ以上を含む。他の具体的な実施態様において、前記1つ以上の症状は、紫斑病、衰弱、疲労、感染症、脱毛症、被曝した組織の水泡形成若しくは壊死、及び/又は出血を含む。他の具体的な実施態様において、前記1つ以上の症状は、神経障害、認知機能障害、失調、振戦、及び/又は発作を含む。他の具体的な実施態様において、前記1つ以上の症状は白血球減少症を含む。
被曝は、偶発的、例えば、核施設、研究機関、又は病院における、被曝が意図されない業務の間の被曝であり得るか、又は個体が放射性物質に汚染された領域(例えば、核爆発又は原子力発電所事故の周りの領域)にいる結果であり得る。被曝は、例えば核攻撃などの軍事行動により、それに付随しても起こりうる。被曝は、故意になることもあり、例えば、原子力事故、例えば原子炉事故に付随する救済又は浄化作業の一部としての被曝、又は医療処置の一部としての被曝があり得る。この実施態様において、医療処置は、例えば、頭部、胸部、胸郭、腹部、又は体の他の部分を含む1つ以上のX-線処置であり得る。医療処置は、頭部、胸部、胸郭、腹部、又は体の他の部分のCTスキャンでもあり得る。医療処置は、部分的又は完全な放射線誘導骨髄破壊でもあり得る。この実施態様において、「部分的」骨髄破壊は、個体の骨髄細胞の全てではなく一部を破壊するのに十分な強度及び期間の放射線の被曝を意味する。対照的に「完全な」骨髄破壊は、個体の生命を維持するために、個体の骨髄細胞の実質的に全てを破壊するのに十分な強度及び期間の放射線の被曝、例えば、治療、例えば、幹細胞移植、例えば、骨髄移植を要する被曝を意味する。
個体は、AMDACによる治療を始めるのに、実際に放射線宿酔又は放射線被曝のいずれかの症状と診断される必要はない。個体が放射線に被曝した兆候で十分である。
個体の放射線障害は、あらゆる種類の放射線により起こり得る。特定の実施態様において、前記放射線は電離放射線である。具体的な実施態様において、該電離放射線は、β線、γ線、又はX-線である。他の実施態様において、前記放射線はα線である。他の実施態様において、前記放射線は中性子線である。個体は、例えば、体の全部分が、同じ、又は実質的に同じ放射線被曝を受ける全身照射を経験したかもしれない。個体は、局所的照射、例えば、個体の体の一部分のみへの照射を経験したかもしれない。
特定の実施態様において、放射線障害を起こした、個体により経験される放射線被曝は急性であり、すなわち、単一被曝又は短期間、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12時間未満の被曝の結果であり得る。特定の実施態様において、急性被曝は亜致死性である。他の実施態様において、急性被曝は致死性であり、例えば、治療されないと、被曝後21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1日以内に個体の死を起こすだろう。特定の他の実施態様において、放射線障害を起こした、個体により経験される放射線被曝は慢性であり、すなわち、例えば、1〜70日又はそれ以上にわたり蓄積する。例えば、個体は、放射性領域での長期間の仕事；放射性領域での長期間の生活などの結果として慢性的に放射線に被曝し得る。特定の他の実施態様において、被曝は実質的に慢性である。「実質的に慢性の被曝」は、例えば、被曝が連続的ではないが慢性的である、例えば、放射線源からの風向が変わる時の特定の場所における被曝など、数日、数週間、又は数か月の長期にわたる被曝を含み得る。特定の実施態様において、慢性被曝は、治療なしで最終的に致死的ではない。他の実施態様において、慢性被曝は治療なしで最終的に致死的である。
具体的な実施態様において、前記放射線は急性の、例えば、0.01mSv(ミリシーベルト)〜0.1mSv(0.001レム〜0.01レム)の単一線量;急性の、例えば、1mSv〜10mSv(0.1レム〜1.0レム)(0.001Gy(グレイ)〜0.01Gy、又は0.1cGy(センチグレイ)〜1.0cGy)の単一線量;急性の、例えば、10mSv〜100mSv(1レム〜10レム)(0.01Gy〜0.1Gy、又は1cGy〜10cGy)の単一線量;急性の、例えば、100mSv〜1000mSv(between10レム〜100レム)(0.1Gy〜1.0Gy、又は10cGy〜100cGy)の単一線量;1000mSv〜2000mSv(100レム〜200レム)(1Gy〜2Gy、又は100cGy〜1000cGy)の単一線量;急性の、例えば、2000mSv〜3000mSv(200レム〜300レム)(2Gy〜3Gy、又は200cGy〜300cGy)の単一線量;急性の、例えば、3000mSv〜4000mSv(300レム〜400レム)(3Gy〜4Gy、又は300cGy〜400cGy)の単一線量;急性の、例えば、4000mSv〜5000mSv(400レム〜500レム)(4Gy〜5Gy、又は400cGy〜500cGy)の単一線量;又は5000mSv〜10000mSv(500レム〜1000レム)(5Gy〜10Gy、又は500cGy〜1000cGy)の単一線量;又は急性の、例えば、10000mSv〜100000mSv(1000レム〜10000レム)(10Gy〜100Gy、又は1000cGy〜10000cGy)の単一線量である。
特定の他の実施態様において、放射線は、0.01mSv〜0.1mSv(0.001レム〜0.01レム)(0.0001Gy〜0.001Gy、又は0.01cGy〜0.1cGy)の慢性被曝;1mSv〜10mSv(0.1レム〜1.0レム)(0.001Gy〜0.01Gy、又は0.1cGy〜1.0cGy)の慢性被曝;10mSv〜100mSv(1レム〜10レム)(0.01Gy〜0.1Gy、又は1cGy〜10cGy)の慢性被曝;100mSv〜1000mSv(10レム〜100レム)(0.1Gy〜1.0Gy、又は10cGy〜100cGy)の慢性被曝;1000mSv〜2000mSv(100レム〜200レム)(1Gy〜2Gy、又は100cGy〜200cGy)の慢性被曝;2000mSv〜3000mSv(200レム〜300レム)(2Gy〜3Gy、又は200cGy〜300cGy)の慢性被曝;3000mSv〜4000mSv(300レム〜400レム)(3Gy〜4Gy、又は300cGy〜400cGy)の慢性被曝;4000mSv〜5000mSv(400レム〜500レム)(4Gy〜5Gy、又は400cGy〜500cGy)の慢性被曝;5000mSv〜10000mSv(500レム〜1000レム)(5Gy〜10Gy、又は500cGy〜100cGy)の慢性被曝;又は10000mSv〜100000mSv(1000レム〜10000レム)(10Gy〜100Gy、又は1000cGy〜10000cGy)の慢性被曝である。
特定の具体的な実施形態において、前記慢性被曝は、1〜6日にわたり;7〜13日にわたり;14〜27日にわたり;28〜56日にわたり;56日より長期にわたる。特定の他の実施態様において、被曝は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12か月にわたる。
放射線被曝の1つ以上の症状、例えば放射線宿酔の1つ以上の症状を改善し、低減し、又はその発生を予防するために、AMDACを予防的に投与することができる。従って、該方法の特定の実施態様において、個体は放射線に被曝したが、前記投与の時点で急性放射線症候群の1つ以上の症状を発していない。AMDACはまた、又は代替的に、放射線被曝の1つ以上の症状が発せられたか、又は明らかになった後で個体に投与することができる。
具体的な実施態様において、個体は、医療現場において前記放射線に被曝した。より具体的な実施態様において、前記個体は、骨髄破壊の目的で、前記放射線に被曝した。より具体的な実施態様において、前記骨髄破壊は、部分的(すなわち、個体の骨髄細胞の少なくとも一部分は放射線治療に耐え、又は線量がそのようになるように計算されている)、又は完全(すなわち、放射線被曝が、個体の骨髄細胞を実質的に全て破壊するように設計されており;又は、個体の生命を維持するために、放射線被曝が幹細胞移植、例えば、骨髄移植を必要とする)である。他の具体的な実施態様において、前記個体は、他の医療目的、例えば、体の1つ以上の部分のイメージングの目的で放射線に被曝した。
他の実施態様において、個体は、医療現場以外で、例えば、職場、例えば、原子力発電所、研究機関、又は兵器施設で被曝した。
他の実施態様において、前記個体は、個体の体に接触しない源からの放射線に被曝する。他の実施態様において、前記個体は、個体の体に接触する放射線源の結果として放射線に被曝する。具体的な実施態様において、前記個体は、個体が放射線源を吸入又は摂取した結果として、例えば、放射性の水、食品、ほこり、空気などの中の、例えば、放射性のリン、硫黄、ストロンチウム、ヨウ素、セシウム、ウラン、プルトニウムなどの摂取の結果として放射線に被曝する。
特定の具体的な実施形態において、前記投与は、前記被曝の96時間以内に;前記被曝の72時間以内に;前記被曝の48時間以内に;前記被曝の24時間以内に;被曝の12時間以内に;被曝の6時間以内に、又は被曝の3時間以内に行われる。特定の他の具体的な実施態様において、前記投与は、前記被曝の検出の96時間以内に;前記被曝の検出の72時間以内に;前記被曝の検出の48時間以内に;前記被曝の検出の24時間以内に;被曝の検出の12時間以内に;被曝の検出の6時間以内に、又は被曝の検出の3時間以内に行われる。特定の実施態様において、AMDACの投与は、被曝した個人において、放射線被曝の1つ以上の症状、例えば、悪心、嘔吐、下痢、頭痛、体の被曝部分の灼熱感などが現れるとすぐに行われる。
特定の実施態様において、前記個体は、前記投与の時点で急性放射線症候群の1つ以上の症状をまだ発していない。他の実施態様において、前記個体は、前記放射線被曝の結果として、急性放射線症候群又は急性放射線症候群の症状を発したか、又は発しそうである。特定の実施態様において、AMDACは、前記個体に、治療的に、すなわち、被曝後、例えば、放射線障害が起こった後に投与される。特定の具体的な実施形態において、前記投与は、前記被曝の96時間以内に;前記被曝の72時間以内に;前記被曝の48時間以内に;又は前記被曝の24時間以内に行われる。特定の他の実施態様において、AMDACは、予防的に、例えば、予測される放射線被曝の前の約12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1時間以内に行われる。放射線被曝が予期される場合、例えば、被曝が医療処置の一部である場合、又は汚染地域（例えば、原子力発電所事故）の中又はその周辺での仕事の一部である場合、AMDACは、1回又は複数回、被曝に先立ち、例えば、前記被曝の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12時間前に投与することができる。
特定の実施態様において、放射線に被曝した個体の治療は、AMDACの単回投与を含む。他の実施態様において、放射線に被曝した個体の治療は、2回以上の、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10回の前記AMDACの投与を含む。
本明細書に提供される治療の方法は、特定の実施態様において、上述のマーカーの組み合わせにより説明されるAMDACのいずれかを含む細胞集団の投与を含み、前記集団中の少なくとも50%の細胞が、前記集団中の少なくとも80%の細胞が、又は前記集団中の少なくとも90%の細胞が前記AMDACである。しかし、細胞の集団は、単離された羊膜又はその部分ではない。
具体的な実施態様において、AMDACを含む細胞の集団は、単離された第二の種類の細胞、例えば、放射線障害を治療できる細胞、例えば、十分な量で、個体の造血系を再構成できる細胞をさらに含む。特定の実施態様において、例えば、第二の種類の細胞は、造血幹細胞、例えば、CD34+細胞、間葉系幹細胞(例えば、骨髄由来間葉系幹細胞)、骨髄由来間質細胞、粗骨髄などである。他の具体的な実施態様において、前記第二の種類の細胞は、胚性幹細胞、血球、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞、体性幹細胞、軟骨細胞、神経芽細胞、筋細胞、内皮細胞、血管芽細胞、内皮始原細胞、周皮細胞、心筋細胞、筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、又は胚性幹細胞に似るように操作された細胞、例えば、iPS細胞である。特定のより具体的な実施態様において、前記第二の種類の細胞は、前記集団中の少なくとも10%の細胞、又は少なくとも25%の細胞を構成する。
特定の実施態様において、単離された第二の種類の細胞は、幹細胞、例えば、胎盤組織から得られた組織培養表面-接着多能性細胞であり、例えば、米国特許第7,045,148号;同第7,255,879号;及び同第7,311,905号並びに米国特許出願公開第2007/0275362号に記載された胎盤幹細胞であり、そのそれぞれの開示は引用によりその全体として本明細書に組み込まれている。具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD10+、CD34-、及びCD105+;CD10+、CD34-、CD105+、及びCD200+;CD10+、CD34-、CD45-、CD90+、CD105+、及びCD200+;又はCD10+、CD34-、CD45-、CD80-、CD86-、CD90+、CD105+、及びCD200+である。他の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+及びHLA-G+;CD73+、CD105+、及びCD200+;CD200+及びOCT-4+;CD73+、CD105+、及びHLA-G+;CD73+及びCD105+であり、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体-様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記集団中の1種以上の胚様体-様体の形成を促進し;又はOCT-4+であり、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体-様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、該集団中の1種以上の胚様体-様体の形成を促進し;又はこれらの任意の組み合わせである。より具体的な実施態様において、前記CD200+、HLA-G+幹細胞はCD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+である。他のより具体的な実施態様において、前記CD73+、CD105+、及びCD200+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である。他のより具体的な実施態様において、前記CD200+、OCT-4+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G+である。他のより具体的な実施態様において、前記CD73+、CD105+、及びHLA-G+幹細胞は、CD34-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。他のより具体的な実施態様において、前記CD73+及びCD105+幹細胞は、OCT-4+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。他のより具体的な実施態様において、前記OCT-4+幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。他のより具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞はその起源が母方である(すなわち、母方の遺伝子型を有する)。他のより具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞はその起源が胎児である(すなわち、胎児の遺伝子型を有する)。
AMDACは、他の種類の複数の細胞と、例えば、幹細胞の集団と、各集団中の全有核細胞の数を比較して、約100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000;又は約1:100,000,000の比で組み合わせることができる。
（5.2 造血再構成）
他の態様において、造血再構成(例えば、部分的又は完全な造血再構成)をその必要のある対象に、例えば、造血幹細胞の部分的損失又は全損失を被った対象に誘導する方法であって、該対象に、治療上有効な量の単離されたAMDACを投与することを含む方法が本明細書に提供される。このように、AMDACは、造血再構成から利益を得るだろう疾病／疾患を治療する方法に利用できる。
本明細書では、造血再構成は、造血系統の１つ以上の細胞、例えば、1つ以上の造血幹細胞の数及び/又は種類が対象において増加し、例えば、AMDACによる治療の結果として、そのような治療のない数及び/又は種類と比べて増加する現象を意味する。理論に束縛されることは望まないが、AMDACによる治療の結果としての造血系統の細胞の数及び/又は種類の増加は、そのような細胞に対するAMDACの直接又は間接的な効果から生じ得る。造血再構成の現象は、当業者に公知である方法、例えば、FACS分析並びに血液学的分析、例えば、赤血球数、ヘマトクリット値、及びヘモグロビンレベル(例えば、以下の実施例4参照)を利用して評価できる。
具体的な実施態様において、造血再構成が必要とされる、造血幹細胞の部分的損失又は全損失を被った対象は、放射線に被曝した(例えば、致死性線量又は亜致死性線量の放射線)。他の具体的な実施態様において、対象は放射線に被曝しなかった。特定の実施態様において、対象は、骨髄破壊、例えば、癌の療法(例えば、化学療法、免疫療法)又は他の療法の一部としての骨髄破壊を受けた。
具体的な実施態様において、AMDACを使用して、骨髄機能不全又は１つ以上の主造血系統の産生の遺伝性若しくは先天性の減少を有する対象の造血系を再構築できる。この実施態様に従って治療できる骨髄機能不全に関連する疾患には、再生不良性貧血、例えば、遺伝性再生不良性貧血(ファンコニー貧血及び骨髄異形成症候群など)、並びに放射線、薬物、及び/又は化学薬品(例えば、ベンゼン)への曝露による貧血などの後天性再生不良性貧血があるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、後天性貧血は放射線の被曝によるものではない。
他の具体的な実施態様において、AMDACを使用して、慢性腎疾患又は肝疾患などの慢性疾患の貧血;自己免疫性溶血性貧血;ヘモグロビン異常症及び鎌状赤血球症若しくはα-サラセミア若しくはβ-サラセミアなどのサラセミアを含むがこれらに限定されない貧血を有する対象の造血系を再構築できる。
他の具体的な実施態様において、AMDACを使用して、赤芽球ろう、例えば、自己免疫赤血球形成不全又は全白血病赤血球形成不全などの原発性疾患として存在する赤芽球ろう;又は血液悪性腫瘍、例えば、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、骨髄線維症、本態性血小板症、若しくは急性リンパ芽球性白血病などの疾患に関連する続発性疾患として存在する赤芽球ろう;固形腫瘍、例えば、胃の癌腫、乳房若しくは胆管の腺癌、肺の扁平上皮癌,甲状腺の癌腫、腎細胞癌腫、又はカポジ肉腫;慢性リンパ性貧血;薬物及び化学薬品、例えば、アロプリノール、アザチオプリニ、セファロチン、エストロゲン、フェヌプロフェン、ハロセン、イソニアジド、フェノバルビタール、スルファチアゾール、若しくはリファンピシン;又は重度腎不全を有する対象の造血系を再構築できる。
特定の実施態様において、対象の造血系統の細胞の数及び/又は種類の減少を起こす条件(例えば、放射線又は骨髄破壊)に曝露された対象の造血再構成は、AMDACによる治療の前の対象におけるそのような細胞の数及び/又は種類に比べた、及び/又は、対象が造血系統の細胞の数の低減を起こす状態に曝露されないならば対象に存在すると期待されるだろうそのような細胞の数及び/又は種類に比べた、該対象における造血系統の細胞の数及び/又は種類の増加を意味する。特定の実施態様において、造血再構成から利益を得るだろう疾病又は疾患を患っている対象における造血再構成は、AMDACによる治療の前の対象におけるそのような細胞の数及び/又は種類に比べた、及び/又は、対象が造血系統の細胞の数の低減を起こす疾病又は疾患を患っていないならば対象において存在すると期待されるだろうそのような細胞の数及び/又は種類に比べた、該対象における造血系統の細胞の数及び/又は種類の増加を意味する。
（5.3 羊膜由来接着細胞の特性）
AMDACは、本明細書に記載される放射線障害の治療及び造血再構成の方法に有用であり、羊膜から以下に記載される2工程の単離手順により得られ、細胞培養表面、例えば、組織培養プラスチックに接着し、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-(オクタマー結合タンパク質4)であり、且つ以下に列記される特性の一部又は全てを表す。
AMDACは、自身を他の羊膜由来細胞又は胎盤由来細胞から区別する細胞マーカーを示す。例えば、一実施態様において、OCT-4-AMDACは、さらに免疫局在化により決定可能なCD49f+である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、RT-PCRにより決定されるHLA-G-である。他の具体的な実施態様において、OCT-4-AMDACは、免疫局在化により決定可能なVEGFR1/Flt-1+(血管内皮細胞成長因子受容体1)及び/又はVEGFR2/KDR+(血管内皮細胞成長因子受容体2)である。具体的な実施態様において、OCT-4-AMDACは、例えば20サイクルで、OCT-4のPCR-増幅mRNAを、等価な数のRNA増幅サイクルで等価な数のNTERA-2細胞よりも、少なくとも2ログ少なく発現する。他の具体的な実施態様において、前記OCT-4-AMDACは、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的な実施態様において、前記OCT-4-AMDACは、例えば、免疫局在化により決定可能なCD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的な実施態様において、AMDACは、OCT-4-及び/又はHLA-G-であり、さらに、例えば、免疫局在化により決定可能なCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的な実施態様において、AMDACは、例えば、免疫局在化により決定可能なOCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。他の具体的な実施態様において、OCT-4-AMDACは、例えば、30サイクルでRT-PCRにより決定可能なSOX2を発現しない。したがって、具体的な実施態様において、該細胞は、免疫局在化により決定可能なOCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ例えば30サイクルでRT-PCRにより決定可能なSOX2-である。
他の実施態様において、前記OCT-4-AMDACは、免疫局在化により決定されるCD29+、CD73+、ABC-p+、及びCD38-の1つ以上である。
他の具体的な実施態様において、例えば、OCT-4-AMDACは、さらに、免疫局在化により決定されるCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(アンジオテンシン-I-変換酵素、ACE)、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1つ以上、又はRT-PCRにより決定されるHLA-G-である。より具体的な実施態様において、前記細胞は、免疫局在化により決定されるCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-であり、且つRT-PCRにより決定されるHLA-G-である。一実施態様において、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、CD31-、CD34-、CD45-、及び/又はCD133-の1つ以上である。具体的な実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-;免疫局在化により決定されるVEGFR1/Flt-1+及び/又はVEGFR2/KDR+,;並びにCD31-、CD34-、CD45-、及び/又はCD133-の1つ以上、又は全てである。
他の具体的な実施態様において、前記細胞は、さらに、免疫局在化により決定されるVE-カドヘリン-である。他の具体的な実施態様において、前記細胞は、さらに、免疫局在化により決定されるCD105+及びCD200+に陽性である。他の具体的な実施態様において、前記細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝露させた後、免疫局在化により検出されるCD34を発現しない。より具体的な実施態様において、前記細胞は、25〜75ng/mLのVEGFに4〜21日間又は50ng/mLのVEGFに4〜21日間曝露させた後、免疫局在化により検出されるCD34を発現しない。さらにより具体的な実施態様において、前記細胞は、1、2.5、5、10、25、50、75、又は100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝露させた後、免疫局在化により検出されるCD34を発現しない。なおさらに具体的な実施態様において、前記細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに7〜14日間、例えば、7日間曝露させた後、免疫局在化により検出されるCD34を発現しない。
具体的な実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定されるVE-カドヘリン-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、及び/又はCD200+の1つ以上である。具体的な実施態様において、羊膜由来細胞は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定されるVE-カドヘリン-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、及びCD200+である。他の具体的な実施態様において、前記細胞は、例えば、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝露させた後、免疫局在化により検出されるCD34を発現しない。
他の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、OCT-4-、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的な実施態様において、前記細胞は、免疫局在化により決定されるCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-の1つ以上である。より具体的な実施態様において、前記細胞は、免疫局在化により決定されるCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。他の具体的な実施態様において、前記細胞は、さらに、免疫局在化により決定されるVEGFR1/Flt-1+及び/又はVEGFR2/KDR+であり;且つ免疫局在化により決定されるCD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及び/又はTie-2-の1つ以上である。他の具体的な実施態様において、前記細胞は、さらに、免疫局在化により決定されるVEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及びTie-2-である。
他の実施態様において、OCT-4-羊膜由来接着細胞は、さらに、免疫局在化により決定されるCD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び/又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1つ以上、若しくは全てであり;又は、さらに、免疫局在化により決定されるCD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD117-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、HLA-G-、及び/又はVE-カドヘリン-の1つ以上、若しくは全てであり、又はRT-PCRにより決定されるSOX2-である。
特定の実施態様において、単離された組織培養プラスチック-接着性羊膜由来接着細胞はCD49f+である。具体的な実施態様において、前記CD49f+細胞は、さらに、免疫局在化により決定されるCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び/又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1つ以上、若しくは全てであり;又は、さらに、免疫局在化により決定されるCD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD117-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、HLA-G-、OCT-4-、及び/又はVE-カドヘリン-の1つ以上、若しくは全てであり、又はRT-PCRにより決定されるSOX2-である。
特定の他の実施態様において、単離された組織培養プラスチック-接着性羊膜由来接着細胞は、HLA-G-、CD90+、及びCD117-である。具体的な実施態様において、前記HLA-G-、CD90+、及びCD117-細胞は、さらに、免疫局在化により決定されるCD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び/又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1つ以上、若しくは全てであり;又は、さらに、免疫局在化により決定されるCD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、OCT-4-、及び/又はVE-カドヘリン-の1つ以上、若しくは全てであり、又はRT-PCRにより決定されるSOX2-である。
他の実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞又は羊膜由来血管新生細胞の集団は、標準的な培養条件下で、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定される、繊維芽細胞成長因子4(FGF4)、インターフェロンγ(IFNG)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド10(CXCL10)、アンジオポエチン4(ANGPT4)、アンジオポエチン-様3(ANGPTL3)、フィブリノーゲンα鎖(FGA)、レプチン(LEP)、プロラクチン(PRL)、プロキネチシン1(PROK1)、テノモジュリン(TNMD)、FMS-様チロシンキナーゼ3(FLT3)、細胞外リンクドメイン含有1(XLKD1)、カドヘリン5、2型(CDH5)、白血球細胞由来ケモタキシン1(LECT1)、プラスミノゲン(PLG)、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、(性決定領域Y)-ボックス2(SOX2)、NANOG、マトリクスメタロプロテアーゼ13(MMP-13)、遠位欠失ホメオボックス5(DLX5)、及び/又は骨γ-カルボキシグルタミン酸(gla)タンパク質(BGLAP)のmRNAを構成的に発現しない。他の実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞又は羊膜由来血管新生細胞の集団は、(ARNT2)、神経増殖因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン3(NT-3)、NT-5、低酸素-誘導因子1α(HIF1A)、低酸素-誘導タンパク質2(HIG2)、ヘムオキシゲナーゼ(脱環化)1(HMOX1)、細胞外スーパーオキシドディスムターゼ[Cu-Zn](SOD3)、カタラーゼ(CAT)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFB1)、トランスフォーミング増殖因子β1受容体(TGFB1R)、及び肝細胞増殖因子受容体(HGFR/c-met)のmRNAを発現する。
別の態様において、本明細書記載の羊膜由来接着細胞を含む、単離された細胞の集団が提供される。該細胞の集団は均質な集団なことがあり、例えば、少なくとも約90％、95％、98％又は99％が羊膜由来接着細胞である細胞集団であり得る。該細胞集団は不均質なことがあり、例えば、その集団の細胞の多くとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％又は80％が羊膜由来接着細胞である細胞集団である。しかし単離された細胞の集団は、組織、すなわち羊膜ではない。
一実施態様において、AMDACを含む単離された細胞の集団、例えば、AMDACについて実質的に均質である細胞の集団が本明細書に提供され、前記AMDACは組織培養プラスチックに接着し、前記AMDACは、RT-PCRにより決定されるOCT-4-である。具体的な実施態様において、AMDACは、例えば、免疫局在化又はRT-PCRにより決定されるCD49f+又はHLA-G+である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACの集団は、免疫局在化により決定されるVEGFR1/Flt-1+及び/又はVEGFR2/KDR+であり、前記単離された細胞の集団は、羊膜(amnion)又は羊膜(amniotic membrane)ではない。より具体的な実施態様において、AMDACは、RT-PCRにより決定されるOCT-4-、及び/又はHLA-G-であり、且つ免疫局在化により決定されるVEGFR1/Flt-1+及び/又はVEGFR2/KDR+である。具体的な実施態様において、前記集団中の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、又は99%の細胞が前記羊膜由来接着細胞である。他の具体的な実施態様において、前記AMDACは、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的な実施態様において、前記AMDACは、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的な実施態様において、AMDACは、OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。他の具体的な実施態様において、AMDACは、例えば、30サイクルのRT-PCRにより決定されるSOX2を発現しない。なおより具体的な実施態様において、集団はAMDACを含み、前記AMDACは、免疫局在化又はフローサイトメトリーにより決定されるOCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ、例えば、30サイクルのRT-PCRにより決定されるSOX2-である。
他の具体的な実施態様において、前記細胞集団中の前記AMDACは、免疫局在化又はフローサイトメトリーにより決定される、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的な実施態様において、AMDACは、免疫局在化又はフローサイトメトリーにより決定される、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的な実施態様において、AMDACは、例えばRT-PCRにより決定される、OCT-4-又はHLA-G-であり、且つさらに、免疫局在化又はフローサイトメトリーにより決定される、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的な実施態様において、前記細胞集団中のAMDACは、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。他の具体的な実施態様において、AMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定されるSOX2を発現しない。したがって、より具体的な実施態様において、細胞は、免疫局在化又はフローサイトメトリーにより決定される、OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定されるSOX2-である。さらにより具体的な実施態様において、AMDACは、OCT-4-又はHLA-G-であり、且つ、さらにCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的な実施態様において、AMDACは、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。
他の実施態様において、前記細胞集団中の羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ、免疫局在化により決定される、VEGFR1/Flt-1+及び/又はVEGFR2/KDR+であり、且つ、さらに、免疫局在化により決定される、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、若しくはCXCR4-の1つ以上であるか、又はRT-PCRにより決定されるHLA-G-であり、ここで前記単離された細胞集団は羊膜ではない。他の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団が本明細書において提供され、ここで前記細胞は組織培養プラスチックに接着し、ここで前記細胞は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ、免疫局在化により決定される、VEGFR1/Flt-1+及び/又はVEGFR2/KDR+であり、ここで前記細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝露された後、免疫局在化により検出されるCD34を発現せず、且つ前記単離された細胞集団は羊膜ではない。上記実施態様のいずれかの具体的な実施態様において、前記集団中の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％の細胞は、前記羊膜由来接着細胞である。
他の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む上記細胞集団のいずれも、例えばI型及びIV型コラーゲンなどの細胞外マトリクスタンパク質、又は、例えば血管内皮増殖因子(VEGF)、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、若しくは塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などの血管新生因子の存在下で、例えば胎盤コラーゲン、又は例えばMATRIGEL(商標)などの基材中又は上において、少なくとも4日間及び最大14日間培養した場合、新芽又は管様構造を形成する。
羊膜由来接着細胞及び羊膜由来接着細胞の集団は、血管新生-関連遺伝子又は心筋発生-関連遺伝子に関連するタンパク質の特徴的な発現を示す。特定の実施態様において、下記のものを発現する細胞、又は細胞集団が本明細書に提供され、ここで前記単離された細胞集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％又は98％は、下記のものの1つ以上又は全てのRNAを発現する羊膜由来接着細胞である：ACTA2(アクチン、α2、平滑筋、大動脈)、ADAMTS1(トロンボスポンジン1型モチーフを持つADAM型メタロペプチダーゼ、1)、AMOT(アンジオモチン)、ANG(アンジオゲニン)、ANGPT1(アンジオポエチン1)、ANGPT2、ANGPTL1(アンジオポエチン-様1)、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1(脳-特異的血管新生阻害剤1)、CD44、CD200、CEACAM1(癌胎児性抗原-関連細胞接着分子1)、CHGA(クロモグラニンA)、COL15A1(コラーゲン、XV型、α1)、COL18A1(コラーゲン、XVIII型、α1)、COL4A1(コラーゲン、IV型、α1)、COL4A2(コラーゲン、IV型、α2)、COL4A3(コラーゲン、IV型、α3)、CSF3(コロニー刺激因子3(顆粒球)、CTGF(結合組織成長因子)、CXCL12(ケモカイン(CXCモチーフ)リガンド12(間質細胞-由来因子1))、CXCL2、DNMT3B(DNA(シトシン-5-)-メチルトランスフェラーゼ3β)、ECGF1(チミジンホスホリラーゼ)、EDG1(内皮細胞分化遺伝子1)、EDIL3(EGF-様反復配列及びジスコイジンI-様ドメイン3)、ENPP2(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ2)、EPHB2(EPH受容体B2)、FBLN5(FIBULIN5)、F2(凝固因子II(トロンビン))、FGF1(酸性繊維芽細胞成長因子)、FGF2(塩基性繊維芽細胞成長因子)、FIGF(c-fosに誘導される成長因子(血管内皮細胞成長因子D))、FLT4(fms-関連チロシンキナーゼ4)、FN1(フィブロネクチン1)、FST(フォリスタチン)、FOXC2(フォークヘッドボックスC2(MFH-1、間葉系フォークヘッド1))、GRN(グラニュリン)、HGF(肝細胞成長因子)、HEY1(YRPWモチーフ1が関連したヘアリー/エンハンサー-オブ-スプリット)、HSPG2(ヘパラン硫酸プロテオグリカン2)、IFNB1(インターフェロン、β1、神経芽細胞)、IL8(インターロイキン8)、IL12A、ITGA4(インテグリン、α4;CD49d)、ITGAV(インテグリン、αV)、ITGB3(インテグリン、β3)、MDK(ミドカイン)、MMP2(マトリクスメタロプロテアーゼ2)、MYOZ2(ミオゼニン2)、NRP1(ニューロピリン1)、NRP2、PDGFB(血小板由来成長因子β)、PDGFRA(血小板由来成長因子受容体α)、PDGFRB、PECAM1(血小板/内皮細胞接着分子)、PF4(血小板因子4)、PGK1(ホスホグリセリン酸キナーゼ1)、PROX1(プロスペロホームボックス1)、PTN(プレイオトロフィン)、SEMA3F(セモフォリン3F)、SERPINB5(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレイドB(オボアルブミン)、メンバー5)、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2(組織メタロプロテアーゼ阻害物質2)、TIMP3、TGFA(トランスフォーミング成長因子、α)、TGFB1、THBS1(トロンボスポンジン1)、THBS2、TIE1(免疫グロブリン-様及びEGF-様ドメインを持つチロシンキナーゼ1)、TIE2/TEK、TNF(腫瘍壊死因子)、TNNI1(トロポニンI、1型)、TNFSF15(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー15)、VASH1(バソヒビン1)、VEGF(血管内皮細胞成長因子)、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1(血管内皮細胞成長因子受容体1)、及び/又はVEGFR2/KDR。
ヒト細胞が使用される場合、全体を通した遺伝子の名称はヒト配列をいい、当業者に周知であるように、代表的配列は文献又はGenBankに見出すことができる。これらの配列に対するプローブは、公共で入手可能な配列、又は、例えば特異的TAQMAN(登録商標)プローブ若しくはTAQMAN(登録商標)Angiogenesis Array(Applied Biosystems社、パーツ番号4378710)など、商業的供給業者を通じて入手可能な配列により決定することができる。
羊膜由来接着細胞及び羊膜由来接着細胞の集団は、血管新生-関連タンパク質の特徴的な発現を示す。特定の実施態様において、CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM17前駆体(Aジスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン17)(TNF-α変換酵素)(TNF-αコンベルターゼ)、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA(α-フィラミン)(フィラミン1)(内皮アクチン-結合タンパク質)(ABP-280)(非筋型フィラミン)、α-アクチニン1(α-アクチニン細胞骨格アイソフォーム)(非筋型α-アクチニン1)(F-アクチン架橋型タンパク質)、低密度リポタンパク受容体-関連タンパク質2前駆体(メガリン)(糖タンパク質330)(gp330)、マクロファージ捕捉受容体I型及びII型(マクロファージアセチル化LDL受容体I型及びII型)、IIB型アクチビン受容体前駆体(ACTR-IIB)、Wnt-9タンパク質、グリア細胞線維性酸性タンパク質、星状膠細胞(GFAP)、ミオシン-結合タンパク質C、心筋型(心筋MyBP-C)(C-タンパク質、心筋アイソフォーム)、及び/又はミオシン重鎖、非筋A型(細胞性ミオシン重鎖、A型)(非筋型ミオシン重鎖-A)(NMMHC-A)を発現する細胞、又は細胞集団が本明細書に提供され、ここで前記単離された細胞集団の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％若しくは98％の細胞は、これらを発現する羊膜由来接着細胞である。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、例えば、内皮細胞、内皮始原細胞などにおいて、血管新生を促進するタンパク質をさらに分泌する。特定の実施態様において、羊膜由来接着細胞、羊膜由来接着細胞の集団、又は前記単離された集団中の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％又は98％の細胞が羊膜由来接着細胞である、羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、ガレクチン-1の1つ以上又は全てを、例えば、1個又は複数の細胞が成長している培養培地へ分泌する。
他の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む上記細胞集団のいずれも、前記羊膜由来接着細胞に接触している内皮細胞の集団中に、新芽又は管様構造の形成を起こすことができる。具体的な実施態様において、羊膜誘導血管新生細胞はヒトの内皮細胞と共培養され、例えば、コラーゲンI型及びIV型などの細胞外マトリクスタンパク質、及び/又は血管内皮細胞成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、若しくは塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF) などの血管新生因子の存在下で、例えば、胎盤コラーゲン又はMATRIGEL（商標）などの基材の中又はその上で、少なくとも4日間及び/又は最長14日間培養される場合、新芽若しくは管様構造を形成し、又は内皮細胞の新芽を支持する。
他の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む上記細胞集団のいずれも、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、又はインターロイキン-8(IL-8)などの血管新生因子を分泌し、それにより、コラーゲンI型及びIV型などの細胞外マトリクスタンパク質の存在下で、例えば、胎盤コラーゲン又はMATRIGEL（商標）などの基材の中又はその上で培養される場合、ヒトの内皮細胞を、新芽又は管様構造を形成するように誘導することができる。
他の実施態様において、細胞集団、例えば羊膜由来接着細胞の集団、又は前記単離された細胞集団中の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％若しくは98％の細胞が、血管新生マイクロRNA類(miRNA類)を骨髄由来間葉系幹細胞よりも高いレベルで発現する羊膜由来接着細胞である細胞集団が本明細書に提供され、ここで前記miRNA類は、miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及び/又はmiR-296の1つ以上又は全てを含む。別の実施態様において、細胞集団、例えば羊膜由来接着細胞の集団、又は前記単離された細胞集団中の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％若しくは98％の細胞が、血管新生マイクロRNA類(miRNA類)の1つ以上又は全てを骨髄由来間葉系幹細胞よりも低いレベルで発現する羊膜由来接着細胞である細胞集団が本明細書に提供され、ここで前記miRNA類は、miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及び/又はmiR-16の1つ以上又は全てを含む。特定の実施態様において、AMDAC、又はAMDACの集団は、血管新生miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、(血管新生miRNAクラスター17-92のメンバー)、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及び/又はmiR-16の1つ以上又は全てを発現する。
このように、一実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞が本明細書において提供され、ここで該細胞は、組織培養プラスチックに接着性であり、前記細胞は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定される、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ、前記細胞は：(a)免疫局在化により決定される、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、又はVEGFR2/KDR(CD309)の1つ以上を発現し；(b)免疫局在化により決定される、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、若しくはVE-カドヘリンの発現を欠き、又はRT-PCRにより決定されるSOX2の発現を欠き:(c)ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、若しくはVEGFR2/KDRのmRNAを発現し;(d)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-マイクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM17、アンジオテンシノゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、アクチビン受容体IIB型前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、星状細胞、ミオシン結合タンパク質C、若しくはミオシン重鎖、非筋A型の1つ以上を発現し;(e)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、若しくはガレクチン-1を、細胞が増殖する培地中に分泌し;(f)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、若しくはmiR-296を、等価な数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも高いレベルで発現し;(g)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、若しくはmiR-16を、等価な数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも低いレベルで発現し;(h)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、若しくはmiR-16を発現し;且つ/又は(i)21%O2下でのCD202b、IL-8、若しくはVEGFの発現に比べて、約5%未満のO2中で培養される場合増加したレベルのCD202b、IL-8、若しくはVEGFを発現する。具体的な実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定されるCD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ(a)免疫局在化により決定されるCD9、CD10、CD44、CD54、CD90、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、及び/若しくはVEGFR2/KDR(CD309)を発現し;(b)免疫局在化により決定されるCD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、及び/若しくはVE-カドヘリンの発現を欠き、又はRT-PCRにより決定されるSOX2の発現を欠き;(c)ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、及び/若しくはVEGFR2/KDRのmRNAを発現し;(d)CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-マイクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM17、アンジオテンシノゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、アクチビン受容体IIB型前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、星状細胞、ミオシン結合タンパク質C、及び/若しくはミオシン重鎖、非筋型Aの1つ以上を発現し;(e)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、及び/若しくはガレクチン-1を、例えば、該細胞が増殖する培地中に分泌し;(f)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及び/若しくはmiR-296を、等価な数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも高いレベルで発現し;(g)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及び/若しくはmiR-16を、等価な数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも低いレベルで発現し;(h)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及び/若しくはmiR-16を発現し;且つ/又は(i)21%O2下でのCD202b、IL-8、若しくはVEGFの発現に比べて、約5%未満のO2中で培養される場合増加したレベルのCD202b、IL-8及び/若しくはVEGFを発現する。上述の特性の1つ以上を有するAMDACを含む細胞集団、例えば、AMDACの集団がさらに本明細書に提供される。
他の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む上記細胞集団は血管新生因子を分泌する。具体的な実施態様において、細胞集団は、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、及び/又はインターロイキン-8(IL-8)を分泌する。他の具体的な実施態様において、羊膜誘導血管新生細胞を含む細胞集団は、1種以上の血管新生因子を分泌し、それにより、インビトロ創傷治癒アッセイにおいてヒトの内皮細胞が移動するように誘導する。他の具体的な実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、ヒト内皮細胞、内皮始原細胞、筋細胞、又は筋芽細胞の成熟、分化、又は増殖を誘導する。
他の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む上記細胞の集団のいずれも、例えば胎盤コラーゲン若しくはMATRIGEL(商標)などの基材上で、細胞外マトリクスタンパク質、例えばI型若しくはIV型コラーゲン及び/又は、1つ以上の血管新生因子、例えばVEGF、EGF、PDGF、若しくはbFGFの存在下で培養した場合、アセチル化された低密度リポタンパク(LDL)を取り込む。
他の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む細胞集団が本明細書に提供されるが、前記細胞は、組織培養プラスチックに接着し、且つ前記細胞は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定される、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である。具体的な実施態様において、前記細胞集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定される、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である羊膜由来細胞である。他の具体的な実施態様において、前記集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定される、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である羊膜由来細胞である。他の具体的な実施態様において、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定される、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である前記細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化により検出されるCD34を発現しない。他の具体的な実施態様において、前記細胞はVE-カドヘリン-でもある。
羊膜由来接着細胞を含む、本明細書に提供される細胞集団は、新芽又は導管若しくは脈管に似た管様構造を形成することができる。一実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、血管新生部分、例えば、VEGF、EGF、PDGF、又はbFGFの存在下で培養される場合、新芽又は管様構造を形成する。より具体的な実施態様において、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定されるVEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である前記羊膜由来細胞は、前記細胞集団が血管内皮細胞成長因子(VEGF)の存在下で培養される場合、新芽又は管様構造を形成する。
本明細書に記載される羊膜由来接着細胞は、初代培養下、又は幹細胞の培養に適した培地での増殖時に、上記特徴、例えば細胞表面マーカー及び/若しくは遺伝子発現プロファイルの組合せ、並びに／又は血管新生能及び機能を示す。そのような培地は、例えば、1〜100％DMEM-LG(Gibco社)、1〜100％MCDB-201(Sigma社)、1〜10％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、0.1〜5×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS、Sigma社)、0.1〜5×リノレン酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA、Sigma社)、10-5〜10-15Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-2〜10-10Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、1〜50ng/mL上皮細胞増殖因子(EGF)(R&D Systems社)、1〜50ng/mL血小板由来増殖因子(PDGF-BB)(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含有する培地を含む。具体的な実施態様において、該培地は、60％DMEM-LG(Gibco社)、40％MCDB-201(Sigma社)、2％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、1×リノレン酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、上皮細胞増殖因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来増殖因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含有する。他の好適な培地は、以下に説明する。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞の単離された集団は、例えば容器内に、約、少なくとも約、又はわずか約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれよりも多い羊膜由来接着細胞を含むことができる。様々な実施態様において、本明細書に提供される単離された細胞集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は99％は、羊膜由来接着細胞である。すなわち、単離された羊膜由来接着細胞の集団は、例えば、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％もの非幹細胞を含むことができる。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、基材上で培養することができる。様々な実施態様において、該基材は、羊膜由来接着細胞の培養及び/又は選択を達成することができる任意の表面でよい。典型的には、該基材は、プラスチック、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、例えば、CELLSTART(商標)、MESENCULT(商標)ACF-基材、オルニチン、若しくはポリリジンなどの、生体分子若しくは合成模倣物質、又は例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどの、細胞外マトリクスタンパク質により処理、コーティング、又はインプリンティングすることができる。
羊膜由来細胞、例えば、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞、及びそのような細胞の集団は、1つ以上の胎盤から単離することができる。例えば、本明細書に提供される羊膜由来細胞の単離された集団は、破壊された羊膜組織、例えば組織消化残渣（すなわち、羊膜の酵素消化により得られる細胞の集まり）から得られた、又はそれに含まれるそのような細胞を含む胎盤細胞の集団であり得るが、前記細胞の集団は羊膜由来細胞に富み、該組織は、単一の胎盤から、又は2つ以上の胎盤に由来するものである。単離された羊膜由来細胞を培養及び拡大して、そのような細胞の集団を作製することができる。羊膜由来接着細胞を含む胎盤細胞の集団も培養及び拡大して、羊膜由来接着細胞の集団を作製することができる。
特定の実施態様において、上記マーカー及び/又は遺伝子発現特徴のいずれかを示すAMDACは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20回、又はそれよりも多く継代したものである。特定の他の実施態様において、上記マーカー及び/又は遺伝子発現特徴のいずれかを示すAMDACは、培養において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49回又は少なくとも50回、又はそれよりも多く倍加される。
（5.4 羊膜-由来血管新生細胞を得る方法）
羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、他の細胞又は細胞集団から、例えば、羊膜組織の特定の消化方法により単離し、任意に、それに続けて得られた細胞又は細胞集団を、羊膜由来接着細胞に特徴的なマーカー、又はマーカー組合せの存在又は非存在下で評価するか、或いは羊膜細胞を入手し、羊膜由来接着細胞に特徴的なマーカーを基に選択することにより、作製することができる。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、例えば、羊膜組織の消化、それに続く接着細胞の選択により作製することができる。一実施態様において、例えば、単離された羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、(1)羊膜組織を、第一の酵素で消化し、細胞を、羊膜の間葉系層の細胞からの羊膜上皮層から解離する工程；(2)引き続き、羊膜の間葉系層を、第二の酵素で消化し、単-細胞懸濁液を形成する工程；(3)該単-細胞懸濁液中の細胞を、組織培養表面、例えば組織培養プラスチック上で培養する工程；並びに、(4)培地の交換後、該表面に接着する細胞を選択し、これにより羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団を作製する工程：により作製することができる。具体的な実施態様において、該第一の酵素はトリプシンである。より具体的な実施態様において、前記トリプシンは、消化されるべき羊膜組織1gにつき溶液5〜20ml、例えば10ml中濃度0.25％トリプシン(w/v)で使用される。別のより具体的な実施態様において、前記トリプシンによる消化は、37℃で約15分間進行され、且つ最大3回繰り返される。別の具体的な実施態様において、前記第二の酵素はコラゲナーゼである。より具体的な実施態様において、前記コラゲナーゼは、消化されるべき羊膜組織1gにつき溶液5ml中濃度50〜500U/Lで使用される。別のより具体的な実施態様において、前記コラゲナーゼによる消化は、37℃で約45〜60分間進行される。別の具体的な実施態様において、コラゲナーゼによる消化後形成された単-細胞懸濁液は、工程(2)と工程(3)の間で、例えば、75μM〜150μMフィルターを通して濾過される。別の具体的な実施態様において、前記第一の酵素はトリプシンであり、且つ前記第二の酵素はコラゲナーゼである。
羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、別の実施態様において、羊膜由来接着細胞の1つ以上の特徴を示す、羊膜からの細胞、例えば、本明細書別所記載のとおり羊膜組織の消化により得られた細胞を選択することにより得ることができる。一実施態様において、例えば、細胞集団は、(a)RT-PCRにより決定されるOCT-4について陰性、及び(b)免疫局在化により決定される、VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200の1以上について陽性である羊膜細胞を選択する工程；並びに、前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程を含む方法により、作製される。具体的な実施態様において、前記羊膜細胞は、さらにVE-カドヘリン-である。具体的な実施態様において、細胞集団は、(a)RT-PCRにより決定されるOCT-4について陰性、及び、免疫局在化により決定されるVE-カドヘリンについて陰性であり、並びに(b)免疫局在化により決定される、VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200の各々について陽性である胎盤細胞を選択する工程；並びに、前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程により、作製される。特定の実施態様において、免疫局在化による選択は、RT-PCRによる選択の前に実行される。他の具体的な実施態様において、前記選択は、1〜100ng/mL VEGFの存在下で、4〜21日間の培養後に、細胞マーカーCD34を発現していない細胞を選択する工程を含む。
他の実施態様において、例えば、細胞集団は、組織培養プラスチックに接着し、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定されるVEGFR1/Flt-1+及びVEGFR2/KDR+である羊膜細胞を選択する工程、並びに前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程を含む方法により、作製される。具体的な実施態様において、細胞集団は、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定される、VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、及びHLA-G-である羊膜細胞を選択する工程を含む方法により、作製される。別の具体的な実施態様において、前記細胞集団は、さらに、免疫局在化により決定される、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及び/又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1つ以上、又は全てである羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をこれらの特徴の1つ以上を示さない細胞から単離する工程により、作製される。他の具体的な実施態様において、前記細胞集団は、さらに、免疫局在化により決定される、VE-カドヘリン-である羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をVE-カドヘリン+である細胞から単離する工程により、作製される。他の具体的な実施態様において、前記細胞集団は、さらに、免疫局在化により決定される、CD105+及びCD200+である羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をCD105-又はCD200-である細胞から単離する工程により、作製される。他の具体的な実施態様において、前記細胞は、1〜100ng/mL VEGFに、4〜21日間曝した後に、免疫局在化により検出されるCD34を発現しない。
細胞の選択において、羊膜由来接着細胞に特異的な特徴について、細胞の集団全体を試験する必要はない。代わりに、細胞集団の1つ以上の細胞アリコート(例えば約0.5％〜2％)を、そのような特徴について試験すればよく、それらの結果を、その集団の残りの細胞に帰することができる。
選択された細胞は、細胞試料(例えば約104〜約105個細胞)を、基材、例えばMATRIGEL(商標)上で、4〜14日間、例えば7日間、VEGF(例えば約50ng/mL)の存在下で培養し、且つ新芽及び/又は細胞ネットワークの外観について細胞を目視により検証することにより、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞であることを確認することができる。
羊膜由来接着細胞を、細胞選択の技術分野で公知の任意の方法を利用して、上記マーカーにより選択することができる。例えば、該接着細胞を、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリー又はFACSにおいて、1つ以上の細胞表面マーカーに対する1つ又は複数の抗体を用いて選択することができる。抗体を磁気ビーズと組み合わせて、選択を達成することができる。特定のマーカーに特異的である抗体は当該技術分野で公知であり、且つ、例えばCD9に対する抗体(Abcam社)；CD54に対する抗体(Abcam社)；CD105に対する抗体(Abcam社；BioDesign International社、サコ、MEなど)；CD200に対する抗体(Abcam社)、サイトケラチンに対する抗体(SigmaAldrich社)などが市販されている。他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えば、CD34、CD38、及びCD45に対する抗体が、例えば、StemCell Technologies社又はBioDesign International社から入手可能である。RT-PCRに適したOCT-4配列に対するプライマーは、例えば、Millipore社若しくはInvitrogen社から、商業的に入手するか、又はGenBank寄託番号DQ486513のヒト配列から容易に誘導することができる。
羊膜由来接着細胞を得るために、胎盤及び羊膜組織を入手し、そのような組織を処理する詳細な方法は、以下に提示される。
（5.4.1 細胞回収組成物)
一般に、細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば細胞回収組成物を使用し、哺乳動物胎盤、例えばヒト胎盤由来の羊膜から得ることができる。好ましくは、該細胞回収組成物は、アポトーシスを防止又は抑制し、細胞死、溶解、分解などを防止又は抑制する。細胞回収組成物は、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、関連の米国特許出願公開第2007/0190042号、表題「胎盤幹細胞回収及び組織保存のための改善された培地(Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs)」に説明されている。
細胞回収組成物は、緩衝成分、例えば4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)を添加又は無添加の、例えば、食塩水(例えばリン酸-緩衝食塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEMなど)などの、羊膜由来接着細胞の回収及び/又は培養に適した任意の生理的に許容し得る溶液を含有することができる。
細胞回収組成物は、回収の時点から培養の時点まで、細胞、例えば羊膜由来接着細胞を保存する、すなわち、該細胞の死を防止するか、又は該細胞の死を遅延させるか、死滅する細胞集団内の細胞の数を減少させるなどの傾向がある1種以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤若しくはJNK阻害剤)；血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン若しくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など)；壊死阻害剤(例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、若しくはクロナゼパム)；TNF-α阻害剤；及び/又は、酸素運搬ペルフルオロカーボン(例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど)であることができる。
細胞回収組成物は、1種以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むことができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼなど)；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE(商標)、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。組織消化酵素を含有する細胞回収組成物の使用は、以下により詳細に考察する。
細胞回収組成物は、殺菌有効量又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。特定の非限定的な実施態様において、抗生物質は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシム、若しくはセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)、又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、若しくはノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施態様において、抗生物質は、グラム陽性細菌及び/又はグラム陰性細菌、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)などに対して活性がある。
細胞回収組成物は、以下の化合物のうちの1以上を含むこともできる：アデノシン(約1mM〜約50mM)；D-グルコース(約20mM〜約100mM)；マグネシウムイオン(約1mM〜約50mM)；一実施態様において、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量で存在する、分子量20,000ダルトン超の高分子(例えば、合成若しくは天然のコロイド、約25g/l〜約100g/l、若しくは約40g/l〜約60g/lで存在するデキストラン若しくはポリエチレングリコールなどの多糖)；酸化防止剤(例えば、約25μM〜約100μMで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、若しくはビタミンE)；還元剤(例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン)；細胞内へのカルシウムの侵入を防止する薬剤(例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル)；ニトログリセリン(例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L)；一実施態様において、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤(例えば、約1000ユニット/l〜約100,000ユニット/lの濃度で存在するヘパリン若しくはヒルジン)；又はアミロライド含有化合物(例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、若しくはイソブチルアミロライド)。
本明細書記載の羊膜由来接着細胞はまた、例えば、以下に記載のように消化時及び消化後に、単純な生理的に許容し得る緩衝液、例えばリン酸-緩衝食塩水、0.9％NaCl溶液、細胞培養培地などに、回収することもできる。
(5.4.2 胎盤の回収及び取り扱い)
一般に、ヒトの胎盤を、出産後その娩出後すぐに、又は例えば帝王切開後に、回収する。好ましい実施態様において、インフォームドコンセント後、及び患者の全病歴を取得して、該胎盤と関連付けた後、胎盤を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。そのような病歴を用いて、胎盤又はそれから採取される細胞の後続的使用を調整することができる。例えば、ヒト胎盤細胞、例えば羊膜由来接着細胞は、その病歴を考慮して、該胎盤と関連する幼児のための、若しくは近親者のための、又はその幼児の親、兄弟姉妹、若しくは他の血縁者のための個人医療に用いることができる。
羊膜由来接着細胞の回収前に、臍帯血及び胎盤血を除去する。特定の実施態様において、分娩後、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセスに供することができる。典型的には、針又はカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる(例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号；Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照されたい)。針又はカニューレを、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤からの臍帯血の排出を助けることができる。そのような臍帯血の回収は、商業的に、例えば、LifeBank USA社(シダーノールズ、NJ)、ViaCord、Cord Blood Registry and Cryocellにより行なわれてもよい。好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるために、胎盤を、それ以上操作することなく、重力排出させる。
典型的には、例えば、灌流又は組織解離による臍帯血の回収及び細胞の回収のために、胎盤を、分娩室又は出産室から別の場所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、近位臍帯をクランプしたまま、滅菌されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ、その後、このプラスチックバッグを断熱容器内に入れることによって、胎盤を(胎盤の温度を20〜28℃に維持する)滅菌された断熱輸送装置に入れて輸送することが好ましい。別の実施態様において、米国特許第7,147,626号に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットに入れて輸送する。好ましくは、胎盤を、分娩から4〜24時間後に、実験室に移送する。特定の実施態様において、臍帯血の回収前に、胎盤への挿入部から好ましくは4〜5cm(センチメートル)以内のところで、近位臍帯をクランプする。他の実施態様において、臍帯血の回収後、しかし、それ以上の胎盤の処理前に、近位臍帯をクランプする。
胎盤は、細胞回収前に、滅菌条件下、且つ4〜25℃(摂氏)の温度、例えば室温で保存することができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤は、例えば0〜24時間の期間、最長48時間、又は48時間よりも長い時間、保存してもよい。一実施態様において、胎盤は、盤出後約0時間〜約2時間に回収される。胎盤は、例えば4〜25℃(摂氏)の温度で、抗凝血剤溶液に入れて保存することができる。好適な抗凝血剤溶液は当該技術分野で周知である。例えば、クエン酸ナトリウム、ヘパリン又はワルファリンナトリウムの溶液を用いることができる。好ましい実施態様において、抗凝血剤溶液は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中で1％w/w)を含む。放血された胎盤は、細胞を回収する前に、36時間を超えない時間、保存することが好ましい。
（5.4.3 羊膜組織の物理的破壊及び酵素消化)
一実施態様において、羊膜を、例えば指を使用するなどし、例えば鈍的切開により、胎盤の残りから分離する。羊膜を、例えば部分又は組織切片に解体し、その後酵素的に消化し、且つ接着細胞を回収する。羊膜由来接着細胞は、全羊膜から、又は羊膜の小切片から、例えば面積約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000平方ミリメートルである羊膜の切片から、得ることができる。
羊膜由来接着細胞は、一般に、盤出後最初の約3日間以内の任意の時点で、胎盤の羊膜又はそれらの一部から回収することができるが、好ましくは盤出後約0時間〜48時間、又は盤出後約8時間〜約18時間である。
一実施態様において、羊膜由来接着細胞は、1種以上の組織消化酵素を使用して酵素消化により羊膜組織から抽出される。羊膜又はその一部は、例えば、上述の細胞回収組成物に溶解又は混合されている1種以上の酵素により消化できる。
特定の実施態様において、細胞回収組成物は、1種以上の組織-破壊酵素（複数可）を含む。酵素消化は、好ましくは、酵素の組み合わせ、例えば、連続する順序で使用される、例えば、マトリクスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼの組み合わせ、例えば、ディスパーゼとコラゲナーゼの組み合わせを使用する。2種以上のプロテアーゼが使用される場合、複数のプロテアーゼを同時に使用して羊膜組織を消化できるが、連続的に使用してもよい。一実施態様において、例えば、羊膜組織は、トリプシンで3回、次いでコラゲナーゼで1回消化される。
一実施態様において、羊膜組織は、マトリクスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び粘液溶解酵素（mucolytic enzyme）の1つ以上により酵素消化される。具体的な実施態様において、羊膜組織は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの組み合わせにより消化される。他の具体的な実施態様において、羊膜組織は、LIBERASE（商標）(Boehringer Mannheim社、Indianapolis、Ind.)及びヒアルロニダーゼの組み合わせにより消化される。羊膜組織の破壊に使用できる他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、又はエラスターゼがある。セリンプロテアーゼは、血清中のα2ミクログロブリンにより阻害され得るので、消化に使用される媒体は、特定の実施態様において、血清不含であり得る。特定の他の実施態様において、EDTA及びDNaseを羊膜組織の消化に使用して、例えば、細胞回収の効率を高める。特定の他の実施態様において、消化残渣は、細胞が粘性の消化物内に閉じ込められるのを防ぐために希釈される。
組織消化酵素の典型的な濃度には、例えば、50〜200U/mLのコラゲナーゼI及びコラゲナーゼIV、1〜10U/mLのディスパーゼ、及び10〜100U/mLのエラスターゼがある。羊膜由来接着細胞を単離するために、プロテアーゼを組み合わせて、すなわち、同じ消化反応に2種以上のプロテアーゼが使用でき、又は連続的に使用できる。例えば、一実施態様において、羊膜組織又はその一部は、まず適切な量の約0.25%の濃度のトリプシンにより例えば、15分間37℃で、それに続いて約1〜約2mg/mlのコラゲナーゼIにより例えば、45分間消化される。
一実施態様において、羊膜由来接着細胞は、下記のように得ることができる。羊膜は、サイズがおよそ0.1インチ×0.1インチ（0.25cm×0.25cm）〜約5インチ×5インチ（12.7cm×12.7cm）、例えば2インチ×2インチ（5.08cm×5.08cm）の切片に切断される。上皮単層は、下記の三重トリプシン処理により、羊膜の胎児側から取り除かれる。羊膜の膜の切片を、温めた(例えば約20℃〜約37℃)トリプシン-EDTA溶液(0.25％)の入った容器に配置する。トリプシンの容量は、約5mL/g羊膜〜約50mL/g羊膜の範囲であることができる。容器は、温度を一定に保ちながら、約5分間〜約30分間、例えば15分間攪拌する。その後、羊膜切片を手作業で除去するか、又は濾過によるなど、任意の適切な方法によりトリプシン溶液から、羊膜の切片を分離する。トリプシン処理工程は、少なくとももう1回繰り返すことができる。
最終トリプシン処理の完了時に、羊膜の切片を、リン酸塩-緩衝食塩水(PBS)/10％FBS、PBS/5％FBS、又はPBS/3％FBSなどの温めたトリプシン中和溶液に満たされた容器に戻す。該容器を、約5秒〜約30分間、例えば、5分間攪拌する。次いで、羊膜の切片を上述の通りトリプシン中和溶液から分離し、羊膜の切片を、温めたPBS(pH7.2)で満たされた容器に配置する。該容器を、約5秒〜約30分間攪拌し、次いで羊膜の切片を、上述のとおりPBSから分離する。
次いで、羊膜の切片を、温めた(例えば約20℃〜約37℃)消化溶液を満たした容器に配置する。消化溶液の容量は、約5mL/g羊膜〜約50mL/g羊膜の範囲であることができる。消化溶液は、DMEMなどの好適な培養培地中に、消化酵素を含む。典型的な消化溶液は、I型コラゲナーゼ(約50U/mL〜約500U/mL);コラゲナーゼI型(約50U/mL〜約500U/mL)+ディスパーゼ(約5U/mL〜約100U/mL);及びコラゲナーゼI型(約50U/mL〜約500U/mL)、ディスパーゼ(約2U/mL〜約50U/mL)及びヒアルロニダーゼ(約3U/mL〜約10U/mL)を含む。羊膜消化が実質的に完了するまで(およそ10分間〜約90分間)、容器を37℃で攪拌する。その後、温かいPBS/5％FBSを、約1mL/g羊膜組織〜約50mL/g羊膜組織の比で容器に加える。該容器を約2分間〜約5分間攪拌する。次に細胞懸濁液を、40μm〜100μmフィルターを用いて濾過し、あらゆる未消化の組織を除去する。細胞を、温PBS(約1mL〜約500mL)中に懸濁させ、次に200×g〜約400×gで約5分間〜約30分間、例えば300×gで約15分間、20℃で遠心分離する。遠心分離後、上清を除去し、細胞を、好適な培養培地中に再懸濁させる。この細胞懸濁液を濾過し(40μm〜70μmフィルター)、あらゆる残存している未消化の組織を除去し、単一細胞懸濁液が生じる。
この実施態様において、懸濁液中の細胞を、本明細書の別の場所に記載されるように収集及び培養し、単離された羊膜由来接着細胞、及びそのような細胞の集団を作製する。残存する未消化の羊膜は、この実施態様において、廃棄できる。羊膜組織から放出された細胞は、例えば、遠心分離により、例えば、回収でき、標準的な細胞培地中で培養できる。
本明細書の消化プロトコルのいずれにおいても、消化により得られた細胞懸濁液は、例えば、約50μm〜約150μm、例えば約75μm〜約125μmの有孔フィルターに通して濾過することができる。より具体的な実施態様において、細胞懸濁液は、2個以上のフィルター、例えば125μmフィルターと75μmフィルターに通して濾過することができる。
本明細書に記載される方法のいずれと組合せても、AMDACは、上記5.3節に記載のように、AMDACの1つ以上の特徴を発現する細胞を選択することにより、消化時に放出された細胞から単離することができる。
AMDACは、例えば、トリプシンによる消化に続いてコラゲナーゼによる消化を含む具体的な2工程単離方法を利用して単離できる。このように、他の態様において、羊膜又はその一部を、上皮細胞が前記羊膜から放出されるように、トリプシンにより消化すること;羊膜又はその一部を、前記上皮細胞から除去すること;羊膜又はその一部を、羊膜由来接着細胞が前記羊膜又はその一部から放出されるように、コラゲナーゼによりさらに消化すること;及び前記羊膜由来接着細胞を前記羊膜から分離することを含む、羊膜由来接着細胞を単離する方法が本明細書に提供される。具体的な実施態様において、羊膜又はその一部の消化は、少なくとも1回繰り返される。他の具体的な実施態様において、コラゲナーゼによる羊膜又はその一部の消化は、少なくとも1回繰り返される。他の具体的な実施態様において、トリプシンは約0.1%〜1.0%(最終濃度)である。より具体的な実施態様において、トリプシンは約0.25%(最終濃度)である。他の具体的な実施態様において、コラゲナーゼは約50U/mL〜約1000U/mL(最終濃度)である。より具体的な実施態様において、コラゲナーゼは約125U/mL(最終濃度)である。他の具体的な実施態様において、該単離方法は、細胞培養物中で前記羊膜由来接着細胞を培養すること及び前記羊膜由来接着細胞を、前記培養物中の非接着細胞から分離して、羊膜由来接着細胞の富化集団を生み出すことをさらに含む。より具体的な実施態様において、前記羊膜由来接着細胞の富化集団中の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の細胞は前記羊膜由来接着細胞である。
上記方法のより具体的な実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定されるOCT-4に陰性であり、且つフローサイトメトリーにより決定されるHLA-G+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。
（5.4.4 羊膜由来接着細胞の単離、選別、及び特徴付け)
細胞ペレットを、上記の新鮮な細胞回収組成物、又は細胞維持に適した培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)；イスコフの改変ダルベッコ培地(IMDM)、例えば2U/mLヘパリン及び2mMEDTAを含有するIMDM無血清培地(GibcoBRL社、NY)；緩衝液(例えばPBS、HBSS)のFBS(例えば2％v/v)との混合液；などの中に再懸濁させる。
フィブロネクチンなどの、追加の細胞外マトリクスコーティングを含む又は含まない、例えば組織培養プラスチックなどの、表面上で培養された羊膜由来接着細胞を、継代するか、又は差分接着(differential adherence)により単離することができる。例えば、上記5.4.3節に記載のように実施された羊膜組織のコラゲナーゼ消化から得られた細胞懸濁液を、例えば3〜7日間、組織培養プラスチック上の培養培地中で培養することができる。培養中に、懸濁液中の複数の細胞が培養表面に接着し、培養を続けた後、羊膜由来接着細胞が生じる。非接着細胞は羊膜由来接着細胞を生み出さず、培地の交換の間に除去される。
羊膜から回収された細胞の数と種類を、免疫局在化、例えばフローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学(例えば、組織特異的抗体若しくは細胞マーカー特異的抗体による染色)、蛍光活性化細胞選別(FACS)、磁気活性化細胞選別(MACS)などの標準的な細胞検出技術を用いて形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学顕微鏡若しくは共焦点顕微鏡法を用いて細胞の形態を調べることにより、並びに／又はPCR及び遺伝子発現プロファイリングなどの当該技術分野で周知の技術を用いて遺伝子発現の変化を測定することにより、モニタリングすることができる。これらの技術を、同様に、1種以上の特定のマーカーが陽性である細胞を同定するためにも用いることができる。例えば、CD34に対する1種以上の抗体を用いて、上記の技術を用い、細胞が検出可能な量のCD34を含むかどうかを決定することができ；もしそうであるならば、細胞はCD34+である。
羊膜由来細胞、例えば、フィコール分離、差分接着、又は両方の組合せによって単離された細胞を、蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いて選別することができる。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離する周知の方法である(例えば、Kamarchの文献(1987, Methods Enzymol, 151：150-165)参照)。個々の粒子中の蛍光部分のレーザーによる励起によって、わずかな電荷が生じ、混合物からの陽性粒子及び陰性粒子の電磁分離が可能になる。一実施態様において、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドを個別の蛍光標識で標識する。細胞をセルソーターに通して処理し、使用された抗体に結合するそれらの能力に基づく細胞の分離を可能にする。FACSで選別された粒子を96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェルに直接に堆積させて、分離及びクローニングをしやすくすることができる。
1つの選別スキームでは、胎盤由来の細胞、例えば羊膜由来接着細胞を、マーカーCD49f、VEGFR2/KDR、及び/又はFlt-1/VEGFR1の発現に基づいて選別することができる。好ましくは、該細胞は、例えば細胞試料中のRT-PCRによるOCT-4の発現の決定により、OCT-4-であると同定され、ここで該試料中の細胞が30サイクル後にOCT-4のmRNAの検出可能な生成を示すことができない場合に、該細胞はOCT-4-である。例えば、VEGFR2/KDR+及びVEGFR1/Flt-1+である羊膜由来の細胞は、VEGFR2/KDR-、及びVEGFR1/Flt-1+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及び/又はVE-カドヘリン-の1つ以上である細胞から選別することができる。具体的な実施態様において、CD49f+、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及び/又はVE-カドヘリン-の1つ以上である羊膜由来の組織培養プラスチック-接着細胞、又はVEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である細胞は、そのようなマーカーの1つ以上を発現しない細胞から選別され、且つ選択される。別の具体的な実施態様において、さらにCD31+、CD34+、CD45+、CD133-、及び/又はTie-2+の1つ以上、又は全てである、CD49f+、VEGFR2/KDR+、VEGFR1/Flt-1+細胞は、そのような特徴の1つ以上、又はいずれも示さない細胞から選別される。別の具体的な実施態様において、さらに、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及び/又はCXCR4-の1つ以上、又は全てである、VEGFR2/KDR+、VEGFR1/Flt-1+細胞は、そのような特徴の1つ以上、又はいずれも示さない細胞から選別される。
羊膜由来接着細胞の選択は、例えば、遠心分離又はフローサイトメトリーを使用する分離により、消化から生じた細胞懸濁液について、又は消化残渣から回収された単離された細胞について実行することができる。発現されたマーカーによる選択は、単独で、或いは例えば培養液中のそれらの接着特性を基に細胞を選択する手順と結びつけて、遂行することができる。例えば、接着選択は、マーカー発現を基に選別する前又は後に遂行することができる。
胎盤細胞の抗体-媒介した検出及び選別に関して、特定のマーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出及び選別(例えば蛍光活性化細胞選別)に適した発蛍光団又は他の標識と組合せて使用することができる。特異的マーカーに対する抗体/発蛍光団組合せは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に結合したCD105に対するモノクローナル抗体(R&D Systems社、ミネアポリス、MNから入手可能)；フィコエリトリン(PE)に結合したCD200に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences Pharmingen社)；VEGFR2/KDR-ビオチン(CD309、Abcam社)などを含むが、これらに限定されない。本明細書に開示されたマーカーのいずれかに対する抗体は、抗体の検出を容易にする抗体の任意の標準標識により標識することができ、これは例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン/ビオチン、アビジン/ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリン(PE)、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、好適な放射性物質の例は、125I、131I、35S、又は3Hを含む。
羊膜由来接着細胞は、単一のマーカーに対する抗体により標識し、且つ単一マーカーを基に検出及び/又は選別することができるか、或いは複数の異なるマーカーに対する複数の抗体で同時に標識し、且つ複数のマーカーを基に選別することができる。
他の実施態様において、磁気ビーズを用いて細胞を分離する、例えば、本明細書記載の羊膜由来接着細胞を他の羊膜細胞から分離することができる。磁気ビーズ(直径0.5〜100μm)に結合するそれらの能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別(MACS)技術を用いて、該細胞を選別してもよい。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を磁気ミクロスフェアに対して行なうことができる。その後、該ビーズを細胞と混合し、結合させておく。その後、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施態様において、その後、これらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再び混合することができる。該細胞を再び磁場に通して、両方の抗体に結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を希釈して、別々の皿、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッシュに入れることができる。
羊膜由来接着細胞を、(生存を評価するための)トリパンブルー排出アッセイ、フルオレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ；及び、(増殖を評価するための)チミジン取込みアッセイ、又はMTT細胞増殖アッセイなどの、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて、生存能力、増殖能力、及び寿命について評価することができる。寿命は、延長された培養下での集団倍加の最大数を決定することなどの、当該技術分野で周知の方法によって測定してもよい。
羊膜由来接着細胞はまた、当該技術分野において公知の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長(陽性選択)、望ましくない細胞の選択的破壊(陰性選択)；例えば大豆凝集素による、混合集団における示差的細胞凝集能を基にした分離；凍結-解凍手法；濾過；通常の及びゾーン遠心分離；遠心溶出(対向流遠心分離)；単位重力分離；向流分配；電気泳動などを用い、他の胎盤細胞から分離することもできる。
（5.5 羊膜由来接着細胞の培養）
哺乳類の細胞に関して、本明細書に記載される羊膜由来接着細胞の増殖は、増殖のために選択された特定の培地に一部依存する。至適条件下で、羊膜由来接着細胞は、典型的には、およそ24時間で数が2倍になる。培養中、本明細書に記載される羊膜由来接着細胞は、培地中の基材、例えば、組織培養容器(例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンコートプラスチックなど)の表面に接着し、単層を形成する。典型的には、羊膜の消化後2〜7日以内に、細胞は培地中で樹立する。それらは、1日あたりおよそ0.4〜1.2の集団倍加で増殖し、少なくとも30〜50の集団倍加を経験し得る。細胞は、サブコンフルエンス及び拡大の間、間葉系/神経芽細胞-様の表現型を示し、コンフルエンスで立方体様/玉石-様の外観を示し、培養中の増殖は非常に接触抑制的である。羊膜誘導血管新生細胞の集団は、培養中の拡大の間に、胚様体を形成することができる。
（5.5.1 培養培地)
単離された羊膜由来接着細胞、又はそのような細胞の集団を用いて、細胞培養物をイニシエートするか、又はそれを播種することができる。一般に、細胞を、コーティングされていないか、或いはラミニン、コラーゲン(例えば、非変性若しくは変性)、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質(例えば、MATRIGEL（商標）(BD Discovery Labware社、ベッドフォード、MA))などの細胞外マトリクス若しくは生体分子でコーティングされているかのいずれかの滅菌組織培養容器に移す。
AMDACは、例えば、幹細胞の培養に適している培地において樹立することができる。樹立培地は、例えば、EGM-2培地(Lonza社)、DMEM＋10％FBS、又は60％DMEM-LG(Gibco社)、40％MCDB-201(Sigma社)、2％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、1×レノレン酸(lenolenic acid)-ウシ-血清-アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、上皮細胞増殖因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来増殖因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含む培地(本明細書において「標準培地」と称す)を含む。
羊膜由来接着細胞は、細胞、例えば接着性胎盤幹細胞の培養に許容し得るものとして当該技術分野で認識されている任意の培地中及び任意の条件下で培養することができる。該培養培地は血清を含むことが好ましい。様々な実施態様において、AMDACの培養又は継代培養のための培地としては、STEMPRO(登録商標)(Invitrogen社)、MSCM-sf(ScienCell社、カールスバッド、CA)、MESENCULT(登録商標)-ACF培地(StemCell Technologies社、バンクーバー、カナダ)、標準培地、EGF非含有標準培地、PDGF非含有標準培地、DMEM＋10％FBS、EGM-2(Lonza社)、EGM-2MV(Lonza社)、2％、10％及び20％ES培地、ES-SSR培地、又はα-MEM-20％FBSを含む。羊膜由来接着細胞の培養に許容し得る培地は、例えば、DMEM、IMDM、DMEM(高グルコース又は低グルコース)、イーグルの基本培地、ハムのF10培地(F10)、ハムのF-12培地(F12)、イスコフの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地(MSCGM、Lonza社)、ADVANCESTEM(商標)培地(Hyclone社)、KNOCKOUT(商標)DMEM(Invitrogen社)、ライボヴィッツのL-15培地、MCDB、DMEM／F12、RPMI 1640、改良DMEM(Gibco社)、DMEM／MCDB201(Sigma社)、及びCELL-GRO FREEなどが挙げられる。様々な実施態様において、例えば、ITS(インスリン-トランスフェリン-セレン)、LA＋BSA(リノール酸-ウシ血清アルブミン)、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-LG(ダルベッコの改変必須培地、低グルコース)／MCDB 201(ニワトリ線維芽細胞基本培地)；約2〜約20％、例えば約10％ウシ胎仔血清(FBS；例えば、限定ウシ胎仔血清、Hyclone社、ローガン、UT)を含むDMEM-HG(高グルコース)；約2〜約20％、例えば約15％FBSを含むDMEM-HG；約2〜約20％、例えば約10％FBS、約2〜約20％、例えば約10％ウマ血清、及びヒドロコルチゾンを含むIMDM(イスコフの改変ダルベッコ培地)；約2〜約20％、例えば約10％FBS、EGF、及びヘパリンを含むM199；約2〜約20％、例えば約10％FBS、GLUTAMAX(商標)、及びゲンタマイシンを含むα-MEM(最小必須培地)；10％FBS、GLUTAMAX(商標)、及びゲンタマイシンを含むDMEM；約2〜約20％、例えば約15％(v/v)ウシ胎仔血清(例えば、限定ウシ胎仔血清、Hyclone社、ローガン、UT)、抗生物質／抗真菌剤(例えばペニシリン約100ユニット/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、及び/又はアンホテリシンBの0.25μg/mL(Invitrogen社、カールスバッド、CA))、及び0.001％(v/v)β-メルカプトエタノール(Sigma社、セントルイス、MO)を含有するDMEM-LG； 2〜20％FBS、非必須アミノ酸(Invitrogen社)、β-メルカプトエタノールを補充した、KNOCKOUT(商標)-DMEM基本培地；KNOCKOUT(商標)Serum Replacementを補充した、KNOCKOUT(商標)基本培地；2〜20％FBSを含有するα-MEM；EGF、VEGF、bFGF、R3-IGF-1、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、アスコルビン酸、FBS、ゲンタマイシンを補充したEBM2(商標)基本培地などが挙げられる。
培養培地には、例えば、血清(例えば、FCS又はFBS、例えば約2〜20％(v/v)；ウマ科(ウマ)血清(ES)；ヒト血清(HS))；β-メルカプトエタノール(BME)、好ましくは、約0.001％(v/v)；1種以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インスリン様増殖因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、及びエリスロポエチン(EPO)；L-バリンを含むアミノ酸；並びに例えば、単独又は組合せた、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を防除するための1種以上の抗生物質及び/又は抗真菌剤を含む1種以上の成分を補充することができる。
羊膜由来接着細胞(AMDAC)は、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートにおいて、標準の組織培養条件で培養することができる。細胞はまた、ハンギングドロップ法を用いて、培養することができる。この方法において、細胞は、培地約5mL中に、約1×104個細胞/mLで懸濁され、且つ該培地の1滴以上が、組織培養容器、例えば100mLのペトリ皿の蓋の内側に垂らされる。この液滴は、例えば、単独の液滴、又は例えばマルチチャネルピペットからの複数の液滴であり得る。蓋を慎重に裏返し、且つ例えば、皿の大気中の含水量を維持するのに十分な量の滅菌PBSなどの、ある量の液体を含む皿の底面上に配置し、細胞を培養する。AMDACはまた、T-フラスコ、Corning社HYPERFLASK(登録商標)、Cell Factories(Nunc)、1-、2-、4-、10-又は40-トレー細胞スタックなどの、標準又はハイボリューム又はハイスループット培養システムにおいても培養することができる。AMDACは、バイオリアクター、例えば、ハイスループットバイオリアクター、静的バイオリアクター、プラグフローバイオリアクターなどにおいても培養できる。バイオリアクターの例には、Celligen Culture Systems (New Brunswick社、エディソン、NJ)、WAVE バイオリアクター（商標）(General Electric社)などがある。
一実施態様において、羊膜由来接着細胞は、該細胞の未分化表現型を維持するように作用する化合物の存在下で培養される。具体的な実施態様において、該化合物は、置換3,4-ジヒドロピリジモル[4,5-d]ピリミジンである。より具体的な実施態様において、該化合物は下記化学構造を有する化合物である。
Figure 2014520857
 該化合物は、羊膜由来接着細胞、又はそのような細胞の集団と、例えば、約1μM〜約10μMの濃度で接触させることができる。
（5.5.2 羊膜由来接着細胞の拡大及び増殖)
いったん単離された羊膜由来接着細胞、又は単離されたそのような細胞の集団(例えば、該細胞又は細胞集団が通常インビボで関連している羊膜細胞の少なくとも50％から分離されている、羊膜由来接着細胞又はそのような細胞の集団)、該細胞は、インビトロで増殖させ、拡大することができる。例えば、接着細胞又は羊膜由来接着細胞の集団を、組織培養容器、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどの中で、40〜70％コンフルエンスになるまで、すなわち、該細胞及びその子孫が、組織培養容器の培養表面積の40〜70％を占めるまで該細胞が増殖するのに十分な時間、培養することができる。
羊膜由来接着細胞は、細胞成長を可能にする密度で培養容器中に播種することができる。例えば、該細胞を、低密度(例えば約400〜約6,000個細胞/cm2)から高密度(例えば約20,000個細胞/cm2以上)で播種してもよい。好ましい実施態様において、該細胞を、大気中、約0％〜約5容積％のCO2の存在下で培養する。いくつかの好ましい実施態様において、該細胞を、大気中約0.1％〜約25％のO2、好ましくは、大気中約5％〜約20％のO2で培養する。該細胞を、約25℃〜約40℃、好ましくは37℃で培養することが好ましい。
該細胞をインキュベーター内で培養することが好ましい。培養時に、培養培地は、静止状態とするか、又は例えば、バイオリアクターを用いて培養時に撹拌することができる。羊膜由来接着細胞を(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシステインなどの添加により)低酸化ストレス下で成長させることが好ましい。
羊膜由来血管新生細胞はコンフルエンスまで成長することができるが、細胞がコンフルエンスまで成長しないことが好ましい。例えば、いったん40％〜70％のコンフルエンスが得られたならば、細胞を継代してもよい。例えば、該細胞を、当該技術分野で周知の技術を用いて酵素的に処理し、例えばトリプシン処理し、それらを組織培養表面から分離することができる。該細胞をピペッティングで取り除き、該細胞を計数した後、約20,000〜100,000個の細胞、好ましくは約50,000個の細胞、又は約400〜約6,000個細胞/cm2の細胞を、新鮮な培養培地を含む新しい培養容器に継代することができる。典型的には、新しい培地は、該細胞が取り除かれた培地と同じ種類である。羊膜由来接着細胞は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20回、又はそれよりも多く継代することができる。AMDACは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49若しくは少なくとも50回、又はそれよりも多く、培養物において倍加することができる。
（5.6 他の細胞型を含む羊膜由来接着細胞の集団）
本明細書に記載される羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、第二の細胞型、例えば、羊膜由来接着細胞ではない胎盤細胞、又は、例えば、胎盤細胞ではない細胞を含んでよい。例えば、羊膜由来接着細胞の単離された集団は、例えば、第二の種類の細胞を含んでよく、例えばそれと組み合わされてよく、前記第二の種類の細胞は、例えば、胚性幹細胞、血球(例えば、胎盤血、胎盤血球、臍帯血、臍帯血球、末梢血、末梢血球、胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来の有核細胞など)、血液から単離された幹細胞(例えば、胎盤血、臍帯血、又は末梢血から単離された幹細胞)、胎盤幹細胞(例えば、その開示を引用によりそのまま本明細書に組み込む米国特許第7,468,276号及び米国特許出願公開第2007/0275362号に記載される胎盤幹細胞)、胎盤灌流液由来の有核細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞;臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄-由来間葉系間質細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄-由来造血幹細胞、粗骨髄、成人(体性)幹細胞、組織内に含まれている幹細胞の集団、培養された細胞、例えば、培養された幹細胞,完全に分化した細胞(例えば、軟骨細胞、神経芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心細胞など)の集団、周皮細胞などである。具体的な実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団は、胎盤幹細胞又は臍帯由来の幹細胞を含む。第二の種類の細胞が血液又は血球である特定の実施態様において、赤血球は細胞集団から除去されている。
具体的な実施態様において、第二の種類の細胞は造血幹細胞である。そのような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血又は末梢血;胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来の全有核細胞;胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来のCD34+細胞の単離された集団;未処理の骨髄;骨髄由来の全有核細胞;骨髄由来のCD34+細胞の単離された集団などに含まれ得る。
他の実施態様において、羊膜由来接着細胞の単離された集団は、血管系由来の複数の成人細胞又は始原細胞と組み合わされる。種々の実施態様において、細胞は、内皮細胞、内皮始原細胞、筋細胞、心筋細胞、周皮細胞、血管芽細胞、筋芽細胞、又は心筋芽細胞である。
他の実施態様において、第二の細胞型は、胚性幹細胞に関連した多能性及び機能のマーカーを発現するために培養中に操作された非胚性細胞型である。
羊膜由来接着細胞の上記の単離された集団の具体的な実施態様において、羊膜由来接着細胞及び第二の種類の細胞のいずれか又は両者は、意図される細胞の受容者にとって自己由来であるか、又は同種異系である。
羊膜由来接着細胞及び羊膜由来接着細胞以外の複数の幹細胞を含む組成物が本明細書にさらに提供される。具体的な実施態様において、組成物は、胎盤から得られる幹細胞、すなわち胎盤幹細胞、例えば、米国特許第7,045,148号;同第7,255,879号;及び同第7,311,905号、並びに米国特許出願公開第2007/0275362号に記載される胎盤幹細胞を含み、それぞれの開示は引用によりその全体として本明細書に組み込まれる。具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200+及びHLA-G+;CD73+、CD105+、及びCD200+;CD200+及びOCT-4+;CD73+、CD105+及びHLA-G+;CD73+及びCD105+であり、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体-様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、該細胞集団中に1つ以上の胚様体-様体の形成を促進し;又はOCT-4+であり、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体-様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記細胞集団中に1つ以上の胚様体-様体の形成を促進し;又はその任意の組み合わせである。より具体的な実施態様において、前記CD200+、HLA-G+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+である。他のより具体的な実施態様において、前記CD73+、CD105+、及びCD200+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である。他のより具体的な実施態様において、前記CD200+、OCT-4+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G+である。他のより具体的な実施態様において、前記CD73+、CD105+、及びHLA-G+幹細胞は、CD34-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。他のより具体的な実施態様において、前記CD73+及びCD105+幹細胞は、OCT-4+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。他のより具体的な実施態様において、前記OCT-4+幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。他のより具体的な実施態様において、胎盤幹細胞は起源が母方である(すなわち、母方の遺伝子型を有する)。他のより具体的な実施態様において、胎盤幹細胞はその起源が胎児である(すなわち、胎児の遺伝子型を有する)。
他の具体的な実施態様において、組成物は羊膜由来接着細胞及び胚性幹細胞を含む。他の具体的な実施態様において、組成物は、羊膜由来接着細胞及び間葉系間質細胞又は幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系間質細胞又は幹細胞を含む。他の具体的な実施態様において、組成物は、骨髄由来造血幹細胞を含む。他の具体的な実施態様において、組成物は、羊膜由来接着細胞及び造血前駆細胞、例えば、骨髄、胎児血、臍帯血、胎盤血、及び/又は末梢血由来の造血前駆細胞を含む。他の具体的な実施態様において、組成物は、羊膜由来接着細胞及び体性幹細胞を含む。より具体的な実施態様において、前記体性幹細胞は、神経幹細胞、肝臓幹細胞、すい臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、又は筋幹細胞である。
他の具体的な実施態様において、第二の種類の細胞は、前記集団において、約、少なくとも、又はわずか10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、又は50%の細胞を構成する。他の具体的な実施態様において、前記組成物中のAMDACは、前記組成物の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、又は90%の細胞を構成する。他の具体的な実施態様において、羊膜由来接着細胞は、前記集団において、約、少なくとも、又はわずか10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、又は45%の細胞を構成する。
羊膜由来接着細胞の単離された集団における細胞は、他の種類の複数の細胞と、例えば、幹細胞の集団と、各集団中の全有核細胞の数を比較して約100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000;又は約1:100,000,000の比で組み合わせることができる。羊膜由来接着細胞の単離された集団における細胞は、複数の細胞型の複数の細胞とも、同様に組み合わせることができる。
（5.7 羊膜由来接着細胞の保存）
羊膜由来接着細胞は保存でき、すなわち、例えば、回収の間又は本明細書に記載される組成物の製造の前に、例えば、本明細書に記載される方法を利用して、長期貯蔵が可能である条件下に、又は例えば、アポトーシス又は壊死などによる細胞死を阻害する条件下におくことができる。
羊膜由来接着細胞は、その開示が引用により本明細書にそのまま組み込まれる米国特許出願公開第2007/0190042号に記載されるとおり、例えば、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存できる。一実施態様において、そのような細胞、又はそのような細胞の集団を保存する方法は、前記細胞又は細胞の集団を、アポトーシスの阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む細胞回収組成剤に接触させることを含むが、前記アポトーシスの阻害剤は、アポトーシスの阻害剤に接触していない細胞の集団に比べて、細胞集団中のアポトーシスを低減又は予防するのに十分な量及び時間存在する。具体的な実施態様において、前記アポトーシスの阻害剤はカスパーゼ阻害剤である。他の具体的な実施態様において、前記アポトーシスの阻害剤はJNK阻害剤である。より具体的な実施態様において、前記JNK阻害剤は、羊膜由来接着細胞の分化又は増殖を変更しない。他の実施態様において、前記細胞回収組成物は、前記アポトーシスの阻害剤及び前記酸素運搬ペルフルオロカーボンを別々の相に含む。他の実施態様において、前記細胞回収組成物は、前記アポトーシスの阻害剤及び前記酸素運搬ペルフルオロカーボンをエマルション中に含む。他の実施態様において、細胞回収組成物は、乳化剤、例えば、レシチンをさらに含む。他の実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記ペルフルオロカーボンは、細胞との接触時に約0℃〜約25℃である。他のより具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記ペルフルオロカーボンは、細胞との接触時に、約2℃〜10℃又は約2℃〜約5℃である。他のより具体的な実施態様において、前記接触は、前記細胞の集団の輸送の間に実施される。他のより具体的な実施態様において、前記接触は、前記細胞の集団の凍結及び解凍の間に実施される。
羊膜由来接着細胞の集団は、例えば、前記細胞の集団をアポトーシスの阻害剤及び臓器保存化合物に接触させることを含む方法であって、前記アポトーシスの阻害剤が、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団に比べて、細胞集団におけるアポトーシスを低減又は予防するのに十分な量及び時間で存在する方法により保存できる。具体的な実施態様において、臓器保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に記載されている; ViaSpanとしても知られている; Southardらの文献、Transplantation 49(2):251-257 (1990)も参照されたい)又はSternらの文献、米国特許第5,552,267号に記載される溶液である。他の実施態様において、前記臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はこれらの組み合わせである。他の実施態様において、細胞回収組成物は、酸素運搬ペルフルオロカーボンを、2相中又はエマルションとしてのいずれかでさらに含む。
該方法の他の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、潅流の間に、アポトーシス阻害剤、及び酸素運搬ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はこれらの組み合わせを含む細胞回収組成物と接触させられる。他の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、そのような細胞回収組成物と、組織破壊のプロセス、例えば、羊膜組織の酵素消化中に接触させられる。他の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、前記細胞回収化合物と、組織破壊、例えば、羊膜組織の酵素消化による回収の後で接触させられる。
典型的には、羊膜由来接着細胞の回収、富化、及び単離の間に、低酸素症による細胞ストレス及び機械的ストレスを最低限にするか又は全く無くすことが好ましい。したがって、該方法の他の実施態様において、羊膜由来接着細胞又は羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、回収、富化、又は単離の間、前記保存の間の6時間未満低酸素状態に曝されるが、低酸素状態は、例えば、正常の大気酸素濃度未満;正常の血中酸素濃度未満などの酸素濃度である。より具体的な実施態様において、前記細胞又は前記細胞の集団は、前記低酸素状態に、前記保存の間2時間未満曝される。他のより具体的な実施態様において、前記細胞又は前記細胞の集団は、前記低酸素状態に、1時間未満、又は30分未満曝され、或いは、回収、富化、又は単離の間に低酸素状態に曝されない。他の具体的な実施態様において、前記細胞の集団は、回収、富化、又は単離の間にせん断応力に曝されない。
羊膜由来接着細胞は、例えば、小型容器、例えばアンプル中の凍結保存培地中で、一般に、又は本明細書に開示される具体的な方法により凍結保存できる。好適な凍結保存培地には、例えば、増殖培地を含む培地、又は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、SigmaAldrichカタログ番号C2695、C2639(Cell Freezing Medium-Serum-free 1X、DMSO不含)又はC6039(Cell Freezing Medium-Glycoerol 1 X 最小必須培地、グリセロール、子ウシ血清、及びウシ血清含有)により特定される細胞凍結培地、Lonza PROFREEZE（商標）2xMedium、メチルセルロース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、ウシ胎児(fetal bovine)血清、ウシ胎児(fetal calf)血清、又はPlasmalyteがあるがこれらに限定されない。凍結保存培地は、好ましくは、DMSO(ジメチルスルホキシド)又はグリセロールを、例えば、約1%〜約20%、例えば、約5%〜10%(v/v)の濃度で含み、任意にウシ胎児血清又はヒト血清を含む。凍結保存培地は、追加の作用物質、例えば、メチルセルロース及び/又はグリセロールを含んでよい。単離された羊膜由来接着細胞は、凍結乾燥の間、好ましくは約1℃/分で冷却される。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、好ましくは約-125℃〜約-140℃である。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に、液体窒素の気相に移すことができる。いくつかの実施態様において、例えば、アンプルがいったん約-80℃に到達すると、それらは液体窒素貯蔵領域に移される。凍結保存は、速度制御凍結器を利用しても実施できる。凍結保存された細胞は、好ましくは約25℃〜約40℃の温度で、好ましくは約37℃の温度に解凍される。
（5.8 羊膜由来接着細胞のバンクの生成）
羊膜由来接着細胞をいくつかの異なる方法で培養して、そのような細胞のロットのセット、例えば、個別に投与可能な投与量のセットを生成することができる。複数の胎盤から得られる、血管新生羊膜細胞のロットのセットは、例えば、長期保存のために、細胞のバンクに配置できる。一般に、羊膜由来接着細胞は、細胞の最初の培養物から得られて、種培養を形成し、それが制御された条件下で拡大されて、およそ等価な数の倍加から細胞集団を形成する。ロットは、好ましくは単一の胎盤の組織から誘導されるが、複数の胎盤の組織から誘導することもできる。
非限定的な一実施態様において、羊膜由来接着細胞のロット又は投与量は、以下の通りに得られる。最初に、羊膜組織を破壊し、例えば、上記5.4.3節に記載の通り連続的なトリプシン及びコラゲナーゼの消化を利用して消化する。コラゲナーゼに消化された組織由来の細胞を、例えば、約1〜3週間、好ましくは約2週間培養する。非接着細胞を除去した後、形成した高密度コロニーを、例えば、トリプシン処理により回収する。これらの細胞を回収し、簡便な体積の培地に再懸濁させ、継代数0細胞であると定義する。
次いで、継代数0細胞を使用して、拡大培養を播種した。拡大培養は、別々の細胞培養装置、例えば、NUNC（商標）によるCell Factoryの任意の配置でよい。継代数0培養物中の細胞を、例えば、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、又は10×104の接着細胞により拡大培養物を播種するように、任意の程度に小分けできる。好ましくは、約1×103〜約3×104の継代数0細胞を使用して、各拡大培養物を播種する。拡大培養物の数は、継代数0細胞の数に依存することがあり、接着細胞が得られる元の特定の胎盤（複数可）によりその数が増減し得る。
次いで、拡大培養物を、培養物中の細胞密度が特定の値、例えば、約1×105細胞/cm2に達するまで増殖させることができる。細胞は、この時点で回収するか、又は凍結保存するかのいずれかが可能であり、上述の通り新しい拡大培養物に継代することもできる。細胞は、使用前に、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20回継代できる。集団倍加の累積数の記録は、好ましくは、拡大培養（複数可）の間維持される。継代数0培養物からの細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、若しくは40の倍加、又は最高60の倍加で拡大できる。しかし、好ましくは、細胞集団を個別の投与量に分割する前の集団倍加の数は、約15〜約30の倍加である。細胞は、拡大プロセスの全体を通して連続的に培養でき、又は拡大の間の1以上の時点で凍結できる。
個別の投与量に使用すべき細胞は、後の使用のために、凍結、例えば、凍結保存することができる。個別の投与量は、例えば、mLあたり約100万〜約5000万の細胞を含むことができ、全体で約106〜約1010の細胞を含むことができる。
したがって、一実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む細胞バンクは、第一の複数の集団倍加用に、ヒトの出産後の胎盤から初代培養羊膜由来接着細胞を拡大すること;該細胞を凍結保存してマスター細胞バンク(Master Cell Bank)を形成すること;第二の複数の集団倍加用に、マスター細胞バンクからの複数の細胞を任意に拡大すること;拡大された細胞を凍結保存して、作業細胞バンク（Working Cell Bank）を形成すること;第三の複数の集団倍加用に、作業細胞バンクからの複数の拡大された羊膜由来接着細胞を任意に拡大すること;及び得られた拡大された細胞を、個別の投与量で凍結保存することを含む方法であって、前記個別の投与量が全体として細胞バンクを構成する方法により作成できる。バンクは、羊膜由来接着細胞のみの投与量又はロットを含み得るが、又は羊膜由来接着細胞のロットと他の種類の細胞、例えば、他の種類の幹細胞若しくは始原細胞のロット若しくは投与量の組み合わせを含み得る。好ましくは、各個別の投与量は、羊膜由来接着細胞のみを含む。他の具体的な実施態様において、前記初代培養物中の前記細胞の全ては、同じ胎盤由来である。他の具体的な実施態様において、前記個別の投与量は、約104〜約105細胞を含む。他の具体的な実施態様において、前記個別の投与量は、約105〜約106細胞を含む。他の具体的な実施態様において、前記個別の投与量は、約106〜約107細胞を含む。他の具体的な実施態様において、前記個別の投与量は、約107〜約108細胞を含む。他の具体的な実施態様において、前記投与量の投与量は、約108〜約109細胞を含む。他の具体的な実施態様において、前記個別の投与量は、約109〜約1010細胞を含む。
特定の実施態様において、羊膜由来接着細胞は作業細胞バンクから解凍でき、複数の集団倍加用に培養できる。所望の数の細胞が生成した場合、又は所望の数の集団倍加が起こった場合、接着細胞を、例えば遠心分離により回収でき、例えば、デキストラン、例えば、5%デキストランを含む溶液に再懸濁させることができる。特定の実施態様において、デキストランは、デキストラン-40である。特定の実施態様において、細胞を再度回収し、デキストラン及び凍結保存剤を含む溶液、例えば、10%のHSA及び2%〜20%の、例えば、5%のDMSOを含む5%デキストラン(例えば、デキストラン-40)溶液に再懸濁させ、凍結保存する。凍結保存された羊膜由来接着細胞を、例えば、使用直前に解凍できる。
好ましい実施態様において、胎盤が得られた元のドナー(例えば、母親)を、少なくとも1種の病原体について検査する。特定の実施態様において、母親が、検査された病原体に陽性である場合、該胎盤からのロット全体を廃棄する。そのような検査は、羊膜由来接着細胞のロットの製造中に、継代数0細胞の樹立前後又は拡大培養中を含めていつでも実施できる。存在か否かを検査する病原体には、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス(I型及びII型)、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどがあるが、これらに限定されない。
（5.9 羊膜由来接着細胞を含む組成物）
本明細書に記載される、放射線に被曝した個体を治療する方法及び/又は造血再構成の方法は、AMDAC、例えば、液体、固体(例えば、マトリクス)、又は両者の組み合わせ(例えば、ハイドロゲル)を含む組成物の使用を包含する。特定の実施態様において、AMDACは、医薬組成物内に含まれており、又は医薬組成物の成分である。一般的に、全身投与に好適な組成物は、個体の放射線被曝が全身に及んだ状況に好ましい。しかし、局所投与、例えば、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下投与などに好適なAMDACを含む医薬組成物。
該細胞は、個体に容易に投与することができる形態、例えば医療用途に好適な容器中に含まれる、例えば静脈内投与に好適なAMDAC溶液の形態で調製することができる。そのような容器は、例えば、注射器、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、瓶、又はAMDACを容易に分注することができる他の容器であることができる。例えば、該容器は、血液バッグ又はレシピエントへの液体の静脈内投与に好適な他のプラスチック製の医療用に許容し得るバッグであることができる。容器は、特定の実施態様において、該細胞を凍結保存することができるものである。本明細書で提供される該組成物、例えば医薬組成物中の細胞は、単一のドナー、又は複数のドナーに由来する羊膜由来接着細胞を含むことができる。該細胞は、意図されるレシピエントと完全にHLAが一致するものであり得るか、又は一部若しくは完全にHLAが一致しないものであり得るが、例えば、完全に自己のもの、部分的に同種異型、又は完全に同種異型であり得る。
したがって、一実施態様において、本明細書に提供される組成物中のAMDACは、容器中にAMDACを含む組成物の形態で、それを必要とする個体に投与される。別の具体的な実施態様において、容器は、バッグ、フラスコ、又は瓶である。より具体的な実施態様において、該バッグは、滅菌プラスチックバッグである。より具体的な実施態様において、該バッグは、例えば静脈内注入、ボーラス注射などによる前記AMDACの静脈内投与に好適であるか、これを可能にするか、又はこれを容易にする。該バッグは、投与の前又は投与の間に、該細胞と1種以上の他の溶液、例えば、薬物との混合を可能にするために相互連結されている複数の管腔又は区画を含むことができる。別の具体的な実施態様において、凍結保存前に、AMDACを含む溶液は、該細胞の凍結保存を容易にする1種以上の化合物を含む。別の具体的な実施態様において、前記AMDACは、生理的に許容し得る水溶液に含まれている。より具体的な実施態様において、該生理的に許容し得る水溶液は、0.9％NaCl溶液である。別の具体的な実施態様において、AMDACは、前記細胞のレシピエントとHLAが一致する細胞であるか、又はそれを含む。別の具体的な実施態様において、前記AMDACは、前記細胞のレシピエントと少なくとも一部HLAが一致しない細胞であるか、又はそれを含む。別の具体的な実施態様において、前記AMDACは、複数のドナーに由来する。様々な具体的な実施態様において、前記容器は、約、少なくとも、又は多くとも1×106個の前記細胞、5×106個の前記細胞、1×107個の前記幹細胞、5×107個の前記細胞、1×108個の前記細胞、5×108個の前記細胞、1×109個の前記細胞、5×109個の前記細胞、又は1×1010個の前記細胞を含む。前述の凍結保存された集団のいずれか他の具体的な実施態様において、前記細胞は、約、少なくとも、若しくはわずか5回、わずか10回、わずか15回、又はわずか20回継代される。前述の凍結保存された細胞のいずれか別の具体的な実施態様において、該細胞は、該容器内で拡大される。具体的な実施態様において、AMDACの単一の単位投与量は、様々な実施態様において、約、少なくとも、又はわずか1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれよりも多いAMDACを含むことができる。
特定の実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、50％以上の生存細胞を含むAMDACの集団を含む(すなわち、該集団内の細胞の少なくとも50％は機能的であるか、又は生存している)。好ましくは、該集団内の細胞の少なくとも60％が生存している。より好ましくは、該医薬組成物中の該集団内の細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％が生存している。
（5.9.1 羊膜由来接着細胞を含むマトリクス）
マトリクス、ヒドロゲル、スキャフォールドなどを含む組成物が本明細書でさらに提供される。そのような組成物は、液体懸濁液中のそのような細胞の代わりに、又は細胞に加えて使用することができる。
該マトリクスは、例えば、恒久的又は分解性の脱細胞性組織、例えば脱細胞化された羊膜、又は合成マトリクスであることができる。該マトリクスは、三次元スキャフォールドであることができる。より具体的な実施態様において、前記マトリクスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、又はビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施態様において、マトリクスは、羊膜又は羊膜由来の生体材料である。別のより具体的な実施態様において、該マトリクスは、細胞外膜タンパク質を含む。別のより具体的な実施態様において、該マトリクスは、合成化合物を含む。別のより具体的な実施態様において、該マトリクスは、生体活性化合物を含む。別のより具体的な実施態様において、該生体活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、又は5,000ダルトン未満の有機分子である。
本明細書記載の羊膜由来接着細胞を、天然マトリクス、例えば、羊膜材料などの胎盤生体材料に播種することができる。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物の胎盤から直接解剖された羊膜；固定又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥している(すなわち、＜20％H2Oの)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥している絨毛膜、実質的に乾燥している羊膜と絨毛膜などであることができる。本明細書に提供される羊膜由来接着細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、その開示がそれらの全体として引用により本明細書中に組み込まれている、Haririの米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されている。
別の具体的な実施態様において、該マトリクスは、細胞外マトリクスを含む組成物である。より具体的な実施態様において、該組成物は、MATRIGEL(商標)(BD Biosciences社)である。
本明細書記載の単離された羊膜由来接着細胞を、例えば注射に好適なヒドロゲル溶液中に懸濁することができる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、又は水素結合により架橋し、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開放格子構造を作り出す有機ポリマー(天然物又は合成物)である。そのような組成物のための好適なヒドロゲルは、RAD16などの自己集合ペプチドを含む。一実施態様において、該細胞を含むヒドロゲル溶液を、例えば、鋳型中で硬化させて、その中に分散した細胞を有する埋め込み用のマトリクスを形成することができる。そのようなマトリクス中の羊膜由来接着細胞を培養し、該細胞を埋め込み前に有糸分裂で拡大させることもできる。ヒドロゲル形成材料としては、イオンによって架橋する、アルギネート及びその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン、並びにポリアクリレート、又はそれぞれ温度又はpHによって架橋する、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーが挙げられる。一部の実施態様において、ヒドロゲル又はマトリクスは生分解性である。
特定の実施態様において、本明細書に提供される細胞を含有する組成物は、インサイチュで重合可能なゲルを含む(例えば、米国特許出願公開第2002/0022676号；Ansethらの文献(J. Control Release, 78(1-3): 199-209(2002))；Wangらの文献(Biomaterials, 24(22): 3969-80(2003))を参照されたい)。いくつかの実施態様において、該ポリマーは、荷電側基、又はその一価イオン塩を有する水、緩衝塩溶液、又は水性アルコール溶液などの水溶液に少なくとも一部溶ける。カチオンと反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ(酢酸ビニル)、及びスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテルモノマー又はビニルエーテルポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーを用いることもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくは、フッ素化)アルコール基、フェノール性OH基、及び酸性OH基である。
具体的な実施態様において、マトリクスは、例えば、PGA、PLA、PCLコポリマー若しくはブレンド、又はヒアルロン酸などの生体吸収性材料から製造されたマルチフィラメント糸で構成され得るフェルトである。この糸は、クリッピング、カッティング、カーディング及びニードリングからなる、標準の織物処理技術を用いフェルトにされる。別の好ましい実施態様において、本発明の細胞は、複合構造である得る発泡体スキャフォールド上に播種される。加えて、3次元フレームワークを、修復、交換又は増強すべき体内の特定の構造物などの、有用な形状に成形することができる。他の使用することができるスキャフォールドの例としては、不織マット、多孔性発泡体、又は自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、グリコール酸と乳酸の吸収性合成コポリマー(例えば、PGA／PLA)(VICRYL、Ethicon社、ソマービル、NJ)から構成される繊維を用いて形成することができる。フリーズドライ、又は凍結乾燥などのプロセスによって形成される、例えば、ポリ(ε-カプロラクトン)／ポリ(グリコール酸)(PCL／PGA)コポリマーから構成される発泡体(例えば、米国特許第6,355,699号参照)をスキャフォールドとして用いることもできる。
本明細書記載の羊膜由来接着細胞を、3次元フレームワーク又はスキャフォールドに播種し、インビボにおいて埋め込むことができる。そのようなフレームワークを、例えば組織形成、例えば骨形成又は脈管形成などを刺激する、増殖因子、細胞、薬物又は他の成分の任意の1種以上と組合せて埋め込むことができる。
本明細書に提供される胎盤羊膜由来接着細胞は、別の実施態様において、複合構造物であり得る発泡体スキャフォールドに播種することができる。そのような発泡体スキャフォールドを、有用な形状、例えば、修復、交換又は増強すべき体内の特定の構造物の一部の形状に成形することができる。いくつかの実施態様において、フレームワークを、細胞接着を強化するために、例えば、0.1M酢酸で処理し、それに続いて、細胞の接種前に、ポリリジン、PBS、及び/又はコラーゲン中でインキュベートする。例えば、マトリクスのプラズマ-コーティングによるか、又は1種以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など)、細胞マトリクス、並びに／又は限定するものではないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどのような他の材料の添加によって、マトリクスの外部表面を修飾し、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を改善することができる。
いくつかの実施態様において、マトリクスは、それを非血栓形成性とする材料を含むか、又は該材料で処理される。これらの処理及び材料は、内皮成長、移動、及び細胞外マトリクス沈着を促進し、且つ持続させることもできる。これらの材料及び処理の例としては、天然材料、例えばラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、合成材料、例えばEPTFE、並びにセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えばPURSPAN(商標)(The Polymer Technology Group社、バークレー、CA)が挙げられるが、これらに限定されない。マトリクスは、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともでき；本明細書に提供される接着細胞の播種の前に、スキャフォールドを、表面電荷を変化させるように処理する(例えば、プラズマでコーティングする)こともできる。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞の接種前に、細胞接着を増強するために、フレームワークを処理することができる。例えば、本発明の細胞の接種前に、ナイロンマトリクスを、0.1モル酢酸で処理し、ポリリジン、PBS、及び/又はコラーゲン中でインキュベーションし、ナイロンをコーティングする。ポリスチレンは、硫酸を用い、同様に処理することができる。
加えて、例えば、フレームワークのプラズマ-コーティングによるか、又は1種以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸)、細胞マトリクス、並びに／又は限定するものではないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、又は植物ゴムなどのような他の材料の添加によって、三次元フレームワークの外部表面を修飾し、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を改善することができる。
いくつかの実施態様において、マトリクスは、マトリクスを非血栓形成性にする材料、例えば、天然材料、例えばラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、並びに合成材料、例えばePTFE又はセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えばPURSPAN(The Polymer Technology Group社、バークレー、CA)などを含むか、又は該材料で処理される。そのような材料には、スキャフォールドを非血栓形成性にするために例えばヘパリンにより、並びにプラズマでコーティングなど、材料の表面電荷を変化させる処理をさらに施すことができる。
羊膜由来接着細胞を含有する治療用細胞組成物はまた、マトリクス-細胞複合体の形状で提供することができる。マトリクスは、生体吸収性であるかどうか、液体、ゲル、又は個体であるかにかかわらず、生体適合性スキャフォールド、格子、自己集合構造などを含むことができる。そのようなマトリクスは、治療用細胞処理、外科的修復、組織工学、及び創傷治癒の分野において公知である。特定の実施態様において、該細胞は、マトリクスに接着する。他の実施態様において、該細胞は、マトリクス空間内に捕捉されるか又は含まれる。その中で細胞がマトリクスと密接に関連して成長し、且つ治療に使用される場合、レシピエントの細胞の内方成長を刺激し且つ支持し、且つ血管新生を刺激若しくは支援するマトリクス-細胞複合体が、最も好ましい。該マトリクス-細胞組成物は、限定するものではないが、埋め込み、注射、外科的接着、他の組織との移植、注入などを含む、当該技術分野において公知のいずれの方法によっても、個体の体内に導入することができる。いくつかの実施態様において、マトリクスは、インビボ、又はインサイチュにおいて形成される。例えば、インサイチュで重合可能なゲルを、本発明に従い使用することができる。そのようなゲルの例は、当該技術分野において公知である。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される細胞は、スキャフォールドなどの三次元マトリクス上に播種され、且つインビボで埋め込まれ、そこで播種された細胞は、フレームワーク上若しくは中で増殖するか、又は他の細胞と共同して若しくは共同せずにインビボにおいて組織の交換を確立することを補助する。三次元フレームワーク上での羊膜由来接着細胞又はそれらの共培養物の成長は、例えば、損傷した若しくは罹患した組織の修復のために、インビボで利用可能な三次元組織又はそれらの基礎の形成を生じることが好ましい。例としては、三次元スキャフォールドは、例えば血管修復において使用するために；又は、循環系若しくは冠血管構造の態様で、管様構造を形成するために使用することができる。本発明の一態様に従い、羊膜由来接着細胞又はその共培養物を、接種するか、或いは、スキャフォールド、発泡体又はヒドロゲルなどの、三次元フレームワーク又はマトリクス上に播種する。フレームワークは、概して平たい、一般に円筒状又は管状などの様々な形状に形作ることができるか、又は考慮される補正構造(corrective structure)のために必要であるか若しくは望ましいような完全に自由な形状であることができる。いくつかの実施態様において、羊膜由来接着細胞が三次元構造上で成長するのに対し、他の実施態様においては、該細胞は、単に生存するか、又は死滅さえするが、レシピエントにおける新たな組織の内方成長又は血管形成を刺激若しくは促進する。
本発明の細胞は、培養時は自由に成長させ、培養物から除去し、且つ三次元フレームワーク上に接種することができる。例えば約106〜5×107個細胞/mLの濃度の細胞による三次元フレームワークの接種は、好ましくは比較的短い期間での、三次元支持体の樹立を生じる。さらにいくつかの用途において、望まれる結果に応じて、より多い数又はより少ない数の細胞を使用することが好ましい。
具体的な実施態様において、マトリクスは、その幅が、それが最終的に挿入される管状臓器の内周とほぼ等しい小片(例えば、長方形の形状)に切断することができる。羊膜由来接着細胞は、スキャフォールド上に接種され、且つ液体培地中で浮遊又は懸濁することによりインキュベーションされる。適切なコンフルエンス段階で、該スキャフォールドを、長端を一緒に合わせることにより、チューブに巻き上げる。次いで、適当な直径の好適な材料の糸を用い、2つの端を一緒に縫合することにより継ぎ目を閉鎖することができる。細胞が管腔を閉塞しないように、該管状フレームワークの開放端の一方に、ノズルを取り付けることができる。液体培地を、インキュベーションチャンバーに連結された供給チャンバーからノズルを通して強制的に流し、管状フレームワークの内部を通る流れを作り出すことができる。他方の開放端を、回収チャンバーに繋がる流出口に取り付け、回収チャンバーから供給チャンバーを通って培地を再循環させることができる。インキュベーションが完了したら、チューブを、ノズル及び流出口から取り外す。例えば、国際出願WO 94/25584号を参照されたい。
一般に、下記の方法のいずれかを用い、2つの三次元フレームワークを合わせて本発明のチューブにすることができる。2つ以上の平らなフレームワークを、他方の表面に載せ、一緒に縫合する。得られる2層シートを次に巻き上げ、前述のように一緒に合わせ、縫合する。特定の実施態様において、内側層として働く1つの管状スキャフォールドに、羊膜由来接着細胞を接種し、インキュベーションすることができる。第二のスキャフォールドを、該管状フレームワークの外周よりもわずかに大きい幅を持つ平坦な小片として成長させることができる。適切な成長に到達した後、該平坦なフレームワークで管状スキャフォールドの外側を包み、引き続き平坦なフレームワークの2つの端の継ぎ目を閉鎖し、平坦なフレームワークを内側チューブに縫合する。別の実施態様において、わずかに異なる直径の2つ以上の管状メッシュを、個別に成長させる。より小さい直径を持つフレームワークを、より大きいものの内側に挿入し、縫合する。これらの各方法について、この二重層のチューブに該方法を再度適用することにより、より多くの層を追加することができる。該スキャフォールドは、羊膜由来接着細胞の任意の成長段階で一緒にすることができ、且つ一緒にしたスキャフォールドのインキュベーションを、望ましい場合は継続することができる。
上記と組合せて、本明細書に提供される細胞及び治療用組成物は、埋め込み可能な装置と組合せて使用することができる。例えば羊膜由来接着細胞は、例えば、ステント、人工弁、心室補助装置、Guglielmi脱着可能コイルなどと同時投与することができる。これらの装置はそのような治療を必要とする個体に提供される主要な治療を構成しているので、該細胞などは、埋め込まれた装置の領域での適切な治癒を補助するか、刺激するか、又は促進する支持療法又は二次的治療として使用することができる。本発明の細胞及び治療組成物を使用し、特定の埋め込み可能な装置を前処理し、インビボにおいて使用した際の問題点を最小化することができる。コーティングされた装置を含む、そのような前処理された装置は、それらを受け取る患者による忍容性がより優れ、局所又は全身の感染症、又は例えば血管の再狭窄若しくはさらなる閉塞のリスクを減らすことができる。
（5.9.2 羊膜由来接着細胞により馴化された培地)
羊膜由来接着細胞により馴化されている培地、すなわち、接着細胞により分泌又は排出された1以上の生体分子を含有する培地が、さらに本明細書において提供される。様々な実施態様において、馴化培地は、その中で該細胞が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日間若しくはそれ以上成長している培地、又は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20の集団倍加又はそれ以上の培地を含む。他の実施態様において、馴化培地は、その中で羊膜由来接着細胞が少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％コンフルエンス、又は最大100％コンフルエンスまで成長している培地を含む。そのような馴化培地を使用し、例えば幹細胞、例えば胎盤幹細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、成体幹細胞などの細胞の集団の培養を支援することができる。別の実施態様において、馴化培地は、その中で羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞でない細胞が一緒に培養されている培地を含む。
馴化培地は、本明細書に提供された接着細胞を含むことができる。従って、羊膜由来接着細胞を含む細胞培養物が、本明細書において提供される。具体的な実施態様において、馴化培地は、複数の羊膜由来接着細胞、例えば羊膜由来接着細胞の集団を含む。
(5.10 改変された羊膜由来接着細胞)
(5.10.1 遺伝子改変された羊膜由来接着細胞)
別の態様において、本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、例えば関心対象の核酸若しくはポリペプチドを産生するように、又は例えば、関心対象の核酸若しくはポリペプチドを生成する骨形成原細胞、筋原細胞、周皮細胞、若しくは血管新生細胞などの分化された細胞を生成するように、遺伝子改変されることができる。例えば、羊膜由来接着細胞を改変して、血管新生因子、血管新生誘導分子、可溶性因子及び受容体、又は移動促進（promigratory）分子、例えば、ケモカイン、例えば、間質細胞由来因子1(SDF-1)又はケモカイン受容体を産生することができる。遺伝子改変は、例えば、限定するものではないが、例えば、パピローマウイルスベクター、SV40ベクター、アデノウイルスベクターなどの非組込み複製ベクター；例えば、レトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターなどの組込みウイルスベクター；又は、複製欠損ウイルスベクターを含む、ウイルス-ベースのベクターを用い、達成することができる。DNAを細胞へ導入する他の方法は、リポソームの使用、エレクトロポレーション、粒子銃、直接DNA注入などを含む。
本明細書に提供される接着細胞は、例えば、プロモーター配列若しくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、配列内リボソーム進入部位などの、1以上の好適な発現制御エレメントにより制御されたDNA又はそれとの機能的に関連して制御されたDNAにより形質転換又はトランスフェクトされ得る。そのようなDNAは、選択マーカーを組込んでいることが好ましい。外来DNAの導入後、操作された接着細胞を、例えば、強化培地において成長させ、その後選択培地に交換することができる。一実施態様において、羊膜由来接着細胞を操作するために使用したDNAは、例えば、サイトカイン、増殖因子、分化物質、又は治療的ポリペプチドなどの、関心対象のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。
接着細胞を操作するために使用するDNAは、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞におけるヌクレオチド配列の発現を駆動するために、当該技術分野において公知の任意のプロモーターを含むことができる。例えばプロモーターとしては、CMVプロモーター/エンハンサー、SV40プロモーター、パピローマウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルスプロモーター、エラスチン遺伝子プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、該プロモーターは、該ヌクレオチド配列が、望ましい時のみに発現されるように調節可能である。プロモーターは、誘導性(例えば、メタロチオネイン及びヒートショックタンパク質に関連したもの)又は構成性のいずれかであることができる。
別の具体的な実施態様において、プロモーターは、組織-特異的であるか、又は組織特異性を示す。そのようなプロモーターの例としては、ミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Shaniの文献、1985、Nature, 314:283)(骨格筋)が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書に開示された羊膜由来接着細胞は、そのような細胞の1種以上の遺伝子の発現を「ノックアウト」若しくは「ノックダウン」するように操作するか、又は「ノックアウト」若しくは「ノックダウン」するように他の方法で選択してよい。細胞に本来備わる遺伝子の発現は、例えば、相同組換えなどによる完全な遺伝子の失活による発現の阻害により低下することができる。一実施態様において、例えば、タンパク質の重要な領域をコードしているエキソン、又はその領域に対するエキソン5'は、例えば、標的遺伝子からの正常なmRNAの生成を妨害し且つ該遺伝子の失活を生じるneoなどの、陽性選択マーカーにより妨害される。遺伝子はまた、遺伝子の一部欠失を作製することによるか、又は全遺伝子を欠失することにより失活することもできる。該ゲノム内で遠く離れた標的遺伝子と相同な2つの領域を伴う構築体を用いることにより、これら2つの領域に介在する配列を欠失することができる(Mombaertsらの文献、1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084)。標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、モルホリノ、DNAzyme、低分子干渉RNA、ショートヘアピンRNA、及びリボザイム分子もまた、該接着細胞における標的遺伝子活性のレベルを低下するために使用することができる。例えば、主要組織適合性遺伝子複合体(HLA)の発現を阻害するアンチセンスRNA分子は、免疫反応に関して最も汎用性があることが示されている。3本鎖分子を、標的遺伝子活性のレベルの低下に利用することができる。例えば、引用により本明細書中に組み込まれている、L. G. Davisら編集の文献「分子生物学における基本的方法(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)」、第2版、1994年、Appleton & Lange社、ノーウォーク、Conn.を参照されたい。
具体的な実施態様において、本明細書に開示された羊膜由来接着細胞は、関心対象のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子により遺伝子改変することができ、ここで関心対象のポリペプチドの発現は、外因性因子、例えば、ポリペプチド、小型有機分子などにより制御可能である。関心対象のポリペプチドは、治療用ポリペプチドであることができる。より具体的な実施態様において、関心対象のポリペプチドは、IL-12又はインターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)である。別のより具体的な実施態様において、関心対象のポリペプチドは、インターロイキン-1受容体アンタゴニストとジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の融合物であり、且つ該外因性因子は、葉酸代謝拮抗物質、例えばメトトレキセートである。そのような構築体は、メトトレキセートとの接触時に、IL-1Ra、又はIL-1RaとDHFRの融合物を発現する羊膜由来接着細胞の操作において有用である。そのような構築体は、例えば、関節リウマチの治療において使用することができる。この実施態様において、IL-1RaとDHFRの融合物は、メトトレキセートなどの葉酸代謝拮抗物質への曝露時に、翻訳によりアップレギュレートされる。従って別の具体的な実施態様において、羊膜由来接着細胞を遺伝子操作するために使用される核酸は、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むことができ、ここで該第一及び第二のポリペプチドは、外因性因子の存在下で翻訳によりアップレギュレートされる融合タンパク質として発現される。該ポリペプチドは、一時的に又は長期に(例えば、数週間又は数ヶ月にわたり)発現され得る。そのような核酸分子はさらに、操作された細胞の陽性選択を可能にするか、又は操作された細胞の可視化を可能にするポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。別のより具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は、例えば適切な可視化条件下で蛍光を発するポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ(Luc)をコードしている。より具体的な実施態様において、そのような核酸分子は、IL-1Ra-DHFR-IRES-Lucを含むことができ、ここでIL-1Raはインターロイキン-1受容体アンタゴニストであり、IRESは配列内リボソーム進入部位であり、及びDHFRはジヒドロ葉酸レダクターゼである。
(5.10.2 不死化羊膜由来接着細胞株)
成長促進タンパク質の産生及び/又は活性が外部因子によって調節可能であるように、哺乳動物の羊膜由来接着細胞を、成長促進遺伝子、すなわち、適切な条件下で、トランスフェクトされた細胞の成長を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の好適なベクターによるトランスフェクションによって、条件的に不死化することができる。好ましい実施態様において、成長促進遺伝子は、限定するものではないが、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス、又はヒトパピローマウイルスのE7タンパク質などのオンコジーンである。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、Narushima、M.らによりヒト膵β-細胞株について例示されたようなcre-lox組換え(Nature Biotechnology, 2005, 23(10:1274-1282))を用い不死化することができる。
成長促進タンパク質の外部調節は、外部調節可能なプロモーター、例えば、その活性を、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度又は該細胞と接触する培地の組成を変更することによって制御することができるプロモーターの制御下に成長促進遺伝子を配置することによって達成することができる。一実施態様において、テトラサイクリン(tet)制御遺伝子発現系を利用することができる(Gossenらの文献(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5547-5551, 1992)；Hoshimaruらの文献(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：1518-1523, 1996)を参照されたい)。tetの非存在下で、このベクター内のtet制御性トランス活性化因子(tTA)は、tetオペレーター配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるphCMV*-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌のトランスポゾン-10由来のtet耐性オペロンのリプレッサー(tetR)と単純ヘルペスウイルスのVP16の酸性ドメインの融合タンパク質である。tetの低い、非毒性濃度(例えば、0.01〜1.0μg/mL)は、tTAによるトランス活性化をほぼ完全に消失させる。
一実施態様において、ベクターは、選択マーカー、例えば、薬物耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。細菌のネオマイシン耐性遺伝子(neoR)は、本方法により利用され得るそのようなマーカーの1つである。neoRを有する細胞は、成長培地への、例えば、100〜200μg/mLのG418の添加などの、当業者に公知の手段によって選択することができる。
トランスフェクションは、限定するものではないが、レトロウイルス感染を含む、当業者に公知の種々の手段のいずれかによって達成することができる。一般に、細胞培養物を、ベクターのプロデューサー細胞株から回収される馴化培地とN2補給剤含有DMEM／F12の混合物とのインキュベーションによってトランスフェクトすることができる。例えば、上記のように調製された胎盤細胞培養物を、1容量の馴化培地と2容量のN2補充剤含有DMEM／F12中での約20時間のインキュベーションによって、例えば、5日後にインビトロで感染させることができる。その後、選択マーカーを有するトランスフェクトされた細胞を、上述のように選択することができる。
トランスフェクション後、培養物を、増殖を可能にする、例えば、24時間の間に細胞の少なくとも約30％を倍加させる表面上で継代する。好ましくは、該基材は、ポリオルニチン(10μg/mL)及び/若しくはラミニン(10μg/mL)でコーティングされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基材、ポリリジン／ラミニン基材、又はフィブロネクチンで処理された表面である。その後、培養物に、3〜4日ごとに成長培地を供給し、この成長培地には、1種以上の増殖増強因子が補充されていてもよいし、補充されていなくてもよい。増殖増強因子は、培養物が50％未満のコンフルエントである場合に、成長培地に添加してもよい。
80〜95％コンフルエントになったとき、条件的に不死化された羊膜由来接着細胞株を、標準的な技術を用いて、トリプシン処理などによって継代することができる。約20回目の継代までは、いくつかの実施態様において、選択(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞の場合、G418の添加による)を維持することが有益である。細胞は、長期保存のために液体窒素中で凍結することもできる。
クローン細胞株を、上記のように調製された条件的に不死化された接着細胞株から単離することができる。一般に、そのようなクローン細胞株を、標準的な技術を用いて、例えば、限定希釈によるか、又はクローニングリングを用いて単離し、拡大することができる。一般に、クローン細胞株に、上記のように栄養を与え、それを継代することができる。
クローンであってもよいが、クローンである必要はない条件的に不死化されたヒト羊膜由来接着細胞株は、一般に、分化を促進する培養条件下で成長促進タンパク質の産生及び/又は活性を抑制することによって、分化するように誘導することができる。例えば、成長促進タンパク質をコードする遺伝子が外部調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば培地の温度又は組成を変更して、成長促進遺伝子の転写を抑制することができる。上で論じられているテトラサイクリンで制御される遺伝子発現系については、成長促進遺伝子の転写を抑制するためのテトラサイクリンの添加によって、分化を達成することができる。一般に、分化を開始するのに、4〜5日間の1μg/mLのテトラサイクリンで十分である。さらなる分化を促進するために、追加の薬剤を成長培地に含めてもよい。
(5.11 投与量及び投与経路)
AMDACを必要とする個体へのAMDACの投与は、治療される疾患又は病態に関連した任意の医学的に許容し得る経路によることができる。前述の治療方法の別の具体的な実施態様において、前記AMDACはボーラス注射により投与される。別の具体的な実施態様において、該単離されたAMDACは、静脈内注入により投与される。具体的な実施態様において、該静脈内注入は、約1〜約8時間にわたる静脈内注入である。別の具体的な実施態様において、該単離されたAMDACは頭蓋内投与される。別の具体的な実施態様において、該単離されたAMDACは筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、該単離されたAMDACは腹腔内投与される。別の具体的な実施態様において、該単離されたAMDACは、動脈内投与される。より具体的な実施態様において、 前記単離されたAMDACは虚血の領域内に投与される。他のより具体的な実施態様において、前記単離されたAMDACは、虚血の周辺の領域に投与される。本治療方法の別の具体的な実施態様において、該単離されたAMDACは、筋肉内、皮内、又は皮下投与される。
前述の治療方法の別の具体的な実施態様において、前記AMDACは、該個体へ一度に投与される。別の具体的な実施態様において、前記単離されたAMDACは、該個体へ2回以上に分けて投与される。別の具体的な実施態様において、前記投与は、例えば前記個体1kgにつきAMDACを、約1×104〜1×105個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的な実施態様において、前記投与は、該個体1kgにつき、約1×105〜1×106個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体1kgにつき、約1×106〜1×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体1kgにつき、約1×107〜1×108個の単離された胎盤細胞を投与することを含む。他の具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体1kgにつき、約1×106〜約2×106個の単離された胎盤細胞；前記個体1kgにつき、約2×106〜約3×106個の単離された胎盤細胞；前記個体1kgにつき、約3×106〜約4×106個の単離された胎盤細胞；前記個体1kgにつき、約4×106〜約5×106個の単離された胎盤細胞；前記個体1kgにつき、約5×106〜約6×106個の単離された胎盤細胞；前記個体1kgにつき、約6×106〜約7×106個の単離された胎盤細胞；前記個体1kgにつき、約7×106〜約8×106個の単離された胎盤細胞；前記個体1kgにつき、約8×106〜約9×106個の単離された胎盤細胞；又は、前記個体1kgにつき、約9×106〜約1×107個の単離された胎盤細胞を投与することを含む。別の具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体へ、前記個体1kgにつき、約1×107〜約2×107個の単離された胎盤細胞を投与することを含む。別の具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体へ、前記個体1kgにつき、約1.3×107〜約1.5×107個の単離された胎盤細胞を投与することを含む。別の具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体へ、前記個体1kgにつき、約3×107個までの単離された胎盤細胞を投与することを含む。具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体へ、約5×106〜約2×107個の単離された胎盤細胞を投与することを含む。別の具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体へ、約20mLの溶液中、約150×106個の単離された胎盤細胞を投与することを含む。
具体的な実施態様において、前記投与は、前記個体への約5×106〜約2×107個の単離された胎盤細胞の投与を含み、ここで前記細胞は、10％デキストラン、例えばデキストラン-40、5％ヒト血清アルブミン、及び任意に免疫抑制薬を含有する溶液中に含まれる。別の具体的な実施態様において、前記投与は、約5×107〜3×109個の単離された胎盤細胞を静脈内投与することを含む。より具体的な実施態様において、前記投与は、約9×108個の単離された胎盤細胞又は約1.8×109個の単離された胎盤細胞を静脈内に投与することを含む。別の具体的な実施態様において、前記投与は、約5×107〜1×108個の単離された胎盤細胞を頭蓋内投与することを含む。より具体的な実施態様において、前記投与は、約9×107個の単離された胎盤細胞を頭蓋内投与することを含む。
(5.12 羊膜由来接着細胞の分化)
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、分化することができる。一実施態様において、例えば、該細胞を血管内皮増殖因子(VEGF)と接触することにより、前記細胞が、内皮細胞、筋原細胞、又は周皮細胞の少なくとも1つの特徴を示すのに十分であるように、該細胞は分化される。より具体的な実施態様において、該内皮細胞、筋原細胞又は周皮細胞の特徴は、OCT-4-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である羊膜細胞と比べ増大している、CD9、CD31、CD54、CD102、NG2(神経/グリア細胞抗原2)、又はα平滑筋アクチンの1つ以上の発現である。他のより具体的な実施態様において、内皮細胞、筋原細胞、又は周皮細胞の前記特徴は、OCT-4-、VEGFR2/KDR+、及びVEGFR1/Flt-1+である羊膜細胞と比べ増大している、CD9、CD31、CD54、CD102、NG2(神経/グリア細胞抗原2)、又はα平滑筋アクチンの1つ以上の発現である。
（5.12.1 血管新生の誘導）
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞からの血管新生は、以下の通り達成できる。羊膜由来接着細胞を、例えば、内皮細胞培地、例えば、EGM（登録商標）-2(Lonza社製)又は60% DMEM-LG(Gibco社製)、40% MCDB-201(Sigma社製);2%ウシ胎児血清(Hyclone Labs.社製);1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS);1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA);5x10-9Mデキサメタゾン(Sigma社製);10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社製);上皮成長因子10ng/mL(R&D Systems社製);及び血小板由来成長因子(PDGF-BB)10ng/mL(R&D Systems)を含む培地中で継代数3まで培養する。次いで、細胞を、MATRIGEL（商標）又はコラーゲン-1を含む基材に、例えば、96-ウェルプレート中で、同じ培地又は例えば、ミリリットルあたり約10〜50ngの血管内皮細胞成長因子(VEGF)を含むFBS(0〜5%v/v)を有するDMEMで例えば、ウェルあたり約1.5x104細胞の密度で播種する。培地を週に約2回代えることができる。血管新生は、倍率50×〜100×で顕微鏡により目視で、導管様構造の新芽形成及び管の形成に関して細胞を観察して証拠とする。
（5.12.2心細胞への分化の誘導）
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞の筋原(心筋原)分化は、例えば、心筋細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に細胞を配置することにより達成することができる。好ましい心筋原性培地は、レチノイン酸1μM；塩基性線維芽細胞増殖因子10ng/mL；及び、トランスフォーミング増殖因子β-1、2ng/mL；及び上皮細胞増殖因子、100ng/mLを補充したDMEM/20％CBSを含む。KnockOut Serum Replacement(Invitrogen社、カールスバッド、CA)を、CBSの代わりに使用することができる。或いは、羊膜由来接着細胞は、1〜100、例えば50ng/mLのカルジオトロピン-1を補充したDMEM/20％CBSにおいて、24時間培養することができる。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、タンパク質-不含培地において10〜14日間培養し、5〜7日間、その後例えば1％臍帯血血清を補充した1％HEPES緩衝液中でヒト心筋層を均質化することにより作製したヒト心筋層抽出物で刺激することができる。
分化は、例えばRT/PCRによるか、又は目視できる細胞の拍動により、心臓アクチン遺伝子発現を明らかにすることにより確認することができる。接着細胞が、これらの特徴の1以上を示す場合、該細胞は、心細胞へ分化したと考えられる。
（6. 実施例）
(6.1 実施例1：羊膜からの接着細胞の単離及び拡大)
本実施例は、羊膜由来接着細胞の単離及び拡大を明らかにする。
(6.1.1 単離)
羊膜由来接着細胞は、以下のように羊膜から単離した。羊膜/絨毛膜を胎盤から切除し、羊膜を手作業で絨毛膜から分離した。羊膜を、滅菌PBSによりすすぎ、残留血液、血塊及び他の物質を取り除いた。滅菌ガーゼを使用して、すすぎにより取り除くことができなかったさらなる血液、血塊、又は他の物質を除去し、羊膜を再度PBSによりすすいだ。過剰なPBSを膜から除去し、羊膜を、外科用メスにより、2インチ×2インチ（5.08cm×5.08cm）の切片に切断した。上皮細胞放出のために、滅菌ジャケット付きガラス処理容器を、37℃の循環水浴に、チューブとコネクターを用いて接続することにより処理容器を組み立て、攪拌プレート上に設置した。トリプシン(0.25％、300mL)を、処理容器中37℃に温め；羊膜切片を加えて、羊膜/トリプシン懸濁液を、例えば、100RPM〜150RPMで、37℃で15分間攪拌した。処理容器に隣接する無菌野上に無菌レセプタクルを配置し、レセプタクルに滅菌75μm〜125μmスクリーン(Millipore社、ビレリカ、MA)を挿入することにより、無菌スクリーニングシステムを集成した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移し、羊膜切片を、例えば滅菌ピンセットを用いて、処理容器へ戻し；上皮細胞を含有するトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を、前述のように、再度トリプシン溶液(0.25％)300mLと一緒に攪拌した。スクリーンを、およそ100〜150mLのPBSですすぎ、このPBS溶液を廃棄した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移した。次いで、羊膜切片を処理容器に戻し；上皮細胞を含むトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を再度、前述のように、トリプシン溶液(0.25％)300mLと攪拌した。スクリーンを、およそ100〜150mLのPBSですすぎ、このPBS溶液を廃棄した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移した。次いで、羊膜切片を処理容器に戻し、上皮細胞を含むトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を、PBS/5％FBS(羊膜のPBS/5％FBS溶液に対する容積比1:1)中で37℃でおよそ2〜5分間攪拌し、トリプシンを中和した。新鮮な無菌スクリーンシステムを組み立てた。トリプシンの中和後、処理容器の内容物を新たなスクリーンに移し、羊膜切片を処理容器に戻した。室温で滅菌PBS(400mL)を処理容器に加え、処理容器の内容物をおよそ2〜5分間攪拌した。スクリーンをおよそ100〜150mLのPBSですすいだ。攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移し；処理フラスコを、PBSですすぎ、このPBS溶液を廃棄した。次いで、処理容器を300mLの予め温めたDMEMで満たし、且つ羊膜切片をDMEM溶液に移した。
羊膜由来接着細胞の放出のために、処理した羊膜の膜を、さらに以下のようにコラゲナーゼで処理した。適量のコラゲナーゼ粉末(供給業者から受け取ったコラゲナーゼロットの活性によって変動)をDMEM中に溶解することにより、滅菌コラゲナーゼストック液(500U/mL)を調製した。この溶液を、0.22μmフィルターに通して濾過し、個別の滅菌容器に分注した。CaCl2溶液(0.5mL、600mM)を各100mL投与量に添加し、これらの投与量を凍結した。コラゲナーゼ(100mL)を、処理容器中の羊膜切片に添加し、この処理容器を30〜50分間、又は羊膜消化が目視検査により完了するまで、攪拌した。羊膜消化が完了した後、予め温めた滅菌PBS/5％FBSの100mLを処理容器に添加し、処理容器をさらに2〜3分間攪拌した。攪拌した後、フラスコの内容物を、無菌60μmスクリーンに移し、液体を真空濾過により回収した。処理容器を400mLのPBSですすぎ、PBS溶液を滅菌濾過した。次いで、濾過した細胞懸濁液を300×gで15分間、20℃で遠心分離し、細胞ペレットを、予め温めたPBS/2％FBS(合計およそ10mL)に再懸濁させた。
(6.1.2 樹立)
新たに単離された血管新生羊膜細胞を、60％DMEM-LG(Gibco社)；40％MCBD-201(Sigma社)；2％FBS(Hyclone Labs)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)；10ng/mLリノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)；1n-デキサメタゾン(Sigma社)；100μMアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)；10ng/mL上皮細胞増殖因子(R&D Systems社)；及び、10ng/mL血小板由来増殖因子(PDGF-BB)(R&D Systems社)を含有する成長培地に加え、T-Flask内に、播種密度10,000個細胞/cm2でプレーティングした。その後培養装置を、37℃で、5％CO2、湿度＞90％でインキュベーションした。細胞の接着、成長及び形態を、毎日モニタリングした。非接着細胞及びデブリを、培地交換により除去した。培地交換は、1週間に2回行った。典型的線維芽細胞様/紡錘体形の形態を持つ接着細胞が、最初のプレーティング後数日で出現した。コンフルエンスが40％〜70％に達した時点で(最初のプレーティング後4〜11日目)、これらの細胞を、5分間、室温で(37℃)でのトリプシン処理(0.25％トリプシン-EDTA)により収集した。PBS-5％FBSによる中和後、細胞を200〜400gで、5〜15分間、室温で遠心分離し、その後成長培地中に再懸濁させた。この時点で、AMDACS株は、初代継代時にうまく樹立されたとみなした。初代継代した羊膜由来接着細胞を、場合によっては、凍結保存又は拡大した。
(6.1.3 培養手順)
羊膜由来接着細胞を前述の成長培地において培養し、且つ適切な組織培養物を処理する培養装置中で、密度2000〜4000個/cm2で播種した。次に培養装置を、37℃、5％CO2、湿度＞90％でインキュベーションした。培養時に、AMDACは、接着し、増殖した。細胞の成長、形態、及びコンフルエンスは、毎日モニタリングした。培養が5日目以上に延びた場合は、培地交換は、新鮮な栄養素を補給するために、週2回行った。コンフルエンスが40％〜70％に達した時点で(播種後3〜7日目)、これらの細胞を、5分間、室温で(37℃)でのトリプシン処理(0.05％〜0.25％トリプシン-EDTA)により収集した。PBS-5％FBSによる中和後、細胞を200〜400gで、5〜15分間、室温で遠心分離し、その後成長培地中に再懸濁させた。
この様式で単離され且つ培養されたAMDACは、典型的にはプレーティングした1×106個細胞から、33530±15090個コロニー-形成単位(線維芽細胞)(CFU-F)を生成した。
(6.2 実施例2：羊膜由来接着細胞の表現型特徴)
(6.2.1 遺伝子及びタンパク質発現プロファイル)
本実施例は、特徴的細胞表面マーカー、mRNA、及びプロテオミクス発現を含む、羊膜由来接着細胞の表現型の特徴を説明する。
(試料調製)：羊膜由来接着細胞を、実施例1記載のように得た。継代数6の細胞を、およそ70％コンフルエンスまで、上記の実施例1に記載した成長培地において成長させ、トリプシン処理し、PBSで洗浄した。NTERA-2細胞(アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、ATCC番号CRL-1973)を、4.5g/Lグルコース、2mMグルタミン及び10％FBSを含有するDMEMにおいて成長させた。有核細胞のカウントを行い、最低2×106〜1×107個の細胞を得た。次に細胞を、QIAshredderを利用する、Qiagen RNeasyキット(Qiagen社、バレンシア、CA)を用いて溶解し、溶解液を得た。次にRNA単離を、Qiagen RNeasyキットを用いて行った。RNA量及び品質を、Nanodrop ND1000分光光度計を用いて、反応物あたり25ng/μLのRNAと決定した。Applied Biosystems社(フォスターシティ、CA)のHigh Capacity cDNAアーカイブキットを用い、cDNA反応物を調製した。リアルタイムPCR反応を、Applied Biosystems社のTAQMAN(登録商標)ユニバーサルPCRマスターミックスを用い実行した。反応は、Applied Biosystems社7300リアルタイムPCRシステムにおいて、40サイクル、標準モードで試行した。
(試料の分析及び結果)：リアルタイムPCR法及び特異的TAQMAN(登録商標)遺伝子発現プローブ及び/又はTAQMAN(登録商標)ヒト血管新生アレイ(Applied Biosystems社)を用い、細胞を、幹細胞関連マーカー、血管新生マーカー、及び心筋原性マーカーの発現について特徴付けた。結果は、関連細胞対照と比較した関心対象の遺伝子の相対発現、又は遍在性に発現されたハウスキーピング遺伝子(例えばGAPDH、18S、又はGUSB)と比較した関心対象の遺伝子の相対発現(デルタCt)のいずれかとして表した。
羊膜由来接着細胞は、様々な幹細胞関連遺伝子、血管新生遺伝子、及び心筋原性遺伝子を発現し、NTERA-2細胞と比べ、OCT-4の発現が相対的に存在しないことを示した。表1は、選択された血管新生遺伝子、心筋原性遺伝子、及び幹細胞遺伝子の発現をまとめ、図1は、幹細胞関連遺伝子POU5F1(OCT-4)、NANOG、SOX2、NES、DNMT3B、及びTERTのAMDACにおける発現の欠如を示す。
表1:RT-PCRにより決定された羊膜由来接着細胞の遺伝子発現プロファイル
Figure 2014520857
Figure 2014520857
Figure 2014520857
「mRNA」の欄は、特定のマーカーのmRNAの有無が各場合に決定されたことを示す。
別の実験において、AMDACは、さらに、アリール炭化水素受容体核移行因子2(ARNT2)、神経増殖因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン3(NT-3)、NT-5、低酸素-誘導因子1α(HIF1A)、低酸素-誘導タンパク質2(HIG2)、ヘムオキシゲナーゼ(脱環化)1(HMOX1)、細胞外スーパーオキシドディスムターゼ[Cu-Zn](SOD3)、カタラーゼ(CAT)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFB1)、トランスフォーミング増殖因子β1受容体(TGFB1R)、及び肝細胞増殖因子受容体(HGFR/c-met)の遺伝子を発現することがわかった。
(6.2.2 羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのフローサイトメトリー)
羊膜由来接着細胞の表現型マーカーを定量する方法としてフローサイトメトリーを使用し、該細胞の正体を定義した。細胞試料を、凍結ストックから得た。解凍前及び試薬調製時には、細胞バイアルをドライアイス上に維持した。その後、試料を、37℃水浴を用いて急速に解凍した。凍結前の細胞のカウントを、初回解凍後の細胞数に左右される希釈の計算に用いた。簡単に述べると、クライオバイアルを、およそ30秒間穏やかに攪拌しながら37℃の水浴中で解凍した。解凍直後に、冷(2〜8℃)解凍溶液(2.5％アルブミン及び5％Gentran 40を含むPBS)およそ100〜200μLを、クライオバイアルに添加し、混合した。穏やかに混合した後、クライオバイアル中の総容量を等容量の冷(2〜8℃)解凍溶液が入った15mLコニカルチューブに移した。細胞をコニカルチューブ内で、400gで5分間、室温で遠心分離し、その後上清を取り除いた。残存する容積を、ピペットにより測定し(概算)；残存容積及び細胞ペレットを、PBS中1％FBSの中に、室温で再懸濁させ、細胞濃度250×103個細胞/100μL緩衝液を達成した。例えば、1×106個細胞ならば、1％FBSの400μL中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、予めラベルを付けた5mL FACSチューブ(Becton Dickinson(BD)社、フランクリンレーク、NJ)に入れた。各一次抗体アイソタイプに関して、細胞懸濁液100μLを、1個のアイソタイプ対照チューブに入れアリコートとした。表現型分析の前に、全ての抗体の濃度を、良好なシグナル対ノイズ比、及び可能な4log動作範囲にわたるCD抗原の適正な検出を実現するように最適化した。各試料を染色するために使用した各アイソタイプ及び試料抗体の容積を決定した。アイソタイプチューブ及び試料チューブ中の抗体の量(μg)を標準化するために、各抗体の濃度を、下記式で計算した：（1／実際の抗体濃度(μg/μL)）×（2.5×105個細胞についての所望の最終的抗体量(μg)）＝添加した抗体のμL数。アイソタイプ及び試料の両方の抗体のマスター混合物は、各チューブに適量の抗体を添加して作製した。細胞を、室温、暗所で、15〜20分間染色した。染色後、各試料中の未結合の抗体を、遠心分離(400g×5分間)により除去し、それに続いて、1％FBS/PBS(室温)2mLを用いて洗浄し、その後、室温で1％FBS/PBSの150μL中に再懸濁させた。次に試料を、製造業者の指示に従って使用するために準備したBecton Dickinson FACSCalibur、FACSCantoI、又はBD FACSCantoIIフローサイトメーターにおいて分析した。多重-パラメーターのフローサイトメトリーデータセット(側方散乱光(SSC)、前方散乱光(FSC)、及び積分された蛍光プロファイル(FL))を、実行時(on-the-fly)計器補正パラメーターを設定することなく取得した。補正パラメーターは、FACSDivaソフトウェアを製造業者の指示に従い用いて取得した後、決定した。これらの計器設定を、各試料に適用した。これらの試験に使用したフルオロフォア複合体は、アロフィコシアニン(APC)、AlexaFluor 647(AF647)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE)、及びペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)であり、これらは全てBD Biosciences社から入手した。表2に、血管新生マーカーを含む、選択された細胞-表面マーカーの発現をまとめる。
表2:フローサイトメトリーにより決定される羊膜由来接着細胞における細胞表面マーカー発現
Figure 2014520857
 「免疫局在化フローサイトメトリー」の欄は、特定のマーカーの有無が、免疫局在化、特にフローサイトメトリーにより決定されたことを示す。
別の実験において、AMDAC細胞を、抗-ヒトCD49f(クローンGoH3、フィコエリトリン-複合型；BD Pharmingen社、パーツ番号555736)により標識し、フローサイトメトリーにより分析した。抗-CD49fで標識されたAMDACのおよそ96％(すなわち、CD49f+であった)。
別の実験においてさらに、AMDACは、免疫局在化によりCD49a、CD106、CD119、CD130、c-met(肝細胞増殖因子受容体；HGFR)、CXCケモカイン受容体1(CXCR1)、PDGFRA、及びPDGFRBを発現することが、免疫局在化により認められた。AMDACはまた、免疫局在化により、CD49e、CD62E、線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR3)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー12A(TNFRSF12A)、インスリン-様増殖因子1受容体(IGF-1R)、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、ケモカイン受容体1(CCR1)、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、上皮細胞増殖因子受容体(EGF-R)、インスリン受容体(CD220)、インターロイキン受容体4(IL4-R；CD124)、IL6-R(CD126)、TNF-R1a及び1b(CD120a、b)、並びにerbB2/Her2の発現を欠くことが認められた。
(6.2.3 羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための免疫組織化学(IHC)/免疫蛍光化学(IFC))
継代数6の羊膜由来接着細胞を、4-ウェルチャンバースライド上でおよそ70％コンフルエンスまで成長させ、各々4％ホルマリン溶液で30分間固定した。固定後、スライドをPBSで2回、5分間すすいだ。次いで、スライドを、二次抗体としての同じ宿主由来の10％正常血清、2×カゼイン、及び0.3％ Triton X100と一緒に、PBS中で加湿チャンバーにおいて、室温で、20分間インキュベーションした。過剰な血清を吸い取って除き、スライドを、加湿チャンバー内で一次抗体(ヤギポリクローナルIgG(Santa Cruz社；サンタクルーズ、CA)と一緒にインキュベーションした。インキュベーションの時間及び温度は、使用した抗体に関する最適条件を選択することにより決定した。概して、インキュベーション時間は、37℃で1〜2時間、又は4℃で一晩であった。次いで、スライドを、PBSで3回、各5分間すすぎ、一次抗体の宿主に対する蛍光-複合した抗-免疫グロブリン二次抗体(ウサギ抗-ヤギ抗体(Santa Cruz社))と一緒に、加湿チャンバー内、室温で、20〜30分間インキュベーションした。その後、スライドをPBSで3回、各5分間すすぎ、核の対比染色のために、DAPI VECTASHIELD(登録商標)(Vector Labs社)マウンティング溶液を利用し、カバースリップを据え付けた。細胞染色は、Nikon蛍光顕微鏡を利用して視覚化した。全ての画像を、対応するアイソタイプ(ヤギIgG(Santa Cruz社))のバックグラウンドに対し規準化した等しい露光時間で撮影した。表3は、羊膜由来接着細胞による血管新生タンパク質の発現の結果をまとめる。
表3:羊膜由来接着細胞上の血管新生マーカーの存在又は非存在
Figure 2014520857
羊膜由来接着細胞は、表3に示されたタンパク質の一つである血管新生マーカー腫瘍内皮マーカー7(TEM-7)を発現した。図2参照。
(6.2.4 羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための膜プロテオミクス)
(膜タンパク質精製)：継代数6の細胞を、成長培地において、およそ70％コンフルエンスまで成長させ、トリプシン処理し、PBSで洗浄した。次いで、細胞を、細胞溶解する前に、プロテアーゼインヒビターカクテル(P8340、Sigma Aldrich社、セントルイス、MO)を含有する溶液と一緒に15分間インキュベーションした。次に細胞を、10mM HCl溶液の添加により溶解し(従って界面活性剤の使用を回避)、400gで10分間遠心分離し、ペレットとし、核を除去した。核除去後(post-nuclear)の上清を超遠心分離チューブに移し、T-1270ローター(Thermo Fisher Scientific社、アッシュビル、NC)を装備したWX80超遠心分離機を用い、100,000gで150分間遠心分離し、膜タンパク質ペレットを作製した。
(プロテオリポソームの生成、固定化、及び消化)：膜タンパク質ペレットを、Nanoxis緩衝液(10mMトリス、300mM NaCl、pH8)を用い、数回洗浄した。膜タンパク質ペレットをNanoxis緩衝液1.5mL中に懸濁させ、その後VIBRA-CELL(商標)VC505超音波処理装置(Sonics & Materials社、ニュータウン、CT)を用い、氷上で20分間、チップ超音波処理した(tip-sonicated)。プロテオリポソームのサイズを、FM1-43色素(Invitrogen社、カールスバッド、CA)による染色、及び蛍光顕微鏡による目視により、決定した。プロテオリポソーム懸濁液のタンパク質濃度を、BCAアッセイ(Thermo Scientific社)により決定した。次にプロテオリポソームを、標準ピペットチップを使用し、LPI(商標)Flow CELL(Nanoxis AB社、ゴーゼンバーグ、スウェーデン)上に注入し、1時間固定させた。固定化後、連続洗浄工程を実行し、トリプシン5μg/mL(Princeton Separations社、アデルフィ、NJ)を、LPI(商標)Flow Cell上に直接注入した。このチップを、37℃で一晩インキュベーションし、トリプシン性ペプチドを、LPI(商標)チップから溶出させ、その後、Sep-Pakカートリッジ(Waters社、ミルフォード、MA)を用い脱塩した。
(LTQ線形イオントラップLC/MS/MS分析)：各トリプシン性消化物試料を、軸方向脱溶媒和(axial desolvation)真空支援ナノキャピラリーエレクトロスプレーイオン化(ADVANCE)源(Michrom Bioresources社)に直接インターフェイス接続された、0.2mm×150mm、3μm、200 ÅMAGIC C18カラム(Michrom Bioresources社、アーバン、CA)上で、180分勾配(緩衝液A：水、0.1％ギ酸；緩衝液B：アセトニトリル、0.1％ギ酸)を使用し、分離した。ADVANCE源は、従来型nanoESIと同等の感度を達成する一方、かなり高い流量3μL/分で操作される。溶出されたペプチドを、各々のフルスキャン質量スペクトルに従い10データ-依存式MS/MSスキャンを利用したLTQ線形イオントラップ質量分析計(Thermo Fisher Scientific社、サンノゼ、CA)において分析した。各生物学的試料について、7回の反復分析のデータセットを収集した。
(バイオインフォマティクス)：各細胞株について収集した7回の反復分析のデータセットに対応する7つの生ファイルを、Sorcerer Solo(商標)ワークステーション(Sage-N Research社、サンノゼ、CA)上でSEQUESTアルゴリズムを実行することにより、IPIヒトデーターベースに対する1項目検索として、検索した。ペプチド質量許容差1.2 amuを特定し、メチオニン酸化を示差的修飾として特定し、且つカルバミドメチル化を静的修飾として特定した。Trans-Proteomic Pipeline(TPP)のスキャフォールドソフトウェアを実行し、膜プロテオミクスデータを検索し且つ解析した。タンパク質が、ペプチド確率95％、タンパク質確率95％及び1つの独自ペプチドを持つと確定された場合に、該タンパク質は分析物とみなした。膜プロテオミクスデータセット間の比較は、研究室で開発したカスタムPerlスクリプトを用いて、実行した。
(結果)：表4に示したように、羊膜由来接着細胞は、様々な血管新生マーカー及び心筋原性マーカーを発現した。
表4: 羊膜由来接着細胞により発現された心筋原性又は血管新生マーカー
Figure 2014520857
(6.2.5 羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのセクレトームプロファイリング)
(タンパク質アレイ)：継代数6の羊膜由来接着細胞を、成長培地において同じ細胞数でプレーティングし、4日後に馴化培地を回収した。細胞-馴化培地における多数の血管新生サイトカイン/増殖因子の同時定性分析を、RayBiotech社の血管新生タンパク質アレイ(ノルクロス、GA)を用い実行した。簡単に述べると、タンパク質アレイを、1×ブロッキング緩衝液(Ray Biotech社)2mL中、室温で30分間インキュベーションし、膜をブロックした。引き続きブロッキング緩衝液をデカンテーションし、膜を、試料1mL(各細胞により4日間馴化した成長培地)と一緒に、室温で1〜2時間インキュベーションした。次に試料をデカンテーションし、膜を、1×洗浄緩衝液I(Ray Biotech社)2mLにより、室温で振盪しながら、5分間3回洗浄した。その後膜を、1×洗浄緩衝液II(Ray Biotech社)2mLにより、室温で振盪しながら、5分間2回洗浄した。その後希釈したビオチン-複合抗体(Ray Biotech社)1mLを、各膜に添加し、室温で1〜2時間インキュベーションし、且つ洗浄緩衝液により前述のように洗浄した。次に希釈したHRP-複合ストレプトアビジン(2mL)を、各膜に添加し、これらの膜を室温で2時間インキュベーションした。最後に、膜を再度洗浄し、ECL(商標)検出キット(Amersham社)により仕様に従いインキュベーションし、結果を、Kodak Gel Logic 2200 Imaging Systemを用いて視覚化し分析した。AMDACによる様々な血管新生タンパク質の分泌を、図3A〜3Dに示す。
(ELISA)：細胞-馴化培地における単独の血管新生サイトカイン／増殖因子の定量分析を、R&D Systems社(ミネアポリス、MN)から市販されているキットを用いて行った。簡単に述べると、ELISAアッセイを、製造業者の指示に従って行い、馴化培地中の各血管新生増殖因子の量を、1×106個細胞に規準化した。羊膜由来接着細胞(n＝6)は、細胞100万個につきVEGFおよそ4500pg、及び細胞100万個につきIL-8およそ17,200pgを示した。
表5:血管新生マーカーのELISA結果
Figure 2014520857
別の実験において、AMDACはまた、アンジオポエチン-1、アンジオポエチン-2、PECAM-1(CD31；血小板内皮細胞接着分子)、ラミニン、フィブロネクチンも分泌することを確認した。
(6.2.6 AMDACマイクロRNA発現は血管新生活性を確認する)
本実施例は、AMDACが、特定のマイクロ-RNA(miRNA)を比較的高レベルで、及び特定の他のmiRNAを比較的低レベルで発現し、それらの各々が、骨髄由来間葉系幹細胞よりも、血管新生機能に相関することを明らかにしている。
前血管新生miR-296が、増殖因子受容体のレベルを調節することにより、血管新生機能を調節することは知られている。例えば、内皮細胞中のmiR-296は、肝細胞増殖因子-調節性チロシンキナーゼ基質(HGS)mRNAを直接標的化することにより、血管新生に著しく寄与し、これはHGSレベルの減少、それによる増殖因子受容体VEGFR2及びPDGFRbのHGS-媒介性分解の低下に繋がる。Wurdingerらの文献、Cancer Cell, 14:382-393 (2008)を参照されたい。加えて、miR-15b及びmiR-16は、血管新生に関与した重要な前血管新生因子であるVEGFの発現を制御し、且つmiR-15b及びmiR-16の低酸素-誘導性減少は、前血管新生サイトカインであるVEGFの増加に寄与することが示されている。Kuelbacherらの文献、Trends in Pharmacological Sciences、29(1):12-15 (2007)を参照されたい。
AMDACは、上記実施例1に記載のように調製した。AMDAC及びBM-MSC細胞(比較対照として使用)に、MIRVANA(商標)miRNA単離キット(Ambion社、カタログ番号1560)を使用し、マイクロRNA(miRNA)調製を施した。細胞0.5×106〜1.5×106個を、変性溶解緩衝液中で破壊した。次に、試料に、酸性-フェノール＋クロロホルム抽出を施し、小型RNA種に関して高度に濃縮されたRNAを単離した。100％エタノールを添加し、この試料を25％エタノールとした。この溶解液／エタノール混合物が、ガラスファイバーフィルターを通過する際に、大型RNAは固定され、小型RNA種は濾液に回収された。次いで、濾液のエタノール濃度を55％まで増加させ、この混合物を第二のガラスファイバーフィルターを通過させ、そこで小型RNAを固定させた。このRNAを洗浄し、低イオン強度溶液で溶出した。回収された小型RNAの濃度及び純度を、260nm及び280nmでその吸光度を測定することにより決定した。
AMDACは、以下の血管新生miRNAを発現することが認められた：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b(血管新生miRNAクラスター17-92のメンバー)、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。AMDACはまた、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)と比べ、高レベルの以下の血管新生miRNAを発現することがわかった：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92(血管新生miRNAクラスター17-92のメンバー)、miR-296。これらの結果は、AMDACが、VEGFR2/KDRを高レベルで発現するという知見とよく相関している(上記参照)。逆に、AMDACは、BM-MSCと比べた場合に、下記血管新生miRNAを低レベルで発現することが認められた：miR-20a、miR-20b、(血管新生miRNAクラスター17-92のメンバー)、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。miR-15b及びmiR-16の低下した発現は、AMDACにおいて認められたVEGFの高レベルの発現と相関した。
（6.3 実施例3:AMDACを使用する放射線障害の治療）
この試験の目的は、照射24時間後に投与されたAMDAC又は参照陽性対照(Neupogen（登録商標）)のいずれかによる処置がある場合とない場合の、セシウム源を使用するγ照射（Cs-γ照射）の単一急性全身被曝の後のマウスのLD60/60を評価することであった。AMDACによる生存の改善の比較分析を、非照射ビヒクル対照群と比較して評価した。
この試験において、4群のそれぞれに29匹のマウスを割り当てた。29匹のマウスのうち9匹を、4日目、15日目、及び29日目(3匹のマウス/日）の仮の剖検のサテライト群に選んで、29匹のマウスをさらに分けた。このサテライト群のマウスを、血液学的分析用の血液の回収及び可能性のある将来のPCR評価用の組織の回収のために確立した。残りの20匹のマウスを主群と称し、60日目の剖検に割り当てた。第1群はCs-γ照射によって処置されなかったが、残りの群は全て(すなわち第2群、第3群、及び第4群)、0日目に940cGyの単一照射線量を受けた。照射後にビヒクル、細胞、又は陽性対照により処置された群には、以下の通り単回静脈内投与、単回皮下投与、又は反復iv投与を与えた:第1群及び第2群にはビヒクルのみを与えた;反復用量投与を第3群に与えたが、200μg/kgのNeupogen（登録商標）(sc)を1〜5日目に与えた;第4群には、1.0×106の生存能力のある総有核細胞(TNC)でAMDAC(iv)を1日目に与えた。1日目は、放射線の投与後24時間を表す。表6を参照されたい。
表6:群ごとの投与スキーム
Figure 2014520857
第1群の主動物又はサテライト動物に割り当てられたマウスに病的状態又は死亡は全く見られなかった。第3群では3匹の動物が死に;早期に屠殺された瀕死のマウスは、第2群及び第4群でそれぞれ1匹及び2匹だった。同様に、サテライトマウスに死亡が見られ、第2群、第3群、及び第4群で、それぞれ3匹、3匹、及び1匹のマウスが死亡しているのが見つかった。投与量処置及び/又は放射線に帰せられる臨床徴候には、主群とサテライト群のいずれか又は両方にみられた背を丸めるポーズ、低体温症、痩せ、活動低下、呼吸困難、及び逆立てた毛皮の所見があった。これらの所見は、毒物学的に限定しており(toxicologically limiting)、放射線のみ又は投与量処置との組み合わせの結果であると考えられた。これらの観察にもかかわらず、試験した4つの群の間の統計的に有意な生存率の比較を、以下に議論のとおり首尾よく試験した。
統計的に有意な平均体重の減少が、放射線処置を受けた群全てにみられた。主群及びサテライト群における体重減少は放射線後に観察され、少なくとも11日目まで、最長60日目まで続き、いくつかの群ではその後の日に散発的な減少が見られた。
上述の背を丸めるポーズ、低体温症、痩せ、活動低下、呼吸困難、逆立てた毛皮の臨床徴候、及び体重減少は全て、毒性学的に限定していると思われる投与量及び/又は放射線処置に帰せられた。サテライト動物の血球免疫レベルの分析により、放射線に被曝した動物の好中球減少症が確認された。
各群の動物の試験の間の生存曲線を図4に示す。生存率の統計的分析を2種の方法で評価した:第一に、処置群(第3群及び第4群）を非処置（ナイーブ）の第1群と比較し、第二に処置群を第2群と比較したが、それは940cGy Cs-γ照射のみに暴露され、照射対照群を表した。
ビヒクル対照の第1群を、放射線のみを受け取った第2群と比べると、生存率に統計的に有意な差を示した(p＜0.001)。940cGyの単一放射線量は、照射後30日で第2群の動物の50%にとって致死的であった（図4参照）。
ビヒクル対照の第1群動物を、照射後24時間にNeupogen(登録商標)で処置された第3群の動物と比較すると、やはり生存率に統計的に有意な差を示した(p＜0.001)。Neupogen(登録商標)(フィルグラスチム)は、顆粒球の増殖及び分化を刺激するために使用され、好中球減少症の治療に使用される顆粒球コロニー-刺激因子(G-CSF)アナログである(例えば、Beveridgeらの文献、1988、Cancer Invest. 16 (6):366-73参照)。照射後5日間毎日Neupogen(登録商標)により、照射されたマウスを処置したにもかかわらず、940 cGyの単一放射線量は、照射後〜20日で第2群の動物の50%に致死的であった(図4参照)。むしろ、Neupogen(登録商標)で処置されたマウスは、照射されたがその後の処置を受けなかったマウス（すなわち、第2群のマウス；図4参照）と同等の生存率を示した。
対照的に、第4群の動物は、放射線に被曝し、次いで放射線の24時間後AMDACにより処置されたが、ビヒクル対照群動物(第1群)と比較して、生存率に統計的に有意な差を示さなかった。図4に示されるとおり、LD50で放射線に被曝したマウスにAMDACの単一投与量を投与すると、動物の80%超の生存を促進するのに十分であった。さらに、放射線被曝の後AMDACにより処置された動物(すなわち第4群の動物)は、照射されたがその後の処置を受けなかった第2群動物とは統計的に有意な生存率の差も示した(p=0.003)。
結論として、致死線量の放射線に被曝した後マウスにAMDACを投与すると、80%超の生存率を増進するが、放射線のみに暴露されたマウス、又は放射線に暴露された後Neupogen(登録商標)により処置されたマウスは50%未満の生存率を示した。
（6.4 実施例4:AMDACは造血再構成を誘導する）
この試験の目的は、上記実施例3に記載された試験を確認し、さらに詳しく調べることである。治療効能は、単一線量のγ-照射を受け取った後マウスへの2種の濃度のAMDACの単回静脈内投与量投与の後で評価した。放射線が誘発する好中球減少症及び免疫応答を含むいくつかの他のエンドポイントに対するAMDAC処置の影響も評価した。
（6.4.1 方法）
（6.4.1.1 実験群及び投与プロトコル）
この試験は、4つの試験群(1-4)からなっており、それをさらに主な下位群とサテライトの下位群に分けた。第1群の動物は放射線に被曝しないが、単回投与量のビヒクル緩衝液を受け取った。第1群では、4匹の動物を主な下位群に、8匹の動物をサテライト下位群に割り当てた。第2〜4群では、それぞれ20匹の動物を主な下位群に、8匹の動物をそれぞれサテライト下位群に割り当てた。第2〜4群の動物は、0日目に、940cGyの単一線量のγ-照射を受けた。照射された第2群の動物は、単回投与量のビヒクル緩衝液を受け取った;第3及び第4群の照射された動物は、放射線処置のおよそ24時間後（1日目）、それぞれAMDACの総有核細胞(TNC)の1回の静脈内(iv）投与量を投与された。表7参照。主な群の生存している動物を、60日目に剖検した;第1群〜4群のサテライト群のそれぞれ4匹の動物を、14日目又は30日目に剖検した。
表7:群ごとの投与スキーム
Figure 2014520857
（6.4.1.2 血液回収及び分析）
イソフルラン麻酔下でマウスの後眼窩洞から、或いは尾静脈から血液を回収した。血液学的試料を、K3-EDTAを抗凝血剤として使用して回収した。抗凝血剤は、回収された血清化学試料には使用しなかった。最低500μlの全血を、終末期血液(terminal bleeds)のために回収した。血液の回収は、主の動物下位群(第1〜4群)から60日目に1回、サテライト動物下位群(第1〜4群)から14日目及び30日目(4匹の動物/群/日)であった。回収した全血は、以下の血液学的分析に使用した:ヘマトクリット値(HCT)、ヘモグロビン(HGB)、赤血球数(RBC)、赤血球分布幅(RDW)、白血球数(WBC)、WBC百分率及び絶対数(好中球絶対数(ANS)、棹状核好中球絶対数(ANB)、棹状核好中球百分率(PNB)、リンパ球絶対数(ALY)、リンパ球百分率(PLY)、単球絶対数(AMO)、単球百分率(PMO)、好酸球絶対数(AEO)、好酸球百分率(PEO)、好塩基球絶対数(ABA)、及び好塩基球百分率(PBA))、平均赤血球ヘモグロビン(MCH)、平均赤血球容積(MCV)、平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCC)、血小板数(PLC)、平均血小板容積(MPV)、及び網状赤血球数(絶対数、REA、及び百分率、RET)。
（6.4.1.3 FACS）
サテライト群の動物を、蛍光活性化細胞選別(FACS)用の骨髄の回収に使用した。
両大腿骨をFACS分析用に回収した。大腿骨を回収し、大腿骨の内容物を、〜25Gの針を持つ1ccのシリンジを使用して、〜300μlのPBSを含む事前にラベル付けしたクライオバイアル(又は等価物)に流しこむことにより骨髄(BM)を単離した。回収した骨髄試料を、およそ1〜2時間以内に移してFACS免疫表現型検査分析の可能性を確立するまで、氷(wet ice)の上に配置した。骨髄細胞を、マウス造血系統(CD3、B220、CD11b、Ly-6c、Ter119)のマウス細胞決定子、c-kit(CD117)及びSca-1に関して、これらのマーカーに対するモノクローナル抗体を使用して、フローサイトメトリーにより分析した。この分析は、試験の14日目及び30日目にサテライト下位群の動物に実施した。標識抗体の略称は以下のとおりである:アロフィコシアニン(APC)、フィコエリトリン(PE)、及びシアニン(Cy)。染色緩衝液は、ウシ血清アルブミン(BSA;1%)をPBSに加えて調製した。以下の表8に記載の蛍光標識モノクローナル抗体を使用して、細胞を96-ウェルプレート中で染色した。
表８:
Figure 2014520857
染色のために、細胞を、丸底96-ウェルマイクロタイタープレートに播いた(1×106細胞/ウェル)。該プレートを300×gで5分間4℃で遠心分離し、上清をデカンテーションすることにより、細胞を冷染色緩衝液で洗浄した(100μl/ウェル;PBS中1%BSA)。マウスIgG(5μg)を各ウェルに加え、2〜8℃で5〜7分間インキュベートした後、抗体混合物(ウェルあたり40μl抗体混合物)を各ウェルに加えた。30〜35分の冷蔵後、染色された細胞を冷染色緩衝液(150〜200μl/ウェル)で2回洗浄した。染色後、LSR-IIフローサイトメーター(Becton Dickinson社製)を使用して試料を分析した。
（6.4.2 結果）
（6.4.2.1 生存試験）
各群内の動物の60日間の試験にわたる生存率曲線を図5に示す。図5に示されるとおり、60日目まで生存したマウスのパーセンテージは、第1〜4群のそれぞれで100%、50%、40%、及び75%であった。第2群(940cGy Cs-γ)の動物に観察された動物の死亡割合は、11、15、18、22、及び29日目までにそれぞれ1、4、3、1、及び1匹の死亡であった;第3群(940cGy Cs-γ及び1.25×106 TNC AMDAC)では、8、11、15、18、22、及び25日目までにそれぞれ1、1、2、3、3、及び2匹の死亡であった;第4群(940cGy Cs-γ及び2.5×106 TNC AMDAC)では、15及び25日目までにそれぞれ4及び1匹の死亡であった。
生存率の統計分析を2種の方法で評価し、第一に、第2〜4群を非照射ビヒクル対照群(第1群)と比較し、次いで、処置群第3群及び第4群を、動物が放射線に被曝してビヒクルのみで処置された第2群と比較した。統計分析は、第3群と第4群の間でも評価したが、それらの動物は異なる用量のAMDACを受け取った(それぞれ、1.25×106TNC及び2.5×106TNC)。
ビヒクル対照第1群にいる動物の数が少ないので、第1群と比べる場合どの群の生存率データの間にも統計的な差を決定しなかった。しかし、図5は、940cGyの単一放射線量が、照射後29日目までの第2群のマウスの50%に致死的であることを明らかに示し、上記実施例3に記載の結果と一致する。さらに、図5は、1.25×106のAMDACで処置されたマウス(第3群)の生存率が、第2群の処置されていないマウスの生存率と同等であるが、より高い投与量のAMDAC(すなわち2.5×106)を受け取ったマウスは、照射されたがその後に処置を受けた第2群のマウスより良好な生存率を示した。
（6.4.2.2 病理学的分析）
14日目及び30日目のサテライト動物の血液学的パラメーターの評価を比較した。第2〜4群のそれぞれは、第1群に比べた場合、ヘマトクリット値(HCT)、ヘモグロビン(HGB)、赤血球(RBC)、白血球(WBC)、好中球絶対数(ANS)、リンパ球絶対数(ALY)、血小板数(PLC)、網状赤血球絶対数(REA)、及び網状赤血球百分率(RET)に統計的に有意な減少を示した。ALY及びPLCを除き、14日目に減少した全パラメーターは、30日目までにビヒクル対照レベルと同等であった。
第2群に得られた血液学的分析の結果を、第3群及び第4群(放射線被曝の後異なる投与量のAMDACにより処置された群)で得られた結果と比較した。特定のパラメーターを比較した場合、有意に異なる結果が観察された。具体的には、第4群の動物は、14日目で、第2群に観察されたHCT、HGB、及びRBC値と比べて、これらのレベルに統計的に有意な増加を示した。図6A〜Cを参照されたい。30日目までには、該値は第2群と同等であった。
（6.4.2.3 FACS結果）
ネズミの骨髄系統陰性、C-kit+/Sca-1+細胞集団(LSK細胞)のFACS分析を、14日目及び30日目に第1〜4群のサテライト動物に実施した。図7Aを参照されたい。この集団は、通常、造血幹細胞及び初期多系統(primitive multilineage)始原細胞中に高度に富化している。予想通り、造血幹細胞及び初期始原細胞(HSC及びHPPC)の頻度は、試験した両時点で、照射されない対照群（第1群）に比べて、照射された対照群（第2群）で大幅に減少した。具体的には、図7Aに示されるとおり、放射線に被曝しなかった第1群マウスの試験された細胞の6.38%がC-kit+/Sca-1+である一方で、第2群（放射線被曝）マウスの試験された細胞のわずか0.0574%がC-kit+/Sca-1+であった。やはり図7Aに示されるとおり、AMDAC-処置マウス(第3及び4群)は、第2群のマウスのそのような細胞のレベルに比べて、はるかに高いレベルのC-kit+/Sca-1+細胞を有した。1.25×106AMDAC(第3群)で処置されたマウスの試験された細胞の1.89%はC-kit+/Sca-1+であり、2.5×106AMDAC(第4群)で処置されたマウスの試験された細胞の8.33%がC-kit+/Sca-1+であった。実際に、放射線被曝の後に、より高い投与量のAMDACで処置されたマウスは、放射線に被曝しなかったマウス（第1群）と同等の数のC-kit+/Sca-1+細胞を有した。このデータは図7Bで強められるが、該図は、第一の時点で（照射の後14日）、第2群のビヒクル処置された照射された動物に比較して、有意に高い頻度のHSC及びHPPCが第4群(AMDAC-処置マウス)に検出されたことを示す。
（6.4.3 結論）
放射線の被曝の後のAMDACの投与は、長期の生存を促進する。さらに、そのような投与は、血液学的パラメーターに有意で有益な変化を起こす。これらの知見は、AMDAC処置が骨髄抑制の重症度を低減でき、それが、放射線の致死的な被曝の後でAMDAC-処置マウスに観察された生存に寄与し得ることを示す。さらに、FACSの結果は、内因性造血幹細胞及び始原細胞の頻度と、照射された対照動物に比較したAMDACの高投与量に観察される高い生存率との直接的な相関を表す。内因性幹細胞に対するAMDACの観察される効果は、内因性造血幹細胞修復の誘導と一致するが、抗アポトーシス効果とは一致せず、その理由は、療法が放射線被曝後24時間に投与され、それが細胞保護剤の効能のウィンドウの外だからである。そのため、該データは、造血再構成を伴う機構によりAMDACが放射線障害を治療することを示す。
(等価物)：
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書で引用されており、それらの開示は、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。

Claims (64)

  1. 放射線に被曝した個体を治療する方法であって、該個体に、治療上有効な量の単離された羊膜由来接着細胞(AMDAC)を投与することを含み、該細胞が組織培養プラスチックに接着し、該細胞がRT-PCRにより決定可能なOCT-4-(オクタマー結合タンパク質4)である、前記方法。
  2. 前記放射線が電離放射線である、請求項１記載の方法。
  3. 前記放射線が、β線、γ線、又はX-線である、請求項１記載の方法。
  4. 前記放射線がα線である、請求項１記載の方法。
  5. 前記放射線が中性子線である、請求項１記載の方法。
  6. 前記放射線が0.01mSv〜0.1mSv(0.001レム〜0.01レム)の単一線量である、請求項１記載の方法。
  7. 前記放射線が1mSv〜10mSv(0.1レム〜1.0レム)(0.001Gy〜0.01Gy)の単一線量である、請求項１記載の方法。
  8. 前記放射線が10mSv〜100mSv(1レム〜10レム)(0.01Gy〜0.1Gy)の単一線量である、請求項１記載の方法。
  9. 前記放射線が100mSv〜1000mSv(10レム〜100レム)(0.1Gy〜1.0Gy)の単一線量である、請求項１記載の方法。
  10. 前記放射線が1000mSv〜2000mSv(100レム〜200レム)(1Gy〜2Gy)の単一線量である、請求項１記載の方法。
  11. 前記放射線が2000mSv〜3000mSv(200レム〜300レム)(2Gy〜3Gy)の単一線量である、請求項１記載の方法。
  12. 前記放射線が3000mSv〜4000mSv(300レム〜400レム)(3Gy〜4Gy)の単一線量である、請求項１記載の方法。
  13. 前記放射線が5000mSv〜10000mSv(500レム〜1000レム)(5Gy〜10Gy)の単一線量である、請求項１記載の方法。
  14. 前記放射線が10000mSv〜100000mSv(1000レム〜10000レム)(10Gy〜100Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  15. 前記放射線が0.01mSv〜0.1mSv(0.001レム〜0.01レム)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  16. 前記放射線が1mSv〜10mSv(0.1レム〜1.0レム)(0.001Gy〜0.01Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  17. 前記放射線が10mSv〜100mSv(1レム〜10レム)(0.01Gy〜0.1Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  18. 前記放射線が100mSv〜1000mSv(10レム〜100レム)(0.1Gy〜1.0Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  19. 前記放射線が1000mSv〜2000mSv(100レム〜200レム)(1Gy〜2Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  20. 前記放射線が2000mSv〜3000mSv(200レム〜300レム)(2Gy〜3Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  21. 前記放射線が3000mSv〜4000mSv(300レム〜400レム)(3Gy〜4Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  22. 前記放射線が5000mSv〜10000mSv(500レム〜1000レム)(5Gy〜10Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  23. 前記放射線が10000mSv〜100000mSv(1000レム〜10000レム)(10Gy〜100Gy)の慢性被曝である、請求項１記載の方法。
  24. 前記慢性被曝が1〜6日にわたる、請求項１５〜２３のいずれか一項記載の方法。
  25. 前記慢性被曝が7〜13日にわたる、請求項１５〜２３のいずれか一項記載の方法。
  26. 前記慢性被曝が14〜27日にわたる、請求項１５〜２３のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記慢性被曝が28〜56日にわたる、請求項１５〜２３のいずれか一項記載の方法。
  28. 前記個体が、前記放射線の被曝の結果として急性放射線症候群又は急性放射線症候群の症状を発したか、又は発しそうである、請求項１記載の方法。
  29. 前記個体が、前記投与の時点で、急性放射線症候群の1つ以上の症状をまだ発していない、請求項１記載の方法。
  30. 前記1つ以上の症状が、悪心、嘔吐、下痢、発熱、及び/又は頭痛の1つ以上を含む、請求項２８記載の方法。
  31. 前記1つ以上の症状が、紫斑病、衰弱、疲労、感染症、脱毛症、被曝した組織の水泡形成若しくは壊死、及び/又は出血を含む、請求項２８記載の方法。
  32. 前記1つ以上の症状が、神経障害、認知機能障害、失調、振戦及び/又は発作を含む、請求項２８記載の方法。
  33. 前記1つ以上の症状が白血球減少症を含む、請求項２８記載の方法。
  34. 前記個体が、該個体の体に接触しない源からの放射線に被曝する、請求項１記載の方法。
  35. 前記個体が、該個体の体に接触する放射線源の結果として放射線に被曝する、請求項１記載の方法。
  36. 前記個体が、該個体が放射線源を吸入又は摂取した結果として放射線に被曝する、請求項1記載の方法。
  37. 前記投与が、前記被曝の96時間以内に行われる、請求項1記載の方法。
  38. 前記投与が、前記被曝の72時間以内に行われる、請求項1記載の方法。
  39. 前記投与が、前記被曝の48時間以内に行われる、請求項1記載の方法。
  40. 前記投与が、前記被曝の24時間以内に行われる、請求項1記載の方法。
  41. 前記細胞がRT-PCRにより決定可能なHLA-G-である、請求項１記載の単離された細胞。
  42. 前記細胞が、さらに、フローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+である、請求項1記載の単離された細胞。
  43. 前記AMDACが、OCT-4-、HLA-G-、及びCD49f+である、請求項３記載の単離された細胞。
  44. 前記AMDACが、フローサイトメトリーにより決定可能なCD90+、CD105+、又はCD117-である、請求項1記載の単離された細胞。
  45. 前記AMDACが、フローサイトメトリーにより決定可能なCD90+、CD105+、及びCD117-である、請求項４４記載の単離された細胞。
  46. 前記AMDACが、RT-PCRにより決定されるOCT-4-及びHLA-G-であり、フローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である、請求項４５記載の単離された細胞。
  47. 前記AMDACが、免疫局在化により決定可能なVEGFR1/Flt-1+(血管内皮細胞成長因子受容体1)及びVEGFR2/KDR+(血管内皮細胞成長因子受容体2)である、請求項１記載の単離された細胞。
  48. 前記AMDACが、免疫局在化により決定可能なCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(アンジオテンシン-I-変換酵素、ACE)、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1つ以上である、請求項１記載の単離された細胞。
  49. 前記AMDACが、免疫局在化により決定可能なCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である、請求項１記載の単離された細胞。
  50. 前記細胞が免疫局在化により決定可能なVE-カドヘリン-である、請求項１記載の単離された細胞。
  51. 前記AMDACが、さらに、免疫局在化により決定可能なCD105+及びCD200+に対して陽性である、請求項１記載の単離された細胞。
  52. 前記AMDACが、50ng/mLのVEGFに7日間曝露された後、免疫局在化により決定可能なCD34を発現しない、請求項１記載の単離された細胞。
  53. 請求項１記載のAMDACを含む細胞の単離された集団であって、該集団中の少なくとも50%の細胞が請求項１記載の細胞である、前記集団。
  54. 前記集団中の少なくとも80%の細胞が請求項１記載のAMDACである、請求項５３記載の単離された細胞集団。
  55. 前記集団中の少なくとも90%の細胞が請求項１記載のAMDACである、請求項５４記載の単離された細胞集団。
  56. 請求項１又は４１〜５２のいずれか一項記載のAMDACを含む組成物。
  57. 前記集団が単離された第二の種類の細胞をさらに含み、該集団が、羊膜、羊膜の一部、又は羊膜のホモジネートでない、請求項５３記載のAMDACを含む単離された細胞集団。
  58. 前記第二の種類の細胞が、胚性幹細胞、血球、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨髄由来の間葉系間質細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、軟骨細胞、神経芽細胞、筋細胞、内皮細胞、血管芽細胞、内皮始原細胞、周皮細胞、心筋細胞、筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、又は胚性幹細胞に似るように操作された細胞である、請求項５７記載の単離された細胞集団。
  59. 前記第二の種類の細胞が、前記集団の少なくとも10%の細胞を構成する、請求項５７又は５８記載の単離された細胞集団。
  60. 前記第二の種類の細胞が、前記集団の少なくとも25%の細胞を構成する、請求項５７又は５８記載の単離された細胞集団。
  61. 前記第二の種類の細胞が、造血幹細胞又は始原細胞である、請求項５７又は５８記載の単離された細胞集団。
  62. 前記造血幹細胞又は始原細胞がCD34+細胞である、請求項６１記載の単離された集団。
  63. 前記AMDACが、組織培養プラスチックに接着し;該細胞が、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定されるCD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり;該AMDACが
    (a)免疫局在化により決定可能なCD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、若しくはVEGFR2/KDR(CD309)の１つ以上を発現し;
    (b)免疫局在化により決定可能なCD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、若しくはVE-カドヘリンの発現を欠き、又はRT-PCRにより決定可能なSOX2の発現を欠き;
    (c)ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、若しくはVEGFR2/KDRのmRNAを発現し;
    (d)タンパク質類CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-マイクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM17、アンジオテンシノゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、アクチビン受容体IIB型前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、星状細胞、ミオシン結合タンパク質C、若しくはミオシン重鎖、非筋細胞A型の１つ以上を発現し;
    (e)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、若しくはガレクチン-1を、AMDACが培養されている培地に分泌し;
    (f)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、若しくはmiR-296を、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞より高レベルで発現し;
    (g)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、若しくはmiR-16を、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞より低レベルで発現し;
    (h)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、若しくはmiR-16を発現し;或いは、
    (i)21%のO2下でのCD202b、IL-8、若しくはVEGFの発現に比べて、約5%未満のO2中で培養された場合にCD202b、IL-8、若しくはVEGFを増加したレベルで発現する、請求項１記載の方法。
  64. 前記AMDACが、RT-PCRにより決定されるOCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定可能なCD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり;該AMDACが
    (a)免疫局在化により決定可能なCD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、及び/若しくはVEGFR2/KDR(CD309)を発現し;
    (b)免疫局在化により決定可能なCD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、及び/又はVE-カドヘリンの発現を欠き、且つ／又はRT-PCRにより決定可能なSOX2の発現を欠き;
    (c)ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、及び/若しくはVEGFR2/KDRのmRNAを発現し;
    (d) CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-マイクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM17、アンジオテンシノゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、アクチビン受容体IIB型前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア繊維酸性タンパク質、星状細胞、ミオシン結合タンパク質C、及び/若しくはミオシン重鎖、非筋細胞A型の１つ以上を発現し;
    (e)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、及びガレクチン-1の1つ以上を、AMDACが培養されている培地に分泌し;
    (f)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及び/若しくはmiR-296を、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞より高レベルで発現し;
    (g)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及び/若しくはmiR-16を、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞より低レベルで発現し;
    (h)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及び/若しくはmiR-16を発現し;且つ、
    (i)21%のO2下でのCD202b、IL-8、及び/若しくはVEGFの発現に比べて、約5%未満のO2中で培養された場合にCD202b、IL-8、及び/若しくはVEGFを増加したレベルで発現する、請求項６３記載の方法。
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