TW202035685A - 組合癌症免疫療法 - Google Patents

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Abstract

本文提供用於動態控制及靶向癌症之多種免疫抑制機制的方法及組合物。一些態樣提供經工程改造以產生多種各自調節腫瘤之不同免疫抑制機制之效應分子的細胞，以及使用該等細胞治療諸如卵巢癌、乳癌或結腸癌之癌症的方法。

Description

組合癌症免疫療法
每年美國有超過22,000例新卵巢癌病例及超過14,000例死亡(Siegel RL等人 (2016) CA Cancer J Clin 66(1):7-30)，據估計每年醫療負擔超過$600M (Dizon D MJ (2010) Gynecol Oncol 116(3))。諸如化學療法(例如卡鉑(carboplatin)/順鉑(cisplatin)及/或太平洋紫杉醇(paclitaxel))之習知方法常常無法治癒卵巢癌。大約70%患者在進行第一線化學療法後未實現症狀緩解，且40%-50%症狀緩解之患者會在三年內復發。
諸如乳癌及結腸癌之其他癌症之治療分別產生85%及65%之五年存活率。療法常常包括侵入性手術與化學療法之組合。
在一些實施例中，本文提供一種基於細胞之組合免疫療法，其用於靶向治療癌症，諸如卵巢癌、乳癌、結腸癌、肺癌及胰臟癌。此組合免疫療法依賴於能夠在腫瘤內及/或附近(「腫瘤微環境(TME)」)進行多因子調節的經工程改造之細胞迴路。儘管組合免疫療法之進展令人興奮，但部分因為以下挑戰，其抗癌功效已受到限制。難以同時遞送多種療法來實現最大功效且不引起顯著副作用。在臨床試驗中亦難以確定多個全身投與及/或局部注射之療法的適當給藥及時間選擇。
然而，本文提供之組合免疫療法係腫瘤特異性且有效的，但限制全身毒性。此組合免疫療法將多個免疫調節效應分子自單一遞送媒劑遞送至腫瘤微環境。對遞送媒劑之設計進行優化，以提高在癌症療法中之整體功能，包括(但不限於)優化啟動子、連接子、信號肽以及多個免疫調節效應分子之次序。
有利地，本發明之細胞迴路在間葉幹細胞(MSC)中進行工程改造，其能夠選擇性地歸巢至腫瘤(包括癌轉移)，能夠產生促炎性/免疫刺激性分泌蛋白質組且在一定條件下產生消炎分泌蛋白質組，且低免疫原性的。此等特徵尤其能夠使其用於例如同種異體細胞療法，且無顯著之安全問題、副作用或排斥反應。
已經日益認識到，腫瘤為腫瘤細胞與周圍基質之間複雜的相互作用，周圍基質包括細胞外基質、癌症相關之基質細胞(MSC及纖維母細胞)、腫瘤血管及免疫系統。TME經由靶向患者之先天性及適應性免疫系統的多種機制抑制抗腫瘤免疫反應。舉例而言，腫瘤可補充及誘導T調控細胞，T調控細胞藉由加工諸如CCL22之特定趨化介素而抑制習知T細胞之抗腫瘤活性。腫瘤亦可表現抑制T細胞及NK細胞活性之分子，諸如免疫檢查點，諸如PD-L1。因此，靶向單一路徑可能不足以實現穩固的針對實體腫瘤之功效。
本發明涵蓋之效應分子的非限制性實例包括細胞介素、抗體、趨化介素、核苷酸、肽、酶及溶瘤病毒。舉例而言，MSC可經工程改造以表現(且通常分泌)以下效應分子中之至少一種、兩種、三種或更多種：IL-12、IL-16、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、IL-21、OX40-配位體、CD40L、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗TGFβ抗體、抗TNFR2、MIP1α (CCL3)、MIP1β (CCL5)、CCL21、CpG寡去氧核苷酸及抗腫瘤肽(例如具有抗腫瘤活性之抗微生物肽，參見例如Gaspar, D.等人Front Microbiol . 2013; 4: 294；Chu, H.等人PLoS One. 2015; 10(5): e0126390，以及網站：aps.unmc.edu/AP/main.php)。
本文提供一種經工程改造之細胞，其包含：a)啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。在一些態樣中，該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
在一些態樣中，細胞為間葉幹細胞(MSC)。在一些態樣中，細胞為幹細胞。在一些態樣中，細胞為免疫細胞。在一些態樣中，細胞為天然殺手(NK)細胞。在一些態樣中，細胞為NKT細胞。在一些態樣中，細胞為先天淋巴樣細胞。在一些態樣中，細胞為腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。在一些態樣中，細胞為肥大細胞。在一些態樣中，細胞為嗜伊紅白血球。在一些態樣中，細胞為嗜鹼性球。在一些態樣中，細胞為單核球。在一些態樣中，細胞為巨噬細胞。在一些態樣中，細胞為嗜中性白血球。在一些態樣中，細胞為骨髓細胞。在一些態樣中，細胞為樹突狀細胞。在一些態樣中，細胞為T細胞。在一些態樣中，細胞為CD8+ T細胞。在一些態樣中，細胞為CD4+ T細胞。在一些態樣中，細胞為細胞毒性T淋巴球(CTL)。在一些態樣中，細胞為病毒特異性T細胞。在一些態樣中，細胞為γ-δ T細胞。在一些態樣中，細胞為T調控細胞。在一些態樣中，細胞為B細胞。
在一些態樣中，啟動子包含外源性啟動子多核苷酸序列。在一些態樣中，啟動子包含內源性啟動子。在一些態樣中，啟動子可操作地連接於表現盒，以使得多核苷酸能夠轉錄為包含式S1-E1-L-S2-E2之單一多核苷酸。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列與第一效應分子及第二效應分子轉譯為不同的多肽可操作地相關聯。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼2A核糖體跳躍標籤。在一些態樣中，2A核糖體跳躍標籤係選自由以下組成之群：P2A、T2A、E2A及F2A。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼T2A核糖體跳躍標籤。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼內部核糖體進入位點(IRES)。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼可裂解多肽。在一些態樣中，可裂解多肽包含弗林蛋白酶(Furin)識別多肽序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列進一步編碼包含Gly、包含Ser或包含Gly-Ser之多肽序列，例如Gly-Ser-Gly多肽序列Gly-Ser-Gly多肽序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向。
在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼第二啟動子，其中該啟動子可操作地連接於表現盒，以使得包含式S1-E1之第一多核苷酸能夠得以轉錄，其中該第二啟動子可操作地連接於表現盒，以使得包含式S2-E2之第二多核苷酸能夠得以轉錄，且其中第一多核苷酸及第二多核苷酸為不同的多核苷酸。在一些態樣中，啟動子及第二啟動子為相同的。在一些態樣中，啟動子及第二啟動子為不同的。
在一些態樣中，該經工程改造之細胞相對於需要治療性治療之個體而言為HLA型。在一些態樣中，經工程改造之細胞為人類細胞。在一些態樣中，人類細胞為自個體，例如將接受細胞之個體分離的細胞。在一些態樣中，分離之細胞自由以下組成之群的組織分離：骨髓、脂肪組織、臍帶、胎肝、肌肉及肺組織。在一些態樣中，工程改造之細胞為培養細胞。
在一些態樣中，經工程改造之MSC包含包括細胞標記物CD105+、CD73+及CD90+之細胞標記物表型。在一些態樣中，細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。在一些態樣中，經工程改造之MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II類HLA-之細胞標記物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。在一些態樣中，細胞標記物表型藉由或已經藉由流動式細胞量測術來測定。
在一些態樣中，經工程改造之細胞包含T細胞。在一些態樣中，經工程改造之細胞包含NK細胞。在一些態樣中，經工程改造之細胞包含NKT細胞。
在一些態樣中，細胞標記物表型進一步包含包括在經工程改造之細胞中表現之第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子的同源受體或同源受體配位體的細胞標記物。在一些態樣中，受體係選自由以下組成之群：IL12RB1、IL12RB2、CCL7及其組合。
在一些態樣中，啟動子及/或第二啟動子包含組成型啟動子。在一些態樣中，組成型啟動子係選自由以下組成之群：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb及hUBIb。在一些態樣中，啟動子包含SFFV啟動子。在一些態樣中，啟動子及/或第二啟動子包含誘導型啟動子。在一些態樣中，誘導型啟動子係選自由以下組成之群：minP、NFkB反應元件、CREB反應元件、NFAT反應元件、SRF反應元件1、SRF反應元件2、AP1反應元件、TCF-LEF反應元件啟動子融合物、缺氧反應元件、SMAD結合元件、STAT3結合位點、誘導分子反應型啟動子及其串聯重複序列。
在一些態樣中，第一信號肽或第二信號肽分別包含相對於第一效應分子或第二效應分子而言為天然的天然信號肽。在一些態樣中，第一信號肽或第二信號肽分別包含相對於第一效應分子或第二效應分子而言為非天然的非天然信號肽。在一些態樣中，非天然信號肽係選自由以下組成之群：IL12、IL2、最佳化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶(Gaussia luciferase)、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白(azurocidin preprotein)、骨結合素(osteonectin)、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素(osteoprotegerin)、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1 (serpin E1)、GROα、CXCL12及IL21。
在一些態樣中，第一信號肽及第二信號肽為相同的。在一些態樣中，編碼第一信號肽之多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。在一些態樣中，第一分泌多肽為人類IL12信號肽。
在一些態樣中，編碼第二信號肽之多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。在一些態樣中，第二分泌多肽為人類IL21信號肽。
在一些態樣中，第一效應分子係獨立地選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶。
在一些態樣中，第二效應分子係選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶。在一些態樣中，第一效應分子及第二效應分子之治療類別為不同的。
在一些態樣中，第一效應分子及/或第二效應分子為經修飾之效應分子。在一些態樣中，第一效應分子及/或第二效應分子經修飾以包含細胞膜繫栓域。在一些態樣中，細胞膜系拴域包含跨膜-細胞內域或跨膜域。在一些態樣中，細胞膜系拴域包含細胞表面受體或其細胞膜結合部分。在一些態樣中，經修飾之效應分子為包含細胞表面受體或其細胞膜結合部分之融合蛋白。在一些態樣中，經修飾之效應分子進一步包含介於效應分子與細胞膜系拴域之間的連接子。在一些態樣中，當表現時，經修飾之效應分子系拴至經工程改造之細胞之細胞膜。
在一些態樣中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干擾素及干擾素-γ。在一些態樣中，IL12細胞介素為IL12p70融合蛋白。在一些態樣中，趨化介素係選自由以下組成之群：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合蛋白、CCL19、CXCL9及XCL1。在一些態樣中，生長因子係選自由以下組成之群：Flt3L及GM-CSF。在一些態樣中，共活化分子係選自由以下組成之群：4-1BBL及CD40L。在一些態樣中，腫瘤微環境調節劑係選自由以下組成之群：腺苷去胺酶、TGFβ抑制劑、免疫檢查點抑制劑、VEGF抑制劑及HPGE2。在一些態樣中，TGFβ抑制劑係選自由以下組成之群：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗體、TGFb-TRAP及其組合。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體。在一些態樣中，VEGF抑制劑包含抗VEGF抗體、抗VEGF肽或其組合。
在一些態樣中，第一效應分子及第二效應分子為人類來源效應分子。
在一些態樣中，第一效應分子包含介白素12 (IL12)，例如呈二聚體形式之p35及p40，在本領域中一般稱為IL-12p70。在一些態樣中，第一效應分子包含IL12p70融合蛋白。在一些態樣中，IL12p70融合蛋白為人類IL12p70融合蛋白。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12包含SEQ ID NO: 137中所示之p35次單元。在一些態樣中，人類IL12包含SEQ ID NO: 137中所示之p40次單元。
在一些態樣中，第二效應分子包含CCL21a。在一些態樣中，CCL21a為人類CCL21a。在一些態樣中，第二效應分子包含IL7。在一些態樣中，IL7為人類IL7。在一些態樣中，第二效應分子包含IL21。在一些態樣中，IL21為人類IL21。
在一些態樣中，表現盒進一步包含包括編碼第三效應分子之多核苷酸序列的E3。在一些態樣中，第三效應分子包含Flt3L。在一些態樣中，第三效應分子包含抗PD1。舉例而言，抗PD1可為抗PD1抗體。在一些態樣中，表現盒進一步包含包括編碼第四效應分子之多核苷酸序列的E4。在一些態樣中，第四效應分子包含腺苷去胺酶。在一些態樣中，第三效應分子包含腺苷去胺酶。在一些態樣中，第三效應分子包含CD40L。在一些態樣中，第三效應分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。在一些態樣中，第三效應分子包含XCL1。
在一些態樣中，第二效應分子包含Flt3L。在一些態樣中，第二效應分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。在一些態樣中，第二效應分子包含抗PD1。在一些態樣中，第二效應分子包含CD40L。
在一些態樣中，第一效應分子包含干擾素-β且第二效應分子包含Flt3L。
在一些態樣中，編碼第一效應分子之多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。在一些態樣中，編碼第二效應分子之多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。
在一些態樣中，經工程改造之細胞包含編碼啟動子及表現盒之多核苷酸序列。在一些態樣中，外源性多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 144中所示之序列。
在一些態樣中，外源性多核苷酸序列整合至經工程改造之細胞之基因組中。在一些態樣中，外源性多核苷酸序列包含一或多個病毒載體多核苷酸序列。
在一些態樣中，一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子或腺病毒多核苷酸序列。
在一些態樣中，表現盒在E2之後進一步包含額外外源性多核苷酸序列，該外源性多核苷酸序列包含下式，自5’至3’定向，該式包含：(L-S-E)X 其中S包含編碼信號肽之多核苷酸序列，E包含編碼效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，X = 1至20，其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，且其中對於各X而言，對應的信號肽與該效應分子可操作地相關聯。
本文亦提供一種包含構築體之經工程改造之細胞，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
本文亦提供一種包含構築體之經工程改造之細胞，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞為間葉幹細胞(MSC)。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
本文亦提供一種包含構築體之經工程改造之細胞，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞間葉幹細胞(MSC)，其中MSC包含包含CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。在一些態樣中，細胞標記物表型藉由或已經藉由流動式細胞量測術來測定。
本文亦提供一種包含構築體之經工程改造之MSC，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之MSC包含包括CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。在一些態樣中，細胞標記物表型藉由或已經藉由流動式細胞量測術來測定。
本文亦提供一種包含構築體之經工程改造之細胞，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。在一些態樣中，細胞為間葉幹細胞(MSC)。在一些態樣中，細胞為天然殺手(NK)細胞。在一些態樣中，細胞為NKT細胞。在一些態樣中，細胞為先天淋巴樣細胞。在一些態樣中，細胞為腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。在一些態樣中，細胞為肥大細胞。在一些態樣中，細胞為嗜伊紅白血球。在一些態樣中，細胞為嗜鹼性球。在一些態樣中，細胞為單核球。在一些態樣中，細胞為巨噬細胞。在一些態樣中，細胞為嗜中性白血球。在一些態樣中，細胞為骨髓細胞。在一些態樣中，細胞為樹突狀細胞。在一些態樣中，細胞為T細胞。在一些態樣中，細胞為CD8+ T細胞。在一些態樣中，細胞為CD4+ T細胞。在一些態樣中，細胞為細胞毒性T淋巴球(CTL)。在一些態樣中，細胞為病毒特異性T細胞。在一些態樣中，細胞為γ-δ T細胞。在一些態樣中，細胞為T調控細胞。在一些態樣中，細胞為B細胞。在一些態樣中，細胞為人類細胞。
在一些態樣中，該經工程改造之細胞相對於需要治療性治療之個體而言為HLA型。在一些態樣中，經工程改造之細胞為人類細胞。在一些態樣中，人類細胞為自個體，例如將接受細胞之個體分離的細胞。在一些態樣中，分離之細胞自由以下組成之群的組織分離：骨髓、脂肪組織、臍帶、胎肝、肌肉及肺組織。在一些態樣中，工程改造之細胞為培養細胞。
在一些態樣中，經工程改造之MSC包含包括細胞標記物CD105+、CD73+及CD90+之細胞標記物表型。在一些態樣中，細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。在一些態樣中，經工程改造之MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II類HLA-之細胞標記物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。在一些態樣中，細胞標記物表型藉由或已經藉由流動式細胞量測術來測定。
在一些態樣中，經工程改造之細胞包含T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞或T調控細胞。在一些態樣中，經工程改造之細胞包含NK細胞。在一些態樣中，經工程改造之細胞包含NKT細胞。在一些態樣中，經工程改造之細胞包含單核球細胞。在一些態樣中，經工程改造之細胞包含巨噬細胞。在一些態樣中，經工程改造之細胞包含TIL。
在一些態樣中，外源性多核苷酸序列整合至經工程改造之細胞之基因組中。在一些態樣中，外源性多核苷酸序列包含一或多種病毒載體多核苷酸序列。在一些態樣中，一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子或腺病毒多核苷酸序列。在一些態樣中，一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒多核苷酸序列。
在一些態樣中，細胞分泌各效應分子。在一些態樣中，第一效應分子以相對於第二效應分子之分泌高10倍的比率分泌。
在一些態樣中，細胞進一步包含抗原識別受體。在一些態樣中，抗原識別受體識別選自由以下組成之群的抗原：5T4、ADAM9、ADGRE2、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、鈣黏附蛋白(Cadherin) 3、鈣黏附蛋白6、CCR1、CCR4、CD117、CD123、CD131、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD244、CD30、CD300LF、CD33、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CD93、CEA、CEACAM5、緊密連接蛋白(Claudin) 18.2、CLEC12A、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、EMB、ENPP3、EpCAM、EphA2、Ephrin A4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRα、FRb、FLT3、GAPT、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-1RAP、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、整合素aV、KIT、L1CAM、LAMP1、LAT2、Lewis Y、LeY、LILRA2、LILRB2、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、間皮素(Mesothelin)、MLC1、MS4A3、MUC1、MUC16、MUC1C、MYADM、NaPi2B、結合素(Nectin) 4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、卵巢素(Ovarin)、P-鈣黏附蛋白(P-cadherin)、pan-Erb2、PIEZO1、PRAM1、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLC22A16、SLC17A9、SLITRK6、SPNS3、SSTR2、STEAP1、存活素(Survivin)、TDGF1、TIM1、TROP2、VSTM1及WT1。
在一些態樣中，抗原識別受體包含抗原結合域。在一些態樣中，抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。在一些態樣中，抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。在一些態樣中，scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些態樣中，VH及VL藉由肽連接子相隔。在一些態樣中，scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。
在一些態樣中，抗原識別受體是嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。在一些態樣中，抗原識別受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，CAR包含一或多個細胞內信號傳導結構域，且該一或多個細胞內信號傳導結構域係選自由以下組成之群：CD3δ鏈細胞內信號傳導結構域、CD97細胞內信號傳導結構域、CD11a-CD18細胞內信號傳導結構域、CD2細胞內信號傳導結構域、ICOS細胞內信號傳導結構域、CD27細胞內信號傳導結構域、CD154細胞內信號傳導結構域、CD8細胞內信號傳導結構域、OX40細胞內信號傳導結構域、4-1BB細胞內信號傳導結構域、CD28細胞內信號傳導結構域、ZAP40細胞內信號傳導結構域、CD30細胞內信號傳導結構域、GITR細胞內信號傳導結構域、HVEM細胞內信號傳導結構域、DAP10細胞內信號傳導結構域、DAP12細胞內信號傳導結構域及MyD88細胞內信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR包含跨膜結構域，且跨膜結構域係選自由以下組成之群：CD8跨膜結構域、CD28跨膜結構域、CD3δ鏈跨膜結構域、CD4跨膜結構域、4-1BB跨膜結構域、OX40跨膜結構域、ICOS跨膜結構域、CTLA-4跨膜結構域、PD-1跨膜結構域、LAG-3跨膜結構域、2B4跨膜結構域及BTLA跨膜結構域。在一些態樣中，CAR包含介於抗原結合域與跨膜結構域之間的間隔區。
本文亦提供一種細胞群體，該細胞群體包含本文所述的任一經工程改造之細胞。在一些態樣中，細胞群體富集該工程改造之細胞。
在一些態樣中，在經工程改造之細胞中表現的第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子促進生長、活力或生長及活力相對於群體中不表現第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子之細胞增加。在一些態樣中，第一效應分子為IL12或IL12p70融合蛋白。在一些態樣中，富集經工程改造之細胞的細胞群體表現IL12受體β1或增加其水平，表現IL12受體β2或增加其水平，或表現IL12受體β1及IL12受體β2或增加其水平。在一些態樣中，第二效應分子為IL21。在一些態樣中，第二效應分子為CCL21。在一些態樣中，富集經工程改造之細胞的細胞群體表現CCL21受體或增加其水平。在一些態樣中，CCL21受體為CCR7。
本文亦提供一種刺激個體中細胞介導之對腫瘤細胞之免疫反應的方法，該方法包括向具有腫瘤之個體投與治療有效劑量的本文所述之任何經工程改造之細胞或細胞群體。
本文亦提供一種刺激(例如誘導)免疫反應之方法，該方法包括向個體投與治療有效劑量的本文所述之任何經工程改造之細胞或細胞群體。
本文亦提供一種提供個體抗腫瘤免疫之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效劑量的本文所述之任何經工程改造之細胞或細胞群體。
本文亦提供一種治療患有癌症之個體之方法，該方法包括向具有腫瘤之個體投與治療有效劑量的本文所述之任何經工程改造之細胞或細胞群體。
本文亦提供一種減小個體中之腫瘤體積之方法，該方法包括向具有腫瘤之個體投與治療有效劑量的本文所述之任何經工程改造之細胞或細胞群體。
在一些態樣中，經工程改造之細胞源自於個體。在一些態樣中，經工程改造之細胞相對於個體係同種異體的。
在一些態樣中，腫瘤係選自由以下組成之群：腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(TALL)、B細胞前淋巴球性白血病、膀胱腫瘤、腦腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸腫瘤、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸腫瘤、食道腫瘤、神經膠質瘤、腎臟腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、脊髓發育不良、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、漿細胞骨髓瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、甲狀腺腫瘤及子宮腫瘤。在一些態樣中，腫瘤為卵巢腫瘤。在一些態樣中，腫瘤為位於腹膜間隙之腫瘤。
本文亦提供一種經工程改造之細胞，其包含：a)啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：(L-S-E)X 其中S包含編碼信號肽之多核苷酸序列，E包含編碼效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，X = 2至20，其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，其中對於(L-S-E)之第一次迭代而言，單元L缺乏，且其中對於各X而言，對應的信號肽與該效應分子可操作地相關聯，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種包含一或多個經工程改造之細胞的細胞群體，其中該一或多個經工程改造之細胞包含：a)啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子, 且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種包含一或多個經工程改造之細胞的細胞群體，其中該一或多個經工程改造之細胞包含：a)啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中在經工程改造之細胞中表現的第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子促進生長、活力或生長及活力相對於群體中不表現第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子之細胞增加，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
在一些態樣中，一或多個經工程改造之細胞表現在該等經工程改造之細胞中表現的第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子的同源受體或同源受體配位體。在一些態樣中，第一效應分子為IL12或IL12p70融合蛋白。在一些態樣中，第二效應分子為IL21。在一些態樣中，第二效應分子為CCL21。
本文亦提供一種包含一或多個經工程改造之細胞的細胞群體，其中該一或多個經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種包含一或多個經工程改造之細胞的細胞群體，其中該一或多個經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中在經工程改造之細胞中表現的第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子促進生長、活力或生長及活力相對於群體中不表現第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子之細胞增加，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
本文亦提供一種產生富集一或多種受體或受體配位體之細胞群體的方法，其包括在使一或多個細胞接觸第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子之條件下培養一或多個細胞，其中接觸之細胞表現第一或多個效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子之一或多種同源受體或同源受體配位體，且其中第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子促進接觸之細胞的生長、活力或生長及活力相對於缺乏第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子時培養之細胞增加。
在一些態樣中，第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子在一或多個細胞中異源表現，且該一或多個細胞以自分泌方式接觸第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子。在一些態樣中，第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子在一或多個額外細胞中表現，且該一或多個細胞以旁分泌方式接觸第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子。在一些態樣中，一或多個額外細胞為餵養細胞。在一些態樣中，一或多個細胞在培養基中培養。
在一些態樣中，藉由添加可溶性第一效應分子、可溶性第二效應分子或可溶性第一及第二效應分子至培養基，使一或多個細胞接觸第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子。在一些態樣中，可溶性第一效應分子及/或可溶性第二效應分子為重組效應分子。
在一些態樣中，一或多個細胞在附著條件下培養。在一些態樣中，一或多個細胞附著至表面上。在一些態樣中，藉由將一或多個細胞暴露於第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子，使附著細胞接觸第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子，固定在表面上。
在一些態樣中，第一效應分子為IL12或IL12p70融合蛋白。在一些態樣中，細胞群體富集IL12受體β1 (IL12Rβ1)、富集IL12受體β2 (IL12Rβ2)或富集IL12Rβ1及IL12Rβ2。在一些態樣中，MSC群體包含包含細胞標記物CD105+、CD73+、CD90+、IL12Rβ1+及IL12Rβ2+之細胞標記物表型。在一些態樣中，細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。
在一些態樣中，細胞群體包含選自由以下組成之群的細胞：天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球及樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γ-δ T細胞及T調控細胞及B細胞。在一些態樣中，細胞群體包含T細胞、NK細胞、NKT細胞、單核球、巨噬細胞或骨髓來源細胞。
在一些態樣中，第二效應分子為IL21。在一些態樣中，第二效應分子為CCL21。在一些態樣中，細胞群體富集CCR7。
在一些態樣中，MSC群體包含包括細胞標記物CD105+、CD73+、CD90+、IL12Rβ1+、IL12Rβ2+及CCR7+之細胞標記物表型。在一些態樣中，細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。
本文亦提供一種富集一或多種受體或受體配位體之細胞群體，其藉由任一本文所述之方法產生。
本文亦提供藉由多核苷酸序列表現之一或多種蛋白質，其中該多核苷酸序列包含啟動子及以自5’至3’取向，包含以下之式描述之表現盒：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。
本文亦提供藉由多核苷酸序列表現之一或多種蛋白質，其中該多核苷酸序列包含以自5’至3’取向，包含以下之式描述之表現盒：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。
本文亦提供一種分離之多核苷酸序列，其包含啟動子及下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。
本文亦提供一種分離之多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。
在一些態樣中，啟動子包含外源性啟動子多核苷酸序列。在一些態樣中，啟動子包含內源性啟動子。在一些態樣中，啟動子可操作地連接於表現盒，以使得多核苷酸能夠轉錄為包含式S1-E1-L-S2-E2之單一多核苷酸。
在一些態樣中，連接子多核苷酸序列與第一效應分子及第二效應分子轉譯為不同的多肽可操作地相關聯。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼2A核糖體跳躍標籤。在一些態樣中，2A核糖體跳躍標籤係選自由以下組成之群：P2A、T2A、E2A及F2A。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼T2A核糖體跳躍標籤。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼內部核糖體進入位點(IRES)。
在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼可裂解多肽。在一些態樣中，可裂解多肽包含弗林蛋白酶識別多肽序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列進一步編碼包含Gly、包含Ser或包含Gly-Ser之多肽序列，例如Gly-Ser-Gly多肽序列Gly-Ser-Gly多肽序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向。
在一些態樣中，連接子多核苷酸序列編碼第二啟動子，其中該啟動子可操作地連接於表現盒，以使得包含式S1-E1之第一多核苷酸能夠得以轉錄，其中該第二啟動子可操作地連接於表現盒，以使得包含式S2-E2之第二多核苷酸能夠得以轉錄，且其中第一多核苷酸及第二多核苷酸為不同的多核苷酸。在一些態樣中，啟動子及第二啟動子為相同的。在一些態樣中，啟動子及第二啟動子為不同的。
在一些態樣中，啟動子及/或第二啟動子包含組成型啟動子。在一些態樣中，組成型啟動子係選自由以下組成之群：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb及hUBIb。在一些態樣中，啟動子包含SFFV啟動子。在一些態樣中，啟動子及/或第二啟動子包含誘導型啟動子。在一些態樣中，誘導型啟動子係選自由以下組成之群：minP、NFkB反應元件、CREB反應元件、NFAT反應元件、SRF反應元件1、SRF反應元件2、AP1反應元件、TCF-LEF反應元件啟動子融合物、缺氧反應元件、SMAD結合元件、STAT3結合位點、誘導分子反應型啟動子及其串聯重複序列。
在一些態樣中，第一信號肽或第二信號肽分別包含相對於第一效應分子或第二效應分子而言為天然的天然信號肽。在一些態樣中，第一信號肽或第二信號肽分別包含相對於第一效應分子或第二效應分子而言為非天然的非天然信號肽。在一些態樣中，非天然信號肽係選自由以下組成之群：非天然信號肽係選自由以下組成之群：IL12、IL2、最佳化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12及IL21。在一些態樣中，第一信號肽及第二信號肽為相同的。在一些態樣中，編碼第一信號肽之多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。
在一些態樣中，第一分泌多肽為人類IL12信號肽。在一些態樣中，編碼第二信號肽之多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。在一些態樣中，第二分泌多肽為人類IL21信號肽。
在一些態樣中，第一效應分子係選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑a、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶。在一些態樣中，第二效應分子係選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶。在一些態樣中，第一效應分子及第二效應分子之治療類別為不同的。在一些態樣中，第一效應分子及/或第二效應分子為經修飾之效應分子。
在一些態樣中，第一效應分子及/或第二效應分子經修飾以包含細胞膜繫栓域。在一些態樣中，細胞膜系拴域包含跨膜-細胞內域或跨膜域。在一些態樣中，細胞膜系拴域包含細胞表面受體或其細胞膜結合部分。在一些態樣中，經修飾之效應分子為包含細胞表面受體或其細胞膜結合部分之融合蛋白。在一些態樣中，經修飾之效應分子進一步包含介於效應分子與細胞膜系拴域之間的連接子。在一些態樣中，當在細胞中表現時，經修飾之效應分子系拴至細胞之細胞膜。
在一些態樣中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干擾素及干擾素-γ。在一些態樣中，IL12細胞介素為IL12p70融合蛋白。在一些態樣中，趨化介素係選自由以下組成之群：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合蛋白、CCL19、CXCL9及XCL1。在一些態樣中，生長因子係選自由以下組成之群：Flt3L及GM-CSF。在一些態樣中，共活化分子係選自由以下組成之群：4-1BBL及CD40L。在一些態樣中，腫瘤微環境調節劑係選自由以下組成之群：腺苷去胺酶、TGFβ抑制劑、免疫檢查點抑制劑、VEGF抑制劑及HPGE2。在一些態樣中，TGFβ抑制劑係選自由以下組成之群：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗體、TGFb-TRAP及其組合。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體。在一些態樣中，VEGF抑制劑包含抗VEGF抗體、抗VEGF肽或其組合。
在一些態樣中，第一效應分子及第二效應分子為人類來源效應分子。
在一些態樣中，第一效應分子包含IL12。在一些態樣中，第一效應分子包含IL12p70融合蛋白。在一些態樣中，IL12p70融合蛋白為人類IL12p70融合蛋白。
在一些態樣中，第二效應分子包含CCL21a。在一些態樣中，CCL21a為人類CCL21a。在一些態樣中，第二效應分子包含IL7。在一些態樣中，IL7為人類IL7。在一些態樣中，第二效應分子包含IL21。在一些態樣中，IL21為人類IL21。
在一些態樣中，表現盒進一步包含包括編碼第三效應分子之多核苷酸序列的E3。在一些態樣中，第三效應分子包含Flt3L。在一些態樣中，第三效應分子包含抗PD1。
在一些態樣中，表現盒進一步包含包括編碼第四效應分子之多核苷酸序列的E4。在一些態樣中，第四效應分子包含腺苷去胺酶。
在一些態樣中，第三效應分子包含腺苷去胺酶。在一些態樣中，第三效應分子包含CD40L。在一些態樣中，第三效應分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。在一些態樣中，第三效應分子包含XCL1。
在一些態樣中，第二效應分子包含Flt3L。在一些態樣中，第二效應分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。在一些態樣中，第二效應分子包含抗PD1。在一些態樣中，第二效應分子包含CD40L。
在一些態樣中，第一效應分子包含干擾素-β且第二效應分子包含Flt3L。
在一些態樣中，編碼第一效應分子之多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。在一些態樣中，編碼第二效應分子之多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。
在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
本文亦提供一種外源性多核苷酸序列，其包含SFFV啟動子及下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。
在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
本文亦提供一種外源性多核苷酸序列，其包含SFFV啟動子及下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子；其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得該等多核苷酸能夠轉錄為包含式S1-E1-L-S2-E2之單一多核苷酸；且其中該多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
在一些態樣中，外源性多核苷酸序列藉由選自由以下組成之群的核酸編碼：DNA、cDNA、RNA、mRNA及裸質粒。
本文亦提供一種表現載體，其包含任何本文所述之外源性多核苷酸序列。在一些態樣中，表現載體為病毒載體。在一些態樣中，表現載體為慢病毒載體。
本文亦提供一種醫藥組合物，其包含任何本文所述之外源性多核苷酸序列及醫藥學上可接受之載劑。
本文亦提供一種醫藥組合物，其包含任何本文所述之經工程改造之細胞及醫藥學上可接受之載劑。一種分離之細胞，其包含任何本文所述之外源性多核苷酸序列、任何本文所述之表現載體或任何本文所述之醫藥組合物。
在一些態樣中，分離之細胞係選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γ-δ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、T調控細胞、病毒特異性T細胞、天然殺手T(NKT)細胞、天然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天淋巴樣細胞、巨大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、嗜中性白血球、骨髓細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、紅血球、血小板細胞、人類胚胎幹細胞(ESC)、ESC來源細胞、多能幹細胞、MSC、誘導性多能幹細胞(iPSC)及iPSC來源細胞。
在一些態樣中，分離之細胞為MSC。
在一些態樣中，外源性多核苷酸序列整合至細胞之基因組中。在一些態樣中，外源性多核苷酸序列包含一或多個病毒載體多核苷酸序列。
在一些態樣中，一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子或腺病毒多核苷酸序列。在一些態樣中，一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒多核苷酸序列。
在一些態樣中，該經工程改造之細胞相對於需要治療性治療之個體而言為HLA型。在一些態樣中，經工程改造之細胞為人類細胞。在一些態樣中，人類細胞為自個體，例如將接受細胞之個體分離之細胞。在一些態樣中，分離之細胞自由以下組成之群的組織分離：骨髓、脂肪組織、臍帶、胎肝、肌肉及肺組織。在一些態樣中，細胞為培養細胞。
在一些態樣中，MSC包含包括細胞標記物CD105+、CD73+及CD90+之細胞標記物表型。在一些態樣中，細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。在一些態樣中，MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II類HLA-之細胞標記物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。在一些態樣中，細胞標記物表型藉由或已經藉由流動式細胞量測術來測定。
在一些態樣中，細胞標記物表型進一步包含包括在細胞中表現之第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子的同源受體或同源受體配位體的細胞標記物。在一些態樣中，受體係選自由以下組成之群：IL12RB1、IL12RB2、CCL7及其組合。
在一些態樣中，細胞分泌各效應分子。在一些態樣中，第一效應分子以相對於第二效應分子之分泌高10倍的比率分泌。
在一些態樣中，細胞進一步包含抗原識別受體。在一些態樣中，抗原識別受體包含抗原結合域。在一些態樣中，抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。在一些態樣中，抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。在一些態樣中，scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些態樣中，VH及VL藉由肽連接子相隔。在一些態樣中，scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。
在一些態樣中，抗原識別受體是嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。在一些態樣中，抗原識別受體是嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，CAR包含一或多個細胞內信號傳導結構域，且該一或多個細胞內信號傳導結構域係選自由以下組成之群：CD3δ鏈細胞內信號傳導結構域、CD97細胞內信號傳導結構域、CD11a-CD18細胞內信號傳導結構域、CD2細胞內信號傳導結構域、ICOS細胞內信號傳導結構域、CD27細胞內信號傳導結構域、CD154細胞內信號傳導結構域、CD8細胞內信號傳導結構域、OX40細胞內信號傳導結構域、4-1BB細胞內信號傳導結構域、CD28細胞內信號傳導結構域、ZAP40細胞內信號傳導結構域、CD30細胞內信號傳導結構域、GITR細胞內信號傳導結構域、HVEM細胞內信號傳導結構域、DAP10細胞內信號傳導結構域、DAP12細胞內信號傳導結構域及MyD88細胞內信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR包含跨膜域，且該跨膜域係選自由以下組成之群：CD8跨膜域、CD28跨膜域、CD3δ鏈跨膜域、CD4跨膜域、4-1BB跨膜域、OX40跨膜域、ICOS跨膜域、CTLA-4跨膜域、PD-1跨膜域、LAG-3跨膜域、2B4跨膜域及BTLA跨膜域。在一些態樣中，CAR包含介於抗原結合域與跨膜結構域之間的間隔區。
本文亦提供一種病毒，其包含任何本文所述之外源性多核苷酸序列或任何本文所述之表現載體。在一些態樣中，病毒係選自由以下組成之群：慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子及腺病毒。在一些態樣中，病毒為慢病毒。
本文亦提供一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括以有效減小腫瘤體積之量向具有腫瘤之個體遞送包含經工程改造以產生調節腫瘤介導之免疫抑制機制之多種效應分子之細胞的組合物，其中該等經工程改造之細胞包含：a)啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子, 且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括以有效減小腫瘤體積之量向具有腫瘤之個體遞送包含經工程改造以產生IL12及IL21之細胞的組合物，其中該等經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種刺激(例如誘導)免疫反應之方法，該方法包括以有效誘導免疫反應之量向個體遞送包含經工程改造以產生調節腫瘤介導之免疫抑制機制之多種效應分子之細胞的組合物，其中該等經工程改造之細胞包含：a)啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子, 且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種刺激(例如誘導)個體中之免疫反應之方法，該方法包括以有效誘導免疫反應之量向個體遞送包含經工程改造以產生IL12及IL21之細胞的組合物，其中該等經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
在一些態樣中，該方法進一步包括投與檢查點抑制劑。在一些態樣中，檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-1L抗體或抗CTLA-4抗體。在一些態樣中，該方法進一步包括投與抗CD40抗體。
在一些態樣中，腫瘤係選自由以下組成之群：腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(TALL)、B細胞前淋巴球性白血病、膀胱腫瘤、腦腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸腫瘤、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸腫瘤、食道腫瘤、神經膠質瘤、腎臟腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、脊髓發育不良、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、漿細胞骨髓瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、甲狀腺腫瘤及子宮腫瘤。在一些態樣中，腫瘤為卵巢腫瘤。在一些態樣中，腫瘤為位於腹膜間隙之腫瘤。
在一些態樣中，投與包含全身投與、腹膜內投與或腫瘤內投與。
在一些態樣中，相對於對照物，腫瘤體積減少至少25%，視情況其中該對照物為未經修飾之細胞。在一些態樣中，相對於對照物，腫瘤體積減少至少50%，視情況其中該對照物為未經修飾之細胞。在一些態樣中，相對於對照物，腫瘤體積減少至少75%，視情況其中該對照物為未經修飾之細胞。
本文亦提供一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括以有效減小腫瘤體積之量向具有腫瘤之個體遞送能夠對細胞進行工程改造以產生調節腫瘤介導之免疫抑制機制之多種效應分子的組合物，其中各經工程改造之細胞包含：a)啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子, 且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括以有效減小腫瘤體積之量向具有腫瘤之個體遞送能夠將細胞進行經工程改造以產生IL12及IL21之細胞的組合物，其中該經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種刺激(例如誘導)個體中之免疫反應之方法，該方法包括以有效誘導免疫反應之量向個體遞送能夠對細胞進行工程改造以產生調節腫瘤介導之免疫抑制機制之多種效應分子的組合物，其中該經工程改造之細胞包含：a)啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，L包含連接子多核苷酸序列，S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子, 且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
本文亦提供一種刺激(例如誘導)個體中之免疫反應之方法，該方法包括以有效誘導免疫反應之量向個體遞送能夠對細胞進行工程改造以產生IL12及IL21之組合物，其中該經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含：a) SFFV啟動子；及b)外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽；E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白；L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽；E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 137中所示之序列。在一些態樣中，人類IL12p70融合蛋白包含SEQ ID NO: 138中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL12p70融合蛋白之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 136中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 142中所示之序列。在一些態樣中，人類IL21包含SEQ ID NO: 143中所示之序列。在一些態樣中，編碼人類IL21之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 141中所示之序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO: 140中所示之序列。在一些態樣中，連接子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 139中所示之序列。在一些態樣中，構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
在一些態樣中，該組合物包含選自由以下組成之群的遞送系統：病毒系統、轉座子系統及核酸酶基因組編輯系統，在一些態樣中，病毒系統係選自由以下組成之群：慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子及腺病毒。在一些態樣中，該核酸酶基因組編輯系統係選自由以下組成之群：鋅指系統、TALEN系統及CRISPR系統。
在一些態樣中，腫瘤係選自由以下組成之群：腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(TALL)、B細胞前淋巴球性白血病、膀胱腫瘤、腦腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸腫瘤、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸腫瘤、食道腫瘤、神經膠質瘤、腎臟腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、脊髓發育不良、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、漿細胞骨髓瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、甲狀腺腫瘤及子宮腫瘤。
在一些態樣中，投與包含全身投與、腹膜內投與或腫瘤內投與。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張以下各者之權益：2018年10月17日申請之美國臨時申請案第62/747,109號；2018年10月17日申請之美國臨時申請案第62/747,114號；及2019年5月3日申請之美國臨時申請案第62/843,180號，各案在此以引用之方式整體併入。序列表
本申請案含有序列表，其已經由EFS-Web提交且在此以引用之方式整體併入本文中。該ASCII複本於20XX年XX月創建，名稱為XXXXXUS_序列表.txt，且大小為X,XXX,XXX個位元組。
間葉幹細胞(MSC) (亦稱間葉基質細胞、多潛能基質細胞、骨髓基質細胞或多潛能間葉基質細胞)為來源於中胚層之非造血成人幹細胞之子集。其具有自我更新能力及多向分化，不僅分化成中胚層譜系，諸如軟骨細胞、骨細胞及脂肪細胞，且亦分化成外胚層細胞及內胚層細胞。MSC沒有倫理問題及畸胎瘤形成，其為用於細胞療法以治療免疫性疾病與非免疫性疾病之主要幹細胞類型。其容易自骨髓、脂肪組織、臍帶、胎肝、肌肉及肺分離，且可成功地在活體外擴增。MSC可藉由細胞表面標記物表型界定，包括包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-之細胞標記物表型；或包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II類HLA-之細胞標記物表型，如以引用之方式併入以達成所有目的之Dominici等人, (Cytotherapy. 2006;8(4):315-7)中更詳細論述。此外，當MSC外源性及全身性遞送至人類及動物時，其往往歸巢(直接遷移至)具有炎症之受損組織部位，包括腫瘤微環境及轉移區域。炎症指引之MSC歸巢涉及若干種與細胞運輸相關之重要分子，該等分子包括趨化介素、黏附分子及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)。
本文提供對諸如MSC之細胞進行工程改造以產生調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制之效應分子的方法。此等MSC在本文中稱為「經工程改造之MSC」。此等MSC通常含有經工程改造之核酸，在自然界中不存在。在一些實施例中，MSC經工程改造以包括包含可操作地連接於編碼效應分子(例如刺激免疫反應之效應分子)之核苷酸序列之啟動子的核酸。
本文亦提供對諸如免疫細胞之細胞進行工程改造以產生效應分子之方法，該等細胞包括(但不限於)天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。包括MSC與免疫細胞之此等細胞在本文中稱為「經工程改造之細胞」。此等細胞通常含有經工程改造之核酸，在自然界中不存在。在一些實施例中，細胞經工程改造以包括包含可操作地連接於編碼效應分子(例如刺激免疫反應之效應分子)之核苷酸序列之啟動子的核酸。
「效應分子」係指一種分子(例如核酸，諸如DNA或RNA，或蛋白質(多肽)或肽)，其結合於另一分子且調節其結合之該分子的生物活性。舉例而言，效應分子可充當配位體以增加或減少酶活性、基因表現或細胞信號傳導。因此，在一些實施例中，效應分子調節(活化或抑制)不同免疫調節機制。藉由直接結合於分子且調節其，效應分子亦可間接地調節第二下游分子。在一些實施例中，效應分子為分泌之分子，而在其他實施例中，效應分子結合於細胞表面或保持在細胞內。舉例而言，效應分子包括改變內部細胞狀態以例如增強細胞之免疫調節活性、歸巢特性或持久性的細胞內轉錄因子、微型RNA及shRNA。效應分子之非限制性實例包括細胞介素、趨化介素、調節代謝物水準之酶、調節細胞介素之抗體或誘餌分子(decoy molecule)、歸巢分子及/或整合素。
術語「調節」涵蓋生物活性之維持、生物活性之抑制(部分或完全)及生物活性之刺激/活化(部分或完全)。該術語亦涵蓋降低或增加(例如增強)生物活性。當一種效應分子調節與另一效應分子調節之腫瘤介導之免疫抑制機制(例如刺激抗原呈遞及/或加工)不同的腫瘤介導之免疫抑制機制(例如刺激T細胞信號傳導)時，兩種不同效應分子視為「調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制」。
效應分子進行之調節可為直接或間接的。當效應分子結合於另一分子且調節該分子之活性時，發生直接調節。當效應分子結合於另一分子，調節該分子之活性且作為該調節之結果，調節又一分子(效應分子未結合之分子)之活性時，發生間接調節。
在一些實施例中，至少一種效應分子對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節引起免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應(例如全身或腫瘤微環境中)增加至少10% (例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或200%)。舉例而言，對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節可引起免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%。在一些實施例中，對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節引起免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應增加10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-100%、10-200%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-100%、20-200%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-100%或50-200%。應瞭解，例如全身或腫瘤微環境中免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應之「增加」係相對於缺少效應分子時將發生之免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應而言的。
在一些實施例中，至少一種效應分子對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節引起免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應(例如全身或腫瘤微環境中)增加至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。舉例而言，對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節可引起免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些實施例中，對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節引起免疫刺激及/或抗腫瘤免疫反應增加2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
免疫刺激及/或抗腫瘤免疫機制之非限制性實例包括T細胞信號傳導、活性及/或募集、抗原呈遞及/或加工、天然殺手細胞介導之細胞毒性信號傳導、活性及/或募集、樹突狀細胞分化及/或成熟、免疫細胞募集、促炎性巨噬細胞信號傳導、活性及/或募集、基質降解、免疫刺激代謝物產生、干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon gene，STING)信號傳導(其增加IFN之分泌及Th1極化，促進抗腫瘤免疫反應)及/或I型干擾素信號傳導。效應分子可刺激上述免疫刺激機制中之至少一種(一或多種)，因此引起免疫刺激反應增加。上述免疫刺激及/或抗腫瘤免疫機制之變化可例如使用T細胞增殖或細胞毒性之活體外分析、活體外抗原呈遞分析、表現分析(例如特定標記物)及/或細胞分泌分析(例如細胞介素)評定。
在一些實施例中，至少一種效應分子對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節引起免疫抑制反應(例如全身或腫瘤微環境中)減少至少10% (例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或200%)。舉例而言，對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節可引起免疫抑制反應減少至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%。在一些實施例中，對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節引起免疫抑制反應減少10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-100%、10-200%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-100%、20-200%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-100%或50-200%。應瞭解，例如全身或腫瘤微環境中免疫抑制反應之「減少」係相對於缺少效應分子時將發生之免疫抑制反應而言的。
在一些實施例中，至少一種效應分子對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節引起免疫抑制反應(例如全身或腫瘤微環境中)減少至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。舉例而言，對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節可引起免疫抑制反應減少至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些實施例中，對腫瘤介導之免疫抑制機制的調節引起免疫抑制反應減少2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
免疫抑制機制之非限制性實例包括負共刺激信號傳導、細胞毒細胞(例如T細胞及/或NK細胞)之促細胞凋亡信號傳導、調節T (Treg)細胞信號傳導、腫瘤檢查點分子產生/維持、骨髓來源抑制性細胞信號傳導、活性及/或募集、免疫抑制因子/代謝物產生及/或血管內皮生長因子信號傳導。效應分子可抑制上述免疫抑制機制中之至少一種(一或多種)，因此引起免疫抑制反應減少。上述免疫抑制機制之變化可例如藉由以下來評定：分析T細胞增殖之增加及/或IFNγ產生之增加(負共刺激信號傳導、Treg 細胞信號傳導及/或MDSC)；膜聯蛋白V/PI流動染色(促細胞凋亡信號傳導)；表現、例如PDL1表現之流動染色(腫瘤檢查點分子產生/維持)；ELISA、LUMINEX®、經由qPCR之RNA、酶促分析，例如IDO色胺酸分解代謝(免疫抑制因子/代謝物產生)；及PI3K、Akt、p38之磷酸化(VEGF信號傳導)。
在一些實施例中，諸如MSC之細胞經工程改造以表現膜系抗CD3及/或抗CD28促效劑細胞外域。
在一些實施例中，諸如MSC之細胞經工程改造以產生至少兩種(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種)效應分子，每一種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在其他實施例中，細胞經工程改造以產生並非由該等細胞天然產生之至少一種效應分子。此類效應分子可例如補充該等細胞天然產生之效應分子的功能。
在一些實施例中，效應分子以累加方式起作用：例如兩種效應分子之作用可等於單獨起作用之兩種效應分子之作用的總和。在其他實施例中，效應分子以協同方式起作用：例如兩種效應分子之作用可超過兩種效應分子之組合功能。本發明亦涵蓋效應分子與產生其之免疫細胞(例如MSC)之間的累加作用及協同作用。
調節腫瘤介導之免疫抑制機制及/或改變腫瘤微環境的效應分子可為例如分泌之因子(例如細胞介素、趨化介素、抗體及/或調節與免疫系統相關之細胞外機制的誘餌受體)、抑制劑(例如抗體、抗體片段、配位體阱及/或小型阻斷肽)、控制細胞狀態之細胞內因子(例如調節細胞狀態以增強促炎性之微型RNA及/或轉錄因子)、包裝成外來體之因子(例如微型RNA、胞漿因子及/或細胞外因子)、表面展示因子(例如檢查點抑制劑、TRAIL)及/或代謝基因(例如產生/調節或降解代謝物或胺基酸之酶)。
在一些實施例中，效應分子可選自分子之以下非限制性類別：細胞介素、抗體、趨化介素、核苷酸、肽及酶。上述類別效應分子之非限制性實例在表1中列出且編碼例示性效應分子之特定序列在表6中列出。效應分子可為人類，諸如表1或表6中列出之彼等人類效應分子，或表1或表6中列出之鼠類效應分子之人類同等物。效應分子可來源於人類，諸如內源人類效應分子或經修飾及/或功能優化，例如密碼子優化以改善表現、經修飾以提高穩定性或在其信號序列進行修飾的效應分子(見下文)。本領域之技術人員已知用於優化功能之各種程式及算法，且可基於所需改善，諸如針對特定物種(例如人類、小鼠、細菌等)之密碼子優化來選擇。表 1. 例示性效應分子
效應子名稱 類別 功能
抗CD40或CD40配位體 促效劑抗體 刺激B細胞及抗原呈遞細胞
Flt3L 配位體促效劑 刺激骨髓細胞及抗原呈遞細胞
CXCL10-11融合物 趨化介素 吸引T細胞
TGFb阻斷肽 拮抗劑肽 抑制TGFb路徑，TME調節劑
腺苷去胺酶 (ADA) TME調節劑 降解TME中之抑制性腺嘌呤核苷
犬尿胺酸酶 TME調節劑 降解犬尿胺酸
HPGE2 TME調節劑 降解PGE2
CXCL13 趨化介素 吸引B細胞
抗PD-1/PD-L1 促效劑抗體 移除檢查點
抗CTLA-4 促效劑抗體 移除檢查點
抗VEGF 拮抗劑抗體 中和免疫抑制/血管生成因子
抗TNFa 拮抗劑抗體 中和細胞介素/促腫瘤因子
抗IL-10 拮抗劑抗體 中和免疫抑制性細胞介素
抗SDF1/CXCL12 拮抗劑抗體 中和促腫瘤趨化介素
(TβRII)2阱 捕捉阱 中和免疫抑制性細胞介素
CCL21 趨化介素 吸引白細胞/NK
CCL1 趨化介素 吸引白細胞/NK
CCL17 趨化介素 吸引白細胞/NK
CCL19 趨化介素 吸引白細胞/NK
CCL21 趨化介素 吸引白細胞/NK
CCL20 趨化介素 吸引白細胞/NK
CCL21a 趨化介素 吸引白細胞/NK
MIP1b (CCL5) 趨化介素 吸引白細胞/NK
CXCL10 趨化介素 吸引白細胞/NK
CXCL11 趨化介素 吸引白細胞/NK
CCL2 趨化介素 吸引單核球
MIP-1α (CCL3) 趨化介素 吸引白細胞/NK
XCL1 趨化介素 吸引白細胞/NK
IFNβ 細胞介素 T細胞反應，殺死腫瘤細胞
IFNγ 細胞介素 T細胞反應，殺死腫瘤細胞
IL-12 細胞介素 T細胞、NK細胞
IL-1β 細胞介素 T細胞、NK細胞
IL-15 細胞介素 刺激T細胞及NK
IL-2 細胞介素 刺激T細胞及NK
IL-21 細胞介素 刺激T細胞
IL-24 細胞介素 刺激T細胞
IL36-γ 細胞介素 刺激T細胞
IL-7 細胞介素 刺激T細胞
IL-22 細胞介素 刺激T細胞
IL-18 細胞介素 刺激T細胞
顆粒酶/穿孔素 酶 直接殺死腫瘤細胞
OX86 (抗OX40) 配位體 刺激T細胞
抗TGFβ 中和抗體 中和免疫抑制性細胞介素
TRAIL 受體/配位體 直接殺死腫瘤細胞
FASL (CD49L) 受體/配位體 直接殺死腫瘤細胞
OX40-L 受體/配位體 刺激T細胞
cGAS 分泌分子 刺激抗原呈遞細胞
41BBL 分泌分子 T細胞共活化
CD40L 分泌分子 刺激T細胞
GM-CSF 分泌分子 單核球之生長因子
STING 分泌分子 刺激抗原呈遞細胞
HAC-V 『微體』_PD1 拮抗劑抗體 抑制檢查點
yCD 前藥 在活化後轉變成細胞毒性分子
CpG/核苷酸 核苷酸 STING促效劑
在一些實施例中，諸如MSC之細胞包含經工程改造之核酸，該經工程改造之核酸包含可操作地連接於編碼效應分子之核苷酸序列的啟動子。在一些實施例中，經工程改造之核酸包含可操作地連接於編碼至少2種效應分子之核苷酸序列的啟動子。舉例而言，經工程改造之核酸可包含可操作地連接於編碼至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少8種、至少9種或至少10種效應分子之核苷酸序列的啟動子。在一些實施例中，經工程改造之核酸包含可操作地連接於編碼1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種效應分子之核苷酸序列的啟動子。
在一些實施例中，諸如經工程改造之MSC的經工程改造之細胞經工程改造以包括至少兩種經工程改造之核酸，各包含可操作地連接於編碼至少一種(例如1種、2種或3種)效應分子之核苷酸序列的啟動子。舉例而言，細胞可經工程改造以包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少8種、至少9種或至少10種經工程改造之核酸，各包含可操作地連接於編碼至少一種(例如1種、2種或3種)效應分子之核苷酸序列的啟動子。在一些實施例中，細胞經工程改造以包含2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種經工程改造之核酸，各包含可操作地連接於編碼至少一種(例如1種、2種或3種)效應分子之核苷酸序列的啟動子。
「經工程改造之核酸」為在自然界中不存在之核酸。然而，應瞭解雖然總體上經工程改造之核酸係非天然存在的，但其可包括在自然界中存在之核苷酸序列。在一些實施例中，經工程改造之核酸包含來自不同生物體(例如來自不同物種)之核苷酸序列。舉例而言，在一些實施例中，經工程改造之核酸包括鼠類核苷酸序列、細菌核苷酸序列、人類核苷酸序列及/或病毒核苷酸序列。術語「經工程改造之核酸」包括重組核酸及合成核酸。「重組核酸」係指藉由將核酸分子接合而構築之分子且在一些實施例中，在活細胞中可重複。「合成核酸」係指經擴增或以化學方式或用其他方式合成之分子。合成核酸包括經化學修飾或以其他方式修飾，但可與天然存在之核酸分子進行鹼基配對的核酸。重組核酸及合成核酸亦包括由上述任一者複製所產生的彼等分子。本發明之經工程改造之核酸可藉由單一分子(例如包括在相同質體或其他載體中)或藉由多種不同分子(例如多種不同的獨立複製之分子)編碼。
本發明之經工程改造之核酸可使用標準分子生物學方法產生(參見例如Green及Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Press)。在一些實施例中，經工程改造之核酸構築體使用GIBSON ASSEMBLY®選殖產生(參見例如Gibson, D.G.等人 Nature Methods, 343-345, 2009；及Gibson, D.G.等人 Nature Methods, 901-903, 2010，各以引用之方式併入本文中)。GIBSON ASSEMBLY®通常在單管反應中使用三種酶活性：5 '外切核酸酶、DNA聚合酶及DNA連接酶活性之'Y擴展活性。5'外切核酸酶活性咀嚼掉5'末端序列且暴露互補序列，以進行黏接。接著聚合酶活性填充黏接區域上之間隙中。接著DNA連接酶將切口密封且將DNA片段共價連接在一起。鄰接片段之重疊序列比用於金門裝配中之序列更長，因此產生更高百分比之恰當裝配。在一些實施例中，經工程改造之核酸構築體使用IN-FUSION®選殖(Clontech)產生。
「啟動子」係指控制核酸序列之其餘部分轉錄之開始及速率的核酸序列控制區。啟動子亦可含有諸如RNA聚合酶及其他轉錄因子之調控蛋白及分子可結合的子區域。啟動子可為組成型、誘導型、阻抑型、組織特異型或其任何組合。啟動子驅動其調控之核酸序列的表現或驅動其轉錄。本文中，當啟動子相對於其調控之核酸序列處於恰當功能位置及取向，從而控制(「驅動」)該序列轉錄開始及/或表現時，認為該啟動子「可操作地連接」。
啟動子可為與基因或序列天生相關之啟動子，可藉由分離位於給定基因或序列之編碼區段上游的5'非編碼序列獲得。此類啟動子可稱為「內源性的」。在一些實施例中，編碼核酸序列可位於重組或異源啟動子之控制下，重組或異源啟動子係指通常在自然環境中不與編碼序列相關之啟動子。此類啟動子可包括其他基因之啟動子；自任何其他細胞分離之啟動子；及非「天然存在」之合成啟動子或強化子，諸如含有不同轉錄調控區之不同元件及/或經由本領域中已知之遺傳工程改造方法改變表現之突變的啟動子。除以合成方式產生啟動子及強化子之核酸序列外，可使用包括聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)之重組選殖及/或核酸擴增技術產生序列(參見例如美國專利第4,683,202號及美國專利第5,928,906號)。
經工程改造之核酸之啟動子可為「誘導型啟動子」，誘導型啟動子係指特徵在於當存在信號、受信號影響或接觸信號時調控(例如起始或活化)轉錄活性之啟動子。信號可為以有效調控從誘導型啟動子轉錄之活性的方式接觸誘導型啟動子的內源性或通常外源性條件(例如光)、化合物(例如化學或非化學化合物)或蛋白質(例如細胞介素)。轉錄活化可涉及直接作用於啟動子來驅動轉錄，或藉由使防止啟動子驅動轉錄之阻抑子失活而間接作用於啟動子。相反地，轉錄失活可涉及直接作用於啟動子來驅動轉錄，或藉由使之後作用於啟動子之阻抑子活化而間接作用於啟動子。
若在局部腫瘤狀態(例如炎症或缺氧)或信號存在下自啟動子轉錄得到活化、失活、增加或減少，則啟動子對該狀態或信號「起反應」或藉由該狀態或信號「調節」。在一些實施例中，啟動子包含反應元件。「反應元件」為啟動子區域內結合調節(調控)自啟動子之基因表現之特定分子(例如轉錄因子)的DNA短序列。可根據本發明使用之反應元件包括不限於根皮素可調之控制元件(phloretin-adjustable control element，PEACE)、鋅指DNA結合域(DBD)、干擾素-γ活化序列(interferon-gamma-activated sequence，GAS) (Decker, T.等人J Interferon Cytokine Res . 1997年3月;17(3):121-34，以引用的方式併入本文中)、干擾素刺激之反應元件(ISRE) (Han, K. J.等人J Biol Chem . 2004年4月9日;279(15):15652-61，以引用的方式併入本文中)、NF-κB反應元件(Wang, V.等人 Cell Reports. 2012; 2(4): 824-839，以引用的方式併入本文中)及STAT3反應元件(Zhang, D.等人J of Biol Chem . 1996; 271: 9503-9509，以引用的方式併入本文中)。本文中涵蓋其他反應元件。反應元件亦可含有串聯重複序列(例如相同的編碼反應元件之核苷酸序列的連續重複序列)以大體上增加反應元件對其同源結合分子之敏感性。串聯重複序列可標記為2X、3X、4X、5X等，以表示存在之重複序列的數目。
反應啟動子(亦稱「誘導型啟動子」(例如TGF-β反應啟動子)之非限制性實例在表2中列出，其展示啟動子及轉錄因子之設計，以及展示誘導分子對轉錄因子(TF)及轉殖基因轉錄(T)之作用(B，結合；D，解離；n.d.，不確定)(A，活化；DA，失活；DR，去阻抑) (參見Horner, M.及Weber, W.FEBS Letters 586 (2012) 20784-2096m，及其中引用之參考文獻)。誘導型啟動子之其他非限制性實例包括表3中所呈現之啟動子。表 2. 反應啟動子之實例
系統 啟動子及操縱子 轉錄因子 (TF) 誘導分子 對誘導劑之反應
TF T
轉錄活化蛋白反應啟動子
AIR PAIR (OalcA-PhCMVmin) AlcR 乙醛 n.d. A
ART PART (OARG-PhCMVmin) ArgR-VP16 l-精胺酸 B A
BIT PBIT3 (OBirA3-PhCMVmin) BIT (BirA-VP16) 生物素 B A
Cumate-活化劑 PCR5 (OCuO6-PhCMVmin) cTA (CymR-VP16) Cumate D DA
Cumate-反向活化劑 PCR5 (OCuO6-PhCMVmin) rcTA (rCymR-VP16) Cumate B A
E-OFF PETR (OETR-PhCMVmin) ET (E-VP16) 紅黴素 D DA
NICE-OFF PNIC (ONIC-PhCMVmin) NT (HdnoR-VP16) 6-羥基-菸鹼 D DA
PEACE PTtgR1 (OTtgR-PhCMVmin) TtgA1 (TtgR-VP16) 根皮素 D DA
PIP-OFF PPIR (OPIR-Phsp70min) PIT (PIP-VP16) 原始黴素I D DA
QuoRex PSCA (OscbR-PhCMVmin)PSPA (OpapRI-PhCMVmin) SCA (ScbR-VP16) SCB1 D DA
Redox PROP (OROP-PhCMVmin) REDOX (REX-VP16) NADH D DA
TET-OFF PhCMV∗-1 (OtetO7-PhCMVmin) tTA (TetR-VP16) 四環素 D DA
TET-ON PhCMV∗-1 (OtetO7-PhCMVmin) rtTA (rTetR-VP16) 強力黴素 B A
TIGR PCTA (OrheO-PhCMVmin) CTA (RheA-VP16) 熱 D DA
TraR O7x(tra盒)-PhCMVmin p65-TraR 3-Oxo-C8-HSL B A
VAC-OFF P1VanO2 (OVanO2-PhCMVmin) VanA1 (VanR-VP16) 香草酸 D DA
轉錄阻抑蛋白反應啟動子
Cumate-阻抑蛋白 PCuO (PCMV5-OCuO) CymR Cumate D DR
E-ON PETRON8 (PSV40-OETR8) E-KRAB 紅黴素 D DR
NICE-ON PNIC (PSV40-ONIC8) NS (HdnoR-KRAB) 6-羥基-菸鹼 D DR
PIP-ON PPIRON (PSV40-OPIR3) PIT3 (PIP-KRAB) 原始黴素I D DR
Q-ON PSCAON8 (PSV40-OscbR8) SCS (ScbR-KRAB) SCB1 D DR
基於TET-ON＜comma＞ 阻抑蛋白 OtetO-PHPRT tTS-H4 (TetR-HDAC4) 強力黴素 D DR
T-REX PTetO (PhCMV-OtetO2) TetR 四環素 D DR
UREX PUREX8 (PSV40-OhucO8) mUTS (KRAB-HucR) 尿酸 D DR
VAC-ON PVanON8 (PhCMV-OVanO8) VanA4 (VanR-KRAB) 香草酸 D DR
雜交啟動子
QuoRexPIP-ON(NOT IF閘) OscbR8-OPIR3-PhCMVmin SCAPIT3 SCB1原始黴素I DD DADR
QuoRexE-ON(NOT IF閘) OscbR-OETR8-PhCMVmin SCAE-KRAB SCB1紅黴素 DD DADR
TET-OFFE-ON(NOT IF閘) OtetO7-OETR8-PhCMVmin tTAE-KRAB 四環素紅黴素 DD DADR
TET-OFFPIP-ONE-ON OtetO7-OPIR3-OETR8-PhCMVmin tTAPIT3E-KRAB   DDD DADRDR
表 3. 例示性誘導型啟動子
名稱 DNA 序列 來源
最小啟動子； minP AGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAG (SEQ ID NO: 1) EU581860.1 (Promega)
NFkB反應元件蛋白啟動子； 5x NFkB-RE GGGAATTTCCGGGGACTTTCCGGGAATTTCCGGGGACTTTCCGGGAATTTCC (SEQ ID NO: 2) EU581860.1 (Promega)
CREB反應元件蛋白啟動子； 4x CRE CACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAA (SEQ ID NO: 3) DQ904461.1 (Promega)
NFAT反應元件蛋白啟動子； 3x NFAT結合位點 GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEQ ID NO: 4) DQ904462.1 (Promega)
SRF反應元件蛋白啟動子；5x SRE AGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCTAGGATGTCCATATTAGGACATCT (SEQ ID NO: 5) FJ773212.1 (Promega)
SRF反應元件蛋白啟動2；5x SRF-RE AGTATGTCCATATTAGGACATCTACCATGTCCATATTAGGACATCTACTATGTCCATATTAGGACATCTTGTATGTCCATATTAGGACATCTAAAATGTCCATATTAGGACATCT (SEQ ID NO: 6) FJ773213.1 (Promega)
AP1反應元件蛋白啟動子；6x AP1-RE TGAGTCAGTGACTCAGTGAGTCAGTGACTCAGTGAGTCAGTGACTCAG (SEQ ID NO: 7) JQ858516.1 (Promega)
TCF-LEF反應元件蛋白啟動子；8x TCF-LEF-RE AGATCAAAGGGTTTAAGATCAAAGGGCTTAAGATCAAAGGGTATAAGATCAAAGGGCCTAAGATCAAAGGGACTAAGATCAAAGGGTTTAAGATCAAAGGGCTTAAGATCAAAGGGCCTA (SEQ ID NO: 8) JX099537.1 (Promega)
SBEx4 GTCTAGACGTCTAGACGTCTAGACGTCTAGAC (SEQ ID NO: 9) Addgene目錄號: 16495
SMAD2/3 - CAGACA x4 CAGACACAGACACAGACACAGACA (SEQ ID NO: 10) Jonk等人(J Biol Chem. 1998年8月14日;273(33):21145-52.
STAT3結合位點 Ggatccggtactcgagatctgcgatctaagtaagcttggcattccggtactgttggtaaagccac (SEQ ID NO: 11) Addgene測序結果#211335
啟動子之其他非限制性實例包括巨細胞病毒(CMV)啟動子、延長因子1-α (EF1a)啟動子、延長因子(EFS)啟動子、MND啟動子(含有具有骨髓增生性肉瘤病毒強化子之經修飾MoMuLV LTR之U3區的合成啟動子)、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、形成脾臟病灶病毒(spleen focus-forming virus，SFFV)啟動子、猿猴病毒40 (SV40)啟動子及泛素C(UbC)啟動子(參見表4)。表 4. 例示性組成型啟動子
名稱 DNA 序列
CMV GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC (SEQ ID NO: 12)
EF1a GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGCCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGACCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGTCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCCGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGTCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA (SEQ ID NO: 13)
EFS GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC (SEQ ID NO: 14)
MND TTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCA (SEQ ID NO: 15)
PGK GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCGGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG (SEQ ID NO: 16)
SFFV GTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGCCCGGG (SEQ ID NO: 17)
SV40 CTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCT (SEQ ID NO: 18)
UbC GCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGGAGCGTTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTTGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCACAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTAAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGGTTTGTCGTCTGGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAAGCTTCTGCAGGTCGACTCTAGAAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGAC (SEQ ID NO: 19)
hEF1aV1 GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGTCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA (SEQ ID NO: 20)
hCAGG ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTC (SEQ ID NO: 21)
hEF1aV2 Gggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacag (SEQ ID NO: 22)
hACTb CCACTAGTTCCATGTCCTTATATGGACTCATCTTTGCCTATTGCGACACACACTCAATGAACACCTACTACGCGCTGCAAAGAGCCCCGCAGGCCTGAGGTGCCCCCACCTCACCACTCTTCCTATTTTTGTGTAAAAATCCAGCTTCTTGTCACCACCTCCAAGGAGGGGGAGGAGGAGGAAGGCAGGTTCCTCTAGGCTGAGCCGAATGCCCCTCTGTGGTCCCACGCCACTGATCGCTGCATGCCCACCACCTGGGTACACACAGTCTGTGATTCCCGGAGCAGAACGGACCCTGCCCACCCGGTCTTGTGTGCTACTCAGTGGACAGACCCAAGGCAAGAAAGGGTGACAAGGACAGGGTCTTCCCAGGCTGGCTTTGAGTTCCTAGCACCGCCCCGCCCCCAATCCTCTGTGGCACATGGAGTCTTGGTCCCCAGAGTCCCCCAGCGGCCTCCAGATGGTCTGGGAGGGCAGTTCAGCTGTGGCTGCGCATAGCAGACATACAACGGACGGTGGGCCCAGACCCAGGCTGTGTAGACCCAGCCCCCCCGCCCCGCAGTGCCTAGGTCACCCACTAACGCCCCAGGCCTGGTCTTGGCTGGGCGTGACTGTTACCCTCAAAAGCAGGCAGCTCCAGGGTAAAAGGTGCCCTGCCCTGTAGAGCCCACCTTCCTTCCCAGGGCTGCGGCTGGGTAGGTTTGTAGCCTTCATCACGGGCCACCTCCAGCCACTGGACCGCTGGCCCCTGCCCTGTCCTGGGGAGTGTGGTCCTGCGACTTCTAAGTGGCCGCAAGCCACCTGACTCCCCCAACACCACACTCTACCTCTCAAGCCCAGGTCTCTCCCTAGTGACCCACCCAGCACATTTAGCTAGCTGAGCCCCACAGCCAGAGGTCCTCAGGCCCTGCTTTCAGGGCAGTTGCTCTGAAGTCGGCAAGGGGGAGTGACTGCCTGGCCACTCCATGCCCTCCAAGAGCTCCTTCTGCAGGAGCGTACAGAACCCAGGGCCCTGGCACCCGTGCAGACCCTGGCCCACCCCACCTGGGCGCTCAGTGCCCAAGAGATGTCCACACCTAGGATGTCCCGCGGTGGGTGGGGGGCCCGAGAGACGGGCAGGCCGGGGGCAGGCCTGGCCATGCGGGGCCGAACCGGGCACTGCCCAGCGTGGGGCGCGGGGGCCACGGCGCGCGCCCCCAGCCCCCGGGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGgtaagcccggccagccgaccggggcaggcggctcacggcccggccgcaggcggccgcggccccttcgcccgtgcagagccgccgtctgggccgcagcggggggcgcatggggggggaaccggaccgccgtggggggcgcgggagaagcccctgggcctccggagatgggggacaccccacgccagttcggaggcgcgaggccgcgctcgggaggcgcgctccgggggtgccgctctcggggcgggggcaaccggcggggtctttgtctgagccgggctcttgccaatggggatcgcagggtgggcgcggcggagcccccgccaggcccggtgggggctggggcgccattgcgcgtgcgcgctggtcctttgggcgctaactgcgtgcgcgctgggaattggcgctaattgcgcgtgcgcgctgggactcaaggcgctaactgcgcgtgcgttctggggcccggggtgccgcggcctgggctggggcgaaggcgggctcggccggaaggggtggggtcgccgcggctcccgggcgcttgcgcgcacttcctgcccgagccgctggccgcccgagggtgtggccgctgcgtgcgcgcgcgccgacccggcgctgtttgaaccgggcggaggcggggctggcgcccggttgggagggggttggggcctggcttcctgccgcgcgccgcggggacgcctccgaccagtgtttgccttttatggtaataacgcggccggcccggcttcctttgtccccaatctgggcgcgcgccggcgccccctggcggcctaaggactcggcgcgccggaagtggccagggcgggggcgacctcggctcacagcgcgcccggctat (SEQ ID NO: 23)
heIF4A1 GTTGATTTCCTTCATCCCTGGCACACGTCCAGGCAGTGTCGAATCCATCTCTGCTACAGGGGAAAACAAATAACATTTGAGTCCAGTGGAGACCGGGAGCAGAAGTAAAGGGAAGTGATAACCCCCAGAGCCCGGAAGCCTCTGGAGGCTGAGACCTCGCCCCCCTTGCGTGATAGGGCCTACGGAGCCACATGACCAAGGCACTGTCGCCTCCGCACGTGTGAGAGTGCAGGGCCCCAAGATGGCTGCCAGGCCTCGAGGCCTGACTCTTCTATGTCACTTCCGTACCGGCGAGAAAGGCGGGCCCTCCAGCCAATGAGGCTGCGGGGCGGGCCTTCACCTTGATAGGCACTCGAGTTATCCAATGGTGCCTGCGGGCCGGAGCGACTAGGAACTAACGTCATGCCGAGTTGCTGAGCGCCGGCAGGCGGGGCCGGGGCGGCCAAACCAATGCGATGGCCGGGGCGGAGTCGGGCGCTCTATAAGTTGTCGATAGGCGGGCACTCCGCCCTAGTTTCTAAGGACCATG (SEQ ID NO: 24)
hGAPDH AGTTCCCCAACTTTCCCGCCTCTCAGCCTTTGAAAGAAAGAAAGGGGAGGGGGCAGGCCGCGTGCAGTCGCGAGCGGTGCTGGGCTCCGGCTCCAATTCCCCATCTCAGTCGCTCCCAAAGTCCTTCTGTTTCATCCAAGCGTGTAAGGGTCCCCGTCCTTGACTCCCTAGTGTCCTGCTGCCCACAGTCCAGTCCTGGGAACCAGCACCGATCACCTCCCATCGGGCCAATCTCAGTCCCTTCCCCCCTACGTCGGGGCCCACACGCTCGGTGCGTGCCCAGTTGAACCAGGCGGCTGCGGAAAAAAAAAAGCGGGGAGAAAGTAGGGCCCGGCTACTAGCGGTTTTACGGGCGCACGTAGCTCAGGCCTCAAGACCTTGGGCTGGGACTGGCTGAGCCTGGCGGGAGGCGGGGTCCGAGTCACCGCCTGCCGCCGCGCCCCCGGTTTCTATAAATTGAGCCCGCAGCCTCCCGCTTCGCTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTTTGCGTCGCCAGgtgaagacgggcggagagaaacccgggaggctagggacggcctgaaggcggcaggggcgggcgcaggccggatgtgttcgcgccgctgcggggtgggcccgggcggcctccgcattgcaggggcgggcggaggacgtgatgcggcgcgggctgggcatggaggcctggtgggggaggggaggggaggcgtgggtgtcggccggggccactaggcgctcactgttctctccctccgcgcagCCGAGCCACATCGCTGAGACAC (SEQ ID NO: 25)
hGRP78 AGTGCGGTTACCAGCGGAAATGCCTCGGGGTCAGAAGTCGCAGGAGAGATAGACAGCTGCTGAACCAATGGGACCAGCGGATGGGGCGGATGTTATCTACCATTGGTGAACGTTAGAAACGAATAGCAGCCAATGAATCAGCTGGGGGGGCGGAGCAGTGACGTTTATTGCGGAGGGGGCCGCTTCGAATCGGCGGCGGCCAGCTTGGTGGCCTGGGCCAATGAACGGCCTCCAACGAGCAGGGCCTTCACCAATCGGCGGCCTCCACGACGGGGCTGGGGGAGGGTATATAAGCCGAGTAGGCGACGGTGAGGTCGACGCCGGCCAAGACAGCACAGACAGATTGACCTATTGGGGTGTTTCGCGAGTGTGAGAGGGAAGCGCCGCGGCCTGTATTTCTAGACCTGCCCTTCGCCTGGTTCGTGGCGCCTTGTGACCCCGGGCCCCTGCCGCCTGCAAGTCGGAAATTGCGCTGTGCTCCTGTGCTACGGCCTGTGGCTGGACTGCCTGCTGCTGCCCAACTGGCTGGCAC (SEQ ID NO: 26)
hGRP94 TAGTTTCATCACCACCGCCACCCCCCCGCCCCCCCGCCATCTGAAAGGGTTCTAGGGGATTTGCAACCTCTCTCGTGTGTTTCTTCTTTCCGAGAAGCGCCGCCACACGAGAAAGCTGGCCGCGAAAGTCGTGCTGGAATCACTTCCAACGAAACCCCAGGCATAGATGGGAAAGGGTGAAGAACACGTTGCCATGGCTACCGTTTCCCCGGTCACGGAATAAACGCTCTCTAGGATCCGGAAGTAGTTCCGCCGCGACCTCTCTAAAAGGATGGATGTGTTCTCTGCTTACATTCATTGGACGTTTTCCCTTAGAGGCCAAGGCCGCCCAGGCAAAGGGGCGGTCCCACGCGTGAGGGGCCCGCGGAGCCATTTGATTGGAGAAAAGCTGCAAACCCTGACCAATCGGAAGGAGCCACGCTTCGGGCATCGGTCACCGCACCTGGACAGCTCCGATTGGTGGACTTCCGCCCCCCCTCACGAATCCTCATTGGGTGCCGTGGGTGCGTGGTGCGGCGCGATTGGTGGGTTCATGTTTCCCGTCCCCCGCCCGCGAGAAGTGGGGGTGAAAAGCGGCCCGACCTGCTTGGGGTGTAGTGGGCGGACCGCGCGGCTGGAGGTGTGAGGATCCGAACCCAGGGGTGGGGGGTGGAGGCGGCTCCTGCGATCGAAGGGGACTTGAGACTCACCGGCCGCACGTC (SEQ ID NO: 27)
hHSP70 GGGCCGCCCACTCCCCCTTCCTCTCAGGGTCCCTGTCCCCTCCAGTGAATCCCAGAAGACTCTGGAGAGTTCTGAGCAGGGGGCGGCACTCTGGCCTCTGATTGGTCCAAGGAAGGCTGGGGGGCAGGACGGGAGGCGAAAACCCTGGAATATTCCCGACCTGGCAGCCTCATCGAGCTCGGTGATTGGCTCAGAAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATAAAAGCCCAGGGGCAAGCGGTCCGGATAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGCTGCGACAGTCCACTACCTTTTTCGAGAGTGACTCCCGTTGTCCCAAGGCTTCCCAGAGCGAACCTGTGCGGCTGCAGGCACCGGCGCGTCGAGTTTCCGGCGTCCGGAAGGACCGAGCTCTTCTCGCGGATCCAGTGTTCCGTTTCCAGCCCCCAATCTCAGAGCGGAGCCGACAGAGAGCAGGGAACCC (SEQ ID NO: 28)
hKINb GCCCCACCCCCGTCCGCGTTACAACCGGGAGGCCCGCTGGGTCCTGCACCGTCACCCTCCTCCCTGTGACCGCCCACCTGATACCCAAACAACTTTCTCGCCCCTCCAGTCCCCAGCTCGCCGAGCGCTTGCGGGGAGCCACCCAGCCTCAGTTTCCCCAGCCCCGGGCGGGGCGAGGGGCGATGACGTCATGCCGGCGCGCGGCATTGTGGGGCGGGGCGAGGCGGGGCGCCGGGGGGAGCAACACTGAGACGCCATTTTCGGCGGCGGGAGCGGCGCAGGCGGCCGAGCGGGACTGGCTGGGTCGGCTGGGCTGCTGGTGCGAGGAGCCGCGGGGCTGTGCTCGGCGGCCAAGGGGACAGCGCGTGGGTGGCCGAGGATGCTGCGGGGCGGTAGCTCCGGCGCCCCTCGCTGGTGACTGCTGCGCCGTGCCTCACACAGCCGAGGCGGGCTCGGCGCACAGTCGCTGCTCCGCGCTCGCGCCCGGCGGCGCTCCAGGTGCTGACAGCGCGAGAGAGCGCGGCCTCAGGAGCAACAC (SEQ ID NO: 29)
hUBIb TTCCAGAGCTTTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTCAAATTCATCCGCCTGATAATTTTCTTATATTTTCCTAAAGAAGGAAGAGAAGCGCATAGAGGAGAAGGGAAATAATTTTTTAGGAGCCTTTCTTACGGCTATGAGGAATTTGGGGCTCAGTTGAAAAGCCTAAACTGCCTCTCGGGAGGTTGGGCGCGGCGAACTACTTTCAGCGGCGCACGGAGACGGCGTCTACGTGAGGGGTGATAAGTGACGCAACACTCGTTGCATAAATTTGCGCTCCGCCAGCCCGGAGCATTTAGGGGCGGTTGGCTTTGTTGGGTGAGCTTGTTTGTGTCCCTGTGGGTGGACGTGGTTGGTGATTGGCAGGATCCTGGTATCCGCTAACAGgtactggcccacagccgtaaagacctgcgggggcgtgagaggggggaatgggtgaggtcaagctggaggcttcttggggttgggtgggccgctgaggggaggggagggcgaggtgacgcgacacccggcctttctgggagagtgggccttgttgacctaaggggggcgagggcagttggcacgcgcacgcgccgacagaaactaacagacattaaccaacagcgattccgtcgcgtttacttgggaggaaggcggaaaagaggtagtttgtgtggcttctggaaaccctaaatttggaatcccagtatgagaatggtgtcccttcttgtgtttcaatgggatttttacttcgcgagtcttgtgggtttggttttgttttcagtttgcctaacaccgtgcttaggtttgaggcagattggagttcggtcgggggagtttgaatatccggaacagttagtggggaaagctgtggacgcttggtaagagagcgctctggattttccgctgttgacgttgaaaccttgaatgacgaatttcgtattaagtgacttagccttgtaaaattgaggggaggcttgcggaatattaacgtatttaaggcattttgaaggaatagttgctaattttgaagaatattaggtgtaaaagcaagaaatacaatgatcctgaggtgacacgcttatgttttacttttaaactagGTCACC (SEQ ID NO: 30)
在一些實施例中，本發明之啟動子藉由腫瘤微環境內之信號調節。若在腫瘤微環境存在下啟動子之活性相對於缺少腫瘤微環境時啟動子之活性增加或減少至少10%，則認為腫瘤微環境調節啟動子。在一些實施例中，啟動子之活性相對於缺少腫瘤微環境時啟動子之活性增加或減少至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%。舉例而言，啟動子之活性相對於缺少腫瘤微環境時啟動子之活性增加或減少10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-100%、10-200%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-100%、20-200%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-100%或50-200%。
在一些實施例中，啟動子之活性相對於缺少腫瘤微環境時啟動子之活性增加或減少至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。舉例而言，啟動子之活性相對於缺少腫瘤微環境時啟動子之活性增加或減少至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些實施例中，啟動子之活性相對於缺少腫瘤微環境時啟動子之活性增加或減少2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
在一些實施例中，本發明之啟動子在低氧狀態下活化。「低氧狀態」為在組織層面，身體或身體區域喪失適當供氧之狀態。低氧狀態可引起炎症(例如在低氧狀態下炎性細胞介素之水準增加)。在一些實施例中，在低氧狀態下活化之啟動子可操作地連接於編碼減少炎性細胞介素活性之表現之效應分子的核苷酸，因此減少由低氧狀態所引起之炎症。在一些實施例中，在低氧狀態下活化之啟動子包含缺氧反應元件(hypoxia responsive element，HRE)。「缺氧反應元件(HRE)」為對低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)起反應之反應元件。在一些實施例中，HRE包含一致基序NCGTG (其中N為A或G)。
在一些實施例中，經工程改造之細胞產生多種效應分子。舉例而言，細胞可經工程改造以產生2-20種不同效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生2-20種、2-19種、2-18種、2-17種、2-16種、2-15種、2-14種、2-13種、2-12種、2-11種、2-10種、2-9種、2-8種、2-7種、2-6種、2-5種、2-4種、2-3種、3-20種、3-19種、3-18種、3-17種、3-16種、3-15種、3-14種、3-13種、3-12種、3-11種、3-10種、3-9種、3-8種、3-7種、3-6種、3-5種、3-4種、4-20種、4-19種、4-18種、4-17種、4-16種、4-15種、4-14種、4-13種、4-12種、4-11種、4-10種、4-9種、4-8種、4-7種、4-6種、4-5種、5-20種、5-19種、5-18種、5-17種、5-16種、5-15種、5-14種、5-13種、5-12種、5-11種、5-10種、5-9種、5-8種、5-7種、5-6種、6-20種、6-19種、6-18種、6-17種、6-16種、6-15種、6-14種、6-13種、6-12種、6-11種、6-10種、6-9種、6-8種、6-7種、7-20種、7-19種、7-18種、7-17種、7-16種、7-15種、7-14種、7-13種、7-12種、7-11種、7-10種、7-9種、7-8種、8-20種、8-19種、8-18種、8-17種、8-16種、8-15種、8-14種、8-13種、8-12種、8-11種、8-10種、8-9種、9-20種、9-19種、9-18種、9-17種、9-16種、9-15種、9-14種、9-13種、9-12種、9-11種、9-10種、10-20種、10-19種、10-18種、10-17種、10-16種、10-15種、10-14種、10-13種、10-12種、10-11種、11-20種、11-19種、11-18種、11-17種、11-16種、11-15種、11-14種、11-13種、11-12種、12-20種、12-19種、12-18種、12-17種、12-16種、12-15種、12-14種、12-13種、13-20種、13-19種、13-18種、13-17種、13-16種、13-15種、13-14種、14-20種、14-19種、14-18種、14-17種、14-16種、14-15種、15-20種、15-19種、15-18種、15-17種、15-16種、16-20種、16-19種、16-18種、16-17種、17-20種、17-19種、17-18種、18-20種、18-19種或19-20種不同效應分子。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生 1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種或20種不同效應分子。
在一些實施例中，外源性序列可為多順反子的，亦即超過一個分開多肽(例如多種效應分子)可由單一mRNA轉錄本產生。經由使用各種連接子，外源性序列可為多順反子，例如編碼第一效應分子之多核苷酸序列可連接於編碼第二效應分子之核苷酸序列，諸如呈第一基因:第二基因5’至3’取向。連接子可編碼2A核糖體跳躍元件，諸如T2A。其他2A核糖體跳躍元件包括(但不限於) E2A、P2A及F2A。2A核糖體跳躍元件允許產生藉由之第一及第二基因編碼的分開多肽，在轉譯期間產生。連接子可編碼可裂解連接子多肽序列，諸如弗林蛋白酶裂解位點或TEV裂解位點，其中在表現之後，可裂解連接子多肽裂解，從而產生藉由第一及第二基因編碼之分開多肽。可裂解連接子可包括多肽序列，諸如進一步促進裂解之可撓性連接子(例如Gly-Ser-Gly序列)。
連接子可編碼內部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site，IRES)，從而在轉譯期間產生藉由第一及第二基因編碼之分開多肽。連接子可編碼剪接接受體，諸如病毒剪接接受體。
連接子可為連接子組合，諸如弗林蛋白酶-2A連接子，其可經由2A核糖體跳躍產生分開多肽，接著進一步裂解弗林蛋白酶位點，從而完全移除2A殘餘物。在一些實施例中，連接子組合可包括弗林蛋白酶序列、可撓性連接子及2A連接子。因此，在一些實施例中，連接子為弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-2A融合多肽。在一些實施例中，本發明之連接子為弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-T2A融合多肽。
一般而言，多順反子系統可使用任何數目之連接子或連接子組合，以表現任何數目之基因或其部分(例如外源性序列可編碼第一、第二及第三效應分子，各由連接子分開，從而產生藉由第一、第二及第三效應分子編碼之分開多肽。
外源性序列可使用多個啟動子以自多個ORF表現基因，亦即超過一個分開mRNA轉錄本可由外源性序列產生。舉例而言，第一啟動子可操作地連接於編碼第一效應分子之多核苷酸序列，且第二啟動子可操作地連接於編碼第二效應分子之多核苷酸序列。
如本文所用，「連接子」可指連接第一多肽序列與第二多肽序列之多肽、上述多順反子連接子或可操作地連接於上述額外ORF之額外啟動子。
本發明之經工程改造之細胞，諸如MSC通常產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，效應分子中之至少一種刺激腫瘤微環境中之炎性路徑，且效應分子中之至少一種抑制腫瘤微環境中之負炎症調節因子。
「腫瘤微環境」為其中存在腫瘤之細胞環境，包括周圍血管、免疫細胞、纖維母細胞、骨髓來源炎性細胞、淋巴細胞、信號傳導分子及細胞外基質(extracellular matrix，ECM) (參見例如Pattabiraman, D.R.及Weinberg, R.A.Nature Reviews Drug Discovery 13, 497-512 (2014)；Balkwill, F.R.等人J Cell Sci 125, 5591-5596, 2012；及Li, H.等人J Cell Biochem 101(4), 805-15, 2007)。
在一些實施例中，細胞經工程改造以產生至少一種歸巢分子。「歸巢」係指細胞主動導航(遷移)至標靶位點(例如細胞、組織(例如腫瘤)或器官)。「歸巢分子」係指將細胞引導至標靶位點之分子。在一些實施例中，歸巢分子用於識別及/或起始細胞與標靶位點之相互作用。歸巢分子之非限制性實例包括CXCR1、CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7及PDGFR。
在一些實施例中，歸巢分子為趨化介素受體(結合於趨化介素之細胞表面分子)。趨化介素為由細胞分泌的可誘導細胞中之定向趨化性的小細胞介素或信號傳導蛋白。趨化介素可分為四個主要亞科：CXC、CC、CX3C及XC，均藉由選擇性地結合於位於標靶細胞表面之趨化介素受體來發揮生物效應。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生CXCR4，CXCR4係一種允許細胞沿著趨化介素梯度歸巢至表現基質細胞來源因子1 (亦稱SDF1、C-X-C基元趨化介素12及CXCL12)之細胞、組織或腫瘤的趨化介素受體。可藉由本發明之經工程改造之細胞產生的趨化介素受體之非限制性實例包括：CXC趨化介素受體(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6及CXCR7)、CC趨化介素受體(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10及CCR11)、CX3C趨化介素受體(例如CX3CR1，其結合於CX3CL1)及XC趨化介素受體(例如XCR1)。在一些實施例中，趨化介素受體為G蛋白連接跨膜受體，或腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族之成員(包括(但不限於)TNFRSF1A、TNFRSF1B)。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生CXCL8、CXCL9及/或CXCL10、CXCL11或涵蓋CXCL10及CXCL11 (促進T細胞募集)、CCL3及/或CXCL5、CCL21 (Th1募集及極化)之融合蛋白。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生CXCL13以促進B細胞募集。
在一些實施例中，細胞經工程改造以產生偵測含有N-甲醯化寡肽(包括(但不限於)FPR2及FPRL1)之G蛋白偶合受體(G-protein coupled receptor，GPCR)。
在一些實施例中，細胞經工程改造以產生偵測介白素(包括(但不限於)IL6R)之受體。
在一些實施例中，細胞經工程改造以產生偵測自其他細胞、組織或腫瘤分泌之生長因子的受體(包括(但不限於)FGFR、PDGFR、EGFR及VEGF家族受體，包括(但不限於)VEGF-C及VEGF-D)。
在一些實施例中，歸巢分子為整合素。整合素為促進細胞-細胞外基質(extracellular matrix，ECM)黏附之跨膜受體。整合素為具有兩個次單元之專性異源二聚體：α (α)及β (β)。整合素之α次單元可為不限於：ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。整合素之β次單元可為不限於：ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7及ITGB8。本發明之細胞可經工程改造以產生整合素α與β次單元之任何組合。
在一些實施例中，歸巢分子為基質金屬蛋白酶(MMP)。MMP為使下伏在內皮細胞壁之基底膜之組分裂解的酶。MMP之非限制性實例包括MMP-2、MMP-9及MMP。在一些實施例中，細胞經工程改造以產生抑制MMP之分子(例如蛋白質)之抑制劑。舉例而言，細胞可經工程改造以表現膜1型MMP (MT1- MMP)之抑制劑(例如RNAi分子)或TIMP金屬蛋白酶抑制劑1 (TIMP-1)。
在一些實施例中，歸巢分子為結合於例如標靶組織之內皮上之選擇素(例如造血細胞E-/L-選擇素配位體(HCELL)，Dykstra等人, Stem Cells. 2016年10月;34(10):2501-2511)的配位體。
術語「歸巢分子」亦涵蓋調控改善/增強細胞歸巢之分子產生的轉錄因子。
在一些實施例中，細胞歸巢藉由局部照射個體中之腫瘤/癌細胞而增加。放射性組織損傷幫助細胞歸巢，以及內源性T細胞歸巢至該損傷組織。經工程改造之細胞的實例
如本文提供之細胞(例如MSC)經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，至少一種(例如1種、2種、3種、4種、5種或更多種)效應分子刺激腫瘤微環境中之至少一種免疫刺激機制，或抑制腫瘤微環境中之至少一種免疫抑制機制。在一些實施例中，至少一種(例如1種、2種、3種、4種、5種或更多種)效應分子刺激腫瘤微環境中之至少一種免疫刺激機制，且至少一種效應分子(例如1種、2種、3種、4種、5種或更多種)抑制腫瘤微環境中之至少一種免疫抑制機制。在其他實施例中，至少兩種(例如2種、3種、4種、5種或更多種)效應分子刺激腫瘤微環境中之至少一種免疫刺激機制。在其他實施例中，至少兩種(例如1種、2種、3種、4種、5種或更多種)效應分子抑制腫瘤微環境中之至少一種免疫刺激機制。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激T細胞信號傳導、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激抗原呈遞及/或加工之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激天然殺手細胞介導之細胞毒性信號傳導、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激樹突狀細胞分化及/或成熟之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激免疫細胞募集之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激M1巨噬細胞信號傳導、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激Th1極化之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激基質降解之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激免疫刺激代謝物產生之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種刺激I型干擾素信號傳導之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種抑制負共刺激信號傳導之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種抑制抗腫瘤免疫細胞之促細胞凋亡信號傳導(例如經由TRAIL)之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種抑制調控T (Treg )細胞信號傳導、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種抑制腫瘤檢查點分子之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種活化干擾素基因刺激蛋白(STING)信號傳導之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種抑制骨髓來源抑制性細胞信號傳導、活性及/或募集之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種降解免疫抑制因子/代謝物之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種抑制血管內皮生長因子信號傳導之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種直接殺死腫瘤細胞之效應分子(例如顆粒酶、穿孔素、溶瘤病毒、細胞溶解肽及酶、例如引起ADCC之抗腫瘤抗體)。
在一些實施例中，至少一種效應分子：刺激T細胞信號傳導、活性及/或募集，刺激抗原呈遞及/或加工，刺激天然殺手細胞介導之細胞毒性信號傳導、活性及/或募集，刺激樹突狀細胞分化及/或成熟，刺激免疫細胞募集，刺激巨噬細胞信號傳導，刺激基質降解，刺激免疫刺激代謝物產生，或刺激I型干擾素信號傳導；且至少一種效應分子抑制負共刺激信號傳導，抑制抗腫瘤免疫細胞之促細胞凋亡信號傳導，抑制調控T (Treg)細胞信號傳導、活性及/或募集，抑制腫瘤檢查點分子，活化干擾素基因刺激蛋白(STING)信號傳導，抑制骨髓來源抑制性細胞信號傳導、活性及/或募集，降解免疫抑制因子/代謝物，抑制血管內皮生長因子信號傳導或直接殺死腫瘤細胞。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生至少一種選自IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配位體及CD40L之效應分子；及/或至少一種選自抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體及抗IL-35抗體之效應分子；及/或至少一種選自MIP1α (CCL3)、MIP1β (CCL5)及 CCL21之效應分子；及/或至少一種選自CpG寡去氧核苷酸之效應分子及/或至少一種選自微生物肽之效應分子。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種選自細胞介素、抗體、趨化介素、核苷酸、肽、酶及干擾素基因刺激蛋白(STING)之效應分子。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種細胞介素或受體/配位體(例如IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配位體及/或CD40L)。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種細胞介素或受體/配位體(例如IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配位體及/或CD40L)。
在一些實施例中，細胞介素產生為與自我結合於細胞介素以誘導細胞特異性靶向結合的抗體、抗體-片段或受體，諸如IL-2與防止IL-2結合於Treg細胞且優先結合於CD8及NK細胞之抗體片段的經工程改造之融合蛋白。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種抗體(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗VEGF、抗TGF-β、抗IL-10、抗TNF-α及/或抗IL-35抗體)。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種趨化介素(MIP1α (CCL3)、MIP1β (CCL5)及/或CCL21)。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種核苷酸(例如CpG寡去氧核苷酸)。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種肽(例如抗腫瘤肽)。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種酶。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種STING活化劑。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及至少一種具有直接抗腫瘤活性之效應子(例如溶瘤病毒)。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及MIP1-α。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及MIP1-β。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及CXCL9。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及CXCL10。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及CXCL11。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及MIP1-α。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及MIP1-β。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及CXCL9。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及CXCL10。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及CXCL11。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及MIP1-α。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及MIP1-β。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及CXCL9。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及CXCL10。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及CXCL11。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TNF相關之細胞凋亡誘導配位體(TRAIL)及MIP1-α。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及MIP1-β。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及CXCL9。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及CXCL10。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及CXCL11。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生干擾素基因刺激蛋白(STING)及MIP1-α。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及MIP1-β。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及CXCL9。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及CXCL10。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及CXCL11。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及MIP1-α。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及MIP1-β。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及CXCL9。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及CXCL10。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及CXCL11。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18及/或41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及MIP1-α。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及MIP1-β。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及CXCL9。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及CXCL10。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及CXCL11。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL10-11融合物、CXCL13及/或CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TNF相關之細胞凋亡誘導配位體(TRAIL)及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生干擾素基因刺激蛋白(STING)及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及MIP1-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及MIP1-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及IL-12。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及IFN-γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及IL-2。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及IL-7。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及IL-15。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及IL-36γ。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及IL-18。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及CD40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及41BB-L。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN- α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生抗CD40抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-L1抗體及/或OX40L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-α及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CXCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-β及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CXCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生TRAIL及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CXCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生STING及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CXCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CXCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生腺苷去胺酶及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CXCL21。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-α及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生MIP1-β及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL9及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL10及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CXCL11及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CCL21及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L及/或41BB-L。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-12及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-γ及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-γ及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-γ及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IFN-γ及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-2及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-2及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-2及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-2及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-7及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-7及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-7及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-7及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-15及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-15及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-15及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-15及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-36-γ及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-36-γ及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-36-γ及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-36-γ及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-18及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-18及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-18及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生IL-18及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生CD40L及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。
在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生41BB-L及抗PD-L1抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生41BB-L及OX40L。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生41BB-L及抗CTLA4抗體。在一些實施例中，細胞(例如MSC)經工程改造以產生41BB-L及抗CD47抗體。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L及/或腺苷去胺酶。在一些實施例中，細胞經工程改造以進一步產生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11及/或CCL21。分泌信號
一般而言，一或多種效應分子在效應分子之N端包含分泌信號肽(亦稱信號肽或信號序列)，其指導新合成之蛋白質進行分泌或膜插入至適當蛋白質加工路徑。與效應分子可操作地相關聯之分泌信號肽可為天然分泌信號肽天然分泌信號肽(例如一般與給定效應分子內源性相關之分泌信號肽)。與效應分子可操作地相關聯之分泌信號肽可為非天然分泌信號肽天然分泌信號肽。非天然分泌信號肽可促進表現及功能改善，諸如維持分泌，尤其環境，諸如腫瘤微環境。非天然分泌信號肽之非限制性實例展示於表5中。表 5. 例示性信號分泌肽
名稱 蛋白質序列 來源 (Uniprot) DNA 序列
IL-12 MCHQQLVISWFSLVFLASPLVA (SEQ ID NO: 112) P29460 ATGTGTCACCAGCAGCTCGTTATATCCTGGTTTAGTTTGGTGTTTCTCGCTTCACCCCTGGTGGCA (SEQ ID NO: 31)
IL-12 ( 密碼子優化 ) MCHQQLVISWFSLVFLASPLVA (SEQ ID NO: 112) - ATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCC (SEQ ID NO: 32)
IL-2 ( 優化 ) MQLLSCIALILALV (SEQ ID NO: 113) - ATGCAACTGCTGTCATGTATCGCACTCATCCTGGCGCTGGTA (SEQ ID NO: 33)
IL-2 ( 天然 ) MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 114) P60568 ATGTATCGGATGCAACTTTTGAGCTGCATCGCATTGTCTCTGGCGCTGGTGACAAATTCC (SEQ ID NO: 34)
胰蛋白酶原 -2 MNLLLILTFVAAAVA (SEQ ID NO: 115) P07478 ATGAATCTCTTGCTCATACTTACGTTTGTCGCTGCTGCCGTTGCG (SEQ ID NO: 35)
高斯螢光素酶 MGVKVLFALICIAVAEA (SEQ ID NO: 116) - ATGGGCGTGAAGGTCTTGTTTGCCCTTATCTGCATAGCTGTTGCGGAGGCG (SEQ ID NO: 36)
CD5 MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG (SEQ ID NO: 117) P06127 ATGCCGATGGGGAGCCTTCAACCTTTGGCAACGCTTTATCTTCTGGGGATGTTGGTTGCTAGTTGCCTTGGG (SEQ ID NO: 37)
IgKVII ( 小鼠 ) METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID NO: 118) ATGGAAACTGACACGTTGTTGCTGTGGGTATTGCTCTTGTGGGTCCCAGGATCTACGGGCGAC (SEQ ID NO: 38)
IgKVII ( 人類 ) MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEQ ID NO: 119) P01597 ATGGATATGAGGGTTCCCGCCCAGCTTTTGGGGCTGCTTTTGTTGTGGCTTCGAGGGGCTCGGTGT (SEQ ID NO: 39)
VSV-G MKCLLYLAFLFIGVNC (SEQ ID NO: 120) - ATGAAGTGTCTGTTGTACCTGGCGTTTCTGTTCATTGGTGTAAACTGT (SEQ ID NO: 40)
催乳激素 MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP (SEQ ID NO: 121) P01236 ATGAATATCAAAGGAAGTCCGTGGAAGGGTAGTCTCCTGCTGCTCCTCGTATCTAACCTTCTCCTTTGTCAATCCGTGGCACCC (SEQ ID NO: 41)
血清白蛋白前原蛋白 MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO: 122) P02768 ATGAAATGGGTAACATTCATATCACTTCTCTTTCTGTTCAGCTCTGCGTATTCT (SEQ ID NO: 42)
天青殺素前原蛋白 MTRLTVLALLAGLLASSRA (SEQ ID NO: 123) 20160 ATGACAAGGCTTACTGTTTTGGCTCTCCTCGCTGGACTCTTGGCTTCCTCCCGAGCA (SEQ ID NO: 43)
骨結合素 (BM40) MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 124) P09486 ATGAGGGCTTGGATTTTTTTTCTGCTCTGCCTTGCCGGTCGAGCCCTGGCG (SEQ ID NO: 44)
CD33 MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 125) P20138 ATGCCTCTTCTGCTTTTGCTTCCTCTTTTGTGGGCAGGTGCCCTCGCA (SEQ ID NO: 45)
IL-6 MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAP (SEQ ID NO: 126) P05231 ATGAACTCTTTCTCAACCTCTGCGTTTGGTCCGGTCGCTTTCTCCCTTGGGCTCCTGCTTGTCTTGCCAGCAGCGTTTCCTGCGCCA (SEQ ID NO: 46)
IL-8 MTSKLAVALLAAFLISAALC (SEQ ID NO: 127) P10145 ATGACAAGTAAACTGGCGGTAGCCTTGCTCGCGGCCTTTTTGATTTCCGCAGCCCTTTGT (SEQ ID NO: 47)
CCL2 MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLA (SEQ ID NO: 128) P13500 ATGAAGGTAAGTGCAGCGTTGCTTTGCCTTCTCCTCATTGCAGCGACCTTTATTCCTCAAGGGCTGGCC (SEQ ID NO: 48)
TIMP2 MGAAARTLRLALGLLLLATLLRPADA (SEQ ID NO: 129) P16035 ATGGGAGCGGCAGCTAGAACACTTCGACTTGCCCTTGGGCTCTTGCTCCTTGCAACCCTCCTTAGACCTGCCGACGCA (SEQ ID NO: 49)
VEGFB MSPLLRRLLLAALLQLAPAQA (SEQ ID NO: 130) P49765 ATGTCACCGTTGTTGCGGAGATTGCTGTTGGCCGCACTTTTGCAACTGGCTCCTGCTCAAGCC (SEQ ID NO: 50)
骨保護素 MNNLLCCALVFLDISIKWTTQ (SEQ ID NO: 131) O00300 ATGAATAACCTGCTCTGTTGTGCGCTCGTGTTCCTGGACATTTCTATAAAATGGACAACGCAA (SEQ ID NO: 51)
絲胺酸蛋白酶抑制劑 E1 MQMSPALTCLVLGLALVFGEGSA (SEQ ID NO: 132) P05121 ATGCAAATGTCTCCTGCCCTTACCTGTCTCGTACTTGGTCTTGCGCTCGTATTTGGAGAGGGATCAGCC (SEQ ID NO: 52)
GROα MARAALSAAPSNPRLLRVALLLLLLVAAGRRAAG (SEQ ID NO: 133) P09341 ATGGCAAGGGCTGCACTCAGTGCTGCCCCGTCTAATCCCAGATTGCTTCGAGTTGCATTGCTTCTTCTGTTGCTGGTTGCAGCTGGTAGGAGAGCAGCGGGT (SEQ ID NO: 53)
CXCL12 MNAKVVVVLVLVLTALCLSDG (SEQ ID NO: 134) P48061 ATGAATGCAAAAGTCGTGGTCGTGCTGGTTTTGGTTCTGACGGCGTTGTGTCTTAGTGATGGG (SEQ ID NO: 54)
IL-21 ( 密碼子優化 ) MERIVICLMVIFLGTLVHKSSS (SEQ ID NO: 135) Q9HBE4 ATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGC (SEQ ID NO: 55)
細胞類型
本發明提及經工程改造以產生多種效應分子之間葉幹細胞(MSC) (例如人類MSC)。如本文提供之經工程改造之細胞(經工程改造以產生效應分子)亦可選自天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、巨噬細胞、嗜中性白血球及樹突狀細胞、T細胞(例如CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γ-δ T細胞及T調控細胞(CD4+ 、FOXP3+ 、CD25+ ))及B細胞。然而應瞭解，對MSC工程改造之任何提及亦可應用於其他細胞類型(例如免疫系統之細胞類型)。
在一些實施例中，經工程改造之細胞(例如MSC)來自(例如獲自或源自於)骨髓。在一些實施例中，經工程改造之間葉幹細胞來自(例如獲自或源自於)脂肪組織。在一些實施例中，經工程改造之間葉幹細胞來自(例如獲自或源自於)臍帶。在一些實施例中，經工程改造之間葉幹細胞來自多能幹細胞(例如胚胎幹細胞或誘導多能幹細胞)。
因此，本發明提供經工程改造以產生多種效應分子之T細胞(例如CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γ-δ T細胞及T調控細胞(CD4+ 、FOXP3+ 、CD25+ ))，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，B細胞經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，NK細胞經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，NKT細胞經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，先天淋巴樣細胞經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，肥大細胞經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，嗜伊紅白血球經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，嗜鹼性球經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，巨噬細胞經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，嗜中性白血球經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。在一些實施例中，樹突狀細胞經工程改造以產生多種效應分子，其中至少兩種效應分子調節不同的腫瘤介導之免疫抑制機制。
在一些實施例中，效應分子中之至少一種刺激腫瘤微環境中之免疫刺激機制及/或抑制腫瘤微環境中之免疫抑制機制。
在一些實施例中，效應分子中之至少一種(a)刺激T細胞信號傳導、活性及/或募集，(b)刺激抗原呈遞及/或加工，(c)刺激天然殺手細胞介導之細胞毒性信號傳導、活性及/或募集，(d)刺激樹突狀細胞分化及/或成熟，(e)刺激免疫細胞募集，(f)刺激促炎性巨噬細胞信號傳導、活性及/或募集或抑制消炎巨噬細胞信號傳導、活性及/或募集，(g)刺激基質降解，(h)刺激免疫刺激代謝物產生，(i)刺激I型干擾素信號傳導，(j)抑制負共刺激信號傳導，(k)抑制抗腫瘤免疫細胞之促細胞凋亡信號傳導，(l)抑制調控T (Treg )細胞信號傳導、活性及/或募集，(m)抑制腫瘤檢查點分子，(n)刺激干擾素基因刺激蛋白(STING)信號傳導，(o)抑制骨髓來源抑制性細胞信號傳導、活性及/或募集，(p)降解免疫抑制因子/代謝物，(q)抑制血管內皮生長因子信號傳導，及/或(r)直接殺死腫瘤細胞。方法
本文亦提供包括培養本發明之經工程改造之MSC (或其他經工程改造之免疫細胞)之方法。已知培養MSC之方法。在一些實施例中，在生長培養基(例如MSCGM人類間葉幹細胞生長BULLETKIT™培養基(含血清)、THERAPEAK™ MSCGM-CD™間葉幹細胞化學成分明確培養基(無血清)或RoosterBio無異源物種MSC培養基)中培養MSC。本領域之技術人員已知培養其他細胞，諸如免疫細胞之方法。
本文進一步提供包括向個體(例如人類個體)遞送或投與如本文提供之經工程改造之細胞以在活體內產生至少一種由該等細胞產生之效應分子的方法。在一些實施例中，細胞經由靜脈內、腹膜內、氣管內、皮下、腫瘤內、經口、肛門、鼻內(例如包裝在遞送粒子中)或動脈(例如頸內動脈)途徑投與。因此，細胞可全身或局部投與(例如至TME)。
本文所述之經工程改造之細胞或多核苷酸可以呈含有醫藥學上可接受之載劑、例如含水載劑之組合物。可使用多種含水載劑，例如水、緩衝水、0.9%鹽水、0.3%甘胺酸、透明質酸及其類似物。此等組合物可藉由習知之熟知滅菌技術來滅菌，或可無菌過濾。所得水溶液可經包裝原樣使用，或凍乾，凍乾製劑在投與前與無菌溶液組合。根據需要組合物可含有醫藥學上可接受之輔助物質以接近生理條件，諸如pH值調節及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨醇酐酯、油酸三乙醇胺酯等。
一些方法包括選擇具有腫瘤(或癌症)之個體(或患者群體)且用經工程改造之細胞治療個體。
在一些情況下，本發明之經工程改造之細胞可用於治療癌症，諸如卵巢癌。本文描述其他癌症。舉例而言，經工程改造之細胞可用於治療膀胱腫瘤、腦腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸腫瘤、結腸直腸腫瘤、食道腫瘤、神經膠質瘤、腎臟腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、黑色素瘤、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、甲狀腺瘤及/或子宮腫瘤。
本文提供之方法亦包括遞送經工程改造之細胞之製劑，諸如經工程改造之細胞。在一些實施例中，製劑為基本上純之製劑，其含有例如少於5% (例如少於4%、3%、2%或1%)除細胞以外之細胞。製劑可包含1×105 個細胞/公斤至1×107 個細胞/公斤至，諸如經工程改造之細胞。
本文提供之方法亦包括活體內遞送能夠產生本文描述之經工程改造之細胞的組合物，諸如活體內遞送慢病毒。亦可使用其他活體內遞送機制及系統，包括已知用於人類療法中之遞送機制及系統，諸如病毒遞送系統(例如逆轉錄病毒或腺病毒系統)、轉座子(例如Sleeping Beauty及PiggyBac轉座子系統)，使用PhiC31整合至基因組假位點，或使用核酸酶，諸如鋅指(ZF)、規律間隔成簇短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)或類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)。
表 6 ：編碼例示性效應分子之序列
IL12 (人類) (SEQ ID NO: 56)
ATGTGCCATCAGCAGCTTGTCATATCTTGGTTTTCACTTGTATTCCTGGCCAGCCCTTTGGTTGCGATCTGGGAGCTCAAGAAGGATGTGTACGTTGTAGAGCTGGACTGGTACCCCGATGCTCCCGGTGAGATGGTCGTTTTGACATGTGACACTCCAGAAGAGGACGGTATTACGTGGACTCTGGACCAGTCCTCCGAAGTTCTTGGTTCTGGTAAGACTCTGACTATCCAGGTGAAAGAATTTGGGGATGCGGGACAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGTTGTCTCATAGTTTGCTGCTTCTCCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGAGCACCGACATACTCAAGGATCAAAAGGAACCCAAAAATAAGACATTTCTGCGATGTGAGGCTAAGAACTATAGTGGCCGCTTCACTTGTTGGTGGCTGACTACCATCAGCACAGATCTCACGTTTTCAGTAAAAAGTAGTAGAGGTTCAAGTGATCCTCAAGGGGTAACGTGCGGTGCTGCAACACTGTCTGCTGAACGCGTAAGAGGAGATAATAAGGAGTACGAGTATTCCGTAGAATGCCAAGAGGACAGTGCTTGTCCTGCGGCCGAGGAGTCTCTCCCAATAGAAGTGATGGTGGACGCGGTGCATAAACTGAAATATGAGAACTACACAAGCAGTTTTTTTATAAGAGATATCATCAAGCCCGATCCGCCGAAGAATTTGCAACTTAAACCGCTTAAAAACTCACGCCAGGTTGAAGTATCCTGGGAGTATCCGGATACATGGTCAACACCACACAGCTATTTTTCCCTTACCTTCTGTGTGCAGGTCCAAGGGAAGAGCAAAAGGGAGAAGAAGGACAGGGTATTCACTGATAAAACTTCCGCGACGGTCATCTGCCGAAAAAACGCTAGTATATCTGTACGGGCGCAGGATAGGTACTATAGTTCTTCTTGGTCTGAGTGGGCCTCAGTTCCGTGCTCTGGGGGAGGAAGTGGAGGAGGGTCCGGCGGTGGAAGCGGGGGAGGGAGTCGCAACTTGCCAGTGGCTACACCAGATCCAGGCATGTTTCCATGTCTGCATCATTCCCAGAATCTCCTGAGAGCGGTGTCAAATATGCTCCAAAAAGCGAGACAAACACTGGAATTTTACCCGTGTACCAGTGAGGAGATTGATCACGAGGACATAACCAAGGACAAGACCTCAACTGTAGAAGCGTGTTTGCCGCTGGAGTTGACTAAGAATGAGTCCTGCCTCAATTCCAGAGAAACTTCATTCATTACTAACGGCAGTTGTCTTGCATCCCGGAAAACGTCCTTTATGATGGCCCTTTGCCTTAGTTCAATTTACGAGGATCTTAAAATGTATCAAGTGGAGTTTAAAACCATGAATGCTAAACTTCTTATGGACCCCAAACGACAAATTTTTCTGGATCAGAATATGCTTGCCGTGATAGACGAACTCATGCAGGCGCTTAATTTTAACTCCGAAACAGTTCCACAAAAATCTAGCCTTGAAGAACCTGATTTTTATAAAACGAAGATTAAACTGTGTATCCTGCTGCATGCCTTTCGCATCCGAGCTGTCACAATCGATAGGGTTATGTCCTACCTTAACGCGAGCtaG
IL12p70 (人類；密碼子優化；粗體表示信號序列) (SEQ ID NO: 57)
ATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCC ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAGCTGGATTGGTACCCGGACGCCCCTGGAGAAATGGTCGTGCTGACTTGCGATACGCCAGAAGAGGACGGCATAACCTGGACCCTGGATCAGAGCTCCGAGGTGCTCGGAAGCGGAAAGACCCTGACCATTCAAGTCAAGGAGTTCGGCGACGCGGGCCAGTACACTTGCCACAAGGGTGGCGAAGTGCTGTCCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGTCCACTGACATCCTCAAGGACCAAAAAGAACCGAAGAACAAGACCTTCCTCCGCTGCGAAGCCAAGAACTACAGCGGTCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACGACAATCTCCACCGACCTGACTTTCTCCGTGAAGTCGTCACGGGGATCAAGCGATCCTCAGGGCGTGACCTGTGGAGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGAGAGTCAGGGGAGACAACAAGGAATATGAGTACTCCGTGGAATGCCAGGAGGACAGCGCCTGCCCTGCCGCGGAAGAGTCCCTGCCTATCGAGGTCATGGTCGATGCCGTGCATAAGCTGAAATACGAGAACTACACTTCCTCCTTCTTTATCCGCGACATCATCAAGCCTGACCCCCCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCACTCAAGAACTCCCGCCAAGTGGAAGTGTCTTGGGAATATCCAGACACTTGGAGCACCCCGCACTCATACTTCTCGCTCACTTTCTGTGTGCAAGTGCAGGGAAAGTCCAAACGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACCGACAAAACCTCCGCCACTGTGATTTGTCGGAAGAACGCGTCAATCAGCGTCCGGGCGCAGGATAGATACTACTCGTCCTCCTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGTGGCGGATCAGGCGGAGGTTCAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGTTCCCGGAACCTCCCTGTGGCAACCCCCGACCCTGGAATGTTCCCGTGCCTACACCACTCCCAAAACCTCCTGAGGGCTGTGTCGAACATGTTGCAGAAGGCCCGCCAGACCCTTGAGTTCTACCCCTGCACCTCGGAAGAAATTGATCACGAGGACATCACCAAGGACAAGACCTCGACCGTGGAAGCCTGCCTGCCGCTGGAACTGACCAAGAACGAATCGTGTCTGAACTCCCGCGAGACAAGCTTTATCACTAACGGCAGCTGCCTGGCGTCGAGAAAGACCTCATTCATGATGGCGCTCTGTCTTTCCTCGATCTACGAAGATCTGAAGATGTATCAGGTCGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCGAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAATATGCTCGCCGTGATTGATGAACTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACTCCGAGACTGTGCCTCAAAAGTCCAGCCTGGAAGAACCGGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGTTGCACGCTTTCCGCATTCGAGCCGTGACCATTGACCGCGTGATGTCCTACCTGAACGCCAGT
IL12 (小鼠) (SEQ ID NO: 58)
ATGTGTCCACAGAAGCTGACAATAAGTTGGTTTGCCATTGTCCTCCTGGTGAGCCCACTCATGGCAATGTGGGAACTCGAAAAGGATGTCTACGTGGTAGAAGTAGATTGGACTCCAGACGCGCCAGGGGAGACAGTGAATTTGACATGTGACACACCAGAAGAAGATGACATTACATGGACATCTGACCAACGCCATGGCGTAATAGGGAGTGGGAAAACACTCACGATCACAGTTAAAGAGTTCTTGGATGCTGGTCAATATACTTGCCATAAAGGCGGCGAGACACTCAGCCACTCACATTTGCTTTTGCATAAAAAAGAGAATGGCATTTGGAGCACTGAAATACTTAAGAACTTTAAGAACAAGACATTTCTCAAGTGTGAGGCCCCTAATTACAGCGGCAGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTCCAGCGCAACATGGACCTCAAGTTTAACATAAAATCTTCTTCCTCTTCACCTGACTCCAGAGCTGTTACTTGCGGCATGGCTTCTCTGAGCGCAGAAAAAGTAACGTTGGATCAAAGAGACTACGAAAAGTACTCTGTTTCTTGTCAAGAGGATGTTACGTGCCCGACGGCCGAAGAAACGCTTCCAATTGAACTCGCGTTGGAAGCTCGCCAACAAAACAAGTATGAAAACTACAGTACAAGCTTCTTTATACGGGATATAATTAAACCCGATCCCCCCAAGAACTTGCAAATGAAACCACTTAAGAACAGCCAGGTGGAAGTTTCCTGGGAGTATCCAGACTCATGGAGTACTCCTCACAGCTATTTTTCTCTGAAATTCTTTGTAAGGATACAACGGAAGAAAGAGAAGATGAAAGAGACCGAGGAGGGTTGTAATCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTGGAGAAAACGTCTACCGAAGTCCAATGTAAAGGTGGCAATGTGTGCGTCCAAGCTCAGGATAGATACTATAATTCAAGTTGCTCCAAGTGGGCCTGTGTTCCATGCCGCGTTCGGAGCGGGGGAGGTAGCGGAGGAGGTAGTGGGGGTGGGTCAGGAGGAGGGAGTCGAGTTATCCCGGTGTCAGGCCCCGCACGCTGCTTGAGCCAGAGTCGCAACCTCCTTAAGACAACAGATGACATGGTGAAAACAGCACGCGAAAAGCTTAAACACTACTCTTGTACGGCGGAGGATATTGATCACGAGGATATTACCCGAGACCAAACTAGCACTTTGAAAACCTGTCTGCCCCTTGAACTTCATAAAAATGAGAGCTGTCTGGCTACACGAGAGACGTCAAGTACGACTAGGGGCAGCTGTCTCCCGCCGCAAAAGACAAGCCTCATGATGACGCTCTGTTTGGGTTCCATTTACGAGGACTTGAAAATGTATCAAACGGAGTTCCAGGCTATAAATGCGGCGTTGCAGAACCATAACCATCAACAAATTATACTTGATAAAGGCATGTTGGTGGCGATTGATGAACTCATGCAGAGTCTCAATCACAACGGGGAAACGTTGAGACAGAAACCCCCAGTCGGTGAAGCGGACCCATATCGAGTAAAAATGAAGCTCTGCATTCTGCTTCACGCATTCAGCACTAGAGTTGTTACCATCAACCGGGTAATGGGATATCTCTCCAGTGCGtaG
IL21 (人類；密碼子優化；粗體表示信號序列) (SEQ ID NO: 59)
ATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGC CAGGGACAGGACAGGCACATGATTAGAATGCGCCAGCTCATCGATATCGTGGACCAGTTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCGGCCCCCGAAGATGTGGAAACCAATTGCGAATGGTCGGCATTTTCCTGCTTTCAAAAGGCACAGCTCAAGTCCGCTAACACCGGGAACAACGAACGGATCATCAACGTGTCCATCAAAAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACCAACGCCGGACGGAGGCAGAAGCATAGGCTGACTTGCCCGTCATGCGACTCCTACGAGAAGAAGCCGCCGAAGGAGTTCCTGGAGCGGTTCAAGTCGCTCCTGCAAAAGATGATTCATCAGCACCTGTCCTCCCGGACTCATGGGTCTGAGGATTCA
IL12p70_T2A_IL21 (人類；密碼子優化；粗體表示信號序列) (SEQ ID NO: 60)
ATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCC ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAGCTGGATTGGTACCCGGACGCCCCTGGAGAAATGGTCGTGCTGACTTGCGATACGCCAGAAGAGGACGGCATAACCTGGACCCTGGATCAGAGCTCCGAGGTGCTCGGAAGCGGAAAGACCCTGACCATTCAAGTCAAGGAGTTCGGCGACGCGGGCCAGTACACTTGCCACAAGGGTGGCGAAGTGCTGTCCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGTCCACTGACATCCTCAAGGACCAAAAAGAACCGAAGAACAAGACCTTCCTCCGCTGCGAAGCCAAGAACTACAGCGGTCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACGACAATCTCCACCGACCTGACTTTCTCCGTGAAGTCGTCACGGGGATCAAGCGATCCTCAGGGCGTGACCTGTGGAGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGAGAGTCAGGGGAGACAACAAGGAATATGAGTACTCCGTGGAATGCCAGGAGGACAGCGCCTGCCCTGCCGCGGAAGAGTCCCTGCCTATCGAGGTCATGGTCGATGCCGTGCATAAGCTGAAATACGAGAACTACACTTCCTCCTTCTTTATCCGCGACATCATCAAGCCTGACCCCCCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCACTCAAGAACTCCCGCCAAGTGGAAGTGTCTTGGGAATATCCAGACACTTGGAGCACCCCGCACTCATACTTCTCGCTCACTTTCTGTGTGCAAGTGCAGGGAAAGTCCAAACGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACCGACAAAACCTCCGCCACTGTGATTTGTCGGAAGAACGCGTCAATCAGCGTCCGGGCGCAGGATAGATACTACTCGTCCTCCTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGTGGCGGATCAGGCGGAGGTTCAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGTTCCCGGAACCTCCCTGTGGCAACCCCCGACCCTGGAATGTTCCCGTGCCTACACCACTCCCAAAACCTCCTGAGGGCTGTGTCGAACATGTTGCAGAAGGCCCGCCAGACCCTTGAGTTCTACCCCTGCACCTCGGAAGAAATTGATCACGAGGACATCACCAAGGACAAGACCTCGACCGTGGAAGCCTGCCTGCCGCTGGAACTGACCAAGAACGAATCGTGTCTGAACTCCCGCGAGACAAGCTTTATCACTAACGGCAGCTGCCTGGCGTCGAGAAAGACCTCATTCATGATGGCGCTCTGTCTTTCCTCGATCTACGAAGATCTGAAGATGTATCAGGTCGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCGAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAATATGCTCGCCGTGATTGATGAACTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACTCCGAGACTGTGCCTCAAAAGTCCAGCCTGGAAGAACCGGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGTTGCACGCTTTCCGCATTCGAGCCGTGACCATTGACCGCGTGATGTCCTACCTGAACGCCAGTAGACGGAAACGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGCTCGCTGCTTACATGCGGGGACGTGGAAGAGAACCCCGGTCCGATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGC CAGGGACAGGACAGGCACATGATTAGAATGCGCCAGCTCATCGATATCGTGGACCAGTTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCGGCCCCCGAAGATGTGGAAACCAATTGCGAATGGTCGGCATTTTCCTGCTTTCAAAAGGCACAGCTCAAGTCCGCTAACACCGGGAACAACGAACGGATCATCAACGTGTCCATCAAAAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACCAACGCCGGACGGAGGCAGAAGCATAGGCTGACTTGCCCGTCATGCGACTCCTACGAGAAGAAGCCGCCGAAGGAGTTCCTGGAGCGGTTCAAGTCGCTCCTGCAAAAGATGATTCATCAGCACCTGTCCTCCCGGACTCATGGGTCTGAGGATTCA
IL-12_2A_CCL21a (人類) (SEQ ID NO: 61)
ATGTGCCATCAGCAGCTTGTCATATCTTGGTTTTCACTTGTATTCCTGGCCAGCCCTTTGGTTGCGATCTGGGAGCTCAAGAAGGATGTGTACGTTGTAGAGCTGGACTGGTACCCCGATGCTCCCGGTGAGATGGTCGTTTTGACATGTGACACTCCAGAAGAGGACGGTATTACGTGGACTCTGGACCAGTCCTCCGAAGTTCTTGGTTCTGGTAAGACTCTGACTATCCAGGTGAAAGAATTTGGGGATGCGGGACAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGTTGTCTCATAGTTTGCTGCTTCTCCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGAGCACCGACATACTCAAGGATCAAAAGGAACCCAAAAATAAGACATTTCTGCGATGTGAGGCTAAGAACTATAGTGGCCGCTTCACTTGTTGGTGGCTGACTACCATCAGCACAGATCTCACGTTTTCAGTAAAAAGTAGTAGAGGTTCAAGTGATCCTCAAGGGGTAACGTGCGGTGCTGCAACACTGTCTGCTGAACGCGTAAGAGGAGATAATAAGGAGTACGAGTATTCCGTAGAATGCCAAGAGGACAGTGCTTGTCCTGCGGCCGAGGAGTCTCTCCCAATAGAAGTGATGGTGGACGCGGTGCATAAACTGAAATATGAGAACTACACAAGCAGTTTTTTTATAAGAGATATCATCAAGCCCGATCCGCCGAAGAATTTGCAACTTAAACCGCTTAAAAACTCACGCCAGGTTGAAGTATCCTGGGAGTATCCGGATACATGGTCAACACCACACAGCTATTTTTCCCTTACCTTCTGTGTGCAGGTCCAAGGGAAGAGCAAAAGGGAGAAGAAGGACAGGGTATTCACTGATAAAACTTCCGCGACGGTCATCTGCCGAAAAAACGCTAGTATATCTGTACGGGCGCAGGATAGGTACTATAGTTCTTCTTGGTCTGAGTGGGCCTCAGTTCCGTGCTCTGGGGGAGGAAGTGGAGGAGGGTCCGGCGGTGGAAGCGGGGGAGGGAGTCGCAACTTGCCAGTGGCTACACCAGATCCAGGCATGTTTCCATGTCTGCATCATTCCCAGAATCTCCTGAGAGCGGTGTCAAATATGCTCCAAAAAGCGAGACAAACACTGGAATTTTACCCGTGTACCAGTGAGGAGATTGATCACGAGGACATAACCAAGGACAAGACCTCAACTGTAGAAGCGTGTTTGCCGCTGGAGTTGACTAAGAATGAGTCCTGCCTCAATTCCAGAGAAACTTCATTCATTACTAACGGCAGTTGTCTTGCATCCCGGAAAACGTCCTTTATGATGGCCCTTTGCCTTAGTTCAATTTACGAGGATCTTAAAATGTATCAAGTGGAGTTTAAAACCATGAATGCTAAACTTCTTATGGACCCCAAACGACAAATTTTTCTGGATCAGAATATGCTTGCCGTGATAGACGAACTCATGCAGGCGCTTAATTTTAACTCCGAAACAGTTCCACAAAAATCTAGCCTTGAAGAACCTGATTTTTATAAAACGAAGATTAAACTGTGTATCCTGCTGCATGCCTTTCGCATCCGAGCTGTCACAATCGATAGGGTTATGTCCTACCTTAACGCGAGCCGGCGCAAGAGGGGTTCCGGAGAGGGAAGGGGTAGTCTGCTCACCTGCGGCGATGTTGAAGAAAATCCTGGTCCCATGGCGCAAAGTCTGGCTCTTTCACTCCTGATCCTGGTCTTGGCCTTCGGGATTCCGAGGACCCAAGGAAGTGATGGTGGCGCCCAAGATTGTTGCCTTAAATACAGCCAGCGGAAAATACCCGCGAAAGTGGTCAGGAGTTATAGAAAACAGGAGCCTTCCCTGGGTTGTAGTATCCCCGCCATACTTTTCCTCCCGAGAAAACGGAGCCAGGCCGAACTGTGCGCTGACCCTAAGGAACTTTGGGTGCAACAACTTATGCAACACCTGGATAAGACACCTTCTCCTCAAAAGCCAGCTCAGGGCTGCCGAAAAGATAGAGGCGCCTCAAAAACCGGAAAAAAGGGCAAAGGTTCTAAAGGATGTAAGCGGACTGAACGCTCTCAAACGCCTAAAGGGCCGtaG
IL-12_2A_CCL21a (小鼠) (SEQ ID NO: 62)
ATGTGTCCACAGAAGCTGACAATAAGTTGGTTTGCCATTGTCCTCCTGGTGAGCCCACTCATGGCAATGTGGGAACTCGAAAAGGATGTCTACGTGGTAGAAGTAGATTGGACTCCAGACGCGCCAGGGGAGACAGTGAATTTGACATGTGACACACCAGAAGAAGATGACATTACATGGACATCTGACCAACGCCATGGCGTAATAGGGAGTGGGAAAACACTCACGATCACAGTTAAAGAGTTCTTGGATGCTGGTCAATATACTTGCCATAAAGGCGGCGAGACACTCAGCCACTCACATTTGCTTTTGCATAAAAAAGAGAATGGCATTTGGAGCACTGAAATACTTAAGAACTTTAAGAACAAGACATTTCTCAAGTGTGAGGCCCCTAATTACAGCGGCAGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTCCAGCGCAACATGGACCTCAAGTTTAACATAAAATCTTCTTCCTCTTCACCTGACTCCAGAGCTGTTACTTGCGGCATGGCTTCTCTGAGCGCAGAAAAAGTAACGTTGGATCAAAGAGACTACGAAAAGTACTCTGTTTCTTGTCAAGAGGATGTTACGTGCCCGACGGCCGAAGAAACGCTTCCAATTGAACTCGCGTTGGAAGCTCGCCAACAAAACAAGTATGAAAACTACAGTACAAGCTTCTTTATACGGGATATAATTAAACCCGATCCCCCCAAGAACTTGCAAATGAAACCACTTAAGAACAGCCAGGTGGAAGTTTCCTGGGAGTATCCAGACTCATGGAGTACTCCTCACAGCTATTTTTCTCTGAAATTCTTTGTAAGGATACAACGGAAGAAAGAGAAGATGAAAGAGACCGAGGAGGGTTGTAATCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTGGAGAAAACGTCTACCGAAGTCCAATGTAAAGGTGGCAATGTGTGCGTCCAAGCTCAGGATAGATACTATAATTCAAGTTGCTCCAAGTGGGCCTGTGTTCCATGCCGCGTTCGGAGCGGGGGAGGTAGCGGAGGAGGTAGTGGGGGTGGGTCAGGAGGAGGGAGTCGAGTTATCCCGGTGTCAGGCCCCGCACGCTGCTTGAGCCAGAGTCGCAACCTCCTTAAGACAACAGATGACATGGTGAAAACAGCACGCGAAAAGCTTAAACACTACTCTTGTACGGCGGAGGATATTGATCACGAGGATATTACCCGAGACCAAACTAGCACTTTGAAAACCTGTCTGCCCCTTGAACTTCATAAAAATGAGAGCTGTCTGGCTACACGAGAGACGTCAAGTACGACTAGGGGCAGCTGTCTCCCGCCGCAAAAGACAAGCCTCATGATGACGCTCTGTTTGGGTTCCATTTACGAGGACTTGAAAATGTATCAAACGGAGTTCCAGGCTATAAATGCGGCGTTGCAGAACCATAACCATCAACAAATTATACTTGATAAAGGCATGTTGGTGGCGATTGATGAACTCATGCAGAGTCTCAATCACAACGGGGAAACGTTGAGACAGAAACCCCCAGTCGGTGAAGCGGACCCATATCGAGTAAAAATGAAGCTCTGCATTCTGCTTCACGCATTCAGCACTAGAGTTGTTACCATCAACCGGGTAATGGGATATCTCTCCAGTGCGCGGCGCAAGAGGGGTTCCGGAGAGGGAAGGGGTAGTCTGCTCACCTGCGGCGATGTTGAAGAAAATCCTGGTCCCATGGCGCAAATGATGACCCTTTCCCTGCTGAGTCTTGTCCTCGCGCTCTGCATCCCGTGGACGCAGGGGTCTGATGGGGGGGGCCAAGACTGTTGCCTGAAGTATTCACAAAAAAAGATACCGTACTCTATTGTCAGAGGGTACAGGAAGCAAGAACCCTCCTTGGGTTGCCCTATACCAGCAATTCTTTTCTCCCCACGCAAGCATTCCAAACCAGAACTGTGTGCGAACCCCGAGGAGGGTTGGGTACAGAACTTGATGCGAAGGCTTGACCAGCCCCCAGCCCCTGGCAAGCAGTCACCTGGGTGCAGAAAAAACAGAGGTACTTCAAAGAGCGGCAAGAAAGGCAAAGGGAGTAAAGGATGTAAAAGAACGGAGCAGACCCAGCCTTCACGAGGCtaG
CCL21a_2A_IL-12 (小鼠) (SEQ ID NO: 63)
ATGGCGCAAATGATGACCCTTTCCCTGCTGAGTCTTGTCCTCGCGCTCTGCATCCCGTGGACGCAGGGGTCTGATGGGGGGGGCCAAGACTGTTGCCTGAAGTATTCACAAAAAAAGATACCGTACTCTATTGTCAGAGGGTACAGGAAGCAAGAACCCTCCTTGGGTTGCCCTATACCAGCAATTCTTTTCTCCCCACGCAAGCATTCCAAACCAGAACTGTGTGCGAACCCCGAGGAGGGTTGGGTACAGAACTTGATGCGAAGGCTTGACCAGCCCCCAGCCCCTGGCAAGCAGTCACCTGGGTGCAGAAAAAACAGAGGTACTTCAAAGAGCGGCAAGAAAGGCAAAGGGAGTAAAGGATGTAAAAGAACGGAGCAGACCCAGCCTTCACGAGGCCGGCGCAAGAGGGGTTCCGGAGAGGGAAGGGGTAGTCTGCTCACCTGCGGCGATGTTGAAGAAAATCCTGGTCCCATGTGTCCACAGAAGCTGACAATAAGTTGGTTTGCCATTGTCCTCCTGGTGAGCCCACTCATGGCAATGTGGGAACTCGAAAAGGATGTCTACGTGGTAGAAGTAGATTGGACTCCAGACGCGCCAGGGGAGACAGTGAATTTGACATGTGACACACCAGAAGAAGATGACATTACATGGACATCTGACCAACGCCATGGCGTAATAGGGAGTGGGAAAACACTCACGATCACAGTTAAAGAGTTCTTGGATGCTGGTCAATATACTTGCCATAAAGGCGGCGAGACACTCAGCCACTCACATTTGCTTTTGCATAAAAAAGAGAATGGCATTTGGAGCACTGAAATACTTAAGAACTTTAAGAACAAGACATTTCTCAAGTGTGAGGCCCCTAATTACAGCGGCAGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTCCAGCGCAACATGGACCTCAAGTTTAACATAAAATCTTCTTCCTCTTCACCTGACTCCAGAGCTGTTACTTGCGGCATGGCTTCTCTGAGCGCAGAAAAAGTAACGTTGGATCAAAGAGACTACGAAAAGTACTCTGTTTCTTGTCAAGAGGATGTTACGTGCCCGACGGCCGAAGAAACGCTTCCAATTGAACTCGCGTTGGAAGCTCGCCAACAAAACAAGTATGAAAACTACAGTACAAGCTTCTTTATACGGGATATAATTAAACCCGATCCCCCCAAGAACTTGCAAATGAAACCACTTAAGAACAGCCAGGTGGAAGTTTCCTGGGAGTATCCAGACTCATGGAGTACTCCTCACAGCTATTTTTCTCTGAAATTCTTTGTAAGGATACAACGGAAGAAAGAGAAGATGAAAGAGACCGAGGAGGGTTGTAATCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTGGAGAAAACGTCTACCGAAGTCCAATGTAAAGGTGGCAATGTGTGCGTCCAAGCTCAGGATAGATACTATAATTCAAGTTGCTCCAAGTGGGCCTGTGTTCCATGCCGCGTTCGGAGCGGGGGAGGTAGCGGAGGAGGTAGTGGGGGTGGGTCAGGAGGAGGGAGTCGAGTTATCCCGGTGTCAGGCCCCGCACGCTGCTTGAGCCAGAGTCGCAACCTCCTTAAGACAACAGATGACATGGTGAAAACAGCACGCGAAAAGCTTAAACACTACTCTTGTACGGCGGAGGATATTGATCACGAGGATATTACCCGAGACCAAACTAGCACTTTGAAAACCTGTCTGCCCCTTGAACTTCATAAAAATGAGAGCTGTCTGGCTACACGAGAGACGTCAAGTACGACTAGGGGCAGCTGTCTCCCGCCGCAAAAGACAAGCCTCATGATGACGCTCTGTTTGGGTTCCATTTACGAGGACTTGAAAATGTATCAAACGGAGTTCCAGGCTATAAATGCGGCGTTGCAGAACCATAACCATCAACAAATTATACTTGATAAAGGCATGTTGGTGGCGATTGATGAACTCATGCAGAGTCTCAATCACAACGGGGAAACGTTGAGACAGAAACCCCCAGTCGGTGAAGCGGACCCATATCGAGTAAAAATGAAGCTCTGCATTCTGCTTCACGCATTCAGCACTAGAGTTGTTACCATCAACCGGGTAATGGGATATCTCTCCAGTGCGtaG
IL7 (小鼠) (SEQ ID NO: 64)
ATGTTTCATGTGTCCTTCAGGTACATATTTGGTATCCCACCACTTATATTGGTGCTCTTGCCTGTAACCAGCTCTGAATGTCATATAAAAGACAAGGAGGGCAAAGCATACGAGTCCGTATTGATGATCTCAATCGATGAACTTGACAAGATGACAGGGACCGATTCTAATTGTCCAAATAACGAGCCAAACTTCTTTCGGAAACACGTGTGTGATGATACAAAAGAAGCTGCTTTTCTTAACAGAGCTGCCAGAAAACTCAAGCAGTTCCTCAAGATGAATATATCCGAGGAATTTAACGTGCATCTCCTCACAGTATCTCAGGGAACTCAAACCCTTGTAAACTGCACTTCTAAGGAGGAGAAGAATGTCAAAGAGCAGAAGAAAAATGATGCATGTTTTTTGAAACGGCTGTTGAGGGAGATCAAAACATGCTGGAATAAAATCCTCAAGGGCTCAATTtaG
IL15 (人類) (SEQ ID NO: 65)
ATGGAAACAGACACATTGCTGCTTTGGGTATTGTTGCTCTGGGTGCCTGGATCAACAGGAAACTGGGTAAACGTAATTTCAGATCTGAAGAAGATCGAGGACCTTATTCAATCCATGCACATCGATGCCACTCTCTACACCGAAAGCGACGTTCACCCATCTTGCAAGGTGACCGCTATGAAATGTGAATTGTTGGAACTTCAGGTAATTTCTCTGGAGAGCGGCGATGCCTCAATACATGACACCGTTGAAAATCTTATCATCCTTGCTAATGATTCACTCTCTAGTAATGGGAACGTAACAGAGAGCGGGTGTAAGGAGTGTGAAGAACTGGAGGAGAAAAACATTAAGGAATTTTTGCAGTCATTCGTCCATATAGTGCAAATGTTCATAAACACTTCCAGAAGAAAGCGAGGCTCTGGGGAGGGGCGAGGCTCTCTGCTGACCTGTGGGGATGTAGAAGAGAATCCAGGTCCCATGGACCGGCTGACCAGCTCATTCCTGCTTCTGATTGTGCCAGCCTACGTGCTCTCCATCACATGTCCTCCCCCAATGAGCGTCGAGCATGCTGACATCTGGGTGAAGTCATACTCCTTGTACAGCAGAGAGAGATACATTTGTAATTCCGGATTCAAGCGCAAGGCCGGCACCTCCTCTCTGACAGAGTGCGTCCTTAACAAAGCAACCAACGTAGCACATTGGACCACACCATCCTTGAAGTGCATACGAGAACCTAAATCTTGCGATAAGACTCATACTTGTCCACCTTGTCCAGCCCCAGAACTGCTTGGCGGACCCTCAGTATTTTTGTTCCCACCAAAGCCAAAAGACACACTCATGATATCCAGAACTCCTGAGGTGACCTGTGTCGTTGTAGACGTTTCCCACGAAGATCCTGAAGTAAAATTCAACTGGTACGTGGATGGGGTCGAAGTCCATAACGCCAAGACTAAACCAAGGGAGGAACAGTATAACTCTACTTACCGAGTAGTTTCTGTGTTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGTTGAACGGGAAGGAGTACAAATGCAAGGTGAGCAATAAAGCTCTGCCCGCACCAATCGAAAAGACAATATCTAAGGCCAAGGGGCAGCCACGAGAGCCCCAGGTATACACACTGCCACCCTCACGCGATGAATTGACTAAGAACCAGGTTTCCCTGACCTGTCTTGTAAAAGGTTTCTACCCTTCCGACATAGCTGTTGAGTGGGAAAGTAACGGGCAGCCAGAGAACAATTACAAGACAACTCCACCCGTTCTTGATAGCGATGGATCATTTTTTCTGTATTCCAAACTCACTGTCGATAAAAGTCGCTGGCAGCAAGGCAATGTTTTTAGCTGCTCAGTCATGCACGAAGCACTGCATAATCACTACACACAAAAAAGTTTGTCCCTTAGCCCTGGTAAGtaG
IL15 (人類) (SEQ ID NO: 66)
ATGTACTCAATGCAGTTGGCCTCCTGTGTAACATTGACCTTGGTCCTCTTGGTCAACAGCAATTGGATCGATGTACGCTACGACTTGGAGAAGATTGAGTCCCTTATACAGAGTATACACATAGATACAACCTTGTATACTGACAGTGACTTCCATCCCAGCTGTAAAGTGACTGCAATGAACTGTTTTTTGTTGGAGTTGCAAGTAATTCTGCATGAATACAGCAACATGACCCTCAATGAAACCGTTAGGAATGTCCTTTATCTCGCAAATTCTACTCTGAGTAGCAATAAGAATGTTGCCGAAAGCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAACTGGAGGAAAAAACTTTCACCGAGTTTCTCCAGAGTTTCATCAGAATTGTCCAAATGTTCATTAATACAAGTAGTGGTGGTGGGAGCGGGGGTGGAGGCAGTGGGGGAGGTGGGAGCGGAGGTGGAGGGTCCGGAGGGGGGAGCCTTCAAGGCACTACTTGTCCTCCACCCGTATCCATCGAGCACGCCGATATTCGAGTTAAAAATTATAGTGTTAATAGCAGAGAACGATACGTCTGCAACTCAGGGTTTAAGAGAAAGGCCGGAACTTCAACTCTCATAGAATGCGTGATTAATAAGAATACTAACGTCGCACATTGGACTACTCCCAGTCTCAAGTGCATACGCGATCCATCTCTCGCTCATTACTCACCAGTACCTACAGTGGTTACTCCTAAGGTGACCTCTCAGCCCGAATCACCATCTCCCAGCGCAAAAGAGCCTGAGGCCTTTTCTCCTAAATCAGACACTGCTATGACTACAGAAACAGCCATAATGCCAGGAAGCCGGCTGACACCATCTCAAACTACCAGCGCAGGCACAACTGGGACTGGCTCCCACAAAAGCTCACGCGCACCAAGTCTCGCCGCAACAATGACATTGGAGCCTACAGCCAGCACATCTCTTAGAATCACAGAAATTTCTCCCCACAGTAGCAAGATGACCAAGGTGGCAATTAGTACCAGCGTCCTTCTTGTAGGAGCTGGAGTTGTGATGGCATTTTTGGCATGGTATATCAAAAGCAGGtaG
IL15 (小鼠) (SEQ ID NO: 67)
ATGAAGATCCTCAAGCCATACATGCGAAACACTAGTATTAGCTGTTACTTGTGTTTTCTGCTGAATAGTCATTTTTTGACTGAAGCAGGAATCCATGTATTTATACTCGGTTGTGTGTCTGTAGGTCTGCCAAAGACTGAGGCTAATTGGATTGACGTGCGCTATGATCTTGAAAAAATAGAGTCCTTGATTCAATCAATACACATCGATACCACTCTCTACACCGACAGTGATTTCCATCCTTCCTGCAAGGTAACAGCTATGAATTGCTTCCTCCTGGAGCTCCAAGTCATTCTCCATGAGTACTCCAACATGACTTTGAACGAAACTGTAAGAAACGTATTGTATCTGGCTAATAGCACCTTGTCTAGTAACAAAAATGTGGCAGAGAGCGGCTGCAAAGAATGTGAAGAATTGGAAGAGAAAACATTTACAGAGTTCCTGCAATCCTTTATTCGCATCGTCCAAATGTTTATCAATACCTCTtaG
IL15 (小鼠) (SEQ ID NO: 68)
ATGTATTCCATGCAACTTGCCAGTTGTGTAACCCTTACTCTCGTCCTGCTCGTTAATTCCGCTGGTGCTAACTGGATAGATGTTCGATACGATCTGGAAAAGATTGAGTCCCTTATCCAATCCATTCATATAGATACCACCCTTTATACTGACAGCGACTTCCATCCTTCTTGCAAGGTGACCGCTATGAATTGTTTCCTGCTGGAACTCCAAGTTATTCTGCATGAATACTCTAATATGACACTTAACGAGACCGTAAGAAATGTTCTCTATCTCGCTAATAGTACTTTGAGCTCAAATAAGAACGTGGCCGAGTCTGGGTGTAAGGAATGCGAAGAGCTGGAAGAAAAGACATTCACCGAGTTTCTCCAGTCTTTCATACGGATTGTGCAGATGTTTATCAACACATCAGATTACAAAGACGACGATGATAAGtaG
IL18 (小鼠) (SEQ ID NO: 69)
ATGGCAGCCATGTCTGAGGACTCTTGTGTGAACTTTAAAGAAATGATGTTCATAGACAATACACTCTACTTTATACCTGAGGAGAATGGAGATTTGGAATCTGACAACTTTGGCAGGCTGCATTGCACTACCGCAGTTATCCGAAACATCAACGATCAGGTACTGTTTGTTGATAAAAGACAACCTGTATTCGAGGACATGACCGACATAGATCAGTCTGCCTCAGAGCCCCAGACTAGGCTTATCATCTATATGTACAAGGACAGCGAAGTACGAGGCCTGGCTGTTACACTCTCAGTCAAAGACTCTAAGATGAGCACCCTGTCATGCAAGAACAAAATTATCAGTTTTGAGGAGATGGACCCACCTGAAAACATAGATGACATTCAGTCAGACCTCATTTTTTTTCAAAAGCGGGTACCAGGACACAACAAAATGGAATTTGAATCATCACTCTACGAAGGACATTTCCTTGCATGCCAGAAAGAGGATGACGCATTCAAATTGATCCTGAAAAAAAAGGACGAAAATGGTGATAAATCAGTCATGTTTACATTGACCAATCTTCACCAAAGTtaG
IL18 (小鼠) (SEQ ID NO: 70)
ATGGCTGCAATGTCTGAAGATAGCTGTGTCAACTTTAAGGAGATGATGTTCATTGATAATACTTTGTACTTTATACCTGAAGAAAATGGAGACCTTGAGTCAGACAACTTCGGGAGACTGCACTGCACAACTGCCGTTATCCGAAACATAAATGATCAAGTATTGTTCGTGGACAAAAGACAACCAGTCTTTGAGGATATGACAGACATCGACCAATCCGCATCTGAACCTCAGACTAGGCTGATCATCTATATGTACGCCGACTCCGAAGTAAGAGGCCTTGCTGTGACACTTAGTGTTAAGGATAGTAAGATGAGCACACTGTCCTGTAAGAATAAGATTATATCTTTTGAAGAGATGGACCCTCCCGAGAACATAGATGACATCCAGAGCGACTTGATCTTCTTTCAGAAGCGAGTGCCAGGCCATAACAAGATGGAATTTGAATCATCTCTTTATGAAGGCCATTTCCTCGCATGTCAAAAGGAGGACGATGCCTTCAAGCTCATTCTGAAAAAAAAAGACGAGAACGGTGATAAGAGCGTGATGTTCACTCTGACAAATCTGCACCAGTCAtaG
IL18 (人類) (SEQ ID NO: 71)
ATGTATCGCATGCAACTCCTGTCCTGCATTGCTCTGAGCTTGGCTTTGGTAACCAACTCATACTTCGGGAAACTGGAGAGTAAACTCTCCGTAATCAGGAATCTTAATGACCAAGTATTGTTTATTGACCAGGGCAACCGCCCGTTGTTCGAGGATATGACTGATTCTGACTGTCGGGATAACGCTCCGAGAACTATCTTTATCATTTCAATGTACAAGGACAGCCAACCGCGGGGTATGGCTGTGACAATCAGTGTCAAATGTGAGAAGATTTCCACGCTGTCCTGCGAAAACAAGATAATTTCTTTCAAAGAAATGAACCCCCCTGACAATATAAAGGATACAAAGAGTGATATCATCTTCTTTCAGAGGTCCGTGCCCGGCCACGATAATAAGATGCAATTTGAAAGTTCATCTTATGAGGGGTACTTTTTGGCATGCGAGAAAGAAAGGGATCTCTTCAAGTTGATCCTGAAGAAGGAGGACGAATTGGGCGACCGCTCCATCATGTTCACAGTCCAGAACGAGGACtaG
IL18 (人類) (SEQ ID NO: 72)
ATGTACCGCATGCAGCTCCTGAGTTGTATTGCCCTTTCCCTCGCTCTCGTTACCAATTCTTACTTCGGTAAGCTTGCCTCTAAACTCTCTGTTATTAGGAACTTGAACGACCAAGTCCTTTTCATAGACCAAGGGAACAGACCACTGTTTGAAGATATGACGGATAGCGATTGCCGAGATAATGCCCCTAGGACGATTTTTATCATTAGTATGTATGCGGACTCTCAACCGAGGGGGATGGCCGTTACTATAAGTGTGAAATGCGAGAAAATATCAACGCTCAGTTGTGAGAACAAAATCATAAGTTTCAAGGAGATGAATCCACCTGATAACATCAAAGACACTAAGTCTGATATTATATTTTTCCAACGAAGTGTTCCGGGACACGATAACAAAATGCAATTTGAGAGCTCCTCATACGAGGGCTACTTCCTCGCGTGTGAGAAAGAAAGGGATTTGTTTAAGCTTATCCTCAAGAAAGAGGACGAGTTGGGGGATCGGAGCATAATGTTTACCGTACAGAATGAGGACtaG
IL21 (小鼠) (SEQ ID NO: 73)
ATGGAGCGGACACTCGTGTGTCTTGTCGTAATTTTTCTCGGGACAGTCGCACACAAGTCCTCACCCCAGGGTCCTGATCGCCTTCTCATACGCCTCCGACATTTGATCGACATTGTAGAGCAGCTCAAAATTTACGAGAATGACCTCGATCCCGAGCTTTTGAGTGCTCCCCAAGACGTTAAGGGTCATTGCGAGCACGCAGCTTTTGCTTGCTTCCAGAAGGCCAAGTTGAAACCAAGCAACCCTGGTAATAATAAGACTTTCATCATCGACTTGGTCGCCCAACTCCGAAGGAGGCTGCCTGCCCGGCGCGGAGGAAAAAAACAAAAGCATATTGCAAAGTGTCCTTCATGTGATTCATACGAAAAGCGGACTCCCAAAGAGTTCTTGGAAAGGTTGAAATGGCTTCTTCAGAAGATGATTCATCAACATTTGTCAtaG
IFN-β (人類) (SEQ ID NO: 74)
ATGACCAACAAATGCCTTTTGCAAATTGCCCTGCTTTTGTGTTTTAGCACTACCGCATTGAGCATGTCATATAACCTCCTCGGCTTCCTTCAGAGATCATCAAACTTTCAGTGTCAGAAACTGCTTTGGCAACTTAATGGCAGGCTCGAATATTGTCTGAAAGATCGGATGAATTTCGACATTCCAGAAGAAATAAAACAGCTTCAACAATTCCAGAAAGAGGACGCCGCCCTGACTATTTACGAGATGCTCCAGAATATCTTCGCCATTTTCCGGCAGGACAGCTCATCCACGGGGTGGAATGAGACTATTGTAGAAAATCTTCTGGCTAATGTGTACCATCAAATTAATCACCTCAAAACGGTGCTTGAGGAAAAACTTGAAAAGGAAGATTTCACACGGGGCAAGTTGATGTCCTCCCTGCACCTTAAACGATACTACGGCAGGATTCTTCATTACTTGAAGGCTAAGGAGTATAGCCATTGCGCGTGGACAATTGTACGGGTAGAAATACTGCGAAACTTTTATTTCATCAACCGGCTCACTGGATACCTTAGAAATtaG
IFN-β (小鼠) (SEQ ID NO: 75)
ATGAACAATCGGTGGATACTCCACGCCGCATTTCTCCTCTGCTTTAGCACGACGGCCCTGTCCATCAACTACAAACAGCTTCAGTTGCAGGAGCGGACTAACATAAGGAAGTGCCAGGAACTGCTGGAACAGCTTAATGGTAAAATTAATCTTACATACCGAGCTGACTTCAAAATTCCTATGGAAATGACCGAGAAGATGCAGAAATCCTACACGGCATTCGCCATCCAGGAAATGCTCCAGAACGTATTTCTCGTGTTCCGCAATAATTTCTCTTCTACGGGTTGGAACGAAACCATTGTTGTTAGACTGCTTGACGAACTGCATCAGCAAACCGTGTTCCTTAAAACCGTGCTTGAGGAGAAGCAGGAGGAGCGCCTGACTTGGGAGATGTCTAGTACCGCACTTCACTTGAAATCCTACTACTGGCGCGTTCAGCGGTATCTGAAGCTGATGAAGTATAACTCATACGCCTGGATGGTAGTGCGCGCAGAGATCTTCAGAAACTTTCTTATCATCCGGCGACTGACCCGAAACTTTCAGAATtaG
IFN-γ (人類) (SEQ ID NO: 76)
ATGAAGTACACTAGCTATATATTGGCCTTCCAGCTTTGCATCGTATTGGGTAGCCTCGGATGCTATTGCCAAGACCCGTATGTCAAAGAAGCCGAAAATCTCAAAAAGTATTTCAATGCCGGACACTCAGACGTCGCGGATAACGGTACACTGTTTCTTGGCATCCTGAAAAATTGGAAGGAAGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGTCACAAATAGTGTCCTTTTACTTTAAGCTGTTCAAAAATTTCAAGGATGACCAAAGTATCCAGAAGAGTGTTGAAACTATCAAAGAGGACATGAATGTGAAATTCTTTAACAGTAATAAGAAGAAGCGCGATGACTTCGAGAAACTCACTAATTACAGCGTAACGGATCTTAACGTCCAACGCAAGGCAATCCACGAGCTTATACAGGTAATGGCTGAGCTTAGTCCCGCAGCCAAGACAGGGAAGAGAAAAAGGTCTCAAATGCTTTTTCGGGGCCGGCGAGCTTCACAAtaG
IFN-γ (小鼠) (SEQ ID NO: 77)
ATGAACGCTACGCATTGCATCCTCGCACTCCAATTGTTCCTCATGGCTGTGTCAGGGTGTTACTGTCACGGTACTGTCATAGAAAGCCTCGAATCCCTGAATAACTATTTTAACAGTAGCGGTATAGATGTAGAAGAAAAGTCTCTCTTTCTTGACATCTGGAGGAATTGGCAAAAGGATGGAGACATGAAGATTCTCCAATCTCAGATTATATCATTTTACTTGAGGCTTTTTGAGGTTCTGAAGGATAACCAGGCGATCAGCAATAATATCAGCGTAATTGAATCTCACCTTATTACAACATTTTTCTCAAATTCCAAGGCAAAGAAAGATGCTTTCATGTCTATCGCGAAATTTGAGGTGAACAATCCTCAGGTACAAAGGCAAGCCTTTAACGAGCTGATTAGAGTTGTACATCAGTTGTTGCCCGAAAGTAGTCTTAGAAAACGCAAACGGAGCCGATGCtaG
IFN-α (小鼠) (SEQ ID NO: 78)
ATGGCAAGGTTGTGCGCTTTTCTCATGGTACTGGCTGTGCTCTCCTATTGGCCTACTTGTTCTCTGGGATGCGACTTGCCACAGACCCACAATCTGCGGAATAAGAGGGCTCTGACTCTGCTGGTGCAAATGAGACGGCTCTCTCCACTTAGCTGTTTGAAAGATAGAAAGGATTTCGGGTTCCCCCAGGAGAAGGTGGATGCCCAGCAGATCAAGAAGGCACAGGCTATCCCCGTCCTTTCCGAGCTGACCCAGCAAATTTTGAACATCTTTACAAGTAAGGATAGTTCAGCTGCATGGAATACCACACTTTTGGATTCTTTTTGTAACGATCTGCATCAGCAGCTGAACGATCTCCAGGGATGCCTGATGCAGCAAGTCGGCGTGCAAGAATTTCCACTCACCCAGGAGGACGCTCTGCTCGCAGTGCGAAAGTATTTTCACCGAATTACCGTGTACCTCCGGGAGAAAAAGCATTCACCCTGCGCTTGGGAAGTAGTCAGGGCCGAAGTATGGAGAGCCCTTAGTAGCTCCGCTAATGTACTGGGCCGGTTGCGGGAAGAGAAAtaG
CCL21 (人類) (SEQ ID NO: 79)
ATGGCGCAAAGTCTGGCTCTTTCACTCCTGATCCTGGTCTTGGCCTTCGGGATTCCGAGGACCCAAGGAAGTGATGGTGGCGCCCAAGATTGTTGCCTTAAATACAGCCAGCGGAAAATACCCGCGAAAGTGGTCAGGAGTTATAGAAAACAGGAGCCTTCCCTGGGTTGTAGTATCCCCGCCATACTTTTCCTCCCGAGAAAACGGAGCCAGGCCGAACTGTGCGCTGACCCTAAGGAACTTTGGGTGCAACAACTTATGCAACACCTGGATAAGACACCTTCTCCTCAAAAGCCAGCTCAGGGCTGCCGAAAAGATAGAGGCGCCTCAAAAACCGGAAAAAAGGGCAAAGGTTCTAAAGGATGTAAGCGGACTGAACGCTCTCAAACGCCTAAAGGGCCGtaG
CCL21a (小鼠) (SEQ ID NO: 80)
ATGGCGCAAATGATGACCCTTTCCCTGCTGAGTCTTGTCCTCGCGCTCTGCATCCCGTGGACGCAGGGGTCTGATGGGGGGGGCCAAGACTGTTGCCTGAAGTATTCACAAAAAAAGATACCGTACTCTATTGTCAGAGGGTACAGGAAGCAAGAACCCTCCTTGGGTTGCCCTATACCAGCAATTCTTTTCTCCCCACGCAAGCATTCCAAACCAGAACTGTGTGCGAACCCCGAGGAGGGTTGGGTACAGAACTTGATGCGAAGGCTTGACCAGCCCCCAGCCCCTGGCAAGCAGTCACCTGGGTGCAGAAAAAACAGAGGTACTTCAAAGAGCGGCAAGAAAGGCAAAGGGAGTAAAGGATGTAAAAGAACGGAGCAGACCCAGCCTTCACGAGGCtaG
無尾CCL21 (人類) (SEQ ID NO: 81)
ATGGCGCAAAGTCTGGCTCTTTCACTCCTGATCCTGGTCTTGGCCTTCGGGATTCCGAGGACCCAAGGAAGTGATGGTGGCGCCCAAGATTGTTGCCTTAAATACAGCCAGCGGAAAATACCCGCGAAAGTGGTCAGGAGTTATAGAAAACAGGAGCCTTCCCTGGGTTGTAGTATCCCCGCCATACTTTTCCTCCCGAGAAAACGGAGCCAGGCCGAACTGTGCGCTGACCCTAAGGAACTTTGGGTGCAACAACTTATGCAACACCTGGATAAGACACCTTCTCCTCAAAAGCCAGCTCAGGGCtaG
無尾CCL21 (小鼠) (SEQ ID NO: 82)
ATGGCGCAAATGATGACCCTTTCCCTGCTGAGTCTTGTCCTCGCGCTCTGCATCCCGTGGACGCAGGGGTCTGATGGGGGGGGCCAAGACTGTTGCCTGAAGTATTCACAAAAAAAGATACCGTACTCTATTGTCAGAGGGTACAGGAAGCAAGAACCCTCCTTGGGTTGCCCTATACCAGCAATTCTTTTCTCCCCACGCAAGCATTCCAAACCAGAACTGTGTGCGAACCCCGAGGAGGGTTGGGTACAGAACTTGATGCGAAGGCTTGACCAGCCCCCAGCCCCTGGCAAGCAGTCACCTGGGtaG
CCL19 (小鼠) (SEQ ID NO: 83)
ATGGCACCCCGCGTCACACCCTTGCTTGCTTTTTCTCTGCTTGTCCTCTGGACCTTCCCCGCTCCTACCCTTGGAGGAGCCAATGATGCCGAGGATTGCTGCCTGAGTGTTACACAAAGGCCAATACCAGGGAATATAGTGAAGGCATTCCGGTATCTGCTCAATGAAGATGGGTGCAGAGTCCCCGCAGTTGTCTTTACAACATTGCGAGGTTACCAGCTTTGTGCTCCCCCAGACCAGCCTTGGGTAGATCGCATTATTCGCCGGTTGAAGAAGAGCTCAGCAAAGAATAAGGGCAATTCCACACGGAGAAGCCCCGTCTCCtaG
CCL19 (小鼠) (SEQ ID NO: 84)
ATGAAATCAGCAGTCCTTTTCTTGCTCGGGATTATTTTTCTGGAACAATGTGGAGTGAGGGGAACACTCGTAATAAGAAACGCTCGGTGCTCATGCATATCAACATCACGGGGCACTATCCACTACAAATCCCTGAAGGATCTGAAGCAGTTCGCCCCAAGCCCTAACTGTAACAAGACCGAAATTATCGCAACTCTCAAAAATGGAGATCAGACTTGTCTTGACCCAGATTCAGCAAATGTCAAGAAGCTGATGAAAGAGTGGGAAAAGAAGATTTCACAAAAAAAAAAGCAAAAACGCGGCAAGAAACATCAAAAGAACATGAAAAACAGGAAACCTAAGACTCCCCAGTCAAGGAGAAGATCCCGCAAGACAACCtaG
CXCL11 (小鼠) (SEQ ID NO: 85)
ATGAACAGAAAAGTTACCGCTATAGCACTTGCTGCCATAATATGGGCCACCGCAGCTCAAGGGTTCCTGATGTTCAAGCAGGGCCGATGCCTCTGCATTGGCCCTGGAATGAAGGCCGTGAAAATGGCCGAAATAGAAAAAGCTAGTGTCATATACCCCTCTAACGGTTGCGATAAAGTCGAGGTTATAGTCACAATGAAAGCTCATAAACGCCAACGCTGCCTCGACCCCCGGTCTAAGCAGGCTAGGCTCATAATGCAAGCAATCGAGAAGAAAAACTTTCTTAGACGGCAAAACATGtaG
CXCL10 (小鼠) (SEQ ID NO: 86)
ATGAACCCATCTGCCGCCGTTATTTTCTGTCTGATACTCCTTGGGCTGAGTGGCACACAAGGCATACCCCTCGCCCGCACAGTCCGGTGTAATTGTATACATATTGACGACGGCCCTGTTAGAATGCGGGCCATCGGTAAGCTGGAGATTATACCAGCAAGCCTTAGTTGTCCCAGGGTTGAAATCATAGCAACTATGAAAAAAAACGACGAACAAAGATGTTTGAATCCCGAGAGCAAGACAATCAAAAACCTTATGAAAGCATTTAGTCAAAAACGCTCTAAACGCGCTCCAtaG
CXCL10 (人類) (SEQ ID NO: 87)
ATGAATCAGACGGCAATCCTTATATGCTGCCTTATATTCCTTACTCTCTCAGGGATACAAGGGGTACCACTTTCTCGGACTGTTCGCTGCACTTGCATTTCAATATCTAACCAACCTGTAAATCCGCGGAGCCTGGAAAAATTGGAGATTATACCTGCTTCTCAATTCTGCCCTCGGGTGGAAATCATCGCCACTATGAAGAAGAAGGGCGAGAAAAGGTGTCTGAATCCAGAGTCAAAGGCAATCAAAAACCTGCTGAAAGCGGTGTCAAAGGAACGGTCCAAGAGATCACCCtaG
CXCL11-CXCL10 (小鼠) (SEQ ID NO: 88)
ATGAACAGGAAAGTAACAGCCATTGCATTGGCTGCCATCATCTGGGCCACCGCAGCACAGGGTTTTCTGATGTTTAAGCAAGGGCGCTGTCTCTGTATAGGCCCAGGCATGAAGGCCGTGAAGATGGCAGAGATTGAGAAGGCATCTGTGATTTATCCTTCTAACGGGTGCGATAAAGTCGAAGTTATTGTGACAATGAAGGCACACAAACGCCAACGGTGTTTGGACCCACGATCTAAACAGGCAAGATTGATTATGCAAGCCATCGAGAAAAAGAACTTTCTCCGAAGGCAAAATATGATCCCTTTGGCTCGGACAGTGCGGTGTAACTGTATTCACATCGACGATGGGCCAGTACGGATGAGAGCAATAGGAAAGCTCGAAATCATACCCGCCTCATTGTCTTGTCCCAGGGTGGAAATAATCGCCACTATGAAAAAGAACGATGAACAGAGGTGTCTCAACCCAGAGAGTAAGACTATCAAGAACCTTATGAAGGCATTCAGTCAGAAGAGGTCAAAGCGAGCACCAtaG
XCL1 (人類) (SEQ ID NO: 89)
ATGAGACTTCTCATATTGGCGCTTCTCGGGATATGTTCTCTTACGGCATACATAGTTGAGGGGGTGGGATCTGAGGTTAGCGATAAACGAACTTGTGTTAGTCTTACAACACAGAGGCTTCCAGTCTCCAGGATAAAAACATATACGATAACTGAGGGATCTCTCAGAGCGGTCATCTTCATAACGAAGAGGGGCCTGAAGGTCTGTGCTGACCCACAAGCGACTTGGGTAAGGGACGTTGTGCGGAGCATGGACAGGAAGAGCAATACTCGCAACAACATGATCCAAACCAAACCTACGGGCACCCAACAGTCAACCAATACTGCGGTAACATTGACGGGGtaG
XCL1 (小鼠) (SEQ ID NO: 90)
ATGCGCCTCCTTCTGCTGACTTTTCTGGGTGTATGTTGCCTGACACCCTGGGTCGTAGAAGGAGTAGGAACCGAGGTTCTGGAAGAGTCCTCATGTGTAAACTTGCAGACACAACGACTCCCCGTCCAAAAAATCAAGACCTATATAATCTGGGAGGGGGCAATGCGGGCCGTCATTTTCGTGACTAAACGAGGTCTCAAAATCTGCGCCGACCCCGAGGCTAAGTGGGTGAAGGCAGCCATTAAGACCGTGGATGGGAGAGCCAGCACCAGAAAGAACATGGCCGAAACAGTACCTACTGGCGCACAGCGGTCAACCTCAACTGCTATAACCTTGACAGGAtaG
m_sCD40L #1 (SEQ ID NO: 91)
ATGGAGACTGACACTCTGCTTCTGTGGGTGTTGCTGCTGTGGGTGCCTGGCAGTACAGGCGATATGCAACGAGGTGACGAGGACCCTCAAATCGCCGCCCATGTAGTCTCTGAAGCTAATAGCAACGCTGCATCCGTCTTGCAGTGGGCAAAGAAAGGCTACTATACTATGAAGTCCAACTTGGTAATGCTTGAAAACGGCAAGCAGTTGACTGTCAAGAGAGAGGGACTTTATTACGTCTATACCCAAGTCACATTCTGTAGCAATCGAGAACCCTCCTCACAGAGGCCTTTTATAGTGGGACTCTGGCTTAAACCAAGTAGCGGCTCTGAGCGCATACTGTTGAAAGCCGCAAACACACACAGCTCTTCCCAACTCTGCGAGCAGCAATCCGTGCATCTCGGTGGAGTATTTGAGCTTCAAGCCGGTGCCTCAGTGTTTGTGAACGTCACTGAGGCCTCCCAGGTCATACATCGAGTTGGGTTCAGCTCCTTCGGCTTGCTCAAGCTCtaG
m_sCD40L #2 (SEQ ID NO: 92)
ATGGAAACTGATACATTGCTGCTCTGGGTTTTGCTGCTCTGGGTGCCTGGGAGTACAGGCGACATGAGGAGGCAGTTCGAGGATCTCGTTAAGGATATTACCCTTAATAAGGAGGAGAAGAAAGAAAACTCTTTTGAGATGCAACGAGGGGACGAAGATCCTCAGATCGCTGCTCACGTGGTCTCTGAAGCTAACAGCAACGCCGCTTCTGTCCTCCAGTGGGCCAAGAAAGGTTATTACACCATGAAATCAAACCTTGTAATGCTTGAAAACGGGAAACAGCTTACAGTGAAGAGGGAAGGTCTTTACTACGTCTATACCCAGGTAACCTTCTGCTCAAACAGAGAACCATCAAGCCAGAGGCCATTCATAGTGGGGCTCTGGCTCAAACCTTCCAGTGGCAGCGAGAGAATCTTGTTGAAAGCTGCTAATACACATAGTAGTAGCCAGCTTTGCGAGCAACAGTCAGTCCACCTCGGGGGGGTGTTTGAGTTGCAAGCAGGGGCCTCAGTATTCGTGAATGTCACTGAGGCTTCCCAGGTAATTCACAGGGTAGGCTTTAGTTCATTCGGTTTGCTGAAGCTTtaG
m_sCD40L #3 (SEQ ID NO: 93)
ATGCGAAGAATGCAGCTTCTGCTCCTTATTGCTCTGAGTCTCGCCCTTGTCACCAACTCCGGGGACAGAATGAAACAAATCGAGGACAAAATTGAAGAAATACTGAGTAAAATATATCACATCGAAAACGAAATTGCACGCATTAAGAAATTGATTGGCGAACGCACCAGTGGCGGCTCTGGTGGCACCGGAGGTTCAGGCGGGACCGGGGGCTCTGACAAAGTCGAAGAGGAGGTTAACCTTCATGAGGACTTTGTGTTCATCAAGAAGCTGAAACGGTGCAATAAAGGAGAAGGTTCTTTGAGCCTCCTTAATTGCGAAGAGATGCGACGACAGTTCGAGGATCTGGTTAAGGACATTACACTTAATAAGGAAGAGAAAAAGGAGAACTCTTTCGAAATGCAGCGCGGCGATGAAGATCCCCAGATAGCCGCCCATGTCGTCTCTGAGGCCAACTCTAACGCAGCATCCGTCCTCCAGTGGGCTAAGAAAGGATATTATACTATGAAAAGCAATTTGGTCATGCTCGAAAACGGTAAACAGCTCACTGTTAAGAGAGAAGGCCTCTATTACGTATATACTCAAGTAACTTTCTGTTCTAATAGGGAACCCTCCTCTCAAAGACCTTTTATCGTAGGACTCTGGTTGAAACCAAGTAGCGGTAGTGAAAGGATTCTGCTCAAAGCAGCTAATACTCACTCCAGCAGTCAACTGTGCGAACAACAAAGCGTTCACCTCGGGGGCGTCTTTGAACTTCAGGCAGGTGCCAGTGTTTTCGTCAACGTAACAGAAGCATCCCAGGTAATTCATCGAGTAGGGTTTTCTAGCTTTGGTTTGCTGAAGCTGtaG
抗CD40_FGK4.5 (SEQ ID NO: 94)
ATGGAAACTGATCGCCTGTTGCTCTGGGTACTTCTTCTGTGGGTGCCTGGGTCCACTGGTGACACTGTACTTACACAATCACCCGCTTTGGCCGTTTCTCCTGGTGAACGGGTCACAATTAGTTGCCGAGCTTCCGATTCTGTATCTACTCTTATGCATTGGTATCAACAAAAACCTGGTCAGCAGCCAAAATTGCTCATTTATCTTGCTAGTCACTTGGAGTCCGGCGTACCTGCTCGATTCAGCGGTAGTGGGTCTGGCACAGATTTCACTTTGACCATAGATCCCGTGGAGGCCGATGACACTGCAACCTACTATTGCCAGCAATCCTGGAACGACCCTTGGACTTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAACTCAAGCGAGCAGATGCTGCCCCAACCGTTAGTATATTCCCACCCTCAACCGAACAACTCGCCACAGGAGGCGCTAGTGTCGTGTGTCTTATGAACAATTTCTATCCACGAGACATTAGCGTCAAGTGGAAAATTGATGGGACAGAAAGGCGAGATGGAGTTTTGGATTCAGTAACAGACCAGGATTCAAAGGATTCTACCTATAGCATGAGCTCCACCTTGAGCCTGACCAAAGCTGATTATGAATCTCATAACCTGTATACTTGTGAAGTGGTGCATAAGACTTCTAGCTCACCAGTGGTTAAATCTTTTAACCGCAACGAATGTCGGCGCAAGAGGGGTTCCGGAGAGGGAAGGGGTAGTCTGCTCACCTGCGGCGATGTTGAAGAAAATCCTGGTCCCATGGACATTCGGCTCTCTTTGGTATTCCTGGTACTTTTTATAAAGGGGGTGCAATGTGAAGTCCAGCTCGTGGAAAGCGGTGGGGGCCTGGTTCAGCCCGGTCGCAGCCTTAAACTTAGTTGCGCAGCATCCGGATTTACATTTTCTGACTATAACATGGCCTGGGTTCGACAGGCACCCAAAAAAGGGCTGGAGTGGGTCGCAACTATCATATACGATGGTTCCCGGACATACTATAGAGATTCAGTGAAGGGGCGCTTTACAATAAGCAGGGACAATGCTAAGTCTACCTTGTATCTTCAGATGGACTCCCTGAGGAGCGAAGATACAGCAACATATTATTGTGCTACAAACCGCTGGTTGCTGCTTCATTATTTCGACTACTGGGGTCAGGGCGTCATGGTAACTGTATCAAGCGCCGAGACCACAGCCCCTTCTGTATATCCATTGGCACCAGGTACTGCTCTGAAATCCAACTCAATGGTAACCCTTGGATGTCTGGTTAAGGGTTATTTTCCCGAGCCCGTCACAGTTACTTGGAACTCTGGGGCCCTTTCTAGCGGAGTCCATACCTTTCCCGCCGTTTTGCAGAGTGGTCTGTACACCCTTACCTCAAGCGTCACAGTTCCATCTAGCACATGGAGCTCCCAGGCAGTAACTTGTAATGTGGCCCATCCAGCCTCCTCAACTAAGGTAGATAAAAAGATCGTTCCCAGAGAATGCAATCCATGTGGATGCACCGGGTCTGAGGTCAGCAGTGTGTTCATTTTCCCACCCAAGACTAAAGATGTATTGACTATTACTCTTACACCCAAAGTAACCTGCGTGGTGGTTGATATTAGTCAAAATGATCCCGAGGTACGGTTCTCTTGGTTTATCGACGACGTCGAAGTACATACAGCTCAGACACACGCTCCCGAGAAACAAAGCAATTCCACTCTTAGGAGCGTGTCCGAGTTGCCAATCGTACATAGGGATTGGCTTAATGGCAAGACCTTTAAGTGTAAGGTCAATTCAGGGGCATTCCCCGCACCAATAGAGAAGAGTATAAGCAAACCCGAGGGGACACCCAGAGGTCCACAGGTCTATACAATGGCTCCCCCCAAGGAAGAGATGACCCAAAGTCAAGTCTCAATTACATGTATGGTGAAGGGCTTTTATCCACCCGACATATACACTGAGTGGAAGATGAATGGACAGCCCCAAGAGAATTATAAAAACACTCCCCCTACCATGGACACCGACGGGTCCTATTTTCTTTATAGTAAATTGAACGTGAAAAAGGAGACCTGGCAACAAGGCAACACTTTCACCTGCTCCGTTCTTCACGAGGGCCTGCATAATCATCATACCGAAAAGTCTCTCAGTCATTCTCCAGGTAAGtaG
CD40L_2 (人類) (SEQ ID NO: 95)
ATGGAAACAGATACGTTGCTGTTGTGGGTACTTCTCCTTTGGGTCCCTGGCAGCACAGGGGACGAGAATAGTTTCGAAATGCAGAAGGGCGACCAGAACCCACAGATCGCGGCTCACGTTATATCAGAAGCAAGTAGTAAGACCACTTCCGTACTTCAGTGGGCTGAAAAAGGATATTACACCATGTCCAACAATCTCGTGACACTGGAGAACGGTAAACAACTTACGGTGAAACGACAGGGCCTCTATTACATCTACGCTCAGGTGACATTCTGCTCAAATAGGGAGGCTTCTAGTCAAGCGCCCTTCATCGCCAGCCTGTGCCTCAAATCTCCCGGCCGGTTCGAACGAATCCTGTTGCGAGCGGCCAATACCCATAGCTCAGCTAAACCTTGCGGCCAGCAGAGTATTCATCTTGGTGGTGTGTTTGAACTTCAGCCGGGAGCATCTGTGTTCGTCAACGTAACGGACCCTAGCCAAGTGTCTCATGGGACAGGTTTTACATCCTTCGGACTCCTCAAGTTGtaG
Flt3L (人類) (SEQ ID NO: 96)
ATGACAGTTCTCGCGCCAGCTTGGAGTCCCACCACATACTTGCTTTTGCTTCTGCTTCTGTCCTCTGGCCTGAGTGGGACCCAAGATTGTTCCTTTCAACATTCCCCAATTAGTTCTGATTTTGCAGTGAAGATTAGAGAGCTCTCAGACTATCTGCTGCAAGATTATCCTGTCACAGTCGCTTCAAACCTGCAAGACGAAGAGCTCTGCGGTGCCTTGTGGCGGTTGGTCTTGGCTCAAAGATGGATGGAGAGACTGAAAACCGTAGCAGGCAGCAAGATGCAGGGTCTCCTGGAAAGGGTGAACACGGAAATCCATTTTGTGACCAAGTGCGCGTTCCAGCCCCCACCGAGTTGTCTCCGGTTTGTTCAAACGAATATATCCCGGTTGCTCCAGGAAACCTCAGAACAACTGGTGGCTTTGAAACCCTGGATCACAAGACAAAACTTTAGTCGGTGCCTCGAACTCCAGTGCCAACCAGATTCTTCTACACTTCCCCCCCCGTGGTCCCCGCGCCCGTTGGAAGCAACGGCCCCAtaG
TGFb TRAP (人類) (SEQ ID NO: 97)
ATGGCCTGGAGTCCTCTGTTTCTGACTCTTATAACTCACTGTGCCGGCAGTTGGGCTATACCCCCTCATGTACAGAAGTCTGTAAACAACGACATGATTGTAACCGACAATAATGGCGCAGTGAAATTCCCACAACTGTGTAAGTTCTGTGATGTACGGTTTAGTACATGCGACAATCAAAAAAGCTGTATGTCTAACTGCTCTATTACATCCATATGTGAAAAACCTCAGGAGGTGTGTGTTGCCGTTTGGCGAAAAAATGATGAGAATATCACACTGGAGACAGTATGTCATGACCCTAAACTGCCATACCATGATTTCATACTGGAGGACGCCGCCAGTCCTAAGTGCATTATGAAAGAGAAAAAGAAACCCGGTGAAACATTCTTTATGTGCTCTTGTAGCTCTGACGAGTGTAACGACAACATTATATTCAGCGAGGAGTACAATACAAGCAACCCCGATATACCACCTCACGTACAAAAAAGTGTCAACAACGATATGATTGTTACCGACAATAACGGAGCTGTTAAGTTTCCTCAGTTGTGCAAGTTCTGCGATGTACGATTCTCTACCTGCGACAACCAAAAGTCATGTATGTCTAACTGTTCCATAACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAGGAAGTCTGCGTCGCCGTGTGGCGGAAAAACGACGAGAATATCACTCTTGAAACCGTTTGTCATGATCCTAAACTGCCCTATCACGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCCCCTAAGTGTATCATGAAAGAAAAGAAGAAACCTGGGGAGACATTCTTTATGTGTTCATGCTCCTCCGATGAGTGTAACGACAATATCATCTTCTCTGAGGAATACAACACTTCTAACCCTGATtaG
弗瑞索單抗(Fresolimumab) (人類) (SEQ ID NO: 98)
ATGGCCTGGTCCCCTCTTTTTCTGACCCTCATCACACACTGTGCAGGCTCATGGGCTGAGACCGTCTTGACCCAGTCCCCAGGAACTTTGTCTCTGTCTCCTGGTGAAAGAGCTACCCTTAGTTGTCGAGCCTCTCAGTCCCTTGGTTCTAGCTATCTCGCTTGGTACCAGCAAAAGCCAGGCCAGGCCCCACGACTGCTGATCTACGGAGCATCTTCACGGGCTCCCGGCATTCCCGATCGATTTTCCGGATCTGGTAGTGGTACAGATTTCACACTGACCATATCTCGCCTGGAGCCCGAGGACTTTGCTGTTTATTATTGTCAGCAGTACGCCGATTCTCCTATCACTTTTGGACAGGGAACCCGCCTGGAGATTAAGCGCACAGTAGCAGCTCCATCCGTCTTTATCTTTCCACCATCAGATGAACAGCTCAAGAGTGGGACCGCAAGTGTAGTATGCCTGCTGAACAATTTTTACCCTAGAGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAGAGTGGCAATAGTCAAGAAAGTGTTACTGAGCAAGATAGTAAGGACTCTACATACTCTTTGAGTTCTACTTTGACCCTGTCAAAAGCAGATTATGAAAAACATAAGGTGTATGCATGTGAAGTTACACACCAAGGGTTGTCCTCTCCAGTTACAAAATCTTTTAATAGAGGAGAGTGCCGCCGCAAACGCGGTAGTGGAGAAGGTCGAGGCTCACTCTTGACCTGTGGCGACGTGGAAGAAAATCCCGGTCCTATGGATTGGACTTGGAGGGTATTTTGTCTTTTGGCAGTAACACCTGGAGCTCACCCCCAAGTACAGCTCGTCCAATCTGGTGCCGAGGTTAAAAAGCCTGGAAGTTCAGTGAAGGTCTCTTGCAAGGCATCTGGATACACCTTTTCATCTAACGTCATATCCTGGGTACGGCAAGCCCCAGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGAGGGGTCATCCCCATCGTGGACATTGCTAATTACGCTCAGCGATTCAAAGGGCGGGTTACTATAACTGCCGACGAGTCTACCTCAACTACCTACATGGAGTTGTCCTCTCTCCGCTCCGAGGACACTGCTGTATATTACTGTGCCAGCACTCTCGGGTTGGTGTTGGATGCCATGGACTATTGGGGACAAGGAACCCTGGTGACAGTTAGCTCCGCAAGCACTAAAGGCCCTTCTGTTTTTCCCTTGGCACCTTGTAGTAGGTCTACCTCTGAGTCTACAGCAGCACTTGGATGCTTGGTTAAGGACTATTTTCCCGAGCCAGTTACAGTCTCTTGGAACAGTGGTGCCCTCACAAGTGGGGTTCATACCTTCCCCGCAGTCCTCCAGAGTAGTGGCCTTTACAGCCTCTCATCAGTTGTGACTGTTCCTAGTTCATCACTCGGTACTAAGACATATACATGTAACGTAGACCACAAGCCAAGCAACACAAAAGTAGACAAACGAGTCGAATCTAAGTATGGACCCCCTTGTCCCTCCTGTCCTGCTCCCGAGTTCCTTGGGGGCCCTTCCGTGTTCTTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACCCTCATGATCTCACGAACCCCAGAGGTAACATGTGTGGTTGTTGACGTAAGTCAGGAAGATCCCGAAGTGCAATTTAATTGGTACGTGGATGGCGTCGAAGTCCATAACGCTAAAACAAAACCCCGAGAGGAACAATTCAATTCCACATATCGGGTGGTGAGTGTATTGACCGTTCTTCACCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGTAAAGTAAGCAACAAAGGTCTGCCAAGTAGCATAGAAAAAACAATATCTAAAGCTAAGGGCCAACCAAGGGAACCACAAGTATATACATTGCCCCCCTCTCAGGAAGAGATGACAAAGAATCAAGTTAGCCTGACCTGTTTGGTAAAGGGGTTCTATCCCTCAGATATAGCAGTCGAGTGGGAATCTAACGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACCCCCCCTGTGTTGGACTCAGACGGCAGCTTCTTTCTCTATTCACGGCTCACTGTTGATAAGTCCCGATGGCAGGAGGGGAATGTTTTCAGCTGTAGCGTGATGCACGAAGCTCTCCACAACCACTATACACAGAAAAGTTTGTCTTTGTCCCTTGGAAAAtaG
TGFb中和肽(人類) (SEQ ID NO: 99)
ATGAGTACATCCTTTCCAGAGCTGGATCTGGAGAATTTTGAGTATGACGACAGTGCCGAAGCCTGCTACCTCGGGGACATAGTCGCATTCGGGACAATCTTTTTGTCTGTATTTTACGCCCTGGTGTTTACATTTGGCCTGGTTGGAAATCTGTTGGTCGTACTCGCTCTCACCAATTCCCGAAAACCCAAAAGTATAACAGACATATACCTGTTGAATCTGGCACTGAGTGACCTTTTGTTCGTCGCCACCCTTCCTTTTTGGACACACTACCTTATCAGTCACGAGGGGCTTCATAATGCTATGTGCAAGCTCACTACTGCCTTCTTCTTTATCGGATTCTTCGGGGGTATCTTTTTTATCACAGTTATTAGCATTGACCGATACCTTGCCATAGTGCTCGCAGCCAACTCAATGAACAACCGCACCGTGCAGCATGGAGTGACTATTTCCTTGGGTGTGTGGGCCGCTGCTATACTTGTCGCCAGCCCTCAATTCATGTTTACCAAAAGGAAAGACAATGAGTGCCTCGGAGATTACCCTGAGGTGTTGCAAGAAATGTGGCCTGTACTTCGAAATAGCGAAGTGAATATACTCGGCTTTGCTCTTCCTCTGCTCATCATGTCATTCTGTTATTTTCGAATAATCCAAACATTGTTCAGCTGTAAGAACCGAAAGAAAGCCCGCGCCGTACGCCTGATTCTGCTCGTTGTGTTCGCCTTTTTTCTGTTTTGGACTCCTTACAACATAATGATATTCCTGGAGACTCTCAAATTCTATAACTTTTTTCCCTCCTGTGATATGAAAAGGGACCTTAGATTGGCTCTCAGTGTCACTGAAACAGTAGCCTTTAGCCATTGTTGTCTCAACCCTTTCATATATGCATTTGCAGGGGAAAAGTTCCGGCGGTATCTCGGACATTTGTATCGGAAGTGCTTGGCCGTGTTGTGTGGTCATCCTGTCCATACCGGATTCTCTCCTGAGAGTCAACGGAGCCGCCAAGATTCAATCCTGTCCAGTTTCACTCACTATACTTCAGAGGGGGATGGCAGCCTTCTGCTC
尿胺酸酶#1 (SEQ ID NO: 100)
ATGGAGACCGACACTTTGTTGCTGTGGGTACTTTTGTTGTGGGTCCCAGGATCTACCGGGGATATGGAACCCTCTCCTCTTGAACTGCCAGTAGACGCCGTGCGCCGCATTGCAGCCGAGTTGAATTGCGATCCAACAGATGAACGCGTTGCCCTGAGGCTCGACGAAGAGGATAAATTGTCACATTTCAGGAACTGCTTTTACATTCCAAAGATGAGGGATCTTCCATCCATAGATCTTAGCCTCGTGTCCGAGGATGACGATGCCATATATTTTCTTGGGAACAGTCTTGGGTTGCAGCCAAAAATGGTACGGACATATCTCGAAGAGGAGCTGGACAAATGGGCTAAAATGGGTGCTTACGGCCACGACGTGGGAAAACGCCCCTGGATAGTTGGCGACGAATCTATCGTGAGTCTTATGAAAGATATAGTTGGAGCACATGAGAAAGAAATTGCACTGATGAATGCCCTTACTATCAATCTGCATCTCCTCTTGCTTTCATTCTTTAAGCCCACTCCTAAACGCCACAAAATACTTTTGGAAGCAAAAGCCTTTCCAAGCGACCACTACGCTATTGAGTCACAAATACAACTCCATGGACTTGATGTGGAAAAGTCTATGCGGATGGTAAAACCACGCGAAGGCGAGGAGACCCTTCGAATGGAGGACATACTTGAGGTCATCGAAGAAGAAGGAGATAGTATAGCAGTTATCCTTTTCAGCGGGCTGCACTTCTACACAGGTCAACTCTTTAACATTCCAGCTATTACTAAGGCAGGCCACGCTAAAGGATGCTTCGTGGGCTTTGACCTTGCACACGCAGTAGGAAACGTAGAGCTCCGCTTGCACGATTGGGGCGTTGATTTCGCCTGCTGGTGTTCATATAAGTATCTTAACTCAGGAGCTGGTGGGTTGGCAGGCGCATTCGTACACGAGAAACACGCTCATACCGTAAAGCCTGCACTGGTAGGGTGGTTCGGACACGATCTCTCTACCCGCTTCAATATGGATAATAAACTCCAGCTTATACCTGGCGCCAATGGATTCAGGATCTCAAATCCTCCTATTTTGCTCGTTTGCAGTTTGCACGCATCTCTTGAGGTGTTCCAGCAGGCTACCATGACTGCACTCCGCCGGAAGTCAATCCTTTTGACCGGATACTTGGAGTATATGCTGAAACATTATCACTCAAAAGATAACACTGAGAATAAGGGCCCCATAGTAAACATTATCACTCCATCTCGGGCTGAAGAGCGCGGCTGCCAACTCACATTGACTTTTTCCATTCCCAAGAAGTCAGTGTTCAAAGAGTTGGAGAAACGGGGGGTTGTATGTGATAAGCGGGAGCCAGATGGAATCCGCGTTGCCCCAGTCCCCCTCTATAATTCTTTTCACGATGTATACAAGTTTATTAGACTGCTGACAAGTATCTTGGACTCATCTGAGCGATCTtaG
尿胺酸酶#2 (SEQ ID NO: 101)
ATGGAACCCTCTCCTCTTGAACTGCCAGTAGACGCCGTGCGCCGCATTGCAGCCGAGTTGAATTGCGATCCAACAGATGAACGCGTTGCCCTGAGGCTCGACGAAGAGGATAAATTGTCACATTTCAGGAACTGCTTTTACATTCCAAAGATGAGGGATCTTCCATCCATAGATCTTAGCCTCGTGTCCGAGGATGACGATGCCATATATTTTCTTGGGAACAGTCTTGGGTTGCAGCCAAAAATGGTACGGACATATCTCGAAGAGGAGCTGGACAAATGGGCTAAAATGGGTGCTTACGGCCACGACGTGGGAAAACGCCCCTGGATAGTTGGCGACGAATCTATCGTGAGTCTTATGAAAGATATAGTTGGAGCACATGAGAAAGAAATTGCACTGATGAATGCCCTTACTATCAATCTGCATCTCCTCTTGCTTTCATTCTTTAAGCCCACTCCTAAACGCCACAAAATACTTTTGGAAGCAAAAGCCTTTCCAAGCGACCACTACGCTATTGAGTCACAAATACAACTCCATGGACTTGATGTGGAAAAGTCTATGCGGATGGTAAAACCACGCGAAGGCGAGGAGACCCTTCGAATGGAGGACATACTTGAGGTCATCGAAGAAGAAGGAGATAGTATAGCAGTTATCCTTTTCAGCGGGCTGCACTTCTACACAGGTCAACTCTTTAACATTCCAGCTATTACTAAGGCAGGCCACGCTAAAGGATGCTTCGTGGGCTTTGACCTTGCACACGCAGTAGGAAACGTAGAGCTCCGCTTGCACGATTGGGGCGTTGATTTCGCCTGCTGGTGTTCATATAAGTATCTTAACTCAGGAGCTGGTGGGTTGGCAGGCGCATTCGTACACGAGAAACACGCTCATACCGTAAAGCCTGCACTGGTAGGGTGGTTCGGACACGATCTCTCTACCCGCTTCAATATGGATAATAAACTCCAGCTTATACCTGGCGCCAATGGATTCAGGATCTCAAATCCTCCTATTTTGCTCGTTTGCAGTTTGCACGCATCTCTTGAGGTGTTCCAGCAGGCTACCATGACTGCACTCCGCCGGAAGTCAATCCTTTTGACCGGATACTTGGAGTATATGCTGAAACATTATCACTCAAAAGATAACACTGAGAATAAGGGCCCCATAGTAAACATTATCACTCCATCTCGGGCTGAAGAGCGCGGCTGCCAACTCACATTGACTTTTTCCATTCCCAAGAAGTCAGTGTTCAAAGAGTTGGAGAAACGGGGGGTTGTATGTGATAAGCGGGAGCCAGATGGAATCCGCGTTGCCCCAGTCCCCCTCTATAATTCTTTTCACGATGTATACAAGTTTATTAGACTGCTGACAAGTATCTTGGACTCATCTGAGCGATCTtaG
VEGF (SEQ ID NO: 102)
ATGAATTTCTTGCTGAGCTGGGTGCATTGGACACTCGCATTGTTGCTGTACTTGCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCACTACTGAGGGCGAGCAAAAGTCTCATGAGGTGATTAAATTTATGGACGTTTACCAACGATCATACTGTCGGCCAATCGAAACCCTCGTAGATATATTCCAGGAGTACCCAGACGAGATCGAATACATTTTCAAGCCCTCATGTGTCCCATTGATGCGATGTGCTGGGTGCTGTAACGACGAAGCACTTGAATGTGTCCCCACCTCCGAGAGTAACATCACAATGCAAATAATGAGAATCAAGCCCCACCAATCCCAACATATCGGTGAAATGTCATTCCTTCAGCATTCCCGCTGCGAGTGCCGGCCTAAGAAGGACCGCACCAAACCAGAGAACCATTGTGAACCCTGTTCTGAGAGACGGAAGCACTTGTTCGTACAGGACCCTCAAACATGCAAGTGCAGCTGTAAGAATACCGACTCACGGTGTAAAGCTAGGCAACTGGAGCTTAATGAAAGGACCTGCCGATGCGATAAACCCAGGAGGtaa
GM-CSF (SEQ ID NO: 103)
ATGTGGTTGCAGAATTTGCTCTTCCTGGGGATTGTGGTCTACAGCCTCTCCGCACCTACCCGCTCTCCTATCACAGTTACAAGACCCTGGAAACATGTGGAGGCCATTAAAGAAGCATTGAATTTGTTGGACGATATGCCCGTCACCCTGAATGAAGAAGTAGAAGTTGTTTCTAATGAGTTCAGCTTTAAAAAATTGACCTGTGTGCAGACACGGCTTAAAATTTTTGAACAGGGACTTAGAGGAAACTTTACTAAGCTGAAGGGGGCACTTAACATGACAGCTTCTTATTATCAGACCTATTGTCCTCCAACACCTGAAACCGACTGTGAAACACAGGTAACCACTTACGCCGATTTTATTGATTCTTTGAAAACATTCCTCACCGATATACCATTTGAGTGTAAGAAGCCAGGCCAAAAGtaG
抗PD1 (SEQ ID NO: 104)
ATGGAAACTGACACACTTCTTCTGTGGGTCTTGCTCCTGTGGGTCCCAGGCTCTACTGGTGACAGTCCTGATAGGCCATGGAACCCACCTACCTTTAGTCCAGCCTTGCTCGTCGTAACCGAAGGGGACAACGCTACATTCACCTGCTCTTTTAGCAATACTTCTGAGAGTTTTCATGTAGTCTGGCATCGGGAGAGTCCATCCGGACAAACAGATACTTTGGCCGCTTTTCCAGAGGATAGGTCTCAACCTGGGCAAGACGCAAGGTTTCGAGTCACACAGCTTCCTAACGGGAGAGATTTTCACATGTCTGTAGTTCGGGCACGCCGAAATGATTCTGGCACATATGTTTGCGGTGTGATCTCACTTGCTCCAAAGATTCAAATAAAGGAGAGCCTTCGCGCCGAGTTGCGGGTGACTGAGCGGGAGCCCAAGTCCTGCGACAAAACCCATACTTGTCCACCCTGTGGCGGCGGGTCATCCGGTGGCGGGTCTGGGGGGCAACCAAGAGAGCCACAGGTATATACTCTTCCCCCCAGCAGAGAAGAAATGACAAAAAACCAAGTGTCCCTGACATGTCTGGTTAAAGGATTTTATCCCAGTGACATTGCTGTAGAATGGGAATCCAATGGTCAACCCGAGAATAACTACAAAACCACTCCTCCAGTATTGGACAGTGACGGTTCCTTCTTCCTCTATTCCAAACTTACAGTGGATAAATCCCGCTGGCAGCAAGGGAATGTATTCAGCTGTAGTGTCATGCACGAAGCTCTTCATAACCATTATACACAGAAATCTCTTTCCCTGAGCCCAGGTAAAtaG
腺苷去胺酶(ADA) #1 (小鼠) (SEQ ID NO: 105)
ATGGAGACTGATACACTTTTGCTCTGGGTTTTGCTCTTGTGGGTACCAGGGTCTACTGGAGATGCACAAACTCCTGCATTCAACAAGCCTAAGGTAGAGCTTCATGTCCATTTGGACGGAGCCATAAAACCTGAAACCATACTCTATTTCGGCAAGAAACGGGGTATAGCACTTCCCGCTGATACCGTGGAAGAGTTGAGAAATATCATTGGCATGGACAAACCTCTTAGCCTGCCTGGCTTTCTTGCAAAGTTCGACTACTATATGCCAGTTATAGCAGGGTGTAGAGAAGCAATAAAGCGAATCGCCTATGAGTTCGTTGAGATGAAGGCTAAAGAAGGAGTTGTTTACGTGGAAGTCCGGTACTCACCTCATCTGCTTGCTAATAGCAAGGTGGACCCAATGCCATGGAATCAAACTGAAGGTGATGTAACCCCTGACGATGTGGTCGATTTGGTCAATCAAGGTCTCCAAGAAGGCGAGCAGGCTTTCGGCATTAAGGTAAGAAGTATATTGTGCTGTATGCGACATCAACCTTCATGGTCCCTGGAGGTCCTCGAATTGTGCAAAAAGTACAATCAAAAAACAGTGGTCGCAATGGATCTCGCTGGAGATGAGACCATAGAAGGTTCCTCTCTTTTCCCCGGTCATGTCGAAGCATATGAAGGGGCTGTCAAAAATGGTATCCACCGCACCGTCCACGCAGGGGAAGTAGGGTCCCCAGAAGTAGTCAGGGAAGCCGTTGACATTTTGAAAACAGAAAGAGTCGGGCATGGCTACCATACAATAGAGGACGAAGCCTTGTACAATCGACTTTTGAAAGAAAATATGCACTTCGAGGTCTGTCCCTGGAGTTCATATCTCACCGGAGCATGGGACCCCAAAACAACCCACGCCGTCGTACGCTTCAAGAATGATAAGGCAAACTACAGTTTGAATACAGATGATCCACTGATATTCAAGTCAACACTTGACACTGACTACCAGATGACAAAAAAAGATATGGGTTTCACCGAAGAAGAGTTCAAGAGATTGAACATTAACGCAGCAAAAAGCTCCTTCCTGCCAGAGGAAGAGAAAAAAGAATTGCTTGAAAGGTTGTATCGAGAATACCAA
腺苷去胺酶(ADA) #2 (小鼠) (SEQ ID NO: 106)
ATGGCACAAACTCCAGCTTTTAATAAGCCCAAAGTGGAACTTCATGTTCATCTGGATGGGGCAATTAAGCCCGAAACTATATTGTACTTTGGCAAAAAGAGGGGTATTGCCCTGCCAGCAGATACCGTTGAGGAGCTTCGCAACATCATTGGGATGGACAAGCCCCTCTCTCTGCCAGGTTTTCTCGCTAAATTCGATTATTATATGCCTGTTATTGCTGGTTGCCGGGAGGCCATCAAGAGGATAGCCTACGAGTTTGTTGAGATGAAGGCCAAAGAGGGCGTGGTGTACGTAGAGGTCAGATACAGCCCTCACCTGCTTGCCAACAGCAAGGTGGACCCAATGCCCTGGAACCAAACCGAGGGGGATGTCACTCCCGACGACGTTGTAGACCTCGTAAATCAGGGCCTTCAAGAGGGCGAGCAGGCATTTGGCATAAAAGTCCGGTCTATACTCTGCTGTATGAGGCACCAACCCTCCTGGTCTTTGGAGGTACTTGAGTTGTGTAAGAAATACAATCAAAAGACTGTAGTCGCCATGGATCTTGCAGGCGATGAAACCATCGAGGGTAGCTCCTTGTTCCCTGGACATGTTGAAGCCTACGAGGGGGCCGTAAAAAATGGGATACACAGGACTGTCCACGCTGGTGAAGTCGGAAGCCCAGAGGTGGTAAGGGAGGCAGTTGACATACTCAAGACAGAGCGGGTTGGACACGGATACCACACAATTGAGGACGAGGCCCTGTATAACCGCCTCCTCAAAGAGAACATGCATTTTGAGGTGTGTCCTTGGTCCAGCTACCTGACTGGTGCTTGGGACCCTAAAACAACTCACGCCGTGGTCCGGTTCAAGAACGATAAAGCCAATTACTCTTTGAATACCGACGACCCCCTCATATTCAAATCAACATTGGATACCGACTACCAAATGACCAAAAAGGATATGGGGTTTACTGAAGAGGAGTTCAAGAGGCTCAACATAAATGCCGCTAAATCCTCCTTTCTCCCCGAGGAAGAAAAAAAAGAACTCCTTGAGCGGCTGTATAGGGAGTATCAA
4-1BBL #1 (小鼠) (SEQ ID NO: 107)
ATGGAAACAGATACACTCTTGCTCTGGGTACTGCTTCTGTGGGTCCCCGGCTCTACTGGGGATGAAGATGATGTAACTACTACAGAAGAACTCGCTCCCGCTCTTGTCCCCCCACCCAAGGGTACCTGCGCCGGTTGGATGGCTGGCATCCCAGGACATCCAGGTCACAACGGTACCCCCGGAAGAGATGGTCGGGATGGAACTCCCGGCGAGAAGGGCGAAAAAGGGGATGCAGGGCTTCTGGGACCTAAAGGTGAAACAGGGGACGTTGGAATGACTGGTGCAGAAGGGCCTCGCGGCTTTCCTGGCACCCCTGGGAGGAAAGGAGAGCCCGGAGAGCTCCAGAGAACTGAACCTCGGCCTGCACTCACTATAACTACTTCCCCTAATCTTGGGACCCGCGAGAACAACGCCGATCAGGTTACACCTGTAAGCCATATCGGGTGCCCCAATACTACCCAGCAAGGGAGTCCCGTGTTCGCAAAGCTTTTGGCTAAAAACCAAGCATCCCTGTGTAACACTACTCTTAATTGGCATTCACAAGACGGTGCTGGTAGCTCTTATCTTTCTCAGGGGCTGCGGTACGAAGAAGATAAGAAGGAATTGGTTGTGGATTCTCCAGGACTCTATTATGTCTTTCTCGAATTGAAGCTCAGTCCCACCTTCACAAACACTGGACACAAAGTCCAGGGCTGGGTAAGTCTGGTACTCCAAGCAAAGCCCCAGGTTGACGATTTCGACAATTTGGCACTCACCGTAGAGCTTTTCCCATGCTCCATGGAAAATAAACTTGTTGATCGGTCATGGTCACAGCTCTTGCTGCTTAAGGCAGGGCATCGCCTCTCAGTGGGTCTGAGAGCTTATTTGCATGGTGCACAAGATGCTTACAGGGATTGGGAATTGTCCTACCCAAACACTACAAGTTTCGGGTTGTTCCTTGTCAAACCTGATAACCCATGGGAGtaG
4-1BBL #2 (小鼠) (SEQ ID NO: 108)
ATGGAAACTGATACACTCCTCCTGTGGGTCCTTCTTTTGTGGGTGCCCGGATCAACCGGCGATGGCTGGATGGCAGGCATCCCAGGACACCCAGGACACAACGGTACTCCAGGTCGAGACGGTCGGGATGGGACTCCTGGGGAGAAAGGCGAGAAAGGGGACGCTGGTTTGCTCGGTCCTAAGGGGGAAACCGGGGATGTAGGAATGACAGGGGCTGAAGGGCCTCGGGGATTTCCTGGGACACCAGGCAGGAAGGGTGAACCAGGGGAGGCCCTCCAGCGCACCGAGCCACGGCCAGCTCTGACCATAACAACAAGTCCAAACCTGGGCACACGCGAAAACAATGCTGACCAGGTGACTCCTGTAAGTCACATCGGATGCCCTAACACTACACAACAGGGCTCTCCTGTATTTGCAAAGCTTCTCGCAAAAAATCAAGCATCACTTTGTAATACAACCCTGAACTGGCATTCTCAGGACGGAGCAGGGTCCTCTTATTTGTCTCAAGGGCTCCGCTACGAAGAAGATAAAAAGGAATTGGTTGTTGACAGTCCAGGTTTGTATTATGTGTTTTTGGAACTTAAGCTGTCACCAACCTTCACTAACACCGGCCACAAGGTCCAAGGCTGGGTTAGTCTTGTTTTGCAAGCCAAACCTCAAGTGGATGATTTTGACAATCTGGCTTTGACTGTTGAGCTTTTTCCATGCAGTATGGAGAATAAACTGGTTGATCGGTCATGGTCACAGCTCCTTCTGCTCAAGGCCGGACATAGGCTGAGTGTGGGACTTCGGGCCTACTTGCACGGCGCCCAGGACGCATACCGAGACTGGGAACTCAGCTACCCTAACACAACTTCTTTTGGGTTGTTCCTTGTCAAACCCGATAATCCTTGGGAAtaG
HPGE2 #1 (小鼠) (SEQ ID NO: 109)
ATGGAGACTGATACTTTGCTCCTGTGGGTTCTTCTCCTGTGGGTTCCTGGTTCCACAGGGGATATGCATGTCAATGGCAAGGTAGCACTCGTGACTGGGGCTGCACAGGGTATCGGGAAAGCTTTTGCCGAGGCCCTGTTGCTGCATGGCGCCAAGGTCGCTTTGGTAGATTGGAACTTGGAGGCTGGAGTTAAATGCAAAGCTGCACTCGACGAACAATTTGAGCCTCAAAAAACCCTCTTTGTGCAGTGTGACGTTGCTGACCAAAAGCAACTCAGGGACACATTCAGGAAGGTCGTAGACCATTTCGGACGCCTCGATATACTCGTTAATAATGCCGGGGTAAACAACGAAAAGAACTGGGAACAAACATTGCAAATCAACCTGGTAAGTGTCATTAGCGGAACTTATCTGGGTCTTGATTATATGAGCAAGCAGAACGGGGGCGAGGGCGGGATCATTATCAACATGTCAAGTCTTGCCGGATTGATGCCAGTTGCTCAGCAGCCTGTTTACTGTGCCAGCAAGCACGGTATTATTGGGTTTACCCGGAGTGCCGCCATGGCCGCAAATCTTATGAAGAGTGGGGTAAGACTGAATGTTATCTGCCCAGGTTTCGTAGATACCCCAATCCTGGAGAGCATCGAGAAGGAGGAAAATATGGGACAATACATTGAATATAAAGATCAAATCAAGGCTATGATGAAGTTCTACGGGGTTCTGCATCCATCCACAATTGCCAACGGGCTCATTAATCTGATTGAGGACGACGCCTTGAACGGAGCTATAATGAAAATCACAGCTTCCAAAGGCATTCACTTCCAAGATTATGATATATCACCCTTGCTTGTCAAGGCTCCTCTGACAAGT
HPGE2 #2 (小鼠) (SEQ ID NO: 110)
ATGCATGTCAATGGCAAGGTAGCACTCGTGACTGGGGCTGCACAGGGTATCGGGAAAGCTTTTGCCGAGGCCCTGTTGCTGCATGGCGCCAAGGTCGCTTTGGTAGATTGGAACTTGGAGGCTGGAGTTAAATGCAAAGCTGCACTCGACGAACAATTTGAGCCTCAAAAAACCCTCTTTGTGCAGTGTGACGTTGCTGACCAAAAGCAACTCAGGGACACATTCAGGAAGGTCGTAGACCATTTCGGACGCCTCGATATACTCGTTAATAATGCCGGGGTAAACAACGAAAAGAACTGGGAACAAACATTGCAAATCAACCTGGTAAGTGTCATTAGCGGAACTTATCTGGGTCTTGATTATATGAGCAAGCAGAACGGGGGCGAGGGCGGGATCATTATCAACATGTCAAGTCTTGCCGGATTGATGCCAGTTGCTCAGCAGCCTGTTTACTGTGCCAGCAAGCACGGTATTATTGGGTTTACCCGGAGTGCCGCCATGGCCGCAAATCTTATGAAGAGTGGGGTAAGACTGAATGTTATCTGCCCAGGTTTCGTAGATACCCCAATCCTGGAGAGCATCGAGAAGGAGGAAAATATGGGACAATACATTGAATATAAAGATCAAATCAAGGCTATGATGAAGTTCTACGGGGTTCTGCATCCATCCACAATTGCCAACGGGCTCATTAATCTGATTGAGGACGACGCCTTGAACGGAGCTATAATGAAAATCACAGCTTCCAAAGGCATTCACTTCCAAGATTATGATATATCACCCTTGCTTGTCAAGGCTCCTCTGACAAGT
額外實施例
以下提供描述特定實施例之列舉段落： 1.     一種經工程改造之細胞，其包含： a) 啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 2.     段落1之經工程改造之細胞，其中該啟動子包含外源性啟動子多核苷酸序列。 3.     段落1之經工程改造之細胞，其中該啟動子包含內源性啟動子。 4.     段落1至3中任一段落之經工程改造之細胞，其中啟動子可操作地連接於表現盒，以使得多核苷酸能夠轉錄為包含式S1-E1-L-S2-E2之單一多核苷酸。 5.     段落4之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列與該第一效應分子及該第二效應分子轉譯為不同的多肽可操作地相關聯。 6.     段落5之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列編碼2A核糖體跳躍標籤。 7.     段落6之經工程改造之細胞，其中該2A核糖體跳躍標籤係選自由以下組成之群：P2A、T2A、E2A及F2A。 8.     段落5之經工程改造之細胞，其中連接子多核苷酸序列編碼T2A核糖體跳躍標籤。 9.     段落5之經工程改造之細胞，該連接子多核苷酸序列編碼內部核糖體進入位點(IRES)。 10.   段落5至9中任一段落之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列編碼可裂解多肽。 11.   段落10之經工程改造之細胞，其中該可裂解多肽包含弗林蛋白酶識別多肽序列。 12.   段落5至9中任一段落之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列進一步編碼Gly-Ser-Gly多肽序列。 13.   段落1至5中任一段落之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向。 14.   段落1至3中任一段落之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列編碼第二啟動子， 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得包含式S1-E1之第一多核苷酸能夠得以轉錄， 其中該第二啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得包含式S2-E2之第二多核苷酸能夠得以轉錄，且其中該第一多核苷酸及該第二多核苷酸為不同的多核苷酸。 15.   段落14之經工程改造之細胞，其中該啟動子及該第二啟動子為相同的。 16.   段落14之經工程改造之細胞，其中該啟動子及該第二啟動子為不同的。 17.   段落1至16中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞相對於需要治療性治療之個體而言為HLA型。 18.   段落1至17中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞為人類細胞。 19.   段落18之經工程改造之細胞，其中該人類細胞為從個體分離之細胞。 20.   段落19之經工程改造之細胞，其中分離之細胞自由以下組成之群的組織分離：骨髓、脂肪組織、臍帶、胎肝、肌肉及肺組織。 21.   段落1至20中任一段落之經工程改造之細胞，其中工程改造之細胞為培養細胞。 22.   段落1至21中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之MSC包含包括細胞標記物CD105+、CD73+及CD90+之細胞標記物表型。 23.   段落22之經工程改造之細胞，其中該細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。 24.   段落1至21中任一段落之經工程改造之細胞，其中經工程改造之MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II類HLA-之細胞標記物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。 25.   段落22至24中任一段落之經工程改造之細胞，其中細胞標記物表型藉由或已經藉由流動式細胞量測術來測定。 26.   段落1至21中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含T細胞。 27.   段落1至21中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含NK細胞。 28.   段落1至21中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含NKT細胞。 29.   段落22至28中任一段落之經工程改造之細胞，其中該細胞標記物表型進一步包含包括在該等經工程改造之細胞中表現之該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子的同源受體或同源受體配位體的細胞標記物。 30.   段落29之經工程改造之細胞，其中該受體係選自由以下組成之群：IL12RB1、IL12RB2、CCL7及其組合。 31.   段落1至30中任一段落之經工程改造之細胞，其中該啟動子及/或該第二啟動子包含組成型啟動子。 32.   段落31之經工程改造之細胞，其中該組成型啟動子係選自由以下組成之群：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb及hUBIb。 33.   段落1至30中任一段落之經工程改造之細胞，其中該啟動子包含SFFV啟動子。 34.   段落1至30中任一段落之經工程改造之細胞，其中該啟動子及/或該第二啟動子包含誘導型啟動子。 35.   段落34之經工程改造之細胞，其中誘導型啟動子係選自由以下組成之群：minP、NFkB反應元件、CREB反應元件、NFAT反應元件、SRF反應元件1、SRF反應元件2、AP1反應元件、TCF-LEF反應元件啟動子融合物、缺氧反應元件、SMAD結合元件、STAT3結合位點、誘導分子反應型啟動子及其串聯重複序列。 36.   段落1至35中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一信號肽或該第二信號肽分別包含相對於該第一效應分子或該第二效應分子而言為天然的天然信號肽。 37.   段落1至36中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一信號肽或該第二信號肽分別包含相對於該第一效應分子或該第二效應分子而言為非天然的非天然信號肽。 38.   段落37之經工程改造之細胞，其中該非天然信號肽係選自由以下組成之群：非天然信號肽係選自由以下組成之群：IL12、IL2、最佳化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12及IL21。 39.   段落1至38中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一信號肽及該第二信號肽為相同的。 40.   段落1至39中任一段落之經工程改造之細胞，其中編碼該第一信號肽之該多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。 41.   段落1至40中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一分泌多肽為人類IL12信號肽。 42.   段落1至40中任一段落之經工程改造之細胞，其中編碼該第二信號肽之該多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。 43.   段落1至42中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第二分泌多肽為人類IL21信號肽。 44.   段落1至42中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子係選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑a、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶。 45.   段落1至44中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第二效應分子係選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶。 46.   段落45之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子及該第二效應分子之治療類別為不同的。 47.   段落1至46中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子及/或該第二效應分子為經修飾之效應分子。 48.   段落47之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子及/或該第二效應分子經修飾以包含細胞膜繫栓域。 49.   段落48之經工程改造之細胞，其中該細胞膜系拴域包含跨膜-細胞內域或跨膜域。 50.   段落48之經工程改造之細胞，其中該細胞膜系拴域包含細胞表面受體或其細胞膜結合部分。 51.   段落50之經工程改造之細胞，其中該經修飾之效應分子為包含細胞表面受體或其細胞膜結合部分之融合蛋白。 52.   段落48至51中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經修飾之效應分子進一步包含介於該效應分子與該細胞膜系拴域之間的連接子。 53.   段落47至52中任一段落之經工程改造之細胞，其中當表現時，該經修飾之效應分子系拴至該經工程改造之細胞之細胞膜。 54.   段落44至53中任一段落之經工程改造之細胞，其中細胞介素係選自由以下組成之群：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干擾素及干擾素-γ。 55.   段落54之經工程改造之細胞，其中該IL12細胞介素為IL12p70融合蛋白。 56.   段落44至55中任一段落之經工程改造之細胞，其中該趨化介素係選自由以下組成之群：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合蛋白、CCL19、CXCL9及XCL1。 57.   段落44至56中任一段落之經工程改造之細胞，其中該生長因子係選自由以下組成之群：Flt3L及GM-CSF。 58.   段落44至57中任一段落之經工程改造之細胞，其中該共活化分子係選自由以下組成之群：4-1BBL及CD40L。 59.   段落34至41中任一段落之經工程改造之細胞，其中該腫瘤微環境調節劑係選自由以下組成之群：腺苷去胺酶、TGFβ抑制劑、免疫檢查點抑制劑、VEGF抑制劑及HPGE2。 60.   段落59之經工程改造之細胞，其中該TGFβ抑制劑係選自由以下組成之群：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗體、TGFb-TRAP及其組合。 61.   段落59之經工程改造之細胞，其中該等免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體。 62.   段落59之經工程改造之細胞，其中該等VEGF抑制劑包含抗VEGF抗體、抗VEGF肽或其組合。 63.   段落1至59中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子及該第二效應分子為人類來源效應分子。 64.   段落1至63中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子包含IL12。 65.   段落1至63中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子包含IL12p70融合蛋白。 66.   段落65之經工程改造之細胞，其中該IL12p70融合蛋白為人類IL12p70融合蛋白。 67.   段落64至66中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第二效應分子包含CCL21a。 68.   段落67之經工程改造之細胞，其中該CCL21a為人類CCL21a。 69.   段落64至66中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第二效應分子包含IL7。 70.   段落69之經工程改造之細胞，其中該IL7為人類IL7。 71.   段落64至66中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第二效應分子包含IL21。 72.   段落71之經工程改造之細胞，其中該IL21為人類IL21。 73.   段落1至72中任一段落之經工程改造之細胞，其中該表現盒進一步包含包括編碼第三效應分子之多核苷酸序列的E3。 74.   段落73之經工程改造之細胞，其中該第三效應分子包含Flt3L。 75.   段落73之經工程改造之細胞，其中該第三效應分子包含抗PD1。 76.   段落75之經工程改造之細胞，其中該表現盒進一步包含包括編碼第四效應分子之多核苷酸序列的E4。 77.   段落76之經工程改造之細胞，其中該第四效應分子包含腺苷去胺酶。 78.   段落73之經工程改造之細胞，其中該第三效應分子包含腺苷去胺酶。 79.   段落73之經工程改造之細胞，其中該第三效應分子包含CD40L。 80.   段落73之經工程改造之細胞，其中該第三效應分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。 81.   段落73之經工程改造之細胞，其中該第三效應分子包含XCL1。 82.   段落64之經工程改造之細胞，其中該第二效應分子包含Flt3L。 83.   段落64之經工程改造之細胞，其中該第二效應分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。 84.   段落64之經工程改造之細胞，其中該第二效應分子包含抗PD1。 85.   段落64之經工程改造之細胞，其中該第二效應分子包含CD40L。 86.   段落1至63中任一段落之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子包含干擾素-β且該第二效應分子包含Flt3L。 87.   段落1至86中任一段落之經工程改造之細胞，其中編碼該第一效應分子之該多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。 88.   段落1至87中任一段落之經工程改造之細胞，其中編碼該第二效應分子之該多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。 89.   段落1至88中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含編碼該啟動子及該表現盒之多核苷酸序列。 90.   段落89之經工程改造之細胞，其中該外源性多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 144中所示之序列。 91.   段落1至90中任一段落之經工程改造之細胞，其中該外源性多核苷酸序列整合至該經工程改造之細胞之基因組中。 92.   段落1至91中任一段落之經工程改造之細胞，其中外源性多核苷酸序列包含一或多個病毒載體多核苷酸序列。 93.   段落92之經工程改造之細胞，其中該一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子或腺病毒多核苷酸序列。 94.   段落1至93中任一段落之經工程改造之細胞，其中該表現盒在E2之後進一步包含額外外源性多核苷酸序列，該外源性多核苷酸序列包含下式，自5’至3’定向，該式包含：(L-S-E)X 其中 S包含編碼信號肽之多核苷酸序列， E包含編碼效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， X = 1至20 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，且其中對於各X，對應的該信號肽與該效應分子可操作地相關聯。 95.   一種包含構築體之經工程改造之細胞，其中該構築體包含： a) SFFV啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽； E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 96.   段落95之經工程改造之細胞，其中該構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。 97.   段落95或段落96之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞相對於需要治療性治療之個體而言為HLA型。 98.   段落95至97中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞為人類細胞。 99.   段落98之經工程改造之細胞，其中該人類細胞為自個體分離之細胞。 100.      段落99之經工程改造之細胞，其中分離之細胞自由以下組成之群的組織分離：骨髓、脂肪組織、臍帶、胎肝、肌肉及肺組織。 101.      段落95至100中任一段落之經工程改造之細胞，其中工程改造之細胞為培養細胞。 102.      段落95至101中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之MSC包含包括細胞標記物CD105+、CD73+及CD90+之細胞標記物表型。 103.      段落102之經工程改造之細胞，其中該細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。 104.      段落95至101中任一段落之經工程改造之細胞，其中經工程改造之MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II類HLA-之細胞標記物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。 105.      段落95至101中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含T細胞。 106.      段落105之經工程改造之細胞，其中該T細胞為CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞或T調控細胞。 107.      段落95至101中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含NK細胞。 108.      段落95至101中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含NKT細胞。 109.      段落95至101中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含單核球細胞。 110.      段落95至101中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含巨噬細胞。 111.      段落95至101中任一段落之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞包含TIL。 112.      段落95至111中任一段落之經工程改造之細胞，其中該外源性多核苷酸序列整合至該經工程改造之細胞之基因組中。 113.      段落95至112中任一段落之經工程改造之細胞，其中外源性多核苷酸序列包含一或多個病毒載體多核苷酸序列。 114.      段落113之經工程改造之細胞，其中該一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子或腺病毒多核苷酸序列。 115.      段落113之經工程改造之細胞，其中該一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒多核苷酸序列。 116.      段落1至115中任一段落之經工程改造之細胞，其中該細胞分泌各效應分子。 117.      段落116之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子以相對於該第二效應分子之分泌高10倍的比率分泌。 118.      段落1至117中任一段落之經工程改造之細胞，其中該細胞進一步包含抗原識別受體。 119.      段落118之經工程改造之細胞，其中該抗原識別受體識別選自由以下組成之群的抗原：5T4、ADAM9、ADGRE2、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、鈣黏附蛋白3、鈣黏附蛋白6、CCR1、CCR4、CD117、CD123、CD131、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD244、CD30、CD300LF、CD33、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CD93、CEA、CEACAM5、緊密連接蛋白18.2、CLEC12A、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、EMB、ENPP3、EpCAM、EphA2、Ephrin A4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRα、FRb、FLT3、GAPT、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-1RAP、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、整合素aV、KIT、L1CAM、LAMP1、LAT2、Lewis Y、LeY、LILRA2、LILRB2、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、間皮素、MLC1、MS4A3、MUC1、MUC16、MUC1C、MYADM、NaPi2B、結合素4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、卵巢素、P-鈣黏附蛋白、pan-Erb2、PIEZO1、PRAM1、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLC22A16、SLC17A9、SLITRK6、SPNS3、SSTR2、STEAP1、存活素、TDGF1、TIM1、TROP2、VSTM1及WT1。 120.      段落118或段落119之經工程改造之細胞，其中該抗原識別受體包含抗原結合域。 121.      段落120之經工程改造之細胞，其中該抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。 122.      段落120之經工程改造之細胞，其中該抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。 123.      段落122之經工程改造之細胞，其中該scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。 124.      段落123之經工程改造之細胞，其中該VH及VL藉由肽連接子相隔。 125.      段落124之經工程改造之細胞，其中該scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。 126.      段落118至125中任一段落之經工程改造之細胞，該抗原識別受體是嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。 127.      段落118至125中任一段落之經工程改造之細胞，該抗原識別受體是嵌合抗原受體(CAR)。 128.      段落127之經工程改造之細胞，其中該CAR包含一或多種細胞內信號傳導結構域，且該一或多種細胞內信號傳導結構域係選自由以下組成之群：CD3δ鏈細胞內信號結構域、CD97細胞內信號結構域、CD11a-CD18細胞內信號結構域、CD2細胞內信號結構域、ICOS細胞內信號結構域、CD27細胞內信號結構域、CD154細胞內信號結構域、CD8細胞內信號結構域、OX40細胞內信號結構域、4-1BB細胞內信號結構域、CD28細胞內信號結構域、ZAP40細胞內信號結構域、CD30細胞內信號結構域、GITR細胞內信號結構域、HVEM細胞內信號結構域、DAP10細胞內信號結構域、DAP12細胞內信號結構域及MyD88細胞內信號結構域。 129.      段落127或段落128之經工程改造之細胞，其中該CAR包含跨膜結構域，且跨膜結構域係選自由以下組成之群：CD8跨膜域、CD28跨膜域、CD3δ鏈跨膜域、CD4跨膜域、4-1BB跨膜域、OX40跨膜域、ICOS跨膜域、CTLA-4跨膜域、PD-1跨膜域、LAG-3跨膜域、2B4跨膜域及BTLA跨膜域。 130.      段落127至129中任一段落之經工程改造之細胞，其中該CAR包含介於該抗原結合域與該跨膜結構域之間的間隔區。 131.      一種細胞群體，該細胞群體包含段落1至130中任一段落之任何經工程改造之細胞。 132.      段落131之細胞群體，其中該等細胞群體富集該等工程改造之細胞。 133.      段落131或段落132之細胞群體，其中在該等經工程改造之細胞中表現的該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子促進生長、活力或生長及活力相對於該群體中不表現該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子之細胞增加。 134.      段落133之細胞群體，其中該第一效應分子為IL12或IL12p70融合蛋白。 135.      段落134之細胞群體，其中富集該等經工程改造之細胞的該細胞群體表現IL12受體β1或增加其水平，表現IL12受體β2或增加其水平，或表現IL12受體β1及IL12受體β2或增加其水平。 136.      段落133至135中任一段落之細胞群體，其中該第二效應分子為IL21。 137.      段落133至135中任一段落之細胞群體，其中該第二效應分子為CCL21。 138.      段落137之細胞群體，其中富集該等經工程改造之細胞的該細胞群體表現CCL21受體或增加其水平。 139.      段落138之細胞群體，其中該CCL21受體為CCR7。 140.      一種刺激個體中細胞介導之對腫瘤細胞之免疫反應的方法，該方法包括向具有腫瘤之個體投與治療有效劑量之段落114至131中任一段落之任何經工程改造之細胞或段落19至139中任一段落之細胞群體。 141.      一種提供個體抗腫瘤免疫之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效劑量之段落1至114中任一段落之任何經工程改造之細胞或段落131至139中任一段落之細胞群體。 142.      一種治療患有癌症之個體之方法，該方法包括向具有腫瘤之個體投與治療有效劑量之段落1至114中任一段落之任何經工程改造之細胞或段落131至139中任一段落之細胞群體。 143.      一種減小個體中之腫瘤體積之方法，該方法包括向具有腫瘤之個體投與治療有效劑量之段落1至114中任一段落之任何經工程改造之細胞或段落131至139中任一段落之細胞群體。 144.      段落140至143中任一段落之方法，其中該經工程改造之細胞源自於該個體。 145.      段落140至143中任一段落之方法，其中該經工程改造之細胞對於該個體為同種異體的。 146.      段落140至145中任一段落之方法，其中該腫瘤係選自由以下組成之群：腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(TALL)、B細胞前淋巴球性白血病、膀胱腫瘤、腦腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸腫瘤、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸腫瘤、食道腫瘤、神經膠質瘤、腎臟腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、脊髓發育不良、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、漿細胞骨髓瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、甲狀腺腫瘤及子宮腫瘤。 147.      段落140至145中任一段落之方法，其中該腫瘤為卵巢腫瘤。 148.      段落中140至147任一段落之方法，其中該腫瘤為位於腹膜間隙之腫瘤。 149.      一種經工程改造之細胞，其包含： a) 啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：(L-S-E)X 其中 S包含編碼信號肽之多核苷酸序列， E包含編碼效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， X = 2至20， 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，其中對於(L - S - E)之第一次迭代而言，單元L缺乏，且其中對於各X而言，對應的信號肽與該效應分子可操作地相關聯，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 150.      一種細胞群體，其包含一或多個經工程改造之細胞，其中該一或多個經工程改造之細胞包含： a) 啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 151.      一種細胞群體，其包含一或多個經工程改造之細胞，其中該一或多個經工程改造之細胞包含： a) 啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中在該等經工程改造之細胞中表現的該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子促進生長、活力或生長及活力相對於該群體中不表現該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子之細胞增加，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 152.      段落151之細胞群體，其中該一或多個經工程改造之細胞表現在該等經工程改造之細胞中表現的該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子的同源受體或同源受體配位體。 153.      段落151或段落152之細胞群體，其中該第一效應分子為IL12或IL12p70融合蛋白。 154.      段落151至153中任一段落之細胞群體，其中該第二效應分子為IL21。 155.      段落151至153中任一段落之細胞群體，其中該第二效應分子為CCL21。 156.      一種細胞群體，其包含一或多個經工程改造之細胞，其中該一或多個經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含： a) SFFV啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽; E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 157.      一種細胞群體，其包含一或多個經工程改造之細胞，其中該一或多個經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含： a) SFFV啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽; E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中在該等經工程改造之細胞中表現的該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子促進生長、活力或生長及活力相對於該群體中不表現該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子之細胞增加，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 158.      段落156或段落157之細胞群體，其中構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。 159.      一種產生富集一或多種受體或受體配位體之細胞群體的方法，其包括在使一或多個細胞接觸第一效應分子、第二效應分子或第一及第二效應分子之條件下培養該一或多個細胞，其中接觸之細胞表現該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子之一或多種同源受體或同源受體配位體，且其中該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子促進接觸之細胞的生長、活力或生長及活力相對於缺乏該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子時培養之細胞增加。 160.      段落159之方法，其中該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子在一或多個細胞中異源表現，且該一或多個細胞以自分泌方式接觸該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子。 161.      段落159之方法，其中該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子在一或多個額外細胞中表現，且該一或多個細胞以旁分泌方式接觸該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子。 162.      段落161之方法，其中該一或多個額外細胞為餵養細胞。 163.      段落159之方法，其中該一或多個細胞在培養基中培養。 164.      段落163之方法，其中藉由添加可溶性第一效應分子、可溶性第二效應分子或可溶性第一效應分子及第二效應分子至該培養基，使該一或多個細胞接觸該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子。 165.      段落163或段落164之方法，其中該可溶性第一效應分子及/或該可溶性第二效應分子為重組效應分子。 166.      段落159之方法，其中該一或多個細胞在附著條件下培養。 167.      段落166之方法，其中該一或多個細胞附著至表面上。 168.      段落167之方法，其中藉由將該一或多個細胞暴露於該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子，使該等附著細胞接觸該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子，固定在表面上。 169.      段落159中任一段落之方法，其中該第一效應分子為IL12或IL12p70融合蛋白。 170.      段落169之方法，其中該細胞群體富集IL12受體β1 (IL12Rβ1)、富集IL12受體β2 (IL12Rβ2)或富集IL12Rβ1及IL12Rβ2。 171.      段落170之方法，其中該MSC群體包含包括細胞標記物CD105+、CD73+、CD90+、IL12Rβ1+及IL12Rβ2+之細胞標記物表型。 172.      段落171之方法，其中細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。 173.      段落159之方法，其中該細胞群體包含選自由以下組成之群的細胞：天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球及樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γ-δ T細胞及T調控細胞及B細胞。 174.      段落173之方法，其中該細胞群體包含T細胞、NK細胞、NKT細胞、單核球、巨噬細胞或骨髓來源細胞。 175.      段落159中任一段落之方法，其中該第二效應分子為IL21。 176.      段落159中任一段落之方法，其中該第二效應分子為CCL21。 177.      段落176之方法，其中該細胞群體富集CCR7。 178.      段落177之方法，其中該MSC群體包含包括細胞標記物CD105+、CD73+、CD90+、IL12Rβ1+、IL12Rβ2+及CCR7+之細胞標記物表型。 179.      段落178之方法，其中細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。 180.      一種細胞群體，其富集一或多種受體或受體配位體，藉由段落159至179中任一段落之方法產生。 181.      一種外源性多核苷酸序列，其包含啟動子及下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。 182.      段落181之外源性多核苷酸序列，其中該啟動子包含外源性啟動子多核苷酸序列。 183.      段落181之外源性多核苷酸序列，其中該啟動子包含內源性啟動子。 184.      段落181至183中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中啟動子可操作地連接於表現盒，以使得多核苷酸能夠轉錄為包含式S1-E1-L-S2-E2之單一多核苷酸。 185.      段落184之外源性多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列與該第一效應分子及該第二效應分子轉譯為不同的多肽可操作地相關聯。 186.      段落185之外源性多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼2A核糖體跳躍標籤。 187.      段落186之外源性多核苷酸序列，其中該2A核糖體跳躍標籤係選自由以下組成之群：P2A、T2A、E2A及F2A。 188.      段落185之外源性多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼T2A核糖體跳躍標籤。 189.      段落185之外源性多核苷酸序列，該連接子多核苷酸序列編碼內部核糖體進入位點(IRES)。 190.      段落185至189中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼可裂解多肽。 191.      段落181之外源性多核苷酸序列，其中該可裂解多肽包含弗林蛋白酶識別多肽序列。 192.      段落185至189中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列進一步編碼Gly-Ser-Gly多肽序列。 193.      段落181至185中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向。 194.      段落181至183中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼第二啟動子， 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得包含式S1-E1之第一多核苷酸能夠得以轉錄， 其中該第二啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得包含式S2-E2之第二多核苷酸能夠得以轉錄，且其中該第一多核苷酸及該第二多核苷酸為不同的多核苷酸。 195.      段落181之外源性多核苷酸序列，其中該啟動子及該第二啟動子為相同的。 196.      段落181之外源性多核苷酸序列，其中該啟動子及該第二啟動子為不同的。 197.      段落181至196中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該啟動子及/或該第二啟動子包含組成型啟動子。 198.      段落197之外源性多核苷酸序列，其中組成型啟動子係選自由以下組成之群：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb及hUBIb。 199.      段落181至196中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該啟動子包含SFFV啟動子。 200.      段落181至196中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該啟動子及/或該第二啟動子包含誘導型啟動子。 201.      段落200之外源性多核苷酸序列，其中誘導型啟動子係選自由以下組成之群：minP、NFkB反應元件、CREB反應元件、NFAT反應元件、SRF反應元件1、SRF反應元件2、AP1反應元件、TCF-LEF反應元件啟動子融合物、缺氧反應元件、SMAD結合元件、STAT3結合位點、誘導分子反應型啟動子及其串聯重複序列。 202.      段落181至201中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一信號肽或該第二信號肽分別包含相對於該第一效應分子或該第二效應分子而言為天然的天然信號肽。 203.      段落181至202中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一信號肽或該第二信號肽分別包含相對於該第一效應分子或該第二效應分子而言為非天然的非天然信號肽。 204.      段落203之外源性多核苷酸序列，其中該非天然信號肽係選自由以下組成之群：非天然信號肽係選自由以下組成之群：IL12、IL2、最佳化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白、骨結合素、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1、GROα、CXCL12及IL21。 205.      段落181至204中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一信號肽及該第二信號肽為相同的。 206.      段落181至205中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中編碼該第一信號肽之該多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。 207.      段落181至206中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一分泌多肽為人類IL12信號肽。 208.      段落181至206中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中編碼該第二信號肽之該多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。 209.      段落181至208中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第二分泌多肽為人類IL21信號肽。 210.      段落181至208中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一效應分子係選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑a、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶。 211.      段落181至210中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第二效應分子係選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶。 212.      段落211之外源性多核苷酸序列，其中該第一效應分子及該第二效應分子之治療類別為不同的。 213.      段落181至212中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一效應分子及/或該第二效應分子為經修飾之效應分子。 214.      段落213之外源性多核苷酸序列，其中該第一效應分子及/或該第二效應分子經修飾以包含細胞膜繫栓域。 215.      段落214之外源性多核苷酸序列，其中該細胞膜系拴域包含跨膜-細胞內域或跨膜域。 216.      段落214之外源性多核苷酸序列，其中該細胞膜系拴域包含細胞表面受體或其細胞膜結合部分。 217.      段落216之外源性多核苷酸序列，其中該經修飾之效應分子為包含細胞表面受體或其細胞膜結合部分之融合蛋白。 218.      段落214至217中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該經修飾之效應分子進一步包含介於該效應分子與該細胞膜系拴域之間的連接子。 219.      段落213至218中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中當在細胞中表現時，經修飾之效應分子系拴至細胞之細胞膜。 220.      段落210至219中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中細胞介素係選自由以下組成之群：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干擾素及干擾素-γ。 221.      段落220之外源性多核苷酸序列，其中該IL12細胞介素為IL12p70融合蛋白。 222.      段落210至221中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該趨化介素係選自由以下組成之群：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合蛋白、CCL19、CXCL9及XCL1。 223.      段落210至222中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該生長因子係選自由以下組成之群：Flt3L及GM-CSF。 224.      段落210至223中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該共活化分子係選自由以下組成之群：4-1BBL及CD40L。 225.      段落210至224中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該腫瘤微環境調節劑係選自由以下組成之群：腺苷去胺酶、TGFβ抑制劑、免疫檢查點抑制劑、VEGF抑制劑及HPGE2。 226.      段落225之外源性多核苷酸序列，其中該TGFβ抑制劑係選自由以下組成之群：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗體、TGFb-TRAP及其組合。 227.      段落225之外源性多核苷酸序列，其中該等免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體。 228.      段落225之外源性多核苷酸序列，其中該等VEGF抑制劑包含抗VEGF抗體、抗VEGF肽或其組合。 229.      段落181至225中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一效應分子及該第二效應分子為人類來源效應分子。 230.      段落181至229中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一效應分子包含IL12。 231.      段落181至229中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一效應分子包含IL12p70融合蛋白。 232.      段落231之外源性多核苷酸序列，其中該IL12p70融合蛋白為人類IL12p70融合蛋白。 233.      段落230至232中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第二效應分子包含CCL21a。 234.      段落233之外源性多核苷酸序列，其中該CCL21a為人類CCL21a。 235.      段落230至232中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第二效應分子包含IL7。 236.      段落235之外源性多核苷酸序列，其中該IL7為人類IL7。 237.      段落230至232中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第二效應分子包含IL21。 238.      段落237之外源性多核苷酸序列，其中該IL21為人類IL21。 239.      段落181至238中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該表現盒進一步包含包括編碼第三效應分子之多核苷酸序列的E3。 240.      段落239之外源性多核苷酸序列，其中該第三效應分子包含Flt3L。 241.      段落239之外源性多核苷酸序列，其中該第三效應分子包含抗PD1。 242.      段落241之外源性多核苷酸序列，其中該表現盒進一步包含包括編碼第四效應分子之多核苷酸序列的E4。 243.      段落242之外源性多核苷酸序列，其中該第四效應分子包含腺苷去胺酶。 244.      段落239之外源性多核苷酸序列，其中該第三效應分子包含腺苷去胺酶。 245.      段落239之外源性多核苷酸序列，其中該第三效應分子包含CD40L。 246.      段落239之外源性多核苷酸序列，其中該第三效應分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。 247.      段落239之外源性多核苷酸序列，其中該第三效應分子包含XCL1。 248.      段落230之外源性多核苷酸序列，其中該第二效應分子包含Flt3L。 249.      段落230之外源性多核苷酸序列，其中該第二效應分子包含CXCL10-CXCL11融合蛋白。 250.      段落230之外源性多核苷酸序列，其中該第二效應分子包含抗PD1。 251.      段落230之外源性多核苷酸序列，其中該第二效應分子包含CD40L。 252.      段落181至229中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該第一效應分子包含干擾素-β且該第二效應分子包含Flt3L。 253.      段落181至252中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中編碼該第一效應分子之該多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。 254.      段落181至253中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中編碼該第二效應分子之該多核苷酸序列包含密碼子優化之多核苷酸序列。 255.      段落181至254中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該外源性多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。 256.      一種外源性多核苷酸序列，其包含SFFV啟動子及下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽; E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。 257.      段落256之外源性多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。 258.      一種外源性多核苷酸序列，其包含SFFV啟動子及下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽; E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21； 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子； 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得該等多核苷酸能夠轉錄為包含式S1-E1-L-S2-E2之單一多核苷酸；且 其中該多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。 259.      段落181至258中任一段落之外源性多核苷酸序列，其中該外源性多核苷酸序列藉由選自由以下組成之群的核酸編碼：DNA、cDNA、RNA、mRNA及裸質粒。 260.      一種表現載體，其包含段落181至259中任一段落之外源性多核苷酸序列。 261.      段落260之表現載體，其中該表現載體為病毒載體。 262.      段落261之表現載體，其中該表現載體為慢病毒載體。 263.      一種組合物，其包含段落181至259中任一段落之外源性多核苷酸序列及醫藥學上可接受之載劑。 264.      一種分離之細胞，其包含段落181至259中任一段落之外源性多核苷酸序列、段落260至262中任一段落之表現載體或段落263之組合物。 265.      段落264之分離之細胞，其中該分離之細胞係選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γ-δ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、T調控細胞、病毒特異性T細胞、天然殺手T(NKT)細胞、天然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天淋巴樣細胞、巨大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、嗜中性白血球、骨髓細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、紅血球、血小板細胞、人類胚胎幹細胞(ESC)、ESC來源細胞、多能幹細胞、MSC、誘導性多能幹細胞(iPSC)及iPSC來源細胞。 266.      段落264之分離之細胞，其中該分離之細胞為MSC。 267.      段落264至266中任一段落之分離之細胞，其中該外源性多核苷酸序列整合至該細胞之基因組中。 268.      段落264至267中任一段落之分離之細胞，其中該外源性多核苷酸序列包含一或多個病毒載體多核苷酸序列。 269.      段落268之分離之細胞，其中該一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子或腺病毒多核苷酸序列。 270.      段落268之分離之細胞，其中該一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒多核苷酸序列。 271.      段落264至270中任一段落之分離之細胞，其中該經工程改造之細胞相對於需要治療性治療之個體而言為HLA型。 272.      段落264至271中任一段落之分離之細胞，其中該經工程改造之細胞為人類細胞。 273.      段落272之分離之細胞，其中該人類細胞為自個體分離之細胞。 274.      段落273之分離之細胞，其中分離之細胞自由以下組成之群的組織分離：骨髓、脂肪組織、臍帶、胎肝、肌肉及肺組織。 275.      段落264至272中任一段落之分離之細胞，其中該細胞為培養細胞。 276.      段落264至275中任一段落之分離之細胞，其中該細胞包含包括細胞標記物CD105+、CD73+及CD90+之細胞標記物表型。 277.      段落276之分離之細胞，其中細胞標記物表型進一步包含缺乏或基本上缺乏選自由以下組成之群之一或多種細胞標記物的表型：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、II類HLA及其組合。 278.      段落264至275中任一段落之分離之細胞，其中該細胞包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II類HLA-之細胞標記物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。 279.      段落264至278中任一段落之分離之細胞，其中該細胞標記物表型進一步包含包括在該細胞中表現之該第一效應分子、該第二效應分子或該第一效應分子及該第二效應分子的同源受體或同源受體配位體的細胞標記物。 280.      段落279之分離之細胞，其中該受體係選自由以下組成之群：IL12RB1、IL12RB2、CCL7及其組合。 281.      段落264至280中任一段落之分離之細胞，其中該細胞分泌各效應分子。 282.      段落281之分離之細胞，其中該第一效應分子以相對於該第二效應分子之分泌高10倍的比率分泌。 283.      段落264至282中任一段落之分離之細胞，其中該細胞進一步包含抗原識別受體。 284.      段落283之分離之細胞，其中該抗原識別受體包含抗原結合域。 285.      段落284之分離之細胞，其中該抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。 286.      段落284之分離之細胞，其中該抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。 287.      段落286之分離之細胞，其中該scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。 288.      段落287之分離之細胞，其中該VH及VL藉由肽連接子相隔。 289.      段落288之分離之細胞，其中該scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。 290.      段落283至289中任一段落之分離之細胞，該抗原識別受體是嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。 291.      段落283至289中任一段落之分離之細胞，該抗原識別受體是嵌合抗原受體(CAR)。 292.      段落291之分離之細胞，其中該CAR包含一或多個細胞內信號傳導結構域，且該一或多個細胞內信號傳導結構域係選自由以下組成之群：CD3ζ鏈細胞內信號傳導結構域、CD97細胞內信號傳導結構域、CD11a-CD18細胞內信號傳導結構域、CD2細胞內信號傳導結構域、ICOS細胞內信號傳導結構域、CD27細胞內信號傳導結構域、CD154細胞內信號傳導結構域、CD8細胞內信號傳導結構域、OX40細胞內信號傳導結構域、4-1BB細胞內信號傳導結構域、CD28細胞內信號傳導結構域、ZAP40細胞內信號傳導結構域、CD30細胞內信號傳導結構域、GITR細胞內信號傳導結構域、HVEM細胞內信號傳導結構域、DAP10細胞內信號傳導結構域、DAP12細胞內信號傳導結構域及MyD88細胞內信號傳導結構域。 293.      段落291或段落292之分離之細胞，其中該CAR包含跨膜結構域，且該跨膜結構域係選自由以下組成之群：CD8跨膜域、CD28跨膜域、CD3ζ鏈跨膜域、CD4跨膜域、4-1BB跨膜域、OX40跨膜域、ICOS跨膜域、CTLA-4跨膜域、PD-1跨膜域、LAG-3跨膜域、2B4跨膜域及BTLA跨膜域。 294.      段落291至293中任一段落之分離之細胞，其中該CAR包含介於該抗原結合域與該跨膜結構域之間的間隔區。 295.      一種病毒，其包含段落181至259中任一段落之外源性多核苷酸序列或段落260至262中任一段落之表現載體。 296.      段落295之病毒，其中該病毒係選自由以下組成之群：慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子及腺病毒。 297.      段落295之病毒，其中該病毒為慢病毒。 298.      一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括以有效減小腫瘤體積之量向具有腫瘤之個體遞送包含經工程改造以產生調節腫瘤介導之免疫抑制機制之多種效應分子之細胞的組合物，其中該等經工程改造之細胞包含： a) 啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 299.      一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括以有效減小腫瘤體積之量向具有腫瘤之個體遞送包含經工程改造以產生IL12及IL21之細胞的組合物，其中該等經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含 a) SFFV啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽; E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 300.      段落299之方法，其中構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。 301.      段落298至300中任一段落之方法，其中該方法進一步包括投與檢查點抑制劑。 302.      段落301之方法，其中該檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-1L抗體或抗CTLA-4抗體。 303.      段落298至302中任一段落之方法，其中該方法進一步包括投與抗CD40抗體。 304.      段落298至303中任一段落之方法，其中腫瘤係選自由以下組成之群：腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(TALL)、B細胞前淋巴球性白血病、膀胱腫瘤、腦腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸腫瘤、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸腫瘤、食道腫瘤、神經膠質瘤、腎臟腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、脊髓發育不良、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、漿細胞骨髓瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、甲狀腺腫瘤及子宮腫瘤。 305.      段落298至303中任一段落之方法，其中該腫瘤為卵巢腫瘤。 306.      段落298至303中任一段落之方法，其中該腫瘤為位於腹膜間隙之腫瘤。 307.      段落298至306中任一段落之方法，其中該投與包含全身投與、腹膜內投與或腫瘤內投與。 308.      段落298至307中任一段落之方法，其中相對於對照物，腫瘤體積減少至少25%，視情況其中該對照物為未經修飾之細胞。 309.      段落307之方法，其中相對於對照物，腫瘤體積減少至少50%，視情況其中該對照物為未經修飾之細胞。 310.      段落309之方法，其中相對於對照物，腫瘤體積減少至少75%，視情況其中該對照物為未經修飾之細胞。 311.      一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括以有效減小腫瘤體積之量向具有腫瘤之個體遞送能夠對細胞進行工程改造以產生調節腫瘤介導之免疫抑制機制之多種效應分子的組合物，其中各經工程改造之細胞包含： a) 啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 312.      一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括以有效減小腫瘤體積之量向具有腫瘤之個體遞送能夠對細胞進行工程改造以產生IL12及IL21之組合物，其中該經工程改造之細胞包含構築體，其中該構築體包含： a) SFFV啟動子；及 b) 外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽； E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。 313.      段落312之方法，其中構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。 314.      段落311至313中任一段落之方法，其中該組合物包含選自由以下組成之群的遞送系統：病毒系統、轉座子系統及核酸酶基因組編輯系統， 315.      段落314之方法，其中該病毒系統係選自由以下組成之群：慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子及腺病毒。 316.      段落314之方法，其中該核酸酶基因組編輯系統係選自由以下組成之群：鋅指系統、TALEN系統及CRISPR系統。 317.      段落311至316中任一段落之方法，其中腫瘤係選自由以下組成之群：腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(TALL)、B細胞前淋巴球性白血病、膀胱腫瘤、腦腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸腫瘤、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸腫瘤、食道腫瘤、神經膠質瘤、腎臟腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、脊髓發育不良、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、漿細胞骨髓瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、甲狀腺腫瘤及子宮腫瘤。 318.      段落311至317中任一段落之方法，其中該投與包含全身投與、腹膜內投與或腫瘤內投與。實例 實例 1
此實例描述利用個別及組合免疫療法有效載荷對MSC進行活體外表徵。首先量測表現免疫療法之MSC對癌細胞之直接抗癌作用。然後量測表現免疫療法之MSC對初級免疫細胞(集中在T細胞上)與癌細胞之共培養物的作用。基於小鼠及人類細胞系統中之炎性生物標記物組，將表現免疫療法之MSC之免疫刺激特性排序。鑑別獨自或與T細胞一起顯著增強癌細胞殺死的表現免疫療法之MSC，且選擇進展至活體外測試之最佳候選者。
方法 ：表現免疫療法之MSC經工程改造以表現表1中列出之效應分子，使用與癌症療法有關之活體外模型評估其功能作用。自循環PBMC分離之人類卵巢癌細胞(例如OVCAR8及SKOV3)及人類免疫細胞用於測試表現hIT之hMSC。小鼠卵巢癌細胞(例如ID8)及小鼠免疫細胞用於測試表現mIT之mMSC。
檢查點抑制劑 .  細胞結合分析用於證實所表現抗體之活性。雖然抗體之標靶CTLA4及PD1均負調控T細胞，但其在T細胞活化之不同階段上調(Boutros C等人 (2016)Nat Rev Clin Oncol 13(8):473-486；Valsecchi ME (2015)New Engl J Med 373(13):1270-1270)。CTLA4在啟動期中暫時上調，而PD1在T細胞活化之效應期中始終表現(Pardoll DM (2012)Nat Rev Cancer 12(4):252-264；Legat A等人 (2013)Front Immunol 4:455)。抗CTLA4抗體結合於T細胞表面上之CTLA4，阻斷CTLA4在早期關閉T細胞活化，且人類抗PD1抗體結合於PD1，阻止腫瘤細胞抑制T細胞活性。
使用EASYSEP™磁性珠粒(STEMCELL Technologies)，藉由陰性選擇，自PBMC分離T細胞。藉由人類T-活化劑CD3/28 Dynabeads (Thermo Fisher)活化分離之T細胞，且歷經5天監測CTLA-4及PD-1之表現，以選擇各表面標記物之最佳表現時機。在適當之日，將來自表現CTLA-4或PD-1之抗體之MSC的條件培養基或來自無表現之MSC之對照條件培養基施加於活化T細胞，以驗證此等抗體之直接細胞表面-受體結合。經螢光染料標記之二次偵測抗體與流動式細胞量測術一起將證實結合。
趨化介素 .  使用細胞遷移分析及表現對CCL21趨化性起反應之趨化介素受體CCR7的分離之未處理T細胞來證實CCL21趨化介素功能性。具體而言，將表現CCL21或對照MSC添加至trans-well之一個隔室，且接著藉由分離之未處理T細胞評定自另一隔室之細胞遷移，接著計數遷移T細胞之數目(Justus CR等人 (2014)J Vis Exp (88))。
細胞介素 .  量測IL2、IL12及IL15之活性。特定針對IL2、IL12及IL15之ELISA分析用於偵測此等細胞介素在MSC上清液中之水準。功能生物活性分析採用CTLL-2細胞株評定IL2或IL15介導之增殖，或採用NKG細胞株評定IL12介導之MSC上清液之IFN-γ產生。使用LUMINEX®技術之多路細胞介素概況分析亦可用於評定細胞介素表現及對免疫細胞之作用。
STING 路徑 .  利用組成性STING突變體有效載荷量測STING路徑活化。使用LUMINEX®珠粒，對MSC中I型干擾素(例如IFN-α2及IFN-β)之分泌與STING突變體之表現進行概況分析。
表現免疫療法之 MSC 對卵巢癌細胞之直接作用 . 在活體外測試MSC對卵巢癌細胞生長及活力之任何直接作用。舉例而言，將候選mMSC或hMSC與小鼠卵巢癌細胞株(ID8)或人類卵巢癌細胞株(OVCAR8及SKOV3)共培養，且藉由良好表徵之乳酸去氫酶(LDH)分析量測癌細胞細胞毒性。在共培養24小時之後，收集上清液，且經由隨後藉由盤式讀數器上之特定吸光度定量的酶促反應來量測與細胞死亡相關之LDH水準。另外，藉由錐蟲藍排染法計數活細胞對比死細胞，且藉由流動式細胞量測術，使用膜聯蛋白-V及碘化丙錠染色計數活細胞對比細胞凋亡/死細胞來評定癌細胞數目。
表現免疫療法之 MSC 對 T 細胞及卵巢癌細胞共培養系統之作用 . 測試確定表現免疫療法之MSC是否可刺激諸如T細胞之免疫細胞，以具有提高之針對活體外卵巢癌細胞之抗癌活性。具體而言，將候選mMSC-mIT與小鼠脾細胞及ID8癌細胞株共培養，或候選hMSC-hIT與人類PBMC及OVCAR8或SKOV3細胞株共培養。共培養分析需要使用PBMC/脾細胞與卵巢癌細胞，有或無MSC，且用抗CD3/28珠粒刺激。為評定癌細胞死亡，使用諸如LDH細胞毒性量測之技術，將染料標記之卵巢癌細胞與未經標記之效應PBMC/脾細胞以固定比率組合且藉由流動式細胞量測術分析殺死，進行16小時殺死分析(Jedema I等人 (2004)Blood 103(7):2677-2682)，且藉由流動式細胞量測術，使用膜聯蛋白- V與碘化丙錠進行細胞凋亡讀取。特別藉由在3-5天之CFSE細胞分裂及1-3天之IFN-γ之細胞介素產生來分析T細胞活化/增殖。
產生表現CTLA-4及PD1之T細胞的替代策略為用植物血球凝集素(phytohaemagglutinin，PHA)活化以表現細胞表面受體PD1及CTLA4。在第3天，約99%之活化T細胞將表現PD1，而約15%其將表現CTLA4 (Pardoll DM (2012)Nat Rev Cancer 12(4):252-264；Legat A等人 (2013)Front Immunol 4:455)。在第10天，活化T細胞將處於效應期，此時CTLA4表現下調但PD1表現維持。評估此等抗體之直接細胞表面-受體結合。在誘導後第3天及第10天，將具有相應檢查點抑制劑抗體表現構築體之MSC施加於T細胞培養物。將經標記之偵測抗體與流動式細胞量測術一起使用來證實結合。商業抗體用作對照。實例 2
此實例描述同基因卵巢癌症模型中表現免疫療法有效載荷之MSC之活體內表徵。使用同基因小鼠卵巢癌模型表徵表現免疫療法之MSC的抗腫瘤功效(具有小鼠免疫系統之mMSC-mIT)。量測同基因卵巢小鼠模型中經工程改造之MSC之腫瘤歸巢及個別及組合免疫療法之表現。亦量測在經工程改造之MSC處理下卵巢腫瘤負荷及小鼠存活。此實例將證明在卵巢腫瘤對比其他身體部位中經工程改造之MSC選擇性歸巢至TME及局部產生免疫療法因子。此實例亦將證明在表現免疫療法之經工程改造之MSC下腫瘤負荷顯著減少，且小鼠存活增加。
方法： 來源於小鼠卵巢上皮表面細胞(mouse ovarian epithelial surface cell，MOSE)之自發轉型的小鼠ID8細胞株用於建立同基因卵巢腫瘤模型(Roby KF等人(2000) Carcinogenesis 21(4):585-591)。亦使用ID8細胞株之衍生物(例如ID8-VEGF (ID8-Defb29/Vegf-a)、ID8-P53DN、ID8-P53KO- PTEN KO、ID8-P53KO- BRCA2 KO、ID8-P53KO-BRCA1 KO、ID8-PD53KO-Nf1KO)。ID8細胞株感染表現海腎螢光素酶(rLuc)之慢病毒以允許進行活體內生物發光成像，其與表現螢火蟲螢光素酶(ffLuc)之MSC呈正交關係。在小鼠中建立同基因卵巢癌症模型之前，在活體外在ID8中證實成功的rLuc表現。對於同基因模型，將5×105 個ID8細胞注射至6至8週齡(36、54)之間的C57BL/6小鼠之腹膜腔中。如實例1中與表現ffLuc之質體一起，對MSC進行工程改造。
在第25天(在注射腫瘤細胞之後)，以每隻動物106 MSC之劑量將候選mMSC-mIT引入同基因小鼠模型中，每週一次，歷時5週(Dembinski JL等人 (2013)Cytotherapy 15(1):20-32)。分別經由rLuc及ffLuc生物發光成像以及終點時刻後的組織學分析，隨著時間過去，目測卵巢腫瘤負荷及候選mMSC-mIT。當小鼠顯現痛苦跡象，諸如體重減輕、毛皮起皺、身體姿勢不佳、腹部擴大及黃疸時，將其處死。量測小鼠之存活曲線。藉由生物發光成像(bioluminescence imaging，BLI)及在處死時藉由屍檢來定量腫瘤細胞之遠處轉移。量測不同時間點之免疫系統概況及活性，作為對療法之反應的生物標記物。
為評定MSC之預期抗腫瘤作用之變化性，變化用於建立模型之ID8細胞之劑量(例如細胞數目至5×106 )，變化所用MSC之劑量，以及調節建立腫瘤後遞送MSC時之時間。
即使在小鼠模型中mMSC已顯示歸巢至卵巢腫瘤，一些有效載荷亦可能破壞此歸巢活性。在此等情況下，此等有效載荷之表現可經工程改造為誘導性的。此可例如用根皮素誘導系統來實現(Gitzinger M等人 (2009)Proc Natl Acad Sci U S A 106(26):10638-10643)。可替代地，二聚系統可用於使用小分子將合成鋅指DNA結合域與反式活化結構域連接(Clackson T等人 (1998)Proc Natl Acad Sci U S A 95(18):10437-10442)。可替代地或另外，可構築誘導性有效載荷表現構築體，其係在腫瘤微環境中基於諸如低O2 之信號引起的。
慢病毒ffLuc構築體亦可用於感染MSC。實例 3
此實例描述表現免疫療法有效載荷之MSC在具有人類免疫細胞之小鼠中的人類卵巢癌症之異種移植模型中的功效之活體內表徵。測試經工程改造之MSC在經由CD34+細胞移植物(具有人類化免疫系統之hMSC-hIT)移植人類免疫細胞之免疫缺陷小鼠中之人類卵巢癌模型中的活性。量測具有人類免疫細胞之小鼠中的人類異種移植卵巢腫瘤中經工程改造之MSC之腫瘤歸巢及個別及組合免疫療法之表現。亦測試在經工程改造之MSC處理下卵巢腫瘤負荷及小鼠存活。此實例將證明在小鼠中人類異種移植卵巢腫瘤對比其他身體部位中經工程改造之MSC的歸巢增加及局部產生免疫療法因子。此實例亦將證明在表現免疫療法之經工程改造之MSC下腫瘤負荷顯著減少，且小鼠存活增加，此與免疫系統組成之變化相關。
方法 . 為能夠將經工程改造之MSC轉化至人類臨床試驗，在人類癌症之人類化小鼠模型中測試hMSC-hIT構築體。藉由在移植CD34+ 造血幹細胞(HSC)之免疫缺陷小鼠(NSG)中使用人類卵巢癌細胞株之異種移植物來模擬表現免疫療法之hMSC在小鼠中之作用。
對於人類卵巢癌細胞，使用OVCAR8及SKOV3細胞株。如實例3中所述之類似分析用於研究隨著時間過去之腫瘤負荷及小鼠存活。
亦可使用兩種替代方法。(1)人類T細胞可輸注至小鼠中。(2)人類PBMC可輸注至小鼠中。
表現載體：pL+MCS ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATCAAAATTTTATCTCGACATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCGATAAGCTTGATATCGCCTGCAGCCGAATTCCTTGACTTGGGATCCGCGTCAAGTGGAGCAAGGCAGGTGGACAGTCCTGCAGGCATGCGTGACTGACTGAGGCCGCGACTCTAGTTTAAACTGCGTGACTGACTCTAGAAGATCCGGCAGTGCGGCCGCGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGACTTTTGCAGAGACGGCCCAAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG (SEQ ID NO: 111)實例 4. 4T1 三陰性乳癌
在以下實驗中，MSC經工程改造以表現以下效應分子中之一者，接著單獨或組合投與原位乳癌小鼠模型：IFNβ、IFNγ、IL12、IL15、IL36γ、IL7、TRAIL、cGAS、CCL21a、OX40L、CD40L或HACv-PD1。在一些實例中，注射檢查點抑制劑(抗CD40、抗PD1或抗CTLA-4抗體)與經工程改造之MSC之投與組合。MSC 歸巢
以下實驗證明在原位小鼠乳癌模型中鼠類MSC歸巢至腫瘤。將表現螢光素酶之4T1乳房腫瘤細胞(5×105 )原位植入雌性BALB/cJ小鼠之背部脂肪墊。在5天之後，將小鼠腹膜內注射1百萬螢光標記(經XenoLight DiR (Caliper Life Sciences))之鼠類BM來源MSC (BM-MSC，治療細胞)。在MSC注射後第1天及第7天，螢光分析用於使用Ami HT活動物成像器(Spectral Instruments)確定MSC定位。在第7天，使用Ami HT成像器，經由4T1細胞之螢光素酶生物發光報導體確定腫瘤定位及尺寸。如圖 3 中所示，注射之MSC共同定位至腫瘤部位，此表明此等細胞實際上在活體內特異性歸巢至4T1乳房腫瘤部位。在一天內注射之MSC歸巢至腫瘤，且持續7天。相比之下，在正常小鼠中缺少腫瘤時注射之MSC不歸巢至背。此等結果表明，MSC可用作抗癌分子、蛋白質或化合物之遞送媒劑。
為確定經工程改造之人類MSC是否可歸巢至小鼠腫瘤，將表現GFP、IL2或CCL21a的經工程改造之人類MSC之不同株系注射至具有4T1腫瘤之BALB/c小鼠中。藉由用測徑規每隔一天量測腫瘤體積來確定功效。圖11A-11B展示人類MSC未歸巢至小鼠4T1腫瘤。活體內功效
以下實驗證明表現免疫療法效應子(有效載荷)之MSC在原位乳癌模型中之活體內功效。將4T1-Neo-Fluc小鼠乳房腫瘤細胞(Imanis Life Sciences，5×105 個細胞)原位植入雌性BALB/cJ小鼠(The Jackson Laboratory)之背部脂肪墊中。接著在植入腫瘤之後5天將小鼠隨機化至處理組。小鼠接受對照MSC生長培養基或表現不同免疫療法效應子(有效載荷)之經工程改造之MSC (2×106 個細胞)的腹膜內注射，每週一次，歷時兩週。各免疫療法藉由不同MSC表現，且MSC (1:1比率)組合以用於組合治療。藉由每隔一天用測徑規量測來監測腫瘤生長，且每週記錄小鼠重量兩次。在第一次MSC處理之後14天處死小鼠，且收集組織以供進一步分析。
圖 4 展示與用培養基處理之對照相比，在用表現組合基因IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC處理的小鼠中腫瘤生長延遲。
圖 5A-5C 展示與經培養基處理之小鼠相比，表現單個免疫療法效應子(例如IFN-β、IFN-γ、IL-12或CCL21a)之經工程改造之MSC抑制同基因4T1小鼠腫瘤之生長。意外地，當免疫療法效應子組合時，尤其IL-12與CCL21a組合以及IFN-β、IFN-γ、IL-12及CCL21a組合，觀察到對腫瘤生長之協同效應(圖 5A-5C )。
圖 6A-6B 展示表現OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或其組合之經工程改造之MSC不抑制腫瘤生長。
圖 7A-7B 展示表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC抑制腫瘤生長；然而，添加抗CD40抗體不減少腫瘤生長。
圖 8A-8B 展示在皮下乳癌模型中表現OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或其組合之經工程改造之MSC不顯著抑制腫瘤生長。
圖 9A-9B 展示表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC抑制腫瘤生長；然而，表現CCL21a、IL-36γ及IL-7之MSC之組合不減少腫瘤生長。然而，一些測試之效應子組合可能引起毒性。劑量擴大
進行劑量擴大研究。此實驗確定表現GFP之經工程改造之MSC細胞不引起毒性(圖 10A-10B )。對大腫瘤之作用
此實驗測試表現IL12及CCL21a之經工程改造之小鼠MSC是否可減少較少腫瘤(＞800 mm3 )之腫瘤負荷。較大腫瘤比小腫瘤更難以治療，且此實驗證明此效應子組合可減少腫瘤擴增(圖 12A-12B )。檢查點抑制劑
圖 13A 展示表現IL-12及CCL21之經工程改造之MSC足夠抑制腫瘤生長，不過在皮下腫瘤模型中藉由注射添加檢查點抑制劑(抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體)不增加功效。實例 5. CT26 結腸直腸癌
在以下實驗中，MSC經工程改造以表現以下效應分子中之一者，接著單獨或組合投與結腸直腸癌小鼠模型：IFNβ、IL12、IL15、IL36γ、IL7、CCL21a、HACv-PD1或41BB。在一些實例中，注射檢查點抑制劑(抗CD40或抗CTLA-4抗體)與經工程改造之MSC之投與組合。
圖 14 展示表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC誘導顯著的腫瘤生長延遲。
圖 15 展示CT26小鼠模型中腫瘤生長動力學以確定給與經工程改造之MSC細胞之最佳時間。活體內功效
以下實驗證明表現免疫療法效應子(有效載荷)之MSC在皮下小鼠結腸(結腸直腸)癌模型中之活體內功效。將CT26-Neo-Fluc小鼠結腸癌細胞(Imanis Life Sciences，5×105 個)皮下注射至雌性BALB/cJ小鼠(The Jackson Laboratory)之側腹中。在植入腫瘤之後七天，接著將小鼠隨機化至以下處理組：對照MSC生長培養基、經工程改造之MSC (MSC-12+CCL21a)、抗CD40抗體、抗CTLA4抗體(Bio X cell)、MSC-12+CCL21a與抗CD40抗體組合或MSC-12+CCL21a與抗CTLA4抗體組合。經工程改造之MSC (2×106 個細胞)經腹膜內(ip)注射，每週一次，歷時兩週(第0天及第7天)。在第0天及第3天經腹膜內注射抗CD40抗體(100 μg)。在第0天、第3天及第7天經腹膜內注射抗CTLA4抗體(100 μg)。藉由每隔一天用測徑規量測來監測腫瘤生長，且每週記錄小鼠重量兩次。在第一次MSC處理之後11天處死小鼠，且收集腫瘤且稱重。量測各處理組中個別小鼠之腫瘤重量，且在圖 16B 之左下圖(左圖)中展示結果。隨著時間過去監測各處理組之平均腫瘤體積(圖 16B ，右圖)。與經GFP處理之小鼠相比，處理組2 (IL-12+CCL21a+抗CTLA4抗體)、4 (IL-12+CCL21a)及7 (IL-12+CCL21a+抗CD40抗體)抑制CT26結腸腫瘤的平均生長(圖 16B ，右圖)。當隨著時間過去量測各處理組中個別小鼠之腫瘤體積時，觀察類似結果(圖 16A )。因此，用表現免疫療法之MSC組合治療抑制活體內結腸癌細胞之生長。
圖 18A 展示表現IL-12、CCL21a及IL15或HACvPD-1之經工程改造之MSC顯著抑制小鼠結腸直腸癌模型中之腫瘤生長。圖 18B 展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。圖 18C 為腫瘤微環境內浸潤免疫群體之代表圖。圖 18D 展示總CD3群體中T調控細胞(Treg)之百分比。用經工程改造之MSC-IL2及CCL21a處理的腫瘤微環境中Treg之數目顯著下降。圖 18E 使免疫浸潤百分比與腫瘤重量相關。發現淋巴細胞增加(CD3+)之樣品與低腫瘤重量相關，而具有增加骨髓(CD11b+)浸潤之樣品與較腫瘤負荷相關。長期存活
向小鼠給與不同濃度之經工程改造之MSC-IL12及CCL21a療法與注射抗CD40抗體組合兩次。在第二給藥之後，每週監測腫瘤體積兩次，直至腫瘤負荷超過1500 mm3 且處死小鼠。圖 17A 展示個別組之腫瘤體積。圖 17B 左圖隨時間追蹤來自個別組之小鼠重量及腫瘤體積。圖 17B 右圖展示不同組之存活曲線。MSC 功效
圖 20A 展示各處理中個別小鼠之腫瘤體積。圖 20B 展示各處理組中個別小鼠之腫瘤重量。藉由用測徑規每隔一天量測腫瘤體積來確定功效。腫瘤生長動力學
圖 21A-21B 展示腹膜內間隙中CT26-LUC (螢光素酶)腫瘤生長之動力學。在第0天注射CT26細胞株，且在第7天、第10天、第14天及第18天收穫三(3)隻小鼠以確定腫瘤生長動力學。利用IVIS成像器監測腫瘤負荷，圖 21A 第一行量測小鼠體重及ROI。第二行監測各組中個別小鼠之腫瘤的腫瘤重量及ROI。第三行將腫瘤重量與整體ROI或腫瘤ROI相關。圖 21B 展示第18天組中三(3)隻小鼠之免疫概況以更好地瞭解腫瘤微環境。腫瘤浸潤統計資料 / 免疫百分比 / 腫瘤重量 皮下小鼠模型
圖 22A 包括表明表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC抑制皮下結腸直腸癌小鼠模型中之腫瘤生長的資料；然而，表現CCL21a及IL-36γ或IL-7之MSC的組合不減少腫瘤生長。圖 23A-23B 包括腫瘤免疫浸潤統計資料。三隻小鼠選自PBS、未處理MSC及MSC-IL12+MSC-CCL21a (組合)組，以針對免疫概況腫瘤微環境進行流動式細胞量測術。圖 23A 展示與給與未處理MSC之組相比，組合組中浸潤CD3及CD8細胞毒性T群體顯著增加。圖 23B 展示與用未處理MSC處理之組相比，組合組中粒細胞骨髓來源抑制性細胞(gMDSC)及巨噬細胞群體顯著減少。
圖 24A-24B 包括關於免疫百分比及腫瘤重量之資料，展示具有更多CD3+及CD8+T細胞之樣品(左上及中央圖)與腫瘤重量下降強烈相關。此等圖亦展示具有較少CD11b骨髓細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞及MDSC之樣品顯示較低腫瘤負荷(圖 24A 之下中及右圖及圖 24B 之上排)。原位小鼠模型
圖 26A 展示表現IL-12及CCL21a或CCL21a及IFN-β之經工程改造之MSC抑制原位小鼠結腸直腸癌模型中之腫瘤生長；然而，表現CCL21a及s41BBL之MSC的組合不減少腫瘤生長。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合治療。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中4T1乳房腫瘤之生長的作用。圖 26A 之各線表示個別小鼠。圖 26B 展示各處理組中個別小鼠之腫瘤重量。MSC-IL12 + MSC-CCL21a展示與注射未處理MSC之小鼠相比功效更佳。亦在用MSC-IFNb + MSC-CCL21a處理之組中觀察到處理功效。
圖 27A-27B 為展示用所指示之經工程改造之MSC處理的各組之免疫概況的圖。在用MSC-IL12 + MSC-CCL21a處理之後觀察到巨噬細胞群體一致下降(圖 27A )。相對於未處理MSC，與用MSC-IL12 + MSC-CCL21a處理之組相比，亦觀察到CD3+群體之浸潤增加及CD11b+群體之浸潤減少的總趨勢(圖 27A 及圖 27B )。
圖 28A-28B 展示免疫浸潤與腫瘤重量相關。具有低巨噬細胞及樹突狀細胞之樣品具有較低腫瘤負荷(圖 28B ，中上和右上)。圖 28C 展示來自各組之平均腫瘤重量。與未處理MSC相比，在MSC-IL12 + MSC-CCL21a或MSC-IFNb + MSC-CCL21a下均觀察到統計顯著性。
圖 29 展示將以上來自結腸直腸癌模型之活體內資料(圖 22A 及圖 26A )組合的圖。來自圖 22A 及圖 26A 之組合CT26資料記錄三組：僅僅腫瘤(PBS)、用未處理MSC處理及用MSC-IL12 + MSC-CCL21a處理。
圖 30A-30C 亦展示來自圖 22A 及圖 26A 之組合資料。圖展示來自流動式細胞量測術實驗資料之免疫浸潤平均數。自圖 30A ，觀察到CD8+T之統計顯著性，此證實MSC-IL12 + MSC-CCL21a能夠使腫瘤微環境恢復極化，且允許更多細胞毒性T細胞浸潤。此外，在用MSC-IL12 + MSC-CCL21a處理之組中CD11b+骨髓群體浸潤減少(圖 30B )。使用樹突狀細胞及巨噬細胞群體收集之資料具有統計顯著性。腹膜內及皮下小鼠結腸直腸癌模型中之 IL12 及 CCL21a 療法
圖 25A-25B 包括來自腹膜內及皮下結腸直腸癌小鼠模型中之MSC-IL-12+CCL21a療法的資料。測試三批不同慢病毒轉導之細胞株的MSC-IL12及CCL21a (TLOO8-3/4、TL019-01/02及TL022-01/02；各TL編號表示一批)。圖 25A 展示在皮下與腹膜內模型中MSC-IL12 + MSC-CCL21a所有三批均可降低腫瘤負荷(前5圖來自SC模型且後3圖來自IP模型)。在第11天收集來自所有小鼠之腫瘤。圖 25B 展示來自各組之平均腫瘤重量。實例 6. MSC 組合細胞介素療法方法
以下方法用於實驗中，如所指示。方法： MSC 培養
骨髓C57BL/6及Balb/C鼠類MSC (mMSC)係購自Cyagen (分別目錄號MUBMX-01001及MUCMX-01001)。mMSC培養基由以下構成：MEM Corning目錄號10-022-CV (500 ml) + MSC FBS Gibco目錄號12662-029 (最終濃度10%) + L-Glut (200 mM)幹細胞07100 (最終濃度2 mM) + PenStrep 100X VWR目錄號97063-708 (最終濃度1X) + 鼠類FGF Peprotech目錄號450-33-100uG (最終濃度-1:10,000稀釋)。購得TrypLE Express (ThermoFisher - #12604021)。PBS不含鎂、鈣或酚紅。
mMSC根據以下方案進行繼代： 1. mMSC應在70%-90%匯合下繼代。 2. 自器皿/燒瓶吸出培養基。 3. 用PBS沖洗盤(例如10 cm器皿用2 mL，15 cm器皿用3 ml)。 4. 添加TrypLE Express(例如10 cm器皿用2 mL，15 cm器皿用3 ml)。 5. 在37℃下培育3-4分鐘。 6. 在側面敲打盤以移去細胞。藉由顯微術證實大部分細胞已移去。 7. 使用培養基將細胞自盤洗去(例如10 cm器皿用8 mL)。 8. 將細胞置於15個圓錐管中且400×g離心5分鐘。 9. 吸出培養基。 10. 使細胞再懸浮於適當培養基中且將細胞塗鋪至新鮮盤/燒瓶中。注意：70%匯合細胞可1:3分離。90%匯合細胞可1:4分離。可替代地，細胞可以3000-5000個細胞/平方公分塗鋪。
購得骨髓來源人類MSC (RoosterBank-hBM-1M-XF, RoosterBio)。購得各種hMSC培養基：無異種蛋白的hMSC培養基- (RoosterBio - #KT-016)；+FBS (含血清) hMSC培養基(Lonza - MSCGM培養基- #PT-3001)。購得TrypLE Express (ThermoFisher - #12604021)。PBS不含鎂、鈣或酚紅。
hMSC根據以下例示性方案進行繼代： 1. hMSC應在70%-90%匯合下繼代。 2. 自器皿/燒瓶吸出培養基。 3. 用PBS沖洗盤(例如10 cm器皿用2 mL)。 4. 添加TrypLE Express(例如10 cm器皿用2 mL)。 5. 在37℃下培育3-4分鐘或在室溫下培育5分鐘。 6. 在側面敲打盤以移去細胞。藉由顯微術證實大部分細胞已移去。 7. 使用Lonza MSCGM培養基將細胞自盤洗去(例如10 cm器皿用8 mL)。 8. 將細胞置於15個錐形管中且400×g離心5分鐘。 9. 吸出培養基。 10. 使細胞再懸浮於Rooster無異種蛋白的培養基中且將細胞塗鋪至新鮮盤/燒瓶中。 注意：70%匯合細胞可1:3分離。90%匯合細胞可1:4分離。可替代地，細胞可以3000-5000個細胞/平方公分塗鋪。
hMSC根據以下例示性方案進行解凍： 1. 使hMSC培養基預溫至37℃。 2. 自液氮移除hMSC等分試樣。 3. 藉由保持管1/2浸入在37℃浴之中60-90秒解凍，直至2/3冷凍樣品解凍。 4. 用70%酒精擦拭管以將管殺菌。 5. 將0.5 mL培養基添加至冷凍管，輕輕地移液2-3次，接著將細胞轉移至15 mL錐形管中之9 mL培養基(總共10 mL)。 6. 400×g離心5分鐘。 7. 吸出培養基，接著輕輕地使糰粒再懸浮於適當體積的Rooster無異種蛋白的培養基中。以3000-5000細胞/平方厘米之濃度塗鋪細胞。 慢病毒產生
使用以下產生慢病毒：Lenti-X 293T包裝細胞株(Clontech，目錄號632180)；LX293T完全生長培養基，沒有抗生素；DMEM，高葡萄糖；1 mM丙酮酸鈉；10% FBS，熱失活；Opti-Mem I還原血清培養基(Gibco/Thermo Fisher；目錄號31985)；FuGene HD (Promega；目錄號E2311)；包膜質體、包裝質體及轉移載體質體；VSV-G假型包膜載體(pMD2.G)；含有Gag、Pol、Rev及Tat的包裝載體，其可與第二代及第三代轉移載體(psMAX2)一起使用。在轉染前一天下午稍晚時間將293T(FT)細胞自90%匯合10 cm器皿提高且以1:3稀釋分配，且在37℃、5% CO2下如常培育細胞隔夜(在轉染次日細胞應60%-85%匯合)。
根據以下方案，為各10 cm器皿準備轉染反應： 1. 在另一1.7 mL管中為各10 cm器皿準備轉染反應。 2. 在室溫下添加900 uL Opti-Mem I。 3. 每一反應添加9 ug載體主鏈(含有所關注之基因)。 4. 每一反應添加8 ug包裝載體。 5. 每一反應添加1 ug包膜載體(pMD2.G)。 6. 藉由迅速旋轉3秒澈底混合。 7. 每一反應添加55 uL Fugene HD。 8. 藉由迅速地上下移液20-30次來混合。 9. 在室溫下靜置10分鐘(允許DNA複合物形成)。 10. 以逐滴方式將混合物慢慢添加在器皿周圍，接著藉由輕輕地前後及上下晃動5-10秒(不旋動)來混合。 11. 將器皿置放於病毒培育箱中。
在第2天及第3天，使用血清移液管收穫病毒上清液。使用Millipore steriflip 0.45 um過濾器移除細胞碎片。根據如下方案使用Lenti-X濃縮液(目錄號631231及631232)：1)將1體積Lenti-X濃縮液與3體積澄清上清液組合。藉由輕輕倒轉來混合；2)在冰上或在4℃下培育混合物30分鐘至隔夜；(3)在4℃下以1,500×g離心樣品45分鐘；(4)小心移除上清液且棄去，注意不擾動糰粒；(5)使用無菌PBS + 0.1% BSA輕輕地使原始體積之1/10至1/100的糰粒再懸浮。 載體
將細胞介素表現盒選殖至pL17D中，其載體圖展示於圖 31 中，其中註釋顯著特徵；例如SFFV啟動子；FLAG及MYC抗原決定基標籤；LTR等。 慢病毒轉導
當細胞50%匯合時將鼠類MSC接種於6孔盤中且感染。病毒以適當MOI添加且培育3小時以轉導細胞。在感染後，將新鮮培養基添加至細胞中。
遵循以下例示性方案轉導人類MSC： 1. 將200,000個人類MSC於2 mL無異種蛋白之人類MSC培養基中塗鋪於6孔盤之各孔中。 2. 在2小時之後，移除培養基且替換為1 mL PBS。 3. 將適當量之病毒添加至各孔中，如藉由以下MOI指示，且在偶爾晃動下將細胞與病毒一起在37℃及5% CO2下培育3小時。 4. 在3小時之後移除病毒，用培養基洗滌盤，接著照常培養MSC (如上所述)，直至細胞到達衰老。計數各繼代之細胞，以便可確定總細胞數目。實例 7 ： MSC 組合細胞介素療法 (CT26)
在以下實例中，對balb/c mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現各種細胞介素。
將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性balb/c (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化成處理組，且用經腹膜內遞送之呈單一劑或呈mMSC組合的表現效應分子之mMSC (1×106 )處理以遞送藥劑組合。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。在第12天及第17天評定腫瘤負荷。針對各個別小鼠，相對於起始信號(處理前)，標準化生物發光信號(光子/秒)。BLI信號減少超過100倍(0.01)相當於完全治癒(在屍檢時無明顯腫瘤)。如圖 32 所示，如藉由BLI水準所評定，單獨或組合的經工程改造以表現不同效應分子之MSC證明在IP腫瘤模型中降低CT26腫瘤負荷之功效。實例 8 ： MSC 組合細胞介素療法 (B16F10)
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現各種細胞介素。
將經修飾以組成性表現螢光素酶(B16F10-Fluc-Puro目錄號：CL052，批號：CL-IM150 Imanis Life Sciences)之B16F10腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化成處理組，且用經腹膜內遞送之呈單一劑或呈mMSC組合的表現效應分子之mMSC (1×106 )處理以遞送藥劑組合。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。在第12天及第17天評定腫瘤負荷。針對各個別小鼠，相對於起始信號(處理前)，標準化生物發光信號(光子/秒)。BLI信號減少超過100倍(0.01)相當於完全治癒(在屍檢時無明顯腫瘤)。如圖33 所示，如藉由BLI水準所評定，單獨或組合的經工程改造以表現不同效應分子之MSC證明在IP腫瘤模型中降低B16F10腫瘤負荷之功效。實例 9 ：經工程改造之人類 MSC 細胞介素產生
在以下實例中，對骨髓來源hMSC (源自於3名人類志願健康供體)進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法自單一慢病毒表現載體表現人類IL12 (p70)及人類CCL21a。慢病毒表現載體(其示意載體圖展示於圖 34 中)使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。
如圖 35 所示，如藉由細胞介素ELISA所評定，經工程改造之hMSC能夠產生hIL12 (圖 35A )及hCCL21a (圖 35B )。值得注意地，蛋白質分泌與MSC轉導期間使用之病毒粒子之量(MOI)有關。實例 10 ：經工程改造之人類 MSC 的功能評定
在以下實例中，對骨髓來源hMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現人類IL12 (p70)。經工程改造之hMSC與自健康獻血者分離之人類T細胞共培養至0.4 μm transwell插入物(transwell分析之示意圖展示於圖 36A 中)。為評定活化之未處理T細胞上IL12誘導之Th1極化，藉由ELISA，在自下部隔室(T細胞)收集之上清液上量測T細胞之IFNγ產生。如圖 36B 所示，藉由CD3 T細胞與表現IL12p70之hMSC共培養，IFNγ產生以MOI劑量依賴方式增加。實例 11 ： IP 模型中 MSC 歸巢至腫瘤
在以下實例中，將表現fLUC之balb/c MSC (2×106 個細胞) IP注射至CT-26 IP腫瘤負載小鼠中。將小鼠處死且在注射後24小時收集組織。如圖 37 所示，如藉由生物發光成像(圖 37A 中所示之影像、圖 37B 中影像之定量)、定量即時PCR (圖 37C )及針對螢火蟲螢光素酶之螢光顯微術(圖 37D )所偵測，fLUC-MSC顯著富集在腫瘤。
另外，在植入腫瘤7天後，經腹膜內向C57Bl/6小鼠植入5×104 B16F10-fLUC細胞，經腹膜內注射經工程改造以表現Nanoluc-EGFP之1×106 C57Bl/6鼠類BM-MSC。在注射MSC之後24小時將小鼠處死，且針對nanoluc信號傳導，離體對腹膜器官(胃、腎、肝臟、結腸、脾、胰臟、網膜/腫瘤、卵巢及輸卵管)成像(NanoGlo受質套組，廠商：Promega，目錄號：N1110)。如圖 37E 所示，在B16F10腫瘤模型中，與腹膜腔中之其他器官相比，鼠類MSC nanoluc信號優先富集在腫瘤中。實例 12 ：在 IP 模型中產生 IL12 之 MSC 減少 CT26 腫瘤負荷
在以下實例中，對balb/c mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12p70。
將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性balb/c (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的表現IL12p70之mMSC (1×106 個細胞)處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。如圖 38 所示，在CT26模型中如藉由BLI所評定，表現IL12p70之MSC引起腫瘤負荷減少(上圖及左下圖)，以及藉由腫瘤重量，可偵測之腹膜內腫瘤完全消除(右下圖)。實例 13 ：在 IP 模型中產生 IL12 之 MSC 減少 B16F10 腫瘤負荷
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12p70。
將經修飾以組成性表現螢光素酶(B16F10-Fluc-Puro目錄號：CL052，批號：CL-IM150 Imanis Life Sciences)之B16F10腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的表現IL12p70之mMSC 1×106 個處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。如圖 39 所示，在B16F10模型中如藉由BLI所評定，表現IL12p70之MSC引起腫瘤負荷減少(上圖及左下圖)，以及藉由腫瘤重量，可偵測之腹膜內腫瘤完全消除(右下圖)。實例 14 ：在 CT26 IP 腫瘤模型中產生 IL12 及 CCL21a 之 MSC 減少腫瘤負荷且延長存活
在以下實例中，對balb/c mMSC進行工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類CCL21a。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。
將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(1×106 個細胞)注射至免疫活性balb/c小鼠(6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的由相同MSC表現IL12p70及CCL21a之mMSC 1×106 (「MSC-IL-12p70_2A_CCL21a」)處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。如圖 40 所示，在CT26模型中，如藉由BLI所評定，表現IL12p70/CCL21a之MSC引起腫瘤負荷減少(上圖及左下圖)，以及藉由腫瘤重量，可偵測之腹膜內腫瘤完全消除(右下圖)。圖 40A 展示如藉由BLI所評定，經PBS處理(圓形)、MSC-Flag-Myc (「未處理MSC」正方形)及表現IL12p70/CCL21a之MSC (三角形)的平均腫瘤負荷。圖 40B 展示如藉由BLI所評定，個別小鼠中經PBS處理(圓形)、MSC-Flag-Myc (「未處理MSC」)及表現IL12p70/CCL21a之MSC (分別為左圖、中圖及右圖)的平均腫瘤負荷。值得注意地，如圖 40C 所示，用表現IL12p70/CCL21a之MSC處理延長存活(100%存活超過90天)，而經對照物處理之小鼠至第20天均死亡或處死。實例 15 ：在 B16F10 IP 腫瘤模型中產生 IL12 及 IL21 之 MSC 減少腫瘤負荷且延長存活
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12 (p70)或鼠類IL21 (亦即各MSC經工程改造以僅表現單一藥劑)。
將經修飾以組成性表現螢光素酶(B16F10-Fluc-Puro目錄號：CL052，批號：CL-IM150 Imanis Life Sciences)之B16F10腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的表現IL12p70之mMSC (1×106 個細胞)與表現IL21之mMSC (1×106 個細胞)的組合或單獨的表現IL12p70之mMSC (1×106 個細胞)處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。如圖 41 所示，相對於經對照物處理之小鼠，用表現IL12p70之MSC處理延長存活，但所有小鼠至第50天均死亡或處死。相比之下，相對於用表現IL12p70之MSC處理，用表現IL12p70之MSC與表現IL21之MSC的組合處理延長存活(60%存活超出60天)。因此，MSC表現IL21可增強表現IL12p70之MSC的功效。實例 16 ：在 CT26 IP 腫瘤模型中產生 IL12 及 CCL21a 之同種異體 MSC 減少腫瘤負荷且延長存活
在以下實例中，對balb/c mMSC (同基因)及C57BL/6 mMSC (同種異體)進行工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類CCL21a。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。
將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(1×106 個細胞)注射至免疫活性balb/c小鼠(6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的由相同MSC表現IL12p70及CCL21a之mMSC (1×106 個細胞) (「MSC-IL12+CCL21」)處理。balb/c對照mMSC (同基因)及C57BL/6對照mMSC (同種異體)經工程改造以表現MSC-Flag-Myc (「未處理」)。PBS亦用作陰性對照物。如圖 1 所示，在CT26模型中，如藉由BLI所評定，表現IL12p70/CCL21a之同基因及同種異體MSC減少腫瘤負荷，而對照處理則未減少。另外，在同基因及同種異體模型中先前用表現IL12p70及CCL21a之mMSC處理且確定90天無腫瘤的小鼠隨後用皮下植入大腿中之CT26腫瘤細胞(100 μl PBS中0.5×106 個細胞)激發，如圖 2A 中所圖示。如圖 2B 所示，與其中建立腫瘤之未處理對照小鼠對比，無腫瘤小鼠排斥腫瘤植入物。因此，用表現IL12p70/CCL21a之MSC處理延長腫瘤負荷減少以及免疫記憶。實例 17 ：產生 IL12 及 CCL21a 之 MSC 顯示相對於未經修飾之細胞增強之生長
在以下實例中，來自3種不同供體之人類MSC以不同感染複數(MOI)進行工程改造以自單一慢病毒表現載體表現及分泌人類IL-12及人類CCL21a。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。
如圖 42 所示，在所測試之三種供體中，與未經基因工程改造之人類MSC (MOI = 0)相比，經基因工程改造之MSC (MOI = 95000、9500或950)展現增強之細胞擴增及生長(圖 42A ，供體1；圖 42B ，供體2；圖 42C ，供體3)。經慢病毒進行基因工程改造以表現GFP之人類MSC未顯示類似增強之細胞擴增或生長表型(資料未示)。實例 18 ：用於人類骨髓 MSC (BM-MSC) 中持續蛋白質表現之啟動子的選擇
在以下實例中，針對驅動人類MSC中報導EGFP構築體之表現，測試各種啟動子。所測試之啟動子為CMV、SFFV、EF1a、EF1a-LTR、EFS、MND、PGK、UbC (參見表4)。使用實例中所述之慢病毒轉導方法，使用同等MOI (感染複數)將細胞轉導。使用流動式細胞量測術，定量連續繼代之EGFP百分比及中值螢光強度(MFI)。
如圖 43 所示，來自2種不同供體之兩種獨立人類BM-MSC細胞株(分別為頂行及底行)進行工程改造且在轉導後第25天評定經工程改造之細胞的GFP百分比(左圖)及MFI (右圖)。藉由GFP百分比與MFI，SFFV啟動子在兩種細胞株中顯示GFP表現。
如圖 44 所示，針對兩種獨立人類BM-MSC細胞株個別(左圖)或來自兩種獨立人類BM-MSC細胞株組合之資料(右圖)，隨時間追蹤EGFP MFI (轉導後第7天至第28天)。在超過28天期間蛋白質表現隨時間穩定。另外，如藉由MFI所定量，與EF1a啟動子相比，SFFV啟動子一致地驅動多幾乎十倍之蛋白質表現。實例 19 ：對人類 MSC 進行工程改造以產生 IL12 及 IL21
在以下實例中，對人類骨髓MSC進行穩定轉導以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法自各種構築體表現IL12p70及IL21。在轉導後細胞擴增3至4個繼代，且將0.2×106 個細胞於4 mL培養基中接種於6孔盤中。在24小時之後收集條件培養基且進行ELISA以確定所產生之IL-12及IL-21濃度。
測試具有啟動子-信號序列1-細胞介素1-2A連接子-信號序列2-細胞介素2之不同組合及/或排列的各種構築體。測試之組合描述於下表 7 中。構築體SB00880之細節呈現於下表 8 中。表 7-IL-12 及 IL-21 表現構築體
構築體名稱(SB#) 啟動子 插入物 骨架 密碼子優化
SB00743 SFFV_1 IL12ss-IL12 pL23d 無
SB00763 EFa1 (pEF6) IL12ss-IL12-fT2A*-IL21ss-IL21 pL40g 無
SB00765 EFa1 (pEF6) IL12ss-IL12-fT2A-IL12ss-IL21 pL40g 無
SB00766 EFa1 (pEF6) IL12ss-IL12-fT2A-IL8ss-IL21 pL40g 無
SB00767 EF1a (pEF6) IL12ss-IL12-fT2A-IL21 pL40g 無
SB00768 EFa1 (pEF6) IL21ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL40g 無
SB00769 EFa1 (pEF6) IL12ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL40g 無
SB00770 EFa1 (pEF6) IL6ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL40g 無
SB00771 EF1a (pEF6) IL8ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL40g 無
SB00772 EF1a (pEF6) IL21ss-IL21-fT2A-IL12 pL40g 無
SB00773 EF1a (pEF6) IL12ss-IL21-fT2A-IL12 pL40g 無
SB00774 EF1a (pEF6) IL6ss-IL21-fT2A-IL12 pL40g 無
SB00775 EF1a (pEF6) IL8ss-IL21-fT2A-IL12 pL40g 無
SB00772 EF1a (pEF6) IL21ss-IL21-fT2A-IL12 pL40g 無
SB00620 SFFV_1 IL2ss-IL21 pL17d 無
SB00838 SFFV_1 IL12ss-IL12-fT2A-IL21ss-IL21 pL41g 無
SB00839 SFFV_1 IL12ss-IL12-fT2A-IL8ss-IL21 pL41g 無
SB00840 SFFV_1 IL12ss-IL12-fT2A-IL21 pL41g 無
SB00841 SFFV_1 IL21ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL41g 無
SB00843 SFFV_1 IL21ss-IL21-fT2A-IL12 pL41g 無
SB00844 SFFV_1 IL8ss-IL21-fT2A-IL12 pL41g 無
SB00868 SFFV_1 IL12ss-IL12 pL41g 有
SB00870 EF1a (pEF6) IL12ss-IL12-fT2A-IL21ss-IL21 pL40g 有
SB00872 EF1a (pEF6) IL12ss-IL12-fT2A-IL21 pL40g 有
SB00869 EF1a (pEF6) IL21ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL40g 有
SB00871 EF1a (pEF6) IL21ss-IL21-fT2A-IL12 pL40g 有
SB00879 SFFV_1 IL21ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL41g 有
SB00880 SFFV_1 IL12ss-IL12-fT2A-IL21ss-IL21 pL41g 有
SB00881 SFFV_1 IL21ss-IL21-fT2A-IL12 pL41g 有
SB00882 SFFV_1 IL12ss-IL12-fT2A-IL21 pL41g 有
SB00862 SFFV_1 IL21ss-IL21 pL23d 無
SB00863 SFFV_1 IL2ss-IL21 pL41g 有
SB00968 SFFV_1 IL2ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL41g 有
SB00969 SFFV_1 IL8ss-IL21-fT2A-IL12ss-IL12 pL41g 有
SB00970 SFFV_1 IL12ss-IL12-fT2A-IL2ss-IL21 pL41g 有
SB00971 SFFV_1 IL12ss-IL12-fT2A-IL8ss-IL21 pL41g 有
SB00862+SB00743 SFFV_1 共轉導IL12 + IL21 pL41g 無
SB00868+863 SFFV_1 共轉導IL12+IL21 (IL2ssIL21) pL41g 有
* fT2A係指弗林蛋白酶-T2A表 8-SB00880 表現構築體序列
SFFV啟動子(SEQ ID NO: 17)
GTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGCCCGGG
人類IL-12信號序列；密碼子優化(核酸)  (SEQ ID NO: 32)
ATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCC
人類IL-12信號序列(胺基酸) (SEQ ID NO: 112)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVA
無信號序列之人類IL-12蛋白質；密碼子優化(核酸)  (SEQ ID NO: 136)
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAGCTGGATTGGTACCCGGACGCCCCTGGAGAAATGGTCGTGCTGACTTGCGATACGCCAGAAGAGGACGGCATAACCTGGACCCTGGATCAGAGCTCCGAGGTGCTCGGAAGCGGAAAGACCCTGACCATTCAAGTCAAGGAGTTCGGCGACGCGGGCCAGTACACTTGCCACAAGGGTGGCGAAGTGCTGTCCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGTCCACTGACATCCTCAAGGACCAAAAAGAACCGAAGAACAAGACCTTCCTCCGCTGCGAAGCCAAGAACTACAGCGGTCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACGACAATCTCCACCGACCTGACTTTCTCCGTGAAGTCGTCACGGGGATCAAGCGATCCTCAGGGCGTGACCTGTGGAGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGAGAGTCAGGGGAGACAACAAGGAATATGAGTACTCCGTGGAATGCCAGGAGGACAGCGCCTGCCCTGCCGCGGAAGAGTCCCTGCCTATCGAGGTCATGGTCGATGCCGTGCATAAGCTGAAATACGAGAACTACACTTCCTCCTTCTTTATCCGCGACATCATCAAGCCTGACCCCCCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCACTCAAGAACTCCCGCCAAGTGGAAGTGTCTTGGGAATATCCAGACACTTGGAGCACCCCGCACTCATACTTCTCGCTCACTTTCTGTGTGCAAGTGCAGGGAAAGTCCAAACGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACCGACAAAACCTCCGCCACTGTGATTTGTCGGAAGAACGCGTCAATCAGCGTCCGGGCGCAGGATAGATACTACTCGTCCTCCTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGTGGCGGATCAGGCGGAGGTTCAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGTTCCCGGAACCTCCCTGTGGCAACCCCCGACCCTGGAATGTTCCCGTGCCTACACCACTCCCAAAACCTCCTGAGGGCTGTGTCGAACATGTTGCAGAAGGCCCGCCAGACCCTTGAGTTCTACCCCTGCACCTCGGAAGAAATTGATCACGAGGACATCACCAAGGACAAGACCTCGACCGTGGAAGCCTGCCTGCCGCTGGAACTGACCAAGAACGAATCGTGTCTGAACTCCCGCGAGACAAGCTTTATCACTAACGGCAGCTGCCTGGCGTCGAGAAAGACCTCATTCATGATGGCGCTCTGTCTTTCCTCGATCTACGAAGATCTGAAGATGTATCAGGTCGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCGAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAATATGCTCGCCGTGATTGATGAACTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACTCCGAGACTGTGCCTCAAAAGTCCAGCCTGGAAGAACCGGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGTTGCACGCTTTCCGCATTCGAGCCGTGACCATTGACCGCGTGATGTCCTACCTGAACGCCAGT
無信號序列之人類IL-12蛋白質(胺基酸) (SEQ ID NO: 137)；p35次單元為粗體；p40次單元為斜體
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS GGGSGGGSGGGSGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
具有信號序列之人類IL-12蛋白質(胺基酸) (SEQ ID NO: 138)；p35次單元為粗體；p40次單元為斜體
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS GGGSGGGSGGGSGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
弗林蛋白酶-T2A連接子(核酸)  (SEQ ID NO: 139)
AGACGGAAACGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGCTCGCTGCTTACATGCGGGGACGTGGAAGAGAACCCCGGTCCG
弗林蛋白酶-T2A連接子(胺基酸))  (SEQ ID NO: 140)
RRKRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
人類IL-21信號序列；密碼子優化(核酸)  (SEQ ID NO: 55)
ATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGC
人類IL-21信號序列(胺基酸)  (SEQ ID NO: 135)
MERIVICLMVIFLGTLVHKSSS
無信號序列之人類IL-21蛋白質；密碼子優化(核酸)  (SEQ ID NO: 141)
CAGGGACAGGACAGGCACATGATTAGAATGCGCCAGCTCATCGATATCGTGGACCAGTTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCGGCCCCCGAAGATGTGGAAACCAATTGCGAATGGTCGGCATTTTCCTGCTTTCAAAAGGCACAGCTCAAGTCCGCTAACACCGGGAACAACGAACGGATCATCAACGTGTCCATCAAAAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACCAACGCCGGACGGAGGCAGAAGCATAGGCTGACTTGCCCGTCATGCGACTCCTACGAGAAGAAGCCGCCGAAGGAGTTCCTGGAGCGGTTCAAGTCGCTCCTGCAAAAGATGATTCATCAGCACCTGTCCTCCCGGACTCATGGGTCTGAGGATTCA
無信號序列之人類IL-21蛋白質(胺基酸)  (SEQ ID NO: 142)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
具有信號序列之人類IL-21蛋白質(胺基酸)  (SEQ ID NO: 143)
MERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
SB00880盒  (SFFV-IL12ss-IL12-fT2A-IL21ss-IL21) (SEQ ID NO: 144)
GTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGCCCGGGGGATCCGCGGAATTCGCCGCCACCATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCCATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAGCTGGATTGGTACCCGGACGCCCCTGGAGAAATGGTCGTGCTGACTTGCGATACGCCAGAAGAGGACGGCATAACCTGGACCCTGGATCAGAGCTCCGAGGTGCTCGGAAGCGGAAAGACCCTGACCATTCAAGTCAAGGAGTTCGGCGACGCGGGCCAGTACACTTGCCACAAGGGTGGCGAAGTGCTGTCCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGTCCACTGACATCCTCAAGGACCAAAAAGAACCGAAGAACAAGACCTTCCTCCGCTGCGAAGCCAAGAACTACAGCGGTCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACGACAATCTCCACCGACCTGACTTTCTCCGTGAAGTCGTCACGGGGATCAAGCGATCCTCAGGGCGTGACCTGTGGAGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGAGAGTCAGGGGAGACAACAAGGAATATGAGTACTCCGTGGAATGCCAGGAGGACAGCGCCTGCCCTGCCGCGGAAGAGTCCCTGCCTATCGAGGTCATGGTCGATGCCGTGCATAAGCTGAAATACGAGAACTACACTTCCTCCTTCTTTATCCGCGACATCATCAAGCCTGACCCCCCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCACTCAAGAACTCCCGCCAAGTGGAAGTGTCTTGGGAATATCCAGACACTTGGAGCACCCCGCACTCATACTTCTCGCTCACTTTCTGTGTGCAAGTGCAGGGAAAGTCCAAACGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACCGACAAAACCTCCGCCACTGTGATTTGTCGGAAGAACGCGTCAATCAGCGTCCGGGCGCAGGATAGATACTACTCGTCCTCCTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGTGGCGGATCAGGCGGAGGTTCAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGTTCCCGGAACCTCCCTGTGGCAACCCCCGACCCTGGAATGTTCCCGTGCCTACACCACTCCCAAAACCTCCTGAGGGCTGTGTCGAACATGTTGCAGAAGGCCCGCCAGACCCTTGAGTTCTACCCCTGCACCTCGGAAGAAATTGATCACGAGGACATCACCAAGGACAAGACCTCGACCGTGGAAGCCTGCCTGCCGCTGGAACTGACCAAGAACGAATCGTGTCTGAACTCCCGCGAGACAAGCTTTATCACTAACGGCAGCTGCCTGGCGTCGAGAAAGACCTCATTCATGATGGCGCTCTGTCTTTCCTCGATCTACGAAGATCTGAAGATGTATCAGGTCGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCGAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAATATGCTCGCCGTGATTGATGAACTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACTCCGAGACTGTGCCTCAAAAGTCCAGCCTGGAAGAACCGGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGTTGCACGCTTTCCGCATTCGAGCCGTGACCATTGACCGCGTGATGTCCTACCTGAACGCCAGTAGACGGAAACGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGCTCGCTGCTTACATGCGGGGACGTGGAAGAGAACCCCGGTCCGATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGCCAGGGACAGGACAGGCACATGATTAGAATGCGCCAGCTCATCGATATCGTGGACCAGTTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCGGCCCCCGAAGATGTGGAAACCAATTGCGAATGGTCGGCATTTTCCTGCTTTCAAAAGGCACAGCTCAAGTCCGCTAACACCGGGAACAACGAACGGATCATCAACGTGTCCATCAAAAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACCAACGCCGGACGGAGGCAGAAGCATAGGCTGACTTGCCCGTCATGCGACTCCTACGAGAAGAAGCCGCCGAAGGAGTTCCTGGAGCGGTTCAAGTCGCTCCTGCAAAAGATGATTCATCAGCACCTGTCCTCCCGGACTCATGGGTCTGAGGATTCATGA
SB00880完整載體(PL41g + SB00880盒) (SEQ ID NO: 145)
TGACTCCTGCGCAGTCCAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGTATCGGTGGGCCCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGTTTAAACAAATAGTCAAAAGCCTCCGGCGACTAGTCGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATTTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCAGAGTACGCCAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAAAATAGCGGCCGCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAATTTTCGGGGGATCCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGCCCGGGGGATCCGCGGAATTCGCCGCCACCATGTGCCATCAGCAACTCGTCATCTCCTGGTTCTCCCTTGTGTTCCTCGCTTCCCCTCTGGTCGCCATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAGCTGGATTGGTACCCGGACGCCCCTGGAGAAATGGTCGTGCTGACTTGCGATACGCCAGAAGAGGACGGCATAACCTGGACCCTGGATCAGAGCTCCGAGGTGCTCGGAAGCGGAAAGACCCTGACCATTCAAGTCAAGGAGTTCGGCGACGCGGGCCAGTACACTTGCCACAAGGGTGGCGAAGTGCTGTCCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGGAATCTGGTCCACTGACATCCTCAAGGACCAAAAAGAACCGAAGAACAAGACCTTCCTCCGCTGCGAAGCCAAGAACTACAGCGGTCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACGACAATCTCCACCGACCTGACTTTCTCCGTGAAGTCGTCACGGGGATCAAGCGATCCTCAGGGCGTGACCTGTGGAGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGAGAGTCAGGGGAGACAACAAGGAATATGAGTACTCCGTGGAATGCCAGGAGGACAGCGCCTGCCCTGCCGCGGAAGAGTCCCTGCCTATCGAGGTCATGGTCGATGCCGTGCATAAGCTGAAATACGAGAACTACACTTCCTCCTTCTTTATCCGCGACATCATCAAGCCTGACCCCCCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCACTCAAGAACTCCCGCCAAGTGGAAGTGTCTTGGGAATATCCAGACACTTGGAGCACCCCGCACTCATACTTCTCGCTCACTTTCTGTGTGCAAGTGCAGGGAAAGTCCAAACGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTCACCGACAAAACCTCCGCCACTGTGATTTGTCGGAAGAACGCGTCAATCAGCGTCCGGGCGCAGGATAGATACTACTCGTCCTCCTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGTGGCGGATCAGGCGGAGGTTCAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGTTCCCGGAACCTCCCTGTGGCAACCCCCGACCCTGGAATGTTCCCGTGCCTACACCACTCCCAAAACCTCCTGAGGGCTGTGTCGAACATGTTGCAGAAGGCCCGCCAGACCCTTGAGTTCTACCCCTGCACCTCGGAAGAAATTGATCACGAGGACATCACCAAGGACAAGACCTCGACCGTGGAAGCCTGCCTGCCGCTGGAACTGACCAAGAACGAATCGTGTCTGAACTCCCGCGAGACAAGCTTTATCACTAACGGCAGCTGCCTGGCGTCGAGAAAGACCTCATTCATGATGGCGCTCTGTCTTTCCTCGATCTACGAAGATCTGAAGATGTATCAGGTCGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCGAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAATATGCTCGCCGTGATTGATGAACTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACTCCGAGACTGTGCCTCAAAAGTCCAGCCTGGAAGAACCGGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGTTGCACGCTTTCCGCATTCGAGCCGTGACCATTGACCGCGTGATGTCCTACCTGAACGCCAGTAGACGGAAACGCGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGCTCGCTGCTTACATGCGGGGACGTGGAAGAGAACCCCGGTCCGATGGAACGCATTGTGATCTGCCTGATGGTCATCTTCCTGGGCACCTTAGTGCACAAGTCGAGCAGCCAGGGACAGGACAGGCACATGATTAGAATGCGCCAGCTCATCGATATCGTGGACCAGTTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTCCTGCCGGCCCCCGAAGATGTGGAAACCAATTGCGAATGGTCGGCATTTTCCTGCTTTCAAAAGGCACAGCTCAAGTCCGCTAACACCGGGAACAACGAACGGATCATCAACGTGTCCATCAAAAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACCAACGCCGGACGGAGGCAGAAGCATAGGCTGACTTGCCCGTCATGCGACTCCTACGAGAAGAAGCCGCCGAAGGAGTTCCTGGAGCGGTTCAAGTCGCTCCTGCAAAAGATGATTCATCAGCACCTGTCCTCCCGGACTCATGGGTCTGAGGATTCATGAGGTTAGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCTTAGTACTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATTCCGGAATTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAAACCGGTGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCATCTAGAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTAGCCGGGCTTTTTTTTCTTAGGCCTTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCC
如藉由ELISA所評定，經工程改造之MSC的IL-12p70及IL-21之分泌分別示於圖 45 及圖 46 中。SB00880顯示經工程改造之MSC表現兩種細胞介素之水準高於大部分測試構築體。另外，如藉由ELISA所評定及圖 47 中所示，確定IL-12與IL-21之比率。使用SB00880進行工程改造之MSC顯示IL-12p70相對於IL-21高10倍之比率。值得注意地，10:1之比率顯示臨床前功效(資料未示)。
進行功能分析，展示經工程改造之MSC的IL-12p70之表現。具有STAT4-SEAP報導體之HEK-293T細胞用於確定由經工程改造之hMSC產生之IL12p70的效力及活性，該STAT4-SEAP報導體報導IL12p70與其受體之結合及經由JAK-STAT4路徑之信號傳導。將經工程改造之MSC培養24小時且收集培養基，且與HEK-293T STAT4-SEAP報導細胞一起培育。用分光光度計確定SEAP產生。如圖 48 所示，編碼IL-12之所有構築體顯示報導活性，表明功能性IL12p70信號傳導。
進行功能分析，展示經工程改造之MSC的IL-21之表現。NK-92人類天然殺手細胞用於確定由經工程改造之hMSC產生之IL-21的功能。將經工程改造之hMSC培養24小時，且收集條件培養基，且用於處理源自於IL-2之NK-92細胞。進行細胞內磷酸流動以定量磷酸化STAT1及磷酸化STAT3活化，作為IL-21活性之讀數。如圖 49 所示，所有編碼IL-21之構築體均顯示STAT1 (左圖)及STAT3 (右圖)磷酸化，表明功能性IL-21信號傳導。
亦使用IL21R-U2OS IL21R/IL2RG二聚報導體(PathHunter® U2OS IL21R/IL2RG二聚細胞株, DiscoverX目錄號：93-1035C3)進行IL-21之功能分析。將報導細胞與來自經工程改造之人類MSC的條件培養基或適當陽性(重組細胞介素)或陰性對照物一起培育。如圖 50 所示，所有編碼IL-21之構築體均顯示二聚。實例 20 ： CT26 腫瘤模型中經工程改造之 MSC 功效
在以下實例中，對balb/c mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現圖 51A 中所示之各種鼠類免疫效應子中的每一種。各MSC經工程改造以僅僅表現單一藥劑。將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(100µl中5×104 個細胞)注射至免疫活性balb/c雌性小鼠(6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的經工程改造之mMSC (1×106 個細胞)處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。
如圖 51A 所示，在CT26同基因腫瘤模型中所選的產生效應子之經工程改造之MSC及所選的產生效應子之經工程改造之MSC顯著減少腫瘤負荷。藉由相對於處理前BLI對處理後BLI (第10天)進行標準化，計算各個別小鼠之腫瘤負荷變化倍數。腫瘤負荷變化倍數低於1 (點線)之所有情況表示腫瘤負荷減少。實現腫瘤負荷顯著減少之最佳MSC -效應子為：IL12、IL15、IL12+抗PD1(微體)、IL12+IL21、IL12+CCL21a、IL12+CXCL10、IL12+CXCL11、IL21+CXCL11、IL21+CCL21a、IL15+CXCL10、GM-CSF+IL12、IL12+IL21+CCL21a。實例 21 ： B16F10 腫瘤模型中經工程改造之 MSC 功效
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現圖 51B 中所示之各種鼠類免疫效應子中的每一種。各MSC經工程改造以僅僅表現單一藥劑。將經修飾以組成性表現螢光素酶(B16F10-Fluc-Puro目錄號：CL052，批號：CL-IM150 Imanis Life Sciences)之 B16F10腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的表現免疫調節細胞介素或趨化介素，諸如IL12p70之mMSC 1×106 處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。
如圖 51B 所示，在CT26同基因腫瘤模型中所選的產生效應子之經工程改造之MSC及所選的產生效應子之經工程改造之MSC顯著減少腫瘤負荷。所選效應子或組合實現腫瘤負荷顯著減少：IL12、IL12+CD40L、IL12+CXCL10、IL12+IL21、IL12+IL21+Flt3L、IL12+IL21+CXCL10、IL12+CCL21a+Flt3L。實例 22 ：在 IP 模型中產生 IL12 之 MSC 減少 CT26 腫瘤負荷
在以下實例中，對balb/c mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12p70或鼠類IL21 (亦即，各MSC經工程改造以僅表現單一藥劑)。將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性balb/c (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。此外，在終止時(腫瘤植入後第17天)測定腫瘤重量。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的mMSC (1×106 個細胞)處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。實驗群組包括：表現鼠類IL12之鼠類MSC、表現鼠類IL21之鼠類MSC以及表現鼠類IL12之鼠類MSC與表現鼠類IL21之鼠類MSC的組合處理(組合中每一者遞送1×106 個細胞)。
如圖 52A 及圖 52B 所示，在CT26模型中，如藉由BLI (圖 52A 左圖)及藉由腫瘤重量(圖 52A 右圖)所評定，相對於對照物，接受表現IL12p70之MSC、表現IL21之MSC及表現IL12p70及IL21之MSC之組合的組減少腫瘤負荷，包括組合處理中顯著減少。圖 52B 展示個別小鼠之BLI螢光素酶量測(結果概述於圖 52A 左圖中)。
重複以上實驗，其中修改為遞送較低劑量之經工程改造之mMSC (1×105 個細胞)。如圖 53A 所示，在CT26模型中，如藉由BLI (圖 53A ；小鼠之個別BLI量測-左圖；BLI量測之概述-右圖)所評定，相對於對照物，接受表現IL12p70之MSC及表現IL12p70及IL21之MSC之組合的組減少腫瘤負荷，包括組合處理中顯著減少。另外，組合處理顯示相對於接受單獨的表現IL12p70之MSC之組功效增加。如圖 53B 所示，在所有經處理之小鼠中用1×105 個表現IL12p70之MSC與1×105 個表現IL21之MSC組合處理引起無腫瘤存活直至40天(n = 8；未達到中值存活期)。相比之下，用1×105 個單獨的表現IL12p70之MSC處理至第40天僅產生25%存活率(n =8；中值存活期19天)。針對FLAG-MSC用PBS處理之對照組至第40天產生0%存活率(各n = 8；各中值存活期12天)。因此，MSC表現IL21可增強表現IL12p70之MSC的功效。實例 23 ：在 IP 模型中產生 IL12 之 MSC 減少 B16F10 腫瘤負荷
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12p70或鼠類IL21 (亦即各MSC經工程改造以僅表現單一藥劑)。將經修飾以組成性表現螢光素酶(B16F10-Fluc-Puro目錄號：CL052，批號：CL-IM150 Imanis Life Sciences)之 B16F10腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。此外，在終止時(腫瘤植入後第17天)測定腫瘤重量。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的mMSC (1×106 個細胞)處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。實驗群組包括：表現鼠類IL12之鼠類MSC、表現鼠類IL21之鼠類MSC以及表現鼠類IL12之鼠類MSC與表現鼠類IL21之鼠類MSC的組合處理(組合中每一者遞送1×106 個細胞)。
如圖 54 及圖 55 所示，在B16F10模型中，如藉由BLI (圖 54 左圖)及藉由腫瘤重量(圖 54 右圖)所評定，相對於對照物，接受表現IL12p70之MSC及表現IL12p70及IL21之MSC之組合的組減少腫瘤負荷，包括組合處理中顯著減少。值得注意地，單獨的表現IL21之MSC未顯示腫瘤負荷或腫瘤重量顯著減少。圖 55 顯示對於對照的表現FLAG之MSC及表現IL12之MSC與表現IL21之MSC之組合，個別小鼠之BLI螢光素酶量測結果(結果概述於圖 54 左圖中)。實例 24 ：在 B16F10 IP 腫瘤中產生 IL12 及 IL21 之 MSC 延長無腫瘤存活期且在腫瘤再激發後存活
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12 (p70)或鼠類IL21 (亦即各MSC經工程改造以僅表現單一藥劑)。將經修飾以組成性表現螢光素酶(B16F10-Fluc-Puro目錄號：CL052，批號：CL-IM150 Imanis Life Sciences)之 B16F10腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的mMSC (1×106 個細胞)處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。實驗群組包括：表現鼠類IL12之鼠類MSC、表現鼠類IL21之鼠類MSC以及表現鼠類IL12之鼠類MSC與表現鼠類IL21之鼠類MSC的組合處理(組合中每一者遞送1×106 個細胞)。
如圖 56 所示，相對於經對照物處理之小鼠(PBS處理及表現FLAG之MSC的處理後中值存活期為8天)，用表現IL12p70之MSC處理延長存活(處理後中值存活期27天)。相對於用表現IL12p70之MSC處理，用表現IL12p70之MSC與表現IL21之MSC的組合處理延長存活(54.5%存活；未達到中值存活期)。因此，MSC表現IL21可增強表現IL12p70之MSC的功效。
另外，超過90天無腫瘤之小鼠隨後用植入側腹中之B16-F10腫瘤細胞(1×106 個細胞)再次激發。未處理之小鼠在與對照物相同之時間植入。藉由測徑規量測皮下腫瘤負荷。如圖 57C 所示，先前接受表現IL12之MSC及表現IL21之MSC組合處理的所有小鼠(n = 4)排斥重新植入之腫瘤，存活，此表明處理實現抗腫瘤免疫記憶。先前接受單獨的表現IL12之MSC處理的小鼠具有50%腫瘤排斥率(4隻小鼠中之2隻；圖 57B )。相比之下，60%未處理小鼠中建立腫瘤(5隻小鼠中之3隻；圖 57A )。實例 25 ：在 B16F10 IP 腫瘤模型中產生 IL12 之 MSC 與免疫檢查點療法組合延長存活
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12 (p70)。將經修飾以組成性表現螢光素酶(B16F10-Fluc-Puro目錄號：CL052，批號：CL-IM150 Imanis Life Sciences)之B16F10腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。將小鼠隨機化至處理組且藉由IP投與200 mg/kg之劑量的單獨抗PD1抗體或與低劑量(1e5)表現IL12之鼠類MSC組合的抗PD1抗體(純系RMP1-14)來處理。
如圖 56 所示，用單獨抗PD1處理產生12.5%存活率及23天之中值存活期(圖56「抗PD1」；8隻小鼠中之1隻具有長期無腫瘤存活)。相比之下，抗PD1與表現IL12p70之MSC組合處理產生50%存活率(圖56「MSC-IL12 (p70) + 抗PD1」；8隻小鼠中之4隻具有長期無腫瘤存活；尚未確定中值存活期)。因此，MSC表現IL12增強抗PD1免疫檢查點療法之功效且將檢查點難治性或抗性模型(B16F10)轉變成反應性的。實例 26 ：在 CT26 IP 腫瘤模型中產生 IL12 及 IL21 之 MSC 減少腫瘤負荷
在以下實例中，對balb/c mMSC進行工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(100 μl中1×105 個細胞)注射至免疫活性雌性balb/c小鼠(6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組且用在1×104 至1×106 個細胞範圍內的不同量之mMSC IP處理。MSC-Flag-Myc (1×106 個細胞)及PBS用作陰性對照物。
如圖 58A-C 所示，如藉由BLI所評定，觀察到表現IL12及IL21之MSC以劑量依賴性方式抗腫瘤之活性(圖58A 第17天相對於第7天標準化；圖 58B 及圖 58C 個別小鼠隨時間之BLI)。在對照FLAG或PBS小鼠中未觀察到功效(圖 58A 及圖 58B )。相比之下，在1×104 之劑量下觀察到最小功效，其中在各遞增劑量下功效遞增(圖 58A 及圖 58C )。如圖 58D 所示，觀察到以劑量依賴性方式的至腫瘤植入後60天之長期無腫瘤存活，其中用1×106 至1×105 處理之小鼠顯著延長無腫瘤存活期(植入後中值存活期：PBS/FLAG-19天；1×106 至1×105 -未達到；3×104 -53天；1×104 -18-19天)。實例 27 ：在 B16F10 IP 腫瘤模型中產生 IL12 及 IL21 之 MSC 減少腫瘤負荷
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。將經修飾以組成性表現螢光素酶(B16F10-Fluc-Puro目錄號：CL052，批號：CL-IM150 Imanis Life Sciences)之 B16F10腫瘤細胞(100 μl中5×104 個細胞)注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組且用在1×105 至1×107 個細胞範圍內的不同量之mMSC處理。MSC-Flag-Myc (3×106 個細胞)及PBS用作陰性對照物。一些組用多劑量處理，相隔5天(在植入腫瘤後第7天、第12天及第17天處理)。
如圖 59A-D 所示，如藉由BLI所評定，觀察到表現IL12及IL21之MSC以劑量依賴性方式抗腫瘤之活性(圖 59A 第17天相對於第7天標準化；圖 59B-D 個別小鼠隨時間之BLI)。在對照FLAG或PBS小鼠中未觀察到功效(圖 59A 及圖 59B )。在1×105 或3×105 個細胞之劑量下未觀察到功效(圖 59A 及圖 59C )。相比之下，在1×106 之劑量下觀察到最小功效，其中在各遞增劑量下功效遞增(圖 59A 及圖 59C )。在多次投與較高劑量後亦觀察到功效(圖 59D )。如圖 59E 所示，觀察到以劑量依賴性方式之長期無腫瘤存活，且在多次投與較高劑量後亦觀察到(植入後中值存活期：PBS-20天；FLAG (×3)-27天；1×107 -31.5天；3×106 -36天；3×106 (×3)-39天；1×106 -33天；1×106 (×3)-39天；3×105- 27天；3×105 (×3)-27天 [曲線與3×105 處理重疊]；1×105 -24天)。實例 28 ：在 MC-38 IP 腫瘤模型中產生 IL12 及 IL21 之 MSC 減少腫瘤負荷
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。MC-38腫瘤細胞經fLUC-EGFP構築體轉導且基於EGFP螢光分類，接著將5×105 個細胞注射至免疫活性C57BL/6 (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入九天後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組且用在3×104 至1×106 個細胞範圍內的不同量之mMSC處理。MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。
如圖 60A 及圖 60B 所示，如藉由BLI所評定，觀察到表現IL12及IL21之MSC以劑量依賴性方式抗腫瘤之活性(圖 60A 第18天相對於第9天標準化；圖 60B 個別小鼠隨時間之BLI)。在對照FLAG或PBS小鼠中未觀察到功效(圖 60A 及圖 60B )。在1×105 或3×104 個細胞之劑量下未觀察到功效(圖 60A 及圖 60B )。相比之下，在3×105 之劑量下觀察到最小功效，其中在1×106 個細胞之遞增劑量下功效遞增(圖 60A 及圖 60B )。如圖 60C 所示，觀察到以劑量依賴性方式之長期無腫瘤存活，其中用1×106 個細胞處理之所有小鼠存活超過至少第30天(植入後中值存活期：PBS-21天；FLAG-29天；1×106 -未達到；3×105 -28天；1×105 -21天；3×104 -21天[PBS、1×105 及3×104 重疊)。因此，經工程改造以表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21之mMSC在MC-38腫瘤模型中顯示功效。實例 29 ： IP 模型中人類 MSC 歸巢至腫瘤
在以下實例中，IP向NSG小鼠植入OVCAR8-fLUC細胞。在植入腫瘤14-21天後，IP遞送經工程改造以表現Nanoluc-EGFP之1×106 個人類BM-MSC。在注射MSC之後24小時將小鼠處死，且針對NanoLuc信號傳導，離體對腹膜器官(胃、腎、肝臟、結腸、脾、胰臟、網膜/腫瘤、卵巢及輸卵管)成像(NanoGlo受質套組，廠商：Promega，目錄號：N1110)。在注射後24小時以及22天收集之腫瘤切片中藉由EGFP螢光使人類MSC成像。
如圖 61A 及圖 61B 所示，與腹膜腔中之其他器官相比，人類MSC NanoLuc信號優先富集在腫瘤中(圖 61A 概述螢光素酶定量；圖 61B 為螢光素酶信號之代表性影像)。另外，MSC之持久性低於22天，且在最遲時間點未偵測到細胞(圖 61B 最右圖)。實例 30 ：效應細胞介素之生物分佈及 PK
在以下實例中，評定藉由經工程改造之MSC產生之效應細胞介素的生物分佈及PK。
在第一實驗中，IP向NSG小鼠植入5×106 個OVCAR8-fLUC腫瘤細胞。在植入腫瘤21-27天後，基於由BLI量測之腫瘤負荷將小鼠隨機化，且用1×106 個經工程改造以自單一慢病毒表現載體表現人類IL12 (p70)及人類IL21之hMSC處理。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。在MSC處理後16-24小時或3天、4天及7天將小鼠處死，且經由IP灌洗，藉由將1 mL PBS注射至腹膜間隙中且收集其來收集腹膜液。在心內穿刺之後自全血分離血清。ELISA (R & D systems)用於確定各時間點及處理類型的各隔室(腹膜液對比血清)中之蛋白質量。
如圖 62A 所示，觀察到腹膜液(各相應時間點之左列)及血清(各相應時間點之右列)中人類IL12 (左圖)及人類IL21 (右圖)短暫產生。觀察腹膜間隙(局部)中，與全身(血清)相比，蛋白質豐度增加至少10倍，顯示經工程改造之MSC局部遞送細胞介素。
在另一個實驗中，對balb/c mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12p70或鼠類IL21 (亦即，各MSC經工程改造以僅表現單一藥劑)。將CT26-fLUC腫瘤細胞(100 μl中1×105 個細胞)注射至免疫活性balb/c (6-8週齡)之腹膜間隙中。IP遞送表現鼠類IL12之鼠類MSC及表現鼠類IL21之鼠類MSC (組合中之每一者遞送1×106 個細胞)。在MSC處理後24小時或72小時將小鼠處死，且經由IP灌洗，藉由將1 mL PBS注射至腹膜間隙中且收集其來收集腹膜液。在心內穿刺之後自全血分離血清。Luminex (Millipore)用於確定各時間點及處理類型的各隔室(腹膜液對比血清)中之蛋白質量。
如圖 62B 所示，觀察到腹膜液(各相應時間點之左列)及血清(各相應時間點之右列)中鼠類IL12 (左圖)及鼠類IL21 (右圖)短暫產生。觀察腹膜間隙(局部)中，與全身(血清)相比，蛋白質豐度增加至少10倍，顯示經工程改造之MSC局部遞送細胞介素。實例 31 ： CT26 IP 腫瘤模型中 MSC 處理及重組細胞介素處理之比較
在以下實例中，對balb/c mMSC進行工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21。亦對Balb/c mMSC進行工程改造以表現鼠類IL12 (p70)或鼠類IL21。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(100 µl中1×105 個細胞)注射至免疫活性雌性balb/c小鼠(6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。對於經MSC處理之小鼠，將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的mMSC (1×106 個細胞)處理，接受表現鼠類IL12之鼠類MSC、表現鼠類IL21之鼠類MSC或表現鼠類IL12及IL21之鼠類MSC，其中MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。另外，處理組亦包括接受劑量為MSC在活體外產生之量(藉由ELISA量測-重組IL12：5 ug/小鼠；重組IL21：0.4 ug/小鼠) 4倍的團注之相應重組細胞介素的小鼠。藉由fLUC BLI，跨越時間點量測腫瘤負荷，且當由於腫瘤負荷而達到終點標準時將小鼠處死。確定卡普蘭梅耶存活曲線(Kaplan Meier survival curve)以計算無腫瘤存活期。
如圖 63A-C 所示，根據延長之無腫瘤存活期，在所有情況下，用經工程改造以產生細胞介素之MSC處理的小鼠勝過重組細胞介素療法(圖 63A -MSC-IL12對比rIL12；圖 63B -MSC-IL21對比rIL21；圖 63C -MSC-IL12/IL21對比rIL12+rIL21)。另外，如圖 63D-E 所示，如藉由腫瘤負荷BLI評定，在所有情況下，用經工程改造以產生細胞介素之MSC處理的小鼠勝過重組細胞介素療法(圖 63D 底行-MSC-IL12對比rIL12；圖 63E 頂行-MSC-IL21對比rIL21；圖 63E 底行-MSC-IL12/IL21對比rIL12+rIL21)。實例 32 ： B16F10 IP 腫瘤模型中 MSC 處理及重組細胞介素處理之比較
在以下實例中，對C57BL/6 mMSC進行工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21。C57BL/6 mMSC亦經工程改造以表現鼠類IL12 (p70)或鼠類IL21。使用實例6中所述之慢病毒轉導方法，慢病毒表現載體使用2A核糖體跳躍元件自單一轉錄本表現兩種細胞介素。將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之B16F10腫瘤細胞(100 µl中1×105 個細胞)注射至免疫活性雌性balb/c小鼠(6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。對於經MSC處理之小鼠，將小鼠隨機化至處理組，且用腹膜內遞送的經工程改造以表現表現IL12及IL21之鼠類MSC的mMSC (3×106 個細胞)處理，其中MSC-Flag-Myc及PBS用作陰性對照物。另外，處理組亦包括接受劑量為MSC在活體外產生之量(藉由ELISA量測-重組IL12：3 ug/小鼠；重組IL21：0.03 ug/小鼠) 4倍的團注之相應重組細胞介素的小鼠。藉由處理後第7天之腫瘤重量量測腫瘤負荷，且當由於腫瘤負荷而達到終點標準時將小鼠處死。確定卡普蘭梅耶存活曲線以計算無腫瘤存活期。
如圖 64A 所示，如藉由腫瘤重量所評定，用經工程改造以產生IL12及IL21之MSC處理的小鼠勝過重組細胞介素療法。另外，如圖 64B 所示，如藉由延長之無腫瘤存活期所評定，用經工程改造以產生IL12及IL21之MSC處理的小鼠勝過重組細胞介素療法。實例 33 ：在 CT26 IP 腫瘤模型中在用產生 IL12 及 IL21 兩者之 MSC 處理後小鼠的免疫概況
在以下實例中，對balb/c mMSC進行工程改造以使用實例6中所述之慢病毒轉導方法表現鼠類IL12p70或鼠類IL21 (亦即，各MSC經工程改造以僅表現單一藥劑)。將經修飾以組成性表現螢光素酶(目錄號：CL043，批號：CL-IM147 Imanis Life Sciences)之CT26腫瘤細胞(1×105 個細胞)注射至免疫活性balb/c (6-8週齡)之腹膜間隙中。在腫瘤植入一週之後，藉由使用AMI成像器進行螢光素酶成像(BLI)來量測腫瘤負荷。將小鼠隨機化至處理組且用腹膜內遞送的表現鼠類IL12之鼠類MSC及表現鼠類IL21之鼠類MSC的組合處理(組合中之每一者遞送1×106 個細胞)或MSC-Flag-Myc及PBS作為陰性對照物進行處理。將小鼠處死且在處理後72小時收集器官。多色流動式細胞量測術用於表徵回應於處理之免疫浸潤。
如圖 65A 及圖 65B 所示，在用MSC-IL12 +MSC IL21處理後，腹膜液中T細胞子集及活化標記物(CD3、CD4、CD8、CD8/CD38+、CD8/IFNg+、CD8/Gzmb+、NK/Gzmb+及CD8:Treg-FoxP3比率)顯著增加。另外，如圖 65C 所示，在用MSC-IL12 + MSC-IL21處理後，腹膜腫瘤-引流淋巴結中諸如樹突狀細胞之抗原呈遞細胞亦顯著增加(CD11c/MHC-II hi、CD86+、CD103+、CD11b+)。因此，表現鼠類IL12之鼠類MSC及表現鼠類IL21之鼠類MSC的組合處理顯示活化免疫概況。實例 34 ：信號肽序列之優化
在以下實例中，效應分子經修飾以用外源性信號肽序列替換其天然信號肽序列(測試之例示性信號肽序列參見表5)。測試經修飾之效應分子的功能改善，諸如改善表現及維持分泌，諸如尤其環境(例如腫瘤微環境)。亦在腫瘤模型中測試經修飾之效應分子的功能效能(例如改善清除腫瘤之能力、改善在不同環境中清除腫瘤之能力或改善清除不同類型腫瘤之能力)。實例 35 ：經工程改造之 MSC 之富集
在以下實例中，MSC經工程改造以在包括未經修飾之細胞，諸如未經修飾之MSC的一群細胞內表現效應分子。藉由使經工程改造之MSC與生長因子(諸如表1中所述之效應分子)接觸來富集經工程改造之MSC，使得富集的彼等經工程改造之MSC為表現該生長因子之受體或受體配位體的經工程改造之MSC之子群。所關注的經工程改造之MSC之子群以各種方式接觸生長因子： 1. 以自分泌方式，藉由對MSC本身進行基因工程改造以表現因子。 2. 以旁分泌方式，藉由對餵養細胞或支持細胞進行基因工程改造以表現該等因子且將彼等因子供應至MSC，或藉由使用含有來自經工程改造以表現此等因子之餵養細胞或支持細胞(諸如293T)之該等因子的條件培養基。 3. 以內分泌方式，藉由在MSC移植後將此等因子之重組蛋白或核酸型式注射至患者中。 4. 經由添加此等因子之可溶性重組蛋白型式至MSC培養條件。 5. 經由用此等因子之重組版本塗佈用於MSC繁殖的組織培養盤/燒瓶表面。 參考文獻： 1.     Kidd S, et al. (2009) Stem Cells 27(10):2614-2623. 2.     Dembinski JL, et al. (2013) Cytotherapy 15(1):20-32. 3.     Siegel RL, et al. (2016) CA Cancer J Clin 66(1):7-30. 4.     Dizon D MJ (2010) Gynecol Oncol 116(3). 5.     Woo SR, et al. (2015) Trends Immunol 36(4):250-256. 6.     Hamanishi J, et al. (2016) Int Immunol 28(7):339-348. 7.     Li S, et al. (2012) Oncolytic Virother 1:1-21. 8.     Koneru M, et al. (2015) J Transl Med 13:102. 9.     Cruz CR, et al. (2010) Cytotherapy 12(6):743-749. 10.   Li YQ, et al. (2013) PLoS One 8(10):e76379. 11.   Wiedemann GM, et al. (2016) Oncoimmunology 5(9):e1175794. 12.   Squillaro T, et al. (2016) Cell Transplant 25(5):829-848. 13.   Studeny M, et al. (2004) J Natl Cancer Inst 96(21):1593-1603. 14.   Ling X, et al. (2010) Cancer Microenviron 3(1):83-95. 15.   Schukur L, et al. (2015) Sci Transl Med 7(318):318ra201. 16.   Howlader N NA, Krapcho M, Garshell J, Miller D, Altekruse SF, Kosary CL, Yu M, Ruhl J, Tatalovich Z, Mariotto A, Lewis DR, Chen HS, Feuer EJ and Cronin KA. (2015). 17.   Lengyel E (2010) Am J Pathol 177(3):1053-1064. 18.   McGuire WP, et al. (1996) The New England journal of medicine 334(1):1-6. 19.   McGuire WP, et al. (1989) Annals of internal medicine 111(4):273-279. 20.   Adams SF & Benencia F (2015) Future Oncology 11(9):1293-1296. 21.   Maude SL, et al. (2014) N Engl J Med 371(16):1507-1517. 22.   Bargou R, et al. (2008) Science 321(5891):974-977. 23.   Kershaw MH, et al. (2014) Clin Trans Immunol 3:e16. 24.   Gilham DE, et al. (2012) Trends Mol Med 18(7):377-384. 25.   Klinger M, et al. (2012) Blood 119(26):6226-6233. 26.   Fu J, et al. (2015) Sci Transl Med 7(283):283ra252. 27.   Moynihan KD, et al. (2016) Nat Med 22(12):1402-1410. 28.   Mohammadi M, et al. (2016) Cancer Gene Ther 23(9):285-286. 29.   Wang D, et al. (2013) Cell Transplant 22(12):2267-2277. 30.   Nowakowski A, et al. (2016) Stem Cells Int 2016:4956063. 31.   Sun Z, et al. (2014) J Hematol Oncol 7:14. 32.   Ando M, et al. (2015) Stem Cell Reports 5(4):597-608. 33.   Zhao Q, et al. (2015) Proc Natl Acad Sci U S A 112(2):530-535. 34.   Xie C, et al. (2013) Br J Cancer 109(5):1198-1205. 35.   Parker BS, et al. (2016) Nat Rev Cancer 16(3):131-144. 36.   Roby KF, et al. (2000) Carcinogenesis 21(4):585-591. 37.   Sharma AD, et al. (2015) J Vis Exp (95):e52242. 38.   Waterman RS, et al. (2012) PLoS One 7(9):e45590. 39.   Dubinett SM, et al. (2010) Cancer J 16(4):325-335. 40.   Tang ED & Wang CY (2015) PLoS One 10(3):e0120090. 41.   Cieri N, et al. (2013) Blood 121(4):573-584. 42.   Fitzgerald KA, et al. (2003) Nat Immunol 4(5):491-496. 43.   Wong AS, et al. (2016) Proc Natl Acad Sci U S A 113(9):2544-2549. 44.   Wong AS, et al. (2015) Nat Biotechnol 33(9):952-961. 45.   Nissim L, et al. (2014) Mol Cell 54(4):698-710. 46.   Deng P, et al. (2016) Neural Regen Res 11(5):702-705. 47.   Beegle JR, et al. (2016) Mol Ther Methods Clin Dev 3:16053. 48.   Boutros C, et al. (2016) Nat Rev Clin Oncol 13(8):473-486. 49.   Valsecchi ME (2015) New Engl J Med 373(13):1270-1270. 50.   Pardoll DM (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-264. 51.   Legat A, et al. (2013) Front Immunol 4:455. 52.   Justus CR, et al. (2014) J Vis Exp (88). 53.   Jedema I, et al. (2004) Blood 103(7):2677-2682. 54.   Peng D, et al. (2015) Nature 527(7577):249-253. 55.   Gitzinger M, et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106(26):10638-10643. 56.   Clackson T, et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95(18):10437-10442. 57.   Siuti P, et al. (2013) Nature Biotechnology 31(5):448-452. 58.   Farzadfard F & Lu TK (2014) Science 346(6211):1256272. 59.   Perli SD, et al. (2016) Science 353(6304). 60.   Roquet N, et al. (2016) Science 353(6297):aad8559. 61.   Wong ASL, et al. (2016) Proceedings of the National Academy of Sciences. 62.   Gardner TS, et al. (2000) Nature 403(6767):339-342. 63.   Deans TL, et al. (2007) Cell 130(2):363-372. 64.   Warren L, et al. (2010) Cell Stem Cell 7(5):618-630. 65.   Yang BX, et al. (2015) Cell 163(1):230-245. 66.   Kumar RM, et al. (2014) Nature 516(7529):56-61. 67.   Zhang J, et al. (2016) Cell Stem Cell 19(1):66-80. 68.   Cahan P, et al. (2014) Cell 158(4):903-915. 69.   Doulatov S, et al. (2013) Cell Stem Cell 13(4):459-470. 70.   Kim K, et al. (2011) Nat Biotechnol 29(12):1117-1119. 71.   Chavez A, et al. (2016) Nat Methods 13(7):563-567. 72.   Slomovic S & Collins JJ (2015) Nat Methods 12(11):1085-1090.
關於引用之主題，本文揭示之所有參考文獻、專利及專利申請案以引用之方式併入，在一些情況下可涵蓋文獻整體。
如本文在說明書及申請專利範圍中所用，除非相反地明顯指示，否則應瞭解不定冠詞「一種(a/an)」意謂「至少一種」。
亦應瞭解，除非相反地明顯指示，否則在本文中主張之包括超過一個步驟或動作的任何方法中，方法之步驟或動作的次序不一定限於敍述之方法之步驟或動作的次序。
在申請專利範圍以及以上說明書中，應理解諸如「包含」、「包括」、「運載」、「具有」、「含有」、「涉及」、「持有」、「由……構成」及其類似詞語之所有銜接詞語為開放性的，亦即意謂包括(但不限於)。僅銜接詞語「由……組成」及「基本上由……組成」分別為封閉或半封閉式銜接詞語，如美國專利局專利審查程序手冊(the United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures)章節2111.03中所述。
圖 1 展示在CT26模型中使用表現IL12p70/CCL21a之同基因及同種異體MSC進行的處理。
圖 2A 及 2B 展示用先前在CT26模型中使用表現IL12p70/CCL21a之同基因及同種異體MSC處理的CT26腫瘤對無腫瘤小鼠再次激發。
圖 3 展示表明腹膜內注射之鼠類BM來源MSC (BM-MSC)在活體內歸巢至4T1乳癌細胞之腫瘤部位的資料。將螢光標記之BM-MSC (治療細胞)注射至負載4T1乳房腫瘤細胞之小鼠中。乳房腫瘤細胞表現螢光素酶報導體。左邊頂部前兩個圖展示如所指示，在注射後第1天及第7天負載腫瘤之小鼠中的治療細胞(BM-MSC)之成像。左邊頂部第三個圖展示在注射後第7天負載腫瘤之小鼠中的腫瘤細胞之成像。左邊底部兩個圖展示如所指示，在注射後第1天及第7天未負載腫瘤之正常小鼠中的治療細胞之成像。在最右邊提供展示腫瘤對治療細胞歸巢之作用的示意圖。
圖 4 展示表明在原位乳癌小鼠模型中表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC誘導顯著腫瘤生長延遲的資料。左圖展示在小鼠(n = 8)中經工程改造之MSC對4T1乳房腫瘤生長的作用。圖中之各線表示在第0天及第7天接受對照MSC生長培養基或經工程改造之MSC之腹膜內注射的小鼠中的腫瘤體積。小鼠接受表現IL-12之經工程改造之MSC及表現CCL21a之經工程改造之MSC的腹膜內注射。藉由用測徑規每隔一天量測來確定腫瘤體積。資料表示平均值±SEM。與對照培養基組相比，*p＜ 0.05，**p＜ 0.005。右邊示意圖展示處理時間線及表現組合基因IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC對所處理小鼠中之腫瘤負荷的作用。
圖 5A 包括表明在原位乳癌(4T1三陰性乳癌)小鼠模型中表現IFN-β、IFN-γ、IL-12、CCL21a或其組合之經工程改造之MSC抑制腫瘤生長的資料。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中4T1乳房腫瘤之生長的作用。圖5A 之各線表示個別小鼠。圖5B 之左圖展示在第14天，各處理中個別小鼠之腫瘤重量。圖5B 之右圖展示接受各處理之小鼠隨時間之腫瘤體積，表示為平均值±SEM。
圖 6A 包括表明在原位乳癌(4T1三陰性乳癌)小鼠模型中表現OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或其組合之經工程改造之MSC不顯著抑制腫瘤生長的資料。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中4T1乳房腫瘤之生長的作用。圖6A 之各線表示個別小鼠。圖 6B 之左圖展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。圖 6B 之右圖展示接受各處理之小鼠隨時間之體重，表示為平均值±SEM。
圖 7A 包括表明表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC抑制原位乳癌(4T1三陰性乳癌)小鼠模型中之腫瘤生長的資料；然而，添加抗CD40抗體不減少腫瘤生長。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中4T1乳房腫瘤之生長的作用。圖 7A 之各線表示個別小鼠。圖 7B 展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。
圖 8A 包括表明在皮下乳癌(4T1三陰性乳癌)小鼠模型中表現OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或其組合之經工程改造之MSC不顯著抑制腫瘤生長的資料。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中4T1乳房腫瘤之生長的作用。圖 8A 之各線表示個別小鼠。圖 8B 之左圖展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。圖 8B 之右圖展示接受各處理之小鼠隨時間之體重，表示為平均值±SEM。
圖 9A 包括表明在原位乳癌(4T1三陰性乳癌)小鼠模型中表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC抑制腫瘤生長的資料；然而，表現CCL21a、IL-36γ及IL-7之MSC的組合不減少腫瘤生長。然而，一些測試的效應子組合可能引起毒性。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中4T1乳房腫瘤之生長的作用。圖 9A 之各線表示個別小鼠。圖 9B 展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。
圖 10A-10B 包括來自針對毒性及篩選之GFP劑量擴大研究的資料。圖 10A 展示表現GFP之經工程改造之MSC未引起毒性。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中4T1乳房腫瘤之生長的作用。圖 10A 之各線表示個別小鼠。圖 10B 展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。
圖 11A 展示經工程改造之人類MSC未歸巢至小鼠4T1腫瘤。圖 11B 展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。藉由用測徑規每隔一天量測腫瘤體積來確定功效。
圖 12 包括展示IL-12及CCL21a可減緩腫瘤擴大之資料。
圖 13A 包括表明在原位乳癌(4T1三陰性乳癌)小鼠模型中表現IL-12及CCL21之經工程改造之MSC充分抑制腫瘤生長，且添加檢查點抑制劑(抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體)不增加功效的資料。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理，且檢查點抑制劑單獨注射。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中4T1乳房腫瘤之生長的作用。圖 13A 之各線表示個別小鼠。圖 13B 展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。
圖 14 展示表明在結腸直腸癌小鼠模型中表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC誘導顯著腫瘤生長延遲的資料。左圖展示在小鼠(n = 8)中經工程改造之MSC對CT26結腸直腸腫瘤生長的作用。圖中之各線表示在第0天及第7天接受對照MSC生長培養基或經工程改造之MSC之腹膜內注射的小鼠中的腫瘤體積。小鼠接受表現IL-12之經工程改造之MSC及表現CCL21a之經工程改造之MSC的腹膜內注射。藉由用測徑規每隔一天量測來確定腫瘤體積。數據表示平均值±SEM。與對照培養基組相比，*p＜ 0.05，**p＜ 0.005。右邊示意圖展示處理時間線及表現組合基因IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC對所處理小鼠中之腫瘤負荷的作用。
圖 15 為展示CT26小鼠模型中腫瘤生長動力學以確定給與經工程改造之MSC細胞之最佳時間的圖。
圖 16A-16B 包括表明在結腸癌之同基因小鼠模型中表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC與抗CD40或抗CTLA4抗體組合對平均腫瘤生長的作用的資料。負載CT26結腸腫瘤之小鼠用七個處理之一處理(每個處理組n = 5-6)。MSC-IL-12+MSC-CCL21a表示用表現IL-12之經工程改造之細胞及表現CCL21a之經工程改造之細胞(1:1比率)處理，用於組合處理。圖16B 之左圖展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。圖 16B 之右圖展示接受各處理之小鼠隨時間之腫瘤體積，表示為平均值±SEM。
圖 17A-17B 包括來自劑量依賴性長期存活研究之資料。圖 17A 展示個別組之腫瘤體積。圖 17B 展示體重(頂部)、腫瘤體積(底部)及存活率(右邊)。
圖 18A 包括表明在小鼠結腸直腸癌模型中表現IL-12、CCL21a及IL15或HACvPD-1之經工程改造之MSC顯著抑制腫瘤生長的資料。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中CT26結腸直腸腫瘤之生長的作用。圖 18A 之各線表示個別小鼠。圖 18B 展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。圖 18C 為腫瘤微環境內浸潤免疫群體之代表圖。圖 18D 展示總CD3群體中T調控細胞(Treg)之百分比。用經工程改造之MSC-IL2及CCL21a處理的腫瘤微環境中Treg之數目顯著下降。圖 18E 使免疫浸潤百分比與腫瘤重量相關。發現具有高淋巴細胞(CD3+)之樣品與低腫瘤重量相關，而具有高骨髓(CD11b+)浸潤之樣品與較高腫瘤負荷相關。
圖 19 展示各處理中個別小鼠之腫瘤體積。藉由用測徑規每隔一天量測腫瘤體積來確定功效。
圖 20 展示各處理中個別小鼠之腫瘤重量。藉由用測徑規每隔一天量測腫瘤體積來確定功效。
圖 21A-21B 展示腹膜內間隙中CT26-LUC (螢光素酶)腫瘤生長之動力學。在第0天注射CT26細胞株，且在第7天、第10天、第14天及第18天收穫三(3)隻小鼠以確定腫瘤生長動力學。利用IVIS成像器監測腫瘤負荷，圖 21A 第一行量測小鼠體重及ROI。第二行監測各組中個別小鼠之腫瘤的腫瘤重量及ROI。第三行將腫瘤重量與整體ROI或腫瘤ROI相關。圖 21B 展示第18天組中三(3) 隻小鼠之免疫概況以更好地表徵腫瘤微環境。
圖 22A 包括表明在皮下結腸直腸癌小鼠模型中表現IL-12及CCL21a之經工程改造之MSC抑制腫瘤生長的資料；然而，表現CCL21a及IL-36γ或IL-7之MSC的組合不減少腫瘤生長。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中CT26結腸腫瘤之生長的作用。圖 22A 之各線表示個別小鼠。圖 22B 展示各處理組中個別小鼠之腫瘤重量。
圖 23A-23B 包括來自由圖22A-22B表示的實驗的腫瘤免疫浸潤統計資料。三隻小鼠選自PBS、未處理MSC及MSC-IL12+MSC-CCL21a (組合)組，以針對免疫概況腫瘤微環境進行流動式細胞量測術。圖 23A 展示與給與未處理MSC之組相比，組合組中浸潤CD3及CD8細胞毒性T群體顯著增加。圖 23B 展示與用未處理MSC處理之組相比，組合組中粒細胞骨髓來源抑制性細胞(gMDSC)及巨噬細胞群體顯著減少。
圖 24A-24B 包括與由圖 22A-22B 表示之實驗相關的關於免疫百分比及腫瘤重量之資料。圖 24A 及圖 24B 展示具有更多CD3+及CD8+ T細胞之樣品(左上及中央圖)與腫瘤重量下降強烈相關。此等圖亦展示具有較少CD11b骨髓細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞及MDSC之樣品顯示較低腫瘤負荷(圖 24A 之中下圖及右圖及圖 24B 之上一行)。
圖 25A-25B 包括來自腹膜內及皮下結腸直腸癌小鼠模型中之MSC-IL-12+CCL21a療法的資料。測試三批不同的經慢病毒轉導之細胞株的MSC-IL12及CCL21a (TLOO8-3/4、TL019-01/02及TL022-01/02；各TL編號表示一批)。圖 25A 展示在皮下與腹膜內模型中MSC-IL12 + MSC-CCL21a所有三批均可降低腫瘤負荷(前5圖來自SC模型且後3圖來自IP模型)。在第11天收集來自所有小鼠之腫瘤。圖 25B 展示來自各組之平均腫瘤重量。
圖 26A 包括表明在皮下結腸直腸癌小鼠模型中經工程改造之組合處理MSC-IL-12+MSC-CCL21a或MSC-CCL21a+MSC-IFN-β抑制腫瘤生長的資料；然而，表現CCL21a及s41BBL之MSC的組合不減少腫瘤生長。各效應子藉由不同MSC表現，且該等MSC (以1:1比率)組合以用於組合處理。各圖展示單獨或組合的表現所指示免疫療法之經工程改造之MSC對小鼠(n = 6-8)中CT26腫瘤之生長的作用。圖 26A 之各線表示個別小鼠。圖 26B 展示各處理組中個別小鼠之腫瘤重量。MSC-IL12 + MSC-CCL21a展示與注射未處理MSC之小鼠相比功效更佳。在用MSC-IFNb + MSC-CCL21a處理之組中亦觀察到處理功效。
圖 27A-27B 提供來自由圖26A-26B表示之實驗的額外資料。圖 27A-27B 為展示用所指示之經工程改造之MSC處理的各組之免疫概況的圖。在用MSC-IL12 + MSC-CCL21a處理之後觀察到巨噬細胞群體一致下降(圖 27A )。相對於未處理MSC，與用MSC-IL12 + MSC-CCL21a處理之組相比，亦觀察到CD3+群體之浸潤增加及CD11b+群體之浸潤減少的總趨勢(圖 27A 及圖 27B )。
圖 28A-28B 亦提供來自由圖26A-26B表示之實驗的額外資料。圖 28A-28B 展示免疫浸潤與腫瘤重量相關。具有低巨噬細胞及樹突狀細胞之樣品具有較低腫瘤負荷(圖 28B ，中上和右上)。
圖 29 展示將以上來自結腸直腸癌症模型之活體內資料(圖22A及圖26A)組合的圖。來自圖 22A 及圖 26A 之組合CT26資料記錄三組：僅僅腫瘤(PBS)、用未處理MSC處理及用MSC-IL12 + MSC-CCL21a處理。
圖 30A-30B 亦展示來自圖 22A 及圖 26A 之組合資料。圖展示來自流動式細胞量測術實驗資料之免疫浸潤平均數。自圖 30A ，觀察到CD8+T之統計顯著性，此證實MSC-IL12 + MSC-CCL21a能夠使腫瘤微環境恢復極化，且允許更多細胞毒性T細胞浸潤。此外，在用MSC-IL12 + MSC-CCL21a處理之組中CD11b+骨髓群體浸潤減少(圖 30B )。所收集之資料顯示樹突狀細胞及巨噬細胞群體具有統計顯著性。
圖 31 展示pL17D之載體圖。
圖 32 展示單獨或組合的經工程改造以表現不同效應分子之MSC及如藉由BLI水準所評定，其在IP腫瘤模型中降低CT26腫瘤負荷之功效。
圖 33 展示單獨或組合的經工程改造以表現不同效應分子之MSC及如藉由BLI水準所評定，其在IP腫瘤模型中降低B16F10腫瘤負荷之功效。
圖 34 展示用於自單一慢病毒表現載體表現人類IL12 (p70)及人類CCL21a之慢病毒表現載體圖。
圖 35 展示如藉由細胞介素ELISA所評定，經工程改造之hMSC之hIL12 (圖 35A )及hCCL21a (圖 35B )產生。
圖 36A 及 36B 展示transwell分析，如藉由IFNγ產生所評定，該分析顯示由MSC產生之hIL12對T細胞之功能性調節。
圖 37 展示如藉由生物發光成像所評定，在負載IP腫瘤之小鼠的腫瘤中MSC歸巢至腫瘤。圖 37A-D 展示CT26腫瘤模型中之歸巢(圖 37A 中所示之影像、圖 37B 中影像之定量概述)、定量即時PCR (圖 37C )及針對螢火蟲螢光素酶之螢光顯微術(圖 37D )。圖 37E 展示B16F10腫瘤模型中之歸巢(影像之定量概述)。
圖 38 展示在CT26 IP模型中如藉由BLI所評定，表現IL12p70之MSC引起腫瘤負荷減少(上圖及左下圖)，以及藉由腫瘤重量，可偵測之腹膜內腫瘤完全消除(右下圖)。
圖 39 展示在B16F10 IP模型中如藉由BLI所評定，表現IL12p70之MSC引起腫瘤負荷減少(上圖及左下圖)，以及藉由腫瘤重量，可偵測之腹膜內腫瘤完全消除(右下圖)。
圖 40 展示在CT26 IP模型中如藉由BLI所評定，表現IL12p70/CCL21a之MSC引起腫瘤負荷減少(上圖及左下圖)，以及藉由腫瘤重量，可偵測之腹膜內腫瘤完全消除(右下圖)。圖 40A 展示如藉由BLI所評定，經PBS處理(圓形)、MSC-Flag-Myc (「未處理MSC」正方形)及表現IL12p70/CCL21a之MSC (三角形)的平均腫瘤負荷。圖 40B 展示如藉由BLI所評定，個別小鼠中經PBS處理(圓形)、MSC-Flag-Myc (「未處理MSC」正方形)及表現IL12p70/CCL21a之MSC (分別為左圖、中圖及右圖)的平均腫瘤負荷。圖 40C 展示用表現IL12p70/CCL21a之MSC處理延長存活(100%存活超過90天)，而經對照物處理之小鼠至第20天均死亡或處死。
圖 41 展示用表現IL12p70之MSC處理延長存活。
圖 42 展示三種不同的供體(圖 42A ，供體1；圖 42B ，供體2；圖 42C ，供體3)中不同MOI (95000、9500、950或未感染)間經基因工程改造之MSC的相對生長。
圖 43 展示來自2種不同供體之兩種獨立人類BM-MSC細胞株(分別為頂行及底行)，其經含有各種驅動EGFP表現之啟動子的構築體轉導。展示轉導後第25天經工程改造之細胞的GFP百分比(左圖)及MFI (右圖)。
圖 44 展示來自2種不同供體之兩種獨立人類BM-MSC細胞株，其經含有各種驅動EGFP表現之啟動子的構築體轉導。展示針對兩種獨立人類BM-MSC細胞株個別(左圖)或來自兩種獨立人類BM-MSC細胞株組合之資料(右圖)，隨時間追蹤之EGFP MFI (轉導後第7天至第28天)。
圖 45 展示如藉由ELISA所評定，經工程改造之MSC的IL-12p70分泌。
圖 46 展示如藉由ELISA所評定，經工程改造之MSC的IL-21分泌。
圖 47 展示如藉由ELISA所評定，經工程改造之MSC分泌的IL-12p70與IL-21之比率。
圖 48 展示利用STAT4-SEAP報導體，使用HEK-293T細胞，針對IL-12p70之功能報導體分析的結果，以評定經工程改造之MSC的細胞介素產生及分泌。
圖 49 展示在NK-92人類天然殺手細胞中，使用細胞內磷酸流動定量磷酸化STAT1 (左圖)及磷酸化STAT3 (右圖)的針對IL-21之功能報導體分析的結果，以評定經工程改造之MSC的細胞介素產生及分泌。
圖 50 展示使用IL21R-U2OS IL21R/IL2RG二聚報導體，針對IL-12之功能報導體分析的結果，以評定經工程改造之MSC的細胞介素產生及分泌。
圖 51A 展示單獨或組合的經工程改造以表現不同效應分子之MSC及如藉由BLI水準所評定，其在IP腫瘤模型中降低CT26腫瘤負荷之功效。
圖 51B 展示單獨或組合的經工程改造以表現不同效應分子之MSC及如藉由BLI水準所評定，其在IP腫瘤模型中降低B16F10腫瘤負荷之功效。
圖 52 展示如藉由BLI (圖 52A 左圖)及藉由腫瘤重量(圖 52A 右圖)所評定，在CT26模型中使用表現IL12p70之MSC、表現IL21之MSC及表現IL12p70及IL21之MSC之組合進行處理的功效。圖 52B 顯示個別小鼠之BLI螢光素酶量測結果。
圖 53 展示如藉由BLI所評定，使用較低劑量之表現IL12p70之MSC及表現IL12p70及IL21之MSC之組合進行處理的功效。圖 53A ；小鼠個別BLI量測結果-左圖；BLI量測結果概述-右圖)。圖 53B 展示處理組之存活曲線。
圖 54 展示如藉由BLI (圖 54 左圖)及藉由腫瘤重量(圖 54 右圖)所評定，在B16F10模型中使用表現IL12p70之MSC、表現IL21之MSC及表現IL12p70及IL21之MSC之組合進行處理的功效。
圖 55 顯示在B16F10模型中在使用表現IL12p70之MSC、表現IL21之MSC及表現IL12p70及IL21之MSC之組合進行處理後個別小鼠之BLI螢光素酶量測結果。
圖 56 展示接受表現IL12p70之MSC、表現IL21之MSC、表現IL12p70及IL21之MSC之組合、抗PD1或IL12p70與抗PD1之組合的處理組之存活曲線。
圖 57 展示腫瘤再次激發後小鼠之存活曲線。圖 57A 展示未處理小鼠。圖 57B 展示先前接受表現IL12之MSC單獨的處理。圖 57C 展示先前接受表現IL12之MSC及表現IL21之MSC的組合處理的小鼠。
圖 58 展示在CT26腫瘤模型中使用經工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21之mMSC進行處理的劑量依賴性功效。圖 58A 展示第17天相對於第7天標準化的功效之BLI評定概述。圖 58B 及圖 58C 展示個別小鼠隨時間之BLI量測結果。圖 58D 展示處理組之存活曲線。
圖 59 展示在B16F10腫瘤模型中使用經工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21之mMSC進行處理的劑量依賴性功效。圖 59A 展示第17天相對於第7天標準化的功效之BLI評定概述。圖 59B 及圖 59C 展示個別小鼠隨時間之BLI量測結果。圖 59D 展示多次投與較高劑量下個別小鼠隨時間之BLI量測結果。圖 59E 展示處理組之存活曲線。
圖 60 展示MC-38腫瘤模型中使用經工程改造以自單一慢病毒表現載體表現鼠類IL12 (p70)及鼠類IL21之mMSC進行處理的劑量依賴性功效。圖 60A 展示第18天相對於第9天標準化的功效之BLI評定概述。圖 60B 展示個別小鼠隨時間之BLI量測結果。圖 60C 展示處理組之存活曲線。
圖 61 展示人類MSC之優先歸巢。圖 61A 展示概述之螢光素酶定量。圖 61B 展示器官中螢光素酶信號之代表性影像。
圖 62A 展示在OVCAR8模型中腹膜液(各相應時間點之左列)及血清(各相應時間點之右列)中之人類IL12 (左圖)及人類IL21 (右圖)的產生。
圖 62B 展示在CT26模型中腹膜液(各相應時間點之左列)及血清(各相應時間點之右列)中之鼠類IL12 (左圖)及鼠類IL21 (右圖)的短暫產生。
圖 63 展示在CT26模型中用經工程改造以產生細胞介素之MSC處理或者用重組細胞介素療法處理之小鼠的功效。圖 63A 展示MSC-IL12對比rIL12之存活曲線。圖 63B 展示MSC-IL21對比rIL21之存活曲線。圖 63C 展示MSC-IL12/IL21對比rIL12+rIL21之存活曲線。圖 63D 及圖 63E 展示用經工程改造以產生細胞介素之MSC處理或者用重組細胞介素療法處理之小鼠的腫瘤負荷之BLI評定。
圖 64 展示在B16F10模型中用經工程改造以產生細胞介素之MSC處理或者用重組細胞介素療法處理之小鼠的功效。圖 63A 展示用經工程改造以產生細胞介素之MSC處理或者用重組細胞介素療法處理之小鼠的腫瘤負荷之腫瘤重量評定。圖 64B 展示處理組之存活曲線。
圖 65 展示在CT26 IP腫瘤模型中在用產生IL12及IL21兩者之MSC處理後小鼠的免疫概況。所示結果為用於表徵對處理作出反應之免疫浸潤的多色流動式細胞量測術分析。圖 65A 及圖 65B 展示T細胞子集及活化標記物(CD3、CD4、CD8、CD8/CD38+、CD8/IFNg+、CD8/Gzmb+、NK/Gzmb+及比率CD8:Treg-FoxP3)。圖 65C 展示諸如樹突狀細胞之抗原呈遞細胞之免疫概況。
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Claims (29)

  1. 一種經工程改造之細胞，其包含： a)      啟動子；及 b)      外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子， 且其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項之經工程改造之細胞，其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得該等多核苷酸能夠轉錄為包含該式S1-E1-L-S2-E2之單一多核苷酸。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列與該第一效應分子及該第二效應分子轉譯為不同的多肽可操作地相關聯。
  4. 如申請專利範圍第3項之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列編碼2A核糖體跳躍標籤或編碼內部核糖體進入位點(IRES)，視情況其中當該連接子多核苷酸序列編碼2A核糖體跳躍標籤時，該2A核糖體跳躍標籤係選自由以下組成之群：P2A、T2A、E2A及F2A。
  5. 如申請專利範圍第1項之經工程改造之細胞，其中該連接子多核苷酸序列編碼第二啟動子， 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得包含式S1-E1之第一多核苷酸能夠得以轉錄， 其中該第二啟動子可操作地連接於該表現盒，以使得包含式S2-E2之第二多核苷酸能夠得以轉錄，且其中該第一多核苷酸及該第二多核苷酸為不同的多核苷酸。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞為人類細胞，視情況其中該人類細胞自選自由以下組成之群的組織分離：骨髓、脂肪組織、臍帶、胎肝、肌肉及肺組織。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之經工程改造之細胞，其中該經工程改造之細胞為MSC，且其中MSC包含：包含CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-、CD14-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD11b-、CD79α-之細胞標記物表型；包含CD105+、CD73+、CD90+、CD19-、II類HLA-之細胞標記物表型；或包含CD73+、CD90+、CD105+及CD166+、CD11b-、CD14-、CD19-、CD34-、CD45-及HLA-DR-之細胞標記物表型。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之經工程改造之細胞，其中該啟動子及/或該第二啟動子包含組成型啟動子，視情況其中該組成型啟動子係選自由以下組成之群：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb及hUBIb。
  9. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之經工程改造之細胞，其中該啟動子及/或該第二啟動子包含誘導型啟動子，視情況其中該誘導型啟動子係選自由以下組成之群：minP、NFkB反應元件、CREB反應元件、NFAT反應元件、SRF反應元件1、SRF反應元件2、AP1反應元件、TCF-LEF反應元件啟動子融合物、缺氧反應元件、SMAD結合元件、STAT3結合位點、誘導分子反應型啟動子及其串聯重複序列。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之經工程改造之細胞，其中該第一信號肽或該第二信號肽分別包含對於該第一效應分子或該第二效應分子而言為天然的天然信號肽。
  11. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之經工程改造之細胞，其中該第一信號肽或該第二信號肽分別包含對於該第一效應分子或該第二效應分子而言非天然的非天然信號肽，視情況其中該非天然信號肽係選自由以下組成之群：IL12、IL2、最佳化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯螢光素酶(Gaussia luciferase)、CD5、人類IgKVII、鼠類IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青殺素前蛋白(azurocidin preprotein)、骨結合素(osteonectin)、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保護素(osteoprotegerin)、絲胺酸蛋白酶抑制劑E1 (serpin E1)、GROα、CXCL12及IL21。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之經工程改造之細胞，其中該第一信號肽及該第二信號肽為相同的。
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之經工程改造之細胞，其中各效應分子係獨立地選自治療類別，其中該治療類別係選自由以下組成之群：細胞介素、趨化介素、生長因子、共活化分子、腫瘤微環境調節劑、受體、配位體、抗體、多核苷酸、肽及酶，視情況其中該第一效應分子及該第二效應分子之該治療類別為不同的，視情況其中該第一效應分子及/或該第二效應分子為經修飾之效應分子，其在表現時繫栓至該經工程改造之MSC之細胞膜。
  14. 如申請專利範圍第13項之經工程改造之細胞，其中： i)       該細胞介素係選自由以下組成之群：IL12、IL12p70融合蛋白、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干擾素及干擾素-γ； ii)      該趨化介素係選自由以下組成之群：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合蛋白、CCL19、CXCL9及XCL1； iii)     該生長因子係選自由以下組成之群：Flt3L及GM-CSF； iv)     該共活化分子係選自由以下組成之群：4-1BBL及CD40L；且 v)      該腫瘤微環境調節劑係選自由以下組成之群：腺苷去胺酶、TGFβ抑制劑、免疫檢查點抑制劑、VEGF抑制劑及HPGE2， 視情況其中該TGFβ抑制劑係選自由以下組成之群：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗體、TGFb-TRAP及其組合， 視情況其中該等免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體，且 視情況其中該等VEGF抑制劑包含抗VEGF抗體、抗VEGF肽或其組合。
  15. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之經工程改造之細胞，其中該第一效應分子包含IL12p70融合蛋白且該第二效應分子包含CCL21a、IL7、IL15、IL21、Flt3L、抗PD1抗體、CD40L或CXCL10-CXCL11融合蛋白。
  16. 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之經工程改造之細胞，其中該表現盒在E2之後進一步包含額外外源性多核苷酸序列，該外源性多核苷酸序列包含下式，自5’至3’定向，該式包含：(L-S-E)X 其中 S包含編碼信號肽之多核苷酸序列， E包含編碼效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， X = 1至20 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，且其中對於各X而言，對應的該信號肽與該效應分子可操作地相關聯， 視情況其中該等額外效應分子中之一或多者包含IL15、Flt3L、抗PD1抗體、腺苷去胺酶、CD40L、CXCL10-CXCL11融合蛋白及/或XCL1。
  17. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之經工程改造之細胞，其中構築體包含：  a)      SFFV啟動子；及 b)      外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶(Furin)識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽； E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子， 視情況其中該構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
  18. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之經工程改造之細胞，其中該外源性多核苷酸序列包含一或多個病毒載體多核苷酸序列，視情況其中該一或多個病毒載體多核苷酸序列包含慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子或腺病毒多核苷酸序列。
  19. 一種細胞群體，其中該細胞群體包含一或多種如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之經工程改造之細胞。
  20. 一種醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之經工程改造之細胞或如申請專利範圍第19項之細胞群體。
  21. 一種減小個體中之腫瘤體積的方法，該方法包括向具有腫瘤之個體遞送包含如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之經工程改造之細胞、如申請專利範圍第19項之細胞群體或如申請專利範圍第20項之醫藥組合物中之任一者的組合物，視情況其中該經工程改造之細胞對於該個體為同種異體的。
  22. 一種誘導個體中之免疫反應的方法，該方法包括投與治療有效劑量的如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之經工程改造之細胞、如申請專利範圍第19項之細胞群體或如申請專利範圍第20項之醫藥組合物中之任一者，視情況其中該經工程改造之細胞對於該個體為同種異體的。
  23. 一種外源性多核苷酸序列，其包含啟動子及下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子。
  24. 如申請專利範圍第23項之外源性多核苷酸，其中該外源性多核苷酸包含包括SFFV啟動子及下式所述之表現盒的序列，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列，其中該第一信號肽為人類IL12信號肽； E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列，其中該第一效應分子為人類IL12p70融合蛋白； L包含連接子多核苷酸序列，其中該連接子多核苷酸序列編碼弗林蛋白酶識別多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列及T2A核糖體跳躍標籤，自N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向； S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列，其中該第二信號肽為人類IL21信號肽； E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，其中該第二效應分子為人類IL21；且 其中該SFFV啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，視情況其中該多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
  25. 一種誘導個體中之免疫反應的方法，該方法包括以有效誘導免疫反應之量向個體遞送包含經工程改造以產生調節腫瘤介導之免疫抑制機制之多種效應分子之細胞的組合物，其中各經工程改造之細胞包含： a)      啟動子；及 b)      外源性多核苷酸序列，其包含下式所述之表現盒，自5’至3’定向，該式包含：S1-E1-L-S2-E2 其中 S1包含編碼第一信號肽之多核苷酸序列， E1包含編碼第一效應分子之多核苷酸序列， L包含連接子多核苷酸序列， S2包含編碼第二信號肽之多核苷酸序列， E2包含編碼第二效應分子之多核苷酸序列，且 其中該啟動子可操作地連接於該表現盒，該第一信號肽可操作地連接於該第一效應分子，且該第二信號肽可操作地連接於該第二效應分子，且 其中該經工程改造之細胞係選自由以下組成之群：間葉幹細胞(MSC)、幹細胞、免疫細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天淋巴樣細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、肥大細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、骨髓細胞、樹突狀細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、病毒特異性T細胞、γ-δ T細胞、T調控細胞及B細胞。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中構築體包含SEQ ID NO: 144中所示之多核苷酸序列。
  27. 一種誘導個體中之免疫反應的方法，該方法包括以有效誘導免疫反應之量向個體遞送能夠對細胞進行工程改造以產生調節腫瘤介導之免疫抑制機制之多種效應分子的組合物，其中該組合物包含如申請專利範圍第23項或第24項之外源性多核苷酸。
  28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該組合物包含選自由以下組成之群的遞送系統：病毒系統、轉座子系統及核酸酶基因組編輯系統， 視情況其中該病毒系統係選自由以下組成之群：慢病毒、逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子及腺病毒，且 視情況其中該核酸酶基因組編輯系統係選自由以下組成之群：鋅指系統、TALEN系統及CRISPR系統。
  29. 如申請專利範圍第25項至第28項中任一項之方法，其中該方法進一步包括投與檢查點抑制劑及/或抗CD40抗體，視情況其中該檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-1L抗體或抗CTLA-4抗體。
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