CN117778327A - 工程化的间充质干细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种工程化的间充质干细胞(MSC)、包含其的药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的用途。所述间充质干细胞(MSC)含有导入的NQO1蛋白编码序列和/或导入的缺氧反应元件(HRE)，和编码一种或多种免疫刺激细胞因子的核酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种工程化的基因修饰的间充质干细胞(MSC)及其在表达免疫刺激性细胞因子以用于肿瘤免疫治疗的用途。
背景技术
癌症是人类健康的重大威胁疾病，由于癌细胞的增殖或分化异常，导致功能异常、细胞生长不受调控、局部组织侵袭和转移。癌细胞由于基因突变表达特异的肿瘤新生抗原，可以被免疫T淋巴细胞识别和杀伤，这是肿瘤免疫治疗的基础。但是肿瘤进化出多种机制，包括上调抑制性免疫检查点分子、召集抑制性髓系细胞等，形成免疫抑制的微环境。经历免疫治疗，缺乏T淋巴细胞生长因子(IL-2、IL-15等)维持刺激或再激活能够导致T淋巴细胞失能和肿瘤复发。作为T淋巴细胞和NK细胞的激动分子，IL-2是FDA批准的第一个细胞因子，用于治疗迁移性黑色素瘤和肾癌。然而，临床应用IL-2治疗癌症一直面临半衰期短和剂量依赖的严重毒副作用。更重要的是IL-2还能扩增免疫抑制性的调节性T细胞(Treg)，限制其抗肿瘤效果。为了克服这些问题，人们尝试了多种策略构建选择性扩增效应T细胞而不扩增Treg的IL-2变体。然而，全身性施用IL-2变体可能倾向性扩增淋巴组织和非肿瘤组织的T细胞和NK细胞，导致严重的毒性。因此，如何将例如IL-2或IL-2变体等细胞因子特异性地递送到肿瘤微环境以有效激活扩增淋巴细胞并避免外周毒性，是当前的一个重要课题。
在实体肿瘤组织内，基质细胞和肿瘤细胞、免疫细胞之间相互作用形成复杂的肿瘤微环境(TME)。MSC是肿瘤相关的基质细胞的重要来源。很多情况下，注射到动物体内的MSC展示出了肿瘤归巢能力。一方面MSC能够促进肿瘤进展，抑制炎症和免疫应答。另一方面，由于肿瘤多效性，MSC具有重大的潜力成为递送或者生产抗肿瘤分子的细胞载体。最近的某些研究报道了利用基因修饰的MSC治疗肿瘤的策略。然而MSC用于肿瘤治疗面临如下重要挑战：一是怎样将免疫抑制性的MSC转化为具有抗肿瘤能力的MSC；二是怎样使MSC在肿瘤内特异表达抗肿瘤因子避免外周表达引起的毒副作用；此外，移植的MSC在体内的存活时间较短，也会影响MSC在临床的使用。因此，使基因修饰的MSC能够提高其体内存活期并且能够可调控地产生肿瘤治疗因子、从而发挥在肿瘤局部激活抗肿瘤免疫应答的作用，是其应用于临床所必需的。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，发明人对MSC进行了精准化改造，获得了一种基因修饰的MSC，其具有增强的肿瘤治疗能力、更强的体内存活能力和在肿瘤组织内特异性表达目标基因产物的能力，从而完成了本发明。
在第一方面，本发明提供一种工程化的间充质干细胞(MSC)，其基因组包含导入的NQO1蛋白编码序列。在一个实施方式中，导入的NQO1蛋白编码序列使所述工程化的MSC能够过表达NQO1蛋白。所述NQO1蛋白的过表达能够延长所述工程化的MSC在肿瘤组织内的存活时间。在一个实施方式中，所述NQO1蛋白编码序列通过慢病毒载体转染、腺病毒载体转染、或mRNA转染而导入MSC的基因组中以得到所述工程化的MSC。在一个实施方式中，所述工程化的MSC的基因组还包含导入的调控元件和目标基因，其中，所述目标基因的表达受所述调控元件调控。
在第二方面，本发明提供一种工程化的MSC，其基因组包含导入的缺氧反应元件(HRE，hypoxia response element)，及可选的位于HRE下游的导入的调控元件和目标基因，所述目标基因的表达受所述调控元件调控。所述HRE能够在肿瘤组织内的缺氧环境下激活下游调控元件(例如启动子)，从而促进所述调控元件后的基因的表达。在一个实施方式中，所述HRE通过慢病毒载体转染、腺病毒载体转染、或者mRNA转染而导入所述工程化的MSC的基因组中。在一个实施方式中，所述HRE及其下游的调控元件(例如启动子)和目标基因通过慢病毒载体转染、腺病毒载体转染、或者mRNA转染而一起导入所述工程化的MSC的基因组中。在一个实施方式中，在所述工程化的MSC的基因组中，所述HRE及其下游的所述调控元件和目标基因可操作地连接。在一个实施方式中，所述HRE的序列来自Eno1、Epo、VEGF-A、PGK、Ldha、ALDA和GAPDH基因中的任一种，优选选自SEQ ID No:2和SEQ ID No:6-11，更优选为来自Eno1基因的SEQ ID No:2。
在第三方面，本发明提供一种工程化的MSC，其基因组包含(i)导入的NQO1蛋白编码序列和(ii)导入的缺氧反应元件(HRE)。在一个实施方式中，所述工程化的MSC的基因组还包含所述HRE下游的导入的调控元件和目标基因，所述目标基因的表达受所述调控元件调控。在一个实施方式中，在所述工程化的MSC的基因组中，所述HRE及其下游的所述调控元件和目标基因可操作地连接。
在上述任意实施方式中，当工程化的MSC还包含调控元件和目标基因时，所述调控元件可以包含启动子。
在上述任意实施方式中，当工程化的MSC还包含调控元件和目标基因时，所述目标基因可以编码抗肿瘤蛋白，例如免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。在一个实施方式中，所述目标基因编码IL-2、IL-1、IL-7、IL-21、IL-12、IL-15及其变体中的任一种。在一个实施方式中，IL-1是IL-1β。在一个实施方式中，IL-2变体是sumIL2。
本发明的工程化MSC能够利用MSC作为载体，将免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子特异性地递送到肿瘤微环境中，从而提高抗肿瘤效果，同时可避免所述细胞因子在全身施用时引起的外周毒副作用。此外，并未观察到本发明的工程化MSC有任何促肿瘤发生活性。
本发明的第四方面还提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含第一至第三方面任一方面的工程化的MSC，所述工程化的MSC的基因组还包含所述导入的调控元件和目标基因，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。在一个实施方式中，所述药物组合物还包含免疫检查点抑制剂和/或特异性识别肿瘤细胞的过继性T细胞。
本发明的第五方面还提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的第一至第三方面任一方面的工程化的MSC，所述工程化的MSC的基因组还包含所述导入的调控元件和目标基因，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。在一个实施方式中，所述受试者是人。在一个实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。在一个实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用过继性T细胞疗法(ACT)。
本发明的第六方面还提供第一至第三方面任一方面的工程化的MSC在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中，所述工程化的MSC的基因组还包含所述导入的调控元件和目标基因，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。在一个实施方式中，所述药物还包含第二抗癌剂，例如免疫检查点抑制剂和/或特异性识别肿瘤细胞的过继性T细胞。
在第四至第六方面的各实施方式中，所述调控元件可以包含启动子。在一个实施方式中，所述启动子是SV40启动子。在一个实施方式中，在所述工程化的MSC中，所述HRE、所述调控元件和目标基因可操作地连接。在一个实施方式中，所述目标基因编码IL-2、IL-1、IL-7、IL-21、IL-12、IL-15及其变体中的任一种。在一个实施方式中，IL-1是IL-1β。在一个实施方式中，IL-2变体是sumIL2。在一个实施方式中，所述癌症可以选自B细胞淋巴瘤、支气管癌、前列腺癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌、喉癌、唾液腺癌、胸腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪癌、睾丸癌、恶性纤维组织细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、小肠癌或阑尾癌、鳞状细胞癌、乳腺癌和卵巢癌。
本发明还提供第一至第三方面任一方面所述的工程化的间充质干细胞作为载体用于递送目标基因的用途。在一个实施方式中，所述载体用于向肿瘤组织递送所述目标基因。在一个实施方式中，所述目标基因是肿瘤治疗基因，优选为编码免疫刺激性蛋白或抗肿瘤蛋白的基因，更优选为编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子的基因，例如上文所述的具体细胞因子。
在本发明的其他方面，还提供了NQO1蛋白用于增强间充质干细胞在肿瘤组织内的存活期的用途；缺氧反应元件(HRE)用于增强间充质干细胞中的目标基因在缺氧环境下的表达的用途；以及NQO1蛋白编码序列与缺氧反应元件(HRE)联合用于制备包含携带目标基因的间充质干细胞的药物组合物的用途。在一个实施方式中，所述缺氧环境是肿瘤内微环境。在一个实施方式中，所述间充质干细胞的基因组包含：(i)导入的NQO1蛋白编码序列，和/或(ii)导入的所述缺氧反应元件以及所述缺氧反应元件下游的导入的调控元件和所述目标基因，并且所述目标基因的表达受所述调控元件调控。
附图说明
现将结合附图来描述本发明的具体实施方式，但附图和下文的具体实施方式都不应解读为对本发明的范围的限制，在附图中：
图1示出了表达NQO1的工程化MSC在肿瘤微环境内的存活数量。(a)为流式细胞术分析结果代表图；(b)为单位重量的肿瘤组织内的MSC存活数量；
图2示出了HRE工程化的MSC对目标基因的表达的影响。(a)为HRE的作用机理示意图；(b)带有IL-1β基因的NQO1/HRE工程化的MSC在常氧和缺氧条件下的IL-1β表达；(c)带有sumIL-2(SIL-2)基因的NQO1/HRE工程化的MSC在常氧和缺氧条件下的SIL-2表达；(d)带有sumIL-2(SIL-2)基因的非工程化MSC、NQO1工程化MSC、NQO1/HRE工程化MSC的抗肿瘤效果；
图3示出了表达SIL2的NQO1/HRE工程化MSC(MSC-NQO1-HRE-SIL2)特异性地在肿瘤组织中表达SIL2。(a)瘤内(i.t.)或瘤旁(p.t.)注射SIL2-Fc蛋白或表达SIL-2的NQO1/HRE工程化MSC后肿瘤中的SIL2水平；(b)瘤内(i.t.)或瘤旁(p.t.)注射SIL2-Fc蛋白或表达SIL-2的NQO1/HRE工程化MSC后血清中的SIL2水平；(c)瘤内(i.t.)或瘤旁(p.t.)注射SIL2-Fc蛋白或表达SIL-2的NQO1/HRE工程化MSC后血清中的IFNγ水平；(d)瘤内(i.t.)或瘤旁(p.t.)注射SIL2-Fc蛋白或表达SIL-2的NQO1/HRE工程化MSC后小鼠的体重变化；其中对照是瘤内注射磷酸盐缓冲液(PBS)。
图4示出了不同剂量的SIL2蛋白和表达SIL2的工程化MSC(MSC-NQO1-HRE-SIL2)细胞对肿瘤体积的影响。其中对照是注射磷酸盐缓冲液(PBS)。
图5示出了注射对照(PBS)、不含肿瘤抑制细胞因子的工程化MSC(MSC-NQO1)、表达野生型IL-2(wtIL2)的工程化MSC和表达SIL2的工程化MSC后肿瘤内的Ki67+CD8+T细胞比例(a)、CD8+T细胞与Treg细胞数量之比(b和c)。统计学显著性：ns-不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6示出了表达SIL2的工程化MSC(MSC-NQO1-HRE-SIL2)和/或免疫检查点抑制剂对荷瘤小鼠的肿瘤体积和生存的影响。用对照MSC(MSC-NQO1，无HRE和SIL2)(●)、对照MSC+免疫检查点抑制剂(■)、MSC-NQO1-HRE-SIL2(▲)、MSC-NQO1-HRE-SIL2+免疫检查点抑制剂(▼)注射后小鼠的肿瘤体积(a)和生存期(b)。统计学显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图7示出了在肿瘤局部的表达SIL2的工程化MSC(MSC-NQO1-HRE-SIL2)对远端肿瘤的影响。在荷瘤小鼠的右侧肿瘤瘤内注射对照MSC(MSC-NQO1，无HRE和SIL2)或MSC-NQO1-HRE-SIL2后，(a)右侧肿瘤的体积变化；(b)左侧肿瘤的体积变化。
图8示出了表达SIL2的工程化MSC(MSC-NQO1-HRE-SIL2)与过继细胞疗法(ACT)联用对晚期肿瘤的效果。在用对照MSC(MSC-NQO1)、MSC-NQO1-HRE-SIL2、对照MSC+两种浓度的ACT、以及MSC-NQO1-HRE-SIL2+低浓度ACT处理肿瘤后的肿瘤体积变化(a)和存活百分比(b)。统计学显著性：***p<0.001，****p<0.0001(双因素ANOVA(a)，对数秩检验(b))。
图9示出了表达IL1β的工程化MSC(MSC-NQO1-HRE-IL1β)特异性地在肿瘤组织中表达IL1β。(a)瘤内注射IL1β蛋白或MSC-NQO1-HRE-IL1β后肿瘤、各器官和血清中的IL1β水平；(b)瘤内注射PBS对照、IL1β蛋白或MSC-NQO1-HRE-IL1β后血清中炎症因子参数水平；(c)瘤内注射PBS对照、IL1β蛋白或MSC-NQO1-HRE-IL1β后小鼠的体重变化；(d)瘤内注射PBS对照、IL1β蛋白或MSC-NQO1-HRE-IL1β后小鼠的肿瘤体积变化；统计学显著性：ns-不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
术语和定义
在本发明中，“导入的NQO1蛋白编码序列”是指通过遗传修饰手段将编码NQO1蛋白的核酸序列导入靶细胞(例如MSC)的基因组中，从而与天然存在于该细胞基因组中的NQO1基因区分开。所述NQO1蛋白编码序列例如可以是人NQO1蛋白(例如NCBI序列NP_000894.1)的编码序列，也可以是小鼠NQO1蛋白的编码序列(例如SEQ ID No:1)或其他哺乳动物的NQO1蛋白的编码序列，但不限于此。
在本发明中，“导入的缺氧反应元件(HRE)”是指通过遗传修饰手段将缺氧反应元件(HRE)导入靶细胞(例如MSC)的基因组中，从而与在天然存在于该细胞基因组中的HRE区分开。在导入的HRE之后，通常在其下游可操作地连接调控元件和目标基因，以促进所述目标基因在缺氧环境下特异的表达。所述HRE的序列可以来源于人或小鼠，可以来源于Eno1、Epo、VEGF-A、PGK、Ldha、ALDA和GAPDH等基因，其序列可以是例如来自Eno1的SEQ ID No:2。
本发明中，工程化所用的“间充质干细胞(MSC)”可以是哺乳动物来源的MSC，例如人、大鼠或小鼠来源的MSC，例如它们的骨髓来源的MSC，但不限于此。
在本发明中，“sumIL-2”或“SIL-2”可以互换使用，是指IL-2的一种突变形式，其在野生型IL-2的基础上含有F42A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F突变。
本文中，将表达目标基因的NQO1/HRE双工程化的MSC表示为“MSC-NQO1-HRE-(目标基因)”。例如，当目标基因是SIL-2时，将表达该SIL-2的NQO1/HRE工程化MSC表示为“MSC-NQO1-HRE-SIL2”。类似地，例如，“MSC-NQO1”表示仅用NQO1工程化的MSC，但不含HRE和受HRE调控的目标基因；“MSC-NQO1-SIL2”表示用NQO1工程化的包含导入的SIL-2基因的MSC，但未用HRE工程化；“MSC-SIL2”表示含有导入的SIL2基因但未用NQO1或HRE工程化的MSC。
以下描述本发明的多个实施方式，本领域技术人员能够理解，这些实施方式并不限制本发明的范围，而是可以变型为本领域技术人员能够预见的等同实施方式并相互组合。
I.NQO1工程化的MSC
本发明首先提供一种工程化的间充质干细胞(MSC)，其基因组包含导入的NQO1蛋白编码序列。NQO1是指NAD(P)H:醌氧化还原酶1。本发明为促进过继转移的治疗性MSC在肿瘤组织中的存活，在MSC中过表达NQO1。发明人惊讶地发现，与未工程化的MSC相比，本发明的过表达NQO1的工程化MSC在肿瘤微环境中的存活期显著延长(见图1)，这使得MSC作为肿瘤内的细胞载体的可用性大大增加，用于例如在肿瘤内更持久或更稳定地递送或者生产抗肿瘤分子或其他功能性分子。本发明的工程化MSC中的所述NQO1蛋白编码序列可以是任何NQO1蛋白的编码序列，例如人NQO1或小鼠NQO1蛋白的编码序列(例如SEQ ID No:1)，但本发明不限于此。
将NQO1蛋白编码序列导入MSC基因组中的方法可以包括将包含NQO1蛋白编码序列的载体(例如慢病毒载体或腺病毒载体)通过转染、转导、感染或其他方式导入MSC中，也可以采用例如mRNA转染或CRISPR Cas9系统等基因编辑方法将NQO1蛋白编码序列插入MSC的基因组中，但本发明不限于此。
在一个实施方式中，所述工程化的MSC的基因组还包含导入的调控元件和目标基因，其中，所述目标基因的表达受所述调控元件调控，所述目标基因可以是任何基因。在一个实施方式中，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。在一个实施方式中，所述目标基因编码T细胞刺激因子IL-2、IL-1、IL-7、IL-21、IL-12、IL-15及其变体中的任一种。在一个实施方式中，IL-1是IL-1β。在一个实施方式中，IL-2变体是sumIL2(SIL2)。在一个实施方式中，当将该工程化的MSC施用至肿瘤中时，所述目标基因可以表达产生抗肿瘤因子以发挥特定的抗肿瘤功能，而该工程化的MSC由于具有延长的寿命而能够增强该抗肿瘤因子的抗肿瘤效果。
II.HRE工程化的MSC
本发明还提供一种工程化的MSC，其基因组包含导入的缺氧反应元件(HRE)，及可选的位于HRE下游的导入的调控元件和目标基因，所述目标基因的表达受所述调控元件调控。发明人发现，在肿瘤组织内的低氧环境下，所述HRE与缺氧累积表达的HIF1α结合后能够激活下游调控元件(例如启动子)，从而可以大大促进所述调控元件下游的基因的表达(见图2)。这可以显著增加MSC作为细胞载体在肿瘤内递送或者生产抗肿瘤分子或其他功能性分子的能力和效率。在一个实施方式中，所述调控元件包含启动子。在一个实施方式中，所述启动子是SV40启动子。在一个实施方式中，所述工程化的MSC包含可操地连接的HRE、所述调控元件和所述目标基因。
所述目标基因可以是任何基因。在一个实施方式中，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。在一个实施方式中，所述目标基因编码IL-2、IL-1、IL-7、IL-21、IL-12、IL-15及其变体中的任一种。在一个实施方式中，IL-1是IL-1β。在一个实施方式中，IL-2变体是sumIL2(SIL2)，其抗肿瘤效果优于野生型IL-2(见图5)。
将HRE、调控元件(例如启动子)和所要表达的目标基因导入MSC基因组中的方法可以包括将包含这些核酸序列的载体(例如慢病毒载体或腺病毒载体)通过转染、转导、感染或其他方式导入MSC中，也可以采用mRNA转染或CRISPR/Cas9系统等基因编辑方法将这些核酸序列插入MSC的基因组中，但本发明不限于此。在一个实施方式中，所述HRE及其下游的调控元件(例如启动子)和目标基因以可操作地连接的方式被一起构建在慢病毒载体中，然后用该慢病毒载体转染所述工程化的MSC。
III.NQO1/HRE工程化的MSC
本发明还提供一种工程化的MSC，其基因组包含(i)导入的NQO1蛋白编码序列，以及(ii)导入缺氧反应元件(HRE)，以及可选的所述HRE下游的调控元件和目标基因，所述目标基因的表达受所述调控元件调控。在一个实施方式中，所述调控元件包含启动子。在一个实施方式中，所述启动子是SV40启动子。在一个实施方式中，在所述工程化的MSC中，所述HRE、调控元件和目标基因可操作地连接。在一个实施方式中，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。在一个实施方式中，所述目标基因编码IL-2、IL-1、IL-7、IL-21、IL-12、IL-15及其变体中的任一种。在一个实施方式中，IL-1是IL-1β。在一个实施方式中，IL-2变体是sumIL2。
将NQO1、HRE、调控元件(例如启动子)和所要表达的目标基因导入MSC基因组中的方法与上文所述相同。在一个实施方式中，所述NQO1蛋白编码序列、所述HRE及其下游的调控元件(例如启动子)和目标基因可以被一起构建在慢病毒载体中，其中HRE、调控元件和目标基因可操作地连接，而NQO1编码序列可以不与它们可操作地连接，而是受独立启动子的调控；然后可以用该慢病毒载体转导MSC。
本发明的NQO1/HRE工程化MSC能够利用MSC作为载体，将免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子(例如IL-1、IL-2)特异性地递送到肿瘤微环境中，相对于未工程化的表达该细胞因子的MSC和向肿瘤直接施用该细胞因子具有更佳的抗肿瘤效果(见图2、图4)，同时，该工程化MSC所表达的免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子基本局限于肿瘤内部，可避免所述细胞因子在全身施用时引起的外周毒副作用(见图3)，但其抗肿瘤效果并不局限于其所施用的肿瘤局部位点，而是对远端肿瘤的生长也具有抑制作用(图7)，这是由于其所激活和扩增的T细胞迁移到远端肿瘤发生了抗肿瘤作用。此外，发明人还发现，本发明的表达IL-2的NQO1/HRE工程化MSC还可以提高免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果(图6)，从而具有适用于具有免疫检查点阻断(ICB)疗法抗性的晚期肿瘤的前景；而且还可以扩增过继的抗肿瘤T细胞，提高过继细胞治疗冷肿瘤的效果(图8)。
然而，本发明的NQO1/HRE工程化MSC作为细胞载体所递送或生产的免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子并不限于IL-2，而是可以用于表达任意具有免疫刺激性或抗肿瘤效果的细胞因子，例如IL-1β等。这是因为NQO1独立地增强MSC在肿瘤微环境内的生存能力，且HRE对下游调控元件和目标基因的表达促进作用依赖于肿瘤微环境中的缺氧环境。本申请已证实当目标基因为IL-1β时，其同样能够以显著水平表达且相对于集中于肿瘤内、外周毒性较低，并且抑瘤效果优于单独注射IL-1β蛋白的情况(图9)。
IV.药物组合物
本发明还提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含工程化的MSC，所述工程化的MSC的基因组包含(i)导入的NQO1蛋白编码序列，和/或(ii)导入的缺氧反应元件(HRE)、所述HRE下游的调控元件和目标基因，其中，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。
在一个实施方式中，所述药物组合物还包含免疫检查点抑制剂，例如抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体。在一个实施方式中，所述药物组合物还包含特异性识别肿瘤细胞的过继性T细胞。
V.治疗癌症的方法
本发明还提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的工程化的MSC，所述工程化的MSC的基因组包含(i)导入的NQO1蛋白编码序列，和/或(ii)导入的缺氧反应元件(HRE)、所述HRE下游的调控元件和目标基因，其中，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。
在一个实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体。在一个实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用过继性T细胞疗法(ACT)，例如CAR-T细胞疗法、TIL疗法和TCR-T疗法。在一个实施方式中，所述受试者是人。
VI.制药用途
本发明还提供工程化的MSC在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述工程化的MSC的基因组包含(i)导入的NQO1蛋白编码序列，和/或(ii)导入的缺氧反应元件(HRE)、所述HRE下游的调控元件和目标基因，其中，所述目标基因编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。
在一个实施方式中，所述药物还包含免疫检查点抑制剂，例如抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体。在一个实施方式中，所述药物还包含特异性识别肿瘤细胞的过继性T细胞。
在上述药物组合物、治疗癌症的方法和制药用途的实施方式中，所述调控元件可以包含启动子。在一个实施方式中，所述启动子是SV40启动子。在一个实施方式中，在所述工程化的MSC中，所述HRE、调控元件和目标基因可操作地连接。在一个实施方式中，所述目标基因编码IL-2、IL-1、IL-7、IL-21、IL-12、IL-15及其变体中的任一种。在一个实施方式中，IL-1是IL-1β。在一个实施方式中，IL-2变体是sumIL2。在一个实施方式中，所述癌症可以选自B细胞淋巴瘤、支气管癌、前列腺癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌、喉癌、唾液腺癌、胸腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪癌、睾丸癌、恶性纤维组织细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、小肠癌或阑尾癌、鳞状细胞癌、乳腺癌和卵巢癌。
实施例
以下将借助实施例来进一步详细描述本发明的实施方式，但应当理解，提供这些实施例仅是为了进行具体说明，并不以任何方式限制本发明的范围。
材料和方法
1.小鼠
C57BL/6J、BALB/c、C57BL/6J-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J(OT1 TCR transgenic)小鼠，6-8周龄，购自Jackson Laboratory。小鼠饲养在SPF环境，所有动物实验符合清华大学实验动物管理实施细则。
2.细胞系和试剂材料
MC38(小鼠结肠癌细胞)、CT26(小鼠结肠癌细胞)和B16F10(小鼠皮肤黑色素瘤细胞)细胞系购自American Type Culture Collection(ATCC)。MC38-OVA和B6-OVA细胞系由表达鸡OVA蛋白基因的慢病毒转染MC38或B16F10获得。细胞系培养基为DMEM培养基(含10％热失活的胎牛血清(FBS)，100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素)，培养条件为37℃，5％CO2。抗PD-L1抗体(Atezolizumab)和抗CTLA-4抗体(9D9)购自BioXCell公司。
3.骨髓来源的MSC细胞的分离、培养和病毒转染
从6-8周的雌性C57BL/6J或BALB/c小鼠分离骨髓细胞，用含有1uM GW2580的Mesencult Expansion Media(Stemcell Technologies)培养基重悬种植在10cm细胞培养皿中，在缺氧条件(1％氧气浓度)下培养。24小时后，通过换液移除未黏附在培养皿底部的细胞。每隔3天更换新鲜培养基，当细胞密度达到60％时做1:3传代。MSC细胞通过流式细胞术检测阳性和阴性表面特征分子的表达进行鉴定。
用表达EGFP基因或EGFP+小鼠NQO1蛋白编码基因(SEQ ID No:1)的慢病毒转染活MSC细胞，通过流式分选EGFP阳性得到MSC-EGFP或MSC-EGFP-NQO1细胞。
缺氧应答原件(HRE)(SEQ ID No:2)和minimal SV40启动子(SEQ ID No:3)从HIF-1reporter p2.1质粒通过PCR获得，将sumIL2编码序列克隆连接到HRE-SV40序列之后放入慢病毒载体，包装成慢病毒后转染MSC分选得到MSC-NQO1-HRE-SIL2或MSC-HRE-SIL2。SIL2的表达通过ELISA来检测。含有来自Epo、VEGF-A、PGK、Ldha、ALDA或GAPDH等基因的HRE的慢病毒载体可以用类似的方法获得。
4.小鼠肿瘤模型建立和治疗
将MC38(1x106)、CT26(5x105)、MC38-OVA(1x106)、B16-OVA(3x105)细胞接种到小鼠的右侧背部皮下，肿瘤建立后，小鼠随机分组。小鼠在特定的时间点注射20μgSIL2蛋白，或者1x106个对照MSC(MSC-NQO1)或者1x106个MSC-NQO1-HRE-SIL2。对于联合免疫检查点阻断治疗晚期肿瘤，C57BL/6J小鼠在接种MC38肿瘤第14天开始(肿瘤大约150mm3)，腹腔注射100μg抗PD-L1+100ug抗CTLA4联合瘤周注射1x106对照EMSC或者MSC-NQO1-HRE-SIL2。每3天1次，共注射两次。对于联合细胞过继治疗，C57BL/6J小鼠皮下接种3x105的B16-OVA，在第11天的时候静脉注射OT-1多肽预激活的OT-1T细胞(1x106或2x105)，在第11天和第14天的时候瘤周注射对照1x106 EMSC或者MSC-NQO1-HRE-SIL2。每周两次测量肿瘤的长(a)、宽(b)和高(c)，计算肿瘤体积＝a*b*c/2。记录荷瘤小鼠的存活曲线，当肿瘤的长、宽或高超过2cm，或者肿瘤大小超过1500mm3，或者荷瘤小鼠体重下降超过20％时，处死小鼠。
5.肿瘤组织消化
肿瘤组织用消化液(RPMI培养基含2％FBS，1mg/ml的collagen IV和100ug/ml的Dnase I)重悬放置在37℃，120rpm消化45min。肿瘤悬液过70μm细胞筛网移除大的碎片或未消化好的肿瘤组织块。滤液用含2mM EDTA的PBS洗两次，然后用FACS缓冲液重悬。
6.流式细胞术分析
肿瘤细胞悬液加入抗FcgIII/II受体(克隆2.4G2)抗体，冰上放置15min阻断非特异结合，然后加入相应的荧光偶联抗体，4℃避光放置30min染色。Fixable viability DyeeFluorTM 506或者Dye eFluorTM 780染色用来排除死细胞。Foxp3核内染色使用True-NuclearTM transcription factor buffer set(BioLegend)根据说明书完成。数据用CytoFLEX flow cytometer(Beckman Coulter)采集，使用软件FlowJo(Tree Star)分析。
7.肿瘤组织匀浆制备
CT26荷瘤小鼠在第9天瘤内注射20μg sumIL2蛋白或者1x106 EMSC-sumIL2。5天后，采集肿瘤组织，剪成小块，用Cell Lysis Kit(Bio-Rad Laboratories)重悬肿瘤组织块，用FastPrep-24 5G匀浆仪制备成匀浆，然后13000rpm离心20min，收集上清存储在-80℃。
8.Cytometric Bead Array(CBA)和ELISA分析血清和组织样本
CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Kit(BD Biosciences)依据说明书操作测量小鼠血清和肿瘤组织匀浆中的细胞因子水平。ELISA采用96孔微孔板(Corning Costar)，2μg/mL(100μL/孔)捕获抗体加入到板中4℃过夜吸附。PBS洗板，然后加入封闭液(PBS含0.05％TWEEN-20和5％脱脂牛奶)封闭后，加入用封闭液稀释的血清或肿瘤匀浆液，37℃放置1.5小时。PBST洗板后加入碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG二抗，37℃放置50min。PBST洗板后加入100μL磷酸对硝基苯酯显色，而后用SPECTROstar Nano(BMG LABTECH)于405nm波长读板。
9.SumIL2-Fc蛋白的制备
构建质粒时，将IL-2的突变体SumIL-2(简称SIL2，含F42A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F突变)连接到hIgG1来源的Fc(含L233A，L234A和P329G突变)的N端(SEQ ID No:4)。质粒采用瞬转方式转染到FreeStyleTM 293-F细胞。转染后第6天收集上清，使用Protein A亲和层析柱纯化上清中的SIL2-Fc蛋白。
10.IL-1β-Fc蛋白的制备
IL-1β-Fc蛋白(其编码序列为SEQ ID No:5)用与制备SumIL2-Fc蛋白类似的方法获得。
11.数据分析
荷瘤小鼠治疗前，根据肿瘤体积随机分配到不同组。数据使用GraphPad Prism统计软件分析，展示为平均值±SEM。肿瘤曲线用双因素ANOVA分析方法计算P值，小鼠存活曲线用对数秩检验分析计算P值，其他数据用未配对双尾t检验来分析。p<0.05代表有显著性差异。
12.序列说明
SEQ ID No:1小鼠NQO1蛋白的编码核酸序列
SEQ ID No:2来自Eno1基因的缺氧反应元件(HRE)的序列
SEQ ID No:3minimal SV40启动子的序列
SEQ ID No:4sumIL2-Fc的编码核酸序列
SEQ ID No:5IL1β-Fc的编码核酸序列
SEQ ID No:6来自EPO基因的缺氧反应元件(HRE)的序列
SEQ ID No:7来自VEGF-A基因的缺氧反应元件(HRE)的序列
SEQ ID No:8来自PGK1基因的缺氧反应元件(HRE)的序列
SEQ ID No:9来自LdhA基因的缺氧反应元件(HRE)的序列
SEQ ID No:10来自ALDA基因的缺氧反应元件(HRE)的序列
SEQ ID No:11来自GAPDH基因的缺氧反应元件(HRE)的序列。
实施例1.NQO1工程化的MSC在肿瘤内具备更长的存活时间
为增强MSC在体内肿瘤组织的存活，如上所述用携带EGFP和NQO1基因序列的慢病毒载体转染MSC细胞得到NQO1工程化的MSC(“MSC-EGFP-NQO1”)，并以仅携带EGFP的MSC作为对照(“MSC-EGFP”)。为评估NQO1工程化的MSC在体内肿瘤组织内的存活时间，使用C57BL/6J雌性8周龄小鼠(n＝5)，皮下接种1x106个MC38细胞。第9天的时候瘤内注射5x105个MSC-EGFP或MSC-EGFP-NQO1，注射后第5天，收集肿瘤组织，通过流式细胞术分析瘤内CD45-GFP+MSC的数量。结果如图1的a和b所示，MSC-EGFP-NQO1相较MSC-EGFP在瘤内数量明显更多，表明表达NQO1的MSC能够更加适应肿瘤微环境，存活时间更长。
实施例2.HRE工程化的MSC-NQO1在缺氧肿瘤组织中特异性表达抗肿瘤因子
为了使MSC-NQO1在肿瘤组织内特异性地表达抗肿瘤因子、避免外周毒性，采用了缺氧诱导启动子元件来调控目标抗肿瘤因子IL-1β(IL-1β-Fc)或SIL-2(sumIL-2-Fc)的基因表达。所述缺氧诱导启动子元件含有从HIF-1reporter P2.1质粒PCR获得的Eno1基因来源的缺氧应答元件(HRE)和minimal SV40启动子。用具有处在HRE-SV40调控下的目标基因(IL-1β或SIL-2)的慢病毒载体或者缺失HRE元件的具有所述目标基因的慢病毒载体分别转染MSC-NQO1，然后在常氧(20％)或缺氧(1％)条件培养24小时。通过ELISA检测表达的抗肿瘤因子IL-1β或SIL-2在上清中的浓度(n＝4)。MSC-NQO1-HRE-IL-1β或-SIL-2(图2中的灰色柱)在缺氧培养条件下表达的IL-1β或SIL-2大约是常氧培养条件的约10倍(图2的b和c)。而对照MSC-NQO1-IL-1β或-SIL2(图2中的黑色柱)在缺氧培养条件和常氧培养条件下生产的IL-1β或SIL-2无明显变化，且均远低于MSC-NQO1-HRE-IL-1β或-SIL-2在缺氧条件下分泌的IL-1β或SIL-2。这表明HRE工程化的MSC可以在缺氧条件下特异性地促进目标基因的表达。
为了检测工程化的MSC的体内抗肿瘤效果。使用C57BL/6J雌性8周龄小鼠皮下接种1x106个MC38细胞。在第9天和第12天瘤内注射1x106个工程化的MSC-NQO1-SIL2、工程化的MSC-NQO1-HRE-SIL2、或MSC-SIL2(即仅具有SIL-2基因而不具有NQO1和HRE元件的MSC)，并每日测量肿瘤体积(n＝5或6)。结果如图2d所示，MSC-NQO1-SIL2相较于MSC-SIL2有改善的抗肿瘤效果，表明NQO1工程化的MSC延长存活可以提高其抗肿瘤能力。而MSC-NQO1-HRE-SIL2具有最强的抗肿瘤效果，表明进一步引入HRE可以增强其抗肿瘤能力。
实施例3.工程化的MSC-NQO1-HRE-SIL2能够特异的在肿瘤组织表达sumIL2,避免外周毒性
如上所述构建了IL-2的突变体sumIL-2(SIL-2)，与未突变的IL-2相比，sumIL-2更加倾向于激活效应CD8+T细胞并降低对抑制性Treg细胞的激活，其对IL2Rα的结合减弱，而对IL2Rβ的结合增强。为延长半衰期，SumIL-2连接到hIgG的Fc部分，该Fc中引入了L233A，L234A和P329G突变以消除细胞依赖的胞毒效应(ADCC)和补体依赖的胞毒效应(CDC)，避免对活化T细胞的删除效应。SumIL-2-Fc相较于IL-2-Fc有更好的抗肿瘤效果，但相应的毒性也增加。
在该实施例中，构建了NQO1-HRE-sumIL2-Fc慢病毒载体(其中SumIL-2-Fc的表达受HRE调控，但NQO1由独立于HRE的元件调控)，包装成病毒并转染MSC细胞，得到“MSC-NQO1-HRE-SIL2”。为评估MSC作为载体运载sumIL-2到肿瘤组织的效果，使用BALB/c雌性8周龄小鼠皮下接种5x105个CT26肿瘤细胞。第9天瘤内或瘤旁注射20ug SIL2-Fc蛋白或1x106个MSC-NQO1-HRE-SIL2，注射后第5天采集肿瘤组织和血清，ELISA检测肿瘤组织匀浆和血清内的sumIL-2水平(n＝5或6)。
结果发现，SIL2-Fc蛋白或MSC-NQO1-HRE-SIL2瘤内注射后的肿瘤组织内的sumIL2浓度水平相似，高于瘤旁注射sIL2-Fc蛋白后在肿瘤组织内的浓度(图3a)。有趣的是，瘤旁注射MSC-NQO1-HRE-SIL2细胞产生的sumIL2蛋白浓度与瘤内注射时相似，表示瘤旁注射的MSC能够归巢到肿瘤组织中并分泌sumIL2蛋白。瘤内或瘤旁注射sumIL2蛋白会导致血清中检测到高浓度的sumIL2蛋白，与之形成对比的是，不管是瘤内注射还是瘤旁注射MSC-NQO1-HRE-SIL2细胞仅导致血清中检测到微量的SIL2蛋白(图3b)。已知血清中高浓度的sumIL2蛋白会激活外周中的T和NK细胞，产生细胞因子导致外周毒性。与此一致的，瘤内或瘤旁注射sumIL2蛋白的小鼠，CBA检测到血清中有明显升高的IFNγ；而瘤内或瘤旁注射MSC-NQO1-HRE-SIL2的小鼠，血清中没有检测到明显的IFNγ蛋白(图3c)。瘤内或瘤旁注射sumIL2蛋白后，小鼠体重明显下降；而瘤内或瘤旁注射MSC-NQO1-HRE-SIL2细胞的小鼠体重与非治疗对照组相比无明显变化(图3d)。
这些结果表明，瘤内或瘤旁注射MSC-NQO1-HRE-SIL2细胞可以特异性地在肿瘤组织内分泌高浓度的sumIL2蛋白，而且在外周组织中几乎不产生SIL2蛋白及其相关毒性。
实施例4.MSC-NQO1-HRE-SIL2具有显著的肿瘤抑制效果
利用CT26结直肠癌小鼠肿瘤模型评估MSC-NQO1-HRE-SIL2的抑瘤效果。使用BALB/c雌性8周龄小鼠皮下接种5x105个CT26肿瘤细胞。接种后第9天和第12天，瘤内注射图4所示剂量的SIL2-Fc蛋白(sumIL-2-Fc)或瘤周注射1x106个MSC-NQO1-HRE-SIL2细胞。每周两次观察小鼠并测量肿瘤大小(n＝5)。结果见图4，在不会引起外周毒性的剂量下，1x106个MSC-NQO1-HRE-SIL2细胞能显著抑制肿瘤生长，且效果略好于2.5ug或10ug SIL2-Fc蛋白的治疗效果。
实施例5.MSC-NQO1-HRE-SIL2的施用选择性扩增肿瘤内CD8+T细胞
为进一步分析MSC-NQO1-HRE-SIL2的施用对抗肿瘤免疫的调节，C57BL/6J雌性8周龄小鼠皮下接种5x105个CT26肿瘤细胞。接种后第9天和第12天，瘤周注射1x106个MSC-NQO1、PBS对照或者MSC-NQO1-HRE-SIL2。第二次注射后第5天分离肿瘤组织，用消化液(含1mg/ml胶原酶IV和100ug/ml DNase I)消化成单细胞悬液，流式检测各亚群细胞数量。结果见图5的a和b，MSC-NQO1-HRE-SIL2大量扩增CD8+T细胞，且CD8+T/Treg细胞比例显著高于其他组。
为进一步分析SIL2相较于wtIL2能够更加特异性的扩增CD8+T细胞而不是Treg，BALB/c雌性8周龄小鼠皮下接种5x105个CT26肿瘤细胞。接种后第9天和第12天，瘤内注射1x106个MSC-NQO1或者MSC-NQO1-HRE-SIL2或MSC-NQO1-HRE-wtIL2(表达野生型IL-2)细胞。第二次注射后第5天分离肿瘤组织，用消化液(含1mg/ml胶原酶IV和100ug/ml DNase I)消化成单细胞悬液，流式检测各亚群细胞数量。结果见图5c，MSC-NQO1-HRE-SIL2治疗组CD8+T/Treg细胞比例显著高于其他组；而wtIL2不仅扩增肿瘤内的抗肿瘤CD8+T细胞，还大量扩增抑制性Treg细胞，因此MSC-NQO1-HRE-wtIL2治疗组CD8+T/Treg比例与MSC-NQO1组差别不大；这些说明MSC-NQO1-HRE-SIL2可以选择性扩增肿瘤内CD8+T细胞，抑制肿瘤生长。
实施例6.MSC-NQO1-HRE-SIL2提高免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果
免疫检查点抑制剂在临床上展示了良好的肿瘤治疗效果，但是仅有部分病人能对免疫检查点阻断(ICB)疗法产生应答，且一部分早期应答的病人后期会变得不应答。为评估MSC-NQO1-HRE-SIL2能否提高免疫检查点抑制剂疗法的功效，使用C57BL/6J雌性8周龄小鼠皮下接种1x106个MC38细胞，并选用晚期肿瘤作为治疗对象，在肿瘤生长第14天和第17天时腹腔注射100ug抗PD-L1+抗CTLA4抗体，或者瘤周注射1x106个MSC-NQO1-HRE-SIL2细胞。记录小鼠的肿瘤生长或者存活曲线(n＝5)。
结果如图6所示，MSC-NQO1-HRE-SIL2单独治疗组(▲)能部分抑制晚期肿瘤生长但不能清除肿瘤；免疫检查点抑制剂加对照MSC治疗组(■)效果略好，但也是只能抑制肿瘤生长；而免疫检查点抑制剂加MSC-NQO1-HRE-SIL2联合治疗组(▼)能更好的显著抑制肿瘤生长(图6a)。从生存曲线看，MSC-NQO1-HRE-SIL2单独治疗组(▲)或免疫检查点抑制剂加对照MSC治疗组(■)能延缓荷瘤小鼠存活至多到50天左右；而免疫检查点抑制剂加MSC-NQO1-HRE-SIL2联合治疗组(▼)有75％的肿瘤被清除，小鼠存活达70天以上。
以上结果说明，MSC-NQO1-HRE-SIL2不仅本身能够抑制肿瘤生长，而且还可以提高免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果，并且对具有免疫检查点阻断(ICB)疗法抗性的晚期肿瘤也具有效果。
实施例7.MSC-NQO1-HRE-SIL2在肿瘤局部产生的sumIL2可以激活T细胞并有效的抑制远端肿瘤生长
采用皮下接种双肿瘤小鼠模型来评估局部施用MSC-NQO1-HRE-SIL2是否能诱导系统性抗肿瘤免疫反应，并控制原位肿瘤外的远端肿瘤。C57BL/6J雌性8周龄小鼠在第0天右侧皮下接种1x106个MC38肿瘤细胞，在第2天左侧皮下接种5x105个MC38肿瘤细胞。在第9天和12天的时候在右侧肿瘤瘤内注射1x106个MSC-NQO1-HRE-SIL2细胞或对照MSC。每周两次同时记录左侧和右侧肿瘤大小(n＝7-10)。
结果如图7所示，相较于对照MSC，MSC-NQO1-HRE-SIL2不仅能显著抑制右侧治疗部位的肿瘤生长，而且能显著抑制左侧远端肿瘤的生长。这表明MSC-NQO1-HRE-SIL2在肿瘤局部可以激活抗肿瘤免疫反应并抑制远端肿瘤生长。
实施例8.施用MSC-NQO1-HRE-SIL2提高晚期肿瘤过继细胞疗法(ACT)的抗肿瘤效果
SIL2能够有效扩增CD8+T细胞，因此推测其可以与过继T细胞疗法联用，用于治疗免疫细胞浸润少的冷肿瘤。B16黑色素瘤选做冷肿瘤模型。C57BL/6J雌性8周龄小鼠在第0天皮下接种3x105个B16-OVA肿瘤细胞，在第9天时静脉注射图8所示数量的OT-1多肽预激活的OT-1T细胞，瘤周注射1x106个对照MSC(MSC-NQO1)或MSC-NQO1-HRE-SIL2并如图所示与ACT联用。每周两次记录肿瘤大小和小鼠生存状况(n＝5-10)。
结果如图8a和8b所示，MSC-NQO1-HRE-SIL2(▼)或ACT(2x105)+对照MSC(▲)仅能部分抑制B16-OVA肿瘤细胞生长，荷瘤小鼠最终死亡；而MSC-NQO1-HRE-SIL2和ACT(2x105)两者联合治疗组(◆)能显著抑制甚至清除肿瘤，延长小鼠存活，治疗效果与提高10倍剂量的ACT(2x106)(■)的治疗效果相当。这些结果表明MSC-NQO1-HRE-SIL2可以扩增过继的抗肿瘤T细胞，提高过继细胞治疗冷肿瘤的效果。
实施例9.工程化的MSC-NQO1-HRE-IL1β能够特异的在肿瘤组织表达IL1β,避免外周毒性
以与实施例3相似的方式构建了NQO1-HRE-IL1β-Fc慢病毒载体(IL1β-Fc的表达受HRE元件调控)，包装成病毒并转染MSC细胞，将经转染的细胞命名为“MSC-NQO1-HRE-IL1β”。以与实施例3相似的方式测试了该MSC在肿瘤组织中的IL1β表达水平以及抗肿瘤效果。
结果如图9a所示，在肿瘤内注射IL1β蛋白或MSC-NQO1-HRE-IL1β后，MSC-NQO1-HRE-IL1β在肿瘤内表达IL1β，而在血清和其他器官中表达显著更低且低于直接注射IL1β蛋白的情况。此外，在注射MSC-NQO1-HRE-IL1β后，血清中的炎症因子IL-6、MCP1和肝脏损伤指标因子ALT、AST均与对照组(此处的对照是瘤内注射PBS组)没有显著差异，而注射IL1β蛋白后这些炎性因子均显著上升(图9b)，这说明施用IL1β蛋白会引起外周组织毒副作用，而MSC-NQO1-HRE-IL1β特异性地在肿瘤内表达不会导致外周组织毒性。
此外，在肿瘤抑制效果方面，对于荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重，MSC-NQO1-HRE-IL1β的效果均明显优于IL-1β蛋白(图9b和c)。
以上描述了本发明的技术思想和具体实施方式，但应当理解，上述具体实施方式不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员可以理解，在不脱离本发明的实质的情况下，可以对具体实施方式中所显示的发明进行多种修改和/或变化，修改和/或变化后的实施方式也涵盖在本发明的范围内。因此，本发明的实施方式仅是说明性的且非限制性的。
Claims (25)
1.一种工程化的间充质干细胞(MSC)，其基因组包含导入的NQO1蛋白编码序列。
2.如权利要求1所述的工程化的间充质干细胞，其基因组还包含导入的调控元件和目标基因，所述目标基因的表达受所述调控元件调控。
3.一种工程化的间充质干细胞(MSC)，其基因组包含导入的缺氧反应元件(HRE)。
4.一种工程化的间充质干细胞(MSC)，其基因组包含导入的NQO1蛋白编码序列和导入的缺氧反应元件(HRE)。
5.如权利要求3或4所述的工程化的间充质干细胞，其基因组还包含位于所述HRE下游的导入的调控元件和目标基因，所述目标基因的表达受所述调控元件调控。
6.如权利要求5所述的工程化的间充质干细胞，其中，所述HRE及其下游的所述调控元件和目标基因可操作地连接。
7.如权利要求2或5所述的工程化的间充质干细胞，其中，所述调控元件包含启动子。
8.如权利要求2或5所述的工程化的间充质干细胞，其中，所述目标基因编码抗肿瘤蛋白，优选免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子。
9.如权利要求2或5所述的工程化的间充质干细胞，其中，所述目标基因编码IL-2、IL-1、IL-7、IL-21、IL-12、IL-15及其变体中的任一种，优选编码sumIL-2或IL-1β。
10.如权利要求1至5中任一项所述的工程化的间充质干细胞，其中，所述导入通过慢病毒载体转染、腺病毒载体转染、或者mRNA转染来进行。
11.如权利要求1或4所述的工程化的间充质干细胞，其中，所述NQO1蛋白编码序列为SEQ ID No:1。
12.如权利要求3或4所述的工程化的间充质干细胞，其中，所述HRE的序列来自Eno1、Epo、VEGF-A、PGK、Ldha、ALDA和GAPDH基因中的任一种。
13.如权利要求3或4所述的工程化的间充质干细胞，其中，所述HRE的序列选自SEQ IDNo:2和SEQ ID No:6-11，优选为SEQ ID No:2。
14.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求8或9所述的工程化的间充质干细胞。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其还包含第二抗癌剂，例如免疫检查点抑制剂和/或识别癌细胞的过继性T细胞。
16.权利要求8或9所述的工程化的间充质干细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
17.如权利要求14所述的药物组合物或权利要求16所述的用途，其中，所述癌症选自B细胞淋巴瘤、支气管癌、前列腺癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌、喉癌、唾液腺癌、胸腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪癌、睾丸癌、恶性纤维组织细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、小肠癌或阑尾癌、鳞状细胞癌、乳腺癌和卵巢癌。
18.NQO1蛋白用于延长间充质干细胞在肿瘤组织内的存活期的用途。
19.缺氧反应元件(HRE)用于增强间充质干细胞中的目标基因在缺氧环境下的表达的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中，所述缺氧环境是肿瘤内微环境。
21.如权利要求19所述的用途，其中，所述间充质干细胞的基因组包含导入的所述缺氧反应元件及其下游的导入的调控元件和所述目标基因，并且所述目标基因的表达受所述调控元件调控。
22.NQO1蛋白编码序列与缺氧反应元件(HRE)联合用于制备包含携带目标基因的间充质干细胞的药物组合物的用途。
23.如权利要求22所述的用途，其中，所述间充质干细胞的基因组包含导入的所述NQO1蛋白编码序列、导入的所述缺氧反应元件、以及所述缺氧反应元件下游的导入的调控元件和所述目标基因，并且所述目标基因的表达受所述调控元件调控。
24.权利要求1至13中任一项所述的工程化的间充质干细胞作为载体用于递送目标基因的用途。
25.如权利要求24所述的用途，其中，所述载体用于向肿瘤组织递送所述目标基因，并且所述目标基因是肿瘤治疗基因，优选为编码抗肿瘤蛋白的基因，更优选为编码免疫刺激性细胞因子或抗肿瘤细胞因子的基因。
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