CN111751532B - Piezo1蛋白作为食管癌标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了PIEZO1蛋白作为食管癌标志物的应用，属于食管癌检测和治疗技术领域，所述PIEZO1蛋白在食管癌组织中的表达量显著高于癌旁组织；通过检测PIEZO1蛋白的表达量能够辅助检测食管癌；通过降低所述PIEZO1蛋白的表达量能够治疗食管癌，降低所述PIEZO1蛋白的表达量能够抑制体外食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并且能够抑制体内肿瘤的生长；根据实施例的记载，降低PIEZO1蛋白的表达量后，体内肿瘤的体积和重量显著下调。

Description

PIEZO1蛋白作为食管癌标志物的应用

技术领域

本发明属于食管癌检测和治疗技术领域，尤其涉及PIEZO1蛋白作为食管癌标志物的应用。

背景技术

食管癌的恶性程度在癌症中位列第八，是造成全世界癌症死亡的第六大主要原因。每年都有48万多的新确诊患者和约40万人的死亡。食管癌根据组织学类型可以分为两种：食管鳞状细胞癌、食管腺癌。其中的80％都为食管鳞状细胞癌。食管鳞状细胞癌的诱发因素主要有烟草，酒精，热饮以及不良饮食。到目前为止，食管癌的发病率还在持续的上升，对人类的威胁逐渐增大。80％的患者在确诊时处于晚期，并且大多数患者已不能进行手术治疗，因为很大一部分肿瘤无法切除或在确诊前已经转移。

食管癌是一个多步骤的过程，涉及一系列的遗传和表观遗传的改变。对食管癌的研究目前已经报道很多，通过激活EMT途径，PI3K途径和P53信号通路等都可以影响食管癌的增殖，侵袭和迁移，但目前食管癌的预后仍然较差，5年内的总体存活率低至20％；所以亟待寻求对治疗食管癌新的靶点和策略。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供PIEZO1蛋白在制备检测食管癌的试剂、治疗食管癌的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了PIEZO1蛋白作为食管癌标志物的应用。

优选的，所述PIEZO1蛋白在食管癌组织中的表达量显著高于癌旁组织。

本发明提供了一种食管癌检测试剂盒，包括检测PIEZO1蛋白的试剂。

优选的，检测PIEZO1蛋白的试剂包括一抗和二抗；所述一抗为Piezo1兔源多克隆抗体；所述二抗为HRP-山羊抗兔。

本发明提供了PIEZO1蛋白表达的抑制剂在制备治疗食管癌药物中的应用。

优选的，所述抑制剂包括PIEZO1蛋白的干扰RNA。

优选的，所述PIEZO1蛋白的干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述抑制剂还包括Piezo1抑制慢病毒，所述Piezo1抑制慢病毒中重组有PIEZO1蛋白的干扰RNA。

本发明还提供了PIEZO1蛋白表达的抑制剂在制备抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭的药物中的应用。

本发明还提供了PIEZO1蛋白表达的抑制剂在制备抑制体内肿瘤的生长的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了PIEZO1蛋白作为食管癌标志物的应用，所述PIEZO1蛋白在食管癌组织中的表达量显著高于癌旁组织；通过检测PIEZO1蛋白的表达量能够辅助检测食管癌；通过降低所述PIEZO1蛋白的表达量能够治疗食管癌，降低所述PIEZO1蛋白的表达量能够抑制体外食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并且能够抑制体内肿瘤的生长；根据实施例的记载，降低PIEZO1蛋白的表达量后，小鼠体内肿瘤的体积和重量显著下调。

附图说明

图1为癌组织和癌旁组织中Piezo1蛋白的免疫组化检测结果；

图2为TCGA数据库验证PIEZO1蛋白在癌组织和癌旁组织中表达量的比较；

图3为PIEZO1蛋白在5种食管癌细胞系表达情况；

图4为PIEZO1蛋白在EC109、EC9706细胞中被敲低表达后的结果，其中A为在EC109细胞中，在激光共聚焦显微镜下拍的转染带有绿色标签的sh-Piezo1的荧光照片，B为qRT-PCR检测的在EC109细胞株中敲低Piezo1的效率，C为在EC9706细胞中，在激光共聚焦显微镜下拍的转染带有绿色标签的sh-Piezo1的荧光照片，D为qRT-PCR检测的在EC9706细胞株中敲低Piezo1的效率；

图5为CK-8法检测敲低PIEZO1蛋白对食管癌细胞增殖的影响；

图6为划痕实验检测敲低PIEZO1蛋白对食管癌细胞迁移能力的影响，其中A为在EC109细胞中，分别在0h、24h和48h拍的划痕情况，B为图A的统计结果；

图7为Transwell法检测敲低PIEZO1对食管癌细胞侵袭的影响；

图8为qRT-PCR与Westren Blot法检测P53信号通路的影响，其中A为qRT-PCR，B为WestrenBlot法检测；

图9为沉默PIEZO1蛋白抑制体内肿瘤生长结果，其中A为肿瘤照片，B为肿瘤质量，C为肿瘤体积；

图10为Piezo1抑制慢病毒的结构示意图。

具体实施方式

本发明提供了PIEZO1蛋白作为食管癌标志物的应用。在本发明中，所述PIEZO1蛋白在食管癌组织中的表达量显著高于癌旁组织；所述PIEZO1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码所述PIEZO1蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过公共数据库及组织芯片免疫组化等手段确认PIEZO1蛋白在食管癌癌症组织中的表达量显著高于癌旁组织，PIEZO1蛋白能够作为食管癌标志物应用。

本发明提供了一种食管癌检测试剂盒，包括检测PIEZO1蛋白的试剂。本发明对所述检测PIEZO1蛋白的实际没有特殊限定，能够准确检测PIEZO1蛋白的表达量即可，在本发明中，检测PIEZO1蛋白的试剂优选的包括一抗和二抗；所述一抗为Piezo1兔源多克隆抗体；所述二抗为HRP-山羊抗兔；在本发明中，所述Piezo1兔源多克隆抗体优选的购自英国Abcam公司；所述HRP-山羊抗兔优选的购自优宁维生物科技股份有限公司。

本发明提供了PIEZO1蛋白表达的抑制剂在制备治疗食管癌药物中的应用。在本发明中，通过降低所述PIEZO1蛋白的表达量实现食管癌的治疗。在本发明中，所述抑制剂优选的包括PIEZO1蛋白的干扰RNA。在本发明中，所述PIEZO1蛋白的干扰RNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示，具体如下：gcctcgtggtctacaagat。在本发明中，所述抑制剂优选的还包括Piezo1抑制慢病毒，所述Piezo1抑制慢病毒中优选的重组有PIEZO1蛋白的干扰RNA；在本发明中，所述Piezo1抑制慢病毒包括初始慢病毒载体，所述初始慢病毒载体优选为pLKD-CMV-G&PR-U6；更优选的，所述PIEZO1蛋白的干扰RNA重组于所述初始慢病毒载体的AgeI和EcoRI酶切位点之间。在本发明中，所述PIEZO1蛋白的干扰RNA或Piezo1抑制慢病毒转入细胞后，能够降低PIEZO1蛋白的表达量，实现食管癌的治疗。

本发明还提供了PIEZO1蛋白表达的抑制剂在制备抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的药物中的应用。本发明对所述PIEZO1蛋白表达的抑制剂没有特殊限定，能够抑制所述PIEZO1蛋白的表达即可；本发明将所述PIEZO1蛋白表达的抑制剂导入食管癌细胞中，通过降低所述食管癌细胞中PIEZO1蛋白的表达量，抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，从而实现食管癌的治疗。

本发明还提供了PIEZO1蛋白表达的抑制剂在制备抑制体内肿瘤的生长的药物中的应用。本发明采用动物体内荷瘤试验进行检测，结果表明，降低PIEZO1蛋白的表达量，能够显著抑制体内肿瘤的生长。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

下载公共数据库Xena中食管癌中表达PIEZO1的RNA-Sep数据(http://xena.ucsc.edu/,04/6/2019)。样本数据包含162个癌症样本和11个正常样本。通过数据归一化处理和绘制散点图，得到PIEZO1在TCGA数据库中食管癌表达情况的散点图，如图1所示，说明PIEZO1在食管癌中高表达。

购买食管癌组织芯片阵列，49例癌症样本和25例正常样本组织。对组织芯片进行Piezo1蛋白免疫组化分析(Piezo1免疫组化由上海芯超生物科技有限公司制作合成)，其中根据样本得分分为4种表达水平：阴性(-：得分为0)；弱(+：得分为0.5)；强(++：得分为1)；阳性(+++：得分为2)。采用SPSS16.0软件，运用统计学卡方检验法，发现PIEZO1蛋白在食管癌中高表达。结果如图2所示，PIEZO1蛋白在癌旁阴性(-)表达率为28％；弱(+)表达率为48％；强(++)表达率为24％；阳性表达率为0％，而PIEZO1蛋白在癌组织的阴性(-)表达率为8.16％；弱(+)表达率为12.24％；强(++)表达率为53.06％；阳性表达率为26.53％，证明PIEZO1在食管癌组织中高表达。可见PIEZO1蛋白在食管癌中高表达，能够作为食管癌标志物应用。

表1免疫组化统计结果

实施例2

Piezo1蛋白干扰RNA以及Piezo1抑制慢病毒的制备

(1)干扰靶点设计和引物合成：根据shRNA设计的一般原则，设计1个siRNA靶点。

Piezo1慢病毒合成序列为GCCTCGTGGTCTACAAGAT(SEQ ID NO.3)。

NC慢病毒合成序列为TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO.4)。

慢病毒的包装由上海和元生物技术股份有限公司完成。

Piezo1基因敲低细胞株构建

RT-qPCR验证5种食管癌细胞(EC109、EC9706、TE-1、KYSE30、KYSE510)发现PIEZO1蛋白在EC109、EC9706细胞中表达相对较高(图3)，对这两种细胞抑制Piezo1蛋白的表达。采用前期构建的Piezo1抑制慢病毒，对两种细胞进行转染，并制备稳定的蛋白表达抑制细胞株。

转染的具体步骤如下：

(1)收取生长状态良好且处于对数生长期的细胞，胰酶消化，离心，按10⁵个/mL接种于24孔板中，放培养箱培养，等待细胞贴壁进行病毒感染；

(2)从-80℃的冰箱中取出Piezo1抑制慢病毒和空载慢病毒，放置冰上融化。吸弃培养基，加入Mol值为20的病毒液和2.5μL的polybrene，补加无血清的培养基至500μL，培养箱培养；

(3)感染病毒8～12h，更换成带有血清的完全培养基，每隔24h，需换液一次；

(4)72～96h，在共聚焦显微镜下观察荧光强度，并拍照记录；

(5)96h后，向转染的细胞中加入筛选的最佳浓度的嘌呤霉素培养基500μL，筛选7～14天；

(6)在筛选过程中，24h更换新鲜培养基，以清除死去的细胞，并每天观察细胞的生长状态。

采用PCR电泳跑胶在基因层面验证PIEZO1蛋白在两种细胞中抑制表达的效率，具体步骤如下：

将EC109细胞和EC9706提取的RNA反转录成cDNA

反应体系如表4所示。

表4RNA反转录成cDNA的体系

PCR仪中反应：42℃，60min；70℃，5min；4℃，5min。

扩增体系如表5所示。

表5PCR扩增体系

PCR仪中反应：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s，共40个循环72℃，5min；4℃，1h。

跑胶：配制1％琼脂糖凝胶，凝固后，拔出梳子，加入20μL cDNA样本，设置电流120V，时间30min。照胶并拍照。

PCR引物序列为：

PIEZO1-S：CTCCCTGTTACGCTTCAATGCT(SEQ ID NO.5)

PIEZO1-A：TGTAGGCATATCTGAAAGGCAAGG(SEQ ID NO.6)

GAPDH-S：CCTCGTCCCGTAGACAAAATG(SEQ ID NO.7)

GAPDH-A：TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT(SEQ ID NO.8)

结果如图4所示，确定PIEZO1蛋白在EC109和EC9706细胞敲低成功。

Piezo1蛋白抑制对细胞功能的影响

PIEZO1蛋白的敲低可显著抑制食管癌细胞的增殖能力

通过CCK-8法结果显示：敲低PIEZO1蛋白的EC109细胞在96h时，其增殖速度显著下降(P＜0.001)，而敲低PIEZO1蛋白的EC9706细胞则在培养24h时，增长速度显著下降，并保持到72h(P＜0.001)。两组结果都具有统计学意义，并差异显著(图5)。表明敲低PIEZO1蛋白可显著抑制食管癌细胞的增殖能力。

PIEZO1蛋白的敲低可显著抑制食管癌的迁移能力

划痕实验检测敲低PIEZO1蛋白的EC109细胞的迁移能力

(1)首先，取出6孔板，用marker笔在板背部笔直的标出一个“井”字，以便拍照时记录相同的视野；

(2)取对数生长期且生长状态良好的实验组细胞和对照组细胞(实验组细胞转染Piezo1慢病毒干扰RNA序列的细胞，对照组是转染了NC慢病毒RNA序列的细胞)，用PBS清洗，胰酶消化，离心，得到细胞沉淀，用1mL完全培养基重悬，细胞计数板计数，计数后调整细胞密度为10⁶个/mL，向6孔板中加入2mL的细胞悬液，每组设置3个复孔，培养箱中培养；

(3)24h后，取出细胞，显微镜下观察细胞状态，细胞生长状况良好，即可用PBS清洗，进行后续实验；

(4)用200μL黄枪头垂直板中，均匀笔直的划出一条划痕，用PBS清洗多次，直至清除掉脱落的细胞；

(5)在显微镜下观察，并找到合适的视野记录拍照；

(6)记录后，加入2mL无血清的1640培养基，继续培养；

(7)在48h后，用PBS清洗漂浮的死细胞，切忌不要碰触细胞，在显微镜下找到对应的拍照视野进行重复拍照，保存；

(8)此实验重复3次，分析数据，使用Image J绘制柱形图。

实验结果显示，在0h进行拍照记录初始划痕状态和位置，并在24h和48h拍照记录相同位置(图6)。发现随着时间变化，实验组细胞划痕间距愈合显著变慢(P＜0.001)。具有统计学差异。实验结果表明，敲低PIEZO1蛋白可显著抑制食管癌的迁移能力。

PIEZO1蛋白的敲低可显著抑制食管癌的侵袭

Transwell基质胶侵袭法步骤如下：

(1)首先将6孔板，枪头预冷。将Matrigel胶从-20℃冰箱中取出，置于冰上，放在4℃的冰箱中过夜融化；

(2)在超净工作台用预冷的枪头吸取200μL PBS到小室，将其润湿。放置30min后，吸出PBS；

(3)用预冷枪头吸取200μL配制好的Matregel胶(1640培养基：Matrigel胶＝9:1)置于小室，在超净工作台放置30min后，放培养箱培养6h使胶凝固；

(4)取生长状态良好且处于对数生长期的实验组细胞和对照组细胞，用胰酶消化，离心，得到细胞沉淀后，用不带有血清的1640培养基重悬，计数后，设置细胞浓度为5×10⁵个/mL，向每个小室中加入200μL细胞悬液，避免产生气泡。每组细胞设置3个复孔；

(5)下室中加入600μL含有20％的胎牛血清的1640培养基，避免产生气泡。培养箱中培养；

(6)24h、48h后将小室取出，去除上层培养基，注意不要碰触细胞和薄膜。将小室放置在37℃PBS中清洗3次，每次5min，动作不宜过大，尽量轻柔；

(7)清洗过后，用甲醇固定30min，PBS清洗甲醇2次，每次5min；

(8)将小室置于0.1％结晶紫溶液染色15min，PBS清洗结晶紫3次，每次5min；

(9)用棉签轻轻擦去上室残余细胞，晾干。在显微镜下选取5个不同的视野，进行拍照，计数分析细胞侵袭情况；

(10)实验重复3次，分析数据，使用Image J绘制柱形图。

利用Transwell基质胶侵袭法检测敲低PIEZO1蛋白对EC109、EC9706细胞侵袭能力的影响。实验结果如图所示(图7)：实验组细胞与对照组细胞在培养了48h后，同一时间不同的5个视野下观察的细胞数，进行统计分析，发现实验组与对照组均能穿透小室，但实验组细胞穿过小室的数量显著下降，并具有统计学意义(P＜0.01)。实验结果表明，敲低PIEZO1蛋白可显著抑制食管癌侵袭。

PIEZO1蛋白的敲低可上调P53信号通路关键因子的表达

通过基因芯片高通量检测及RT-qPCR法验证，确定：敲低PIEZO1蛋白后，P53、Caspase3、Caspase9、Bax因子的基因表达水平显著上调(如图8)。

P53、Caspase3、Caspase9、Bax因子的扩增引物如下：

Caspase9：

forward 5’-TCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCC-3’(SEQ ID NO.9)

reverse 5’-CAACGTACCAGGAGCCACTCT-3’(SEQ ID NO.10)

Caspase3：

forward 5’-TGGTTCATCCAGTCGCTTTG-3’(SEQ ID NO.11)

reverse 5’-TTCTGTTGCCACCTTTCGG-3’(SEQ ID NO.12)

p53：

forward 5’-GTTGGTCGGTGGGTTGGTAGT-3’(SEQ ID NO.13)

reverse 5’-GGGATGGGGTGAGATTTCCTT-3’(SEQ ID NO.14)

Bax：

forward 5’-CCCGAGAGGTCTTTTTCCG-3’(SEQ ID NO.15)

reverse 5’-TGAGCACCAGTTTGCTGGC-3’(SEQ ID NO.16)。

RT-qPCR法具体步骤如下：

提取细胞RNA后，进行反转录：

细胞RNA提取步骤：

(1)收集生长状态良好的细胞，转速1500rpm，离心5min，得到细胞沉淀，弃上清，在沉淀中加入1mLTrizol，反复吹打40次，静置冰上10min；

(2)加入200μL氯仿，轻轻混匀15s，静置冰上10min。随后12000rpm，4℃，离心15min；

(3)离心后，会出现分层现象，吸取上层水相移至新的无酶EP管中，加入等量的异丙醇，用手轻轻混匀，静置冰上10min。随后12000rpm，4℃，离心15min；

(4)离心后，会发现管底部出现少量沉淀。弃上清，向管中加入1mL75％乙醇，用于洗涤沉淀。可将沉淀轻轻拍起，观察其移动位置即可。随后7500rpm，4℃，离心5min；

(5)弃上清，将管内剩余乙醇晾干。按照沉淀的量加入适当的DEPC水，溶解RNA；

(6)测量RNA的浓度和纯度，放置-20℃冰箱保存。

反转录体系如表6所示。

表6反转录体系

在冰上完成加样并将所有组分混匀，42℃水浴2min。

表7反转录后的PCR体系

PCR仪中操作，程序设置为：37℃，15min；85℃，5s。

荧光定量PCR反应配置体系如表8所示。

表8荧光定量PCR反应配置体系

上机，设置程序为：95℃，30s；95℃，5s；60℃，5s，40个循环。应结束后，导出Ct值，运用

法进行分析统计。

荷瘤小鼠实验证明Piezo1的敲低肿瘤体积和重量明显降低

购买来自北京维通利华的Balb/c无胸腺裸鼠右后腿部皮下注射100μL的EC109实验组和对照组细胞悬液。注射后3d，观察裸鼠状态，并首次用游标卡尺测量肿瘤的长、宽，记录数据；随后每隔2d测量一次肿瘤的长和宽，并记录数据；持续23d，根据公式V＝(ab)2/2，计算肿瘤体积(V)，其中a和b分别是肿瘤灶的长轴和短轴；在第23d通过颈脱法杀死小鼠，取出肿瘤并称重，收集肿瘤，保存在-80℃，记录数据；统计分析小鼠的体重和肿瘤的增殖率。

动物体内实验证明：与对照组相比，敲低PIEZO1蛋白后，肿瘤的体积和重量显著下调(图9)。肿瘤组织通过Western Blot成功证明：与对照组相比，实验组中PIEZO1蛋白表达显著下调。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南省医药科学研究院

<120> PIEZO1蛋白作为食管癌标志物的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2520

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Pro His Val Phe Gly Ala Val Leu Tyr Trp Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Cys Ala Leu Leu Ala Ala Cys Leu Leu Arg Phe Ser Gly Leu Ser Leu

20 25 30

Val Tyr Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Trp Phe Pro Gly Pro Thr

35 40 45

Arg Cys Gly Leu Gln Gly His Thr Gly Arg Leu Leu Arg Ala Leu Leu

50 55 60

Gly Leu Ser Leu Leu Phe Leu Val Ala His Leu Ala Leu Gln Ile Cys

65 70 75 80

Leu His Thr Val Pro Arg Leu Asp Gln Leu Leu Gly Pro Ser Cys Ser

85 90 95

Arg Trp Glu Thr Leu Ser Arg His Ile Gly Val Thr Arg Leu Asp Leu

100 105 110

Lys Asp Ile Pro Asn Ala Ile Arg Leu Val Ala Pro Asp Leu Gly Ile

115 120 125

Leu Val Val Ser Ser Val Cys Leu Gly Ile Cys Gly Arg Leu Ala Arg

130 135 140

Asn Thr Arg Gln Ser Pro His Pro Arg Glu Leu Asp Asp Asp Glu Arg

145 150 155 160

Asp Val Asp Ala Ser Pro Thr Ala Gly Leu Gln Glu Ala Ala Thr Leu

165 170 175

Ala Pro Thr Arg Arg Ser Arg Leu Ala Ala Arg Phe Arg Val Thr Ala

180 185 190

His Trp Leu Leu Val Ala Ala Gly Arg Val Leu Ala Val Thr Leu Leu

195 200 205

Ala Leu Ala Gly Ile Ala His Pro Ser Ala Leu Ser Ser Val Tyr Leu

210 215 220

Leu Leu Phe Leu Ala Leu Cys Thr Trp Trp Ala Cys His Phe Pro Ile

225 230 235 240

Ser Thr Arg Gly Phe Ser Arg Leu Cys Ala Ala Val Gly Cys Phe Gly

245 250 255

Ala Gly His Leu Ile Cys Leu Tyr Cys Tyr Gln Met Pro Leu Ala Gln

260 265 270

Ala Leu Leu Pro Pro Ala Gly Ile Trp Ala Arg Val Leu Gly Leu Lys

275 280 285

Asp Phe Val Gly Pro Thr Asn Cys Ser Ser Pro His Ala Leu Val Leu

290 295 300

Asn Thr Gly Leu Asp Trp Pro Val Tyr Ala Ser Pro Gly Val Leu Leu

305 310 315 320

Leu Leu Cys Tyr Ala Thr Ala Ser Leu Arg Lys Leu Arg Ala Tyr Arg

325 330 335

Pro Ser Gly Gln Arg Lys Glu Ala Ala Lys Gly Tyr Glu Ala Arg Glu

340 345 350

Leu Glu Leu Ala Glu Leu Asp Gln Trp Pro Gln Glu Arg Glu Ser Asp

355 360 365

Gln His Val Val Pro Thr Ala Pro Asp Thr Glu Ala Asp Asn Cys Ile

370 375 380

Val His Glu Leu Thr Gly Gln Ser Ser Val Leu Arg Arg Pro Val Arg

385 390 395 400

Pro Lys Arg Ala Glu Pro Arg Glu Ala Ser Pro Leu His Ser Leu Gly

405 410 415

His Leu Ile Met Asp Gln Ser Tyr Val Cys Ala Leu Ile Ala Met Met

420 425 430

Val Trp Ser Ile Thr Tyr His Ser Trp Leu Thr Phe Val Leu Leu Leu

435 440 445

Trp Ala Cys Leu Ile Trp Thr Val Arg Ser Arg His Gln Leu Ala Met

450 455 460

Leu Cys Ser Pro Cys Ile Leu Leu Tyr Gly Met Thr Leu Cys Cys Leu

465 470 475 480

Arg Tyr Val Trp Ala Met Asp Leu Arg Pro Glu Leu Pro Thr Thr Leu

485 490 495

Gly Pro Val Ser Leu Arg Gln Leu Gly Leu Glu His Thr Arg Tyr Pro

500 505 510

Cys Leu Asp Leu Gly Ala Met Leu Leu Tyr Thr Leu Thr Phe Trp Leu

515 520 525

Leu Leu Arg Gln Phe Val Lys Glu Lys Leu Leu Lys Trp Ala Glu Ser

530 535 540

Pro Ala Ala Leu Thr Glu Val Thr Val Ala Asp Thr Glu Pro Thr Arg

545 550 555 560

Thr Gln Thr Leu Leu Gln Ser Leu Gly Glu Leu Val Lys Gly Val Tyr

565 570 575

Ala Lys Tyr Trp Ile Tyr Val Cys Ala Gly Met Phe Ile Val Val Ser

580 585 590

Phe Ala Gly Arg Leu Val Val Tyr Lys Ile Val Tyr Met Phe Leu Phe

595 600 605

Leu Leu Cys Leu Thr Leu Phe Gln Val Tyr Tyr Ser Leu Trp Arg Lys

610 615 620

Leu Leu Lys Ala Phe Trp Trp Leu Val Val Ala Tyr Thr Met Leu Val

625 630 635 640

Leu Ile Ala Val Tyr Thr Phe Gln Phe Gln Asp Phe Pro Ala Tyr Trp

645 650 655

Arg Asn Leu Thr Gly Phe Thr Asp Glu Gln Leu Gly Asp Leu Gly Leu

660 665 670

Glu Gln Phe Ser Val Ser Glu Leu Phe Ser Ser Ile Leu Val Pro Gly

675 680 685

Phe Phe Leu Leu Ala Cys Ile Leu Gln Leu His Tyr Phe His Arg Pro

690 695 700

Phe Met Gln Leu Thr Asp Met Glu His Val Ser Leu Pro Gly Thr Arg

705 710 715 720

Leu Pro Arg Trp Ala His Arg Gln Asp Ala Val Ser Gly Thr Pro Leu

725 730 735

Leu Arg Glu Glu Gln Gln Glu His Gln Gln Gln Gln Gln Glu Glu Glu

740 745 750

Glu Glu Glu Glu Asp Ser Arg Asp Glu Gly Leu Gly Val Ala Thr Pro

755 760 765

His Gln Ala Thr Gln Val Pro Glu Gly Ala Ala Lys Trp Gly Leu Val

770 775 780

Ala Glu Arg Leu Leu Glu Leu Ala Ala Gly Phe Ser Asp Val Leu Ser

785 790 795 800

Arg Val Gln Val Phe Leu Arg Arg Leu Leu Glu Leu His Val Phe Lys

805 810 815

Leu Val Ala Leu Tyr Thr Val Trp Val Ala Leu Lys Glu Val Ser Val

820 825 830

Met Asn Leu Leu Leu Val Val Leu Trp Ala Phe Ala Leu Pro Tyr Pro

835 840 845

Arg Phe Arg Pro Met Ala Ser Cys Leu Ser Thr Val Trp Thr Cys Val

850 855 860

Ile Ile Val Cys Lys Met Leu Tyr Gln Leu Lys Val Val Asn Pro Gln

865 870 875 880

Glu Tyr Ser Ser Asn Cys Thr Glu Pro Phe Pro Asn Ser Thr Asn Leu

885 890 895

Leu Pro Thr Glu Ile Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Gly Pro Val Asp

900 905 910

Pro Ala Asn Trp Phe Gly Val Arg Lys Gly Phe Pro Asn Leu Gly Tyr

915 920 925

Ile Gln Asn His Leu Gln Val Leu Leu Leu Leu Val Phe Glu Ala Ile

930 935 940

Val Tyr Arg Arg Gln Glu His Tyr Arg Arg Gln His Gln Leu Ala Pro

945 950 955 960

Leu Pro Ala Gln Ala Val Phe Ala Ser Gly Thr Arg Gln Gln Leu Asp

965 970 975

Gln Asp Leu Leu Gly Cys Leu Lys Tyr Phe Ile Asn Phe Phe Phe Tyr

980 985 990

Lys Phe Gly Leu Glu Ile Cys Phe Leu Met Ala Val Asn Val Ile Gly

995 1000 1005

Gln Arg Met Asn Phe Leu Val Thr Leu His Gly Cys Trp Leu Val Ala

1010 1015 1020

Ile Leu Thr Arg Arg His Arg Gln Ala Ile Ala Arg Leu Trp Pro Asn

1025 1030 1035 1040

Tyr Cys Leu Phe Leu Ala Leu Phe Leu Leu Tyr Gln Tyr Leu Leu Cys

1045 1050 1055

Leu Gly Met Pro Pro Ala Leu Cys Ile Asp Tyr Pro Trp Arg Trp Ser

1060 1065 1070

Arg Ala Val Pro Met Asn Ser Ala Pro Ile Lys Trp Leu Tyr Leu Pro

1075 1080 1085

Asp Phe Phe Arg Ala Pro Asn Ser Thr Asn Leu Ile Ser Asp Phe Leu

1090 1095 1100

Leu Leu Leu Cys Ala Ser Gln Gln Trp Gln Val Phe Ser Ala Glu Arg

1105 1110 1115 1120

Thr Glu Glu Trp Gln Arg Met Ala Gly Val Asn Thr Asp Arg Leu Glu

1125 1130 1135

Pro Leu Arg Gly Glu Pro Asn Pro Val Pro Asn Phe Ile His Cys Arg

1140 1145 1150

Ser Tyr Leu Asp Met Leu Lys Leu Ala Val Phe Arg Tyr Leu Phe Trp

1155 1160 1165

Leu Val Leu Val Val Val Phe Val Thr Gly Ala Thr Arg Ile Ser Ile

1170 1175 1180

Phe Gly Leu Gly Tyr Leu Leu Ala Cys Phe Tyr Leu Leu Leu Phe Gly

1185 1190 1195 1200

Thr Ala Leu Leu Gln Arg Asp Thr Arg Ala Arg Leu Val Leu Trp Asp

1205 1210 1215

Cys Leu Ile Leu Tyr Asn Val Thr Val Ile Ile Ser Lys Asn Met Leu

1220 1225 1230

Ser Leu Leu Ala Cys Val Phe Val Glu Gln Met Gln Thr Gly Phe Cys

1235 1240 1245

Trp Val Ile Gln Leu Phe Ser Leu Val Cys Thr Val Lys Gly Tyr Tyr

1250 1255 1260

Asp Pro Lys Glu Met Met Asp Arg Asp Gln Asp Cys Leu Leu Pro Val

1265 1270 1275 1280

Glu Glu Ala Gly Ile Ile Trp Asp Ser Val Cys Phe Phe Phe Leu Leu

1285 1290 1295

Leu Gln Arg Arg Val Phe Leu Ser His Tyr Tyr Leu His Val Arg Ala

1300 1305 1310

Asp Leu Gln Ala Thr Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Phe Ala Leu Tyr

1315 1320 1325

Asn Ala Ala Asn Leu Lys Ser Ile Asp Phe His Arg Arg Ile Glu Glu

1330 1335 1340

Lys Ser Leu Ala Gln Leu Lys Arg Gln Met Glu Arg Ile Arg Ala Lys

1345 1350 1355 1360

Gln Glu Lys His Arg Gln Gly Arg Val Asp Arg Ser Arg Pro Gln Asp

1365 1370 1375

Thr Leu Gly Pro Lys Asp Pro Gly Leu Glu Pro Gly Pro Asp Ser Pro

1380 1385 1390

Gly Gly Ser Ser Pro Leu Arg Arg Gln Trp Trp Arg Pro Trp Leu Asp

1395 1400 1405

His Ala Thr Val Ile His Ser Gly Asp Tyr Phe Leu Phe Glu Ser Asp

1410 1415 1420

Ser Glu Glu Glu Glu Glu Ala Val Pro Glu Asp Pro Arg Pro Ser Ala

1425 1430 1435 1440

Gln Ser Ala Phe Gln Leu Ala Tyr Gln Ala Trp Val Thr Asn Ala Gln

1445 1450 1455

Ala Val Leu Arg Arg Arg Gln Gln Glu Gln Glu Gln Ala Arg Gln Glu

1460 1465 1470

Gln Ala Gly Gln Leu Pro Thr Gly Gly Gly Pro Ser Gln Glu Val Glu

1475 1480 1485

Pro Ala Glu Gly Pro Glu Glu Ala Ala Ala Gly Arg Ser His Val Val

1490 1495 1500

Gln Arg Val Leu Ser Thr Ala Gln Phe Leu Trp Met Leu Gly Gln Ala

1505 1510 1515 1520

Leu Val Asp Glu Leu Thr Arg Trp Leu Gln Glu Phe Thr Arg His His

1525 1530 1535

Gly Thr Met Ser Asp Val Leu Arg Ala Glu Arg Tyr Leu Leu Thr Gln

1540 1545 1550

Glu Leu Leu Gln Gly Gly Glu Val His Arg Gly Val Leu Asp Gln Leu

1555 1560 1565

Tyr Thr Ser Gln Ala Glu Ala Thr Leu Pro Gly Pro Thr Glu Ala Pro

1570 1575 1580

Asn Ala Pro Ser Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Ala Glu Glu Pro Leu

1585 1590 1595 1600

Ser Ser Met Thr Asp Asp Met Gly Ser Pro Leu Ser Thr Gly Tyr His

1605 1610 1615

Thr Arg Ser Gly Ser Glu Glu Ala Val Thr Asp Pro Gly Glu Arg Glu

1620 1625 1630

Ala Gly Ala Ser Leu Tyr Gln Gly Leu Met Arg Thr Ala Ser Glu Leu

1635 1640 1645

Leu Leu Asp Arg Arg Leu Arg Ile Pro Glu Leu Glu Glu Ala Glu Leu

1650 1655 1660

Phe Ala Glu Gly Gln Gly Arg Ala Leu Arg Leu Leu Arg Ala Val Tyr

1665 1670 1675 1680

Gln Cys Val Ala Ala His Ser Glu Leu Leu Cys Tyr Phe Ile Ile Ile

1685 1690 1695

Leu Asn His Met Val Thr Ala Ser Ala Gly Ser Leu Val Leu Pro Val

1700 1705 1710

Leu Val Phe Leu Trp Ala Met Leu Ser Ile Pro Arg Pro Ser Lys Arg

1715 1720 1725

Phe Trp Met Thr Ala Ile Val Phe Thr Glu Ile Ala Val Val Val Lys

1730 1735 1740

Tyr Leu Phe Gln Phe Gly Phe Phe Pro Trp Asn Ser His Val Val Leu

1745 1750 1755 1760

Arg Arg Tyr Glu Asn Lys Pro Tyr Phe Pro Pro Arg Ile Leu Gly Leu

1765 1770 1775

Glu Lys Thr Asp Gly Tyr Ile Lys Tyr Asp Leu Val Gln Leu Met Ala

1780 1785 1790

Leu Phe Phe His Arg Ser Gln Leu Leu Cys Tyr Gly Leu Trp Asp His

1795 1800 1805

Glu Glu Asp Ser Pro Ser Lys Glu His Asp Lys Ser Gly Glu Glu Glu

1810 1815 1820

Gln Gly Ala Glu Glu Gly Pro Gly Val Pro Ala Ala Thr Thr Glu Asp

1825 1830 1835 1840

His Ile Gln Val Glu Ala Arg Val Gly Pro Thr Asp Gly Thr Pro Glu

1845 1850 1855

Ser Gln Val Glu Leu Arg Pro Arg Asp Thr Arg Arg Ile Ser Leu Arg

1860 1865 1870

Phe Arg Arg Arg Lys Glu Gly Pro Ala Arg Lys Gly Ala Ala Ala Ile

1875 1880 1885

Glu Ala Glu Asp Arg Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Lys Glu Ala

1890 1895 1900

Pro Thr Gly Arg Glu Lys Arg Pro Ser Arg Ser Gly Gly Arg Val Arg

1905 1910 1915 1920

Ala Ala Gly Arg Arg Leu Gln Gly Phe Cys Leu Ser Leu Ala Gln Gly

1925 1930 1935

Thr Tyr Arg Pro Leu Arg Arg Phe Phe His Asp Ile Leu His Thr Lys

1940 1945 1950

Tyr Arg Ala Ala Thr Asp Val Tyr Ala Leu Met Phe Leu Ala Asp Val

1955 1960 1965

Val Asp Phe Ile Ile Ile Ile Phe Gly Phe Trp Ala Phe Gly Lys His

1970 1975 1980

Ser Ala Ala Thr Asp Ile Thr Ser Ser Leu Ser Asp Asp Gln Val Pro

1985 1990 1995 2000

Glu Ala Phe Leu Val Met Leu Leu Ile Gln Phe Ser Thr Met Val Val

2005 2010 2015

Asp Arg Ala Leu Tyr Leu Arg Lys Thr Val Leu Gly Lys Leu Ala Phe

2020 2025 2030

Gln Val Ala Leu Val Leu Ala Ile His Leu Trp Met Phe Phe Ile Leu

2035 2040 2045

Pro Ala Val Thr Glu Arg Met Phe Asn Gln Asn Val Val Ala Gln Leu

2050 2055 2060

Trp Tyr Phe Val Lys Cys Ile Tyr Phe Ala Leu Ser Ala Tyr Gln Ile

2065 2070 2075 2080

Arg Cys Gly Tyr Pro Thr Arg Ile Leu Gly Asn Phe Leu Thr Lys Lys

2085 2090 2095

Tyr Asn His Leu Asn Leu Phe Leu Phe Gln Gly Phe Arg Leu Val Pro

2100 2105 2110

Phe Leu Val Glu Leu Arg Ala Val Met Asp Trp Val Trp Thr Asp Thr

2115 2120 2125

Thr Leu Ser Leu Ser Ser Trp Met Cys Val Glu Asp Ile Tyr Ala Asn

2130 2135 2140

Ile Phe Ile Ile Lys Cys Ser Arg Glu Thr Glu Lys Lys Tyr Pro Gln

2145 2150 2155 2160

Pro Lys Gly Gln Lys Lys Lys Lys Ile Val Lys Tyr Gly Met Gly Gly

2165 2170 2175

Leu Ile Ile Leu Phe Leu Ile Ala Ile Ile Trp Phe Pro Leu Leu Phe

2180 2185 2190

Met Ser Leu Val Arg Ser Val Val Gly Val Val Asn Gln Pro Ile Asp

2195 2200 2205

Val Thr Val Thr Leu Lys Leu Gly Gly Tyr Glu Pro Leu Phe Thr Met

2210 2215 2220

Ser Ala Gln Gln Pro Ser Ile Ile Pro Phe Thr Ala Gln Ala Tyr Glu

2225 2230 2235 2240

Glu Leu Ser Arg Gln Phe Asp Pro Gln Pro Leu Ala Met Gln Phe Ile

2245 2250 2255

Ser Gln Tyr Ser Pro Glu Asp Val Val Thr Ala Gln Ile Glu Gly Ser

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Ser Gly Ala Leu Trp Arg Ile Ser Pro Pro Ser Arg Ala Gln Met Lys

2275 2280 2285

Arg Glu Leu Tyr Asn Gly Thr Ala Asp Ile Thr Leu Arg Phe Thr Trp

2290 2295 2300

Asn Phe Gln Arg Asp Leu Ala Lys Gly Gly Thr Val Glu Tyr Ala Asn

2305 2310 2315 2320

Glu Lys His Met Leu Ala Leu Ala Pro Asn Ser Thr Ala Arg Arg Gln

2325 2330 2335

Leu Ala Ser Leu Leu Glu Gly Thr Ser Asp Gln Ser Val Val Ile Pro

2340 2345 2350

Asn Leu Phe Pro Lys Tyr Ile Arg Ala Pro Asn Gly Pro Glu Ala Asn

2355 2360 2365

Pro Val Lys Gln Leu Gln Pro Asn Glu Glu Ala Asp Tyr Leu Gly Val

2370 2375 2380

Arg Ile Gln Leu Arg Arg Glu Gln Gly Ala Gly Ala Thr Gly Phe Leu

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Glu Trp Trp Val Ile Glu Leu Gln Glu Cys Arg Thr Asp Cys Asn Leu

2405 2410 2415

Leu Pro Met Val Ile Phe Ser Asp Lys Val Ser Pro Pro Ser Leu Gly

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Phe Leu Ala Gly Tyr Gly Ile Met Gly Leu Tyr Val Ser Ile Val Leu

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Val Ile Gly Lys Phe Val Arg Gly Phe Phe Ser Glu Ile Ser His Ser

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Ile Met Phe Glu Glu Leu Pro Cys Val Asp Arg Ile Leu Lys Leu Cys

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Gln Asp Ile Phe Leu Val Arg Glu Thr Arg Glu Leu Glu Leu Glu Glu

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Glu Leu Tyr Ala Lys Leu Ile Phe Leu Tyr Arg Ser Pro Glu Thr Met

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Ile Lys Trp Thr Arg Glu Lys Glu

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<210> 2

<211> 8089

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gggagccgcc gtccggccca gctcggcccc agtgagccga gcgctgcgct ccgccgaggg 60

gcagggcggt cgcctgagcg agcgcgggcc cgggacgtcg gcaccggcgg ggcggccgaa 120

ggagaaggag gaagaggaga aggcggcgcg cgggtccccg cgggtcagcc atggcgcgcc 180

ggccccgggg cccccgcacc gccccatagc gccgcggcgt ccgctcggtc tgggccgggc 240

cctgggccct ccagccatgg agccgcacgt gctcggcgcg gtcctgtact ggctgctgct 300

gccctgcgcg ctgctggctg cctgcctgct ccgcttcagc ggactctcgc tggtctacct 360

gctcttcctg ctgctgctgc cctggttccc cggccccacc cgatgcggcc tccaaggtca 420

cacaggccgc ctcctgcggg cattgctggg cctcagcctg ctcttcctgg tggcccatct 480

cgccctccag atctgcctgc atattgtgcc ccgcctggac cagctcctgg gacccagctg 540

cagccgctgg gagaccctct cgcgacacat aggggtcaca aggctggacc tgaaggacat 600

ccccaacgcc atccggctgg tggcccctga cctgggcatc ttggtggtct cctctgtctg 660

cctcggcatc tgcgggcgcc ttgcaaggaa cacccggcag agcccacatc cacgggagct 720

ggatgatgat gagagggatg tggatgccag cccgacggca gggctgcagg aagcagcaac 780

gctggcccct acacggaggt cacggctggc cgctcgtttc cgagtcacgg cccactggct 840

gctggtggcg gctgggcggg tcctggccgt aacactgctt gcactggcag gcatcgccca 900

cccctcggcc ctctccagtg tctacctgct gctcttcctg gccctctgca cctggtgggc 960

ctgccacttt cccatcagca ctcggggctt cagcagactc tgcgtcgcgg tggggtgctt 1020

cggcgccggc catctcatct gcctctactg ctaccagatg cccttggcac aggctctgct 1080

cccgcctgcc ggcatctggg ctagggtgct gggtctcaag gacttcgtgg gtcccaccaa 1140

ctgctccagc ccccacgcgc tggtcctcaa caccggcctg gactggcctg tgtatgccag 1200

ccccggcgtc ctcctgctgc tgtgctacgc cacggcctct ctgcgcaagc tccgcgcgta 1260

ccgcccctcc ggccagagga aggaggcggc aaaggggtat gaggctcggg agctggagct 1320

agcagagctg gaccagtggc cccaggaacg ggagtctgac cagcacgtgg tgcccacagc 1380

acccgacacc gaggctgata actgcatcgt gcacgagctg accggccaga gctccgtcct 1440

gcggcggcct gtgcggccca agcgggctga gcccagggag gcgtctccgc tccacagcct 1500

gggccacctc atcatggacc agagctatgt gtgcgcgctc attgccatga tggtatggag 1560

catcacctac cacagctggc tgaccttcgt actgctgctc tgggcctgcc tcatctggac 1620

ggtgcgcagc cgccaccaac tggccatgct gtgctcgccc tgcatcctgc tgtatgggat 1680

gacgctgtgc tgcctacgct acgtgtgggc catggacctg cgccctgagc tgcccaccac 1740

cctgggcccc gtcagcctgc gccagctggg gctggagcac acccgctacc cctgtctgga 1800

ccttggtgcc atgttgctct acaccctgac cttctggctc ctgctgcgcc agtttgtgaa 1860

agagaagctg ctgaagtggg cagagtctcc agctgcgctg acggaggtca ccgtggcaga 1920

cacagagccc acgcggacgc agacgctgtt gcagagcctg ggggagctgg tgaagggcgt 1980

gtacgccaag tactggatct atgtgtgtgc tggcatgttc atcgtggtca gcttcgccgg 2040

ccgcctcgtg gtctacaaga ttgtctacat gttcctcttc ctgctctgcc tcaccctctt 2100

ccaggtctac tacagcctgt ggcggaagct gctcaaggcc ttctggtggc tcgtggtggc 2160

ctacaccatg ctggtcctca tcgccgtcta caccttccag ttccaggact tccctgccta 2220

ctggcgcaac ctcactggct tcaccgacga gcagctgggg gacctgggcc tggagcagtt 2280

cagcgtgtcc gagctcttct ccagcatcct ggtgcccggc ttcttcctcc tggcctgcat 2340

cctgcagctg cactacttcc acaggccctt catgcagctc accgacatgg agcacgtgtc 2400

cctgcctggc acgcgcctcc cgcgctgggc tcacaggcag gatgcagtga gtgggacccc 2460

actgctgcgg gaggagcagc aggagcatca gcagcagcag caggaggagg aggaggagga 2520

ggaggactcc agggacgagg ggctgggcgt ggccactccc caccaggcca cgcaggtgcc 2580

tgaaggggca gccaagtggg gcctggtggc tgagcggctg ctggagctgg cagccggctt 2640

ctcggacgtc ctctcacgcg tgcaggtgtt cctgcggcgg ctgctggagc ttcacgtttt 2700

caagctggtg gccctgtaca ccgtctgggt ggccctgaag gaggtgtcgg tgatgaacct 2760

gctgctggtg gtgctgtggg ccttcgccct gccctaccca cgcttccggc ccatggcctc 2820

ctgcctgtcc accgtgtgga cctgcgtcat catcgtgtgt aagatgctgt accagctcaa 2880

ggttgtcaac ccccaggagt attccagcaa ctgcaccgag cccttcccca acagcaccaa 2940

cttgctgccc acggagatca gccagtccct gctgtaccgg gggcccgtgg accctgccaa 3000

ctggtttggg gtgcggaaag ggttccccaa cctgggctac atccagaacc acctgcaagt 3060

gctgctgctg ctggtattcg aggccatcgt gtaccggcgc caggagcact accgccggca 3120

gcaccagctg gccccgctgc ctgcccaggc cgtgtttgcc agcggcaccc gccagcagct 3180

ggaccaggat ctgctcggct gcctcaagta cttcatcaac ttcttcttct acaaattcgg 3240

gctggagatc tgcttcctga tggccgtgaa cgtgatcggg cagcgcatga actttctggt 3300

gaccctgcac ggttgctggc tggtggccat cctcacccgc aggcaccgcc aggccattgc 3360

ccgcctctgg cccaactact gcctcttcct ggcgctgttc ctgctgtacc agtacctgct 3420

gtgcctgggg atgcccccgg ccctgtgcat tgattatccc tggcgctgga gccgggccgt 3480

ccccatgaac tccgcactca tcaagtggct gtacctgcct gatttcttcc gggcccccaa 3540

ctccaccaac ctcatcagcg actttctcct gctgctgtgc gcctcccagc agtggcaggt 3600

gttctcagct gagcgcacag aggagtggca gcgcatggct ggcgtcaaca ccgaccgcct 3660

ggagccgctg cggggggagc ccaaccccgt gcccaacttt atccactgca ggtcctacct 3720

tgacatgctg aaggtggccg tcttccgata cctgttctgg ctggtgctgg tggtggtgtt 3780

tgtcacgggg gccacccgca tcagcatctt cgggctgggc tacctgctgg cctgcttcta 3840

cctgctgctc ttcggcacgg ccctgctgca gagggacaca cgggcccgcc tcgtgctgtg 3900

ggactgcctc attctgtaca acgtcaccgt catcatctcc aagaacatgc tgtcgctcct 3960

ggcctgcgtc ttcgtggagc agatgcagac cggcttctgc tgggtcatcc agctcttcag 4020

ccttgtatgc accgtcaagg gctactatga ccccaaggag atgatggaca gagaccagga 4080

ctgcctgctg cctgtggagg aggctggcat catctgggac agcgtctgct tcttcttcct 4140

gctgctgcag cgccgcgtct tccttagcca ttactacctg cacgtcaggg ccgacctcca 4200

ggccaccgcc ctgctagcct ccaggggctt cgccctctac aacgctgcca acctcaagag 4260

cattgacttt caccgcagga tagaggagaa gtccctggcc cagctgaaaa gacagatgga 4320

gcgtatccgt gccaagcagg agaagcacag gcagggccgg gtggaccgca gtcgccccca 4380

ggacaccctg ggccccaagg accccggcct ggagccaggg cccgacagtc cagggggctc 4440

ctccccgcca cggaggcagt ggtggcggcc ctggctggac cacgccacag tcatccactc 4500

cggggactac ttcctgtttg agtccgacag tgaggaagag gaggaggctg ttcctgaaga 4560

cccgaggccg tcggcacaga gtgccttcca gctggcgtac caggcatggg tgaccaacgc 4620

ccaggcggtg ctgaggcggc ggcagcagga gcaggagcag gcaaggcagg aacaggcagg 4680

acagctaccc acaggaggtg gtcccagcca ggaggtggag ccagcagagg gccccgagga 4740

ggcagcggca ggccggagcc atgtggtgca gagggtgctg agcacggcgc agttcctgtg 4800

gatgctgggg caggcgctag tggatgagct gacacgctgg ctgcaggagt tcacccggca 4860

ccacggcacc atgagcgacg tgctgcgggc agagcgctac ctcctcacac aggagctcct 4920

gcagggcggc gaagtgcaca ggggcgtgct ggatcagctg tacacaagcc aggccgaggc 4980

cacgctgcca ggccccaccg aggcccccaa tgccccaagc accgtgtcca gtgggctggg 5040

cgcggaggag ccactcagca gcatgacaga cgacatgggc agccccctga gcaccggcta 5100

ccacacgcgc agtggcagtg aggaggcagt caccgacccc ggggagcgtg aggctggtgc 5160

ctctctgtac cagggactga tgcggacggc cagcgagctg ctcctggaca ggcgcctgcg 5220

catcccagag ctggaggagg cagagctgtt tgcggagggg cagggccggg cgctgcggct 5280

gctgcgggcc gtgtaccagt gtgtggccgc ccactcggag ctgctctgct acttcatcat 5340

catcctcaac cacatggtca cggcctccgc cggctcgctg gtgctgcccg tgctcgtctt 5400

cctgtgggcc atgctgtcga tcccgaggcc cagcaagcgc ttctggatga cggccatcgt 5460

cttcaccgag atcgcggtgg tcgtcaagta cctgttccag tttgggttct tcccctggaa 5520

cagccacgtg gtgctgcggc gctacgagaa caagccctac ttcccgcccc gcatcctggg 5580

cctggagaag actgacggct acatcaagta cgacctggtg cagctcatgg cccttttctt 5640

ccaccgctcc cagctgctgt gctatggcct ctgggaccat gaggaggact caccatccaa 5700

ggagcatgac aagagcggcg aggaggagca gggagccgag gaggggccag gggtgcctgc 5760

ggccaccacc gaagaccaca ttcaggtgga agccagggtc ggacccacgg acgggacccc 5820

agaaccccaa gtggagctca ggccccgtga tacgaggcgc atcagtctac gttttagaag 5880

aaggaagaag gagggcccag cacggaaagg agcggcagcc atcgaagctg aggacaggga 5940

ggaagaagag ggggaggaag agaaagaggc ccccacgggg agagagaaga ggccaagccg 6000

ctctggagga agagtaaggg cggccgggcg gcggctgcag ggcttctgcc tgtccctggc 6060

ccagggcaca tatcggccgc tacggcgctt cttccacgac atcctgcaca ccaagtaccg 6120

cgcagccacc gacgtctatg ccctcatgtt cctggctgat gttgtcgact tcatcatcat 6180

catttttggc ttctgggcct ttgggaagca ctcggcggcc acagacatca cgtcctccct 6240

atcagacgac caggtacccg aggctttcct ggtcatgctg ctgatccagt tcagtaccat 6300

ggtggttgac cgcgccctct acctgcgcaa gaccgtgctg ggcaagctgg ccttccaggt 6360

ggcgctggtg ctggccatcc acctatggat gttcttcatc ctgcccgccg tcactgagag 6420

gatgttcaac cagaatgtgg tggcccagct ctggtacttc gtgaagtgca tctacttcgc 6480

cctgtccgcc taccagatcc gctgcggcta ccccacccgc atcctcggca acttcctcac 6540

caagaagtac aatcatctca acctcttcct cttccagggg ttccggctgg tgccgttcct 6600

ggtggagctg cgggcagtga tggactgggt gtggacggac accacgctgt ccctgtccag 6660

ctggatgtgt gtggaggaca tctatgccaa catcttcatc atcaaatgca gccgagagac 6720

agagaagaaa tacccgcagc ccaaagggca gaagaagaag aagatcgtca agtacggcat 6780

gggtggcctc atcatcctct tcctcatcgc catcatctgg ttcccactgc tcttcatgtc 6840

gctggtgcgc tccgtggttg gggttgtcaa ccagcccatc gatgtcaccg tcaccctgaa 6900

gctgggcggc tatgagccgc tgttcaccat gagcgcccag cagccgtcca tcatcccctt 6960

cacggcccag gcctatgagg agctgtcccg gcagtttgac ccccagccgc tggccatgca 7020

gttcatcagc cagtacagcc ctgaggacat cgtcacggcg cagattgagg gcagctccgg 7080

ggcgctgtgg cgcatcagtc cccccagccg tgcccagatg aagcgggagc tctacaacgg 7140

cacggccgac atcaccctgc gcttcacctg gaacttccag agggacctgg cgaagggagg 7200

cactgtggag tatgccaacg agaagcacat gctggccctg gcccccaaca gcactgcacg 7260

gcggcagctg gccagcctgc tcgagggcac ctcggaccag tctgtggtca tccctaatct 7320

cttccccaag tacatccgtg cccccaacgg gcccgaagcc aaccctgtga agcagctgca 7380

gcccaatgag gaggccgact acctcggcgt gcgtatccag ctgcggaggg agcagggtgc 7440

gggggccacc ggcttcctcg aatggtgggt catcgagctg caggagtgcc ggaccgactg 7500

caacctgctg cccatggtca ttttcagtga caaggtcagc ccaccgagcc tcggcttcct 7560

ggctggctac ggcatcatgg ggctgtacgt gtccatcgtg ctggtcatcg gcaagttcgt 7620

gcgcggattc ttcagcgaga tctcgcactc cattatgttc gaggagctgc cgtgcgtgga 7680

ccgcatcctc aagctctgcc aggacatctt cctggtgcgg gagactcggg agctggagct 7740

ggaggaggag ttgtacgcca agctcatctt cctctaccgc tcaccggaga ccatgatcaa 7800

gtggactcgt gagaaggagt aggagctgct gctggcgccc gagagggaag gagccggcct 7860

gctgggcagc gtggccacaa ggggcggcac tcctcaggcc gggggagcca ctgccccgtc 7920

caaggccgcc agctgtgatg catcctcccg gcctgcctga gccctgatgc tgctgtcaga 7980

gaaggacact gcgtccccac ggcctgcgtg gcgctgccgt cccccacgtg tactgtagag 8040

tttttttttt aattaaaaaa tgttttattt atacaaatgg acaatcaga 8089

<210> 3

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<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcctcgtggt ctacaagat 19

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<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ctccctgtta cgcttcaatg ct 22

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<212> DNA

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<400> 6

tgtaggcata tctgaaaggc aagg 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cctcgtcccg tagacaaaat g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tgaggtcaat gaaggggtcg t 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tctttgtgtc ctactctact ttccc 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caacgtacca ggagccactc t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tggttcatcc agtcgctttg 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ttctgttgcc acctttcgg 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gttggtcggt gggttggtag t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gggatggggt gagatttcct t 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

cccgagaggt ctttttccg 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

tgagcaccag tttgctggc 19

Claims (2)

1.PIEZO1蛋白表达的抑制剂在制备治疗食管癌药物中的应用；

所述抑制剂包括PIEZO1蛋白的干扰RNA；

所述PIEZO1蛋白的干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述抑制剂还包括Piezo1抑制慢病毒，所述Piezo1抑制慢病毒中重组有PIEZO1蛋白的干扰RNA。

2.PIEZO1蛋白表达的抑制剂在制备抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭的药物中的应用；

所述抑制剂包括PIEZO1蛋白的干扰RNA；

所述PIEZO1蛋白的干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述抑制剂还包括Piezo1抑制慢病毒，所述Piezo1抑制慢病毒中重组有PIEZO1蛋白的干扰RNA。

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