CN111032069A - Piezo调节剂在制备药物中的用途 - Google Patents

Abstract

提供了调节剂在制备用于调节以下至少一项的药物中的用途，其中所述调节剂用于激活或抑制Piezo：血管发育；血压调节；红细胞功能；上皮稳态；先天性淋巴发育不良；神经元分化；肾功能；膀胱功能障碍；骨骼功能；细胞生长和迁移；癌症发展和转移；温柔触感；机械疼痛；肺功能；神经肌肉功能。

Description

Piezo调节剂在制备药物中的用途

技术领域

本公开内容涉及生物医药，更具体地涉及用于激活或抑制Piezo的调节剂在制备药物中的用途。

背景技术

机械敏感(Mechanosensitive，MS)离子通道是分子力传感器(molecular forcetransducer)，专门用于将各种机械力快速转换为电化学信号以控制关键的生物活动，例如触摸感知、听力和血压调节。因此，有必要了解这种转换过程(称为机械门控(mechanogating))是如何精确发生的。尽管在研究原核MS通道(即MscL)方面已取得重大进展，但我们对哺乳动物MS阳离子通道的机械门控机理了解甚少。

进化上保守的Piezo蛋白家族(包括Piezo1和Piezo2)已被确立为长期寻找的哺乳动物MS阳离子通道。在小鼠中，Piezos已显示出在多种机械力转导(mechanotransduction)过程中起关键作用，包括触感、听觉和与血流相关的切应力。在人类中，导致通道功能改变的Piezo基因中的突变与许多涉及机械力转导的遗传疾病有关。这些研究证明了Piezo通道的功能重要性和作为治疗靶标的潜力。

Piezo通道代表哺乳动物机械敏感阳离子通道的原型。但是，其机械门控机制仍不清楚。

发明内容

本公开内容的实施例试图在至少一定程度上解决现有技术中存在的问题中的至少一个，或者为消费者提供有用的商业选择。

在这里，发明人发现了被称为Jedi的新的Piezo1化学激活剂，其可以直接结合至Piezo1并通过调节其机械敏感性来激活Piezo1。Jedi通过可能位于远端叶片结构中的N端细胞外环区域而不是位于

距离的C端离子传导孔起作用，暗示了机械门控的长距离变构调节。中央区域被确定为形成

长的细胞内梁结构(beam-structure)，该结构将叶片连接到孔。特定细胞外环区域或梁中单个残基的诱变表征揭示了用于Jedi调节和机械力转导的关键决定因素，以及用于独特的机械刺激(例如戳刺(poking)和牵拉(stretch))的指定形式。发明人提出，Piezo1将梁用作杠杆状装置，用于有效地将力从机械敏感叶片转换到离子传导孔，从而实现远距离机械门控。

在这里，发明人还确定了SERCA2(对维持细胞Ca²⁺稳态至关重要的广泛表达的内质网定位Ca²⁺ATPase)是Piezo1的新的调节蛋白。值得注意的是，SERCA2与连接孔模块和机械力转导模块的14个残基组成的接头区域连接，并通过抑制其机械敏感性来抑制Piezo1介导的电流。接头区域中的突变残基影响Piezo1的机械灵敏性和SERCA2介导的调节，表明这些残基在机械门控和调节中的关键作用。重要的是，SERCA2介导的调节严格控制内皮细胞的Piezo1依赖性迁移。总之，通过鉴定Piezo1的新的相互作用蛋白及其机械门控和调节中涉及的关键成分，发明人的研究对该原型机械敏感阳离子通道的机械门控机理和分子调节提供了重要见解。

根据本公开内容的第一广泛方面的实施例，提供了调节剂在制备用于调节以下至少一项的药物中的用途，其中所述调节剂用于激活或抑制Piezo：血管发育；血压调节；红细胞功能；上皮稳态；先天性淋巴发育不良；神经元分化；肾功能；膀胱功能障碍；骨骼功能；细胞生长和迁移；癌症发展和转移；温柔触感；机械疼痛；肺功能；神经肌肉功能。根据一些实施例，用于激活或抑制Piezo的调节剂在调节上述至少一项中显示出显著作用。

根据本公开内容的一些实施例，上述用途可以具有以下附加特征中的至少一种：

根据本公开内容的一些实施例，Piezo是Piezo1或Piezo2。通过实验发现，用于激活或抑制Piezo1或Piezo2的调节剂在调节上述至少一项中显示出更显著的作用。

根据本公开内容的一些实施例，Piezo来自小鼠或人类。

根据本公开内容的一些实施例，所述调节剂用于激活Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个来实现激活Piezo：(1)N端机械力转导模块的细胞外环区域；(2)远端叶片结构；(3)小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；(4)小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；(5)特征性的

长的细胞内梁结构；(6)小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的梁结构的残基Y1307-R1368；(7)小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；(8)小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；以及(9)小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501。根据本公开内容的一些实施例，“作用于”是指但不限于激活、结合或传导。通过实验，发明人发现作用于Piezo的上述位点和/或功能区域中的至少一个的调节剂可以有效地激活Piezo。

根据本公开内容的一些实施例，调节剂是Jedi1、Jedi2或其功能类似物。发明人惊奇地发现，Jedi1、Jedi2或其功能类似物可以有效地激活Piezo1。发明人还研究了Jedi1、Jedi2或功能类似物的特异性激活模式，并成功地发现：细胞外叶片上的Jedi作用可以通过Piezo1的梁特异性地传递到孔中。

根据本公开内容的另一些实施例，调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽如上所定义。优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；或小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；或人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域。通过实验发现，以上定义的这些多肽或其功能类似物的过表达可以有效地激活Piezo。以上定义的多肽或其功能类似物可以用作Piezo激活剂。

根据本公开内容的一些实施例，其中调节剂用于抑制Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个来实现抑制Piezo：(1)小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；(2)小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo2的2173-2752的C端片段；(3)小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及(4)小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。根据本公开内容的一些实施例，“作用于”还指但不限于激活、结合或传导。通过实验，发明人发现作用于Piezo的上述位点和/或功能区域中的至少一个的调节剂可以有效地抑制Piezo。

根据本公开内容的一些实施例，调节剂是SERCA2或其功能类似物。发明人惊奇地发现SERCA2或其功能类似物可有效抑制Piezo1。发明人还研究了SERCA2或其功能类似物的特异性激活模式，并成功地发现SERCA2与连接孔模块和机械力转导模块的14个残基组成的接头区域结合，并通过抑制其机械敏感性来抑制Piezo1介导的电流。

根据本公开内容的一些实施例，调节剂是多肽或其功能类似物，其中该多肽如上所定义，优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的接头区域：2172-2185EKKYPQPKGQKKKK(SEQID NO：1)；或人Piezo1的接头区域：2156-2169EKKYPQPKGQKKKK；或小鼠Piezo2的接头区域：2455-2468EKRYPQPRGQKKKK(SEQ ID NO：3)；或人Piezo2的接头区域：2385-2398EKKYPQPKGQKKKK(SEQ ID NO：4)。通过实验发现，以上定义的这些多肽或其功能类似物的过表达可以有效抑制。以上定义的多肽或其功能类似物可以用作Piezo抑制剂。

根据本公开内容的第二广泛方面的实施例，提供了一种用于筛选药物的方法，其中所述药物用于调节以下至少一项：血管发育；血压调节；红细胞功能；上皮稳态；先天性淋巴发育不良；神经元分化；肾功能；膀胱功能障碍；骨骼功能；细胞生长和迁移；癌症发展和转移；温柔触感；机械疼痛；肺功能；神经肌肉功能，其中所述方法包括：(1)使候选化合物与表达Piezo通道的细胞接触，其中所述细胞来自小鼠或人类；(2)在所述接触之前和之后，检测Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个的激活水平或构象变化：a.N端机械力转导模块的细胞外环区域；b.远端叶片结构；c.小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；d.小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；e.特征性的

长的细胞内梁结构；f.小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的梁结构的残基Y1307-R1368；g.小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；h.小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；i.小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501；j.小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；k.小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo2的2173-2752的C端片段；l.小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及m.小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398，其中基因座和/或功能区域的激活水平升高或基因座和/或功能区域的构象改变，表明候选化合物充当药物。通过根据本实施例的上述方法选择的药物可以有效地用于所述功能中的至少一种。

根据本公开内容的一些实施例，上述方法可以具有以下附加特征中的至少一个：

根据本公开内容的一些实施例，Piezo是Piezo1或Piezo2。

根据本公开内容的第三广泛方面的实施例，提供了一种治疗Piezor相关疾病的方法，其包括：向有此需要的受试者施用调节剂，其中所述调节剂用于激活或抑制Piezo。发现用于激活或抑制Piezo的调节剂可以有效治疗Piezor相关疾病。

根据本公开内容的一些实施例，上述方法可以具有以下附加特征中的至少一个：

根据本公开内容的一些实施例，其中所述Piezo相关疾病包括以下至少一种：

脱水性遗传性口型红细胞增多症(dehydrated hereditary stomatocytosis，DHS)、5型远端关节弯曲(distal arthrogryposis type 5，DA5)、Gordon综合症(Gordonsyndrome，GS)和Marden-Walker综合症(Marden-Walker syndrome，MWS)以及广泛性淋巴发育不良。

根据本公开内容的一些实施例，其中所述调节剂用于激活Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个来实现激活Piezo：(1)N端机械力转导模块的细胞外环区域；(2)远端叶片结构；(3)小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；(4)小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；(5)特征性的

长的细胞内梁结构；(6)小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的梁结构的残基Y1307-R1368；(7)小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；(8)小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；以及(9)小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501，任选地，其中所述调节剂是Jedi1、Jedi2或其功能类似物，任选地，其中所述调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽如上所定义，优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；或小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；或人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域。根据本公开内容的一些实施例，用于通过Piezo的上述位点和/或功能区域中的至少一个激活Piezo的调节剂可以有效地治疗Piezor相关疾病，例如脱水性遗传性口型红细胞增多症(DHS)、5型远端关节弯曲(DA5)、Gordon综合征(GS)和Marden-Walker综合征(MWS)，以及广泛性淋巴发育不良。

根据本公开内容的一些实施例，所述调节剂用于抑制Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个来实现抑制Piezo：(1)小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；(2)小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo2的2173-2752的C端片段；(3)小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及(4)小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398，任选地，其中所述调节剂是SERCA2或其功能类似物，任选地，其中所述调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽如上所定义，任选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；或小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。根据本公开内容的一些实施例，用于通过Piezo的上述位点和/或功能区域之一抑制Piezo的调节剂可以有效地抑制Piezor相关疾病。

本公开内容的以上概述并非旨在描述本公开内容的每个公开的实施例或每个实施方式。随后的附图和详细描述更具体地举例说明了示例性实施例。

本公开内容的实施例的附加方面和优点将在以下描述中部分地给出，从以下描述中部分变得明显，或者从本公开内容的实施例的实践中获悉。

附图说明

从以下参考附图的描述中，本公开内容的实施例的这些和其他方面以及优点将变得明显，并且将更容易理解，其中：

图1显示了被鉴定为对于Piezo1的Jedi1/2激活和机械门控重要的关键元件的拓扑和结构示意图；

图2显示了引起Piezo1介导的Ca²⁺内流的Jedi1和Jedi2的鉴定；

图3显示了Jedi对Piezo1的电生理作用的表征；

图4显示Jedi1/2和Yoda1直接结合到1-2190的N端区域；

图5显示两个细胞外环区域657-677和870-921对于Piezo1的Jedi激活和机械力转导是至关重要的；

图6显示了细胞内梁结构域的比对；

图7显示位于梁结构域中的L1342和L1345决定mPiezo1的化学激活和机械敏感性。

图8显示了作为Piezo1的新相互作用蛋白的SERCA2的鉴定；

图9显示Piezo1的连接中央孔和外围螺旋桨结构的接头区域2172-2185对于SERCA2相互作用是至关重要的；

图10显示SERCA2抑制Piezo1介导的戳刺引起的电流；

图11显示SERCA2通过接头区域抑制Piezo1机械敏感性；以及

图12显示了HUVEC中SERCA2对于Piezo1依赖性机械力转导过程的调节。

具体实施方式

将详细参考本公开内容的实施例。本文中参考附图描述的实施例是示例性、说明性的，并且用于一般性地理解本公开内容。实施例不应被解释为限制本公开内容。在整个说明书中，相同或相似的元件以及具有相同或相似功能的元件由相似的附图标记表示。

另外，诸如“第一”和“第二”等术语在本文中出于描述的目的使用，并且不旨在指示或暗示相对重要性或显著性。

调节剂在制备药物中的用途

根据本公开内容的第一广泛方面的实施例，提供了调节剂在制备用于调节以下至少一项的药物中的用途，其中所述调节剂用于激活或抑制Piezo：血管发育；血压调节；红细胞功能；上皮稳态；先天性淋巴发育不良；神经元分化；肾功能；膀胱功能障碍；骨骼功能；细胞生长和迁移；癌症发展和转移；温柔触感；机械疼痛；肺功能；神经肌肉功能。根据实一些施例，用于激活或抑制Piezo的调节剂在调节上述至少一项中显示出显著作用。

根据本公开内容的一些实施例，Piezo是Piezo1或Piezo2。通过实验发现，用于激活或抑制Piezo1或Piezo2的调节剂在调节上述至少一项中显示出更显著的作用。

根据本公开内容的一些实施例，Piezo来自小鼠或人类。

根据本公开内容的一些实施例，所述调节剂用于激活Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个来实现激活Piezo：(1)N端机械力转导模块的细胞外环区域；(2)远端叶片结构；(3)小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；(4)小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；(5)特征性的

长的细胞内梁结构；(6)小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的梁结构的残基Y1307-R1368；(7)小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；(8)小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；以及(9)小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501。根据本公开内容的一些实施例，“作用于”是指但不限于激活、结合或传导。通过实验，发明人发现作用于Piezo的上述位点和/或功能区域中的至少一个的调节剂可以有效地激活Piezo。

根据本公开内容的一些实施例，调节剂是Jedi1、Jedi2或其功能类似物。发明人惊奇地发现，Jedi1、Jedi2或其功能类似物可以有效地激活Piezo1。发明人还研究了Jedi1、Jedi2或功能类似物的特异性激活模式，并成功地发现：细胞外叶片上的Jedi作用可以通过Piezo1梁特异性地传递到孔中。

根据本公开内容的另一些实施例，所述调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽如上所定义。优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；或小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域。通过实验发现，以上定义的这些多肽或其功能类似物的过表达可以有效地激活Piezo。以上定义的多肽或其功能类似物可以用作Piezo激活剂。

根据本公开内容的一些实施例，其中所述调节剂用于抑制Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个来实现抑制Piezo：(1)小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；(2)小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo2的2173-2752的C端片段；(3)小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及(4)小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。根据本公开内容的一些实施例，“作用于”还指但不限于激活、结合或传导。通过实验，发明人发现作用于Piezo的上述位点和/或功能区域中的至少一个的调节剂可以有效地抑制Piezo。

根据本公开内容的一些实施例，调节剂是SERCA2或其功能类似物。发明人惊奇地发现SERCA2或其功能类似物可有效抑制Piezo1。发明人还研究了SERCA2或其功能类似物的特异性激活模式，并成功地发现SERCA2与连接孔模块和机械力转导模块的14个残基组成的接头区域连接，并通过抑制其机械敏感性来抑制Piezo1介导的电流。

根据本公开内容的一些实施例，调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽如上所定义，优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的接头区域：2172-2185EKKYPQPKGQKKKK(SEQ ID NO：1)；或人Piezo1的接头区域：2156-2169EKKYPQPKGQKKKK；或小鼠Piezo2的接头区域：2455-2468EKRYPQPRGQKKKK(SEQ ID NO：3)；或人Piezo2的接头区域：2385-2398EKKYPQPKGQKKKK(SEQ ID NO：4)。通过实验发现，以上定义的这些多肽或其功能类似物的过表达可以有效抑制Piezo。以上定义的多肽或其功能类似物可以用作Piezo抑制剂。

用于筛选药物的方法

根据本公开内容的第二广泛方面的实施例，提供了一种用于筛选药物的方法，其中所述药物用于调节以下至少一项：血管发育；血压调节；红细胞功能；上皮稳态；先天性淋巴发育不良；神经元分化；肾功能；膀胱功能障碍；骨骼功能；细胞生长和迁移；癌症发展和转移；温柔触感；机械疼痛；肺功能；神经肌肉功能，其中所述方法包括：(1)使候选化合物与表达Piezo通道的细胞接触，其中所述细胞来自小鼠或人类；(2)在所述接触之前和之后，检测Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个的激活水平或构象变化：a.N端机械力转导模块的细胞外环区域；b.远端叶片结构；c.小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；d.小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；e.特征性的

长的细胞内梁结构；f.小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的梁结构的残基Y1307-R1368；g.小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；h.小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；i.小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501；j.小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；k.小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo2的2173-2752的C端片段；l.小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及m.小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398，其中基因座和/或功能区域的激活水平升高或基因座和/或功能区域的构象改变，表明候选化合物充当药物。通过根据本实施例的上述方法选择的药物可以有效地用于所述功能中的至少一项。

根据本公开内容的一些实施例，Piezo是Piezo1或Piezo2。

治疗Piezor相关疾病的方法

根据本公开内容的第三广泛方面的实施例，提供了一种治疗Piezor相关疾病的方法，其包括：向有此需要的受试者施用调节剂，其中所述调节剂用于激活或抑制Piezo。发现用于激活或抑制Piezo的调节剂可以有效治疗Piezor相关疾病。

根据本公开内容的一些实施例，其中Piezor相关疾病包括以下至少一种：

脱水性遗传性口型红细胞增多症(DHS)、5型远端关节弯曲(DA5)、Gordon综合症(GS)和Marden-Walker综合症(MWS)以及广泛性淋巴发育不良。

根据本公开内容的一些实施例，其中所述调节剂用于激活Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个来实现激活Piezo：(1)N端机械力转导模块的细胞外环区域；(2)远端叶片结构；(3)小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；(4)小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；(5)特征性的

长的细胞内梁结构；(6)小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的梁结构的残基Y1307-R1368；(7)小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；(8)小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；以及(9)小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501，任选地，其中调节剂是Jedi1、Jedi2或其功能类似物，任选地，其中调节剂是多肽或其功能类似物，其中多肽如上所定义，优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；或小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；或人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域。根据本公开内容的一些实施例，用于通过Piezo的上述位点和/或功能区域之一激活Piezo的调节剂可以有效治疗Piezor相关疾病。

根据本公开内容的一些实施例，所述调节剂用于抑制Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点和/或功能区域中的至少一个来实现抑制Piezo：(1)小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；(2)小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo2的2173-2752的C端片段；(3)小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及(4)小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398，任选地，其中所述调节剂是SERCA2或其功能类似物，任选地，其中所述调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽如上所定义，任选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；或小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。根据本公开内容的一些实施例，用于通过Piezo的上述位点和/或功能区域之一抑制Piezo的调节剂可以有效地抑制Piezor相关疾病。

化合物或药物组合物

本发明还提供了包含用于激活或抑制Piezo的调节剂(例如Piezo激活剂Jedi1、Jedi2或Piezo抑制剂SERCA2)的药物组合物。根据本发明的一些具体实例，药物组合物可以进一步包含药学上可接受的辅料、载体、佐剂、溶剂及其组合。

本发明提供了一种治疗、预防或改善疾病或病症的方法，其包括施用安全有效量的包含化合物和一种或多种治疗活性剂的药物组合。其中，药物组合包含一种或多种另外的用于治疗Piezor相关疾病的药物。

本文公开的药物组合物的化合物的量是指可以通过以下基因座和/或功能区域中的至少一个有效激活或抑制Piezor的量：a.N端机械力转导模块的细胞外环区域；b.远端叶片结构；c.小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；d.小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；e.特征性的

长的细胞内梁结构；f.小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的梁结构的残基Y1307-R1368；g.小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；h.小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；i.小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501；j.小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；k.小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo2的2173-2752的C端片段；l.小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及m.小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。本发明组合物中活性成分的剂量可以变化，但是，活性成分的量必须使得获得合适的剂型。活性成分可以以提供最佳药物功效的剂量施用于需要这种治疗的患者(动物或人)。选择的剂量基于期望的治疗效果、施用途径和治疗持续时间。取决于疾病的性质和严重程度、患者的体重、患者随后的特殊饮食、同时用药以及本领域技术人员将认识到的其他因素，剂量因患者而异。剂量范围通常为每位患者每天约0.5mg至1.0g，其可以以单剂量或多剂量施用。在一个实施例中，剂量范围为每位患者每天约0.5mg至500mg；在另一个实施例中，为每位患者每天约0.5mg至200mg；在又一个实施例中，为每位患者每天约5mg至50mg。

还应理解，本发明的某些化合物可以以游离形式存在以用于治疗，或在适当的情况下以其药学上可接受的衍生物或前药存在。药学上可接受的衍生物包括药学上可接受的盐、酯、这样的酯的盐、或任何其他加合物或衍生物，其在向有此需要的患者施用后能够直接或间接提供本文中另外描述的化合物或代谢物或其残余物。

本发明的药物组合物可以以散装形式制备和包装，其中可以提取安全有效量的本文公开的式(I)化合物，然后例如以粉末或糖浆给予患者。一般而言，每天向患者施用0.0001至10mg/kg体重的剂量水平以获得有效的Piezo激活或抑制。本发明的药物组合物可以单位剂量形式制备和包装，其中每个物理上离散的单位包含安全有效量的本文公开的式(I)化合物。当以单位剂量形式制备时，本发明的药物组合物通常包含约0.5mg至1g、或1mg至700mg、或5mg至100mg的化合物。

当本发明的药物组合物除了本发明的化合物之外还包含一种或多种其他活性成分时，本发明的化合物与第二活性成分的重量比可以变化并且取决于每种成分的有效剂量。通常，将使用各自的有效剂量。因此，例如，当本发明的化合物与另一种药剂组合时，本发明的化合物与其他药剂的重量比通常为约1000:1至约1:1000，例如约200:1至1:200。本发明化合物和其他活性成分的组合通常也将在上述范围内，但是在每种情况下，应使用有效剂量的每种活性成分。

如本文所用，“药学上可接受的辅料”是指参与赋予药物组合物形式或一致性的药学上可接受的材料、组合物或溶媒。每种辅料在混合时必须与药物组合物的其他成分相容，从而避免在施用于患者时会大幅降低本发明化合物的功效以及导致药物学上不可接受的组合物的相互作用。另外，每种辅料当然必须具有足够高的纯度以使其药学上可接受。

合适的药学上可接受的辅料将根据所选的特定剂量形式而变化。另外，可以因为其在组合物中可以发挥的特定功能选择合适的药学上可接受的辅料。例如，可以因为其促进产生均匀剂量形式的能力来选择某些药学上可接受的辅料。可以因为其促进产生稳定剂量形式的能力来选择某些药学上可接受的辅料。可以因为一旦向患者从一个器官或身体的一部分施用到另一器官或身体的一部分时其促进携带或运输本发明化合物的能力来选择某些药学上可接受的辅料。可以因为其增强患者依从性的能力来选择某些药学上可接受的辅料。

合适的药学上可接受的辅料包括以下辅料类型：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、制粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、矫味剂、风味掩盖剂剂、着色剂、抗结块剂、湿润剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。本领域技术人员将理解，取决于制剂中存在多少辅料以及制剂中存在什么其他成分，某些药学上可接受的辅料可以起到多于一种功能并且可以起到替代的功能。

本领域技术人员具有知识和技术而能够选择合适量的合适药学上可接受的辅料以用于本发明。另外，本领域技术人员可获得许多描述药学上可接受的辅料的资源，这些资源可用于选择合适的药学上可接受的辅料。实例包括Remington's PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company)、The Handbook of Pharmaceutical Additives(Gower Publishing Limited)和The Handbook of Pharmaceutical Excipients(theAmerican Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press)。

在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005,编辑D.B.Troy,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia和Encyclopedia ofPharmaceutical Technology,编辑J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,MarcelDekker,New York(其各自的内容通过引用并入本文)中，公开了用于配制药学上可接受的组合物的多种载体及用于其制备的已知技术。除非任何常规载体介质与本发明化合物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学作用或以有害的方式与药学上可接受的组合物的任何其他组分相互作用，否则预期其使用是在本发明的范围内。

使用本领域技术人员已知的技术和方法制备本发明的药物组合物。Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company)中描述了本领域中常用的一些方法。

因此，本发明的另一方面涉及用于制备药物组合物的方法。所述药物组合物包含本文公开的化合物和药学上可接受的辅料、载体、佐剂、溶媒或其组合，该方法包括混合各成分。包含本文公开的化合物的药物组合物可以在例如环境温度和大气压下制备。

本发明的化合物通常将配制成适合通过期望施用途径向患者施用的剂型。例如，剂型包括适于以下的那些：(1)口服施用，例如片剂、胶囊剂、囊片、丸剂、锭剂、散剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、香囊和扁囊剂；(2)肠胃外施用，例如无菌溶液剂、混悬剂和用于重构的粉剂；(3)透皮施用，例如透皮贴剂；(4)直肠施用，例如栓剂；(5)吸入，例如气雾剂、溶液剂和干粉剂；(6)局部施用，例如乳膏剂、软膏剂、洗剂、溶液剂、糊剂、喷雾剂、泡沫剂和凝胶剂。

在一个实施例中，本文公开的化合物可以制备为口服。在另一个实施例中，本文公开的化合物可以制备为吸入。在另一个实施例中，本文公开的化合物可制备为鼻施用。在另一个实施例中，本文公开的化合物可以制备为经皮施用。在另一些实施例中，本文公开的化合物可制备为局部施用。

本文提供的药物组合物可以作为压制片剂、磨碎的片剂、可咀嚼的锭剂、快速溶解的片剂、多压制片剂或肠溶衣片剂、糖衣或膜衣片剂提供。肠溶衣片剂是用抗胃酸作用但在肠中溶解或崩解的物质包衣的压制片剂，从而保护活性成分不受胃的酸性环境的影响。肠溶衣包括但不限于脂肪酸、脂肪、水杨酸苯酯、蜡、虫胶、氨化虫胶和醋酸纤维素邻苯二甲酸酯。糖衣片剂是被糖衣包围的压制片剂，糖衣可能有益于掩盖令人讨厌的味道或气味以及保护片剂免于氧化。膜衣片剂是被水溶性材料的薄层或膜覆盖的压制片剂。膜衣包括但不限于羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和乙酸纤维素邻苯二甲酸酯。膜衣赋予与糖衣相同的一般特性。多压制片剂是通过多于一个压制循环制成的压制片剂，包括分层片剂、压制包衣或干包衣片剂。

片剂剂型可由粉末、结晶或颗粒形式的活性成分单独或与本文所述的一种或多种载体或辅料(包括粘合剂、崩解剂、控释聚合物、润滑剂、稀释剂和/或着色剂)组合制备。矫味剂和甜味剂在可咀嚼的片剂和锭剂的形成中特别有用。

本文提供的药物组合物可以以软胶囊或硬胶囊的形式提供，所述软胶囊或硬胶囊可由明胶、甲基纤维素、淀粉或藻酸钙制成。硬明胶胶囊也称为干填充胶囊(DFC)，由两个部分组成，一个部分在另一个部分上滑动，从而完全封闭活性成分。软弹性胶囊(SEC)是柔软的球形外壳(例如明胶外壳)，其通过添加甘油、山梨糖醇或类似的多元醇来增塑。软明胶外壳可包含防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂是如本文所述的那些，包括对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯以及山梨酸。本文提供的液体、半固体和固体剂型可以封装在胶囊中。合适的液体和半固体剂型包括碳酸亚丙酯、植物油或甘油三酸酯中的溶液剂和混悬剂。含有这种溶液剂的胶囊剂可以如美国专利No.4,328,245、4,409,239和4,410,545中所述制备。胶囊剂也可以如本领域技术人员已知进行包衣以改变或维持活性成分的溶解。

本文提供的药物组合物可以以液体和半固体剂型提供，包括乳剂、溶液剂、混悬剂、酏剂和糖浆剂。乳剂是两相系统，其中一种液体以小滴的形式分散在另一种液体中，其可以是水包油或油包水。乳剂可包含药学上可接受的非水液体或溶剂、乳化剂和防腐剂。混悬剂可包含药学上可接受的助悬剂和防腐剂。醇水溶液可包含药学上可接受的缩醛，例如低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛，例如乙醛二乙基缩醛；以及具有一个或多个羟基的与水混溶的溶剂，例如丙二醇和乙醇。酏剂是澄清、甜味的水醇溶液剂。糖浆剂是糖(例如蔗糖)的浓水溶液，并且还可以包含防腐剂。对于液体剂型，例如，聚乙二醇中的溶液可以用足量的药学上可接受的液体载体(例如水)稀释以方便地测量用于施用。

其他有用的液体和半固体剂型包括但不限于包含以下的那些：本文提供的活性成分，以及二烷基化的单或聚亚烷基二醇，包括1,2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750是指聚乙二醇的近似平均分子量。这些制剂可进一步包含一种或多种抗氧化剂，例如丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、对苯二酚、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、脑磷脂、抗坏血酸、苹果酸、山梨醇、磷酸、亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢钠、硫代二丙酸及其酯和二硫代氨基甲酸酯。

适当时，可以将用于口服施用的剂量单位制剂微囊化。还可以例如通过将颗粒材料涂覆或嵌入聚合物、蜡等中来制备制剂以延长或维持释放。

本文提供的用于口服施用的药物组合物也还可以以脂质体、胶束、微球或纳米系统的形式提供。胶束剂型可以如美国专利No.6,350,458中所述制备。

本文提供的药物组合物可以以待重构为液体剂型的非泡腾或泡腾的颗粒和粉末形式提供。非泡腾颗粒或粉末中使用的药学上可接受的载体和辅料可以包括稀释剂、甜味剂和湿润剂。泡腾颗粒或粉末中使用的药学上可接受的载体和辅料可以包括有机酸和二氧化碳源。

着色剂和调味剂可以用于所有以上剂型中。

本文公开的化合物也可以偶联至作为靶向药物载体的可溶性聚合物。这样的聚合物可以包括被棕榈酰基取代的聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺基苯酚、聚羟乙基天冬酰胺基苯酚或聚环氧乙烷聚赖氨酸。化合物还可偶联至适合于实现药物的受控释放的一类可生物降解的聚合物，例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二羟基吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。

本文提供的药物组合物可以配制成即释或调释剂型，包括延迟、持续、脉冲、受控、靶向和程序化释放形式。

本文提供的药物组合物可以与不损害期望治疗作用的其他活性成分或与补充期望作用的物质共配制。

本文提供的药物组合物可以通过注射、输注或植入来肠胃外施用，以用于局部或全身施用。如本文所用，肠胃外施用包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、滑膜内和皮下施用。

本文提供的药物组合物可以以适合于肠胃外施用的任何剂型配制，包括溶液剂、混悬剂、乳剂、胶束、脂质体、微球、纳米系统和适合于在注射之前的液体中的溶液剂或混悬剂的固体形式。这样的剂型可以根据药学领域的技术人员已知的常规方法制备(参见，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，同上)。

用于肠胃外施用的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体和辅料，包括但不限于水性溶媒、水混溶性溶媒、非水性溶媒、防止微生物生长的抗微生物剂或防腐剂、稳定剂、溶解度增强剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、润湿剂或乳化剂、络合剂、螯合剂(sequestering或chelating agent)、冷冻保护剂、冻干保护剂、增稠剂、pH调节剂和惰性气体。

合适的水性溶剂包括但不限于水、盐水、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液。非水溶媒包括但不限于植物来源的不挥发油、蓖麻油、玉米油、棉籽油、橄榄油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化植物油、氢化大豆油、椰子油中链甘油三酸酯和棕榈籽油。水混溶性溶媒包括但不限于乙醇、1,3-丁二醇、液态聚乙二醇(例如聚乙二醇300和聚乙二醇400)、丙二醇、甘油、N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜。

合适的抗微生物剂或防腐剂包括但不限于苯酚、甲酚、汞剂(mercurial)、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(例如苄索氯铵)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，以及山梨酸。合适的等渗剂包括但不限于氯化钠、甘油和右旋糖。合适的缓冲剂包括但不限于磷酸盐和柠檬酸盐。合适的抗氧化剂是本文所述的那些，包括亚硫酸氢盐和偏亚硫酸氢钠。合适的局部麻醉剂包括但不限于盐酸普鲁卡因。合适的助悬剂和分散剂是本文所述的那些，包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。合适的乳化剂包括本文所述的那些，包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯80和三乙醇胺油酸酯。合适的螯合剂包括但不限于EDTA。合适的pH调节剂包括但不限于氢氧化钠、盐酸、柠檬酸和乳酸。合适的络合剂包括但不限于环糊精，包括α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精和磺基丁基醚7-β-环糊精(

CyDex,Lenexa,Kans)。

本文提供的药物组合物可以配制用于单剂量或多剂量施用。单剂量制剂包装在安瓿瓶、小瓶或注射器中。多剂量肠胃外制剂必须包含抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂。如本领域已知和实践的，所有肠胃外制剂必须是无菌的。

在一个实施例中，药物组合物以即用型无菌溶液剂形式提供。在另一个实施例中，药物组合物以无菌干可溶性产品(包括冻干粉末剂和皮下注射片剂)的形式提供，以在使用前用溶媒重构。在又一个实施例中，药物组合物以即用型无菌混悬剂的形式提供。在又一个实施例中，药物组合物以无菌干不溶性产品的形式提供，以在使用前用溶媒重构。在另一个实施例中，药物组合物以即用型无菌乳剂提供。

药物组合物可以配制成悬浮液、固体、半固体或触变液体，以作为植入的贮库施用。在一个实施例中，本文提供的药物组合物分散在固体内部基质中，该固体内部基质被不溶于体液但允许药物组合物中的活性成分扩散通过的外部聚合物膜包围。

合适的内部基质包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙二酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、碳酸硅酮共聚物、亲水性聚合物，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的水凝胶、胶原蛋白、交联的聚乙烯醇和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯。

合适的外部聚合物膜包括聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯酯的共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、离聚物聚对苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡胶环氧氯丙烷橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。

在另一方面，本发明的药物组合物被制备成适于通过吸入向患者施用的剂型，例如以干粉剂、气雾剂、混悬剂或溶液剂组合物。在一个实施例中，本发明涉及一种适合以干粉剂通过吸入向患者施用的剂型。在一个实施例中，本发明涉及一种适合以干粉剂通过吸入向患者施用的剂型。通过吸入递送至肺的干粉组合物通常包含作为细分粉末的本文公开的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种作为细分粉末的药学上可接受的辅料。特别适用于干粉剂的药学上可接受的辅料是本领域技术人员已知的，包括乳糖、淀粉、甘露醇以及单糖、二糖和多糖。可以通过例如微粉化和研磨来制备细分粉末。通常，尺寸减小的(例如微粉化的)化合物可以通过约1至约10微米的D₅₀值来定义(例如，使用激光衍射测量)。

可以通过将本文公开的化合物或其药学上可接受的盐混悬或溶解在液化抛射剂中来形成气雾剂。合适的抛射剂包括卤代烃、烃和其他液化气体。代表性的抛射剂包括：三氯氟甲烷(抛射剂11)、二氯氟甲烷(抛射剂12)、二氯四氟乙烷(抛射剂114)、四氟乙烷(HFA-134a)、1,1-二氟乙烷(HFA-152a)、二氟甲烷(HFA-32)、五氟乙烷(HFA-12)、七氟丙烷(HFA-227a)、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、丁烷、异丁烷和戊烷。包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐的气雾剂通常将通过计量吸入器(MDI)施用于患者。这样的设备是本领域技术人员已知的。

气雾剂可包含通常利用MDI使用的另外的药学上可接受的辅料，例如表面活性剂、润滑剂、助溶剂和其他辅料，以改善制剂的物理稳定性、改善阀性能、改善溶解度或改善味道。

适用于透皮施用的药物组合物可以以意在长时间与患者的表皮保持紧密接触的离散贴剂形式存在。例如，可以如Pharmaceutical Research,3(6),318(1986)中一般描述的那样，通过离子电渗法从贴剂递送活性成分。

适用于局部施用的药物组合物可以配制成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、粉末剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。软膏剂、乳膏剂和凝胶剂可以例如用水性或油性基质并添加适当的增稠剂和/或胶凝剂和/或溶剂来配制。因此，这样的基质可以例如包括水和/或油，例如液体石蜡或植物油，例如花生油或蓖麻油，或溶剂，例如聚乙二醇。可以根据基质的性质使用的增稠剂和胶凝剂包括软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、聚乙二醇、羊毛脂、蜂蜡、羧基聚亚甲基和纤维素衍生物，和/或单硬脂酸甘油酯和/或非离子乳化剂。

洗剂可以用水性或油性基质配制，并且通常还将包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂或增稠剂。

用于外部施用的粉末剂可以借助任何合适的粉末基质例如滑石、乳糖或淀粉来形成。滴剂可以用水性或非水性基质配制，其还包含一种或多种分散剂、增溶剂、助悬剂或防腐剂。

局部制剂可以通过每天一次或多次施用来施用到受影响区域；在皮肤区域上，可以有利地使用封闭敷料。可以通过粘合剂储库系统实现连续或延长的递送。

在一个实施例中，本文公开的疗法包括向有需要的患者施用安全有效量的化合物或包含该化合物的药物组合物。本文公开的每个实例都包括治疗上述疾病的方法，其包括向有需要的患者施用安全有效量的化合物。

在一个实施例中，本发明的化合物或其药物组合物可以通过任何合适的施用途径施用，包括全身施用和局部施用两者。全身施用包括口服施用、肠胃外施用、经皮施用和直肠施用。肠胃外施用是指除肠内或经皮以外的施用途径，并且通常是通过注射或输注。肠胃外施用包括静脉内、肌内和皮下注射或输注。局部施用包括施用于皮肤以及眼内、耳内、阴道内、吸入和鼻内施用。在一个实施例中，本发明的化合物或其药物组合物可以口服施用。在另一个实施例中，本发明的化合物或其药物组合物可以通过吸入施用。在另一个实施例中，本发明的化合物或其药物组合物可以鼻内施用。

在一个实施例中，本发明的化合物或其药物组合物可以施用一次或根据给药方案施用，其中在给定的时间段内以不同的时间间隔施用若干个剂量。例如，可以每天一次、两次、三次或四次施用剂量。在一个实施例中，每天一次施用剂量。在另一个实施例中，每天两次施用剂量。可以施用剂量直至达到期望的治疗效果，或无限期地施用以维持期望的治疗效果。用于本发明的化合物或其药物组合物的合适的给药方案取决于该化合物的药代动力学性质，例如吸收、分布和半衰期，其可以由技术人员确定。另外，对于本发明的化合物或其药物组合物，合适的给药方案(包括这样的方案的持续时间)取决于所治疗的疾病、所治疗疾病的严重程度、所治疗患者的年龄和身体状况、待治疗患者的病史、同时治疗的性质、期望的治疗效果以及技术人员的知识和专长内的类似因素。本领域技术人员将进一步理解，合适的给药方案可能需要考虑个体患者对给药方案的响应或者随着时间推移因个体患者需求的变化而进行调整。

本发明的化合物可以与一种或多种其他治疗剂同时或在其之前或之后施用。本发明的各化合物可以通过相同或不同的施用途径分开施用，也可以与其他药剂在相同的药物组合物中一起施用。

对于约50-70kg的受试者，本发明的药物组合物或组合可以为约1-1000mg活性成分，优选约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg活性成分的单位剂量。化合物、药物组合物或其组合的治疗有效剂量取决于受试者的物种，体重、年龄和个体状况，所治疗的病症或疾病或其严重性。本领域普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制病症或疾病进展所必需的每种活性成分的有效量。

有利地使用哺乳动物例如小鼠、大鼠、狗、猴或分离的器官、组织及其制备物，上述剂量特性在体外和体内试验中是可以证明的。本发明的化合物可以以溶液剂(例如优选水性溶液剂)的形式在体外应用，以及在肠内或肠胃外，优选静脉内，例如以混悬剂或水性溶液剂的形式在体内应用。

在一个实施例中，本文公开的化合物的治疗有效剂量为每天约0.1mg至约2,000mg。药物组合物应提供约0.1mg至约2000mg化合物的剂量。在一个具体实施例中，制备药物剂量单位形式以提供，每剂量单位形式的约1mg至约2,000mg、约10mg至约1,000mg、约20mg至约500mg或约25mg至约250mg的活性成分或的必需成分的组合。在一个具体实施例中，制备药物剂量单位形式以提供约10mg、20mg、25mg、50mg、100mg、250mg、500mg、1000mg或2000mg的活性成分。

另外，本发明的化合物可以作为前药施用。如本文所用，本发明化合物的“前药”是化合物的功能衍生物，其在施用于患者后最终在体内释放本发明的化合物。作为前药施用本发明化合物可以使技术人员能够进行以下一项或多项：(a)改变化合物在体内作用的起效；(b)改变化合物在体内作用的持续时间；(c)改变化合物在体内的运输或分布；(d)改变化合物在体内的溶解度；(e)克服化合物的副作用或其他困难。用于制备前药的典型功能衍生物包括在体内以化学方式或酶促裂解方式的化合物的修饰。这样的修饰包括制备磷酸盐、酰胺、酯、硫酯、碳酸酯和氨基甲酸酯，这是本领域技术人员众所周知的。

提供以下实例以便可以更充分地理解本发明。然而，应当理解，这些实施例仅提供了实施本发明的方法，并且本发明不限于这些实施例。

相关方法如下：

方法

荧光成像板读取器(FLIPR)和化合物筛选

使人胚肾293T(HEK293T)细胞在含有4.5mg/ml葡萄糖、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中生长。将细胞接种在50ug/ml聚D-赖氨酸包被的96孔板中(3x10⁴细胞/孔)中，使其生长约18小时，然后使用lipofectamine 2000(Invitrogen,Life technology)用总共250ng含有Piezo1或Piezo2的cDNA和GCaMP6共转染。转染后两天，将细胞用含有1xHBSS(1.3mM Ca²⁺)和10mM HEPES(pH7.2)的缓冲液洗涤。然后将96孔板转移至FLIPR Tetra(Molecular Device)中，以监测添加在独立的化合物板中制备的化合物之前和之后的GCAMP6荧光。对于初筛，我们筛选了约3000种化合物，这些化合物来自Yu Rao博士实验室收集的化学文库，由包含多种特权药物支架的不同种类的杂环构成，或者购自Maybridge(Cambridge,UK)的Maybridge Ro3多样性片段文库(Maybridge Ro3Diversity Fragment Library)，由分子量低于350且具有高的三依从性原则(high ruleof three compliance)的2500种片段化合物组成。以200μM终浓度测试了每种化合物。选择约20个击中物(hit)在Piezo1、Piezo2或载体转染的细胞中进行重新测试。从片段库中鉴定出Piezo1化学激活剂1和2(PCA1和PCA2)。对于后续表征，PCA1购自Alfa Aesar。PCA2和Yoda1分别在Wei He博士和Liansuo Zu博士的实验室合成。有关化学合成，请参见补充实验程序。

Fura-2单细胞Ca²⁺成像

根据之前的方案进行Fura-2单细胞Ca²⁺成像。简单地说，将mCherry-Piezo1 cDNA(1μg)转染的HEK293T细胞接种到12-mm圆形玻璃盖玻片上，将其涂上聚D-赖氨酸并置于24孔板中，并在转染后约36小时进行Fura-2单细胞Ca²⁺成像。用含有1xHBSS(1.3mM Ca²⁺)和10mM HEPES(pH7.2)的缓冲液洗涤细胞，与2.5μM Fura-2和0.05％Pluronic F-127(LifeTechnologies)孵育约1h，然后再次用缓冲液洗涤。将盖玻片安装在配有CoolSNAP CCD相机和Lambda XL灯箱(Sutter Instrument)的倒置Nikon-Tie显微镜中，并选择mCherry阳性和阴性细胞，以使用MetaFluor荧光比率成像软件(Molecular Device)以20×物镜测量340/380的比率(NA 0.75)。

全细胞电生理学和机械刺激

HEK293T细胞培养、瞬时转染和使用Axopatch 200B放大器(Axon Instruments)或HEKA EPC10进行的膜片钳实验的方案与之前所述6,8基本相似。对于全细胞膜片钳记录，当填充有由(单位为mM)133CsCl、1CaCl₂、1MgCl2、5EGTA、10HEPES(pH 7.3，含CsOH)、4MgATP和0.4Na₂GTP构成的内部溶液时，记录电极的电阻为2-3MΩ。细胞外溶液由(单位为mM)133NaCl、3KCl、2.5CaCl2、1MgCl₂、10HEPES(pH 7.3，含NaOH)和10葡萄糖构成。所有实验均在室温下进行。使用Clampex 10.4软件(Axon Instruments)或Patchmaster软件对电流以20kHz采样，并且以5kHz过滤。从电流迹线中离线减去机械刺激之前的泄漏电流。除离子选择性实验外，未针对液体接界电位(LJP)校正电压。使用Clampex 10.4软件计算LJP。

如所述的，使用火抛光的玻璃移液器(尖端直径3-4μm)以80°的角度向记录的细胞传递机械刺激。通过Clampex控制的压电晶体微台(E625LVPZT Controller/Amplifier；Physik Instrument)驱动探针朝向细胞的向下移动。探针在向下和向上运动期间的速度为1μm/ms，并且刺激保持150ms。每20s施加一系列以1μm增量递增的机械阶跃(mechanicalstep)，并在-70mV的保持电位下记录电流。

将PCA1(100mM)、PCA2(100mM)和Yoda1(30mM)的储备溶液溶解在DMSO中并使用外部或内部溶液稀释至如图例所示的期望的最终浓度。使用多通道灌注系统(MPS-2,WorldPrecision Instruments)将化合物溶液吹入记录细胞。在其他条件下，将化合物直接添加到记录室中。

I-V关系和PCa/PCs的测量

根据先前报道的方案5,8进行实验。在由(单位为mM)149Cs-甲磺酸盐、1CsCl和10HEPES(pH7.3，含CsOH)组成的内部溶液和包含(单位为mM)50葡萄糖酸钙、0.5CaCl2、10HEPES和170蔗糖(pH7.3，含CsOH)的细胞外溶液中测量PCa/PCs。对于I-V关系记录，在来自-60mV的保持电位的机械刺激(150ms)之前700ms施加电压阶跃。电压阶跃从-92.9mV到+67.1以20mV的增量给予(校正LJP)。由于mPiezo1野生型的平均I-V曲线在高压下偏离了严格的线性I-V关系，因此选择-32.9mV至+27.1mV的电压范围以通过线性回归拟合平均I-V曲线。通过全细胞I-V曲线的线性回归拟合确定特定记录溶液下每个细胞的反转电位。通过使用以下Goldman-Hodgkin-Katz(GHK)等式计算渗透率：PCa/PCs：

细胞附着电生理学

如先前所述8，在细胞附着的膜片钳配置中记录牵拉激活电流。将电流以20kHz采样，并以2kHz过滤。向移液器填充由(单位为mM)130NaCl、5KCl、10HEPES、1CaCl2、1MgCl2、10TEA-Cl(pH 7.3，含NaOH)组成的溶液和由(单位为mM)140KCl、10HEPES、1MgCl2、10葡萄糖(pH 7.3，含KOH)组成的用于将膜电位归零的外部溶液。所有实验均在室温下进行。使用Patchmaster控制的压力钳HSPC-1装置(ALAscientific)通过记录电极以500ms负压脉冲刺激膜片。以-80mV的保持电位记录牵拉激活的通道，压力阶跃为0至-100mm Hg(-10mm Hg增量)，并且将4-11记录迹线对于每个细胞进行平均用于分析。电流-压力关系通过以下形式的玻尔兹曼方程拟合：I(P)＝[1+exp(-(P–P50)/s)]-1，其中I是给定压力下牵拉激活电流的峰值，P是施加的膜片压力(单位为mm Hg)，P50是引起为Imax的50％的电流值的压力值，并且s反映了电流对压力的敏感性。

分子克隆

如先前所述8，使用一步克隆试剂盒根据说明书将所有构建体亚克隆，并测序以验证期望的突变。

蛋白质纯化

蛋白质纯化程序基本上类似于我们先前描述的方案，对包含mPiezo1野生型或突变蛋白的FPLC(Superose 6柱)峰级分进行SPR结合实验。

表面等离子体共振分析(SPR)

在25℃下，在BIAcore T200仪器(GE Healthcare)上进行通过SPR的实时结合和分析。通过胺偶联方法将蛋白质固定在研究级CM5传感器芯片上。流通池1留空作为参考。将10mM乙酸钠pH5.0[mPiezo1、CED、mPiezo1-Δ(657-677)、mPiezo1-Δ(870-921)]或pH4.5(1-2190)中的蛋白质(50μg/ml)固定在流通池2上。对于数据收集，将化合物以30μl/min的流速以多种浓度在1xPBS和0.05％表面活性剂P20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)的缓冲液中注射到流通池上。使蛋白质和化合物缔合180秒并解离180秒。使用BIAcore T200评估软件通过拟合至1:1亲和结合模型来分析数据。

Piezo1交联和LC-MS/MS分析

使纯化的Piezo1蛋白在室温下与间隔臂长分别为

和

的DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)(disuccinimidyl suberate)、BS3(双[磺基琥珀酰亚胺]辛二酸酯)(bis[sulfosuccinimidyl]suberate)、磺基-GMBS(N[g-马来酰亚胺丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)(N-[gmaleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester)交联。然后将样品消化并进行LC-MS/MS分析。

使用pLink软件鉴定交联肽

pLink搜索参数类似于先前描述的30：仪器，HCD；前体质量公差(precursor masstolerance)，20ppm；碎片质量公差(fragment mass tolerance)，20ppm；交联剂，BS3/DSS(交联位点K和蛋白质N端，交联质量位移(cross-link mass-shift)138.0680796，单联质量位移(mono-link massshift)156.0786442)；交联剂，磺基-GMBS(交联位点K或具有半胱氨酸的蛋白质N端，交联质量位移165.0422，单联质量位移183.05276)；为BS3/DSS搜索指定了固定的修改C57.02146；肽长度，每条链最少4个氨基酸和最多100个氨基酸；肽质量，每条链最小400和最大10,000Da；酶，胰蛋白酶，每条链最多两个错误切割位点(每个交联四个)。mPiezo1的蛋白质序列用于数据库搜索。通过要求FDR<5％、E-值<0.0001、谱计数>＝1来过滤结果。使用pLabel 30注释MS2谱，要求质量偏差≤20ppm。

荧光共振能量转移(FRET)

将HEK293T细胞培养在4室玻璃底皿(Introtro Scientific)中，然后用2μgmPiezo1-Clover(1365)-mRuby2(C)转染或分别用1μg mPiezo1-Clover(C)和1μg mPiezo1-mRuby2(C)cDNA共转染。转染后36小时，用含有1xHBSS(1.3mM Ca2+)和10mM HEPES(pH7.2)的缓冲液洗涤细胞。然后，使用油浸物镜(60X；NA1.4；Olympus)在UVlaser共聚焦显微镜(IX83；Olympus)上对细胞成像。Clover用氩激光在488nm激发，并通过560nm带通滤光片检测，而mRuby2用黄色激光在559nm激发，并通过585nm长通滤光片检测。

使用接受体光漂白法(acceptor photobleaching method)35确定用mPiezo1-Clover(1365)-mRuby2(C)转染或者用mPiezo1-Clover(C)和mPiezo1-mRuby2(C)共转染的单个细胞的FRET。将细胞的所选区域用559nm激光进行光漂白3秒，以实现mRuby2荧光的～80％的光漂白效果，并且在mRuby2接受体光漂白之前和之后获得Clover荧光。通过FV1200FRET分析软件(Olympus)使用以下等式计算FRET数据：FRET效率＝1-[Clover22信号(光漂白之前)/Clover信号(光漂白之后)]。

免疫染色

按照先前报道的程序进行活细胞标记。

cDNA克隆和分子克隆

小鼠Piezo1(mPiezo1)和小鼠Piezo2(mPiezo2)克隆由Scripps研究所的ArdemPatapoutian博士慷慨提供。通过用Flag标签替换Piezo1-GST-ires-GFP或Piezo2-GST-ires-GFP构建体的C端GST标签来产生Piezo1-Flag构建体。Flag-SERCA2克隆是来自中国科学院遗传与发育生物学研究所的黄勋博士(Dr.Xun Huang at the Institute ofGenetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Science)的礼物。用一步克隆试剂盒按照说明书(Vazyme Biotech)构建所有突变、截短和其他分子克隆。通过测序验证所有构建体。

细胞培养和转染

人胚肾293T(HEK293T)细胞培养在补充有10％胎牛血清(FBS)、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM中。Neuro-2A(N2A)细胞培养在含有10％FBS、非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的MEM中。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自AllcellsCo.Ltd.(中国上海)，并在用50μg/mL胶原蛋白-I(Sigma)包被的板中使用补充有EGM-2bullet kit(Lonza)的EGM-2生长培养基培养。HUVEC用于实验多达8代。根据制造商的说明，使用聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)或Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染细胞。

抗体

mPiezo1抗体由Abgent Co.Ltd(中国苏州)定制产生。程序概述如下。在细菌中表达mPiezo1的C端胞外区(氨基酸2218-2453)并且纯化用于在兔中免疫，然后通过抗原亲和色谱纯化mPiezo1兔抗体。该抗体以1:500–1:2000的浓度用于western印迹。用于western印迹的其他抗体包括兔抗GST(Millipore,1:3,000)、小鼠抗SERCA2(Thermo,MA3-910,1:1,000)、小鼠抗Flag(Sigma,克隆M2,1:3,000)、小鼠抗eNOS(BD Biosciences,1:1000)、小鼠抗p(S1177)-eNOS(BD Biosciences,1:1,000)、兔抗β-肌动蛋白(Cell SignalingTechnology,1:3,000)。

GST沉降(GST pull-down)和免疫共沉淀

如先前所述制备来源于用所示构建体瞬时转染的HEK293T的细胞裂解物。对于GST沉降实验，将谷胱甘肽磁珠(Pierce)与细胞裂解物在4℃下孵育过夜。将珠洗涤5次，并在1×SDS上样缓冲液中煮沸5-10分钟。通过SDS-PAGE凝胶分离蛋白质样品，然后根据说明书(Sigma)进行银染或进行western印迹。对于异源表达的Piezo1-Flag的免疫沉淀，使用抗Flag M2磁珠(Sigma)。对于内源Piezo1和SERCA2的免疫共沉淀，将N2A细胞在冰上在Tris-HCl裂解缓冲液[10mM Tris-HCl,pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100、0.5％NP-40、蛋白酶抑制剂(Roche)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂(Roche)]中裂解1小时。将蛋白G磁珠(Cell Signaling Technology)与IgG或抗SERCA2抗体(Thermo,MA3-910,1:100)在4℃孵育2小时。然后将抗体结合的珠与N2A细胞裂解物在4℃下孵育过夜，然后用裂解缓冲液洗涤5次。对免疫沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE和western印迹分析。

western印迹

将来自GST沉降、免疫沉淀或HUVEC细胞裂解物(在Tris-HCl裂解缓冲液中裂解)的蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离。根据先前描述的程序，将蛋白质转移到0.45μmPVDF膜(Millipore)上进行western印迹。简单地说，将膜用TBST缓冲液(含0.1％Tween-20的TBS缓冲液)中的5％脱脂牛奶(Bio-rad)封闭，并与一抗孵育过夜。在用TBST缓冲液洗涤3次之后，将膜与过氧化物酶偶联的抗兔IgG二抗(CST,1:10,000)或抗小鼠IgG二抗(pierce,1:20,000)于室温孵育1小时，然后洗涤并使用ECL检测试剂盒(Pierce)检测。

细胞表面生物素化

将培养的细胞用含有Ca²⁺/Mg²⁺的冰冷的DPBS(DPBSCM)(BeyotimeBiotechnology)洗涤3次，与含有0.5mg/mL NHS-LC-Biotin(Pierce)的DPBSCM孵育。在4℃下孵育45分钟后，通过用100mM甘氨酸溶液代替Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液来终止生物素化反应。然后裂解细胞。将2％的裂解物用作全细胞裂解物样品，并将剩余的细胞裂解物与链霉亲和素磁珠(Pierce)在4℃孵育过夜。洗涤5次后，使沉淀的样品变性，并准备用于SDS-PAGE凝胶分离和western印迹。

质谱

将纯化的蛋白质样品在8％SDS-PAGE凝胶上分离，并通过银染可视化。切下特异性存在于mPiezo1-GST样品中但不存在于GST对照样品中的凝胶带，并在清华大学蛋白质核心设施(Protein Core Facility of Tsinghua University)进行质谱鉴定。质谱分析的详细步骤如前所述。

RNA干扰

通过包含对照或mPiezo1 shRNA的慢病毒感染，实现N2A细胞中Piezo1的敲低。为了产生慢病毒，使用PEI将包含shRNA编码序列的PLL3.7慢病毒载体和辅助载体(pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pCMV-VSV-G)共转染到HEK293T细胞中。72至96小时后，收集存在于培养基中的病毒，并通过0.45μm大小的过滤器(Millipore)过滤。使用聚乙二醇沉淀(Sigma)，将含病毒的培养基进一步浓缩200倍。为了感染N2A细胞，将含有10μl病毒溶液和8ug/mL的溴化己二甲醚(Sigma)的新鲜MEM培养基添加到6孔板的一个孔中。感染后72小时，收获细胞用于RNA分离和随后的定量实时PCR以验证敲低效率。对于HUVEC中的敲低实验，按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用50nM siRNA转染细胞。4-6小时后，将培养基更换为新鲜的EGM-2培养基。转染后72小时，收获细胞，并对细胞裂解物进行western印迹以分析敲低效率。

shRNA或siRNA序列在下面列出：

mPiezo1 shRNA：TCGGCGCTTGCTAGAACTTCA(SEQ ID NO：5)；

混杂siRNA：UUCUCCGAACGUGUCACGU(SEQ ID NO：6)；

hPiezo1 siRNA：AGAAGAAGAUCGUCAAGUA(SEQ ID NO：7)；

hSERCA2 siRNA混合池：

AAGCAGGACAUCAAUGAGCAA(SEQ ID NO：8)；

AAGGUGAUACUUGUUCCCUUA(SEQ ID NO：9)；

CAACUGGAGUUAACACCGAAA(SEQ ID NO：10)；

CAGAAAGUCAAUGUCGGUUUA(SEQ ID NO：11)；

用于Piezo1的实时PCR引物包括：

Piezo1正向引物：5’-TGCCATGCTCCTCTATCTGCT-3’(SEQ ID NO：12)；

Piezo1反向引物：5’-GGCGCACACATAGATCCAGTA-3’(SEQ ID NO：13)；

GAPDH正向引物：5’-GCACCACCAACTGCTTAG-3’(SEQ ID NO：14)；

GAPDH反向引物：5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’(SEQ ID NO：15)。

Piezo1-Flag敲入N2A细胞系(Piezo1-Flag knock-in N2A cell line)的产生

所有程序按照Feng Zhang实验室提供的方案进行。简单地说，通过CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu)设计单向导RNA(sgRNA)序列，然后合成一对包含sgRNA序列的互补寡核苷酸DNA片段，退火并插入到Cas9-gRNA表达质粒pX330(Addgene)中。通过在位点G2410两侧插入一对mPiezo1基因组序列(约600bp)作为同源臂和插入的Flag标签序列来由pcDNA3.1(-)质粒(含ires-GFP报告基因)制备基于质粒的供体修复模板。用含有sgRNA序列的pX330质粒和供体质粒转染N2A细胞。转染后48小时，通过荧光激活细胞分选(FACS)分离GFP阳性细胞，并将其传代到96孔板中(每孔单细胞)。然后选择生长的细胞克隆，并通过PCR和测序检测Piezo1基因组中Flag-标签编码序列的插入。

mPiezo1 sgRNA序列：UGGGGAGCAAGCGGGCACCA(SEQ ID NO：16)；

供体质粒的插入序列：

免疫染色

基本上如先前报道进行免疫染色实验。对于活细胞标记，将盖玻片上培养的细胞与兔抗Flag抗体(Sigma，克隆M2，1:100)在室温下孵育1小时。在用培养基洗涤之后，将细胞与Alexa Fluor 594驴抗兔IgG二抗(Invitrogen，1:200)在室温下孵育1小时。在洗涤之后，将细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定。对于细胞可渗透染色，将细胞固定，用0.02％Triton X-100透化并用1×PBS缓冲液中的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭。然后将细胞与兔抗Flag抗体(Sigma，克隆M2，1:500)或小鼠抗SERCA2(1:500)在室温下孵育1小时。在用TBST缓冲液洗涤之后，将细胞与Alexa Fluor 594驴抗兔IgG二抗(Invitrogen，1:500)或Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG二抗(Invitrogen，1:500)在室温下孵育1小时。在洗涤之后，将盖玻片安装到载玻片上进行共聚焦成像。所有成像步骤均使用488nm激发波长和562nm发射波长在具有60x油镜(N.A.＝0.95)或100×油镜(N.A.＝1.49)的Nikon A1共焦显微镜(NikonInstruments)或DeltaVision Elite高分辨率显微镜(GE Healthcare Life Sciences)上进行。使用Nikon NIS-Elements AR软件或SoftWoRx Explorer软件(GE Healthcare LifeSciences)分析图像。在来自多个细胞的两个彩色图像的细胞中的不同亚细胞部分，使用安装了ImageJ软件的JACoP插件(美国国立卫生研究院)将Piezo1-Flag敲入N2A细胞中Piezo1和SERCA2的共定位的定量分析计算为皮尔逊系数(Pearson’s coefficient)。

Fura-2单细胞Ca²⁺成像

根据先前的方法进行Fura-2单细胞Ca²⁺成像。简单地说，将经Flag-SERCA2-ires-GFP cDNA cDNA(0.5μg)或经Flag-SERCA2-IRES-GFP cDNA(0.5μg)转染的HEK293T细胞铺板并置于24孔板中，并且在转染后约36小时进行Fura-2单细胞Ca²⁺成像。将聚D-赖氨酸包被的8mm圆形玻璃盖玻片上生长的细胞用含有1xHBSS(1.3mM Ca²⁺)和10mM HEPES(pH 7.2)的缓冲液洗涤，然后与2.5μM Fura-2-AM(Molecular Probes)和0.05％Pluronic F-127(Lifetechnologies)在室温下孵育30分钟，然后用缓冲液洗涤。将盖玻片安装在配有CoolSNAPCCD相机和Lambda XL灯箱(Sutter Instrument)的倒置Nikon-Tie显微镜中，并选择mCherry或GFP阳性和阴性细胞，以使用MetaFluor荧光比率成像软件(Molecular Device)以20×物镜(N.A.＝0.75)测量340/380比率。

全细胞电生理学和机械刺激

HEK293T细胞培养、瞬时转染和使用Axopatch 200B放大器(Axon Instruments)或HEKA EPC10进行的膜片钳实验的方案与先前所述¹⁹基本相似。为了研究SERCA2对Piezo1 WT或突变体的调节作用，将Flag-SERCA2-ires-GFP/Piezo1-mCherry或FLAG-SERCA2-ires-RFP/Piezo1-pp-GST-ires-GFP共转染以鉴定显示GFP和mCherry或RFP两种信号的共表达细胞。在两个转染条件之间观察到的机械激活电流相似，因此将数据合并。

对于全细胞膜片钳记录，当填充有由(单位为mM)133CsCl、1CaCl₂、1MgCl₂、5EGTA、10HEPES(pH 7.3，含CsOH)、4MgATP和0.4Na₂GTP构成的内部溶液时，记录电极的电阻为2-3MΩ。细胞外溶液由(单位为mM)133NaCl、3KCl、2.5CaCl₂、1MgCl₂、10HEPES(pH 7.3，含NaOH)和10葡萄糖构成。所有实验均在室温下进行。使用Clampex 10.4软件(Axon Instruments)或Patchmaster软件对电流以20kHz采样，并且以5kHz过滤。从电流迹线中离线减去机械刺激之前的泄漏电流。未针对液体接界电位(LJP)校正电压。

如上所述，使用火抛光的玻璃移液器(尖端直径3-4μm)以80°的角度向记录的细胞传递机械刺激。通过Clampex控制的压电晶体微台(E625LVPZT Controller/Amplifier；Physik Instrument)驱动探针朝向细胞的向下移动。探针在向下和向上运动期间的速度为1μm/ms，并且刺激保持150ms。每20s施加一系列以1μm增量递增的机械阶跃，并在-70mV的保持电位下记录电流。

细胞附着电生理学

如先前所述¹⁹，在细胞附着的膜片钳配置中记录牵拉激活的电流。电流以20kHz采样，并以2kHz过滤。向移液器填充由(单位为mM)130NaCl、5KCl、10HEPES、1CaCl₂、1MgCl₂、10TEA-Cl(pH 7.3，含NaOH)组成的溶液和由(单位为mM)140KCl、10HEPES、1MgCl₂、10葡萄糖(pH 7.3，含KOH)组成的用于将膜电位归零的外部溶液。所有实验均在室温下进行。使用Patchmaster控制的压力钳HSPC-1装置(ALA-scientific)通过记录电极以500ms负压脉冲刺激膜片。以-80mV的保持电位记录牵拉激活的通道，压力阶跃为0至-100mm Hg(-10mm Hg增量)，并且将4-11记录迹线对于每个细胞进行平均用于分析。电流-压力关系通过以下形式的玻尔兹曼方程拟合：I(P)＝[1+exp(-(P–P₅₀)/s)]^-1，其中I是给定压力下牵拉激活电流的峰值，P是施加的膜片压力(单位为mm Hg)，P₅₀是引起为Imax的50％的电流值的压力值，并且s反映了电流对压力的敏感性。

细胞迁移测定

使用Transwell渗透性支持物(8.0μm孔，Corning)进行细胞迁移测定。将用siRNA转染的HUVEC用不含FBS的EGM-2培养基饥饿4-6小时，然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)消化。将细胞重悬并在含有0.4％FBS的100μl EGM-2培养基中以5×10⁴个细胞/孔的浓度传代到transwell插入物中。在24孔板中，在下部隔室中添加500μl补充有0.4％FBS和25ng/mLVEGF(Peprotech)的EGM2培养基。在补充有0.5％CO₂的细胞培养箱中于37℃孵育6-8小时后，将插入物用4％PFA于37℃固定10分钟。在用1×PBS洗涤之后，轻轻擦拭每个插入物内部的细胞，并用0.1％的结晶紫(Amersco)将每个插入物的底面染色。使用Olympus IX73光学显微镜对迁移细胞进行成像，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)进行评估。

细胞渗透性肽

由GeneScript(中国南京)合成mPiezo1蛋白的接头区域(氨基酸2171-2185)的序列，并在其N端进行豆蔻酰化(myr-NH2-TEKKYPQPKGQKKKK-COOH)。合成了具有相同的组成但是不与任何已知蛋白质类似的混杂肽(myr-NH2-KQKPKTKEKYKQKGT-COOH)。对于GST沉降，将肽以200μM的工作浓度添加到细胞裂解物中，并孵育过夜。对于全细胞膜片钳实验，将肽在内部溶液(50μM,200μM)中预混合并填充到移液器中。对于利用HUVEC迁移和western印迹，将肽以50μM的终浓度添加到培养基中至少30分钟。

试剂

特异性靶向人SERCA2的siRNA(产品ID：SI02626673、SI02626680、SI03053337、SI03062710)购自Qiagen。靶向小鼠SERCA2的siRNA由Sigma合成。混杂siRNA和靶向人Piezo1的siRNA由GenePharma Co.Ltd.(中国上海)合成。Yoda1购自Maybrige。GsMTx4购自Tocris Bioscience。其他化学品购自Sigma或Ameresco。

数据分析

所有数据均显示为平均值±SEM。使用未配对的学生t检验或单方差ANOVA分析多个样品来评估统计学显著性。

实例

在本研究中，发明人首先进行了高通量筛选以鉴定出Piezo1的两种新的化学激活剂。鉴于先前报道的Piezo1化学激活剂Yoda1被称为Jedi33，发明人将我们新的Piezo1激活剂称为Jedi1和Jedi2。利用Jedi1/2和Yoda1作为宝贵的工具化合物，发明人发现了对于Piezo1的Jedi1/2激活和机械力转导所需的关键组件，包括两个胞外环(657-677和870-921)，中央梁构成区(1301-1363)，以及梁结构域中的两个残基L1342和L1345(图1)。发明人提出，较长的细胞内梁可利用L1342/L1345作为枢轴点来形成杠杆状装置，从而使Piezo1有效地将力从远端机械敏感叶片传递到中央离子传导孔(图1)。

新的Piezo1化学激活剂的高通量筛选和鉴定

药理化合物是探测离子通道的结构-功能关系的宝贵工具。为了鉴定Piezo通道的特异性化学激活剂，发明人已使用96孔格式的荧光成像板读取器(FLIPR)筛选了约3000种化合物，这些化合物可引起用小鼠Piezo1(mPiezo1)或mPiezo2共转染并且遗传编码Ca²⁺报告基因GCAMP6的HEK293T细胞中的Ca²⁺增加。发明人最初选择在Piezo1或Piezo2转染的细胞中引起Ca²⁺响应的化合物，随后排除在Piezo1、Piezo2和载体转染的细胞中引起Ca²⁺响应的非特异性击中物(图2a)。最终，发明人成功鉴定出两种Piezo1化学激活剂，但未鉴定出任何特异性Piezo2激活剂。鉴于先前鉴定的Piezo1化学激活剂已命名为Yoda1，我们将两种新的Piezo1激活剂称为Jedi1和Jedi2。

Jedi1和Jedi2是分子量分别为202.81和208.23Da的小分子。它们具有3-羧酸甲基呋喃的共同结构基序(图2b中红色突出显示的部分)，表明3-羧酸甲基呋喃基序可能解释了它们对Piezo1的激活作用。Jedi1/2与Yoda1没有结构相似性，暗示了不同的激活机制(图2b)。Jedi1/2中3-羧酸甲基呋喃基序的存在可能解释了它们比Yoda1(至多约30μM)相对更好地水溶解度(至多约2mM)。

Jedi1和Jedi2两者均在mPiezo1转染的细胞中特异性引起剂量依赖性响应，但是在mPiezo2或载体转染的细胞中则没有(图2c，d)。与具有共同结构基序的Jedi一致，Jedi1和Jedi2对mPiezo1具有可比较的EC₅₀，分别为约200μM和158μM(图2c，d)。发明人进一步使用比率式Ca²⁺染料Fura-2的单细胞Ca²⁺成像进一步表征了Jedi引起的Ca²⁺响应(图2e-g)。Jedi1和Jedi2二者在mPiezo1-mCherry构建体转染的mCherry阳性HEK293T细胞中引起强的Ca²⁺增加，所述细胞也响应于Yoda1(图2e)。此外，去除细胞外Ca²⁺消除了响应，表明Jedi引起Ca²⁺内流，而不是从ER Ca²⁺储库的Ca²⁺释放(图2f)。人Piezo1(hPiezo1)也响应于Jedi1(图2g)。值得注意的是，Jedi诱导的响应显示出快速激活，明显的衰减和快速的可逆性(图2e-g)。相比之下，Yoda1诱导的响应具有缓慢的激活，没有衰减和差可逆性(图2e)。这些数据表明，Jedi和Yoda1可能具有不同的激活机制。

Jedi引起Piezo1介导的电流

接下来，发明人使用膜片钳电生理学来表征Jedi对Piezo1的电生理学作用。在无间隙记录模式下的全细胞膜片配置中，我们发现向表达mPiezo1-mRuby2的HEK293T细胞喷射施用Jedi1或Yoda1分别引起11.1±2.1pA/pF和5.1±0.4pA/pF的内向电流。相比之下，两种化合物都不会引起来自载体转染细胞的电流(图3a，b)。这些数据表明Jedi1和Yoda1对Piezo1的激动作用，与其触发Piezo1依赖性Ca²⁺内流的能力一致。此外，与单细胞钙成像结果一致(图2e)，Jedi1引起的电流比Yoda1诱导的电流显示更快的开始和更快的衰减(图3a，c)，进一步支持Jedi1和Yoda1可能具有不同的激活机制。

为了测试Jedi1和Yoda1对Piezo1的激活作用是否需要细胞内调节因子，我们利用存在于移液器溶液的化合物进行了由内向外(inside-out)膜片记录。Jedi1和Yoda1分别导致打开概率(NP_o)的9.6±2.4和14.8±0.6倍变化(图3d，e)。同样，Jedi2也引起了Piezo1的显著更多打开。相反，任何一种化合物都不会改变在-80mV处测得的单位电导率(图3f)。总之，这些数据表明Jedi1/2和Yoda1在门控Piezo1中的激动作用不依赖于细胞内调节因子。Jedi1通过Piezo1的细胞外侧发挥作用以增强其机械敏感性

接下来，发明人使用与压力钳耦合的细胞附着的膜片配置评估了Jedi1和Yoda1对牵拉诱导的Piezo1电流的影响。在没有外部施加压力的情况下(但是，应注意，细胞附着的膜片中可能存在膜张力)，利用存在于移液器溶液中的Jedi1或Yoda1的膜片比利用DMSO对照的膜片显示出更多的自发单通道打开(Jedi1和Yoda1的NP_o分别具有4.7±1.4和3.1±1.3倍变化)，这与Jedi1和Yoda1对Piezo1的激动作用一致(图3a-e)。Jedi1和Yoda1都没有改变最大牵拉诱导的Piezo1电流。然而，与先前的报道³³一致，Yoda1引起了压力-电流关系的显著向左移动(图3g，h)。重要的是，Jedi1产生了类似的效果(图3g，h)。对于DMSO、Jedi1和Yoda1，测得的P₅₀(半数最大激活所需的压力)分别为-27.0±3.4、-16.7±2.2和-15.1±0.9mmHg(图3i)。总的来说，这些数据表明，Jedi1增强了Piezo1的机械敏感性。

接下来，发明人检查了Jedi1/2对通过用Piezo驱动的钝玻璃移液管戳刺质膜引起的Piezo1全细胞电流的影响。在施用Jedi1或Jedi2时，戳刺诱导的表达mPiezo1-mRuby2的细胞的全细胞电流分别增加3.8±0.5和5.4±0.7倍，表明增强了Piezo1介导的机械激活电流。发明人进一步检查了在DMSO、Jedi1和Yoda1的存在下Piezo1的逐步戳刺诱导的电流。当在细胞外施用时，Jedi1显著增强了戳刺诱导的最大电流(Imax)，并使失活Tau减慢到与Yoda1对Piezo1相似的程度(图3j-l)。相比之下，当通过移液器溶液施用到细胞内侧时，Jedi1没有作用(图3m-o)。这些数据表明，Jedi1在细胞外侧增强Piezo1介导的戳刺电流，与其亲水特性一致。相比之下，细胞内施用的Yoda1在增强戳刺电流和减缓失活方面仍然有效(图3m-o)。此外，Jedi1和Yoda1的共施用在增强Piezo1戳刺电流方面产生了协同作用(图3p-r)。这些数据进一步支持Jedi1和Yoda1通过不同的机制来调节Piezo1。

Jedi1/2结合至N端区域(1-2190)而不是C端胞外结构域(2214-2457)

接下来，发明人采用表面等离子体共振(SPR)结合测定法来检查Jedi1/2是否直接结合至溶解在C₁₂E₁₀洗涤剂中的纯化mPiezo1蛋白。基于胺偶联方法，使用含有10mM乙酸钠(pH 5.0)、150mM NaCl、0.026％C₁₂E₁₀和0.05％表面活性剂P20的缓冲液将Piezo1蛋白(50μg/ml)最佳固定在研究级CM5传感器芯片上。负染色电子显微镜显示低pH缓冲液条件似乎不会引起Piezo1蛋白完整性的明显变化。Yoda1已显示激活重构为脂质双层的纯化Piezo1蛋白，表明直接结合机制。与此相符，实时SPR结合测定表明Yoda1以45.6±14.3μM的K_d结合到固定化mPiezo1蛋白(图4e，f)，接近其估计的约17.1μM的EC₅₀。这些数据不仅首次提供了Yoda1与Piezo1蛋白结合的直接证据，而且还验证了SPR结合测定。重要的是，发明人发现Jedi1和Jedi2分别以2754±425和2770±178μM的K_d与mPiezo1蛋白结合(图4a-d)。相比之下，对照化合物未显示任何结合(图4g，h)，表明Yoda1和Jedi1/2与Piezo1的结合不太可能是由于非特异性结合。结合观察到的Jedi1/2通过Piezo1的细胞外侧起作用而不依赖于细胞内调节因子，这些结合结果表明Jedi1/2直接作用于Piezo1。但是，由于其低结合亲和力，我们不能完全排除Jedi1/2可能间接激活Piezo1的可能性。

由于Jedi1/2通过Piezo1的细胞外侧起作用，因此发明人询问其是否可能与C端细胞外结构域(CED)(2214-2457)结合，该结构域三聚化以形成中央离子传导孔模块的细胞外帽结构(图1)。然而，Jedi1/2、Yoda1和对照化合物均不与纯化CED蛋白(由于它们是可溶性蛋白，因此不使用C₁₂E₁₀洗涤剂)结合(图4a-h)。接下来，我们使用与mPiezo1相同的纯化程序纯化了大的N端片段[mPiezo1(1-2190)]蛋白。纯化mPiezo1(1-2190)蛋白质的FPLC谱显示，它们可能以包括三聚体在内的多种寡聚状态存在。我们使用对应于三聚体蛋白的FPLC级分进行SPR结合测定。Jedi1/2和Yoda1以与mPiezo1几乎相同的程度与mPiezo1(1-2190)]蛋白结合(图4a-f)。相比之下，对照化合物没有显示任何结合(图4g，h)。总之，这些数据表明，Jedi1/2和Yoda1与残基1-2190的N端片段结合，该片形成外围螺旋桨状结构，并可能充当Piezo1的机械力转导模块^7,8。鉴于Jedi1/2通过细胞外侧发挥功能，我们提出Jedi1/2与可能位于远端叶片结构中的细胞外环区域结合。Jedi结合区相对于孔的远端定位指示Piezo1的独特的远距离变构机械门控。

残基657-677和870-921的细胞外环区域对于Piezo1的Jedi激活是必要的，但对于Piezo1的Yoda1激活不是

为了鉴定对于Jedi激活的关键细胞外区域，我们产生了一系列缺失突变体，其中我们一次一个移除了先前验证的细胞外环(图1a)，所述缺失突变体包括mPiezo1-Δ(84-122)、mPiezo1-Δ(275-317)、mPiezo1-Δ(492-521)、mPiezo1-Δ(657-677)、mPiezo1-Δ(870-921)、mPiezo1-Δ(1060-1150)。Western印迹显示，mPiezo1-Δ(657-677)和mPiezo1-Δ(870-921)具有与mPiezo1相当的表达，而其他缺失突变体具有大幅降低的表达。使用在mPiezo1或缺失突变体的CED中细胞外定位的残基A2419之后插入的FLAG-标签的活免疫染色，我们发现只有mPiezo1-Δ(657-677)和mPiezo1-Δ(870-921)显示出质膜标记(分别为mPiezo1水平的96％和54％)(图5a，b)。与缺失突变体的表达模式一致，只有mPiezo1-Δ(657-677)和mPiezo1-Δ(870-921)是有功能的(图5c，d)。因此，我们集中于表征这两种突变体。

值得注意的是，对于表达mPiezo1-Δ(657-677)或mPiezo1-Δ(870-921)的细胞，Jedi1/2既没有引起Ca²⁺响应(图5d)和全细胞电流(图5e)，也没有增强戳刺或牵拉诱导的电流(图5f)。相比之下，对于mPiezo1-Δ(657-677)或mPiezo1-Δ(870-921)转导的细胞，Yoda1保留了引起Ca²⁺响应(图5d)、全细胞电流(图5e)和增强戳刺诱导的电流(图5f)。尽管在质膜中显示相对降低的表达(图5b)，但mPiezo1-Δ(870-921)介导了与mPiezo1相当的Yoda1诱导的Ca²⁺响应和电流(图5d，e)。此外，Yoda1诱导的表达mPiezo1、mPiezo1-Δ(657-677)或mPiezo1-Δ(870-921)的细胞的戳刺电流的增加倍数没有显著差异(分别为4.8±1.1、7.7±2.5和7.2±2.6倍)(图5g)。这些结果表明，这两个环区域对于Jedi引起的Piezo1的激活和调节是必要的，但对于Yoda1引起的Piezo1的激活和调节不是，这与这两类激活剂对Piezo1的不同激活机制是一致的。

发明人询问这两个区域是否可能形成Jedi1/2的结合位点。纯化mPiezo1-Δ(657-677)和mPiezo1-Δ(870-921)蛋白的FPLC谱揭示了对应于三聚体Piezo1复合物的峰级分，表明突变蛋白的正常三聚化。进一步的SPR结合测定发现mPiezo1-Δ(657-677)和mPiezo1-Δ(870-921)与Jedi1/2和Yoda1具有类似的结合。因此，不是Jedi1/2的主要结合位点，这两个细胞外环形成用于介导Jedi诱导的Piezo1激活的关键转导位点。其他四种环缺失突变体的低表达、缺乏膜表达和电流阻止了我们分析那些细胞外环在决定Jedi活性中的作用。

657-677和870-921环区域在机械激活Piezo1中起关键作用

发明人测试了657-677和870-921环是否参与Piezo1的机械激活。值得注意的是，戳刺诱导的mPiezo1-Δ(657-677)(3.2±0.7pA/pF)和mPiezo1-Δ(870-921)(2.1±0.5pA/pF)的Imax分别仅为mPiezo1介导的电流(61.7±7.8pA/pF)的4.3±1.3％和3.3±0.8％(图5c)。在mPiezo1-Δ(657-677)或mPiezo1-Δ(870-921)转染的Piezo1敲除HEK293T细胞(P1KO)中观察到了类似的残余戳刺诱导的电流，其中Piezo1编码区被破坏，排除了残余电流由内源Piezo1介导的可能性。这些数据表明，缺失这两个环会严重损害但不会完全消除Piezo1的戳刺引起的电流。

此外，尽管两种突变体均保留了Yoda1响应性(图5d-g)，但是在存在Yoda1的情况下，mPiezo1-Δ(657-677)或mPiezo1-Δ(870-921)介导的电流小于在存在mPiezo1的情况(图5e)。例如，虽然Yoda1诱导了表达mPiezo1、mPiezo1-Δ(657-677)或mPiezo1-Δ(870-921)的细胞的戳刺电流相似倍数增加(图3g)，但是Yoda1增强的mPiezo1-Δ(657-677)(34.0±10.8pA/pF)和mPiezo1-Δ(870-921)(38.2±12.8pA/pF)的戳刺电流仅达到mPiezo1(243.4±53.8pA/pF)的14.0±4.5％和15.7±5.3％。此外，尽管在质膜中显示正常表达(图5b)，但是响应于30uM Yoda1由mPiezo1-Δ(657-677)介导的Ca²⁺响应(图5d)和电流(图5e)分别为mPiezo1的71.6±4.0％和19.8±2.9％。这些数据与突变通道固有的机械敏感性受损有关(图5c)。

有趣的是，在表达mPiezo1-Δ(657-677)或mPiezo1-Δ(870-921)的细胞中，消除了牵拉诱导的Piezo1样电流(图5h，i)。此外，Jedi1/2和Yoda1都无法挽救两种突变体中牵拉诱导电流产生中的障碍(图5h，i)。考虑到mPiezo1-Δ(657-677)和mPiezo1-Δ(870-921)明显保留了响应于Yoda1以诱导Ca2+内流、内向电流和增强戳刺电流的能力(图5d-g)，因此牵拉响应的完全丧失更有可能是由于它们在响应牵拉时的固有的缺陷。

总之，这些数据表明，两个环区域在介导Piezo1的机械激活中起着关键作用，并且Piezo1对于不同形式的机械刺激和化学调节可能具有不同的机械门控方式。

残基F1301-Q1363构成细细胞内梁结构

Piezo1的包含对Jedi作用至关重要的区域的N端部分可能构成了三叶螺旋桨状Piezo1的特征性远端叶片结构。因此，我们想知道小分子如Jedi1/2或机械刺激在远端细胞外区域的作用如何传递以门控位于距离远端叶片

的中央离子传导孔(图1)。将叶片连接到细胞内孔的特征性的

长的细胞内梁结构(图1)可能密切参与。梁结构的分子组成尚未在Piezo1的中分辨率冷冻EM结构中解析出来。因此，我们采用了化学交联偶联质谱法(CXMS)来鉴定形成梁结构的主要序列。

使用包括Sulfo-GMBS、DSS和BS的交联剂将纯化的mPiezo1蛋白交联，然后进行蛋白酶消化和质谱分析。在从这些样品中鉴定出的交联肽对中，K1329-C2099、K1340-K2112和K1358-K2541交联，有助于我们将F1301-Q1363的预测长螺旋区域分配到紧随预测的TM26(I1280-Y1300)之后的梁结构(图1a和图6a-c)。先前确定的Piezo1的cryo-EM结构使我们能够将K2541登记到细胞内C端结构域(CTD)，将C2099和K2112登记到锚结构域(图1a和图6c)。基于预测的二级结构，我们在梁的近端附近手动分配了K1358(K1358-K2541:

)(图6b，c)。然后，K1340和K1329分别进入梁中紧靠K2112(K1340-K2112:

)和K2541(K1329-C2099:

)的位置。

提出的分配预测，位于梁近端侧的残基1365应该非常靠近C端。因此，通过构建在残基1365和C端分别具有同时插入的Clover(作为供体的绿色荧光蛋白)和mRuby2(作为接受体的红色荧光蛋白)的mPiezo1-Clover(1365)-mRuby2(C)融合蛋白(图6c)，我们利用荧光共振能量转移(FRET)来验证这种分配。用mPiezo1-Clover(1365)-mRuby2(C)转染的HEK293T细胞保留了对Jedi和Yoda1的响应性，并显示出与mPiezo1-mRuby2转染的细胞相似的戳刺诱导的电流，证明了融合蛋白的正确表达和功能。在用mPiezo1-Clover(1365)-mRuby2(C)转染的细胞中，接受体mRuby2的光漂白导致Clover供体的荧光增强，表明在残基1365和C端之间的位置之间发生了FRET(图6d，e)。FRET效率甚至比来自用mPiezo1-Clover(C)和mPiezo1-mRuby2(C)共转染的细胞中C端附近的那些更强(图6d，e)，进一步支持残基1365和C端之间的紧密接近度。

综上所述，这些数据支持包含残基F1301-Q1363的中央区域形成了特征性的梁结构，其在结构上将远端叶片与中央孔结构连接。梁结构域的鉴定使我们能够进一步测试其在Jedi诱导的Piezo1激活和机械力转导中的功能作用。

使梁结构域中的残基L1342和L1345突变消除了Jedi和Yoda诱导的Piezo1激活

缺失残基1280到1366严重损害所得突变蛋白的表达。从突变体转染的细胞中未记录到戳刺诱导的电流。这些数据表明该区域的重要性。有趣的是，在Piezo1中梁结构域包含唯一预测的卷曲螺旋基序LAQLKRQM(1341-1348)(图6b，c)，这促使我们表征了关键的潜在卷曲螺旋贡献残基L1342和L1345的作用，考虑到观察到的K1340和K2112的交联，其可能与锚或CTD结构域相互作用。值得注意的是，所有突变，包括L1342A/L1345A、L1342D/L1345D、L1342S/L1345S、L1342A和L1345A，都完全消除了Jedi1引起的Ca²⁺响应，如通过单细胞Ca²⁺成像和FLIPR测定的(图7a-c)。一致地，Jedi1也未能增强L1342A/L1345A突变体的戳刺诱导的MA电流(图7d)和机械敏感性(图7h，i)。相比之下，Yoda1强力地增强戳刺诱导的电流，并减慢了L1342A/L1345A突变体的失活速率(图7d-g)。但是，其并没有改变电流-压力关系和牵拉诱导的电流的P₅₀值(图7h，i)。Yoda1对L1342A/L1345A突变体的作用类似于其对mPiezo1-Δ(657-677)和mPiezo1-Δ(870-921)突变体的作用：特异性地增强戳刺诱导的响应，但不能增强牵拉诱导的响应。这些数据表明，657-677和870-921的两个细胞外环和细胞内梁可能构成介导Jedi1/2作用的重要转导途径，并进一步支持Piezo1对于不同形式的机械刺激和化学调节具有独特的机械门控方式。

L1342A/L1345A突变体具有受损的机械敏感性

发明人研究了L1342和L1345是否参与Piezo1的机械力转导。L1342A/L1345A突变体具有大幅降低的戳刺诱导的Imax(24.0±4.5pA)，其为mPiezo1介导的Imax(114.6±17.4)的21.0±3.9％(图7e，f)。突变体的失活Tau不同于mPiezo1的(图7g)。与mPiezo1-Δ(657-677)和mPiezo1-Δ(870-921)突变体的牵拉诱导电流消除(图3h，i)相反，L1342A/L1345A仍然被牵拉激活(图7h)，但机械敏感性降低(mPiezo1 vs L1342A/L1345A:-27.1±3.1vs-46.2±6.4mmHg的P₅₀)(图7i)。这些数据表明，位于梁近端的L1342和L1345关键参与了Piezo1的机械力转导。

接下来，发明人已经确定了包括SERCA1-3在内的肌浆/内质网Ca2+ATPase(SERCA)家族与Piezo蛋白相互作用。集中于表征Piezo1与SERCA1-3中广泛表达的同种型SERCA2之间的相互作用和调节，发明人确定了在孔模块和机械力转导模块之间的14个残基组成的接头区域对于Piezo1的机械门控和SERCA2介导的抑制至关重要。这些发现表明，接头区域在使机械力转导模块与孔模块的偶联中起关键作用，类似于电压门控的K+通道或瞬态受体电位(TRP)通道的S4-S5接头的作用。因此，发明人的研究支持以下工作模型：Piezo1采用外围螺旋桨结构作为机械力转导模块来门控中央离子传导孔模块。在生理上，发明人表明，SERCA2介导的Piezo1调节影响内皮细胞的Piezo1依赖性迁移。

作为Piezo1的新的相互作用蛋白的SERCA的鉴定

为了鉴定Piezo1的调节蛋白，发明人推测相互作用蛋白更可能存在于表达相对高水平的内源Piezo1的细胞中，例如C2C12细胞。基于此推测，我们首先进行了从用编码GST对照或Piezo1-GST融合蛋白的构建体转染的HEK293T细胞(内源Piezo1的表达可忽略不计)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)沉降。然后将GST或Piezo1-GST缔合珠与来自C2C12细胞的细胞裂解物孵育，然后在SDS-PAGE凝胶上分离后对沉降的蛋白质进行银染。发明人在Piezo1-GST样品中特异性检测到了与分子量为～300kDa的Piezo1-GST蛋白相匹配的强带，而在GST对照样品中没有(图8a)，表明Piezo1-GST蛋白的成功沉降。在Piezo1-GST样品组中，特异性观察到在130kDa分子标记附近迁移的蛋白带(图8a)。将该带切下用于质谱分析，从而鉴定出与肌浆/内质网Ca²⁺ATPase的同工型2(SERCA2)相对应的肽。SERCA2是用于使胞质Ca²⁺再循环到SR/ER Ca²⁺储库中的定位于SR/ER的Ca²⁺ATPase，而该过程对于维持几乎所有细胞类型(包括内皮细胞)中的Ca²⁺稳态都是至关重要的。

为了验证SERCA2是否确实是Piezo1的新的结合蛋白，我们产生了Flag标记的SERCA2(Flag-SERCA2)构建体，其编码SERCA2的广泛表达的剪接变体SERCA2b。用Piezo1-GST和Flag-SERCA2共转染的HEK293T细胞的沉降实验表明，使用谷胱甘肽珠使Flag-SERCA2蛋白与Piezo1-GST蛋白一起沉降(图8b)。相比之下，从来自用单独Piezo1-GST或GST/Flag-SERCA2转染的细胞的沉降样品中未检测到Flag-SERCA2蛋白(图8b)。同样，主要在心肌细胞中表达的SERCA2的另一种剪接变体SERCA2a也能够与Piezo1相互作用。此外，SERCA家族的其他两个同工型SERCA1(主要在骨骼肌中表达)和SERCA3(在有限数量的非肌肉细胞中表达)也能够与Piezo1相互作用。考虑到SERCA2的广泛表达，发明人接下来集中于表征SERCA2和Piezo1之间的相互作用。

与重组Piezo1-GST蛋白能够沉降C2C12细胞中内源表达的SERCA2一致(图8a)，发明人发现异源过表达的Piezo1-Flag蛋白能够沉降HEK293T细胞中内源表达的SERCA2蛋白，其用抗SERCA2抗体通过Western印迹检测(图8c)。接下来，发明人使用抗SERCA2抗体来沉降来自表达相对较高水平Piezo1蛋白的Neuro2A(N2A)细胞的内源表达的SERCA2。在抗SERCA2免疫沉淀的样品中，通过Piezo1抗体特异性检测到300kDa分子标记附近的蛋白带(图8d)。shRNA介导的Piezo1敲低极大地降低了这种免疫共沉淀蛋白的水平，从而证实了对照shRNA转染组中抗Piezo1抗体识别的带中Piezo1蛋白的特异性存在(图8d)。这些沉降实验表明，异源和内源表达的Piezo1和SERCA2可以相互作用。

Piezo1在质膜(PM)中充当机械敏感阳离子通道，而SERCA2是ER Ca²⁺泵。因此，发明人采用了免疫荧光染色来检查Piezo1和SERCA2之间的内源共定位。图8d中用于western印迹研究的抗Piezo1抗体没有使内源表达的Piezo1蛋白染色所需的特异性和亲和力，促使发明人使用CRISPR/Cas9技术产生Piezo1-Flag敲入N2A细胞系。将Flag编码序列插入到与小鼠Piezo1的残基G2420相对应的位置之后。通过特异性抗Flag免疫染色验证了敲入细胞系中Piezo1-Flag蛋白的正确表达。通过单细胞Fura-2 Ca²⁺成像和电生理学测定时，Piezo1-Flag敲入细胞显示出与野生型N2A细胞类似的Yoda1(Piezo1化学激活剂²⁴)引起的Ca²⁺响应和戳刺诱导的电流，证明了内源Piezo1-Flag蛋白的正常功能。用抗Flag和抗SERCA2抗体对敲入细胞进行的免疫共染色以及随后的共聚焦成像揭示了Piezo1和SERCA2在细胞外围的高水平共定位(图8e和图8f的白框)。还在细胞内部检测到Piezo1蛋白，其中它们与SERCA2较少共定位(图8e和图8f的灰色框)。这些数据表明，Piezo1和SERCA2可在PM-ER连接处相互作用，类似于ER定位的STIM1和PM定位的Orai蛋白之间的相互作用，这些蛋白构成了Ca²⁺释放激活的Ca²⁺(CRAC)通道。

将Piezo1的接头区域映射为SERCA2相互作用的关键结构域

接下来，发明人着手确定Piezo1中负责与SERCA2相互作用的区域。我们发现Piezo1的C端片段(1960-2547)能够沉降共表达的Flag-SERCA2蛋白(图9a，b)。相比之下，N端片段(1-730)和预测的位于中央区域的细胞内片段(1367-1652)是无效的(图9b)。1960-2547的片段包含结构上解析的外围螺旋1-4(PH1-4)、锚、接头和包含外部螺旋(OH)、C端胞外结构域(CED)、内部螺旋(IH)和C端胞内结构域(CTD)的孔模块(图9a)。有趣的是，去除CTD(2484-2547)或PH/锚(1960-2170)分别导致比1960-2483和2171-2547的相应片段更强的SERCA2沉降(图9a-c)，表明PH/锚和CTD结构域可能为SERCA2相互作用提供了空间位阻。

基于结构组织(图9a)，连接锚和OH的富含赖氨酸的接头区域(2172-2185)暴露于细胞内表面，但被CTD部分掩盖(图9a)。因此，接头区域可以用作SERCA2的结合元件。符合此假设，含接头的2171-2483(无CTD)和2171-2547(有CTD)片段能够与SERCA2相互作用，而不含接头的2186-2547片段显示几乎消除的相互作用(图9a，d，e)。此外，与具有CTD的2171-2547片段相比，不具有CTD的2171-2483片段表现出更强的与SERCA2的相互作用(图9a，d，e)，与接头区域被CTD部分掩盖相一致。

发明人继续鉴定了14个残基构成的接头区域内对于SERCA2相互作用的关键贡献残基。值得注意的是，将Piezo1中的残基2172-2181[Piezo1-(2172-2181)10A]或4个赖氨酸残基的簇(2182-2185)(Piezo1-KKKK-AAAA)中和为丙氨酸降低了SERCA2相互作用(图9f，g)。这些数据表明，接头区域中的残基是Piezo1和SERCA2之间相互作用的必需条件。

考虑到接头区域对于SERCA2与全长Piezo1和在结构上限定的C-末端片段两者的相互作用都是至关重要的，发明人假设该接头可能充当SERCA2的直接结合位点。为了进一步证实该假设，本发明人合成了允许膜渗透的在N端残基具有肉豆蔻酰基化的接头肽(2171-2185)和混杂的对照肽，然后测试了它们在影响Piezo1-SERCA2相互作用中的作用。值得注意的是，接头肽而非混杂肽显著降低了Piezo1和SERCA2之间的相互作用(图9h，i)，表明接头肽和Piezo1竞争SERCA2相互作用。总的来说，这些数据表明接头区域充当SERCA2的关键结合位点。

Piezo1中关键相互作用残基的鉴定提供了SERCA2可能直接与Piezo1结合的令人信服的证据。这使得SERCA2不同于先前鉴定的Piezo1调节蛋白，包括聚半胱氨酸2(PC-2)和stomatin样蛋白3(STOML3)，后者似乎通过间接改变膜的曲率或硬度来调节Piezo功能。因此，我们继续测试SERCA2相互作用如何调节Piezo1功能。

SERCA2抑制Piezo1介导的机械敏感电流

值得注意的是，SERCA2与Piezo1的共表达极大地抑制了戳刺诱导的最大全细胞电流(Piezo1/载体vs Piezo1/SERCA2:1929.0±275.6vs 403.9±65.2pA)并加快了失活速率(Piezo1/载体vs Piezo1/SERCA2:19.7±2.3vs 11.7±2.0ms)(图10a-c)。此外，对共转染的Piezo1的表达没有影响的Ca²⁺泵缺陷型突变体SERCA2-C318R²⁹仍有效地与Piezo1相互作用并抑制Piezo1介导的戳刺诱导的电流(Piezo1/SERCA2-C318R为403.9±65.2pA)(图10a-c)。这些数据表明SERCA2对Piezo1的抑制作用不依赖于其Ca²⁺泵送活性。

接下来，发明人检查了内源Piezo1介导的机械敏感电流是否可以通过SERCA2调节。与以前的N2A细胞的研究²³一致，戳刺诱导了阶跃依赖性的内向电流，最大MA电流为85.2±10.5pA(图10d，e)。SERCA2的过表达将内源MA电流显著抑制到28.2±3.8pA(图10d，e)。相比之下，siRNA介导的内源SERCA2的敲低将电流显著提高至316.0±65.3pA(图10d，e)。这些数据表明，内源表达的Piezo1在功能上受SERCA2调节。

Piezo1在内皮细胞中表达用于适当的血管发育和血压调节，促使我们研究在这种细胞类型中SERCA2对Piezo1的调节。在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中，发明人检测到相对较小的内源戳刺诱导的电流(24.8±2.5pA)。当用针对Piezo1的siRNA将Piezo1敲低时(10.5±0.9pA)(图10f，g)或用机械敏感通道阻滞剂GsMTx4阻断时(1.1±1.1pA)电流显著降低，但是被Piezo1化学激活剂Yoda1增强(146.6±48pA)。这些特征表明HUVEC中的戳刺诱导的电流由内源表达的Piezo1介导。值得注意的是，当敲低内源SERCA2时，戳刺诱导的电流显著提高到159.0±51.3pA(图10f，g)。显示了siRNA介导的Piezo1和SERCA2蛋白的敲低的效率。总之，这些数据表明SERCA2在功能上抑制了不同细胞类型中Piezo1介导的机械敏感电流。

SERCA2的共表达不影响Piezo1在质膜中的定位

用Piezo1-A2419Flag(在位于细胞外CED中的A2419之后插入Flag标签¹⁹)/载体或Piezo1-A2419 Flag/SERCA2转染的细胞的活免疫染色显示出Piezo1在质膜中的相似表达。一致地，生物素化测定显示在Piezo1-GST/Flag转染的细胞和Piezo1-GST/Flag-SERCA转染的细胞之间质膜中Piezo1表达没有差异。总之，这些数据表明SERCA2对Piezo1电流的抑制不是由于抑制了质膜中Piezo1的表达。

SERCA2通过接头区域抑制Piezo1的机械敏感性

通过检查牵拉诱导的通道活性，我们发现SERCA2抑制Piezo1的机械敏感性，导致降低牵拉诱导的Piezo1电流以及压力-电流响应曲线向右移动(图11a，b)。与SERCA2共表达的Piezo1的半最大激活(P₅₀)所需的压力为与空载体共转染的Piezo1的几乎2倍(Piezo1/载体vs Piezo1/SERCA2:-30.5±1.7vs-58.8±6.1mmHg)(图11c)。单通道分析表明，SERCA2不影响Piezo1的单位电导率。考虑到质膜中Piezo1的表达不受SERCA2共表达的影响，发明人数据表明SERCA2对Piezo1介导的电流的抑制作用主要是由于Piezo1的机械敏感性降低。

接下来，我们询问SERCA2是否通过接头区域在功能上调节Piezo1。与它们和SERCA2相互作用的缺陷相一致，Piezo1-(2172-2181)10A和Piezo1-KKKK-AAAA突变体并未显示出对它们的机械引起电流的显著SERCA2依赖性抑制和加快失活速率(图11d-f)。有趣的是，与接头肽破坏Piezo1和SERCA2之间相互作用的作用一致(图9h，i)，向用Piezo1和SERCA2共转染的细胞导施用接头肽导致最大戳刺诱导电流的剂量依赖性增加(图11i)和相关的失活Tau(图11j)，逆转了SERCA2对Piezo1功能的抑制作用。这些数据强烈表明，Piezo1的接头区域充当SERCA2的调节位点。

鉴于接头区域在Piezo1和Piezo2之间高度保守，我们询问SERCA2是否与Piezo2相互作用并对其进行调节。实际上，与Piezo1类似，Piezo2也与SERCA2相互作用。此外，SERCA2的共表达显著抑制戳刺诱导的Piezo2电流。这些数据表明，Piezo1和Piezo2具有类似的通过SERCA2的调节机制。

接头对于Piezo1的机械门控至关重要

值得注意的是，尽管如通过生物素化检测所检查的其在质膜中正常表达(图11g-h)，但是接头突变体本身的压力-电流响应曲线向右移动(图11b)，增强了P₅₀值(对于Piezo1-(2172-2181)10A和Piezo1-KKKK-AAAA分别为-52.1±2.4和-56.9±4.3mmHg)(图11c)，并且大幅降低了戳刺诱导的全细胞电流(图11d-f)。为了排除Piezo1-(2172-2181)10A或Piezo1-KKKK-AAAA转染的HEK293T细胞的残余机械敏感电流可能是由内源Piezo1介导的，我们进一步在其中Piezo1基因的编码序列被破的Piezo1-KO-HEK293细胞³¹中检查了其戳刺诱导的电流。我们观察到，与用Piezo1转染的细胞相比，用突变体转染的Piezo1-KO-HEK293T细胞具有类似降低的戳刺诱导的电流。相比之下，从载体转染的Piezo1-KO-HEK293T细胞中未观察到机械敏感电流。这些数据表明，接头突变体的机械敏感电流的产生固有地被受损。因此，接头可能通过将外围机械力转导模块偶联到中央离子传导孔而在Piezo1机械门控中起关键作用。

SERCA2影响内皮细胞的Piezo1依赖性迁移

已显示Piezo1介导的机械力转导在介导HUVEC的迁移过程中起关键作用⁵，而该过程可能是血管正常发育所必需的。实际上，通过transwell测定检查，siRNA介导的Piezo1敲低抑制HUVEC迁移(图12a，b)。相比之下，SERCA2的敲低增加了细胞迁移(图12a，b)。重要的是，SERCA2敲低诱导的对细胞迁移的作用通过同时敲低Piezo1蛋白(图12c)或者使用非特异性阻滞剂钌红(RR)或相对特异性的阻滞剂GsMTX4在功能上阻断Piezo1通道活性(图12d)的抑制。显示了SERCA2和Piezo1的敲低效率。

先前的研究表明，内皮NO合成(eNOS)充当参与Piezo1控制的细胞迁移的关键信号转导分子⁵。我们证实在用或不用血管内皮生长因子(VEGF)处理的HUVEC中，Piezo1的敲低抑制残基S1177处eNOS的磷酸化(图12e，f)。相比之下，SERCA2的敲低增加eNOS磷酸化(图12e，f)，这与观察到的SERCA2敲低导致Piezo1活性和细胞迁移增强一致。

最后，发明人发现向HUVEC细胞施用接头肽导致增加的细胞迁移(图12g，h)和eNOS磷酸化(图12i，j)，进一步证明了SERCA2在影响HUVEC迁移和eNOS磷酸化中的作用是通过SERCA2-Piezo1相互作用介导的。综上所述，我们的数据表明，SERCA2对Piezo1活性的调节可表现为重要生理意义的Piezo1介导的细胞机械力转导过程的变化。

在整个说明书中，对“实施例”、“一些实施例”、“一个实施例”、“另一个实例”、“实例”、“具体实例”或“一些实例”的引用是指结合实施例或实例描述的特定特征、结构、材料或特性包括在本公开内容得至少一个实施例或实例中。因此，本说明书中各处的短语例如“在一些实施例中”、“在一个实施例中”、“在实施例中”、“在另一个实例中”、“在实例中”、“在一个具体实例中”、“在一些实例中”未必是指本公开内容得相同实施例或实例。此外，特定的特征、结构、材料或特性在一个或多个实施例或实例中可以以任何合适的方式组合。

尽管已经示出和描述了说明性实施例，但是本领域技术人员将理解，以上实施例不能被解释为限制本公开内容，并且在不脱离本公开内容的精神、原理和范围的情况下可以对实施例进行改变、替代和修改。

Claims (15)

1.调节剂在制备用于调节以下至少一项的药物中的用途，其中所述调节剂用于激活或抑制Piezo：

血管发育；

血压调节；

红细胞功能；

上皮稳态；

先天性淋巴发育不良；

神经元分化；

肾功能；

膀胱功能障碍；

骨骼功能；

细胞生长和迁移；

癌症发展和转移；

温柔触感；

机械疼痛；

肺功能；

神经肌肉功能。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述Piezo是Piezo1或Piezo2。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述Piezo来自小鼠或人类。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述调节剂用于激活Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点或/或功能区域中的至少一个来实现激活Piezo：

(1)N端机械力转导模块的细胞外环区域；

(2)远端叶片结构；

(3)小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；

(4)小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；

(5)特征性的

长的细胞内梁结构；

(6)小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的残基Y1307-R1368；

(7)小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；

(8)小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；以及

(9)小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述调节剂是Jedi1、Jedi2或其功能类似物。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽在权利要求6中定义，

优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；或小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域。

7.根据权利要求3所述的用途，其中所述调节剂用于抑制Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点或/或功能区域中的至少一个来实现抑制Piezo：

(1)小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；

(2)小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo1的2173-2752的C端片段；

(3)小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及

(4)小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述调节剂是SERCA2或其功能类似物。

9.根据权利要求7所述的用途，其中所述调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽在权利要求7中定义，

优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；或小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。

10.一种用于筛选药物的方法，其中所述药物用于调节以下至少一项，

血管发育；

血压调节；

红细胞功能；

上皮稳态；

先天性淋巴发育不良；

神经元分化；

肾功能；

膀胱功能障碍；

骨骼功能；

细胞生长和迁移；

癌症发展和转移；

温柔触感；

机械疼痛；

肺功能；

神经肌肉功能，其中所述方法包括：

(1)使候选化合物与表达Piezo通道的细胞接触，其中所述细胞来自小鼠或人类；

(2)在所述接触之前和之后，检测Piezo的以下位点或/或功能区域中的至少一个的激活水平或构象变化：

a.N端机械力转导模块的细胞外环区域；

b.远端叶片结构；

c.小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；

d.小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；

e.特征性的

长的细胞内梁结构；

f.小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的残基Y1307-R1368；

g.小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；

h.小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；

i.小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501；

j.小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；

k.小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo1的2173-2752的C端片段；

l.小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及

m.小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。

其中所述位点和/或功能区域的激活水平升高或所述基因座和/或功能区域的构象改变，表明所述候选化合物充当药物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述Piezor是Piezor1或Piezor2。

12.一种治疗Piezor相关疾病的方法，其包括：

向有此需要的受试者施用调节剂，其中所述调节剂用于激活或抑制Piezo。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Piezor相关疾病包括以下至少一种：

脱水性遗传性口型红细胞增多症、5型远端关节弯曲、Gordon综合症和Marden-Walker综合症以及广泛性淋巴发育不良。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述调节剂用于激活Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点或/或功能区域中的至少一个来实现激活Piezo：

(1)N端机械力转导模块的细胞外环区域；

(2)远端叶片结构；

(3)小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；

(4)小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域；

(5)特征性的

长的细胞内梁结构；

(6)小鼠Piezo1的梁结构的残基F1302-Q1363；或人Piezo1的残基Y1307-R1368；

(7)小鼠Piezo2的残基F1451-K1512；或人Piezo2的残基F1458-K1519；

(8)小鼠Piezo1的梁结构域中的残基L1342和L1345；或人Piezo1的梁结构域中的残基L1347和L1350；以及

(9)小鼠Piezo2的梁结构域中的残基M1491和L1494；或人Piezo2的梁结构域中的残基M1498和L1501，

任选地，其中所述调节剂是Jedi1、Jedi2或其功能类似物。

任选地，其中所述调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽如上所定义，

优选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的残基657-677和870-921的细胞外环区域；或人Piezo1的残基651-671和875-926的细胞外环区域；或小鼠Piezo2的残基762-782和1020-1071的细胞外环区域；或人Piezo2的残基758-778和1054-1105的细胞外环区域。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述调节剂用于抑制Piezo，其中通过作用于Piezo的以下位点或/或功能区域中的至少一个来实现抑制Piezo：

(1)小鼠Piezo1的1960-2547的C端片段；或人Piezo1的1944-2521的C端片段；

(2)小鼠Piezo2的2243-2822的C端片段；或人Piezo1的2173-2752的C端片段；

(3)小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；以及

(4)小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。

任选地，其中所述调节剂是SERCA2或其功能类似物。

任选地，其中所述调节剂是多肽或其功能类似物，其中所述多肽如上所定义，

任选地，其中所述多肽是小鼠Piezo1的接头区域：2172-EKKYPQPKGQKKKK-2185；或人Piezo1的接头区域：2156-EKKYPQPKGQKKKK-2169；或小鼠Piezo2的接头区域：2455-EKRYPQPRGQKKKK-2468；或人Piezo2的接头区域：2385-EKKYPQPKGQKKKK-2398。

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