CN115120723A

CN115120723A - 巨噬细胞Piezo1敲除在促进缺血组织血管新生中的应用

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Publication number: CN115120723A
Application number: CN202210532213.3A
Authority: CN
Inventors: 项美香; 谢澜
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2042-05-09
Also published as: CN115120723B

Abstract

本发明涉及一种巨噬细胞Piezo1抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用，所述巨噬细胞Piezo1抑制剂为抑制Piezo1活性的物质或者降低Piezo1水平的物质。本发明首次发现巨噬细胞Piezo1在下肢缺血后通过感知缺血组织基质硬度的改变而被激活，通过调控FGF2影响缺血下肢血管新生及血流改善等作用及机制，巨噬细胞Piezo1的敲除可改善小鼠缺血下肢血流灌注，为临床治疗提供新的干预靶点。

Description

巨噬细胞Piezo1敲除在促进缺血组织血管新生中的应用

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种促进血管新生的方法。

背景技术

外周动脉疾病(Peripheral artery disease，PAD)是由血管动脉粥样硬化引起、以血管狭窄甚至阻塞为主要特征的慢性缺血性疾病，最常发生于下肢。随着生活方式改变及人口老龄化加剧，PAD的发病率持续增加，在70岁以上人群中发病率高达10-20％，已成为严重威胁公众健康的重大疾病之一。尽管外科或介入血运重建治疗可在一定程度缓解病情，但仍有许多患者不适宜或丧失血运重建的时机。迄今为止，无明确有效的药物可改善PAD患者的血流灌注，因此针对下肢缺血损伤的研究有助于寻找新得治疗靶点。

炎症反应在下肢缺血损伤和缺血后组织修复中发挥重要的作用。巨噬细胞是重要的炎症细胞，大量巨噬细胞浸润于缺血组织，发挥调节炎症和组织修复的作用。既往研究表明，巨噬细胞可通过调节血管生长因子如纤维细胞生长因子-2(FGF2)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子-B(PDGF-B)等分泌，参与下肢缺血后组织修复过程。过去大量研究表明，纤维细胞生长因子-2(FGF2)可促进内皮细胞成管、增殖和迁移等介导的血管新生，改善缺血下肢灌注。目前仍需要进一步探索巨噬细胞在下肢缺血损伤修复中的分子机制。

Piezo1是一种新型机械应力性非选择性阳离子通道，Piezo1激活可介导Ca²⁺内流，激动细胞内Ca²⁺依赖的信号通路，参与细胞病理生理活动。既往研究表明，内皮及平滑肌来源Piezo1参与调控早期血管发育和维持血管稳态，最新的研究发现巨噬细胞来源的Piezo1在炎症的调控中起着重要的作用。但巨噬细胞Piezo1在下肢缺血修复中的作用及机制迄今尚未报道。发明人前期实验发现，小鼠下肢缺血模型中，缺血后的腓肠肌组织中浸润的巨噬细胞高表达Piezo1，而髓系特异性Piezo1敲除可以促进毛细血管新生，上调血管新生因子FGF2的表达，加快小鼠下肢血流恢复。因此发明人推测，巨噬细胞Piezo1具有损害小鼠下肢缺血后血流恢复的作用。

细胞内Ca²⁺浓度的增加可以激活钙/钙调素激活蛋白激酶家族成员CaMKII。CaMKII分子具有催化和调节两个结构域，Ca²⁺结合其调节域而激活激酶活性，激活的CaMKII进一步在苏氨酸位点(Thr286)进行自磷酸化，使激酶在结构上富有活性。被激活的CaMKII入核，可促进ETS1(在血管生成及血管重塑中发挥重要作用的转录因子)在丝氨酸位点(Ser282)的磷酸化，被磷酸化后的ETS1失去了与DNA结合的活性从而抑制其下游的转录过程。

目前尚未见巨噬细胞Piezo1靶点与促进血管新生之间关联性的相关报道。

发明内容

根据过去大量研究结合前期研究结果，发明人提出如下科学假说：1)巨噬细胞Piezo1在下肢缺血后通过感知微环境硬度的变化而被激活，损害缺血下肢血流灌注的恢复，其敲除可促进患肢血流恢复；2)巨噬细胞Piezo1抑制FGF2的表达，损害下肢血管新生；3)巨噬细胞Piezo1促进细胞内Ca²⁺内流，调控钙离子依赖的CaMKII/ETS1信号通路，抑制ETS1与FGF2 DNA结合的能力，导致FGF2转录受阻。本发明首次阐明巨噬细胞Piezo1参与调控下肢缺血修复作用及机制，为临床干预提供新的作用靶点。

基于上述发现，本发明提出的解决上述技术问题的技术方案如下。

本发明的第一方面提供一种巨噬细胞Piezo1抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用。

优选的，所述巨噬细胞Piezo1抑制剂为抑制Piezo1活性的物质或者降低Piezo1水平的物质。

更优选的，所述抑制Piezo1活性的物质选自GsMTx4、毒胡萝卜素、细胞松弛素D或维拉帕米等；所述降低Piezo1水平的物质选自干扰RNA、microRNA或基因敲除材料等。

本发明的第二方面提供一种巨噬细胞Piezo1抑制剂在制备改善缺血下肢血流灌注水平的药物中的应用。

本发明的第三方面提供一种巨噬细胞Piezo1抑制剂在制备促进血管新生因子FGF2表达和分泌的药物中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明首次从动物、组织、细胞、分子等多个层面探讨巨噬细胞Piezo1调控FGF2促进缺血下肢血管新生及血流改善等作用及机制，相关内容国内外尚无报道。

2、本研究将首次阐明巨噬细胞Piezo1在小鼠下肢缺血后通过感知缺血组织基质硬度的改变而被激活，并在循环修复中的作用及机制，其敲除可改善小鼠缺血下肢血流灌注，为临床治疗提供新的干预靶点。

3、本发明设计的髓系特异性Piezo1敲除小鼠的应用可排除全身性或其他组织细胞等的影响，为研究巨噬细胞Piezo1在下肢缺血修复中作用及其对血管新生的影响提供很好的保障。

4、本发明首次应用纳米压痕仪测量了小鼠下肢缺血后不同时期腓肠肌杨氏弹性模量，腓肠肌硬度的改变为机械敏感阳离子通道Piezo1在病理中的作用被发现提供了不可或缺的基础。

附图说明

图1是小鼠下肢缺血模型构建验证(图1A为激光多普勒血流仪检测股动脉结扎术后小鼠下肢的血流灌注图，图1B为H&E染色术后缺血腓肠肌组织图)；

图2是野生型小鼠下肢缺血术前及术后腓肠肌硬度变化；

图3是人和小鼠下肢缺血后组织Piezo1的表达图(图3A健康人(Health)和下肢缺血病人(CLI)腓肠肌活检样本中Piezo1表达对比图；图3B和3C是野生型小鼠下肢缺血术后荧光定量PCR和Western Blot检测缺血组织中Piezo1表达对比图)；

图4是野生型小鼠下肢缺血术前及术后缺血组织中巨噬细胞数量对比；

图5是缺血组织中浸润的巨噬细胞中Piezo1表达图(图5A和5B是小鼠下肢缺血术后荧光定量PCR和Western Blot检测巨噬细胞与非巨噬细胞中Piezo1表达对比图，图5C是荧光定量PCR检测巨噬细胞中代表性机械敏感离子通道表达)；

图6是小鼠基因鉴定和敲除效率验证结果；

图7是髓系特异性Piezo1敲除对小鼠缺血下肢血流灌注的影响；

图8是髓系特异性Piezo1敲除对小鼠下肢缺血组织血管新生的影响；

图9是髓系特异性Piezo1敲除对小鼠下肢缺血组织FGF2表达的影响；

图10是体外巨噬细胞Piezo1敲除或过表达对FGF2表达的影响；

图11是体外巨噬细胞Piezo1敲除对内皮细胞血管新生的影响；

图12是巨噬细胞Piezo1敲除对细胞内钙离子浓度的影响；

图13是巨噬细胞Piezo1敲除或激活对CaMKII/ETS1通路的影响；

图14是巨噬细胞ETS1对FGF2转录调控的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。如无特别说明，以下试验例中的H&E染色、免疫荧光染色、荧光定量PCR、WesternBlot、小鼠基因鉴定等均为本领域已知的常规实验技术。

试验例1、野生型小鼠下肢缺血模型对Piezo1和巨噬细胞的影响

1、试验方法

1.1、试验对象

小鼠下肢缺血模型的建立

野生型小鼠行股动脉结扎术构建小鼠单侧下肢缺血模型。

1.2、试验分组

共分2组，分别为Piezo1^fl/fl+左股动脉假手术组和Piezo1^fl/fl+右股动脉结扎术组，每组6只。

1.3、观测指标

1.3.1、腓肠肌硬度(腓肠肌杨氏模量测定)

小鼠麻醉并清除双下肢毛发后，分别取下肢缺血模型术前、术后3天、术后7天、术后14天小鼠腓肠肌组织，在体视显微镜下分离成单个肌束，用胶水将肌束粘在载玻片上，并滴少许纯净水使其保持湿润。随后应用Piuma纳米压痕仪(0.47N/m探头)进行测量，然后在软件(Dataviewer，Piuma)上计算结果。

1.3.2、Piezo1表达

通过Real-time PCR、Western-Blot检测下肢缺血组织中Piezo1表达水平；流式细胞术分选出术后3天小鼠腓肠肌组织样本中巨噬细胞(CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺)和非巨噬细胞亚群，通过Real-time PCR、Western-blot检测下肢缺血组织中巨噬细胞内Piezo1表达水平。

2、试验结果

2.1、小鼠下肢缺血模型的成功构建

应用激光多普勒血流仪检测发现股动脉结扎术后小鼠下肢的血流灌注显著减少(图1A)。H&E染色发现术后14天缺血的腓肠肌组织中可见大量骨骼肌坏死，炎症细胞聚集(图1B)，刻度尺代表100μm。上述试验结果表明，应用本试验的方法可以成功构建小鼠下肢缺血模型。

2.2、小鼠下肢缺血对腓肠肌的硬度影响

应用纳米压痕仪发现，股动脉结扎术后小鼠下肢腓肠肌杨氏模量持续增加(图2)。

2.3、下肢缺血组织中Piezo1表达量的变化

通过分析健康人(Health)和下肢缺血病人(critical limb ischemia，CLI)腓肠肌活检样本RNA测序数据(GSE120642)，发现下肢缺血病人样本中Piezo1表达上调(图3A)。通过对野生型小鼠下肢缺血术后第3天双侧腓肠肌取材，荧光定量PCR和Western Blot检测发现缺血后第3天缺血组织中Piezo1表达显著上调(图3B和3C)。

2.4、缺血组织中巨噬细胞浸润情况

野生型小鼠下肢缺血术后第3天双侧腓肠肌取材，流式分选巨噬细胞(CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺)，发现缺血组织中巨噬细胞数量与对照组相比显著增多(图4A和4B)。

2.5、缺血组织中浸润的巨噬细胞中Piezo1表达情况

小鼠下肢缺血术后第3天双侧腓肠肌组织流式分选巨噬细胞(CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺)，荧光定量PCR和Western Blot检测发现Piezo1高表达于巨噬细胞(图5A和5B)。荧光定量PCR检测分选出的巨噬细胞中代表性的机械敏感离子通道表达，发现相比于其它离子通道，Piezo1高表达于浸润的巨噬细胞中，并且显著高于它的同源通道Piezo2(图5C)。

试验例2、髓系特异性Piezo1敲除小鼠下肢缺血模型对巨噬细胞Piezo1调控FGF2的影响

1、试验方法

1.1、试验对象

1.1.1、髓系特异性Piezo1基因敲除小鼠的繁殖

条件性Piezo1敲除小鼠(Piezo1^fl/fl)和LyzM-Cre转基因小鼠均购自美国Jackson实验室。将Piezo1^fl/fl小鼠和LyzM-Cre小鼠杂交后可得到髓系特异性Piezo1敲除(Piezo1^ΔMΦ)小鼠，同窝鼠中LyzM-Cre基因阴性的Piezo1^fl/fl小鼠为Piezo1^ΔMΦ的实验对照鼠。

1.1.2、小鼠下肢缺血模型的建立

选取10周龄Piezo1^fl/fl和Piezo1^ΔMΦ小鼠，麻醉小鼠后去除小鼠左右下肢毛发，消毒皮肤，在体视显微镜下近卵圆窝处剪开皮肤，暴露股动脉，腹壁下动脉用丝线结扎，近膝关节处股动脉分叉上端也做相应结扎。用眼科剪剪除血管，假手术组只穿线不结扎，缝合切口，小鼠苏醒。术后14天取双侧腓肠肌。

1.2、试验分组

共分4组，分别为Piezo1^fl/fl+左股动脉假手术组、Piezo1^fl/fl+右股动脉结扎术组、Piezo1^ΔMΦ+左股动脉假手术组和Piezo1^ΔMΦ+右股动脉结扎术组，每组8只。

1.3、观测指标

1.3.1、血流灌注量比值(小鼠激光多普勒血流成像检测)

小鼠麻醉并清除双下肢毛发后，应用Perimed激光多普勒血流仪分别在下肢缺血模型术前、术后即刻、术后3天、术后7天、术后14天对下肢进行实时血流灌注成像检测，左下肢假手术组为参照，计算右下肢相对血流灌注量，以缺血/未缺血下肢血流灌注量比值作为统计指标。

1.3.2、足趾坏死分数与组织坏死面积

利用足趾坏死评分方法评估，具体评分标准如下：0分：无坏死；1分：1个足趾坏死；2分：2个或以上足趾坏死；3分：发生足部坏死；4分：发生腿部坏死；5分：发生自发截肢。H&E染色评估组织坏死面积。

1.3.3、血管新生

免疫荧光检测毛细血管(内皮细胞标志物CD31)。

1.3.4、FGF2表达

通过Real-time PCR、Western-blot检测下肢缺血组织中FGF2表达水平；免疫荧光染色法观察巨噬细胞FGF2的表达水平(CD68+FGF2)。

2、试验结果

2.1、小鼠基因鉴定和敲除效率验证

PCR检测Piezo1^fl/fl小鼠的条带位置，位于380bp(图6A)，LysM-Cre小鼠的条带位置，位于700bp(图6A)。Piezo1^fl/fl与Piezo1^ΔMΦ小鼠骨髓来源巨噬细胞检测Piezo1 mRNA水平，表明Piezo1^ΔMΦ小鼠较Piezo1^fl/fl对照小鼠Piezo1 mRNA水平下降约70％(图6B)。

2.2、髓系特异性Piezo1敲除后小鼠缺血下肢血流灌注变化

Piezo1^fl/fl与Piezo1^ΔMΦ小鼠建立下肢缺血模型后，检测下肢血流灌注情况。与Piezo1^fl/fl小鼠相比，Piezo1^ΔMΦ小鼠显著改善术后3天、7天和14天缺血下肢的血流灌注(图7A和7B)。术后14天足趾缺血大体图及足趾坏死分数和运动功能评分提示Piezo1^ΔMΦ小鼠血流灌注改善(图7C-7E)。H&E染色显示Piezo1^ΔMΦ小鼠术后14天的坏死面积与Piezo1^fl/fl小鼠相比显著降低(图7F-7G)。

2.3、髓系特异性Piezo1敲除后小鼠下肢缺血组织血管新生变化

应用免疫荧光染色检测术后14天腓肠肌组织，发现髓系特异性Piezo1敲除促进缺血下肢的毛细血管新生(图8)，刻度尺代表50μm。

2.4、髓系特异性Piezo1敲除后小鼠下肢缺血组织FGF2表达变化

Piezo1^ΔMΦ小鼠下肢缺血组织中促血管新生因子FGF2的RNA水平和蛋白水平显著高于对照小鼠缺血组织(图9A-9C)，且小鼠下肢缺血术后14天腓肠肌标本荧光免疫染色显示Piezo1^ΔMΦ小鼠腓肠肌组织中FGF2多表达在巨噬细胞上(图9D和9E)。

试验例3、培养的巨噬细胞中Piezo1对调控FGF2和血管新生的影响

1、试验方法

1.1、试验对象

小鼠骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages，BMDMs)原代培养和共培养

应用巨噬细胞特异性Piezo1敲除(Piezo1^ΔMΦ)小鼠和同窝对照小鼠(Piezo1^fl/fl)来源BMDMs，给予不同预处理后，与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养，观察血管新生，同时收集细胞和培养上清液。

小鼠骨髓来源巨噬细胞的原代分离及培养

10周龄雄性小鼠脱颈法处死。分离取出小鼠两侧胫腓骨，除去肌肉后暂时浸泡在预冷的高糖培养基中。在原细胞操作台中，将胫腓骨两段骨关节剪去，并且用注射器反复冲洗骨髓腔，至骨髓完全冲洗干净。收集冲洗出来的细胞经过滤网过滤后，离心去除上清。红细胞裂解液对细胞裂红5分钟后，离心5分钟。弃上清，细胞沉淀在10％胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基重悬后根据细胞密度接种在培养瓶。培养基中同时需加入10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)促进细胞朝巨噬细胞分化，一般2-3天换液，7天后可得到成熟巨噬细胞。

1.2、试验分组

应用糖氧剥夺(Oxygen and glucose deprivation，OGD)模型刺激巨噬细胞，模拟体内缺血环境，对照组予以正常氧浓度刺激。共7组(N＝3)，分别为Piezo1^fl/fl BMDMs+常氧组、Piezo1^fl/flBMDMs+缺氧组、Piezo1^fl/fl BMDMs+常氧+Yoda1(Piezo1特异性激动剂)组、Piezo1^fl/fl BMDMs+缺氧+Yoda1组、Piezo1^ΔMΦBMDMs+常氧组、Piezo1^ΔMΦBMDMs+缺氧组和Piezo1^ΔMΦBMDMs+缺氧+siFGF2(应用小干扰RNA沉默FGF2基因表达)组。

1.3、观测指标

1.3.1、Piezo1表达及活性

通过Real-time PCR、Western-blot检测巨噬细胞Piezo1表达。

1.3.2、FGF2表达

通过Real-time PCR检测巨噬细胞中FGF2表达水平；Western-blot检测细胞上清液中FGF2表达水平。

1.3.3、内皮细胞小管样结构形成实验(Tube formation Assay)

收集来自不同处理的巨噬细胞的条件培养基，将HUVEC细胞用胰蛋白酶化，然后以约3×10⁵个细胞/mL重新悬浮在含有1％FBS的条件培养基中。将100μL细胞悬液接种到预铺有Matrigel胶的96孔板中，然后在37℃、5％CO₂中孵育6小时。在中心凹处检查管形成能力，并通过Image-Pro Plus软件量化每个视野的管形成总长度数。

2、试验结果

2.1、体外巨噬细胞Piezo1敲除或过表达对FGF2表达的影响

体外培养Piezo1^fl/fl与Piezo1^ΔMΦ小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)，予以糖氧剥夺(OGD)模型6小时刺激，模拟体内缺血环境。适当的缺氧刺激可以增加细胞中促血管新生因子的表达，在我们的实验中证实了缺氧可以上调FGF2。此外观察到Piezo1^ΔMΦ小鼠的BMDMs比Piezo1^fl/fl组FGF2表达显著增加(图10A和10B)。用Piezo1特异性激动剂Yoda1刺激Piezo1^fl/fl小鼠的BMDMs，发现FGF2的表达显著减少(图10C和10D)。

2.2、体外巨噬细胞Piezo1敲除对血管新生的影响

Piezo1^fl/fl与Piezo1^ΔMΦ小鼠骨髓来源巨噬细胞条件性上清培养基(ConditionedMedium，CM)处理人脐静脉内皮细胞，予以常氧或OGD模型6小时刺激，内皮细胞小管样结构形成实验(Tube formationAssay)提示缺氧可以诱导血管新生；且与Piezo1^fl/fl小鼠来源巨噬细胞条件性上清培养基相比，Piezo1^ΔMΦ小鼠组显著促进内皮细胞小管样结构形成(图11)，提示巨噬细胞Piezo1敲除促进血管新生。

试验例4、培养的巨噬细胞中CaMKII/ETS1介导巨噬细胞Piezo1调控FGF2的分子机制研究

1、试验方法

1.1、应用野生型小鼠BMDMs原代培养，分别予以小干扰RNA沉默Piezo1基因表达(siPiezo1)、Yoda1(Piezo1特异性激动剂)激活Piezo1通道处理，观察巨噬细胞Piezo1对细胞内钙离子浓度和CaMKII/ETS1通路的影响。

1.1.1、试验对象

野生型小鼠BMDMs原代培养及处理

应用野生型小鼠来源BMDMs，应用小干扰RNA沉默Piezo1基因表达(siPiezo1)(对照组用siScr处理)、Yoda1刺激(对照组用DMSO处理)，收集细胞及培养上清液。

1.1.2、试验分组

共8组(N＝3)，分别为野生型BMDMs+siScr+常氧组、野生型BMDMs+siPiezo1+常氧组、野生型BMDMs+siScr+缺氧组、野生型BMDMs+siPiezo1+缺氧组、野生型BMDMs+DMSO+常氧组、野生型BMDMs+Yoda1+常氧组、野生型BMDMs+DMSO+缺氧组和野生型BMDMs+Yoda1+缺氧组。

1.1.3、检测指标

1.1.3.1、细胞内钙离子浓度测定

将予以不同刺激的BMDMs用D-HANKs溶液清洗2次后，避光环境下将Fluo-3AM(终浓度5μmol/L)溶解于D-HANKs溶液后加于细胞中37℃孵育30分钟，随后用D-HANKs溶液清洗2次，洗去残余染料。随后在荧光倒置显微镜或者流式细胞分析仪上测定细胞内钙离子荧光强度。

1.1.3.2、CaMKII/ETS1通路表达

Western-blot检测巨噬细胞中p-CaMKII(Thr286)、总CaMKII、p-ETS1(Ser282)、总ETS1表达水平。

1.2、ETS1调控FGF2表达的分子机制研究

1.2.1、试验分组

共2组(N＝3)，分别为野生型BMDMs组和野生型BMDMs+siPiezo1组。

1.2.2、检测指标

1.2.2.1、应用小干扰RNA沉默ETS1基因表达(siETS1)，观察FGF2 mRNA和蛋白水平的表达变化：

1.2.2.2、FGF2启动子核心区分析

对FGF2启动子区域进行序列分析，明确FGF2启动子核心区；利用生物信息学方法分析并预测FGF2启动子区可能的ETS1可能结合位点。

1.2.2.3、ETS1与FGF2启动子的结合

应用染色质免疫共沉淀(ChIP)检测巨噬细胞中ETS1与FGF2启动子核心区序列是否直接结合。染色质免疫共沉淀实验主要使用了CST公司的SimpleChIP EnzymaticChromatin IP Kit试剂盒，具体步骤按说明书进行。10⁷的BMDMs细胞，加入1％的福尔马林进行蛋白质DNA交联，甘氨酸中止交联过程。清洗细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的PBS，将细胞刮下收集。离心后弃去上清，细胞沉淀在缓冲液中重悬。每份样本中加入0.5μl微球菌核酸酶，37℃水浴条件下20分钟，适当摇动使DNA充分裂解为150-900bp，超声破裂核膜。离心后得到上清即为染色质样本。在样本中加入ETS1抗体和IgG抗体，组蛋白H3抗体作为阳性对照，置于4℃层析柜中旋转过夜。第二天，加入蛋白G琼脂糖珠，缓慢摇动条件下4℃孵育2小时。洗涤后离心去上清。将琼脂糖珠在洗脱液中震荡洗脱，洗脱后在上清中加入蛋白酶K分解剩余蛋白，提纯得到DNA片段。根据JASPAR系统预测ETS1与FGF2基因预测结合位点设计引物。PCR扩增，如果有条带则证明ETS1与该引物所对应的区域存在结合。

1.3、ETS1对FGF2启动子核心区活性的影响

1.3.1、试验对象

双荧光素酶报告基因(luciferase)：构建FGF2启动子片段荧光素酶报告质粒，构建ETS1过表达质粒及空载质粒，将荧光素酶报告质粒和ETS1过表达质粒或空载质粒共同转染HEK 293T细胞，检测ETS1是否能激活FGF2。

双荧光素酶报告基因检测使用了promega公司Dual-Luciferase Reporter AssaySystem试剂盒，步骤按说明书进行。构建ETS1过表达质粒及空载，野生型FGF2启动子荧光素酶报告质粒和突变型FGF2启动子荧光素酶报告质粒及海肾荧光素酶质粒。HEK293T细胞接种在24孔板中，使用Lipofectamine 3000reagent转染试剂，对应每孔细胞中加入500ngETS1过表达质粒或空载，500ng野生型FGF2启动子荧光素酶报告质粒或突变型FGF2启动子荧光素酶报告质粒。此外每孔都加入40ng海肾荧光素酶质粒。培养48小时后，洗去杂细胞，裂解细胞。20μl裂解产物转移至含有缓冲液的1.5ml EP管中，使用promega公司的光度计检测萤火虫荧光素酶。随后立刻加入中止液，再次检测海肾荧光素酶。两者数字的比值即为启动子区域被激活的相对活性，每组实验重复3次。

1.3.2、试验分组

共4组(N＝3)分别为HEK 293T细胞+空载质粒+野生型FGF2启动子荧光素酶报告质粒、HEK 293T细胞+ETS1过表达质粒+野生型FGF2启动子荧光素酶报告质粒、HEK293T细胞+空载质粒+突变型FGF2启动子荧光素酶报告质粒和HEK 293T细胞+ETS1过表达质粒+突变型FGF2启动子荧光素酶报告质粒。

1.3.3、检测指标

将FGF2启动子区域与ETS1的结合位点进行突变，比较突变后的质粒与未突变质粒的启动子活性。

2、试验结果

2.1、巨噬细胞Piezo1敲除对细胞内钙离子浓度的影响

野生型小鼠BMDMs予以小干扰RNA下调Piezo1表达(siPiezo1)处理，对照组以Scramble siRNA(siScr)处理，在常氧或OGD模型刺激6小时后，观察巨噬细胞内钙离子浓度[(Ca²⁺)_i]，发现缺氧显著上调了[(Ca²⁺)_i]，主要是因为缺氧刺激下细胞内ATP产生受阻，钙泵失活，导致细胞内主动转运出的Ca²⁺大幅减少。此外，研究发现巨噬细胞Piezo1敲除组与对照组相比，[(Ca²⁺)_i]显著下降(图12A-12C)，表明巨噬细胞Piezo1在调控Ca²⁺流入方面起着至关重要的作用。

2.2、巨噬细胞Piezo1基因敲除对CaMKII/ETS1通路的影响

应用western blot发现，巨噬细胞Piezo1敲除后p-CaMKII/CaMKII、p-ETS1/ETS1明显下调(图13D和13E)，而Yoda1刺激后CaMKII/ETS1通路被显著激活(图13F和13G)，表明Piezo1通过CaMKII/ETS1通路发挥作用。而ETS1在丝氨酸位点的磷酸化导致其与DNA结合的能力被抑制，因此我们猜测ETS1可能参与调控FGF2的转录。

2.3、巨噬细胞ETS1基因敲除对FGF2的影响

应用小干扰RNA沉默ETS1基因表达(siETS1)处理野生型小鼠BMDMs，发现体外巨噬细胞ETS1基因敲除可以同时在RNA和蛋白层面抑制FGF2的表达(图14A-14C)。应用JASPAR软件预测，发现ETS1与FGF2启动子区具有强结合位点(R1，-339/-344；R2，-576/-585)，提示ETS1可能通过直接结合FGF2启动子促进其表达。染色质免疫共沉淀技术(ChIP)提示ETS1特异性与FGF2启动子R1区域结合(图14D和14E)。构建含有R1区域的野生型FGF2启动子荧光素酶报告质粒与ETS1过表达质粒或空载共转染，双荧光素酶报告基因(luciferase)结果显示ETS1促进FGF2启动子的表达(图14F)；构建R1区域突变后的突变型FGF2启动子荧光素酶报告质粒与ETS1过表达质粒或空载共转染，显示两组间没有显著差异(图14F)，再次证实了ETS1特异性与FGF2启动子R1区域结合。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种巨噬细胞Piezo1抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用。

2.一种巨噬细胞Piezo1抑制剂在制备改善缺血下肢血流灌注水平的药物中的应用。

3.一种巨噬细胞Piezo1抑制剂在制备促进血管新生因子FGF2表达和分泌的药物中的应用。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述巨噬细胞Piezo1抑制剂为抑制Piezo1活性的物质或者降低Piezo1水平的物质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制Piezo1活性的物质选自GsMTx4、毒胡萝卜素、细胞松弛素D或维拉帕米等。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降低Piezo1水平的物质选自干扰RNA、microRNA或基因敲除材料等。