CN113368242B

CN113368242B - 一种抑制非小细胞肺癌靶标的应用

Info

Publication number: CN113368242B
Application number: CN202110580514.9A
Authority: CN
Inventors: 楼哲丰; 孙碧诺; 洪丹; 赵玲玲; 黄海山
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2041-05-27
Also published as: CN113368242A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及抑制非小细胞肺癌转移的新靶标发现与其应用，更具体涉及hsa_circ_0004089作为抑制非小细胞肺癌转移新靶标研究与其应用。本发明公开了hsa_circ_0004089表达促进剂在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用。

Description

一种抑制非小细胞肺癌靶标的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抑制非小细胞肺癌转移的新靶标发现与其应用，更具体涉及hsa_circ_0004089作为抑制非小细胞肺癌转移新靶标研究与其应用。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构(IARC)发布的全球癌症负担状况最新估计报告数据显示，全球癌症负担持续增长。IARC通过GLOBOCAN估算，2020年全球新发生癌症数约1929万例，癌症死亡数约996万例。其中，肺癌约占新发生病例11.4％，死亡数约占18.4％；中国癌症死亡人数300万，其中肺癌死亡人数高达71万，占癌症死亡人数的23.8％，依然是我国主要的恶性肿瘤。肺癌根据病理组织可分为：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC约占80％～85％。NSCLC早期症状不特异，易被忽略；很多患者有明显不适时已是晚期或已转移，错过最佳治疗时间。肿瘤的分化程度往往与其恶性程度负相关，相比于高分化和中分化癌，低分化和未分化癌则更具侵袭性，生长更快，更易于扩散到身体其他部位。研究表明，转移是造成NSCLC患者死亡的主要原因。因此寻找更加准确特异及有效抑制肿瘤转移的治疗靶标，提高NSCLC患者的诊断与治疗效果，是本行业目前临床实践中需要迫切解决的问题。

随着高通量测序技术与分子生物学技术的不断发展，越来越多的研究表明非编码RNA在肺癌的进展中发挥着重要作用。环状RNA(circRNA)在20世纪90年代初被发现，但由于当时技术限制，一直被认为是转录的副产物；然而近年来的研究表明，哺乳动物中富含着多种circRNA，并具有组织特异性。CircRNA大多是起源于编码蛋白功能的mRNA，少数来自非编码RNA或基因间序列；绝大多数已知的circRNA可以作为竞争性结合miRNA的“miRNASponge”调控miRNA靶基因mRNA降解与翻译抑制的不同命运，并进一步导致靶基因蛋白表达量的变化。近些年来，人们已发现circRNA可以在人体中参与包括肿瘤发生与发展在内的几乎所有的生命过程。但是包括NSCLC在内，还有众多的具有重要作用但是功能未知的circRNA分子未被研究报道，因此新circRNA分子靶标的鉴定及机制阐明，有助于全面了解circRNA的生物学功能，同时也有助于促进新的高效诊治NSCLC的药物的研发。

已有文献报道经自噬抑制剂二磷酸氯喹处理的胰腺癌细胞PANC-1后，hsa_circ_0004089的表达上调，但hsa_circ_0004089在肿瘤临床样本中的表达情况及生物学功能尚不清楚，因此研究其在NSCLC中的表达水平及生物学功能，有助于以hsa_circ_0004089为靶标的新的NSCLC的药物的研发。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种抑制NSCLC转移的靶标及其应用，本发明表明hsa_circ_0004089可以应用为NSCLC转移的靶标。

为了解决上述技术问题，本发明提供hsa_circ_0004089作为抑制非小细胞肺癌转移的靶标的应用。

本发明还同时提供了上述hsa_circ_0004089表达促进剂在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用。

作为本发明应用的改进：抑制非小细胞肺癌细胞的体内转移。

作为本发明应用的进一步改进：所述hsa_circ_0004089表达促进剂为hsa_circ_0004089的过表达质粒。

本发明还同时提供了一种治疗非小细胞肺癌的组合物，组合物包含：

(1)hsa_circ_0004089的表达促进剂；

(2)药剂学上能够接受的载体。

作为本发明的治疗非小细胞肺癌的组合物的改进：所述hsa_circ_0004089表达促进剂为hsa_circ_0004089的表达质粒。

本发明还同时提供了一种检测hsa_circ_0004089表达的试剂：所述hsa_circ_0004089表达的试剂包含基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂，荧光定量PCR定量检测方法的试剂包含一对特异性引物，

F(上游引物)：5’-GGTGATGAGTATGATGCACCT-3’；

R(下游引物)：5’-ATCCTGCAAACTGCATACTGA-3’。

本发明所采取的技术方案如下：本发明发现，通过对实验室收集的77对临床组织样本进行RT-qPCR检测，发现在77对临床组织样本中，相较于正常肺组织，hsa_circ_0004089基因在癌组织中显著低表达。同时，将77对临床样本按照病理学分化程度进行分类并分组，qPCR检测发现，hsa_circ_0004089在低分化癌患者组织中表达更低。

本发明通过构建hsa_circ_0004089过表达质粒并建立H1299细胞和H226细胞过表达稳转细胞株后，通过Transwell实验，体外研究发现hsa_circ_0004089的低表达显著促进了H1299细胞和H226细胞的迁移与侵袭能力。

本发明采取尾静脉注射的方式建立裸鼠肺转移模型，观察H1299细胞在裸鼠体内肺转移情况。研究发现，hsa_circ_0004089显著抑制了非小细胞肺癌细胞(NSCLC细胞)H1299细胞的体内转移能力。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过qPCR实验技术发现，相较于癌旁正常组织，在癌组织中hsa_circ_0004089在转录水平呈现显著低表达，同时，hsa_circ_0004089在低分化癌组织中的表达量更低；本发明进一步以NSCLC细胞H1299、H226细胞为模型，过表达hsa_circ_0004089可显著抑制NSCLC细胞H1299、H226的体外迁移与侵袭能力；动物实验表明，过表达hsa_circ_0004089可显著抑制NSCLC细胞H1299的体内转移能力，表明hsa_circ_0004089可以作为抑制NSCLC转移的潜在的治疗靶标。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为hsa_circ_0004089在NSCLC组织及细胞中表达量相对低且与NSCLC恶性程度相关；(*)表示差异具有统计学意义(P<0.05)；

图1中，

A为利用本发明所述hsa_circ_0004089特异性引物检测hsa_circ_0004089在77对临床样本中转录水平表达情况；

B为利用本发明所述hsa_circ_0004089特异性引物检测hsa_circ_0004089在不同分化程度的NSCLC组织中的表达差异情况；

C为利用本发明所述hsa_circ_0004089特异性引物检测hsa_circ_0004089在NSCLC细胞系中转录水平表达情况；

图2为hsa_circ_0004089可显著抑制NSCLC细胞H1299与H226的体外迁移与侵袭能力；(*)表示差异具有统计学意义(P<0.05)；

图2中，

A为在H1299、H226细胞中过表达hsa_circ_0004089后通过qPCR鉴定过表达效率；

B-E为通过Transwell实验检测hsa_circ_0004089对NSCLC细胞H1299与H226体外迁移与侵袭能力的影响。

图3为hsa_circ_0004089可显著抑制NSCLC细胞H1299的体内转移能力；

图3中，

A为采取尾静脉注射的方式建立裸鼠肺转移模型，造模成功后对裸鼠肺组织进行正反面拍照；(*)表示差异具有统计学意义(P<0.05)

B为采取尾静脉注射的方式建立裸鼠肺转移模型，造模成功后观察过表达hsa_circ_0004089后H1299细胞相较于对照细胞在裸鼠肺中转移情况，裸鼠肺转移灶计数；

C为采取尾静脉注射的方式建立裸鼠肺转移模型，造模成功后对裸鼠肺组织进行HE染色。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1

通过RT-qPCR检测收集的77对临床样本中转录水平的表达情况(图1A)；检测hsa_circ_0004089在不同分化程度的NSCLC组织中的表达差异情况(图1B)；检测hsa_circ_0004089在肺正常支气管上皮细胞、NSCLC细胞的表达情况(图1C)。

具体如下：

1)组织样本

已确诊并实施手术切除的NSCLC临床组织样本等由温州医科大学附属第一医院提供，样本采集与利用已通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会的伦理批准，严格按照相关制度与流程进行采集与利用。采集到样本后，一部分组织采取液氮速冻的方式保存于液氮罐中，一部分组织立即用4％的PFA固定24h-48h，具体处理流程如下：

a.组织脱水：组织经4％PFA固定后，流水冲洗组织20min，除去残余的PFA固定液。之后按照30％酒精1h→50％酒精1h→70％酒精4℃过夜→80％酒精1h→90％酒精1h→95％酒精1h→100％酒精I1h→100％酒精II 1h的顺序将组织梯度脱水(I与II代表玻璃瓶编号，酒精试剂无差异)。

b.组织透明：组织经梯度脱水后，将组织置入50％无水乙醇与50％二甲苯的混合液玻璃缸中5min，之后将组织转入二甲苯I中5min，之后再转入二甲苯II中5min(I与II代表玻璃瓶编号，二甲苯试剂无差异)。

c.组织浸蜡：组织透明后，将组织浸入软蜡中2h，之后浸入硬蜡中1h。

d.组织包埋：将组织从塑料包埋盒中取出，放入金属包埋盒中，将塑料包埋盒掩于其上，滴加适量的硬蜡，使硬蜡充分包裹塑料包埋盒，待硬蜡微凝固后将蜡块继续转入冰盒中，使蜡块与金属包埋盒脱离，取出蜡块，常温或4℃长期保存。

2)组织总RNA提取

a.从超低温冰箱中取出NSCLC临床样本，每个样本取样约50mg于EP管中，加入1mL的Trizol混匀，组织需要剪碎并用组织破碎仪充分破碎。

b.加入200μL氯仿，剧烈震荡30s，冰上静置3min；提前预冷离心机至4℃。4℃离心：12000g，15min。

c.用200μL的去酶枪头吸取上清，移至新的EP管中，约400μL。加入等体积的400μL异丙醇，颠倒混匀，冰上静置20min；4℃离心：12000g，10min，弃去上清。

d.用DEPC水配制75％酒精，向上述沉淀中加入1mL配置好的75％酒精，吹打沉淀，4℃离心：7500g，5min，弃去上清，重复此步骤。

e.弃去上清后空离1min，用去酶小枪头吸取残留上清，留底部白色沉淀。开盖晾干，待底部白色沉淀透明后加入去酶水；4℃溶解2h，测定RNA浓度。

3)RT-qPCR

依照3)中提取并测定完成RNA浓度后，使用购买于Promega公司的GoScript^TMReverse Transcription System逆转录试剂盒进行逆转录，根据试剂说明书逆转录反应体系及步骤如下：

按照说明书将各试剂成分与RNA模板加入到去酶PCR管中，振荡混匀，之后将其置于PCR仪，设置PCR仪第一步反应程序：70℃，5min。反应完成后，冰上静置大于5min，按照如下表体系将各组分混匀并加入到第一步反应所得产物中，进行第二步PCR反应。

上按照说明书将各组分加入到PCR管中，振荡混匀，之后将其置于PCR仪，设置PCR仪第二步反应程序：25℃5min，42℃60min，70℃15min。得到cDNA后，封口膜密封-80℃保存或完成下一步实验后再进行保存处理。将所需细胞获得cDNA后，利用Promega所购试剂盒进行PCR，PCR反应体系如下(4℃操作)：

PCR Forward Primer：5’-GGTGATGAGTATGATGCACCT-3’；

PCR Reverse Primer：5’-ATCCTGCAAACTGCATACTGA-3’。

按照以上反应体系将各组分充分混匀，加于384孔板中，每个样本设置3个复孔，离心：3000rpm，1min，使各组分混匀并沉于孔底，置于Q6荧光定量PCR仪中进行检测。检测引物为权利要求书中所述检测hsa_circ_0004089表达的特异性引物，PCR反应条件为热激活：95℃，2min，变性：95℃，15s，退火：60℃，30s，延伸：60℃，30s，共设置40cycles。

所得结果为：hsa_circ_0004089在NSCLC组织中表达相对低表达且与肿瘤分化程度相关。

实施例2

hsa_circ_0004089显著抑制NSCLC细胞的体外迁移与侵袭能力

依据基因合成方式合成目的基因hsa_circ_0004089序列并通过亚克隆方法在pLC5-ciR质粒载体上构建hsa_circ_0004089过表达质粒(委托北京擎科生物有限公司构建)，随后在H1299与H226细胞中过表达hsa_circ_0004089，建立稳定转染细胞H1299-hsa_circ_0004089，H226-hsa_circ_0004089及其对照细胞H1299-Vector，H226-Vector。qPCR实验验证过表达效率(图2A)。

采用Transwell实验，将H1299-hsa_circ_0004089，H226-hsa_circ_0004089以及对照细胞用0.1％对应的培养基重悬细胞之后种于上室中，下室采用全培培养，24h后4％PFA固定20min，100％甲醇渗透20min，吉姆萨染色液进行避光染色30min并拍照，对迁移和浸润的细胞数定量分析，如图2B-E所示，其差异具有统计学意义(P<0.05)。

所得结果为：hsa_circ_0004089显著抑制NSCLC细胞体外迁移与侵袭能力。

实施例3

过表达hsa_circ_0004089显著抑制NSCLC细胞的体内转移能力

1)动物饲养

BALB/C-nu雌性裸鼠，周龄为3-4周，体重15±0.5克，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心SPF级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。

2)尾静脉注射

0.25％胰酶消化处于对数生长期的H1299-Vector细胞、H1299-hsa_circ_0004089细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50mL离心管中，1200rpm离心5min，弃去上清培养基，用PBS重悬细胞洗一次，再次1200rpm离心5min后弃去PBS，加入1mL PBS重悬，按照一定比例稀释细胞后冲池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠尾静脉注射100μL细胞悬液，其中包含1.5×10⁶细胞。裸鼠尾静脉注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，接种前将细胞悬液充分混匀，用1mL无菌胰岛素注射器吸取100μL细胞悬液，缓慢尾静脉注射，每组注射5只裸鼠。

3)测定拍照

待裸鼠接种肿瘤细胞生长12周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出裸鼠肺组织，拍照(图3A)，统计转移灶数目(图3B)并固定包埋肺组织。

4)HE染色

包埋后的组织经过切片机切至4μm厚度片，42℃展片；

a.烤片：65℃烘箱内烤片2h。

b.脱蜡：二甲苯I 5min→二甲苯II 5min→1/2二甲苯1/2酒精2min(洗二甲苯)，脱蜡时间与石蜡能否彻底溶解及当时气温相关。若气温较高，则可缩短脱蜡时间，反之则可延长脱蜡时间。

c.复水：100％酒精4min→95％酒精5min→85％酒精2min→70％酒精2min→50％酒精2min→ddH2O 1min。

d.苏木素染色：苏木精染色2min，自来水10min内换水5次。

e.分化：0.5％盐酸乙醇10s，蒸馏洗10s，氨水洗10s。

f.脱水：切片经70％酒精2min→85％酒精2min→95％酒精4min。

g.伊红染色：0.5％伊红液染色3min→95％酒精3min→100％酒精I 5min→100％酒精II 5min。

h.透明：二甲苯I 3min，二甲苯II 3min。

i.中性树胶封片，待其干燥后于显微镜下拍照(图3C)。

所得结果为：过表达hsa_circ_0004089显著抑制NSCLC细胞的体内转移能力；因此，进一步表明hsa_circ_0004089可以作为抑制NSCLC转移的新治疗靶标。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种抑制非小细胞肺癌靶标的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtgatgagt atgatgcacc t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcctgcaaa ctgcatactg a 21

Claims

1.hsa_circ_0004089表达促进剂在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用，其特征在于：所述hsa_circ_0004089表达促进剂为hsa_circ_0004089的过表达质粒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制非小细胞肺癌细胞的体内转移。

3.一种治疗非小细胞肺癌的组合物，其特征在于，组合物包含：

（1）hsa_circ_0004089表达促进剂；所述hsa_circ_0004089表达促进剂为hsa_circ_0004089的过表达质粒；

（2）药剂学上能够接受的载体。