BRPI0922184A2

BRPI0922184A2 - célula isolada, população isolada de células, matriz ou estrutura sintética permanente ou decelularizada degradável, e , método para tratar um indivíduo

Info

Publication number: BRPI0922184A2
Application number: BRPI0922184-0A
Authority: BR
Inventors: Stewart ABBOT; Jia-Lun Wang; James W. Edinger; Aleksandar Francki; Aleksandr Kaplunovsky; Vladimir Jankovic; Kristen Labazzo; Eric Law; Neerav D. Padliya; Jennifer Paredes
Original assignee: Anthrogenesis Corporation
Priority date: 2008-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2020-08-18
Also published as: AU2009316541A1; IL212765A; RU2015130665A; CA2743566C; WO2010059828A1; US8367409B2; CN102282252B; CN102282252A; NZ592726A; NZ602455A; US9198938B2; US20100124569A1; US20160361366A1; RU2015130665A3; EP2367932A1; CN107201337A; RU2011124524A; RU2562154C2; MX2011005229A; JP2012509087A

Abstract

CÉLULA ISOLADA, POPULAÇÃO ISOLADA DE CÉLULAS, MATRIZ OU ESTRUTURA SINTÉTICA PERMANENTE OU DECELULARIZADA DEGRADÁVEL, E, MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO. São aqui fornecidas novas células angiogênicas a partir do âmnio relacionadas às células aderentes derivadas do âmnio, e populações de tais células e composições que compreendem as mesmas. São aqui fornecidos adicionalmente métodos para obter tais células e métodos de usar as células no tratamento de indivíduos.

Description

+ “CÉLULA ISOLADA, POPULAÇÃO ISOLADA DE CÉLULAS, MATRIZ e OU ESTRUTURA SINTÉTICA PERMANENTE OU DECELULARIZADA * DEGRADÁVEL, E, MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO” ú Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente - 5 provisóriados Estados Unidos 61/116.248, depositado em 19 de novembro de 2009, cuja revelação é incorporada pela referência na sua íntegra.

CAMPO DA INVENÇÃO São aqui fornecidas células angiogênicas inéditas a partir do âmnio, e populações de tais células, aqui referidas como "células aderentes — derivadas do âmnio" (AMDACs). As células aderentes derivadas do âmnio são distintas das células tronco derivadas da placenta previamente descritas, incluindo células tronco derivadas da placenta aderentes ao plástico para cultura de tecidos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO = 15 As composições celulares, por exemplo, composições de célula tronco, têm se tornado uma terapia atraente para inúmeras deficiências fisiológicas, por exemplo, transplante de medula óssea. Existe uma necessidade de populações adicionais de células, por exemplo, células tronco ou células progenitoras que apresentam potencial e/ou propriedades —angiogênicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Em um aspecto, é aqui fornecido uma célula isolada aderente derivada de âmnio, aqui também referida como uma AMDAC, em que a dita célula é aderente ao plástico para cultura de tecidos, e em que a dita célula é OCT (negativa para OCT-4, também conhecida como POUSF1 ou proteína de ligação do octâmero 4), ou da maneira determinada pela reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR), por exemplo, comparada a uma linhagem celular controle apropriada, tal como uma linhagem de célula tronco derivada de carcinoma embrionário (por exemplo, NTERA-2, por

- exemplo, disponível pela American Type Culture Collection, ATCC número CRL- 1973), da maneira determinada por RT-PCR para 30 ciclos. Em uma ' modalidade específica, as células são OCT-4', da maneira determinada por Ú RT-PCR, e VEGFRI/FIt-1* (receptor do fator de crescimento endotelial . 5 — vascularl) e/ou VEGFR2/KDR' (receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2, também conhecida como receptor do domínio de inserção da quinase), da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, as células são OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, e CD49f (integrina-a6), da maneira determinada por —imunolocalização. Em uma modalidade específica, a dita célula é OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, e HLA-G, da maneira determinada por RT-PCR. Em uma outra modalidade específica, a dita célula é OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR, e CD90*, CD105*, ou CD117' da maneira determinada por imunolocalização. Em uma modalidade mais específica, a * 15 dita célula OCT4 é CD90”, CDIO05S* e CDI17. Em uma outra modalidade específica, a célula é OCT-4', e não expressa SOX2, por exemplo, da maneira determinada por RT-PCR para 30 ciclos.

Em uma outra modalidade, a dita célula OCT-4' é uma ou mais de CD29”, CD73', ABC- P”, e CD38, da maneira determinada por —imunolocalização.

Em uma outra modalidade específica, a dita célula OCT-4 é adicionalmente uma ou mais de CD9*, CD10”, CD44*, CD54*, CD98”, Tie-2" (receptor de angiopoietina), TEM-7" (marcador endotelial de tumor 7), CD31” , CD34', CD45', CD133”, CD143 (enzima conversora de agiotensina 1, ACE), —CDI46 (molécula de adesão de célula de melanoma), CXCRA4 (receptor 4 de quimiocina (motivo C-X-C)) da maneira determinada por imunolocalização. Em uma modalidade mais específica, a dita célula é CD9*, CD10”, CD44”, CD54”, CD98”, Tie-2", TEM-7”, CD31”, CD34, CD45, CD133, CDI43”, CD146' e CXCR4' da maneira determinada por imunolocalização. Em uma

- outra modalidade mais específica, a célula aderente derivada de âmnio aqui ; fornecida é OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR; VEGFRI/Flt-1* e/ou VEGFR2/KDR', da maneira determinada por imunolocalização; e um ou ú mais, ou todos, de CD31, CD34, CD45, CD 133, e/ou Tie-2' da maneira . 5 — determinada por imunolocalização. Em uma modalidade específica, a célula aderente derivada de âmnio, ou uma população de células aderentes derivadas do âmnio, expressa pelo menos 2 log menos de RNAm amplificado por PCR para OCT-4" em, por exemplo, >20 ciclos, do que uma célula NTERA-2, ou população.de células NTERA-2 com um número equivalente de células. Em uma outra modalidade específica, a dita célula OCT-4' é adicionalmente VE- caderina' (CDI44) da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, a dita célula OCT-4' é adicionalmente positiva : para CD105* e CD200* da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, a dita célula OCT-4' não expressa CD34' da "15 maneira detectada por imunolocalização após exposição a 1 a 100 ng/mL de VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) por 4 a 21 dias.

Em um outro aspecto, é aqui fornecido uma célula isolada aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para cultura de tecidos, e em que a dita célula é OCT-4º e SOX-2, da maneira determinada por RT-PCR; e CD90”, CDI05”, e CDI17, da maneira determinada por citometria de fluxo. Em modalidades específicas, a célula OCT-4, SOX-2' é adicionalmente HLA-G' ou CD271, da maneira determinada por citometria de fluxo. Em uma modalidade mais específica, a dita célula é OCT-4' e SOX-2, da maneira determinada por RT-PCR; e —CD90”, CDIO05', CDI1I7, CD271º e HLA-G', da maneira determinada por citometria de fluxo.

Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma célula isolada aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para cultura de tecidos, e em que a dita célula é positiva para CD309 (também

- conhecida como VEGFR2/KDR'). Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma célula isolada aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para ú cultura de tecidos, e em que a dita célula é OCT-4', da maneira determinada - 5 porRT-PCR,e uma ou maisde VEGFR2/KDR', CD9*, CDS4”, CDIOS, CD200*, ou VE-caderina”, da maneira determinada por imunolocalização.

Em uma modalidade específica, a dita célula é OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR em, por exemplo, >20 ciclos, e VEGFR2/KDR*, CD9”, CD54”, CDI05”, CD200* e VE-caderina,y da maneira determinada por —imunolocalização.

Em uma outra modalidade específica, a célula não expressa CD34”, da maneira detectada por imunolocalização, após exposição a 1 a 100 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias. : Em uma outra modalidade, a célula aderente derivada de âmnio é OCT-4, CD49f', HLA-G, CD90”, CDI05”, e CDI17.. Em uma * 15 modalidade mais específica, a dita célula é uma ou mais de CD9”, CDIO', CD44", CD54”, CD98", Tie-2', TEM-7*, CD31”, CD34, CD45, CD133, CD143”, CDI46 (molécula de adesão de célula de melanoma), ou CXCR4, da maneira determinada por imunolocalização ou citometria de fluxo.

Em uma modalidade mais específica, a dita célula é CD9*, CDIO0*, CD44*, CD54', CD98”, Tie-2”, TEM-7”, CD31”, CD34', CD457, CD133, CDI43, CDI46 e CXCR4 da maneira determinada por imunolocalização.

Em uma outra modalidade específica, a dita célula é adicionalmente VEGFR1/FIlt-1* e/ou VEGFR2/KDR', da maneira determinada por imunolocalização; e uma ou mais de CD31, CD34, CD45, CD133' e/ou Tie-2, da maneira — determinada por imunolocalização.

Em uma outra modalidade específica, a dita célula é adicionalmente VEGFR1/FIlt-1", VEGFR2/KDR", CD31', CD34”, CDA45”, CD133 e Tie-2', da maneira determinada por imunolocalização.

Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma célula isolada aderente derivada de âmnio, em que a dita célula não expressa RNAm para

- FGFA4, IFNG, CXCL10, ANGPT4, ANGPTL3, FGA, LEP, PRL, PROK1, . TNMD, FLT3, XLKD1, CDH5, LECTI, PLG, TERT, SOX2, NANOG, MMP-13, DIXS ou BGLAP, da maneira determinada por RT-PCR, por * exemplo, para 30 ciclos.

Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma - 5 — célula isolada aderente derivada de âmnio, em que a dita célula não expressa constitutivamente uma ou mais de cadeia invariante, HLA-DR-DP-DQ, CD6,

CD?271, da maneira determinada por citometria de fluxo.

Adicionalmente é aqui fornecida uma população isolada de células que compreende uma célula aderente derivada de âmnio.

Em uma modalidade específica, pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de células na dita população são as células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma modalidade, a dita célula é OCT-4', da maneira : determinada por RT-PCR, e VEGFRI/FIt-I' e/ou VEGFR2/KDR' da maneira determinada por imunolocalização, e em que a dita população isolada de 7" 15 célulasnãoé um âmnio.

Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população isolada de células que compreende uma célula aderente derivada de âmnio que é OCT-4' e HLA-G, da maneira determinada por RT-PCR, e VEGFRI/FIt-l* ou VEGFR2/KDR'da maneira determinada por imunolocalização; e em que a dita população isolada de células não é um —âmnio.

Em uma modalidade específica, pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de células na dita população são as ditas células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população isolada de células que compreende uma célula aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para — cultura de tecidos, em que a dita célula é OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, VEGFRI/FIt-l" e VEGFR2/KDR "da maneira determinada por imunolocalização, em que a dita célula é adicionalmente uma ou mais de CD9*, CDI0”, CD4*, CD54"”, CD98”, Tie-2', TEM-T', CD31, CD34, CD45, CD133”, CDI43, CDI46, ou CXCRA4”, da maneira determinada por

- imunolocalização, ou HLA-G' da maneira determinada por RT-PCR for, por ' exemplo, >20 ciclos, e em que a dita população isolada de células não é um âmnio.

Em uma modalidade específica, pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 “ %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de células na dita população são as ditas - 5 — células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população isolada de células que compreende uma célula aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para cultura de tecidos, em que a dita célula é OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, VEGFRI/FIt-1* e/ou VEGFR2/KDR "da maneira determinada por —imunolocalização, em que a dita célula não expressa CD34' da maneira detectada por imunolocalização após exposição a 1 a 100 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias, e em que a dita população isolada de células não é um âmnio.

Em uma modalidade específica, pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 i %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de células na dita população são as ditas 7 15 células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma outra modalidade, quaisquer das populações de células anteriores que compreendem células aderentes derivadas do âmnio formam brotamentos ou estruturas do tipo tubo quando cultivadas na presença de fatores angiogênicos tais como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) ou fator de crescimento de fibroblasto básico (DFGF), por exemplo, em um substrato tal como MATRI

GEL'Y, Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população de células, em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou — 98% de célulasna dita população isolada de células são as células aderentes derivadas do âmnio que são OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, e positiva para VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CDI105, ou CD200. Em uma modalidade específica, pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de células na dita população isolada de células são as células

- aderentes derivadas do âmnio que são OCT-4', da maneira determinada por : RT-PCR, e VEGFR2/KDR', CD9*, CD54”, CDI05* e CD200”, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma modalidade mais específica, as % ditas células aderentes derivadas do âmnio não expressam CD34”, da maneira - 5 — detectada por imunolocalização, após exposição a 1 a 100 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias. Em uma modalidade específica, as ditas células aderentes derivadas do âmnio são aderentes ao plástico para cultura de tecidos. Em uma outra modalidade específica, a dita população de células forma brotamentos ou estruturas do tipo tubo quando cultivadas na presença de um fator —angiogênico tais como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) ou fator de crescimento de fibroblasto básico (DFGF), por exemplo, em um substrato tal como MATRI GEL'M, i Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população de * 15 células, por exemplo, células humanas, em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de células na dita população isolada de células são as células aderentes derivadas do âmnio que expressam RNA para uma ou mais, ou todas, de ACTA2, ADAMTS1I, AMOT, ANG, ANGPTI, ANGPT2, ANGPTLI, ANGPTL2, ANGPTLA, BAII, CD44, CD200, —CEACAMI, CHGA, COLISAI, COLI8AI, COL4AI, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLNS, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLTA4, FNI, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNBI1, IL8, ILI2A, ITGA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MY0Z2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, —PF4, PGKI, PROXI, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINFI, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIEI, TIEV/TEK, TNF, TNNII, TNFSFI15, VASH1I, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFRI/FLTI ou VEGFR2/KDR.

Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população de

- células, por exemplo, uma população de células aderentes derivadas do : âmnio, ou uma população de células em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de células na dita população isolada de ú células são as células aderentes derivadas do âmnio que expressam uma ou - 5 mais de, ou todas de, CD49d, Conexina-43, HLA-ABC, Beta 2- microglobulina, CD349, CD318, PDL1, CD106, Galectina-1, precursor de ADAM 17 (Um domínio de desintegrina e metaloproteinase 17) (enzima conversora de TNF-alfa)à (TNF-alfa convertase)) precursor de angiotensinogênio, Filamina A (Alfa-filamina) (Filamina 1) (Proteína de ligação de actina endotelial) (ABP-280) (Filamina não muscular), Alfa- actinina 1 (Isoforma do citoesqueleto de alfa-actinina) (Alfa-actinina 1 não muscular) (Proteína de ligação cruzada de F-actina), precursor de proteína 2 relacionado ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (megalina) i (glicoproteína 330) (gp330), receptor captador de macrófago tipos I e II 7 15 (receptor LDI acetilado de macrófago I e II), precursor tipo HB do receptor de activina (ACTR-IIB), proteína Wnt-9, proteína acídica fribilar glial, astrócito (GFAP), proteína C de ligação de miosina, tipo cardíaca (MyBP-C cardíaca) (C-proteína, isoforma do músculo cardíaco), ou miosina de cadeia pesada, tipo não muscular A (miosina celular de cadeia pesada, tipo A) — (miosina não muscular de cadeia pesada-A) (NMMHC-A).

Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma população de células, por exemplo, uma população de células aderentes derivadas do âmnio, ou uma população de células em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de células na dita população isolada de —célulassão as células aderentes derivadas do âmnio que secretam uma ou mais, ou todas, de VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, folistatina, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-I, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, ou Galectina- 1, por exemplo, em meio de cultura no qual a célula ou células são crescidas.

Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população de

- células, por exemplo, uma população de células aderentes derivadas do âmnio, ou uma população de células em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, ; 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de células na dita população isolada de É células são as células aderentes derivadas do âmnio que expressam RNAs - 5 micro angiogênicos (RNAmis) em um nível maior que células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea, em que os ditos RNAmis compreendem um ou mais, ou todos, de Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi- 19b, Rmi-92, e/ou Rmi-296. Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população de células, por exemplo, uma população de células aderentes — derivadas do âmnio, ou uma população de células em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de células na dita população isolada de células são as células aderentes derivadas do âmnio que expressam um ou mais de, ou todos de, RNAs micro angiogênicos (RNAmis) em um i nível menor que células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea, 7 15 emqueosditos RNAmis compreendem um ou mais, ou todos, de Rmi-20a, Rmi-20b, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b e/ou Rmi-16. Em certas modalidades, AMDACSs, ou populações de AMDACSs, expressam um ou mais, ou todos, os RNAmis angiogênicos Rmi-17-3p, Rmi-l18a, Rmi-18b, Rmi-19b, Rmi-92, Rmi-20a, Rmi-20b, Rmi-296, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b e/ou Rmi-16.

Em uma outra modalidade específica, é aqui fornecida uma célula angiogênica derivada de âmnio, ou população de células angiogênicas derivadas de âmnio, que expressam níveis maiores de CD202b, IL-8 e/ou VEGF em condições hipóxicas (por exemplo, menos que cerca de 5 % de O») comparadas às condições normóxicas (por exemplo, cerca de 20 % ou cerca de21%deO).

Em uma outra modalidade específica, a população isolada de células aderentes derivadas do âmnio compreende adicionalmente um segundo tipo de célula Em modalidades específicas, as AMDACs compreendem pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %,

- 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou pelo menos 98 % : de células na dita população. Em uma modalidade específica, o segundo tipo de célula está contido no sangue placentário ou é isolado deste, sangue do “ cordão umbilical, medula óssea bruta ou outros tecidos. Em uma modalidade - 5 mais específica, o dito segundo tipo de célula é célula tronco embrionária, uma célula sanguínea, uma célula tronco isolada do sangue periférico, uma célula tronco isolada do sangue placentário, uma célula tronco isolada de perfusado placentário, uma célula tronco isolada de tecido placentário, uma célula tronco isolada de sangue do cordão umbilical, uma célula tronco do 10 — cordão umbilical, uma célula tronco mesenquimal derivada de medula óssea, uma célula estromal mesenquimal, uma célula tronco hematopioética, uma célula tronco somática, um condrócito, um fibroblasto, uma célula muscular, uma célula endotelial, uma célula progenitora endotelial, um pericito, um i miócito, um cardiomiócito, um mioblasto, um angioblasto ou um * 15 —cardiomioblasto. Em uma outra modalidade específica, o dito segundo tipo de célula é uma célula progenitora ou tronco hematopoiética, por exemplo, uma célula um CD34*. Em uma outra modalidade mais específica, o dito segundo tipo de célula compreende pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou pelo —menos598% de células na dita população.

Em uma outra modalidade específica, qualquer uma das células anteriores são, ou foram, proliferadas na cultura. Em uma outra modalidade específica, qualquer uma das células anteriores é de uma cultura das ditas células que passaram pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 vezes ou mais. Em uma outra modalidade específica, qualquer uma das células anteriores é de uma cultura que dobrou seu cultivo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou pelo menos 50 vezes ou mais.

. Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo quaisquer das : células aderentes derivadas do âmnio, ou populações de células % compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas. Em : 5 uma modalidade específica, a composição é uma matriz ou estrutura, por exemplo, uma matriz ou estrutura de matriz natural, por exemplo, uma matriz ou estrutura de tecido decelularizado degradável ou permanente; ou matriz ou estrutura sintética. Em uma modalidade mais específica, a dita matriz ou estrutura é moldada na forma de um tubo ou outra forma tridimensional de um organóide. Em uma outra modalidade mais específica, a dita matriz é uma matriz de tecido decelularizado. Em uma outra modalidade específica, a composição compreende uma ou mais das células aderentes derivadas do âmnio isoladas aqui fornecidas, ou população de células compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio, em uma solução fisiologicamente 7 15 — aceitável, por exemplo, uma solução salina, meio de cultura ou similares.

Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um indivíduo com uma doença ou distúrbio do sistema circulatório, compreendendo administrar uma ou mais das células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas ao dito indivíduo em uma quantidade e por um período — suficiente para melhoria detectável de um ou mais sintomas da dita doença ou distúrbio. Em uma outra modalidade, é aqui fornecido um método de tratar um indivíduo com uma doença ou distúrbio do sistema circulatório, compreendendo administrar células aderentes derivadas do âmnio ao dito indivíduo em uma quantidade e por um período suficiente para melhoria — detectável de um ou mais indícios de função cardíaca, em que os ditos indícios de função cardíaca são rendimento cardíaco torácico (CO), índice cardíaco (CI), pressão pulmonar arterial em cunha (PAWP), índice cardíaco (CD, % de encurtamento fracional (% de FS), fração de ejeção (EF), fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF); diâmetro diastólico final ventricular

- esquerdo (LVEDD), diâmetro sistólico final ventricular esquerdo (LVESD), contratilidade (dP/dt), uma diminuição no funcionamento atrial ou ventricular, um aumento na eficiência de bombeamento, uma diminuição na taxa de perda 7 de eficiência de bombeamento, uma diminuição na perda do funcionamento . 5 — hemodinâmico, ou diminuição nas complicações associadas à cardiomiopatia, comparados ao indivíduo antes da administração de células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma modalidade específica, a dita doença ou distúrbio é infarto do miocárdio.

Em uma outra modalidade específica, a dita doença ou distúrbio é cardiomiopatia.

Em outras modalidades específicas, a dita doença ou distúrbio é aneurisma, angina, estenose aórtica, aortite, arritmias, arteriosclerose, arterite, hipertrofia septal assimétrica (ASH), aterosclerose, fibrilação e taquicardia atrial, endocardite bacteriana, síndrome de Barlow (prolapso da vávula mitral), bradicardia, doença de Buerger (tromboangiite * 15 obliterante), cardiomegalia, cardite, doença da artéria carótida, coarctação da aorta, deficiências cardíacas congênitas, insuficiência cardíaca congestiva, doença da artéria coronária, síndrome de Eisenmenger, embolia, endocardite, eritromelalgia, fibrilação, displasia fibromuscular, bloqueio cardíaco, sopro cardíaco, hipertensão, hipotensão, calcificação arterial infantil idiopática, doença de Kawasaki (síndrome do linfonodo mucocutâneo, doença do linfonodo mucocutâneo, poliarterite infantil), síndrome metabólica, angina microvascular, miocardite, taquicardia atrial paroxística (PAT), periarterite nodosa (poliarterite, poliarterite nodosa), pericardite, doença vascular periférica, isquemia límbica crítica, flebite, estenose de válvula pulmonar — (estenose pulmonar), doença de Raynaud, estenose arterial renal, hipertensão renovascular, doença cardíaca reumática, vasculopatia diabética, defeitos septais, isquemia silenciosa, síndrome X, taquicardia, arterite de Takayasu, tetralogia de Fallot, transposição dos vasos grandes, atresia tricúspide, tronco arterioso, doença cardíaca valvar, úlceras varicosas, veias varicosas, vasculite,

- defeito septal ventricular, síndrome de Wolff-Parkinson-White, defeito do coxim endocárdico, febre reumática aguda, pericardite reumática aguda, endocardite reumática aguda, miocardite reumática aguda, doenças cardíacas “ reumáticas crônicas, doenças da válvula mitral, estenose mitral, insuficiência . 5 mitral reumática, doenças da válvula aórtica, doenças de outras estruturas endocárdicas, doença cardíaca isquêmica (aguda e subaguda), angina de peito, doença cardíaca pulmonar aguda, embolia pulmonar, doença cardiopulmonar crônica, doença cardíaca cifoescoliótica, miocardite, endocardite, fibrose endomiocárdica, fibroelastose endocárdica, bloqueio atrioventricular, —disritmias cardíacas, degeneração miocárdica, doença cerebrovascular, uma doença de artérias, arteríolas e capilares, ou uma doença de veias e vasos linfáticos.

Em outras modalidades específicas, a dita doença ou distúrbio i é uma oclusão e estenose de artérias pré-cerebrais, ou oclusão de artérias * 15 cerebrais. Em um aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um indivíduo que apresenta uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro do indivíduo ou em tomo deste, por exemplo, que apresenta um sintoma ou déficit neurológico atribuível a uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro do indivíduo, ou em torno deste, ou sistema nervoso central (CNS), compreendendo administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de AMDACSs isoladas. Em certas modalidades, a interrupção do fluxo de sangue resulta em lesão anóxica ou lesão hipóxica no cérebro ou CNS do indivíduo. Em outras modalidades específicas, a dita doença ou distúrbio é uma oclusão e estenose de artérias periféricas. Em um aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um indivíduo que apresenta uma interrupção do fluxo de sangue no membro ou ao redor dele, por exemplo, que apresenta um sintoma ou déficit vascular atribuível a uma interrupção do fluxo de sangue no sistema vascular periférico do indivíduo ou em torno dele,

- compreendendo — administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de AMDACSs isoladas. Em certas modalidades, a interrupção do fluxo de sangue resulta em lesão anóxica ou lesão hipóxica nos - membros ou extremidades do indivíduo.

- 5 Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um indivíduo que sofre de uma ferida ou trauma, compreendendo administrar uma ou mais das células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas ao dito indivíduo em uma quantidade e por um período suficiente para melhoria detectável da dita ferida ou trauma.

Em uma outra modalidade específica do método de tratamento, as ditas células são administradas ao dito indivíduo por injeção. Em uma modalidade mais específica, a dita injeção é injeção em uma área isquêmica : do coração do indivíduo. Em uma outra modalidade específica do método de tratamento, as ditas células são administradas ao dito indivíduo por infusão 7" 15 intravenosa. Em uma outra modalidade específica do método de tratamento, as ditas células, ou uma população das ditas células, ou uma população de células compreendendo as ditas células, são administradas ao dito indivíduo por implantação no dito indivídiuo de uma matriz ou estrutura compreendendo células aderentes derivadas do âmnio, da maneira descrita anteriormente.

As células aderentes derivadas do âmnio isoladas e populações de célula aqui fornecidas não são as células tronco derivadas da placenta isoladas ou populações de célula descritas, por exemplo, em patente U.S.

7.255.879 ou publicação de pedido de patente U.S. 2007/0275362. As células — aderentes derivadas do âmnio isoladas aqui fornecidas também não são células progenitoras endoteliais, células epiteliais amnióticas, trofoblastos, citotrofoblastos, células germinativas embrionárias, células tronco embrionárias, células obtidas da massa celular interna de um embrião, ou células obtidas a partir da crista gonadal de um embrião.

. Da maneira aqui usada, o termo "cerca de" significa, por exemplo, em 10 % de uma figura ou valor declarados.

: Da maneira aqui usada, a palavra "angiogênico", com relação . às células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas, significa que as - 5 — células podem formar vasos ou brotamentos do tipo vaso, ou que as células podem promover angiogênese (por exemplo, a formação de vasos ou estruturas do tipo vaso) em uma outra população de células, por exemplo, células endoteliais.

Da maneira aqui usada, o termo "angiogênese" refere-se ao — processo de formação de vaso sanguíneo que inclui, mas sem limitação, ativação, migração, proliferação de célula endotelial, remodelamento de matriz e estabilização celular.

Da maneira aqui usada, o termo "célula tronco" define as propriedades funcionais de qualquer população de célula fornecida que pode * 15 proliferar extensivamente, mas não necessariamente infinitamente, e contribuir para a formação de tecidos múltiplos, tanto durante o desenvolvimento embrionário quanto na substituição e reparo do tecido após o nascimento.

Da maneira aqui usada, o termo "célula progenitora" define as — propriedades funcionais de qualquer população de célula fornecida que pode proliferar extensivamente, mas não necessariamente infinitamente, e contribuir para a formação de um conjunto restrito de tecidos múltiplos em comparação com uma célula tronco, tanto durante o desenvolvimento embrionário quanto na substituição e reparo do tecido após o nascimento.

Da maneira aqui usada, a palavra "derivado" significa isolado ou purificado de outra forma. Por exemplo, células aderentes derivadas do âmnio são isoladas a partir do âmnio. A palavra "derivado" inclui células que são cultivadas de células isoladas diretamente de um tecido, por exemplo, do âmnio, e de células cultivadas ou expandidas de isolados primários.

. Da maneira aqui usada, "imunolocalização" significa a detecção de um composto, por exemplo, um marcador celular, usando uma proteína imune, por exemplo, um anticorpo ou fragmento deste em, por é exemplo, citometria de fluxo, classificação celular ativada por fluorescência, - S — classificação celular magnética, hibridização in situ, imunoistoquímica ou similares.

Da maneira aqui usada, o termo "célula isolada" significa uma célula que é substancialmente separada de outras células do tecido, por exemplo, âmnio ou placenta, a partir das quais a célula é derivada. Uma célula é "isolada" se pelo menos cerca de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou pelo menos 99 % das células, com as quais a célula tronco é naturalmente associada, forem removidas da célula, por exemplo, durante a coleta e/ou cultivo da célula.

Da maneira aqui usada, o termo "população isolada de células" 7 15 —significauma população de células que é substancialmente separada de outras células do tecido, por exemplo, âmnio ou placenta, a partir das quais a população de células é derivada. Uma célula é "isolada" se pelo menos cerca de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou pelo menos 99 % das células com as quais a população de células, ou células a partir das quaisa população de células é derivada, é naturalmente associada, forem removidas da célula, por exemplo, durante a coleta e/ou o cultivo de células aderentes derivadas do âmnio.

Da maneira aqui usada, uma célula é "positiva" com relação a um marcador particular quando este marcador é detectável da maneira — antecedente, por exemplo, por imunolocalização, por exemplo, por citometria de fluxo; ou por RT-PCR. Por exemplo, uma célula é descrita como positiva para, por exemplo, CDI05, se CDI05 for detectável na célula em uma quantidade detectavelmente maior do que o antecedente (em comparação com, por exemplo, um isotipo controle). No contexto de, por exemplo,

- detecção mediada por anticorpo, "positiva", como uma indicação de um marcador de superfície celular particular presente, significa que o marcador é ' detectável usando um anticorpo, por exemplo, um anticorpo marcado de | maneira fluorescente específico para este marcador; "positiva" também - 5 significa que uma célula carrega este marcador em uma quantidade que produz um sinal, por exemplo, em um citômetro, que está detectavelmente acima do antecedente. Por exemplo, uma célula é "CD105", onde a célula é detectavelmente marcada com um anticorpo específico para CDI105, e o sinal do anticorpo é detectavelmente maior que um controle (por exemplo, anterior). Ao contrário, "negativo", no mesmo contexto, significa que o marcador de superfície celular não é detectável usando um anticorpo específico para este marcador comparado ao anterior. Por exemplo, uma célula é "CD34", onde a célula não é detectavelmente marcada com um i anticorpo específico para CD34. A menos que de outra forma aqui notada, 7 15 agrupamento de marcadores de diferenciação ("CD") são detectados usando anticorpos. Por exemplo, OCT-4' pode ser determinada como presente, e uma célula é OCT-4* se o RNAm para OCT-4' for detectável usando RT-PCR, por exemplo, para 30 ciclos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS A figura | mostra a expressão de genes relacionados à célula tronco por células aderentes derivadas do âmnio e células NTERA-2.

A figura 2 mostra a expressão de TEM-7 na superfície celular de células aderentes derivadas do âmnio (AMDACSs).

A figura 3 mostra a secreção de proteínas angiogênicas — selecionadas por células aderentes derivadas do âmnio.

A figura 4 mostra o efeito angiogênico do meio condicionado com células aderentes derivadas do âmnio na formação do tubo de célula endotelial humana (HUVEC).

A figura 5 mostra o efeito angiogênico do meio condicionado

. com células aderentes derivadas do âmnio na migração de célula endotelial humana.

A figura 6 mostra o efeito do meio condicionado com células ç aderentes derivadas do âmnio na proliferação de célula endotelial humana.

- 5 A figura 7 mostra a absorção de LD1 acetilado por HUVECs e “células aderentes derivadas do âmnio.

A figura 8 mostra a formação do tubo de HUVECs e células aderentes derivadas do âmnio. A figura 9 mostra a secreção de VEGF e IL-8 por células 10 — aderentes derivadas do âmnio em condições hipóxicas e normóxicas. A figura 10 mostra a expressão do marcador celular Tie2 em condições normóxicas (cerca de 21 % de Oz) e hipóxicas (menos que cerca de % de Os). Eixo Y: percentual de células positivas para Tie2 por citometria i de fluxo.

7 15 A figura 11 mostra a eficácia da diferenciação cardiomiocítica de células aderentes derivadas do âmnio, em que AM refere-se às células aderentes derivadas do âmnio (AMDACs), HD refere-se a gota pendente não tratada, HD IND refere-se a gota pendente exposta a condições de indução, e HD IND + 5-AZA refere-se à indução na presença ou ausência de 5- —azacitidina. CTRL refere-se à gota pendente não tratada controle. A figura 12 mostra o efeito positivo de AMDACs na angiogênese em um modelo de angiogênese de corioalantóide de ovo. Lote 1, Lote 2, Lote 3: AMDACS de três preparações de célula separada. bFGF: fator de crescimento de fibroblasto básico (controle positivo)) MDAMB?231: — Linhagem celular de câncer de mama angiogênica (controle positivo). Eixo Y: Grau de formação de vaso sanguíneo. A figura 13 mostra o efeito positivo de meio condicionado com AMDAC na angiogênese em um modelo de angiogênese de corioalantóide de ovo. Lote 1, Lote 2, Lote 3: AMDACS de três preparações

+ de célula separada. bFGF: fator de crescimento de fibroblasto básico (controle positivo). MDAMB231: Linhagem celular de câncer de mama angiogênica : (controle positivo). Eixo Y: Grau de formação de vaso sanguíneo. ç As figuras 14A e 14B mostram espécies de oxigênio reativo - 5 geradaspor peróxido de hidrogênio presentes nas culturas de astrócitos, co- culturas de astrócitos e células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea (BM-MSCs), ou co-culturas de astrócitos e AMDACSs. 14A: AMDACSs, Lot 1; 14B: AMDACs, Lot 2. As condições HA (astrócitos humanos) sozinhos, astrócitos + H,O,, e astrócitos + BM-MSCs + H,O,; são os mesmo para as figuras 14A e 14B. À atividade de RFU ROS: unidades de fluorescência relativa para espécies de oxigênio reativo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

CARACTERÍSTICAS DE CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS DO i ÂMNIO 7 15 São aqui fornecidas células angiogênicas aderentes exclusivas, e populações de tais células, isoladas do âmnio, aqui referidas como "células aderentes derivadas do âmnio" ou AMDACSs. As células aderentes derivadas do âmnio assemelham-se superficialmente às células mesenquimais na aparência, com uma forma em geral fibroblastóide. As células se aderem a uma superfície de cultura celular, por exemplo, ao plástico para cultura de tecidos.

AMDACs exibem marcadores celulares que distinguem-nas de outras células derivadas de âmnio ou derivadas de placenta. Por exemplo, em uma modalidade, a célula aderente derivada de âmnio é OCT-4 (proteína de —ligaçãodo octâmero 4), da maneira determinada por RT-PCR. Em uma outra modalidade específica, a célula OCT-4' aderente derivada de âmnio é CD49f', da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, a dita célula OCT-4' é HLA-G, da maneira determinada por RT- PCR. Em uma outra modalidade específica, a célula OCT-4' é VEGFR1/FIlt-

. 1º (receptor do fator de crescimento endotelial vascular 1) e/ou VEGFR2/KDR (receptor do fator de crescimento endotelial vascular X), da : maneira determinada por imunolocalização. Em uma modalidade específica, a . célula OCT-4' aderente derivada de âmnio, ou uma população de célula OCT- - 5 4s aderentes derivadas do âmnio, expressa pelo menos 2 log menos de RNAm amplificado por PCR para OCT-4' em, por exemplo, 20 ciclos, do que uma célula NTERA-2, ou população de células NTERA-2 com um número equivalente de células e ciclos de amplificação de RNA. Em uma outra modalidade específica, a dita célula OCT-4" é CD90”, CD105* ou CDI17.

Em uma modalidade mais específica, a dita célula OCT-4" é CD90”, CD105* e CD1I17. Em uma modalidade mais específica, a célula é OCT-4' ou HLA- G, e é adicionalmente CD49f, CD90”, CDI0S* e CDI1I7. Em uma modalidade mais específica, a célula é OCT-4, HLA-G, CD49f”, CD90”, CD105* e CD117”. Em uma outra modalidade específica, a célula OCT-4" não * 15 expressa SOX2, por exemplo, da maneira determinada por RT-PCR para 30 ciclos. Em uma modalidade específica, portanto, a célula é OCT-4', CD49f', CD90*, CDI05* e CD117, da maneira determinada por imunolocalização ou citometria de fluxo, e SOX2, da maneira determinada por RT-PCR, por exemplo, para 30 ciclos.

Em uma outra modalidade, a dita célula OCT-4' é uma ou mais de CD29*, CD73', ABC-p' e CD38, da maneira determinada por imunolocalização.

Em uma outra modalidade específica, por exemplo, uma AMDAC OCT-4 pode ser adicionalmente uma ou mais de CD9*, CDIO0”, CDH, CD54', CD98' TEM-7* (marcador endotelial de tumor 7), CD31”, CD34”, CD45', CD133”, CDI43' (enzima conversora de agiotensina 1, ACE), CD146 (molécula de adesão de célula de melanoma), ou CXCR4' (receptor 4 de quimiocina (motivo C-X-C)), da maneira determinada por imunolocalização, ou HLA-G' da maneira determinada por RT- PCR. Em

' uma modalidade mais específica, a dita célula é CD9*, CDI0”, CD4", CD54”, CD98*, Tie-2", TEM-7*, CD31”, CD34, CD45", CD133, CDI43”, ' CDI146' e CXCRA4”, da maneira determinada por imunolocalização, e HLA-G . da maneira determinada por RT-PCR. Em uma modalidade, a célula aderente - 5 — derivada de âmnio aqui fornecida é uma ou mais de CD31”, CD34”, CD45' e/ou CD133”. Em uma modalidade específica, a célula aderente derivada de âmnio é OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR; VEGFRI1/FIt-1* e/ou VEGFR2/KDR', da maneira determinada por imunolocalização; e uma ou mais, ou todas, de CD31”, CD34', CDA45”, e/ou CD133”.

Em uma outra modalidade específica, a dita célula é adicionalmente VE-caderina”, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, a dita célula é adicionalmente positiva para CDI105* e CD200', da maneira determinada por imunolocalização. Em i uma outra modalidade específica, a dita célula não expressa CD34, da * 15 maneira detectada por imunolocalização após exposição a 1 a 100 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias. Em modalidades mais específicas, a dita célula não expressa CD34 da maneira detectada por imunolocalização após exposição a 25 to 75 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias, ou a 50 ng/mL de VEGF por 4a 21 dias. Ainda em modalidades mais específicas, a dita célula não expressa —CD34 da maneira detectada por imunolocalização após exposição a 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75 ou 100 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias. Ainda em modalidades mais específicas, a dita célula não expressa CD34' da maneira detectada por imunolocalização após exposição a 1 a 100 ng/mL de VEGF por 7 a 14, por exemplo, 7 dias.

Em modalidades específicas, a célula aderente derivada de âmnio é OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, e uma ou mais de VE- caderina”, VEGFR2/KDR", CD9*, CD54", CDI05* e/ou CD200”, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma modalidade específica, a célula derivada de o âmnio é OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR e VE-

. caderina, VEGFR2/KDR', CD9”, CD54', CDI05* e CD200”, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, as ditas células não expressam CD34, da maneira detectada por - imunolocalização, por exemplo, após exposição a 1 a 100 ng/mL de VEGF - 5 por4a2ldias.

Em uma outra modalidade, a célula aderente derivada de âmnio é OCT-4, CD49f', HLA-G, CD90*, CDI05* e CDI17. Em uma modalidade mais específica, a dita célula é uma ou mais de CD9*, CDIO”, CD44*, CD54”, CD98”, Tie-2', TEM-7', CD31”, CD34, CD45, CD133”, CDI43, CDI46 ou CXCRA4, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma modalidade mais específica, a dita célula é CD9”, CD10*, CD44', CD54*, CD98”, Tie-2, TEM-7”, CD3T, CD34, CD45, CDI33', CDI 43”, CDI146' e CXCRA4”, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma i outra modalidade específica, a dita célula é adicionalmente VEGFR1/Flt-1* * 15 e/ou VEGFRA/KDR', da maneira determinada por imunolocalização; e uma ou mais de CD31, CD34, CD45, CD133' e/ou Tie-2, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, a dita célula é adicionalmente VEGFR1/Flt-1*, VEGFR2/KDR', CD31”, CD34, CDA45”, CD133 e Tie-2', da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade, as células aderentes derivadas do âmnio OCT-4' são adicionalmente uma ou mais, ou todas, de CD9”, CDI1O0”, CD44”, CD49f', CD54*, CD90*, CD98*, CDI O05*, CD200”, Tie-2", TEM-7", VEGFRI1/FIt-1* e/ou VEGFR2/KDR' (CD309”), da maneira determinada por imunolocalização; ou adicionalmente uma ou mais, ou todas, de CD31”, — CD34,CD38, CD45, CDI17, CD1I33, CDI43, CDI, CDI46, CD271, CXCR4, HLA-G e/ou VE-caderina, da maneira determinada por imunolocalização, ou SOX2, da maneira determinada por RT- PCR.

Em certas modalidades, as células aderentes derivadas de âmnio isoladas aderentes ao plástico para cultura de tecidos são CD49f'. Em

. uma modalidade específica, as ditas células CD49f* são adicionalmente uma ou mais, ou todas, de CD9”, CDI0”, CD44', CD54*, CD90*, CD98*, CD105*, : CD200”, Tie-2", TEM-7', VEGFR1/FIt-1* e/ou VEGFR2/KDR"* (CD309”), da % maneira determinada por imunolocalização; ou adicionalmente uma ou mais, - 5 outodas,deCD31,CD34,CD38,CD45, CDI17, CD133', CDI43”, CDI , CDI46, CD271', CXCR4”, HLA-G, OCT-4' e/ou VE-caderina, da maneira determinada por imunolocalização, ou SOX2, da maneira determinada por RT-PCR.

Em outras certas modalidades, as células aderentes derivadas de âmnio isoladas aderentes ao plástico para cultura de tecidos são HLA-G, CD90”, e CDI117. Em uma modalidade específica, as ditas células HLA-G, CD90* e CDI17 são adicionalmente uma ou mais, ou todas, de CD, CD10”, CD44*, CD49f', CD54”, CD98”, CD105*, CD200”, Tie-2', TEM-7T', i VEGFRI/FIt-1* e/ou VEGFR2/KDR' (CD309*), da maneira determinada por * 15 imunolocalização; ou adicionalmente uma ou mais, ou todas, de CD31”, CD34, CD38, CD45,CD133”, CD1I43, CDIM, CDI46, CD27r, CXCR4, OCT-4' e/ou VE-caderina”, da maneira determinada por imunolocalização, ou SOX2, da maneira determinada por RT-PCR. Em uma outra modalidade, as células aderentes derivadas do —âmnio isoladas, ou população de células angiogênicas derivadas de âmnio, não expressam constitutivamente RNAm para fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF4), interferon y (TFNG), ligante 10 de quimiocina (motivo C-X-C) (CXCLIO0), angiopoietina 4 (ANGPTA4), tipo angiopoietina 3(ANGPTI13), cadeia a de fibrinogênio (FGA), leptina (LEP), prolactina —(PRL), procineticina 1 (PROKI), tenomodulina (TNMD), tirosina quinase 3 de tipo FMS (FLT3), domínio contendo elemento de ligação extracelular 1 (XLKD]), caderina 5, tipe 2 (CDH5), quemoxatina derivada de célula de leucócito 1 (LECT1), plasminogênio (PLG), transcriptase reversa telomerase (TERT), (região de determinação do sexo Y)-caixa 2 (SOX2), NANOG,

. matriz metaloprotease 13 (MMP-13), 5 menos distal (DIXS), e/ou proteína óssea gama-carboxiglutamato (gla) (BGLAP), da maneira determinada por RT-PCR, por exemplo, para 30 ciclos em condições padrões de cultivo.

Em - outras modalidades, células aderentes derivadas do âmnio isoladas, ou - 5 população de células angiogênicas derivadas de âmnio, expressam RNAm para (ARNT2), fator de crescimento neural (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neutrófico derivado da glia (GDNF), neurotrofina 3 (NT-3), NT-5, fator la indutível por hipóxia (HIFIA), proteína 2 indutível por hipóxia (HIG2), heme oxigenase (deciclização) 1 (HMOXI), — superóxido desmutase extracelular [Cu-Zn] (SOD3), catalase (CAT), fator de crescimento transformante Bl (TGFBI1), receptor do fator de crescimento transformante B1 (TGFBIR) e receptor do fator de crescimento de hepatócito (HGFR/c-met)

Em um outro aspecto, são aqui fornecidas populações de * 15 —célulasisoladas compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas.

As populações de células podem ser populações homogêneas, por exemplo, uma população de células, pelo menos cerca de 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % das quais são as células aderentes derivadas do âmnio.

As populações de células podem ser heterogêneas, por exemplo, uma população —decélulasem que no máximo cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % ou 80 % das células na população são as células aderentes derivadas do âmnio.

Entretanto, as populações de células isoladas não são teciduais, isto é,

membrana amniótica.

Em uma modalidade, é aqui fornecida uma população isolada — de células que compreendem AMDACSs, por exemplo, uma população de células substancialmente homogênea para AMDACs, em que as ditas AMDACs são aderentes ao plástico para cultura de tecidos, e em que as ditas AMDACs são OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR.

Em uma modalidade específica, as AMDACs são CD49f' ou HLA-G”, por exemplo,

. da maneira determinada por imunolocalização ou RT-PCR. Em uma outra modalidade específica, a dita população de AMDACs é VEGFR1/FIt-1* e/ou : VEGFR2/KDR", da maneira determinada por imunolocalização, em que a dita É população isolada de células não é um âmnio ou membrana amniótica. Em - 5 uma modalidade mais específica, as AMDACs são OCT-4, e/ou HLA-G' da maneira determinada por RT-PCR, e VEGFRI/FIt-1* e/ou VEGFR2/KDR', da maneira determinada por imunolocalização. Em uma modalidade específica, pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % das células na dita população são as ditas células aderentes derivadas do âmnio. Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACs são CD90”, CD105* ou CD117. Em uma modalidade mais específica, as ditas AMDACs são CD90”, CDI0S* e CDI17. Em uma modalidade mais específica, as AMDACs são OCT-4", CD49f”, CD90”, CDI 05* e CD117. Em | uma outra modalidade específica, as AMDACs não expressam SOX2, por * 15 exemplo, da maneira determinada por RT-PCR para 30 ciclos. Em uma modalidade ainda mais específica, a população compreende AMDACs, em que as ditas AMDACs são OCT-4', HLA-G, CD49f', CD90”, CDI05* e CDI117, da maneira determinada por imunolocalização ou citometria de fluxo, e SOX2', por exemplo, da maneira determinada por RT-PCR para 30 ciclos.

Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACs na dita população de células são CD90', CDI05* ou CDI117, da maneira determinada por imunolocalização ou citometria de fluxo. Em uma modalidade mais específica, as AMDACs são CD90”, CD105* e CD117, da —maneira determinada por imunolocalização ou citometria de fluxo. Em uma modalidade mais específica, as AMDACs são OCT-4' ou HLA-G, por exemplo, da maneira determinada por RT-PCR, e são adicionalmente CD49f', CD90”, CDI05* e CDI 17, da maneira determinada por imunolocalização ou citometria de fluxo. Em uma modalidade mais específica, as AMDACs na

: dita população de células são OCT-4, HLA-G, CD49f', CD90”, CD105* e CDI117. Em uma outra modalidade específica, as AMDACs não expressam : SOX2, por exemplo, da maneira determinada por RT-PCR para 30 ciclos. Em - uma modalidade mais específica, portanto, a célula é OCT-4, CD49f', -« 5 CD90”, CDIO0S' e CDI1I7, da maneira determinada por imunolocalização ou citometria de fluxo, e SOX2', da maneira determinada por RT-PCR, por exemplo, para 30 ciclos. Em uma modalidade ainda mais específica, as AMDACs são OCT-4' ou HLA-G', e são adicionalmente CD49f', CD90”, CD105* e CD117. Em uma modalidade mais específica, as AMDACs são OCT, HLA-G, CD49f', CD90*, CDIO05* e CD117.

Em uma outra modalidade, as células aderentes derivadas do âmnio na dita população de células são aderentes ao plástico para cultura de tecidos, OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, e VEGFRI1/FIt-1* e/ou i VEGFR2/KDR', da maneira determinada por imunolocalização, e são * 15 adicionalmente uma ou mais de CD9”, CD1I0*, CD44*, CD54*, CD98*, Tie- 2º, TEM-T”, CD31', CD34”, CD45, CD133”, CDI43”, CDI46' ou CXCR4', da maneira determinada por imunolocalização, ou HLA-G da maneira determinada por RT-PCR, e em que a dita população isolada de células não é um âmnio. Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população isolada de células que compreendem uma célula aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para cultura de tecidos, em que a dita célula é OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, e VEGFR1/Flt-1* e/ou VEGFR2/KDR", da maneira determinada por imunolocalização, em que a dita célula não expressa CD34' da maneira detectada por imunolocalização — após exposição a | a 100 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias, e em que a dita população isolada de células não é um âmnio. Em uma modalidade específica de quaisquer das modalidades anteriores, pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % das células na dita população são as ditas células aderentes derivadas do âmnio.

' Em uma outra modalidade, quaisquer das populações de células anteriores que compreendem células aderentes derivadas do âmnio : formam brotamentos ou estruturas do tipo tubo quando cultivadas na presença * de uma proteína de matriz extracelular, por exemplo, colágeno tipo I e IV, ou - 5 um fator angiogênico, por exemplo, fator de crescimento do tipo endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) ou fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), por exemplo, em ou em um substrato tal como colágeno placentário, por exemplo, ou MATRIGELY por pelo menos 4 dias e até 14 dias.

As células aderentes derivadas do âmnio, e populações de células aderentes derivadas do âmnio, exibem expressão característica de proteínas relacionadas aos genes relacionados à angiogênese ou relacionados à cardiomiogênese. Em certas modalidades, é aqui fornecida uma célula que expressa, ou uma população de células, em que pelo menos cerca de 50 %, 60 “15 % 70%, 80%, 90%, 95% ou 98 % das células na dita população isolada de células são as células aderentes derivadas do âmnio que expressam RNA para uma ou mais de, ou todas de, ACTA2 (actina, alfa 2, músculo liso, aorta), ADAMTS1 (ADAM metalopeptidase com motivo trombospondina tipo 1, 1), AMOT (angiomotina), ANG (angiogenina), ANGPTI (angiopoietina 1), —ANGPT2, ANGPTLI (angiopoietina-tipo 1), ANGPTL2, ANGPTLIA, BAII (inibidor de angiogênese específico cerebral 1), CD44, CD200, CEACAMI (molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 1), CHGA (cromogranina A), COLISAI1 (colágeno, tipo XV, alfa 1), COLISAI (colágeno, tipo XVIII, alfa 1), COL4A1 (colágeno, tipo IV, alfa 1), COL4A2 — (colágeno, tipo IV, alfa 2), COL4A3 (colágeno, tipo IV, alfa 3), CSF3 (fator estimulante de colônia 3 (granulócito), CTGF (fator de crescimento de tecido conectivo), CXCL12 (ligante 12 de quimiocina (motivo CXC) (fator 1 derivado de célula estromal)), CXCL2, DNMT3B (DNA (citosina-5-)- metiltransferase 3 beta), ECGF1 (timidina fosforilase), EDG1 (gene de

. diferenciação de célula endotelial 1), EDIL3 (domínios 3 do tipo discoidina 1 e repetições do tipo EGF), ENPP2 (ectonucleotídeo ' pirofosfatase/fosfodiesterase 2), EPHB2 (receptor B2 de EPH), FBLNS % (FIBULIN 5), F2 (fator de coagulação II (trombina)), FGF1 (fator acídico de - 5 crescimento de fibroblasto), FGF2 (fator de crescimento de fibroblasto básico), FIGF (fator de crescimento induzido por c-fos (fator de crescimento endotelial vascular D)), FLT4 (tirosina quinase 4 relacionada à fms), FN1 (fibronectina 1), FST (folistatina), FOXC2 (caixa cabeça de forquila C2 (MFH-H, cabeça de forquilha mesenquimal 1)), GRN (granulina), HGF (fator — de crescimento de hepatócito), HEY 1 (motivo 1 piloso/melhorador-de-divisão relacionado com YRPW), HSPG2 (sulfato de heparana proteoglicana 2), IFNBI1 (interferon, beta 1, fibroblasto), IL8 (interleucina 8), ILI2A, ITGA4 (integrina, alfa 4; CD49d), ITGAV (integrina, alfa V), ITGB3 (integrina, beta i 3), MDK (midkine), MMP2 (matriz metaloprotease 2), MY0Z2 (miozenina - 15 2), NRPI (neuropilina 1), NRP2, PDGFB (fator de crescimento 3 derivado de plaqueta), PDGFRA (receptor do fator de crescimento a derivado de plaqueta) PDGFRB, PECAMI1 (molécula de adesão celular de plaqueta/endotelial), PF4 (fator de plaqueta 4), PGK1 (fosfoglicerati quinase 1), PROXI (homeobox próspero 1), PIN (pleiotrofina)y) SEMA3F (semoforina 3F), SERPINBS (inibidor de serpina peptidase, clado B (ovalbumina), elemento 5), SERPINC1, SERPINF1, TIMP2 (inibidor tecidual de metaloproteinases 2), TIMP3, TGFA (fator de crescimento transformante, alfa), TGFB1, THBS1 (trombospondina 1), THBS2, TIE! (tirosina quinase com domínios 1 do tipo imunoglobulina e do tipo EGF), TIEN/TEK, TNF (fator de necrose tumoral), TNNII (troponina 1, tipo 1), TNFSF 15 (fator de necrose tumoral (ligante) superfamília, elemento 15), VASHI (vasoibina 1), VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), VEGFB, VEGFC, VEGFRI/FLTI (receptor do fator de crescimento endotelial vascular 1), e/ou

VEGFR2/KDR.

. Quando as células humanas são usadas, as designações de gene referem-se todas às sequências humanas e, como é bem conhecido pelos ': versados na técnica, sequências representativas podem ser encontradas na f. literatura ou no GenBank.

Sondas para as sequências podem ser determinadas - 5 por sequências que são publicamente disponíveis, ou por meio de fontes comerciais, por exemplo, sondas específicas TAQMANQO ou arranjo de angiogênese TAQMANOQ (Applied Biosystems, parte no. 4378710). Células aderentes derivadas do âmnio, e populações de células aderentes derivadas do âmnio, exibem expressão característica de proteínas relacionadas à angiogênese.

Em certas modalidades, é aqui fornecida uma célula que expressa, ou uma população de células, em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % das células na dita população isolada de células são as células aderentes derivadas do âmnio que i expressam CD49d, Conexina-43, HLA-ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, 7 15 —CD318,PDLI1,CDI06, Galectina-l, precursor de ADAM 17 (um domínio de desintegrina e metaloproteinase 17) (enzima conversora de TNF-alfa) (TNF- alfa convertase), precursor de angiotensinogênio, filamina A (alfa-filamina) (filamina 1) (proteína de ligação de actina endotelial) (ABP-280) (filamina não muscular), alfa-actinina 1 (Isoforma do citoesqueleto de alfa-actinina) (alfa-actinina 1 não muscular) (proteína de ligação cruzada de F-actina), precursor de proteína 2 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (Megalina) (glicoproteína 330) (gp330), receptor captador de macrófago tipos I e II (receptor LD1 acetilado de macrófago 1 e II), precursor tipo HB do receptor de activina (ACTR-IIB), proteína Wnt-9, proteína acídica fribilar glial, astrócito (GFAP), proteína C de ligação de miosina, tipo cardíaca (MyBP-C cardíaca) (C-proteína, isoforma do músculo cardíaco), e/ou miosina de cadeia pesada, tipo não muscular A (miosina celular de cadeia pesada, tipo A) (miosina não muscular de cadeia pesada-A)

(NMMHC-A).

. As células aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas secretam adicionalmente proteínas que promovem angiogênese, por exemplo, ': em células endoteliais, células progenitoras endoteliais, ou similares. Em - certas modalidades, a célula aderente derivada de âmnio, população de células - 5 aderentes derivadas do âmnio, ou população de células compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio, por exemplo, em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % das células na dita população isolada de células são as células aderentes derivadas do âmnio, secretam uma ou mais, ou todas, de VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, —Folistatina, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-I, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, Galectina-l, por exemplo, em meio de cultura no qual a célula, ou células, são crescidas.

Em uma outra modalidade, quaisquer das populações de i células anteriores que compreendem células aderentes derivadas do âmnio * 15 podem causar a formação de brotamentos ou estruturas do tipo tubo em uma população de células endoteliais em contato com as ditas células aderentes derivadas do âmnio. Em uma modalidade específica, as células angiogênicas derivadas de âmnio são co-cultivadas com células endoteliais humanas, formando brotamentos ou estruturas do tipo tubo, ou auxiliando os — brotamentos de célula endotelial, por exemplo, quando cultivadas na presença de proteínas de matriz extracelular, tal como colágeno tipo I e IV, e/ou fatores angiogênicos, tais como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) ou fator de crescimento de fibroblasto básico (DFGF), por exemplo, em um substrato ou sobre este tal como colágeno placentário ou MATRIGELWY por pelo menos 4 dias e/ou até 14 dias. Em uma outra modalidade, quaisquer das populações de células anteriores que compreendem células aderentes derivadas do âmnio secretam fatores angiogênicos, tais como fator de crescimento endotelial

: vascular (VEGF), fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento de fibroblasto básico ': (bFGF), ou interleucina-8 (IL-8) e, por meio disso, podem induzir células - endoteliais humanas a formar brotamentos ou estruturas do tipo tubo quando - 5 cultivadasna presença de proteínas de matriz extracelular tal como colágeno tipo I e IV, por exemplo, em um substrato ou sobre este, tal como colágeno placentário ou MATRIGELTY, Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população de células, por exemplo, uma população de células aderentes derivadas do —âmnio, ou uma população de células em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % das células na dita população isolada de células são as células aderentes derivadas do âmnio que expressam RNAs micro angiogênicos (RNAmis) em um nível maior que células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea, em que os ditos RNAmis 7 15 compreendem um ou mais, ou todos, de Rmi-17-3p, Rmi- 18a, Rmi-18b, Rmi-19b, Rmi-92, e/ou Rmi-296. Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população de células, por exemplo, uma população de células aderentes derivadas do âmnio, ou uma população de células em que pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % das células na dita — população isolada de células são as células aderentes derivadas do âmnio que expressam um ou mais de, ou todos de, RNAs micro angiogênicos (RNAmis) em um nível menor que células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea, em que os ditos RNAmis compreendem um ou mais, ou todos, de Rmi- 20a, Rmi-20b, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-l15b, e/ou Rmi-l6. Em certas — modalidades, AMDACSs, ou populações de AMDACS, expressam um ou mais, ou todos, dos RNAmis agiogênicos Rmi-17-3p, Rmi- 18a, Rmi- 18b, Rmi- 19b, Rmi-92, Rmi-20a, Rmi-20b, (elementos do agrupamento 17-92 de RNAm:i angiogênico cluster 17/92), Rmi-296, Rmi-221, Rmi-222, Rmi- 15b e/ou Rmi- 16.

: Assim, em uma modalidade, é aqui fornecida uma célula isolada aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para cultura de tecidos, e em que a dita célula é OCT-4', da maneira % determinada por RT-PCR, e CD49f”, HLA-G, CD90*, CDI05* e CDIL17, da - 5 maneira determinada por imunolocalização, e em que a dita célula: (a) expressa uma ou mais de CD9, CD10, CD44, CDS4, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRI/FIt-1 ou VEGFR2/KDR (CD309), da maneira determinada por imunolocalização; (b) expressão de falta de CD31, CD34', CD38', CD45”, CD133, CDI43, CDI, CDI46, CD271, CXCR4, HLA-G ou VE- —caderina, da maneira determinada por imunolocalização, ou expressão de falta de SOX2, da maneira determinada por RT-PCR; (c) expressa RNAm para ACTA2, ADAMTS1I, AMOT, ANG, ANGPTI, ANGPT2, ANGPTLI, ANGPTL2, ANGPTLA, BAII, CD44, CD200, CEACAMI, CHGA, | COLISAI, COLI8AI, COL4AI, COL4A2, COL4A3, CSF3, CTGF, 7 15 CXCLI2, CXCL2, DNMT3B, ECGF1I, EDGI, EDIL3, ENPP2, EPHB?2, FBLNS, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLTA4, FNI, FEST, FOXC2, GRN, HGF, HEY1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGAA4, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYO0Z2, NRPI, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, PF4, PGK1, PROX1, PIN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINCI, SERPINFI, —TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1I, THBS1, THBS2, TIEI, TIEN/TEK, TNF, TNNII, TNFSFI5, VASH1I, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFRI/FLTI ou VEGFR2/KDR,; (d) expressa uma ou mais das proteínas CD49d, Conexina- 43, HLA-ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDL1, CDI106, Galectina-l, ADAM 17, precursor de angiotensinogênio, filamina A, alfa- — actinina 1, megalina, receptor LD1 acetilado de macrófago 1 e II, precursor do tipo HB do receptor activina, proteína Wnt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrócito, proteína C de ligação à miosina, ou cadeia pesada de miosina, tipo não muscular A; (e) secreta VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, Folistatina, G- CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-I, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, ou

. Galectina-1 em meio de cultura no qual a célula cresce; (f) expressa micro RNAs Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi-19b, Rmi-92, ou Rmi-296 em um ' nível maior que um número equivalente de células tronco mensenquimais % derivadas de medula óssea; (g) expressa micro RNAs Rmi-20a, Rmi-20b, - 5 — Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, ou Rmi-16 em um nível menor que um número equivalente de células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea; (h) expressa RNAmis Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi-19b, Rmi-92, Rmi- 20a, Rmi-20b, Rmi-296, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, ou Rmi-16; e/ou (1) . expressa níveis maiores de CD202b, IL-8 ou VEGF quando cultivada em — menos que cerca de 5 % de Ox, comparada à expressão de CD202b, IL-8 ou VEGF em 21 % de O.

Em uma modalidade específica, a célula isolada aderente derivada de âmnio é OCT-4', da maneira determinada por RT-PCR, e CD49f”, HLA-G, CD90*, CDI05* e CD117”, da maneira determinada por i imunolocalização, e (a) expressa CD9, CD10, CD44, CD54, CD90, CD98, * 15 CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRIFIt-l e/ou VEGFR2/KDR (CD309), da maneira determinada por imunolocalização; (b) expressão de falta de CD31”, CD34”, CD38', CD45', CD133”, CDI43”, CDI, CDI46”, CD271”, CXCR4,

HLA-G e/ou VE-caderina, da maneira determinada por imunolocalização, ou . expressão de falta de SOX2, da maneira determinada por RT-PCR; (c) expressa RNAm para ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPTI, ANGPT2, ANGPTLI, ANGPTL2, ANGPTILA, BAII, CD44, CD200, CEACAMI, CHGA, COLISAI1, COLI8AI, COL4A1I, COL4A42, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDG1, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLNS, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLTA4, FNI, FEST, FOXC2, GRN, —HGF,HEYI,HSPG2,IFNBI, IL8, ILI2A, ITGAA, ITGAV, ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRP1, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINB5, SERPINC1, SERPINFI, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIE1I, TIENTEK, TNF, TNNII, TNFSF15, VASHI, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFRI/FLTI, e/ou

. VEGFR2/KDR; (d) expressa uma ou mais de CD49d, Conexina-43, HLA- ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDL1, CD106, Galectina-1, : ADAM 17, precursor de angiotensinogênio, filamina A, alfa-actinina 1, ” megalina, receptor LDI acetilado de macrófago 1 e II, precursor do tipo HB - 5 do receptor activina, proteína Wnt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrócito, proteína C de ligação à miosina, e/ou cadeia pesada de miosina, tipo não muscular A; (e) secreta VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, Folistatina, G- CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-I, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, e/ou Galectina-l, por exemplo, em meio de cultura no qual a célula cresce; (f) expressa micro RNAs Rmi- 17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi-19b, Rmi-92 e/ou Rmi-296 em um nível maior que um número equivalente de células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea; (g) expressa micro RNAs Rmi- 20a, Rmi-20b, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, e/ou Rmi-16 em um nível menor | que um número equivalente de células tronco mensenquimais derivadas de * 15 medula óssea; (h) expressa RNAmis Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi- 19b, Rmi-92, Rmi-20a, Rmi-20b, Rmi-296, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, e/ou Rmi-16 e/ou (i) expressa níveis maiores de CD202b, IL-8 e/ou VEGF quando cultivada em menos que cerca de 5 % de O,, comparada à expressão de CD202b, IL-8 e/ou VEGF em 21 % de Oz.

Adicionalmente, são aqui —fomecidas populações de células compreendendo AMDACS, por exemplo, as populações de AMDACs com uma ou mais das características anteriormente citadas.

Em uma outra modalidade, quaisquer das populações de células anteriores que compreendem células aderentes derivadas do âmnio — secretam fatores angiogênicos.

Em modalidades específicas, a população de células secreta fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento de fibroblasto básico (DFGF), e/ou interleucina- 8 (IL-8) Em outras modalidades específicas, a população de células

: compreendendo as células angiogênicas derivadas de âmnio secreta um ou mais fatores angiogênicos e induz por meio disso que as células endoteliais ' humanas migrem em um ensaio de cicatrização de ferida in vitro. Em outras % modalidades específicas, a população de células compreendendo as células - 5 aderentes derivadas do âmnio induz maturação, diferenciação ou proliferação de células endoteliais humanas, progenitores endoteliais, miócitos ou mioblastos.

Em uma outra modalidade, quaisquer das populações de células anteriores que compreendem células aderentes derivadas do âmnio obtêm lipoproteína de baixa densidade acetilada (LD1) quando cultivadas na presença de proteínas de matriz extracelular, por exemplo, colágeno tipo I ou IV, e/ou um ou mais fatores angiogênicos, por exemplo, VEGF, EGF, PDGF ou bFGF, por exemplo, em um substrato tal como colágeno placentário ou i MATRIGEL'Y, “15 Em uma outra modalidade, é aqui fornecida uma população de células compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio, em que as ditas células são aderentes ao plástico para cultura de tecidos, e em que as ditas células são OCT-47, da maneira determinada por RT-PCR, e VEGFR2/KDR', CD9”, CD54”, CDI05”, CD200* ou VE-caderina, da maneira determinada por imunolocalização. Em modalidades específicas, pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % das células na dita população de células são as células derivadas do âmnio que são OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR, e VEGFR2/KDR', CD9”, CD54'”, CD105”, CD200* ou VE- caderina, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % das células na dita população são as células derivadas do âmnio que são OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR, e VEGFR2/KDR', CD9*, CD54*, CD105*, CD200* e VE-caderina”, da maneira

. determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, as ditas células que são OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR, e ' VEGFR2/KDR', CD9*, CD54*, CD105*, CD200* ou VE- caderina”, da " maneira determinada por imunolocalização, não expressam CD34, da * 5 maneiradetectadapor imunolocalização, após exposição a 1 a 100 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias. Em uma outra modalidade específica, as ditas células são também VE-caderina. As populações de células aqui fornecidas, compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio, são capazes de formar brotamentos ou — estruturas do tipo tubo que se assemelham a vasos ou vasculatura. Em uma modalidade, as populações de células compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio formam brotamentos ou estruturas do tipo tubo quando cultivadas na presença de uma fração angiogênica, por exemplo, VEGF, EGF, PDGF ou bFGF. Em uma modalidade mais específica, as ditas células * 15 derivadas de âmnio que são OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR, e VEGFR2/KDR', CD9”, CD54"”, CDI05”, CD200* ou VE-caderina”, da maneira determinada por imunolocalização, formam brotamentos ou estruturas do tipo tubo quando a dita população de células é cultivada na presença de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

As células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas exibem as características anteriores, por exemplo, combinações de marcadores de superfície celular e/ou perfis de expressão de gene e/ou eficácia e função angiogênica em cultura primária, ou durante a proliferação em meio adequado para a cultura de células tronco. Tais meios incluem, por exemplo, meio — compreendendo | a 100 % de DMEM-LG (Gibco), 1 a 100 % de MCDB-201 (Sigma), 1 a 10 % de soro fetal bovino (FCS) (Hyclone Laboratories), 0,1 a 5x insulina-transferrina-selênio (ITS, Sigma), 0,1 a 5x ácido linolênico- albumina sérica bovina (LA-BSA, Sigma), dexametasona 10” a 10” M (Sigma), 2-fosfato de ácido ascórbico 10? a 10ºM (Sigma), 1 a 50 ng/mL de

. fator de crescimento epidérmico (EGF), (R&D Systems), 1 a 50 ng/mL de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF-BB) (R&D Systems), e * 100U de penicilina/ 1.000U de estreptomicinan Em uma modalidade ” específica, o meio compreende 60 % de DMEM-LG (Gibco), 40 % de + 5 MCDB-201 (Sigma), 2% de soro fetal bovino (FCS) (Hyclone Laboratories), 1x de insulina-transferrina-selênio (ITS), 1x ácido linolênico-albumina sérica bovina (LA-BSA), dexametasona 10º M (Sigma), 2-fosfato de ácido ascórbico 10M (Sigma), fator de crescimento epidérmico (EGF) 10 ng/mL (R&D Systems), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems), e 100U de penicilina/1.000U de estreptomicina. Outros meios adequados são descritos a seguir. As populações de células isoladas aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas podem compreender cerca de, pelo menos cerca de, ou não mais que cerca de, 1 x 105,5 x 10%, 1x 105, 5x 105, 1x10,5x10,1x *15 105 5x10851x10,5x10%,1x10,5 x 10", 1 x 10! ou mais células aderentes derivadas do âmnio, por exemplo, em um recipiente. Em várias modalidades, pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 99 % das células nas populações de célula isolada aqui fornecidas são células aderentes derivadas do âmnio. Isto é, uma população de células aderentes derivadas do âmnio isoladas podem compreender, por exemplo, tanto quanto 1%, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % de células não tronco.

As células aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas podem ser cultivadas em um substrato. Em várias modalidades, o substrato — pode ser qualquer superfície na qual o cultivo e/ou seleção de células aderentes derivadas do âmnio possa ser realizada. Tipicamente, o substrato é plástico, por exemplo, placa de cultura de tecido ou placa de plástico com multipoços. O plástico para cultura de tecidos pode ser tratado, revestido ou impresso com uma biomolécula ou agente mimético sintético, por exemplo,

R CELLSTART'Y, substrato ACF MESENCULTMY, ornitina, ou polilisina, ou uma proteína de matriz extracelular, por exemplo, colágeno, laminina, : fibronectina, vitronectina ou similares.

. Células derivadas de âmnio, por exemplo, as células aderentes - 5 derivadasdoâmnio aqui fornecidas, e populações de tais células, podem ser isoladas de uma ou mais placentas. Por exemplo, uma população isolada das células derivadas do âmnio aqui fornecida pode ser uma população de células placentárias compreendendo tais células obtidas, ou contidas, de tecido de âmnio rompido, por exemplo, tecido digerido (isto é, a coleção de células — obtidas por digestão enzimática de um âmnio), em que a dita população de células é enriquecida pelas células derivadas do âmnio, e em que o tecido é de uma única placenta ou de duas ou mais placentas. As células derivadas de âmnio isoladas podem ser cultivadas e expandidas para produzir populações de tais células. Populações de células placentárias compreendendo as células * 15 aderentes derivadas do âmnio também podem ser cultivadas e expandidas para produzir populações de células aderentes derivadas do âmnio.

Em certas modalidades, AMDACSs que exibem quaisquer das características de marcadores e/ou expressão de gene anteriores foram passadas pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 190u20 vezes ou mais. Em outras certas modalidades, AMDACs que exibem quaisquer das características de marcadores e/ou expressão de gene anteriores foram dobradas na cultura pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou pelo menos 50 —vezesoumais.

POPULAÇÕES DE CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS

DO ÂMNIO COMPREENDENDO OUTROS TIPOS CELULARES As populações de célula isolada compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas podem compreender um segundo

. tipo celular, por exemplo, células placentárias que não são células aderentes derivadas do âmnio ou, por exemplo, células que não são células placentárias. : Por exemplo, uma população isolada de células aderentes derivadas do âmnio E pode compreender, por exemplo, pode ser combinada com, uma população de - 5 um segundo tipo de células, em que o dito segundo tipo de célula são, por exemplo, células tronco embrionárias, célula sanguíneas (por exemplo, sangue placentário, células sanguíneas placentárias, sangue do cordão umbilical, células de sangue do cordão umbilical, sangue periférico, células de sangue periférico, células nucleadas de sangue placentário, sangue do — cordão umbilical, ou sangue periférico e similares), células tronco isoladas do sangue (por exemplo, células tronco isoladas de sangue placentário, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico), células tronco derivadas da placenta (por exemplo, a células tronco derivadas da placenta descritas na patente U.S. i 7.468.276, e em publicação de pedido de patente U.S. 2007/0275362, cujas * 15 revelações são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra), células nucleadas de perfusado placentário, por exemplo, células nucleadas totais de perfusado placentário; células tronco do cordão umbilical, populações de células nucleadas derivadas de sangue, células estromais mesenquimais derivadas de medula óssea, células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea, células tronco hematopoiéticas derivadas de medula óssea, medula óssea bruta, células tronco do adulto (somáticas), populações de células tronco contidas no tecido, células cultivadas, por exemplo, células tronco cultivadas, populações de células completamente diferenciadas (por exemplo, condrócitos, fibroblastos, células amnióticas, osteoblastos, células — musculares, células cardíacas, etc.), pericitos e similares.

Em uma modalidade específica, uma população de células compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio compreende células tronco derivadas da placenta ou células tronco do cordão umbilical.

Em certas modalidades nas quais o segundo tipo de célula é sangue ou célula sanguíneas, os eritrócitos foram

. removidos da população de células. Em uma modalidade específica, o segundo tipo de célula é : uma célula tronco hematopioética. Tais células tronco hematopoiéticas podem É estar, por exemplo, contidas em sangue placentário não processado, sangue do - 5 cordãoumbilical ou sangue periférico; em células nucleadas totais de sangue placentário, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico; em uma população isolada de células de sangue placentário CD34”, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico; em medula óssea não processada; em células nucleadas totais da medula óssea; em uma população isolada de células CD34* da medula óssea, ou similares.

Em uma outra modalidade, uma população isolada de células aderentes derivadas do âmnio é combinada com uma pluralidade de células de adulto ou progenitoras do sistema vascular. Em várias modalidades, as células são células endoteliais, células progenitoras endoteliais, miócitos, * 15 cardiomiócitos, pericitos, angioblastos, mioblastos ou cardiomioblastos.

Em um uma outra modalidade, o segundo tipo celular é um tipo celular não embrionário manipulado na cultura a fim de expressar marcadores de pluripotência e funções associadas com células tronco embrionárias.

Em modalidades específias das populações isoladas anteriores de células aderentes derivadas do âmnio, uma ou outra das células aderentes derivadas do âmnio e células de um segundo tipo são autólogas, ou são alogênicas, em um recipiente pretendido das células.

Adicionalmente, é aqui fornecida uma composição — compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio, e uma pluralidade de células tronco sem ser as células aderentes derivadas do âmnio. Em uma modalidade específica, a composição compreende uma célula tronco que é obtida de uma placenta, isto é, uma célula tronco placentária, por exemplo, células tronco derivadas da placenta descritas em patente U.S. 7.045.148;

- 7.255.879 e 7.311.905, e em publicação de pedido de patente U.S. 2007/0275362, cujas revelações de cada uma são aqui incorporadas pela : referência na sua íntegra.

Em modalidades específicas, as ditas células tronco * derivadas da placenta são CD200* e HLA-G*; CD73*, CD105”, e CD200”; - 5 CD200 eOCT4";CD73*, CDI0S* e HLA-G"; CD73* e CDI05* e facilitam a formação de um ou mais corpos do tipo embrionário em uma população de células placentárias compreendendo a dita célula tronco quando a dita população é cultivada em condições que permitem a formação de um corpo do tipo embrionário, ou OCT-4* e facilitam a formação de um ou mais corpos do tipo embrionário em uma população de células placentárias compreendendo a célula tronco quando a dita população é cultivada em condições que permitem a formação de corpos do tipo embrionário; ou qualquer combinação destas.

Em uma modalidade mais específica, as ditas | células tronco CD200”, HLA-G* são CD34, CD38, CD45, CD73* e - 15 CDI05'”. Em uma outra modalidade mais específica, as ditas células tronco CD73”, CDI05* e CD200* são CD34', CD38, CD45' e HLA-G"”. Em uma outra modalidade mais específica, as ditas células tronco CD200*, OCT-4* são CD34, CD38, CD45", CD73*, CDI05S* e HLA-G"”. Em uma outra modalidade mais específica, as ditas células tronco CD73*, CD105* e HLA- G são CD34, CD45, OCT-4* e CD200”. Em uma outra modalidade mais específica, as ditas células tronco CD73* e CDI105* são OCT-4*, CD34, CD38' e CD45". Em uma outra modalidade mais específica, as ditas células tronco OCT-4* são CD73”, CD105*, CD200*, CD34', CD38' e CD45". Em uma outra modalidade mais específica, as células tronco derivadas da placenta —sãodeorigem materna (isto é, apresentam o genótipo materno). Em uma outra modalidade mais específica, as células tronco derivadas da placenta são de origem fetal (isto é, apresentam o genótipo fetal). Em uma outra modalidade específica, a composição compreende células aderentes derivadas do âmnio e células tronco

. embrionárias. Em uma outra modalidade específica, a composição compreende células aderentes derivadas do âmnio e células estromais : mesenquimais ou tronco, por exemplo, células estromais mesenquimais ou ” tronco derivadas de medula óssea. Em uma outra modalidade específica, a . 5 composição compreende células tronco hematopoiéticas derivadas de medula óssea. Em uma outra modalidade específica, a composição compreende células aderentes derivadas do âmnio e células progenitoras hematopoiéticas, por exemplo, células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea, sangue fetal, sangue do cordão umbilical, sangue placentário e/ou sangue periférico. Em uma outra modalidade específica, a composição compreende células aderentes derivadas do âmnio e células tronco somáticas. Em uma modalidade mais específica, a dita célula tronco somática é uma célula tronco neural, uma célula tronco hepática, uma célula tronco pancreática, uma célula tronco endotelial, uma célula tronco cardíaca ou uma célula tronco muscular. “15 Em outras modalidades específicas, o segundo tipo de células compreende cerca de, pelo menos, ou não mais que, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, ou 50 % das células na dita população. Em outras modalidades específicas, as AMDACSs na dita composição compreendem pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % ou 90 % das células na ditacomposição. Em outras modalidades específicas, as células aderentes derivadas do âmnio compreendem cerca de, pelo menos, ou não mais que, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, ou 45 % das células na dita população.

As células em uma população isolada de células aderentes — derivadas do âmnio podem ser combinadas com uma pluralidade de células de um outro tipo, por exemplo, com uma população de células tronco, em uma razão de cerca de 100.000.000:1, 50.000.000:1, 20.000.000:1, 10.000.000:1,

5.000.000:1, 2.000.000:1, 1.000.000:1, 500.000:1, 200.000:1, 100.000:1,

50.000:1, 20.000:1, 10.000:1, 5.000:1, 2.000:1, 1.000:1, 500:1, 200:1, 100:1,

. 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1.000; 1:2.000; 1:5.000; 1:10.000; 1:20.000; 1:50.000; 1:100.000; 1:500.000; ' 1:1.000.000; 1:2.000.000; 1:5.000.000; 1:10.000.000; 1:20.000.000; ” 1:50.000.000; ou cerca de 1:100.000.000, números comparativos de células - 5 nucleadastotaisem cada população isolada de células aderentes derivadas do âmnio podem ser combinados com uma pluralidade de células de uma pluralidade de tipos celulares, igualmente.

CRESCIMENTO NA CULTURA O crescimento das células aderentes derivadas do âmnio aqui — descritas, para qualquer célula de mamífero, depende em parte do meio particular selecionado para o crescimento. Em condições ideais, as células aderentes derivadas do âmnio tipicamente dobram em número em aproximadamente 24 horas. Durante o cultivo, as células aderentes derivadas i do âmnio aqui descritas se aderem a um substrato na cultura, por exemplo, na 7 15 — superfície um recipiente de cultura de tecido (por exemplo, placa de cultura de tecido plástico, plástico revestido com fibronectina e similares) e formam uma monocamada. Tipicamente, as células se estabelecem na cultura em 2-7 dias após a digestão do âmnio. Elas proliferam em aproximadamente 0,4 a 1,2 aumentos em dobro da população por dia e podem passar por pelo menos 30 a — 50 aumentos em dobro da população. As células exibem um fenótipo do tipo célula mesenquimal/fibroblástica durante a subconfluência e expansão, e uma aparência na confluência do tipo cuboidal/pedra arredondada, e a proliferação na cultura é fortemente inibida por contato. As populações de células angiogênicas derivadas de âmnio podem formar corpos embriogênicos — durantea expansão na cultura.

MÉTODOS DE OBTER CÉLULAS ANGIOGÊNICAS DERIVADAS DE

ÂMNIO As células aderentes derivadas do âmmnio, e populações de células compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio, podem ser

- produzidas, por exemplo, isoladas de outras células ou populações de célula, por exemplo, por meio de métodos particulares de digestão de tecido de ' âmnio, seguido opcionalmente por avaliação das células ou população de " célula resultantes quanto a presença ou ausência de marcadores, ou - 5 — combinações de marcadores, características de células aderentes derivadas do âmnio, ou obtendo células de âmnio e selecionando com base nas características de marcadores de células aderentes derivadas do âmnio.

As células aderentes derivadas do âmnio, e populações de células isoladas compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas podem ser produzidas, por exemplo, por digestão de tecido de âmnio seguido por seleção de células aderentes.

Em uma modalidade, por exemplo, células aderentes derivadas do âmnio isoladas, ou uma população isolada de células que compreendem células aderentes derivadas do âmnio, podem ser produzidas (1) digerindo o tecido de âmnio com uma primeira * 15 enzima para dissociar células da camada epitelial do âmnio das células da camada mesenquimal do âmnio; (2) digerindo subsequentemente a camada mesenquimal do âmnio com uma segunda enzima para formar uma suspensão de célula única; (3) cultivando células na dita suspensão de célula única em uma superfície de cultura de tecido, por exemplo, plástico para cultura de tecidos; e (4) selecionando células que se aderem à dita superfície após uma mudança do meio, produzindo por meio disso uma população isolada de células que compreendem células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma modalidade específica, a dita primeira enzima é tripsina.

Em uma modalidade mais específica, a dita tripsina é usada em uma concentração de tripsina a 0,25% (p/v), em 5-20, por exemplo, 10 mililitros de solução por grama de tecido de âmnio a ser digerido.

Em uma outra modalidade mais específica, a dita digestão com tripsina continua naturalmente por cerca de 15 minutos a 37 ºC e é repetida até três vezes.

Em uma outra modalidade específica, a dita segunda enzima é colagenase.

Em uma modalidade mais específica, a dita

. colagenase é usada em uma concentração entre 50 e 500 U/L em 5 mL por grama de tecido de âmnio a ser digerido.

Em uma outra modalidade mais : específica, a dita digestão com colagenase continua naturalmente por cerca de " 45-60 minutos a 37 ºC.

Em uma outra modalidade específica, a suspensão de « 5 célula única formada após a digestão com colagenase é filtrada por meio de, por exemplo, um filtro de 75 uM - 150 uM entre a etapa (2) e etapa (3). Em uma outra modalidade específica, a dita primeira enzima é tripsina, e a dita segunda enzima é colagenase.

Uma população isolada de células que compreendem células — aderentes derivadas do âmnio, em uma outra modalidade, pode ser obtida selecionando células a partir do âmnio, por exemplo, células obtidas digerindo tecido de âmnio, da maneira descrita aqui em alguma parte, que exibem uma ou mais características de uma célula aderente derivada de âmnio.

Em uma modalidade, por exemplo, uma população de célula é produzida por um * 15 método compreendendo selecionar células de âmnio que são (a) negativas para OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR, e (b) positivas para uma ou mais de VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CDI05, CD200, da maneira determinada por imunolocalização; e isolar as ditas células de outras células para formar uma população de célula.

Em uma modalidade específica, as ditas células de âmnio são adicionalmente VE-caderina.

Em uma modalidade específica, uma população de célula é produzida selecionando células placentárias que são (a) negativas para OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR, e VE- caderina, da maneira determinada por imunolocalização, e (b) positivas para cada uma de VEGFR2/KDR, CD9, CD54, CD105, CD200, da —maneira determinada por imunolocalização; e isolar as ditas células de outras células para formar uma população de célula.

Em certas modalidades, a seleção por imunolocalização é realizada antes da seleção por RT-PCR.

Em uma outra modalidade específica, a dita seleção compreende selecionar células que não expressam marcador celular CD34' após cultivo por 4 a 21

R dias na presença de 1 a 100 ng/mL de VEGF.

Em uma outra modalidade, por exemplo, uma população de : célula é produzida por um método compreendendo selecionar células de " âmnio que são aderentes ao plástico para cultura de tecidos e são OCT-4, da . 5 — maneira determinada por RT-PCR, e VEGFRI/FIt-I e VEGFR2/KDR", da maneira determinada por imunolocalização, e isolar as ditas células de outras células para formar uma população de célula. Em uma modalidade específica, uma população de célula é produzida por um método compreendendo selecionar células de âmnio que são OCT-4', da maneira determinada por RT- PCR, e VEGFRI/FIt-1I*, VEGFR2/KDR"* e HLA-G, da maneira determinada por imunolocalização. Em uma outra modalidade específica, a dita população de célula é produzida selecionando células de âmnio que são adicionalmente uma ou mais, ou todas, de CD9”, CD1I0”, CD44”, CD54”, CD98*, Tie-2', i TEM-7', CD31', CD34, CD45, CD133, CDI43', CDI46' e/ou CXCR4 * 15 (receptor 4 de quimiocina (motivo C-X-C)), da maneira determinada por imunolocalização, e isolar as células a partir das células que não exibem uma ou mais destas características. Em uma outra modalidade específica, a dita população de célula é produzida selecionando células de âmnio que são adicionalmente VE-caderina”, da maneira determinada por imunolocalização, eisolaras células a partir das células que são VE-caderina . Em uma outra modalidade específica, a dita população de célula é produzida selecionando células de âmnio que são adicionalmente CD105* e CD200”, da maneira determinada por imunolocalização, e isolar as células a partir das células que são CD105 ou CD200. Em uma outra modalidade específica, a dita célula não —expressaCD34 da maneira detectada por imunolocalização após exposição a 1a 100 ng/mL de VEGF por 4 a 21 dias. Na seleção de células, não é necessário testar uma população total de células quanto a características específicas das células aderentes derivadas do âmnio. Em vez disso, uma ou mais alíquotas de células (por

. exemplo, cerca de 0,5 % - 2 %) de uma população de células podem ser testadas com relação a tais características, e os resultados podem ser ' atribuídos às células restantes na população. bh: As células selecionadas podem ser confirmadas como as « 5 célulasaderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas cultivando uma amostra das células (por exemplo, cerca de 10º a cerca de 10º células) em um substrato, por exemplo, MATRIGEL'M, por 4 a 14, por exemplo, 7, dias na presença de VEGF (por exemplo, cerca de 50 ng/mL), e inspecionando visualmente as células quanto à aparência de brotamentos e/ou redes celulares.

As células aderentes derivadas do âmnio podem ser selecionadas pelos marcadores anteriores usando qualquer método conhecido na técnica de seleção de célula. Por exemplo, as células aderentes podem ser i selecionadas usando um anticorpo ou anticorpos em um ou mais marcadores “15 de superfície celular, por exemplo, em imunolocalização, por exemplo, citometria de fluxo ou FACS. A seleção pode ser realizada usando anticorpos Junto com microesferas magnéticas. Os anticorpos que são específicos para certos marcadores são conhecidos na técnica e são disponíveis comercialmente, por exemplo, anticorpos para CD9 (Abeam); CD54 —(Abeam); CDIO05 (Abeam; BioDesign International, Saco, ME, etc); CD200 (Abeam) citoqueratina (SigmaAldrich). Os anticorpos para outros marcadores também são disponíveis comercialmente, por exemplo, CD34, CD38 e CD45' são disponíveis, por exemplo, pela StemCell Technologies ou BioDesign International. Os oligonucleotídeos iniciadores para as sequências OCTH4 adequadas para RT-PCR podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da Millipore ou Invitrogen, ou podem ser derivados facilmente da sequência humana no acesso ao GenBank número DQ486513.

Os métodos detalhados de obter placenta e tecido de âmnio, e tratar tal tecido a fim de obter células aderentes derivadas do âmnio, são

R fornecidos a seguir. Composição da coleção de célula i Em geral, as células podem ser obtidas a partir do âmnio de " uma placenta de mamífero, por exemplo, uma placenta humana, usando uma . 5 — solução fisiologicamente aceitável, por exemplo, uma composição de coleta de célula. Preferivelmente, a composição de coleta de célula previne e suprime apoptose, previne e suprime morte celular, lise, decomposição e similares. Uma composição de coleta de célula é descrita em detalhes na publicação de pedido de patente relacionada U.S. 2007/0190042, intitulada "“Improved Medioum for Collecting Palcental Stem Cells and Preserving Organs," cuja revelação é aqui incorporada pela referência na sua íntegra.

A composição de coleta de célula pode compreender qualquer solução fisiologicamente aceitável adequda para a coleção e/ou cultivo de i células aderentes derivadas do âmnio, por exemplo, uma solução salina (por * 15 exemplo, salina tamponada com fosfato, solução de Kreb, solução de Kreb modificada, solução de Eagle, NaCl a 0,9 %, etc.), um meio de cultura (por exemplo, DMEM, H.DMEM, etc.) e similares, com ou sem a adição de um componente de tamponamento, por exemplo, ácido 4-(2-hidroxietil)- 1- piperazinaetanossulfônico (HEPES).

A composição de coleta de célula pode compreender um ou mais components que tendem a preservar células, por exemplo, células aderentes derivadas do âmnio, isto é, prevenir as células quanto à coloração, ou retardar a morte das células, reduzir o número de células em uma população de células que morrem, ou similares, a partir do tempo de coleta atéotempoo cultivo. Tais componentes podem ser, por exemplo, um inibidor de apoptose (por exemplo, um inibidor de caspase ou inibidor de INK); um vasodilador (por exemplo, sulfato de magnésio, um medicamento anti- hipertensivo, peptídeo atrial natriurético (ANP), adrenocorticotropina, hormônio liberador de corticotropina, nitroprussiato de sódio, hidralazina,

. trifosfato de adenosina, adenosina, indometacina ou sulfato de magnésio, um inibidor de fosfodiesterase, etc.); um inibidor de necrose (por exemplo, 2-(IH- ' Tndol-3-il)-3-pentilamino-maleimida, = ditiocarbamato de pirrolidina ou ” clonazepam); um inibidor de TNF-a; e/ou um perfluorocarbono que carrega * 5 oxigênio (por exemplo, brometo de perfluoroctila, brometo de perfluorodecila, etc.).

A composição de coleta de célula pode compreender um ou mais enzimas que degradam, por exemplo, um metaloprotease, uma serina protease, uma protease neutra, uma RNase, ou uma DNase ou similares. Tais enzimas incluem, mas sem limitação, colagenases (por exemplo, colagenase 1, II, IM ou IV, uma colagenase de Clostridium histolyticum, etc.); dispase, termolisina, elastase, tripsina, LIBERASETM, hialuronidase e similares. O uso de composições da coleção de célula que compreendem enzimas que digerem i tecido é discutido com mais detalhes a seguir.

"15 A composição de coleta de célula pode compreender um quantidade bactericida ou bacteriostaticamente efetiva de um antibiótico. Em certas modalidades não limitantes, o antibiótico é um macrolídeo (por exemplo, tobramicina), uma cefalosporina (por exemplo, cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima ou cefadroxil), uma —claritromicina, uma eritromicina, uma penicilina (por exemplo, penicilina V) ou uma quinolona (por exemplo, ofloxacina, ciprofloxacina ou norfloxacina), uma tetraciclina, uma estreptomicina, etc. Em uma modalidade particular, o antibiótico é ativo contra bactérias Gram(t+) e/ou Gram(-), por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e similares.

A composição de coleta de célula também pode compreender um ou mais dos compostos a seguir: adenosina (cerca de 1 mM a cerca de 50 mM); D-glicose (cerca de 20 mM a cerca de 100 mM); íons de magnésio (cerca de 1 mM a cerca de 50 mM); uma macromolécula de peso molecular maior que 20.000 daltons, em uma modalidade, presentes em uma quantidade

. suficiente para manter a integridade endotelial e a viabilidade celular (por exemplo, um colóide sintético ou de ocorrência natural, um polissacarídeo tal como dextrano ou um polietileno glicol presente em cerca de 25 g/1 a cerca - de 100 g/1, ou cerca de 40 g/1 a cerca de 60 g/1); um antioxidante (por . 5 exemplo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutationa, vitamina C ou vitamina E presentes em cerca de 25 uM a cerca de 100 uM); um agente redutor (por exemplo, N-acetilcisteína presente em cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM); um agente que previne a entrada de cálcio nas células (por exemplo, verapamil presente em cerca de 2 UM a cerca de 25 uM); —nitroglicerina (por exemplo, cerca de 0,05 g/L a cerca de 0,2 g/L); um anticoagulante, em uma modalidade, presente em uma quantidade suficiente para auxiliar na prevenção da coagulação do sangue residual (por exemplo, heparina ou hirudina presente em uma concentração de cerca de 1.000 unidades/I a cerca de 100.000 unidades/1); ou um composto contendo * 15 amilorida (por exemplo, amilorida, etil isopropil amilorida, hexametileno amilorida, dimetil amilorida ou isobutil amilorida presente em cerca de 1,0 UM a cerca de 5 uM). As células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas também podem ser coletadas, por exemplo, durante e após a digestão da 20 . maneira descrita anteriormente, em um tampão fisiologicamente aceitável simples, por exemplo, salina tamponada com fosfato, uma solução de NaCl a 0,9 %, meio de cultura de célula ou similares.

Coleta e manuseio de placenta Em geral, uma placenta humana é recuperada logo após sua expulsão após o nascimento ou após, por exemplo, cesariana.

Em uma modalidade preferida, a placenta é recuperada de uma paciente após informar consentimento e após um histórico médico completo da paciente ser obtido e estar associado com a placenta.

Preferivelmente, o histórico médico continua após o parto.

Um histórico médico como este pode ser usado para coordinar

. uso subsequente da placenta ou células colatadas destas. Por exemplo, células placentárias humanas, por exemplo, células aderentes derivadas do âmnio, í podem ser usadas, à luz do histórico médico, para medicina personalizada do ” recém nascido, ou um parente próximo, associada à placenta, ou para os pais, . S — irmãos ou outros parentes do recém nascido. Antes da recuperação de células aderentes derivadas do âmnio, o sangue do cordão umbilical e sangue placentário são removidos. Em certas modalidades, após distribuição, o sangue do cordão na placenta é recuperado. A placenta pode ser submetida a um processo de recuperação do sangue do cordão convencional. Tipicamente, uma agulha ou cânula é usada, com o auxílio da gravidade, para dessangrar a placenta (ver, por exemplo, Anderson, patente U.S. 5.372.581; Hessel et al, patente U.S. 5.415.665). A agulha ou cânula é colocada em geral na veia umbilical e a placenta pode ser i gentilmente massageada para auxiliar na drenagem do sangue do cordão a * 15 partir da placenta. A recuperação de sangue do cordão como esta pode ser realizada comercialmente, por exemplo, LifeBank USA, Cedar Knolls, N. J., ViaCord, Cord Blood Registry and Cryocell. Preferivelmente, a placenta é drenada pela gravidade sem manipulação adicional de maneira a minimizar a destruição do tecido durante a recuperação do sangue do cordão.

Tipicamente, uma placenta é transportada da sala de cirurgia ou sala de parto para um outro local, por exemplo, um laboratório, para recuperação de sangue do cordão e coleta de células, por exemplo, por perfusão ou dissociação de tecido. A placenta é preferivelmente transportada em um dispositivo hermeticamente fechado estéril (que mantém a temperatura — da placenta entre 20-28 ºC), por exemplo, colocando a placenta, com cordão umbilical grampeado, em uma sacola de plástico estéril com fecho, que é então colocada em um recipiente isolado. Em uma outra modalidade, a placenta é transportada em um conjunto de coleta de sangue do cordão substancialmente da maneira descrita na patente dos Estados Unidos

. 7.147.626. Preferivelmente, a placenta é transportada para o laboratório quatro a vinte e quatro horas após a cirurgia.

Em certas modalidades, o cordão ' umbilical proximal é grampeado, preferivelmente em 4-5 cm (centímetros) da É inserção no disco placentário antes da recuperação do sangue do cordão.

Em . 5 outras modalidades, o cordão umbilical proximal é grampeado após a recuperação do sangue do cordão, mas antes do processamento adicional da placenta.

A placenta, antes da coleta de célula, pode ser armazenada em condições estéreis e em uma temperatura de, por exemplo, 4 25 ºC (centígrados), por exemplo, em temperatura ambiente.

A placenta pode ser armazenada, por exemplo, por um período de zero a vinte e quatro horas, até quarenta e oito horas, ou mais de cinquenta e oito horas, antes da aspersão da placenta para remover qualquer sangue residual do cordão.

Em uma i modalidade, a placenta é coletada entre cerca de zero horas a cerca de duas * 15 horas após a expulsão.

À placenta pode ser armazenada em uma solução anticoagulante em uma temperatura de, por exemplo, 4 a 25 ºC (centígrados). As soluções adequadas de anticoagulante são bem conhecidas na técnica.

Por exemplo, uma solução de citrato de sódio, heparina ou varfarina sódica pode ser usada.

Em uma modalidade preferida, a solução de anticoagulantes — compreende uma solução de heparina (por exemplo, 1 % p/p em solução 1:1.000). A placenta dessangrada é preferivelmente armazenada por não mais que 36 horas antes das células serem coletadas.

Rompimento físico e digestão enzimática de tecido de âmnio Em uma modalidade, o âmnio é separado do resto da placenta, — por exemplo, por dissecção romba, por exemplo, usando os dedos.

O âmnio pode ser dissecado, por exemplo, em partes ou segmentos de tecido, antes da digestão enzimática e recuperação de célula aderente.

As células aderentes derivadas do âmnio podem ser obtidas de um âmnio completo, ou de um pequeno segmento de âmnio, por exemplo, um segmento de âmnio que

. apresenta cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou cerca de 1.000 milímetros : quadrados em área.

fe As células aderentes derivadas do âmnio podem ser em geral -* 5 coletadasdeumãâmnio placentário ou uma porção deste, em qualquer período em torno dos três primeiros dias após a expulsão, mas preferivelmente entre cerca de O horas e 48 horas após expulsão, ou cerca de 8 horas e cerca de 18 horas após a expulsão.

Em uma modalidade, as células aderentes derivadas do âmnio são extraídas a partir do tecido de âmnio por digestão enzimática usando uma ou mais enzimas que digerem o tecido. O âmnio, ou uma porção deste, por exemplo, pode ser digerido com uma ou mais enzimas dissolvidas ou misturado em uma composição de coleta de célula da maneira descrita i anteriormente.

* 15 Em certas modalidades, a composição de coleta de célula compreende uma ou mais enzimas que rompem tecido. A digestão enzimática usa preferivelmente uma combinação de enzimas, por exemplo, uma combinação de uma matriz metaloprotease e uma protease neutra, por exemplo, uma combinação de dispase e colagenase, por exemplo, usada em — ordem sequencial. Quando mais de uma protease é usada, as proteases podem ser usadas ao mesmo tempo para digerir o tecido de âmnio, ou podem ser usadas em série. Em uma modalidade, por exemplo, o tecido de âmnio é digerido três vezes com tripsina e então uma vez com colagenase.

Em uma modalidade, o tecido de âmnio é digerido —enzimaticamente com uma ou mais de uma matriz metaloprotease, uma protease neutra e uma enzima mucolítica. Em uma modalidade específica, o tecido de âmnio é digerido com uma combinação de colagenase, dispase, e hialuronidase. Em uma outra modalidade específica, o tecido de âmnio é digerido com uma combinação de LIBERASE!M (Boehringer Mannheim

. Corp., Indianapolis, Ind.) e hialuronidase. Outras enzimas que podem ser usadas para romper o tecido de âmnio incluem papaína, desoxirribonucleases, i serina proteases, tais como tripsina, quimotripsina ou elastase. As serinas ” proteases podem ser inibidas por alfa 2 microglobulina no soro e, portanto, o . 5 —meio usado para digestão, em certas modalidades, pode ser sem soro. Em outras certas modalidades, EDTA e DNase são usadas na digestão de tecido de âmnio, por exemplo, para aumentar a eficácia da recuperação de célula. Em outras certas modalidades, o material digerido é diluído de maneira a evitar a captura de células na digestão viscosa.

Concentrações típicas para digestão enzimática de tecido incluem, por exemplo, 50-200 U/mL para colagenase I e colagenase IV, 1-10 U/mL para dispase, e 10-100 U/mL para elastase. As proteases podem ser usadas em combinação, isto é, duas ou mais proteases na mesma reação de : digestão, ou podem ser usadas sequencialmente a fim de isolar células * 15 aderentes derivadas do âmnio. Por exemplo, em uma modalidade, o tecido de âmnio, ou parte deste, é digerido primeiro com uma quantidade apropriada de tripsina, em uma concentração de cerca de 0,25 %, por exemplo, por 15 minutos a 37 ºC, seguido por colagenase I em cerca de 1 a cerca de 2 mg/mL, por exemplo, por 45 minutos.

Em uma modalidade, as células aderentes derivadas do âmnio podem ser obtidas da maneira a seguir. A membrana amniótica é cortada em segmentos de aproximadamente 0,1” x 0,1” a cerca de 5" x 5", por exemplo, 2” x 2”, em tamanho. À monocamada epitelial é removida do lado fetal da membrana amniótica por tripsinização tripla da maneira a seguir. Os — segmentos de membrana amniótica são colocados em um recipiente com solução aquecida de tripsina-EDTA (por exemplo, cerca de 20 ºC a cerca de 37 ºC) (0,25 %). O volume de tripsina pode variar de cerca de 5 mL por grama de âmnio a cerca de 50 mL por grama de âmnio. O recipiente é agitado por cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, por exemplo, 15 minutos,

. mantendo ao mesmo tempo a temperatura constante. Os segmentos de membrana amniótica são então separados da solução de tripsina por qualquer método apropriado, tal como removendo manualmente os segmentos de . âmnio ou por filtração. A etapa de tripsinização pode ser repetida pelo menos ” 5 maisuma vez.

Mediante finalização da tripsinização final, os segmentos de membrana amniótica são colocados de volta no recipiente preenchido com solução de neutralização de tripsina aquecida, tal como salina tamponada com fosfato (PBS)/FBS 10 %, PBS/5 % FBS ou PBS/3 % FBS. O recipiente é agitado por cerca de 5 segundos a cerca de 30 minutos, por exemplo, 5 minutos. Os segmentos de membrana amniótica são então separados da solução de neutralização de tripsina da maneira descrita anteriormente, e os segmentos de membrana amniótica são colocados no recipiente preenchido com PBS aquecido, pH 7,2. O recipiente é agitado por cerca de 5 segundos a * 15 cerca de 30 minutos e os segmentos de membrana amniótica são então separados do PBS, da maneira descrita anteriormente.

Os segmentos de membrana amniótica são então colocados no recipiente preenchido com solução de digestão aquecida (por exemplo, cerca de 20 ºC a cerca de 37 ºC). O volume da solução de digestão pode variar de —cercade5 mL por grama de âmnio a cerca de 50 mL por grama de âmnio. As soluções de digestão compreendem as enzimas de digestão em um meio de cultura apropriado, tal como DMEM. As soluções de digestão típicas incluem colagenase tipo I (cerca de 50 U/mL a cerca de 500 U/mL); colagenase tipo I (cerca de 50 U/mL a cerca de 500 U/mL) mais dispase (cerca de 5 UmL a —cercade 100 UML); e colagenase tipo I (cerca de 50 U/mL a cerca de 500 U/MmL), dispase (cerca de 2 U/mL a cerca de 50 U/mL) e hialuronidase (cerca de 3 U/mL a cerca de 10 U/ mL). O recipiente é agitado a 37 ºC até que a digestão de âmnio seja substancialmente completa (aproximadamente 10 minutos a cerca de 90 minutos). O PBS/5 % FBS aquecido é então adicionado

. ao recipiente em uma razão de cerca de 1 mL por grama de tecido amniótico a cerca de 50 mL por grama de tecido amniótico.

O recipiente é agitado por S cerca de 2 minutos a cerca de 5 minutos.

A suspensão celular é então filtrada ” para remover qualquer tecido não digerido usando um filtro de 40 um a 100 - 5 um Ascélulassão suspensasem PBS aquecido (cerca de 1 mL a cerca de 500 mL), e então centrifugadas a 200 x g a cerca de 400 x g por cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, por exemplo 300 x g por cerca de 15 minutos a 20 ºC.

Após a centrifugação, o sobrenadante é removido e as células são re- suspensas em um meio de cultura adequado.

A suspensão celular pode ser filtrada (em filtro de 40 um a 70 um) para remover qualquer tecido não digerido remanescente, rendendo uma suspensão celular simples.

Nesta modalidade, as células em suspensão são coletadas e cultivadas, da maneira descrita aqui em alguma parte para produzir células i aderentes derivadas do âmnio isoladas, e populações de tais células.

O âmnio * 15 —nãodigerido remanescente, nesta modalidade, pode ser descartado.

As células liberadas do tecido de âmnio podem ser, por exemplo, coletadas, por exemplo, por centrifugação, e cultivadas em meio de cultura de célula padrão.

Em quaisquer dos protocolos de digestão aqui, a suspensão celular obtida por digestão pode ser filtrada, por exemplo, por meio de um filtro compreendendo poros de cerca de 50 um a cerca de 150 um, por exemplo, de cerca de 75 um a cerca de 125 um.

Em uma modalidade mais específica, a suspensão celular pode ser filtrada por meio de dois ou mais filtros, por exemplo, um filtro de 125 um e um filtro de 75 um.

Junto com quaisquer dos métodos aqui descritos, AMDACs —podem ser isoladas das células liberadas durante a digestão selecionando células que expressam uma ou mais características de AMDACS, da maneira descrita na seção 5.1 anterior.

As AMDACs, por exemplo, também podem ser isoladas usando um método de isolamento de duas etapas específico compreendendo a

. digestão com tripsina seguido por digestão com colagenase.

Assim, em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de isolar células aderentes derivadas do âmnio compreendendo digerir uma membrana amniótica ou ” porção desta com tripsina, de maneira tal que as células epiteliais sejam - S — liberadas da dita membrana amniótica; remover a membrana amniótica ou porção desta das ditas células epiteliais; digerir ao mesmo tempo a membrana amniótica ou porção desta com colagenase, de maneira tal que as células aderentes derivadas do âmnio selam liberadas da dita membrana amniótica ou porção desta; e separar as ditas células aderentes derivadas do âmnio da dita membrana amniótica.

Em uma modalidade específica, a digestão da membrana amniótica ou porção desta é repetida pelo menos uma vez.

Em uma outra modalidade específica, a digestão da membrana amniótica ou porção desta com colagenase é repetida pelo menos uma vez.

Em uma outra i modalidade específica, a tripsina está em cerca de 0,1 % - 1,0 % * 15 (concentração final). Em uma modalidade mais específica, a tripsina está em cerca de 0,25 % (concentração final). Em uma outra modalidade específica, a colagenase está em cerca de 50 U/mL a cerca de 1.000 U/mL (concentração final). Em uma modalidade mais específica, a colagenase está em cerca de 125 U/mL (concentração final). Em uma outra modalidade específica, o método de isolamento compreende adicionalmente cultivar as ditas células aderentes derivadas do âmnio em cultura de células e separar as ditas células aderentes derivadas do âmnio das células não aderentes na dita cultura para produzir uma população enriquecida de células aderentes derivadas do âmnio.

Em modalidades mais específicas, pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % 75% 80%, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % das células na dita população enriquecida de células aderentes derivadas do âmnio são as ditas células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma modalidade mais específica dos métodos anteriores, as células aderentes derivadas do âmnio são negativas para OCT-4, da

R maneira determinada por RT-PCR, e uma ou mais de HLA- G*, CD90', CD105* e CD117', da maneira determinada por citometria de fluxo.

Isolamento, classificação e caracterização de células aderentes derivadas do ” âmnio - 5 Os precipitados celulares podem ser resuspensos em composição de coleta de célula nova, da maneira descrita anteriormente, ou um meio adequado para manutenção da célula, por exemplo, meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM); meio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), por exemplo, meio IMDM sem soro contendo 2U/mL de heparina e 2mM de EDTA (GibcoBRL, NY); uma mistura de tampão (por exemplo PBS, HBSS) com FBS (por exemplo 2 % v/v); ou similares.

As células aderentes derivadas do âmnio que foram cultivadas, por exemplo, em uma superfície, por exemplo, em plástico para cultura de tecidos, com ou sem revestimento de matriz extracelular adicional, tal como * 15 fibronectina, podem ser passadas ou isoladas por aderência diferencial.

Por exemplo, uma suspensão celular obtida da digestão por colagenase do tecido de âmnio, realizada da maneira descrita na seção 5.4.3 anterior, pode ser cultivada, por exemplo, por 3-7 dias em meio de cultura em plástico para cultura de tecidos.

Durante o cultivo, uma pluralidade de células na suspensão se aderem à superfície da cultura e, após cultivo continuado, fornecem as células aderentes derivadas do âmnio.

As células não aderentes, que não dão origem às células aderentes derivadas do âmnio, são removidas durante a troca de meio.

O número e tipo de células coletadas a partir do âmnio podem ser monitorados, por exemplo, medindo mudanças na morfologia e marcadores de superfície celular usando técnicas padrões de detecção celular tal como imunolocalização, por exemplo, citometria de fluxo, classificação celular, imunocitoquímica (por exemplo, coloração com anticorpos específicos para ou pata marcadores celulares) classificação celular ativada

. por fluorescência (FACS), classificação celular ativada por magnetismo (MACS), por exame da morfologia de células usando luz ou microscopia S confocal, e/ou medindo as mudanças na expressão de gene usando técnicas [= bem conhecidas na tecnologia, tais como PCR e perfil de expressão de gene. - S — Estas técnicas podem ser usadas, também, para identificar células que são positivas para um ou mais marcadores particulares. Por exemplo, usando um ou mais anticorpos para CD34, um pode determinar, usando as técnicas anteriores, se uma célula compreende uma quantidade detectável de CD34'; se for assim, a célula é CD34*.

As células derivadas de âmnio, por exemplo, células que foram isoladas por separação de Ficoll, aderência diferencial, ou uma combinação de ambas, pode ser classificada usando um classificador de célula ativada por fluorescência (FACS). A classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) é um método bem conhecido para separar partículas, incluindo as * 15 células, com base nas propriedades fluorescentes das partículas (ver, por exemplo, Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). A excitação a laser de frações fluorescentes nas partículas individuais resulta em uma pequena carga elétrica que permite a separação eletromagnética de partículas positivas e negativas de uma mistura. Em uma modalidade, os anticorpos — específicos de marcador de superfície celular ou ligantes são marcados com rótulos fluorescentes distintos. As células são processadas por meio do classificador celular, permitindo a separação de células com base na sua capacidade de se ligar aos anticorpos usados. As partículas classificadas de FACS podem ser depositadas diretamente em poços individuais de placas de — 96 poços ou384 poços para facilitar a separação e clonagem.

Em um esquema de classificação, células de placenta, por exemplo, células aderentes derivadas do âmnio, podem ser classificadas com base na expressão dos marcadores CD49f', VEGFR2/KDR, e/ou Flt- 1/VEGFRI. Preferivelmente, as células são identificadas como sendo OCT-4,

. por exemplo, determinando a expressão de OCT-4' por RT-PCR em uma amostra das células, em que as células são OCT-4' se as células na amostra ' não conseguirem mostrar produção detectável de RNAm para OCT-4" após 30 ” ciclos. Por exemplo, células a partir do âmnio que são VEGFR2/KDR' e - 5 —VEGFRI/FItl'* podem ser classificadas a partir de células que são uma ou mais de VEGFR2/KDR e VEGFRI/FIt-I, CD9*, CD54*, CD105”, CD200* e/ou VE-caderina. Em uma modalidade específica, células aderentes ao plástico para cultura de tecidos derivadas de âmnio, que são uma ou mais de CD49f', VEGFR2/KDR', CD9*, CD54*, CD105”, CD200” e/ou VE-caderina”, ou células que são VEGFR2/KDR", CD9”, CD54'”, CD105*, CD200* e VE- caderina”, são classificadas como diferente das células que não expressam um ou mais de tal(s) marcador(s) e selecionadas. Em uma outra modalidade específica, células CD49f', VEGFR2/KDR', VEGFRI/FIt-1' que são ' adicionalmente uma ou mais, ou todas, de CD31*, CD34", CD45*, CD133”, "* 15 e/ouTie-2” são classificadas como células que não exibem uma ou mais, ou qualquer de tais características. Em uma outra modalidade específica, células VEGFR2/KDR', VEGFRI/Flt-1* que são adicionalmente uma ou mais, ou todas, de CD9”, CD1I0”, CD44”, CD54*, CD98*, Tie-2”, TEM- É, CD31, CD34, CD45', CD133, CDI43”, CDI46' e/ou CXCRA4”, são classificadas a partir das células que não exibem uma ou mais, ou qualquer de tais características.

A seleção para células aderentes derivadas do âmnio pode ser realizada em uma suspensão celular que resulta da digestão, ou em células isoladas coletadas do material digerido, por exemplo, por centrifugação ou separação usando citometria de fluxo. A seleção por marcadores expresso pode ser realizada sozinha ou, por exemplo, junto com procedimentos para selecionar células com base na suas propriedades de aderência na cultura. Por exemplo, uma seleção de aderência pode ser realizada antes ou após a classificação, com base na expressão do marcador.

. Com relação à detecção mediada por anticorpo e classificação de células placentárias, qualquer anticorpo, específico para um marcador ' particular, pode ser usado em combinação com qualquer fluoróforo ou outra é marca adequada para a detecção e classificação de células (por exemplo, - 5 classificação celular ativada por fluorescência). As combinações de anticorpo/fluoróforo para marcadores específicos incluem, mas sem limitação, anticorpos monoclonais conjugados de isotiocianato de fluoresceína (FITC) contra CD105 (disponível pela R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); anticorpos monoclonais conjugados de ficoeritrina (PE) contra CD200 (BD —Biosciences Pharmingen); VEGFR2/KDR-Biotina (CD309, Abeam) e similares. Anticorpos para quaisquer dos marcadores aqui revelados podem ser marcados com qualquer rótulo padrão para anticorpos que facilitem a detecção dos anticorpos incluindo, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, — fosfatase alcalina, B-galactosidase, — acetilcolinesterase " 15 estreptavidina/biotina, avidina/biotina, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina (PE), luminol, luciferase, luciferina e aequorina, e exemplos de material radioativo adequado incluem PT vn 35$ ou ?H.

Células aderentes derivadas do âmnio podem ser marcadas com um anticorpo para um marcador único e detectadas e classificadas com base no marcador único, ou podem ser marcadas simultaneamente com múltiplos anticorpos para uma pluralidade de diferentes marcadores e classificadas com base na pluralidade de marcadores.

Em uma outra modalidade, microesferas magnéticas podem ser usadas para separar células, por exemplo, para separar as células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas de outras células de âmnio. As células podem ser classificadas usando uma técnica de classificação de célula ativada por magnetismo (MACS), um método para separar partículas com base na sua

. capacidade de se ligar a microesferas magnéticas (0,5-100 um de diâmetro). Uma variedade de modificações usadas pode ser realizada nas microesferas ' magnéticas, incluindo adição covalente de anticorpo que reconhece * especificamente uma molécula de superfície celular particular ou hapteno. As * 5 microesferas são então misturadas com as células para permitir a ligação. As células são então passadas por um campo magnético para separar as células com o marcador de superfície celular específico. Em uma modalidade, estas células podem então ser isoladas e re-misturadas com microesferas magnéticas acopladas a um anticorpo contra marcadores de superfície celular — adicionais. As células são passadas novamente por um campo magnético, isolando as células que se ligam a ambos os anticorpos. Tais células podem ser então diluídas em placas separadas, tais como placas de microtitulação, para isolamento clonal.

Células aderentes derivadas do âmnio podem ser avaliadas 7" 15 —quantoa viabilidade, potencial de proliferação e longevidade usando técnicas padrões conhecidas na tecnologia, tais como ensaio de exclusão de azul de tripano, ensaio de absorção de diacetato de fluoresceína, ensaio de absorção de iodeto de propído (para avaliar a viabilidade) e ensaio de absorção de timidina ou ensaio de poliferação de célula MTT (para avaliar a proliferação). A longevidade pode ser determinada por métodos bem conhecidos na técnica, tal como a determinação do número máximo da população que aumenta em dobro em um cultura prolongada. As células aderentes derivadas do âmnio também podem ser separadas das outras células placentárias usando outras técnicas conhecidas na tecnologia, por exemplo, crescimento seletivo de células desejadas (seleção positiva), destruição seletiva de células indesejadas (seleção negativa); separação a base de aglutinabilidade celular diferencial nas população mistas, por exemplo, como com aglutinina de soja; procedimentos de congelamento- descongelamento; filtração; centrifugação convencional e zonal; elutriação

. centrífuga (centrifugação contra corrente); separação de unidade de gravidade; distribuição contra corrente; eletroforese e similares. ' CULTURA DE CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS DO ÂMNIO a Meios de cultura - 5 As células aderentes derivadas do âmnio isoladas, ou populações de tais células, podem ser usadas para iniciar, ou semear, culturas de célula.

As células são transferidas em geral para vasos de cultura de tecido estéreis tanto revestidos quanto não revestidos com matriz extracelular ou biomoléculas, tais como laminina, colágeno (por exemplo, natural ou —desnaturado), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina e proteína de membrana extracelular (por exemplo, MATRIGEL!M (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)). Aa AMDACSs, por exemplo, podem ser estabelecidas em i meios adequados para a cultura de células tronco.

Os meios de "* 15 estabelecimento, por exemplo, podem incluir meio EGM-2 (Lonza), DMEM + FBS 10 %, ou meio compreendendo 60 % de DMEM-LG (Gibco), MCDB- 201 40 % (Sigma), soro fetal bovino 2 % (FCS) (Hyclone Laboratories), insulina-transferrina-selênio 1X (ITS), ácido lenolênico-albumina sérica bovina 1X (LA-BSA), dexametasona 10º M (Sigma), 2-fosfato de ácido ascórbico de 10”M (Sigma), fator de crescimento epidérmico (EGF) 10 ng/ml (R&D Systems), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF- BB) 10 ng/ml (R&D Systems), e 100 U de penicilina/ 1.000 U de estreptomicina (aqui referidos como "meio padrão"). As células aderentes derivadas do âmnio podem ser cultivadas em qualquer meio, e em quaisquer condições reconhecidas na técnica como aceitáveis para a cultura de células, por exemplo, células tronco aderentes derivadas da placenta.

Preferivelmente, o meio de cultura compreende soro.

Em várias modalidades, meios para a cultura ou subcultura de AMDACs inclui STEMPROG (Invitrogen), MSCM-sf (ScienCell, Carlsbad, CA), meio

. MESENCULTQR-ACF (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá), meio padrão, meio padrão pobre em EGF, meio padrão pobre em PDGF, DMEM + : FBS 10 %, EGM-2 (Lonza), EGM-2MV (Lonza), meios ES 2 %, 10 % e 20 a %, meio ES-SSR, ou a-MEM-FBS 20 %. O meio aceitável para a cultura de . 5 — células aderentes derivadas do âmnio inclui, por exemplo, DMEM, IMDM, DMEM (alto ou baixo teor de glicose), meio basal de Eagle, meio F10 de Ham (FIO), meio F-12 de Ham (F12), meio de Dulbecco modificado por Iscove, meio de crescimento de célula tronco mesenquimal (MSCGM Lonza), meio ADVANCESTEM'YM (Hyclone), KNOCKOUT'!M DMEM (Invitrogen), —meioL-15 de Leibovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avançado (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), e meio sem célula GRO, ou similares.

Em várias modalidades, por exemplo, DMEM-LG (meio essencial modificado por Dulbecco, baixo teor de glicose/MCDB 201 (meio basal de fibroblasto do ovo) contendo ITS (insulina-transferrina-selênio), LA+BSA (ácido * 15 linolêico-albumina bovina sérica), dextrose, ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, IGF-I, e penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (alto teor de glicose) compreendendo cerca de 2 a cerca de 20 %, por exemplo, cerca de 10 %, de soro fetal bovino (FBS; por exemplo, soro fetal bovino definido, Hyclone, Logan, Utah); DMEM-HG compreendendo cerca de 2 a cerca de 20 %, por — exemplo, cerca de 15%, de FBS; IMDM (meio de Dulbecco modificado por Iscove) compreendendo cerca de 2 a cerca de 20 %, por exemplo, cerca de 10 %, de FBS, cerca de 2 a cerca de 20 %, por exemplo, cerca de 10 %, de soro de cavalo e hidrocortisona; M 199 compreendendo cerca de 2 a cerca de 20 %, por exemplo, cerca de 10 %, de FBS, EGF e heparina; a-MEM (meio — essencial mínimo) compreendendo cerca de 2 a cerca de 20 %, por exemplo, cerca de 10 %, de FBS, GLUTAMAX'Y e gentamicina; DMEM compreendendo FBS 10 %, GLUTAMAXTMY e gentamicina; DMEM-LG compreendendo cerca de 2 a cerca de 20 %, por exemplo, cerca de 15 %, (v/v) de soro fetal bovino (por exemplo, soro fetal bovino definido, Hyclone,

. Logan, Utah), antibióticos/antimicóticos (por exemplo, penicilina em cerca de 100 Unidades/mililitro, estreptomicina em 100 micrograms/mililitro e/ou : anfoteriina B em 0,25 microgramas/mililitro (Invitrogen, Carlsbad, & Califórnia)) e 0,001 % (v/v) de B-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis Mo.); . 5 —meio basal KNOCKOUT'!M-DMEM suplementado com 2 a 20 % de FBS, aminoácido não essencial (Invitrogen), beta-mercaptoetanol, meio basal KNOCKOUT'Y suplementado com substituição de soro KNOCKOUT'TY, alfa-MEM compreendendo 2 a 20 % de FBS, meio basal EBM2'M suplementado com EGF, VEGF, bFGF, R3IGF-1, hidrocortisona, heparina, ácido ascórbico, FBS, gentamicina) ou similares.

O meio de cultura pode ser suplementado com um ou mais componentes incluindo, por exemplo, soro (por exemplo, FCS ou FBS, por exemplo, cerca de 2-20 % (v/v); soro equino (cavalo) (ES); soro humano i (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferivelmente cerca de 0,001 % (v/v); * 15 um ou mais fatores de crescimento, por exemplo, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblasto básico (DFGF), fator de crescimento do tipo insulina 1 (IGF-I), fator inibitório de leucemia (LIF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e eritropoietina (EPO); aminoácidos, incluindo L- —valina;eum ou mais agentes antibióticos e/ou antimicóticos para controlar a contaminação microbiana, tais como, por exemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina e nistatina, tanto sozinhos quanto em combinação.

As células aderentes derivadas do âmnio (AMDACs) podem — ser cultivadas em condições de cultura de tecido padrão, por exemplo, em placas de cultura de tecido ou placas multipoços. As células também podem ser cultivadas usando um método de gota pendente. Neste método, as células são suspensas em cerca de 1 x 10º células por mL em cerca de 5 mL de meio, e uma ou mais gotas do meio são colocadas dentro da tampa de um recipiente

. de cultura de tecido, por exemplo, uma placa de Petri de 100 mL. As gotas podem ser, por exemplo, gotas únicas, ou gotas múltiplas, por exemplo, de í uma pipeta multicanal. A tampa é cuidadosamente invertida e colocada na - superfície do fundo da placa, que contém um volume de líquido, por exemplo, . 5 de PBS estéril suficiente para manter o teor de umidade na atmosfera da placa, e as células são cultivadas. As AMDACSs também podem ser cultivadas em sistemas padrões ou de grande volume ou de muito rendimento, tal como frascos T, Corning HYPERFLASKO, Cell Factories (Nuno), 1, 2, 4, 10 ou 40 pilhas de bandeja celular e similares.

Em uma modalidade, as células aderentes derivadas do âmnio são cultivadas na presença de um composto que age para manter um fenótipo não diferenciado nas células. Em uma modalidade específica, o composto é um 3,4-di-hidropiridimol[4,5-d]parimidina substituída. Em uma modalidade | mais específica, o composto é um composto com a estrutura química a seguir: “o CH:

NS O 1H CH; O composto pode ser colocado em contato com uma célula aderente derivada de âmnio, ou população de tais células, em uma concentração, por exemplo, entre cerca de 1 uM a cerca de 10 uM.

Expansão e proliferação de células aderentes derivadas do âmnio Uma vez que uma célula aderente derivada de âmnio é isolada, ou população de tais células é isolada (por exemplo, células aderentes derivadas do âmnio, ou população de tais células separadas em pelo menos 50 % das células de âmnio com as quais a célula ou população de células está normalmente associada in vivo), as células podem ser proliferadas e — prolongadas in vitro. Por exemplo, uma população de células aderentes ou células aderentes derivadas do âmnio podem ser cultivadas em recipientes de

. cultura de tecido, por exemplo, placas, frascos, placas multipoços ou similares, por um período suficiente para as células proliferarem em 40-70 % Í de confluência, isto é, até que as células e sua progênie ocupem 40-70 % da *. área superficial de cultura do recipiente de cultura de tecido. - 5 As células aderentes derivadas do âmnio podem ser semeadas nos vasos de cultura em uma densidade que permite o crescimento celular. Por exemplo, as células podem ser semeadas em baixa densidade (por exemplo, cerca de 400 a cerca de 6.000 células/cm?) à alta densidade (por exemplo, cerca de 20.000 ou mais células/cm”). Em uma modalidade preferida, as células são cultivadas em cerca de O % a cerca de 5% em volume de CO, no ar. Em algumas modalidades preferidas, as células são cultivadas em cerca de 0,1 % a cerca de 25 % de O; no ar, preferivelmente cerca de 5 % a cerca de 20 % de O; no ar. As células são preferivelmente ' cultivadas em cerca de 25 ºC a cerca de 40 ºC, preferivelmente em cerca de 37 * 15 ºC As células são preferivelmente cultivadas em uma incubadora. Durante o cultivo, o meio de cultura pode ser estático ou pode ser agitado, por exemplo, durante o cultivo usando um Dbiorreator. As células aderentes derivadas do âmnio preferivelmente são crescidas em baixo estresse oxidativo (por exemplo, com adição de glutationa, ácido ascórbico, catalase, tocoferol, N-acetilcisteína ou similares).

Embora as células angiogênicas derivadas de âmnio possam ser crescidas para confluência, as células preferivelmente não crescem para confluência. Por exemplo, uma vez que 40 %-70 % de confluência é obtida, as células podem ser passadas. Por exemplo, as células podem ser tratadas enzimaticamente, por exemplo, tripsinizadas, usando técnicas bem conhecidas na tecnologia, para separá-las da superfície de cultura de tecido. Após remover as células pipetando e contado as células, cerca de 20.000-100.000 células, preferivelmente cerca de 50.000 células, ou cerca de 400 a cerca de

R 6.000 células/em?, podem ser passadas em um novo recipiente de cultura contendo meio de cultura fresco. Tipicamente, o novo meio é do mesmo tipo í de meio a partir do qual as células foram removidas. As células aderentes . derivadas do âmnio podem ser passadas pelo menos 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10, . 5 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 vezes ou mais. AMDACs pode ser duplicadas na cultura pelo menos 1, 2,3, 4,5,6,7,8,9, 10,11, 12,13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou pelo menos 50 vezes ou mais.

CONSERVAÇÃO DE CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS DO ÂMNIO As células aderentes derivadas do âmnio podem ser conservadas, isto é, colocadas em condições que permitem armazenamento a longo prazo, ou condições que inibem a morte celular, por exemplo, por apoptose ou necrose, por exemplo, durante a coleta ou antes da produção das * 15 composições aqui descritas, por exemplo, usando os métodos aqui descritos. As células aderentes derivadas do âmnio podem ser conservados usando, por exemplo, uma composição compreendendo um inibidor de apoptose, inibidor de necrose e/ou um perfluorcarbono que carrega oxigênio, da maneira descrita em pedido de publicação U.S. 2007/0190042, cuja revelação é aqui incorporada pela referência na sua íntegra. Em uma modalidade, um método de conservar tais células, ou uma população de tais células, compreende colocar as ditas células ou população de células em contato com uma composição de coleta de célula compreendendo um inhibitor de apoptose e um perfluorcarbono que carrega — oxigênio, em que o dito inibidor de apoptose está presente em uma quantidade e por um período suficiente para reduzir ou prevenir apoptose na população de células, comparadas a uma população de células não colocadas em contato com o inibidor de apoptose. Em uma modalidade específica, o dito inibidor de apoptose é um inibidor de caspase. Em uma outra modalidade específica, o

. dito inibidor de apoptose é um inibidor de INK.

Em uma modalidade mais específica, o dito inibidor de INK não modula a diferenciação ou proliferação ; de células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma outra modalidade, a dita "* composição de coleta de célula compreende o dito inibidor de apoptose e o , 5 — dito perfluorcarbono que carrega oxigênio em fases separadas.

Em uma outra modalidade, a dita composição de coleta de célula compreende o dito inibidor de apoptose e o dito perfluorcarbono que carrega oxigênio em uma emulsão.

Em uma outra modalidade, a composição de coleta de célula compreende adicionalmente um emulsificante, por exemplo, lecitina.

Em uma outra “modalidade, o dito inibidor de apoptose e o dito perfluorcarbono estão entre cerca de 0 ºC e cerca de 25 ºC durante o tempo de contato com as células.

Em uma outra modalidade mais específica, o dito inibidor de apoptose e o dito perfluorcarbono são entre cerca de 2 ºC e 10 ºC, ou entre cerca de 2ºC e cerca ' de 5 ºC, durante o tempo de contato com as células.

Em uma outra * 15 modalidade mais específica, o dito colocar em contato é realizado durante o transporte da dita população de células.

Em uma outra modalidade mais específica, o dito colocar em contato é realizado durante o congelamento e descongelamento da dita população de células.

As populações de células aderentes derivadas do âmnio podem — ser conservadas, por exemplo, por um método compreendendo colocar uma população das ditas células em contato com um inibidor de apoptose e um composto conservante de órgão, em que o dito inibidor de apoptose está presente em uma quantidade e por um período suficiente para reduzir ou prevenir a apoptose na população de células, comparada a uma população de células não colocada em contato com o inibidor de apoptose.

Em uma modalidade específica, o composto conservante de órgão é solução UW (descrita na patente U.S. 4.798.824; também conhecida como ViaSpan; ver também Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990)) ou uma solução descrita em Stem et al., patente U.S. 5.552.267. Em uma outra

7O . modalidade, o dito composto conservante de órgão é amido de hidroxietila, ácido lactobiônico, rafinose ou uma combinação destes. Em uma outra í modalidade, a composição de coleta de célula compreende adicionalmente um * perfluorcarbono que carrega oxigênio, tanto em duas fases quanto como uma , 5 emulsão.

Em uma outra modalidade do método, as células aderentes derivadas do âmnio são colocadas em contato com uma composição de coleta de célula compreendendo um inibidor de apoptose e perfluorcarbono que carrega oxigênio, composto conservante de órgão, ou combinação destes, durante a perfusão. Em uma outra modalidade, as células aderentes derivadas do âmnio são colocadas em contato com uma composição de coleta de célula como esta durante um processo de rompimento tecidual, por exemplo, digestão enzimática de tecido de âmnio. Em uma outra modalidade, as células Ú aderentes derivadas do âmnio são colocadas em contato com o dito composto * 15 de coleta de célula após a coleta por rompimento tecidual, por exemplo, digestão enzimática de tecido de âmnio.

Tipicamente, durante a coleta de células aderentes derivadas do âmnio, enriquecimento e isolamento, é preferível minimizar ou eliminar o estresse celular em virtude da hipóxia e estresse mecânico. Em uma outra modalidade do método, portanto, uma célula aderente derivada de âmnio, ou população de células compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio, é exposta a uma condição hipóxica durante a coleta, enriquecimento ou isolamento por menos de seis horas durante a dita conservação, em que uma condição hipóxica é uma concentração de oxigênio que é, por exemplo, menor que a concentração normal de oxigênio atmosférico; menor que a concentração normal de oxigênio no sangue ou similares. Em uma modalidade mais específica, as ditas células ou população das ditas células são expostas à dita condição hipóxica por menos de duas horas durante a dita conservação. Em uma outra modalidade mais específica, as ditas células ou rá . população das ditas células são expostas à dita condição hipóxica por menos de uma hora, ou menos de trinta minutos, ou não são expostas à uma condição " hipóxica, durante a coleta, enriquecimento ou isolamento. Em uma outra & modalidade específica, a dita população de células não é exposta ao estresse . 5 — porcisalhamento durante a coleta, enriquecimento ou isolamento.

As células aderentes derivadas do âmnio podem ser crioconservadas, em geral ou pelos métodos específicos aqui revelados, por exemplo, em meio de criopreservação em recipientes pequenos, por exemplo, ampolas. O meio de criopreservação adequado inclui, mas sem limitação, meio de cultura incluindo, por exemplo, meio de crescimento, ou meio de congelamento celular, por exemplo, meio de congelamento celular disponível comercialmente, por exemplo, meio de congelamento celular identificado pelos números de catálogo da SigmaAldrich C2695, C2639 (Meio de Ú congelamento celular sem soro 1X, não contendo DMSO) ou C6039 (Meio de * 15 congelamento celular-glicerol 1X contendo meio enssencial mínimo, glicerol, soro fetal bovino e soro bovino), meio Lonza PROFREEZE'N 2x, metilcelulose, dextran, albumina sérica humana, soro fetal bovino, soro fetal ou plasmalite. O meio de criopreservação compreende preferivelmente DMSO (dimetilsulfóxido) ou glicerol, em uma concentração, por exemplo, de cercade 1% a cerca de 20 %, por exemplo, cerca de 5 % a 10 % (v/v), incluindo opcionalmente soro fetal bovino ou soro humano. O meio de criopreservação pode compreender agentes adicionais, por exemplo, metilcelulose e/ou glicerol. As células aderentes derivadas do âmnio isoladas são preferivelmente resfriadas em cerca de | ºC/min durante a — crioconservação. Uma temperatura de crioconservação preferida é cerca de - 80 ºC a cerca de -180 ºC, preferivelmente cerca de -125 ºC a cerca de -140 ºC. As células crioconservadas podem ser transferidas para a fase de vapor do nitrogênio líquido antes do descongelamento para uso. Em algumas modalidades, por exemplo, uma vez que as ampolas atingiram cerca de -80

. ºC, elas são transferidas para uma área de armazenamento de nitrogênio líquido. A crioconservação também pode ser realizada usando um congelador Í com taxa controlada. As células crioconservadas são preferivelmente C descongeladas em uma temperatura de cerca de 25 ºC a cerca de 40 “ºC, - 5 preferivelmente em uma temperatura de cerca de 37 ºC.

PRODUÇÃO DE UM BANCO DE CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS

DO ÂMNIO As células aderentes derivadas do âmnio podem ser cultivadas em inúmeras maneiras diferentes para produzir um conjunto de lotes, por exemplo, um conjunto de doses individualmente administradas, de tais células. Os conjuntos de lotes de células amnióticas angiogênicas, obtidos de uma pluralidade de placentas, podem ser arranjados em um banco de células, por exemplo, para armazenamento a longo prazo. Em geral, as células S aderentes derivadas do âmnio são obtidas de uma cultura inicial de células * 15 —paraformar uma cultura original, que é prolongada em condições prolongadas para formar populações de células de números aproximadamente equivalentes da duplicação. Os lotes são preferivelmente derivados do tecido de uma única placenta, mas podem ser derivados do tecido de uma pluralidade de placentas. Em uma modalidade não limitante, os lotes ou doses de células "— aderentes derivadas do âmnio são obtidos da maneira a seguir. O tecido de âmnio é primeiro rompido, por exemplo, digerido da maneira descrita na seção 5.4.3 anterior usando tripsina sérica e digestões de colagenase. As células do tecido digerido com colagenase são cultivadas, por exemplo, por cerca de 1-3 semanas, preferivelmente cerca de 2 semanas. Após a remoção — das células não aderentes, as colônias de alta densidade que formam são coletadas, por exemplo, por tripsinização. Estas células são coletadas e re- suspensas em um volume conveniente de meio de cultura, e definidas como células de passagem 0. As células de passagem 0 podem então ser usadas para semear

. as culturas de expansão. As culturas de expansão podem apresentar qualquer disposição de aparelhos de cultura de célula separada, por exemplo, uma S fábrica de célula para NUNCTWY, As células na cultura de passagem 0 podem F ser subdivididas em qualquer grau de maneira a semear as culturas de * 5 expansãocom, por exemplo, 1x 10, 2x10,3x10%,4x10%,5x10%,6x 10, 7 x 10%, 8 x 10º, 9 x 10%, 1 x 10%, 1 x 10%, 2x 10%, 3 x 10º, 4 x 10%, 5 x 10%, 6 x 10%, 7 x 10%, 8 x 10%, 9 x 10%, ou 10 x 10º células aderentes. Preferivelmente, de cerca de 1 x 10º a cerca de 3 x 10º células de passagem O são usadas para semear cada cultura de expansão. O número de culturas de expansão pode depender do número de células de passagem 0, e pode ser maior ou menor em número dependendo da(s) placenta(s) particular(s), a partir da qual(s) as células aderentes são obtidas. As culturas de expansão podem então crescer até que a VW densidade de células na cultura atinja um certo valor, por exemplo, cerca de 1 * 15 x10 células/ocm?. As células podem ser tanto coletadas e crioconservadas neste ponto, quanto passadas em novas culturas de expansão da maneira descrita anteriormente. As células podem ser passadas, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 vezes antes do uso. Um registro do número cumulativo de duplicações da população é preferivelmente mantido durante a(s) cultura(s) de expansão. As células de uma cultura de passagem 0 podem ser expandidas por 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou 40 duplicações, ou até 60 duplicações. Preferivelmente, entretanto, o número de duplicações da população, antes de dividir a população de células em doses individuais, está — entrecercade 15 e cerca de 30 duplicações. As células podem ser cultivadas continuamente em todo o processo de expansão, ou podem ser congeladas em um ou mais pontos durante a expansão.

As células a serem usadas para doses individuais podem ser congeladas, por exemplo, crioconservadas para uso posterior. As doses

: individuais podem compreender, por exemplo, cerca de 1 milão a cerca de 50 milhões de células por mL, e podem compreender entre cerca de 10º e cerca

' de 10º células no total. ” Em uma modalidade, portanto, um banco de células - 5 — compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio podem ser preparados por um método compreendendo: expandir a cultura primária de células aderentes derivadas do âmnio de uma placenta pós-parto humana para uma primeira pluralidade de duplicações da população; crioconservar as células para formar um banco principal de células; expandir opcionalmente uma pluralidade das células do banco principal de células para uma segunda Pluralidade de duplicações da população; crioconservar as células expandidas para formar um banco operacional de células; expandir opcionalmente uma Pluralidade das células aderentes derivadas do âmnio expandidas do banco ' operacional de células para uma terceira pluralidade de duplicações da * 15 população; e crioconservar as células expandidas resultantes em doses individuais, em que as ditas doses individuais compõem coletivamente um banco de células.

O banco pode compreender doses, ou lotes, apenas de células aderentes derivadas do âmnio, ou podem compreender uma combinação de lotes de células aderentes derivadas do âmnio e lotes ou doses —deum outro tipo de célula, por exemplo, um outro tipo de célula tronco ou progenitora.

Preferivelmente, cada dose individual compreende apenas células aderentes derivadas do âmnio.

Em uma outra modalidade específica, todas as ditas células na dita cultura primária são da mesma placenta.

Em uma outra modalidade específica, as ditas doses individuais compreendem de cerca de 10º a cerca de 10º células.

Em uma outra modalidade específica, as ditas doses individuais compreendem de cerca de 10º a cerca de 107 células.

. Em uma outra modalidade específica, as ditas doses individuais compreendem de cerca de 10º a cerca de 10º células. Em uma outra modalidade específica, as ditas doses individuais compreendem de cerca de 10º a cerca de 10"º * células.

. 5 Em certas modalidades, as células aderentes derivadas do âmnio podem ser descongeladas a partir de um banco operacional de células e cultivadas para uma pluralidade de duplicações da população. Quando um número desejado de células é gerado, ou um número desejado de duplicações da população ocorre, as células aderentes podem ser coletadas, por exemplo, por centrifugação, e re-suspensas em uma solução compreendendo, por exemplo, dextran, por exemplo, dextran 5 %. Em certas modalidades, o dextran é dextran-40. Em certas modalidades, as células são coletadas em um segundo período e re-suspensas em uma solução compreendendo dextran e É um crioconservante, por exemplo, uma solução de dextran 5 % (por exemplo, * 15 dextran40) compreendendo HSA 10 % e 2 %-20 %, por exemplo, DMSO 5 %, e crioconservadas. As células crioconservadas aderentes derivadas do âmnio podem ser descongeladas, por exemplo, imediatamente antes do uso.

Em uma modalidade preferida, a doadora a partir da qual a placenta é obtida (por exemplo, a mãe) é testada com relação a pelo menos um patógeno. Em certas modalidades, se a mãe é positiva para um patógeno testado, todo o lote da placenta é descartado. Um teste com oeste pode ser realizado a qualquer momento durante a produção de lotes de células aderentes derivadas do âmnio, incluindo antes ou após o estabelecimento de células de passagem 0, ou durante a cultura de expansão. Patógenos para os —quaisa presença é testada podem incluir, sem limitação, vírus da hetatite A, hetatite B, hetatite C, hetatite D, hetatite E, da imunodeficiência humana (tipos I e II), citomegalovírus, herpesvírus e similares.

USOS DE CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS DO ÂMNIO São aqui fornecidas composições que compreendem células

. aderentes derivadas do âmnio. Exemplos de tais composições incluem composições farmacêuticas (ver seção 5.8.1 a seguir); matrizes e estruturas ' (ver seção 5.8.2 a seguir), e meios condicionados por células aderentes . derivadas do âmnio (ver seção 5.8.3 a seguir).

. 5 Composições que compreendem células aderentes derivadas do âmnio Em certas modalidades, as células aderentes derivadas do âmnio estão contidas, ou são componentes, em uma composição farmacêutica. As células podem ser preparadas de uma forma que é facilmente —administrável a um indivíduo, por exemplo, células aderentes derivadas do âmnio que estão contidas em um recipiente que é adequado para uso médico. Um recipiente como este pode ser, por exemplo, uma seringa, sacola plástica estéril, frasco, jarra, ou outro recipiente a partir do qual a população de célula angiogênica derivada de âmnio pode ser facilemente dispensada. Por ; 15 exemplo,orecipiente pode ser uma sacola de sangue ou outro plástico, sacola ç aceitável pela equipe médica adequada para a administração intravenosa de um líquido em um recipiente. O recipiente, em certas modalidades, é aquele que permite a crioconservação das células. As células nas composições, por exemplo, composições farmacêuticas aqui fornecidas, podem compreender células aderentes derivadas do âmnio derivado de um único doador, ou de múltiplos doadores. As células podem ser completamente combinadas pelo HLA em um recipiente pretendido, ou parcial ou completamente combinadas pelo HLA. Assim, em uma modalidade, as células aderentes derivadas do —âmnio nas composições aqui fornecidas são administradas a um indivíduo, que necessita destas, na forma de uma composição compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio em um recipiente. Em uma outra modalidade específica, o recipiente é uma sacola, frasco ou jarra. Em modalidade mais específica, a dita sacola é uma sacola plástica estéril. Em uma modalidade

T7 ' mais específica, a dita sacola é adequada para permitir ou facilitar a administração intravenosa das ditas células aderentes, por exemplo, por : infusão intravenosa, injeção em bolo ou similares. À sacola pode " compreender lúmens ou compartimentos múltiplos que são interconectados “ 5 para permitira mistura das células e uma ou mais de outras soluções, por exemplo, um medicamento, antes ou durante a administração. Em uma outra modalidade específica, antes da crioconservação, a solução compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio compreende um ou mais compostos que facilitam a crioconservação das células. Em uma outra modalidade específica, as ditas células aderentes derivadas do âmnio são contidas em uma solução aquosa fisiologicamente aceitável. Em uma modalidade mais específica, a dita solução aquosa fisiologicamente aceitável é uma solução de NaCl a 0,9 %.

Em uma outra modalidade específica, as ditas células aderentes derivadas do âmnio compreendem células placentárias que são combinadas pelo HLA em * 15 umrecipiente das ditas células. Em uma outra modalidade específica, as ditas ' células aderentes derivadas do âmnio compreendem células que são pelo menos parcialmente combinadas pelo HLA em um recipiente das ditas células. Em uma outra modalidade específica, as ditas células aderentes derivadas do âmnio são derivadas de uma pluralidade de doadores. Em várias modalidades específicas, o dito recipiente compreende cerca de, pelo menos, ou no máximo 1 x 10º das ditas células, 5 x 10º das ditas células, 1 x 10º das ditas células tronco, 5 x 107 das ditas células, 1 x 10º das ditas células, 5 x 10º das ditas células, 1 x 10º das ditas células, 5 x 10º das ditas células, ou 1 x 10'º das ditas células. Em outras modalidades específicas de quaisquer das — populações crioconservadas precedentes, as ditas células foram passadas cerca de, pelo menos, ou não mais que 5 vezes, não mais que 10 vezes, não mais que 15 vezes, ou não mais que 20 vezes. Em uma outra modalidade específica de quaisquer das células crioconservadas precedentes, as ditas células foram expandidas no dito recipiente. Em modalidades específicas,

. uma dose única de células aderentes derivadas do âmnio podem compreender, em várias modalidades, cerca de, pelo menos, ou não mais que 1 x 10,5 x : 10%, 1x 106, 5 x 106, 1x 10, 5 x 10, 1 x 105, 5x 1085, 1x 10º, 5x 10%, 1 x as 10,5 x 10", 1 x 10" ou mais células aderentes derivadas do âmnio.

í 5 Em certas modalidades, as composições farmacêuticas aqui fornecidas compreendem populações de células aderentes derivadas do âmnio que compreendem 50 % de células viáveis ou mais (isto é, pelo menos 50 % das células na população são funcionais ou vivas). Preferivelmente, pelo menos 60 % das células na população são viáveis. Mais preferivelmente, pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % das células na população na composição farmacêutica são viáveis. Matrizes que compreendem as células aderentes derivadas do âmnio Adicionalmente, são aqui fornecidas composições que * 15 compreendem matrizes, hidrogéis, estruturas e similares. Tais composições : podem ser usadas no lugar, ou em adição a, de tais células em suspensão líquida.

A matriz pode ser, por exemplo, um tecido decelularizado permanente ou degradável, por exemplo, uma membrana amniótica —decelularizada ou uma matriz sintética. O matriz pode ser uma estrutura tridimensional. Em uma modalidade mais específica, a dita matriz compreende colágeno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina, ou vitronectina. Em uma outra modalidade mais específica, a matriz é uma membrana amniótica ou um biomaterial derivado da membrana amniótica.

Em uma outra modalidade mais específica, a dita matriz compreende uma proteina de membrana extracelular. Em uma outra modalidade mais específica, a dita matriz compreende um composto sintético. Em uma outra modalidade mais específica, a dita matriz compreende um composto bioativo.

Em uma outra modalidade mais específica, o dito composto bioativo é um

' fator de crescimento, uma citocina, um anticorpo ou uma molécula orgânica de menos de 5.000 daltons.

: As células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas podem

7. ser semeadas em uma matriz natural, por exemplo, um biomaterial : 5 — placentário, tal como um material de membrana amniótica. Um material de membrana amniótica como este pode ser, por exemplo, membrana amniótica dissecada diretamente de uma placenta de mamífero; membrana amniótica fixa ou tratada pelo calor, membrana amniótica substancialmente seva (isto é, <20 % de H,O), membrana coriônica, membrana coriônica substancialmente — seca, membrana amniótica e coriônica substancialmente seca e similares. Os biomateriais placentários preferidos, nos quais as células aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas podem ser semeadas, são descritos em Hariri, pedido de publicação U.S. 2004/0048796, cuja revelação é aqui incorporada pela referência na sua íntegra.

“ 15 Em uma outra modalidade específica, a matriz é uma . composição compreendendo uma matriz extracelular. Em uma modalidade mais específica, a dita composição é MATRIGEL'TY (BD Biosciences). As células aderentes derivadas do âmnio isoladas aqui descritas podem ser suspensas em uma solução de hidrogel adequada, por exemplo, para injeção. O hidrogel é, por exemplo, um polímero orgânico (natural ou sintético) que é reticulado por meio de ligações covalentes, iônicas ou de hidrogênio para criar uma estrutura tridimensional de malha aberta que captura moléculas de água para formar um gel. Os hidrogéis adequados para tais composições incluem peptídeos auto-montáveis, tal como RAD 16. Em uma modalidade, uma solução de hidrogel compreendendo as células pode endurecer naturalemte, por exemplo em um molde, para formar uma matriz com células dispersas nela para implantação. As células aderentes derivadas do âmnio em uma matriz como esta também podem ser cultivadas de maneira tal que as células sejam mitoticamente expandidas, por exemplo, antes da

. implantação. Os materiais que formam hidrogéis incluem polissacarídeos tais como alginato e sais destes, peptídeos, polifosfazinas e poliacrilatos, que são 7 ionicamente reticulados, ou polímeros bloco, tais como copolímeros bloco de ” polietileno óxido-polipropileno glicol, que são reticulados por temperatura ou : 5 pH, respectivamente. Em algumas modalidades, o hidrogel ou matriz é biodegradável.

Em certas modalidades, as composições que compreendem células aqui fornecidas, compreendem um gel polimerizável in situ (ver, por exemplo, publicação do pedido de patente U.S. 2002/0022676; Anseth et al., DJ. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003). Em algumas modalidades, os polímeros são pelo menos parcialmente solúveis em soluções aquosas, tais como água, soluções tamponadas com sal ou soluções alcóolicas aquosas, que carregam grupos laterais, ou um sal iônico monovalente destes. Exemplos de polímeros com * 15 grupos laterais acídicos que podem ser reagidos com cátions são : poli(fosfazenos), ácidos poli(acrílicos), ácidos poli(metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico e ácido metacrílico, acetato de poli(vinila) e polímeros sulfonados, tal como poliestireno sulfonado. Os copolímeros com grupos materias acídicos formados por reação de ácido acrílico ou metacrílico e —monômeros ou polímeros de vinil éter também podem ser usados. Exemplos de grupos acídicos são grupos de ácido carboxílico, grupos de ácido sulfônico, grupos alcoólicos halogenados (preferivelmente fluorados), grupos OH fenólicos, e grupos OH acídicos.

Em uma modalidade específica, a matriz é um feltro que pode ser composto de um fio de multifilamentos feito de um material bioabsorvível, por exemplo, copolímeros ou blendas PGA, PLA, PCL, ou ácido hialurônico. O fio é preparado em um feltro usando técnicas de processamento têxteis padrões que consistem em dobrar, cortar, cardar e costurar. Em uma outra modalidade preferida, as células da invenção são

' semeadas em estruturas do tipo espuma, que podem ser estruturas compostas. Além do mais, a estrutura tridimensional pode ser moldada em uma forma : utilizável, tal como uma estrutura específica no corpo a ser reparado, * substituído ou aumentado. Outros exemplos de estruturas que podem ser “ 5 usadas incluem esteiras não tecidas, espumas porosas, ou peptídeos auto : montáveis. As esteiras não tecidas podem ser formadas usando fibras compreendidas de um copolímero absorvível sintético de ácidos glicólico e lático (por exemplo, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N. J.). As espumas compostas de, por exemplo, copolímero poli(e- —caprolactona)/ácido poli(glicólico) (PCL/PGA), formadas por processos tal como secagem por congelamento ou liofilização (ver, por exemplo, patente U.S. 6.355.699), também podem ser usadas como estruturas. As células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas podem ser semeadas em uma estrutura ou andaime tridimensional e implantadas in * 15 vivo. Uma estrutura como esta pode ser implantada em combinação com . qualquer um ou mais fatores de crescimento, células, medicamentos ou outros componentes destes, por exemplo, formação tecidual estimulada, por exemplo, formação óssea ou formação de vasculatura.

As células placentárias aderentes derivadas do âmnio aqui — fornecidas, em uma outra modalidade, podem ser semeadas em estruturas de espuma que podem ser estruturas compostas. Tais estruturas de espuma podem ser moldadas em uma forma utilizável, tal como aquela de uma porção de uma estrutura específica no corpo a ser reparado, substituído ou aumentado. Em algumas modalidades, a estrutura é tratada, por exemplo, com — ácido acético 0,IM seguido por incubação em polilisina, PBS e/ou colágeno, antes da inoculação das células afim de melhorar a anexação celular. As superfícies externas de uma matriz podem ser modificadas para melhorar a anexação ou crescimento de células e diferenciação de tecido, tal como revestimento com plasma da matriz, ou adição de uma ou mais proteínas (por

B exemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteínas, glicosaminoglicanos (por exemplo, sulfato de heparina, sulfato de Í condroitina-4, sulfato de condroitina-6, sulfato de dermatano, sulfato de *% queratina, etc.), uma matriz celular, e/ou outros materiais tais como, mas sem e 5 — limitação, gelatina, alginatos, ágar, agarose, e gomas de planta e similares. Em algumas modalidades, a matriz compreende, ou é tratada com, materiais que tornam-a não trombogênica. Estes tratamentos e materiais também podem promover e sustentar o crescimento endotelial, migração e deposição de matriz extracelular. Exemplos destes materiais e tratamentos incluem, mas sem limitação, materiais naturais, tais como proteínas de membrana basal, tais como laminina e colágeno tipo IV, materiais sintéticos tal como EPTFE, e silicones de poliuretanouréia segmentados tal como PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Califórnia). À matriz também pode compreender anti-thrombotic agentes anti-trombóticos - 15 tal como heparina; as estruturas também podem ser tratadas para alterar a Ú carga da superfície (por exemplo, revestimento com plasma) antes de semear com as células aderentes aqui fornecidas. A estrutura pode ser tratada antes da inoculação das células aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas a fim de melhorar a anexação

20. celular. Por exemplo, antes da inoculação com as células da invenção, as matrizes de náilon podem ser tratadas com ácido acético 0,1 molar e incubadas em polilisina, PBS e/ou colágeno para revestir o náilon. O poliestireno pode ser tratado de maneira similar usando ácido sulfúrico. Além do mais, as superfícies externas da estrutura tridimensional podem ser modificadas para melhorar a anexação ou crescimento de células e diferenciação de tecido, tal como revestimento com plasmas da estrutura ou adição de uma ou mais proteínas (por exemplo, colágenos, “fibras elásticas, fibras reticulares),) glicoproteínas, glicosaminoglicanos (por exemplo, sulfato de heparina, sulfato de

: condroitina-4, sulfato de condroitina-6, sulfato de dermatano, sulfato de queratina), uma matriz celular, e/ou outros materiais tais como, mas sem ' limitação, gelatina, alginatos, ágar, agarose, ou gomas de planta. f Em algumas modalidades, a matriz compreende ou é tratada « 5 commateriaisque tornam a matriz não trombogênica, por exemplo, materiais : naturais tais como proteínas de membrana basal, tais como laminina e colágeno tipo IV, e materiais sintéticos tal como ePTFE ou silicones de poliuretanouréia segmentados tal como PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Califómia). Tais materiais podem ser tratados — adicionalmente para tornar a estrutura não trombogênica, por exemplo, com i heparina, e com tratamentos que alteram a carga superficial do material, tal como revestimento com plasma.

As composições celulares terapêuticas que compreendem células aderentes derivadas do âmnio também podem ser fornecidas na forma - 15 de um complexo matriz-célula. As matrizes podem incluir estruturas D biocompatíveis, material reticulado, estruturas auto montáveis e similares, que bioabsorvíveis ou não, líquida, gel ou sólida. Tais matrizes são conhecidas na técnica de tratamento celular terapêutico, reparo cirúrgico, modificação genética do tecido e cicatrização de ferida. Em certas modalidades, as células se aderem à matriz. Em outras modalidades, as células são capturadas ou contidas em espaços de matriz. São mais preferidas aqueles complexos matriz-célula, nos quais as células crescem em associação próxima com a matriz e quando usadas terapeuticamente, estimulam e auxiliam a estagnação de células em um recipiente, ou estimulam ou auxiliam a angiogênese. As — composições matriz-célula podem ser introduzidas no corpo de um indivíduo de qualquer maneira conhecida na técnica incluindo, mas sem limitação, implantação, injeção, anexação cirúrgica, transplante com outro tecido, injeção e similares. Em algumas modalidades, as matrizes se formam in vivo ou in situ. Por exemplo, os géis polimerizáveis in situ podem ser usados de

. acordo com a invenção. Exemplos de tais géis são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as células aqui fornecidas são í semeadas em tais matrizes tridimensionais, tal como estruturas, e implantadas - in vivo, onde as células semeadas podem proliferar na estrutura ou sobre ela ] 5 —ouauxiliarno estabelecimento do tecido de substituição in vivo com ou sem a - cooperação de outras células. O crescimento das células aderentes derivadas do âmnio ou co-culturas destas na estrutura tridimensional resulta preferivelmente na formação de um tecido tridimensional, ou base deste, que pode ser utilizado in vivo, por exemplo, para reparo de tecido danificado ou — doente. Por exemplo, as estruturas tridimensionais podem ser usadas para formar estruturas tubulares, por exemplo, para uso no reparo de vasos sanguíneos; ou aspectos do sistema circulatório ou estruturas coronárias. De acordo com um aspecto da invenção, as células aderentes derivadas do âmnio, ou co-culturas destes, são inoculadas ou semeadas em uma estrutura ou matriz 7 15 tridimensional, tal como uma estrutura, uma espuma ou hidrogel. A estrutura p pode ser configurada em várias formas, tal como em geral plana, em geral cilíndrica ou tubular, ou pode ser completamente sem forma, como pode ser exigido ou desejado para a estrutura corretiva em consideração. Em algumas modalidades, as células aderentes derivadas do âmnio crescem na estrutura tridimensional, enquanto em outras modalidades as células apenas sobrevivem, ou mesmo morrem, mas estimulam ou promovem a estagnação de novo tecido ou vascularização em um recipiente.

As células da invenção podem ser crescidas livremente na cultura, removidas da cultura e inoculadas em uma estrutura tridimensional. À — inoculação da estrutura tridimensional com uma concentração de células, por exemplo, aproximadamente 10º a 5 x 10º células per mililitro, preferivelmente resulta no estabelecimento do suporte tridimensional em períodos de tempo relativamente menores. Além do mais, em algumas pedidos, pode ser preferivelmente para usar um maior ou menor número de células, dependendo

. do resultado desejado. Em uma modalidade específica, a matriz pode ser cortada em í uma fita (por exemplo, de forma retangular), a partir da qual a largura é . aproximadamente igual à circunferência interna de um órgão tubular, em que Í 5 — será finalmente inserida. As células aderentes derivadas do âmnio podem ser , inoculadas na estrutura e incubadas flutuando ou suspendendo em meios líquidos. No estágio apropriado de confluência, a estrutura pode ser rolada em um tubo unindo as extremidades longas juntas. A emenda pode então ser fechada suturando as duas extremidades juntas usando fibras de um material adequado de um diâmetro apropriado. A fim de prevenir que as células fechem o o lúmen, uma das extremidades abertas da estrutura tubular pode ser fixa a um bocal. Os meios líquido podem ser forçados através do bocal a partir de uma câmara fonte conectada à câmara de incubação para criar uma corrente através do interior da estrutura tubular. A outra extremidade da * 15 abertura pode ser fixa para um abertura de saída de fluxo que conduz em uma . câmara de coleta a partir da qual os meios podem ser re-circulados através da câmara fonte. O tubo pode ser desconectado do bocal e da abertura da saída de fluxo quando a incubação estiver completa. Ver, por exemplo, pedido internacional WO 94/25584.

Em geral, duas estruturas tridimensionais podem ser combinadas em um tubo de acordo com a invenção usando quaisquer dos métodos a seguir. Duas ou mais estruturas planas podem ser depositadas uma sobre a outra e suturadas juntas. A lâmina de duas camadas resultante pode então ser rolada e, da maneira descrita anteriormente, unida e segura. Em certas modalidades, uma estrutura tubular que é funciona como a camada interna pode ser inoculada com células aderentes derivadas do âmnio e incubada. Uma segunda estrutura pode ser crescida como uma fita plana com largura um pouco maior que a circunferência externa da estrutura tubular. Após o crescimento apropriado ser obtido, a estrutura plana recobre o lado de

. fora da estrutura tubular, seguido pelo fechamento da costura das duas extremidades da estrutura plana e garantindo a estrutura plana na parte interna ' do tubo. Em uma outra modalidade, duas ou mais malhas tubulares com x. diâmetros pouco diferente podem ser crescidas separadamente. A estrutura : 5 —comomenor diâmetro pode ser inserida dentro da maior e mantida. Para cada - um destes métodos, mais camadas podem ser adicionadas reaplicando o método no tubo de camada dupla. As estruturas podem ser combinadas em qualquer estágio de crescimento das células aderentes derivadas do âmnio, e a incubação das estruturas combinadas pode continuar quando desejável.

Junto com as anteriores, as células e composições terapêuticas aqui fornecidas podem ser usadas junto com dispositivos implantáveis. Por exemplo, as células aderentes derivadas do âmnio podem ser co-administradas com, por exemplo, endoproteses esxasíveis, válvulas artificiais, dispositivos de assistência ventricular, bobinas destacáveis de Guglielmi e similares.

7 15 Como os dispositivos podem constituir a terapia dominante fornecida a um ' indivíduo que necessita de tal terapia, as células e similares podem ser usadas como suporte ou terapia secundária para auxiliar, estimular ou promover cicatrização adequada na área do dispositivo implantado. As células e composições terapêuticas da invenção também podem ser usadas para pré- tratar certos dispositivos implantáveis para minimizar problemas quando eles são usados in vivo. Tais dispositivos pré-tratados, incluindo dispositivos de revestimento, podem ser melhor tolerados por pacientes que recembem os mesmos, com menor risco de infecção local ou sistêmica ou, por exemplo, restenose ou oclusão adicional de vasos sanguíneos.

Meios condicionados por células aderentes derivadas do âmnio Adicionalmente é aqui fornecido o meio que foi condicionado por células aderentes derivadas do âmnio, isto é, meio compreendendo uma ou mais biomoléculas secretadas ou excretadas pelas células aderentes. Em várias modalidades, o meio condicionado compreende o meio no qual as

D células foram crescidas por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais dias, ou por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, í 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 duplicações da população, ou mais. Em outras *. modalidades, o meio condicionado compreende o meio no qual as células — aderentes derivadas do âmnio foram crescidas em pelo menos 30 %, 40 %, 50 V %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % de confluência, ou até 100 % de confluência. O meio condicionado com este pode ser usado para auxiliar a cultura de uma população de células, por exemplo, células tronco, por exemplo, células tronco derivadas da placenta, células tronco embrionárias, células —germinativas embrionárias, células tronco do adulto ou similares. Em uma outra modalidade, o meio condicionado compreende o meio no qual as células aderentes derivadas do âmnio, e células que não são células aderentes derivadas do âmnio, foram cultivadas juntas. O meio condicionado pode compreender as células aderentes * 15 aqui fornecidas. Assim, é aqui fornecida uma cultura de célula y compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio. Em uma modalidade específica, o meio condicionado compreende uma pluralidade, por exemplo, uma população, de células aderentes derivadas do âmnio.

CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS DO ÂMNIO MODIFICADAS Células aderentes derivadas do âmnio geneticamente modificadas Em um outro aspecto, as células aderentes derivadas do âmnio aqui descritas pode ser geneticamente modificadas, por exemplo, para produzir um ácido nucléico ou polipeptídeo de interesse, ou para produzir uma célula diferenciada, por exemplo, uma célula osteogênica, célula miocítica, célula pericítica ou célula angiogênica, que produz um ácido nucléico ou polipeptídeo de interesse. Por exemplo, as células aderentes derivadas do âmnio podem ser modificadas para produzir fatores angiogênicos, tais como moléculas proangiogênicas, fatores solúveis e

; receptores ou moléculas pró-migratórias tais como quimiocinas, por exemplo, fator 1 derivado de célula estromal (SDF-I) ou receptores de quimiocina. À Í modificação genética pode ser realizada, por exemplo, usando vetores a base *. de vírus incluindo, mas sem limitação, vetores de replicação não integrantes, : 5 — por exemplo, vetores de papiloma vírus, vetores SV40, vetores adenovirais; " vetores virais integrantes, por exemplo, vetor de retrovírus ou vetores virais associados a adeno ou vetores virais defectivos de replicação. Outros métodos de introduzir DNA nas células incluem o uso de lipossomos, eletroporação, uma arma de partícula, injeção direta de DNA ou similares.

As células aderentes aqui fornecidas podem ser, por exemplo, transformadas ou transfectadas com DNA controlado, ou em associação operacional com, por um ou mais elementos de controle de expressão apropriado, por exemplo, sequências promotoras ou melhoradoras, finalizadores de transcrição, sítios de poliadenilação, sítios de entrada * 15 ribossomal interna. Preferivelmente, um DNA como este incorpora um í marcador selecionável. Após a introdução do DNA estrangeiro, as células aderentes geneticamente modificadas podem ser, por exemplo, crescidas em meios enriquecidos e então trocadas para meios seletivos. Em uma modalidade, o DNA usado para modificar uma célula aderente derivada de âmnio compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse, por exemplo, uma citocina, fator de crescimento, agente de diferenciação ou polipeptídeo terapêutico.

O DNA usado para modificar a célula aderente pode compreender qualquer promotor conhecido na técnica para direcionar a expressão de uma sequência de nucleotídeos em célula de mamíferos, por exemplo, células humanas. Por exemplo, os promotores incluem, mas sem limitação, promotor/melhorador de CMV, promotor de SV40, promotor de papilomavírus, promotor do vírus Epstein-Barr, promotor do gene elastina e similares. Em uma modalidade específica, o promotor é regulável de maneira

' tal que a sequência de nucleotídeos seja expressa apenas quando desejado. Os promotores podem ser tanto indutíveis (por exemplo, aqueles associados com S metalotioneina e proteínas do choque térmico) quanto constitutivos. . Em uma outra modalidade específica, o promotor é específico * 5 paratecido ou exibe especificidade tecidual. Exemplos de tais promotores - incluem, mas sem limitação, região de controle de gene de duas cadeias leves de miosina (Shani, 1985, Nature 314:283) (músculos esquelético).

As células aderentes derivadas do âmnio aqui reveladas podem ser modificadas por engenharia ou selecionadas de outra forma para "neutralizar" ou "diminuir" a expressão de um ou mais genes em tais células. A expressão de um gene natural em uma célula pode ser diminuída, por exemplo, por inibição da expressão inativando o gene completamente, por exemplo, por recombinação homóloga. Em uma modalidade, por exemplo, um exon que codifica uma região importante da proteína, ou um exon 5' nesta * 15 região, é interrompido por um marcador selecionável positivo, por exemplo, . neo, que previne a produção de RNAm normal do gene alvo e que resulta na inativação do gene. Um gene também pode ser inativado criando uma deleção em parte de um gene ou deletando todo o gene. Usando um construto com duas regiões de homologia para o gene alvo que estão muito a parte no genoma, as sequências de intervenção das duas regiões podem ser deletadas (Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084). Moléculas anti-sentido, morfolinos, DNAzimas, RNA de interferência pequenos, RNA em grampo pequeno e moléculas de ribozima que inibem a expressão do gene alvo também podem ser usadas para reduzir o nível da atividade do gene alvo nas células aderentes. Por exemplo, móleculas de RNA anti-sentido que inibem a expressão dos principais complexos de gene de histocompatibilidade (HLA) mostraram ser mais versáteis com relação às resposta imunes. As moléculas de três hélices podem ser utilizadas na redução do nível da atividade de gene alvo. Ver, por exemplo, L. G. Davis et al. (eds), 1994,

. BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2nd ed., Appleton &

Lange, Norwalk, Conn., que é aqui incorporada pela referência. ' Em uma modalidade específica, as células aderentes derivadas ” do âmnio aqui reveladas podem ser geneticamente modificadas com uma : 5 —molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos . que codifica um polipeptídeo de interesse, em que a expressão do polipeptídeo de interesse é controlável por um fator exógeno, por exemplo, polipeptídeo, molécula orgânica pequena ou similares.

O polipeptídeo de interesse pode ser um polipeptídeo terapêutico.

Em uma modalidade mais específica, o polipeptídeo de interesse é antagonista do receptor IL- 12 ou interleucina-1 (IL-IRa). Em uma outra modalidade mais específica, o polipeptídeo de interesse é uma fusão do antagonista do receptor de interleucina-1 e di-hidrofolato redutase (DHFR), e o fator exógeno é um antifolato, por exemplo, metotrexato.

Um construto como este é usado na * 15 modificação de células aderentes derivadas do âmnio que expressam IL-IRa, : ou uma fusão de IL-IRa e DHFR, mediante contato com metotrexato.

Um construto como este pode ser usado, por exemplo, no tratamento de artrite reumatóide.

Nesta modalidade, a fusão de ILIRa e DHFR é translacionalmente suprarregulada mediante exposição a um antifolato tal como metotrexato.

Portanto, em uma outra modalidade específica, o ácido nucléico usado para modificar geneticamente uma célula aderente derivada de âmnio pode compreender sequências de nucleotídeos que codificam um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que os ditos primeiro e segundo polipeptídeos são expressos como uma proteína de fusão que é — translacionalmente suprarregulada na presença de um fator exógeno.

O polipeptídeo pode ser expresso de maneira transiente ou a longo prazo (por exemplo, com relação ao curso de semanas ou meses). Uma molécula de ácido nucléico como esta pode compreender adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que permite a seleção positiva

. de células modificadas, ou permite a visualização das células modificadas por engenharia. Em uma outra modalidade mais específica, a sequência de ' nucleotídeos codifica um polipeptídeo que é, por exemplo, fluorescente em ” condições de visualização apropriadas, por exemplo, luciferase (Luc). Em S uma modalidade mais específica, uma molécula de ácido nucléico como esta - pode compreender IL-IRa-DHFR-IRES-Luc, onde IL-IRa é antagonista do receptor de interleucina-1, IRES é um sítio de entrada ribossomal interno e DHFR é di-hidrofolato redutase. Linhagens celulares aderentes derivadas de âmnio imortalizada As células de mamífero aderentes derivadas do âmnio podem ser condicionalmente imortalizada por transfecção com qualquer vetor adequado contendo um gene promotor de crescimento, isto é, um gene que codifica uma proteína que, em condições apropriadas, promove o crescimento da célula transfectada, de maneira tal que a produção e/ou atividade da : 15 proteína promotora de crescimento seja regulável por um fator externo. Em . uma modalidade preferida, o gene promotor de crescimento é um oncogene tais como, mas sem limitação, v-myc, N-myc, c-myc, p53, antígeno T grande de SV40 grande, antígeno T grande de polioma, proteína Ela de adenovírus ou E7 de papilomavírus humano. Em uma outra modalidade, as células — aderentes derivadas do âmnio podem ser imortalizadas usando recombinação cre-lox, da maneira exemplificada para uma linhagem de célula Bº pancreática humana por Narushima, M., et al (Nature Biotechnology, 2005, 23(10:1274" 1282).

A regulação externa da proteína promotora de crescimento — pode ser atingida colocando o gene promotor de crescimento no controle de um promotor regulável externamente, por exemplo, um promotor da atividade que pode ser controlado, por exemplo, modificando a temperatura da célula transfectadas ou a composição do meio em contato com as células. Em uma modalidade, um sistema de expressão de gene controlado por tetraciclina (tet)

, pode ser empregada (ver Gossen et al, Proc.

NaT1. Acad.

ScL USA 89:5547 5551, 1992; Hoshimaru et al, Proc.

NaT1. Acad.

ScL USA 93:1518-1523, S 1996). Na ausência de tet, um transativador controlado por tet (tTA) neste . vetor ativa fortemente a transcrição de phemv+1, um promotor mínimo de : 5 — citomegalovírus humano fundido nas sequências operadoras de tet.

O tTA é - uma proteína de fusão do repressor (tetR) do operon de resistência tet derivado do transposon 10 de Escherichia coli e o domínio acídico de VP16 do vírus herpes simplex.

Concentrações baixas não tóxicas de tet (por exemplo, 0,01-1,0 ug/mL) eliminam quase completamente a transativação por tTA.

Em uma modalidade, o vetor contém adicionalmente um gene que codifica um marcador selecionável, por exemplo, uma proteína que confere resistência ao medicamento.

O gene de resistência bacteriana à neomicina (neo) é um marcador como este que pode ser empregado nos presentes métodos.

As células que carregam neo" podem ser selecionadas por : meios conhecidos pelos versados na técnica, tal como a adição de, por exemplo, 100-200 ug/mL de G418 ao meio de crescimento.

A transfecção pode ser atingida por qualquer de uma variedade de meios conhecidos pelos versados na técnica incluindo, mas sem limitação, infecção retroviral.

Em geral, uma cultura de células pode ser transfectada por incubação com uma mistura de meio condicionado coletado da linhagem celular produtora para o vetor e DMEM/F12 contendo suplementos de N2. Por exemplo, uma cultura de células placentárias preparada da maneira descrita anteriormente pode ser infectada após, por exemplo, cinco dias por incubação in vitro por cerca de 20 horas, em um volume de meio condicionado e dois volumes de DMEM/F12 contendo suplementos de N2. As células transfectadas que carregam um marcador selecionável podem ser selecionadas da maneira descrita anteriormente.

Após a transfecção, as culturas são passadas em uma

, superfície que permite a proliferação, por exemplo, permite pelo menos 30 % das células duplicarem em um período de 24 horas. Preferivelmente, o í substrato é um substrato de poliornitina/laminina, que consiste em plástico . para cultura de tecidos revestido com poliornitina (10 ug/mL) e/ou laminina ? 5 (10 ugmlL), um substrato de polilisina/laminina ou uma superfície tratada - com fibronectina. As culturas são então supridas a cada 3-4 dias com meio de crescimento, que pode ou não ser suplementado com um ou mais fatores melhoradores de proliferação. Os fatores melhoradores de proliferação podem ser adicionados ao meio de crescimento quando as culturas apresentarem menos de 50% de confluência.

As linhagens celulares aderentes derivadas de âmnio imortalizadas de maneira condicional podem ser passadas usando técnicas padrões, tal como tripsinização, quando apresentam 80-95 % de confluência. Até aproximadamente a vigésima passagem, em algumas modalidades, isto é * 15 benéfico para manter a seleção (por exemplo, pela adição de G418 para . células contendo um gene de resistência à neomicina). As células também podem ser congeladas em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

As linhagens celulares clonais podem ser isoladas de uma linhagem celular aderente imortalizada de maneira condicional preparada da maneira descrita anteriormente. Em geral, tais linhagens celulares clonais podem ser isoladas usando técnicas padrões, tal como diluição limite, ou usando anéis de clonagem, e expandidas. As linhagens celulares clonais podem ser em geral nutridas e passadas da maneira descrita anteriormente.

As linhagens celulares aderentes derivadas de âmnio humanas : imortalizadas de maneira condicional, que podem ou não ser clonais, podem ser em geral induzidas à diferenciação suprimindo a produção e/ou atividade da proteína promotora de crescimento em condições de cultura que facilitam a diferenciação. Por exemplo, se o gene que codifica o proteína promotora de

: crescimento estiver no controle de um promotor regulável externamente, as condições, por exemplo, temperatura ou composição de meio, podem ser ' modificadas para suprimir a transcrição do gene promotor de crescimento. - Para o sistema de expressão de gene controlado por tetraciclina discutido ó 5 — anteriormente, a diferenciação pode ser atingida pela adição de tetraciclina - para suprimir a transcrição do gene promotor do crescimento. Em geral, 1 ng/mL de tetraciclina por 4-5 dias é suficiente para iniciar a diferenciação. Para promover a diferenciação adicional, os agentes adicionais podem ser incluídos no meio de crescimento.

MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO CÉLULAS

ADERENTES DERIVADAS DO ÂMNIO Doenças do sistema circulatório As células aderentes derivadas do âmnio, populações de tais células, e populações de células compreendendo as células aderentes * 15 derivadas do âmnio aqui fornecidas, podem ser usadas para tratar indivíduos . que exibem uma variedade de estágio de doença ou condições que se beneficiariam da angiogênese. Exemplos de tais estágio de doença ou condições incluem infarto do miocárdio, acidente vascular, insuficiência cardíaca congestiva, doença de artéria periférica, síndrome do coração esquerdo hipoplástico, úlcera diabética, úlcera de decúbito, úlcera venosa, úlcera arterial, queimadura, não união de fratura, perda óssea associada a tumor, osteoartrite e reparo ósseo maxilofacial. As células aderentes derivadas do âmnio, e populações de tais células, também podem ser usadas para promover a angiogênese em indivíduos que exibem perda de tecido traumático ou prevenir a formação de cicatriz, ou em indivíduos com substituição total de articulação ou prótese dental. Em uma modalidade mais específica, as células aderentes derivadas do âmnio, e populações de tais células aqui fornecidas, podem ser usadas para tratar um indivíduo com uma insuficiência do sistema

, circulatório, por exemplo, e indivíduo com doença vascular periférica ou doença da artéria coronária.

Í Em um aspecto, são aqui fornecidos métodos para tartar um - paciente com uma doença ou lesão cardíaca compreendendo administrar uma r 5 composição celular terapêutica a um paciente com uma doença ou lesão do p coração ou sistema circulatório, e avaliar o paciente com relação a melhorias na função cardíaca, em que a dita composição celular compreende células aderentes derivadas do âmnio da maneira aqui descrita.

Em uma modalidade, a doença cardíaca é uma cardiomiopatia.

Em modalidades específicas, a —cardiomiopatia é tanto idiopática quanto uma cardiomiopatia com uma causa conhecida.

Em outras modalidades específicas, a cardiomiopatia é de natureza tanto isquêmica quanto não isquêmica.

Em outras modalidades, a doença do coração ou sistema circulatório compreende uma ou mais de angioplastia, aneurisma, angina (angina de peito), estenose aórtica, aortite, arritmias, * 15 arteriosclerose, arterite, hipertrofia septal assimétrica (ASH), aterosclerose, ! fibrilação e taquicardia atrial, endocardite bacteriana, síndrome de Barlow (prolapso da vávula mitral), bradicardia, doença de Buerger (tromboangiite obliterante), cardiomegalia, cardiomiopatia, cardite, doença da artéria carótida, coarctação da aorta, congenital doença cardíacas (deficiências cardíacas congênitas), insuficiência cardíaca congestiva (insuficiência cardíaca), doença da artéria coronária, síndrome de Eisenmenger, embolia, endocardite, eritromelalgia, fibrilação, displasia fibromuscular, bloqueio cardíaco, sopro cardíaco, hipertensão, hipotensão, calcificação arterial infantil idiopática, doença de Kawasaki (síndrome do linfonodo mucocutâneo, doença — do linfonodo mucocutâneo, poliarterite infantil), síndrome metabólica, angina microvascular, infarto do miocárdio (ataque cardíaco), miocardite, taquicardia atrial paroxística (PAT), periarterite nodosa (poliarterite, poliarterite nodosa), pericardite, doença vascular periférica, isquemia límbica crítica, vasculopatia diabética, flebite, estenose de válvula pulmonar (estenose pulmonar), doença

- de Raynaud, estenose arterial renal, hipertensão renovascular, doença cardíaca reumática, defeitos septais, isquemia silenciosa, síndrome X, taquicardia, ' arterite de Takayasu, tetralogia de Fallot, transposição dos vasos grandes, - atresia tricúspide, tronco arterioso, doença cardíaca valvar, úlceras varicosas, : 5 veias varicosas, vasculite, defeito septal ventricular, síndrome de Wolff - Parkinson- White, ou defeito do coxim endocárdico. : Em outras modalidades, a doença do coração ou sistema circulatório compreende uma ou mais de febre reumática aguda, pericardite reumática aguda, endocardite reumática aguda, miocardite reumática aguda, — doenças cardíacas reumáticas crônicas, doenças da válvula mitral, estenose mitral, insuficiência mitral reumática, doenças da válvula aórtica, doenças de outras estruturas endocárdicas, doença cardíaca isquêmica (aguda e subaguda), angina de peito, doenças de circulação pulmonar (doença cardíaca pulmonar aguda, embolia pulmonar, doença cardiopulmonar crônica), doença * 15 cardíaca cifoescoliótica, miocardite, endocardite, fibrose endomiocárdica, . fibroelastose endocárdica, bloqueio atrioventricular, disritmias cardíacas, degeneração miocárdica, doenças do sistema circulatório incluinda doença cerebrovascular, oclusão e estenose de artérias pré-cerebrais, oclusão de artérias cerebrais, doenças de artérias, arteríolas e capilares (aterosclerose, aneurisma), ou doenças de veias e vasos linfáticos.

Em uma modalidade, o tratamento compreende tratamento de um paciente com uma cardiomiopatia com uma composição celular terapêutica compreendendo as células aderentes derivadas do âmnio, tanto com quanto sem um outro tipo celular. Em outras modalidades preferida, o — paciente experimenta os benefícios da terapia, por exemplo, da capacidade das células auxiliarem o crescimento de outras células, incluindo as células tronco ou células progenitoras presentes no coração, a partir do tecido estagnado ou vascularização do tecido, e a partir da presença de fatores celulares benéficos, quimiocinas, citocinas e similares, mas as células não

: integram ou multiplacam no paciente. Em uma outra modalidade, o paciente se beneficia do tratamento terapêutico com as células, mas as células não ' sobrevivem por um período prolongado no paciente. Em uma modalidade, as - células declinam gradualmente em número, viabilidade ou atividade : 5 — bioquímica, em outras modalidades, o declínio nas células pode ser precedido . por um período de atividade, por exemplo, crescimento, divisão, ou atividade bioquímica. Em outras modalidades, células senescentes, não viáveis ou mesmo mortas são capazes de apresentar um efeito terapêutico benéfico. Melhorias em um indivíduo com uma doença ou distúrbio do sistema circulatório, em que são administradas ao indivíduo as células aderentes derivadas do âmnio ou composições terapêuticas aqui fornecidas, podem ser avaliadas ou demonstradas por melhorias detectáveis em um ou mais sintomas da doença ou distúrbio do sistema circulatório.

Em uma outra modalidade, melhorias em um indivíduo com * 15 umadoença ou distúrbio do sistema circulatório, em que são administradas ao ' indivíduo as células aderentes derivadas do âmnio ou composições terapêuticas aqui fornecidas, podem ser avaliadas ou demonstradas por melhorias detectáveis em um ou mais indícios de função cardíaca, por exemplo, demonstração de melhorias detectáveis em um ou mais de rendimento cardíaco torácico (CO), índice cardíaco (CI), pressão pulmonar arterial em cunhas (PAWP) e índice cardíaco (CI), % de encurtamento fracional (% de FS), fração de ejeção (EF), fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF); diâmetro diastólico final ventricular esquerdo (LVEDD), diâmetro sistólico final ventricular esquerdo (LVESD), contratilidade (por exemplo dP/dt), alças pressão-volume, medições de trabalho cardíaco, um aumento no funcionamento atrial ou ventricular; um aumento na eficiência de bombeamento, uma diminuição na taxa de perda de eficiência de bombeamento, uma diminuição na perda do funcionamento hemodinâmico; e uma diminuição nas complicações associadas à cardiomiopatia, comparado ao

: indivíduo antes da administração de células aderentes derivadas do âmnio.

Melhorias em um indivíduo que recebe as composições í terapêuticas aqui fornecidas também podem ser avaliadas por métricas - subjetivas, por exemplo, a auto avaliação do indivíduo com relação ao seu ba 5 — estadode saúde após a administração.

' O successo de administração das células, em certas modalidades, não baseia-se na sobrevivência das células aderentes derivadas do âmnio administradas ao indivíduo. Ao contrário, o sucesso baseia-se em um ou mais dados métricos de melhorias na saúde cardíaca ou circulatória, da maneira citada anteriormente. Assim, as células não precisam integrar e bater com a saúde do paciente ou em vasos sanguíneos.

Em certas modalidades, os métodos de tratamento aqui fornecidos compreendem induzir as células aderentes terapêuticas derivadas do âmnio para diferenciar junto com a linhagem mesenquimal, por exemplo, * 15 no sentido de um fenótipo cardiomiogênico, angiogênico ou vasculogênico, : ou nas células tais como miócitos, cardiomiócitos, células endoteliais, células do miocárdio, células do epicárdio, células endoteliais vasculares, células do músculo liso (por exemplo, células vasculares do músculo liso).

A administração de células aderentes derivadas do âmnio, ou composições terapêuticas que compreendem tais células, a um indivíduo em precisa destas pode ser realizada, por exemplo, por transplante, implantação (por exemplo, das próprias células ou das células como parte de uma combinação matriz-célula), injeção (por exemplo, diretamente no sítio da doença ou condição, por exemplo, diretamente em um sítio isquêmica no coração de um indivíduo que teve um infarto do miocárdio), infusão, distribuição via cateter, ou qualquer outro meio conhecido na técnica para fornecer a terapia celular.

Em uma modalidade, as composições terapêuticas celulares são fornecidas a um indivíduo que precisa destas, por exemplo, por injeção

: em um ou mais sítios no indivíduo. Em uma modalidade específica, as composições terapêuticas celulares são fornecidas por injeção intracardíaca, Y por exemplo, em uma área isquêmica no coração. Em outras modalidades - específicas, as células são injetadas na superfície do coração, em uma área ba 5 — adjacente, ou mesmo em uma área mais remota. Em modalidades preferidas, , as células podem permanecer na área doente ou lesada.

Um indivíduo com uma doença ou condição dos sistemas coronários ou vasculares pode ser administrado com células aderentes derivadas do âmnio a qualquer momento, as células sendo terapeuticamente benéficas. Em certas modalidades, por exemplo, as células ou composições terapêuticas da invenção são administradas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 horas, ou 1, 2, 3, 4,5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 dias do infarto do miocárdio. A administração no período próximo a * 15 um infarto do miocárdio, por exemplo, em 1-3 ou 1-7 dias, é preferível com . relação à administração em um período mais distante, por exemplo, após 3 ou 7 dias após um infarto do miocárdio. Em outras modalidades, as células ou composições terapêuticas da invenção são administradas em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 horas, ou 1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, ou 30 dias do diagnóstico inicial da doença ou condição.

São aqui também fornecidos estojos para uso no tratamento de infarto do miocárdio. Os estojos fornecem a composição celular terapêutica que pode ser preparada em uma forma farmaceuticamente aceitável, por exemplo, misturando com um veículo farmaceuticamante aceitável e um aplicador junto com as instruções para uso. De maneira ideal, o estojo pode ser usado no campo, por exemplo em um escritório de médico, ou em um fornecedor de cuidado de emergência a ser aplicado em um paciente diagnosticado como aquele que teve um infarto do miocárdio ou evento

B cardíaco similar.

Em modalidades específicas dos métodos de tratamento aqui á fornecidos, as células aderentes derivadas do âmnio são administradas com . células tronco (isto é, células tronco que não são células aderentes derivadas í 5 do âmnio), mioblastos, miócitos, cardiomioblastos, cardiomiócitos, ou r progenitores de mioblastos, miócitos, cardiomioblastos, e/ou cardiomiócitos.

Em uma modalidade específica, os métodos de tratamento aqui fornecidos compreendem administrar células aderentes derivadas do âmnio, por exemplo, uma composição terapêutica compreendendo as células, a um paciente com uma doença do coração ou sistema circulatório; e avaliar o paciente quanto a melhorias na função cardíaca, em que a composição celular terapêutica é administrada como um complexo matriz-célula.

Em certas modalidades, a matriz é um estrutura, preferivelmente bioabsorvível, compreendendo pelo menos as células. 7 15 Com esta finalidade, são aqui fornecidas populações de células ! aderentes derivadas do âmnio incubadas na presença de um ou mais fatores que estimulam a diferenciação de célula tronco ou progenitora junto com uma via cardiogênica, angiogênica, hemangiogênica ou vasculogênica.

Tais fatores são conhecidos na técnica; a determinação de condições adequadas para diferenciação pode ser realizada com experimentos de rotina.

Tais fatores incluem, mas sem limitação, fatores tais como fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas, produtos celulares, agentes de desmetilação, e outros estímulos que são agora conhecidos ou posteriormente determinados para estimular a diferenciação, por exemplo, de células tronco, junto com vias ou — linhagens cardiogênicas, angiogênicas, hemangiogênicas ou vasculogênicas.

As células aderentes derivadas do âmnio podem ser diferenciadas junto com as vias ou linhagens cardiogênicas, angiogênicas, hemangiogênicas ou vasculogênicas em cultura das células na presença de fatores compreendendo pelo menos um de um agente de demetilação, um

| fator de proteína BMP, FGF, Wnt, fatores Hedgehog e/ou anti-Wnt. A inclusão de agentes de desmetilação tende a permitir que as é células se diferenciem junto com linhagens mesnquimais, no sentido de uma - via cardiomiogênica. A diferenciação pode ser determinada, por exemplo, h' S — pela expressão de pelo menos um de cardiomiosina, miosina esquelética, ou p GAT AJA; ou pela aquisição de um rítmo de batidas, espontânea ou de outra maneira induzida; ou pela capacidade de integrar pelo menos parcialmente em um músculo cardíaco do paciente sem arritmias induzidas. Os agentes de desmetilação que podem ser usados para iniciar tal diferenciação incluem, mas sem limitação, 5-azacitidina, 5-AZA-2'-desoxicitidina, dimetilsulfóxido, cloreto de queleritrina, ácido retinóico ou sais destes, ácido 2-amino-4- (etiltio)butírico, procainamida e procaína.

Em certas modalidades aqui, as células induzidas com um ou mais fatores, da maneira identificada anteriormente, podem se tornar células 7 15 —cardiomiogênicas, angiogênicas, hemangiogênicas ou vasculogênicas, ou progenitoras. Preferivelmente, pelo menos algumas das células podem integrar pelo menos parcialmente em um sistema cardiovascular de recipiente incluindo, mas sem limitação, músculo cardíaco, estruturas vasculares e outras do coração, vasos sanguíneos periféricos ou cardíacos e similares. Em outras certas modalidades, as células aderentes diferenciadas derivadas do âmnio se diferenciam nas células que adquirem dois ou mais dos indícios de células cardiomiogênicas ou suas progeitoras, e são capazes de integrar parcial ou totalmente em vocoração ou vasculatura do recipiente. Em modalidades específicas, as células, quando administradas a um indivíduo, —não resultam em nenhum aumento nas arritmias, defeitos cardíacos, defeitos do vaso sanguíneo ou outras anomalias do sistema circulatório ou saúde do indivíduo. Em certas modalidades, as células aderentes derivadas do âmnio agem para promover a diferenciação de células tronco naturalmente presentes no músculo cardíaco do paciente, vasos sanguíneos, sangue e similares para diferenciar elas mesmas em, por exemplo, cardiomiócitos, ou pelo menos junto com limbhagens cardiomiogênicas, angiogênicas, hemangiogênicas ou í vasculogênicas.

- As células aderentes derivadas do âmnio, e populações de tais E 5 células, podem ser fornecidas terapeuticamente ou proflaticamente a um - indivíduo, por exemplo, um indivíduo com uma doença, distúrbio ou condição, ou que afeta, do coração ou sistema circulatório. Tais doenças, distúrbios ou condições podem incluir insuficiência cardíaca congestiva em virtude da aterosclerose, cardiomiopatia ou lesão cardíaca, por exemplo, uma lesão isquêmica, tal como do infarto do miocárdio ou ferida (aguda ou crônica).

Em certas modalidades, o indivíduo é administrado com uma quantidade terapeuticamente efetiva de células aderentes derivadas do âmnio, por exemplo, em uma população de células que compreendem as células * 15 — aderentes derivadas do âmnio. Em uma modalidade específica, a população ' compreende cerca de 50 % de células aderentes derivadas do âmnio. Em uma outra modalidade específica, a população é uma população substancialmente homogênea de células aderentes derivadas do âmnio. Em outras modalidades, a população compreende pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 33%,40%, 60%, 66%, 70%, 75 %, 80 %, ou 90 % de células aderentes derivadas do âmnio.

As células aderentes derivadas do âmnio podem ser administradas a um indivíduo na forma de uma composição terapêutica compreendendo as células e um outro agente terapêutico, tais como fator de — crescimento do tipo insulina (IGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), IL-8, um agente anti-trombogênico (por exemplo, heparina,y derivados de heparinay uroquinase e PPack

= (dextrofenilalanina prolina arginina clorometilcetona); compostos anti- trombina, antagonistas do receptor de plaquetas, anticorpos anti-trombina, anticorpos do receptor anti-plaquetas, aspirina, dipridamol, protamina, hirudina, inibidores de prostaglandina e/ou inibidores de plaquetas), um agente anti-apoptótico (por exemplo, EPO, derivados e análogos de EPO e ' seus sais, TPO, IGF-I, IGF-II, fator de crescimento de hepatócito (HGF), ou inibidor de caspases), um agente anti-inflamatório (por exemplo, inibidores de P38 MAP quinase, estatinas, inibidores de IL-6 e IL-I, pemirolast, tranilast, remicade, sirolimus, compostos anti-inflamatórios não esteroidais, por exemplo, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, tepoxalina, tolmetina ou suprofen), um agente imunosupressor ou imunomodulatório (por exemplo, inibidores de calcineurina, por exemplo, ciclosporina, tacrolimus, inibidores de mTOR tal como sirolimus ou everolimus; anti-proliferantes tais como azatioprina e micofenolato de mofetila; corticosteróides, por exemplo, as prednisolona ou hidrocortisona; anticorpos tais como anticorpos do receptor - anti-IL-2Ra monoclonal, Basiliximab, Daclizuma, anticorpos policlonais anti- célula T tais como anti-timócito globulina (ATG), anti-limfócito globulina (ALG) e o anticorpo monoclonal anti-célula T OKT3, ou células tronco aderentes derivadas da placenta, da maneira descrita na patente U.S.

7.468.276, e publicação de pedido de patente U.S. e 2007/0275362, cujas revelações são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra), e/ou um antioxidante (por exemplo, probucol; vitaminas A, C e E, coenzima Q-10, glutationa, L cisteína, N-acetilcisteína, ou derivados, análogo ou sais do antioxidante preceedente). Em certas modalidades, as composições terapêuticas que compreendem as células aderentes derivadas do âmnio compreendem adicionalmente um ou mais tipos celulares adicionais, por exemplo, células do adulto (por exemplo, fibroblastos ou células endodérmicas), ou células tronco ou progenitoras. Tais agentes terapêuticos e/ou uma ou mais células adicionais podem ser administrados a um indivíduo a que necessita destes, individualmente ou em combinações de dois ou mais de | tais compostos ou agentes.

Em certas modalidades, o indivíduo a ser tratado é um mamífero.

Em uma modalidade específica, o indivíduo a ser tratado é um “5 humano.

Em modalidades específicas, o indivíduo é um animal de fazenda ou Wi um animal doméstico.

Em outras modalidades específicas, o indivíduo a ser tratado é um cavalo, ovelha, vaca ou bezerro, porco, cachorro ou gato.

Acidente vascular e outra doença isquêmica Em certas modalidades, é aqui fornecido um método de tratar um indivíduo com uma interrupção do fluxo sanguíneo, por exemplo, no cérebro ou em torno deste, ou na vasculatura periférica, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de AMDACs.

Em certas modalidades específicas, a ischemia é doença arterial periférica (PAD), por exemplo, é isquemia límbica crítica (CLD). Em outras "15 certas modalidades, a ischemia é uma ischemia do sistema nervoso central - (CNS). Em outras certas modalidades, a ischemia é doença arterial periférica, doença vascular isquêmica, doença cardíaca isquêmica, doença cerebral isquêmica ou doença renal isquêmica.

Em uma modalidade específica, a dita interrupção de fluxo de — sangue é um acidente vascular.

Em uma modalidade mais específica, o dito acidente vascular é um acidente vascular isquêmico.

Em uma outra modalidade mais específica, o dito acidente vascular é um acidente vascular hemorrágico, por exemplo, uma hemorragia cerebral intracraniana ou hemorragia subaracnóide espontânea.

Em uma outra modalidade específica, a dita interrupção é um hematoma.

Em modalidades mais específicas, o hematoma é um hematoma dural, um hematoma subdural ou um hematoma subaracnóide.

Em uma outra modalidade específica, o dito hematoma é causado por força externa no crânio, por exemplo, uma lesão na cabeça.

Em uma outra modalidade específica, a dita interrupção é um ataque isquêmico transiente (TIA), por exemplo, TIA recorrente. Em uma outra modalidade | específica, a dita interrupção é um vasoespasmo, por exemplo, um vasoespasmo após um acidente vascular hemorrágico.

Em uma outra modalidade específica do método, a dita quantidade terapeuticamente efetiva são inúmeras AMDACSs que resultam em ' eliminação, melhorias detectáveis, diminuição da gravidade, ou retardo do progresso de um ou mais sintomas, ou déficit neurológicos atribuíveis a uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste ou CNS exibido pelo dito indivíduol, por exemplo, lesão anóxica ou lesão hipóxica. Em uma outra modalidade específica, a dita quantidade terapeuticamente efetiva de AMDACSs isoladas é administrada ao dito indivíduo profilaticamente, por exemplo, para reduzir ou eliminar o dano neurológico causado por uma segunda ou subsequente interrupção de fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste, ou CNS, após a dita interrupção de fluxo de sangue. Em uma outra modalidade específica, o dito sintoma de - interrupção de fuxo sanguíneo no cérebro ou em torno deste, por exemplo, acidente vascular, lesão anóxica ou lesão hipóxica, é uma ou mais de hemiplegia (paralisação de um lado do corpo); hemiparesia (fraqueza em um lado do corpo); fraqueza muscular da face; dormência; redução na sensação; sentido alterado de cheiro, sentido do paladar, audição ou visão; perda do olfato, paladar, audição ou visão; caimento de uma pálpebra (ptose); fraqueza detectável de um músculo ocular; menor reflexo faríngeo; menor capacidade de deglutição; menor reatividade da pupila à luz; menor sensação da face; menro equilíbrio; nistagmo; taxa de respiração alterada; taxa cardíaca alterada; fraqueza em músculo esternocleidomastóideo com menor capacidade ou incapacidade virar a cabeça para o outro lado; fraqueza na lingua; afasia (incapacidade de falar ou entender a linguagem); apraxia (movimentos voluntários alterados); uma deficiência no campo visual; um déficit de memória; heminegligência ou negligência hemiespacial (déficit de atenção com relação ao espaço no lado do campo visual oposto à lesão); pensamento — desorganizado; confusão; desenvolvimento de gestos hipersexuais; anosognosia (negação persistente da existência de um déficit); dificuldade de caminhar; coordenação de movimento alterado; vertigem; desequilíbrio; perda da consciência; dor de cabeça e/ou vômito. ' Em uma outra modalidade específica, os métodos de tratamento descritos anteriormente compreendem administrar um segundo agente terapêutico ao dito indivíduo. Em uma modalidade mais específica, o dito segundo agente terapêutico é um agente neuroprotetor. Em uma “modalidade mais específica, o dito segundo agente terapêutico é NXY-059 (um derivado de dissulfonila de fenilbutilnitrona: N-óxido de 4-((terc- butilimino)-metil)benzeno-l,3-dissulfonato dissódico, ou 4-((óxido-terc-butil- azaniumilideno)metil)benzeno-1,3-dissulfonato dissódico; também conhecido como dissufonton). Em uma outra modalidade mais específica, o segundo “15 agente terapêutico é um agente trombolítico. Em uma modalidade mais - específica, o dito agente trombolítico é ativador de plasminogênio tecidual (tPA). Em modalidades nas quais a interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste é uma hemorragia, o segundo agente terapêutico pode ser um medicamento anti-hipertensivo, por exemplo, um beta bloqueador ou medicamento diurético, uma combinação de um medicamento diurético e um medicamento diurético com pouco potássio, uma combinação de um beta bloqueador e um medicamento diurético, uma combinação de um inibidor da enzima conversora de angiotensina (ACE) e um diurético, um antagonista de angiotensina-ll e um medicamento diurético, e/ou um bloqueador de canal de —cálcioeum inibidor da ACE. Em uma outra modalidade mais específica, o segundo agente terapêutico é um bloqueador de canal de cálcio, antagonista de glutamato, agonista do ácido gama aminobutírico (GABA), um antioxidante ou captador de radical livre.

Em uma outra modalidade específica do método de tratamento,

as ditas AMDACs isoladas são administradas ao dito indivíduo em 21-30, por i exemplo, 21 dias de desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste do dito indivíduo, por exemplo, em 21-30, por exemplo, 21 dias de desenvolvimento “5 de sintomas de acidente vascular, lesão anóxica ou lesão hipóxica.

Em uma : outra modalidade específica do método de tratamento, as ditas AMDACs isoladas são administradas ao dito indivíduo em 14 dias de desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste do dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica do método de tratamento, as ditas AMDACSs isoladas são administradas ao dito indivíduo em 7 dias de desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste do dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica do método de tratamento, as ditas AMDACSs isoladas são administradas ao dito indivíduo em 48 horas de “15 desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma interrupção do fluxo de . sangue no cérebro ou em torno deste do dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACSs isoladas são administradas ao dito indivíduo em 24 horas de desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste do dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACs isoladas são administradas ao dito indivíduo em 12 horas de desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste do dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACs isoladas são administradas ao dito indivíduo em 3 horas de — desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste do dito indivíduo.

Em uma modalidade específica, a dita interrupção de fluxo de sangue é isquemia límbica crítica.

Em uma outra modalidade mais específica, a dita CLI é um bloqueio grave nas artérias das extremidades inferiores, que reduz marcadamente o fluxo sanguíneo. Em uma outra modalidade mais específica a dita CLI é caracterizada por dor de repouso isquêmica, dor grave nas pernas e pés enquanto a pessoa não se movimenta, feridas que não cicatrizam nos pés ou pernas, dor ou dormência nos pés, pele brilhante, mole “SS esecadas pernas ou pés, espeçamento das unhas dos pés, ausência ou menor ' pulso nas pernas ou pés, feridas abertas, infecções de pele ou úlceras que não cicatrizam, gangrena seca (pele seva escura) das pernas ou pés. Em uma outra modalidade específica, CLI pode levar à perda dos dedos e ou os membros completos. Em uma outra modalidade específica do método, a dita quantidade —terapeuticamente efetiva são inúmeras AMDACS que resultam na eliminação, melhorias detectáveis, menor gravidade, ou retardo da progressão de um ou mais sintomas, perda da função límbica e ou privação de oxigênio (hipóxia/anóxia) atribuível a uma interrupção do fluxo de sangue no cérebro ou em torno deste, ou CNS, exibido pelo dito indivíduo, por exemplo, lesão “15 anóxica ou lesão hipóxica. Em uma outra modalidade específica, a dita . quantidade terapeuticamente efetiva de AMDACSs isoladas é administrada ao dito indivíduo profilaticamente, por exemplo, para reduzir ou eliminar dano tecidual causado por uma segunda ou subsequente interrupção de fluxo de sangue no membro ou entormo deste, após a dita interrupção de fluxo de sangue.

Dosagens e vias de administração A administração de AMDACs a um indivíduo que necessita destas pode ser por qualquer via aceitável pela equipe médica relevante para a doença ou condição a ser tratada. Em uma outra modalidade específica dos —métodos de tratamento descritos anteriormente, as ditas AMDACs são administradas por injeção em bolo. Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACSs isoladas são administradas por infusão intravenosa. Em uma modalidade específica, a dita infusão intravenosa é infusão intravenosa por cerca de | a cerca de 8 horas. Em uma outra modalidade específica, as ditas

AMDACs isoladas são administradas intracranialmente. Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACs isoladas são administradas intramuscularmente. Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACs isoladas são administradas intraperitoneamente. Em uma outra modalidade específica, as ditas AMDACs isoladas são administradas intra-arterialmente. ' Em uma modalidade mais específica, as ditas AMDACs isoladas são administradas em uma área de isquemia. Em uma outra modalidade mais específica, as ditas AMDACSs isoladas são administradas em uma área periférica para uma isquemia. Em uma outra modalidade específica do método de tratamento, as ditas AMDACs isoladas são administradas intramuscularmente, intradermicamente ou subcutaneamente.

Em uma outra modalidade específica dos métodos de tratamento descritos anteriormente, as ditas AMDACs são administradas uma vez ao dito indivíduo. Em uma outra modalidade específica, as ditas “15 AMDAC;s isoladas são administradas ao dito indivíduo em duas ou mais . administrações separadas. Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar entre cerca de 1 x 10º e 1 x 10º de AMDACs isoladas, por exemplo, AMDACs por quilograma do dito indivíduo. Em uma outra modalidade específica, o dito administrar — compreende administrar entre cerca de 1 x 10º e 1 x 10º de AMDACS isoladas por quilograma do dito indivíduo. Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar entre cerca de 1 x 10º e 1 x 107 de AMDACs isoladas por quilograma do dito indivíduo. Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar entre cerca delx10' elx10º de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo. Em outras modalidades específicas, o dito administrar compreende administrar entre cerca de 1 x 10º e cerca de 2 x 10º de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo; entre cerca de 2 x 10º e cerca de 3 x 10º de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo; entre cerca de 3 x 10º e cerca de 4 x 10º de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo; entre cerca de 4 x 10º e cerca de 5 x 10º de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo; entre cerca de S x 10º e cerca de 6 x 10º de células placentárias isoladas por quilograma do “5 dito indivíduo; entre cerca de 6 x 10º e cerca de 7 x 10º de células placentárias ' isoladas por quilograma do dito indivíduo; entre cerca de 7 x 10º e cerca de 8 x 10º de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo; entre cerca de 8 x 10º e cerca de 9 x 10º de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo; ou entre cerca de 9 x 10º e cerca de 1 x 107 de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar entre cerca de 1 x 10º e cerca de 2 x 10º de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo ao dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar entre cerca de 1,3 x 107 e cerca de “15 1,5x10 de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo ao . dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar até cerca de 3 x 107 de células placentárias isoladas por quilograma do dito indivíduo ao dito indivíduo.

Em uma modalidade específica, o dito administrar compreende administrar entre cerca de 5 x 10º e —cercade2x 10 de células placentárias isoladas ao dito indivíduo.

Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar cerca de 150 x 10º de células placentárias isoladas em cerca de 20 mililitros de solução ao dito indivíduo.

Em uma modalidade específica, o dito administrar compreende — administrar entre cerca de 5 x 10º e cerca de 2 x 10 de células placentárias isoladas ao dito indivíduo, em que as ditas células estão contidas em uma solução compreendendo dextran 10 %, por exemplo, dextran-40, albumina sérica humana 5 % e, opcionalmente, um imunossupressor.

Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar entre cerca de 5 x 10º e 3 x 10º de células placentárias isoladas intravenosamente. Em Í modalidades mais específicas, o dito administrar compreende administrar cerca de 9 x 10º de células placentárias isoladas ou cerca de 1,8 x 10º de células placentárias isoladas intravenosamente. Em uma outra modalidade específica, o dito administrar compreende administrar entre cerca de 5 x 10º e í 1 x 10º de células placentárias isoladas intracranialmente. Em uma modalidade mais específica, o dito administrar compreende administrar cerca de 9 x 10º de células placentárias isoladas intracranialmente. DIFERENCIAÇÃO — DE CÉLULAS ADERENTES

DERIVADAS DO ÂMNIO As células aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas podem ser diferenciadas. Em uma modalidade, a célula foi diferenciada de maneira suficiente para a dita célula exibir pelo menos uma característica de uma célula endotelial, uma célula miogênica, ou uma célula pericítica, por “15 exemplo, colocando a célula em contato com o fator de crescimento endotelial . vascular (VEGF), ou da maneira descrita nas seções 5.11.2, 6.3.3, ou 6.3.4 a seguir. Em modalidades mais específicas, a dita característica de uma célula endotelial, célula miogênica ou célula pericítica é a expressão de uma ou mais de CD9, CD31, CD54, CD102, NG2 (antígeno 2 neural/glial) ou actina de — músculo liso alfa, que é maior comparada a uma célula amniótica que é OCT- 4, VEGFR2/KDR', CD9*, CD54*, CDI05*, CD200* e VE-caderina. Em outras modalidades mais específicas, a dita característica de uma célula endotelial, célula miogênica ou célula pericítica é a expressão de uma ou mais de CD9, CD31, CD54, CD 102, NG2 (antígeno 2 neural/glial) ou actina de — músculo liso alfa, que é maior comparada a uma célula amniótica que é OCT- 4, VEGFR2/KDR' e VEGFR1/FIt-1". Indução de angiogênese A angiogênese das células aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas pode ser realizada da maneira a seguir. As células aderentes derivadas do âmnio são cultivadas, por exemplo, em um meio de célula i endotelial, por exemplo, EGMG&-2 (Lonza) ou um meio compreendendo DMEM-LG 60 % (Gibco), MCDB-201 40 % (Sigma); soro fetal bovino 2 % (Hyclone Labs.); insulina-transferrina-selênio 1x (ITS); ácido linolêico- “5 albumina bovina sérica lx (LA-BSA); dexametasona 5 x 10º M (Sigma); 2- ' fosfato de ácido ascórbico 10ºM (Sigma); fator de crescimento epidérmico 10 ng/mL (R&D Systems) e fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF- BB) 10 ng/ml (R&D Systems) para a passagem 3. As células são então plaqueadas em MATRI GEL'Y ou um substrato compreendendo colágeno-1, —porexemplo, placas de 96 poços em uma densidade, por exemplo, de cerca de 1,5 x 10º células por poço no mesmo meio ou DMEM com FBS (0 - 5 % v/v) compreendendo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), por exemplo, em cerca de 10 a 50 ng per mililitro. O meio pode ser trocado cerca de duas vezes por semana. A angiogênese é evidenciada por inspeção visual “15 dascélulas para brotamento de estruturas do tipo vaso e formação do tubo, . visíveis em um microscópio em uma magnificação de, por exemplo, 50X a 100X.

Indução de diferenciação em células cardíacas A diferenciação miogênica (cardiogênica) das células — aderentes derivadas do âmnio aqui fornecidas pode ser realizada, por exemplo, colocando as células em condições de cultura de células que induzem a diferenciação em cardiomiócitos. Um meio cardiomiocítico preferido compreende DMEM/CBS 20 % suplementado com ácido retinóico 1 JM; fator de crescimento de fibroblasto básico, 10 ng/mL; e fator de crescimento transformante beta-l, 2 ng/ml; e fator de crescimento epidérmico, 100 ng/mL. A substituição de soro neutralizado (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) pode ser usada no lugar de CBS. Alternativamente, as células aderentes derivadas do âmnio são cultivadas em DMEM/CBS 20 % suplementado com 1 a 100, por exemplo, 50 ng/mL de cardiotropina-1 por 24 horas. Em uma outra modalidade, as células aderentes derivadas do âmnio podem ser cultivadas 10-14 dias em meio sem proteína por 5-7 dias, e são então estimuladas com extrato de miocárdio humano, por exemplo, produzido homogeneizando o miocárdio humano em tampão HEPES 1 % suplementado “5 comlº%desorodo sangue do cordão.

: A diferenciação pode ser confirmada por demonstração da expressão de gene de actina cardíaca, por exemplo, por RT/PCR, ou por batida visível da célula. Considera-se que a célula aderente foi diferenciada em uma célula cardíaca quando a célula exibe uma ou mais destas — características.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: ISOLAMENTO E EXPANSÃO DE CÉLULAS

ADERENTES DA MAMBRANA AMNIÓTICA Este exemplo demonstra o isolamento e expansão de células “15 aderentes derivadas do âmnio. - Isolamento As células aderentes derivadas do âmnio foram isoladas da membrana amniótica da maneira a seguir. Âmnio/córion foram cortados a partir da placenta, e âmnio foi separado manualmente do córion. O âmnio foi

20. rinsado com PBS estéril para remover sangue residual, coágulos de sangue e outro material. Gaze estéril foi usada para remover sangue adicional, coágulos de sangue ou outro material que não foi removido pela rinsagem, e o âmnio foi rinsado novamente com PBS. O excesso de PBS foi removido da membrana, e o âmnio foi cortado com um bisturi em segmentos 2 a 2. Para liberação da célula epitelia0, um vaso de processamento foi ajustado conectando um vaso de processamento de vidro revestido estéril em um banho maria circulante a 37 ºC usando tubos e conectores, e ajustado em uma placa de agitação. A tripsina (0,25 %, 300 mL) foi aquecida a 37 ºC no vaso de processamento; os segmentos de âmnios foram adicionados, e a suspensão de âmnio/tripsina foi agitada, por exemplo, em 100 RPM-150 RPM a 37 ºC i por 15 minutos.

Um sistema de peneira estéril foi montado colocando um receptáculo estéril em um campo estéril próximo ao vaso de processamento e inserindo uma peneira estéril de 75 um a 125 um no receptáculo (Millipore,

“5 Billerica, MA). Após agitar os segmentos de âmnio por 15 minutos, os ' conteúdos do vaso de processamento foram transferidos para a peneira, e os segmentos de âmnio foram transferidos, por exemplo, usando pinças de apoio estéreis no vaso de processamento; a solução de tripsina contendo as células epiteliais foi descartada.

Os segmentos de âmnio foram agitados novamente com 300 mL de solução de tripsina (0,25 %), da maneira descrita anteriormente.

A peneira foi rinsada com aproximadamente 100-150 mL de

PBS, e a solução de PBS foi descartada.

Após agitar os segmentos de âmnio por 15 minutos, os conteúdos do vaso de processamento foram transferidos para a peneira.

Os segmentos de âmnio foram então transferidos de volta para

“15 ovasode processamento; a solução de tripsina contendo as células epiteliais , foi descartada.

Os segmentos de âmnio foram agitados novamente com 300 mL de solução de tripsina (0,25 %) da maneira descrita anteriormente.

À peneira foi rinsada com aproximadamente 100-150 mL de PBS, e a solução de PBS foi descartada.

Após agitar os segmentos de âmnio por 15 minutos, os

— conteúdos do vaso de processamento foram transferidos para a peneira.

Os segmentos de âmnio foram então transferidos de volta para o vaso de processamento, e a solução de tripsina contendo as células epiteliais foi descartada.

Os segmentos de âmnio foram agitados em PBS/5 % FBS (razão

1:1 de âmnio para solução de PBS/FBS 5 % em volume) a 37 ºC por

— aproximadamente 2-5 minutos para neutralizar a tripsina.

Um sistema de peneiras estéreis novas foi montado.

Após neutralizar a tripsina, os conteúdos do vaso de processamento foram transferidos para a nova peneira, e os segmentos de âmnio foram transferidos de volta para o vaso de processamento.

PBS estéril em temperatura ambiente (400 mL) foi adicionado no vaso de processamento, e os conteúdos do vaso de processamento foram agitados por aproximadamente 2-5 minutos. A peneira foi rinsada com aproximadamente 100-150 mL de PBS. Após agitação, os conteúdos do vaso de processamento foram transferidos para a peneira; o frasco de processamento foi rinsado com PBS, e a solução de PBS foi descartada. O ' vaso de processamento foi então preenchido com 300 mL. de DMEM pré- aquecido, e os segmentos de âmnio foram transferidos em a solução de DMEM.

Para liberação das células aderentes derivadas do âmnio, a “membrana amniótica tratada foi tratada adicionalmente com colagenase da maneira a seguir. Uma solução estoque de colagenase estéril (500 U/mL) foi preparada dissolvendo a quantidade apropriada de pó de colagenase (que variou com a atividade do lote de colagenase recebido do fornecedor) em DMEM. A solução foi filtrada por meio de um filtro de 0,22 um e dispensada “15 em recipientes estéreis individuais. A solução de CaCl, (0,5 mL, 600 mM) foi adicionada e cada dose de 100 mL, e as doses foram congeladas. À colagenase (100 mL) foi adicionada aos segmentos de âmnio no vaso de processamento, e o vaso de processamento foi agitado por 30-50 minutos, ou até que a digestão do âmnio fosse completa por inspeção visual. Após a digestão do âmnio terminar, 100 mL de PBS /FBS 5 % estéril pré-aquecido foi adicionado ao vaso de processamento, e o vaso de processamento foi agitado por mais 2-3 minutos. Após a agitação, os conteúdos do frasco foram transferidos para uma peneira estéril de 60 um, e o líquido foi coletado por filtração a vácuo. O vaso de processamento foi rinsado com 400 mL de PBS, ea soluçãode PBS filtrada para esterilidade. A suspensão celular filtrada foi então centrifugada a 300 x g por 15 minutos a 20 ºC, e os precipitados celulares foram ressuspensos em PBS/FBS 2 % pré-aquecido (aproximadamente 10 mL no total).

Estabelecimento

As células amnióticas angiogênicas recém isoladas foram adicionadas ao meio de crescimento contendo DMEM-LG 60 % (Gibco); MCBD-201 40 % (Sigma); FBS 2 % (Hyclone Labs), insulina-transferrina- selênio 1x (ITS); 10 ng/mL de ácido linolêico-albumina bovina sérica (LA- BSA); 1 n-dexametasona (Sigma); 2-fosfato de ácido ascórbico 100 uM ' (Sigma); 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (R & D Systems); e ng/mL de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF-BB) (R & D Systems), e foram plaqueadas em um frasco T em uma densidade de semeadura de 10.000 células por em”. O(s) dispositivo(s) de cultura foi(s) 10 então incubado(s) a 37 ºC, 5 % de CO, com >90 % de umidade. Anexação celular, crescimento e morfologia foram monitorados diariamente. As células não aderentes e debris foram removidos por troca de meio. A troca de meio foi realizada duas vezes por semana. As células aderentes com morfologia de forma fibroblastóide/fuso típica apareceram vários dias após o plaqueamento “15 inicial. Quando a confluência atingiu 40 % - 70 % (em 4 - 11 dias após o , plaqueamento inicial), as células foram coletadas por tripsinização (tripsina a 0,25 % - EDTA) por 5 minutos em temperatura ambiente (37 ºC). Após a neutralização com PBS- FBS 5 %, as células foram centrifugadas a 200 - 400 g por 5-15 minutos em temperatura ambiente, e então foram re-suspensas em —meiode crescimento. Neste ponto, considerou-se que uma linhagem AMDAC é satisfatoriamente estabelecida na passagem inicial. As células aderentes derivadas do âmnio de passagem inicial foram, em alguns casos, crioconservadas ou expandidas.

Procedimento de cultivo As células aderentes derivadas do âmnio foram cultivadas no meio de crescimento descrito anteriormente e semeadas em uma densidade de

2.000 — 4.000 por cm? em uma cultura de tecido - dispositivo(s) de cultura tratada apropriado(s). O(s) dispositivo(s) de cultura foi(m) então incubado(s) a 37 ºC, 5 % CO; com >90 % de umidade. Durante o cultivo, as AMDACSs se aderiram e proliferaram. O crescimento celular, morfologia e confluência Í foram monitorados diariamente. A troca de meio foi realizada duas vezes por semana para reabastecer os nutrientes novos se a cultura se prolongar por 5 dias ou mais. Quando a confluência atingiu 40 % - 70 % (em 3 - 7 dias após a semeadura), as células foram coletadas por tripsinização (0,05 % - tripsina a e 0,25 % - EDTA) por 5 minutos em temperatura ambiente (37 ºC). Após a neutralização com PBS-FBS 5 %, as células foram centrifugadas a 200 - 400 g por 5-15 minutos em temperatura ambiente, então foram re-suspensas em meio de crescimento.

As AMDACS isoladas e cultivadas desta maneira produziram tipicamente 33530 +/- 15090 unidades formadoras de colônia (fibroblasto) (CFU-F) além das 1 x 10º células plaqueadas.

EXEMPLO 2: CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE

CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS DO ÂMNIO “os Perfis de expressão de gene e proteína . Este exemplo descreve a caracterização fenotípica de células aderentes derivadas do âmnio, incluindo marcador de superfície celular característico, RNAm e expressão proteômica. Preparação da amostra: As células aderentes derivadas do âmnio foram obtidas da maneira descrita no exemplo 1. As células na passagem 6 foram crescidas em aproximadamente 70 % de confluência em meio de crescimento da maneira descrita no exemplo 1 anterior, tripsinizadas e lavadas em PBS. As células NTERA-2 (American Type Culture Collection, ATCC número CRL- 1973) foram crescidas em DMEM contendo 4,5 g/L de glicose, glutamina 2 mM e —FBS10%.As contagens de célula nucleada foram realizadas para obter um mínimo de 2 x 10º a 1x 10º células. As células foram então lisadas usando um entojo Qiagen RNeasy (Qiagen, Valência, CA), utilizando um QIAshredder para obter os lisados. O isolamento de RNA foi então realizado usando um estojo da Qiagen RNeasy. A quantidade e qualidade de RNA foram determinadas usando um espectrofotômetro Nanodrop ND1000, 25 ng/nL de RNA/reação. As reações de DNAc foram preparadas usando um estojo da Applied Biosystems (Foster City, CA) High Capacity cDNA Archive. As reações de PCR em tempo real foram realizadas usando misturas principais de PCR universal TAQMANº da Applied Biosystems. As reações correram no modo padrão em um sistema para ' PCR em tempo real 7300 para 40 ciclos da Applied Biosystems.

Análise e resultados da amostra: Usando a metodologia da PCR em tempo real e sondas de expressão de gene específicas TAQMANSº e/ou os arranjos de angiogênese humana TAQMANº (Applied Biosystems), as células — foram caracterizadas com relação à expressão de marcadores relacionados à célula tronco, angiogênicos e cardiomiogênicos. Os resultados foram expressos tanto como a expressão relativa de um gene de interesse em comparação com os controles celulares pertinentes, quanto cmo a expressão relativa (delta Ct) do gene de interesse em comparação com um gene regulador expresso de maneira ubíqua “15 (porexemplo, GAPDH, 18S, ou GUSB).

. As células aderentes derivadas do âmnio expressaram vários genes relacionados à célula tronco, angiogênicos e cardiomiogênicos e exibiram uma ausência relativa da expressão de OCT-4' em comparição com as células NTERA-2. A tabela 1 sumariza a expressão de genes angiogênicos, — cardiomiogênicos e de célula tronco selecionados.

Tabela 1: Perfil da expressão de gene de células aderentes derivadas do âmnio da maneira determinada por RT-PCR. [essas oem | oses ToeRNA | aerea a [aan Do Do x |

AMOT x x : [Ae IT TX ae TA DO O [anerr TX IT Tx are O TX [ANTE [ox Doo OX o] [aee TC TX | [aseeta [O TX TX [ane Doo O Tx ' EB TO TX [Ba o [Eme EI x ro x OX [as TI E Lea TA EX [emas [x TX [ea x EX [—enaao x OI [Cenas — [x OX [= ensia [Xx X— Esse OO EGFR2/KDR) ess TT TI TA Cam [A DX | , e O EX] [Leona TI IT Tx : [Foo TI TT [eo TX TO [eo FIT TX] [eua TD OX [Es Tc EX ss Rc [or ACE Cam TRI IX ox TRT [exe TX TO [Rs JT TI TX) [oe TO TX) Ba A TX) [Ba A TO Ee AC OX se OC TO] rr TAC OO] E Ar

FF TA O

FR O ST Era DD x Err Ac

FGF4 x x ' e O

NC NS NT pu

E ro - os CI Po atear aC . A a e uv

E A a ÇÕ se e

CD a vb av ra pu

LC O O re a ul O ÇÕ ee O ÇÕÕ uv

NL NS DS é PÇ ru AÇO . ra aos es uu Rg Ç

NC NS a e Cv Ç | POUSFT (ETA

RR PRO AÇO

RN e AÇO

EB Res ÇA SER a sera so O O) nv AÇO

BR Bv Bs Ç

THBS2 x x : e a

DD a nv [Grs TA To . ra ae a Para Ç : [Tas oc o [x

EE [vB IT TX er a | vecrraFra Dar [otor To IT o] A coluna "RNAm" indica que a presença ou ausência de RNAm para marcadores particulares foi determinada em cada exemplo. Em um experimento separado, observou-se adicionalmente que as AMDACs expressam genes para o translocador nuclear 2 do receptor — de hidrocarboneto Arila (ARNT2), fator de crescimento neural (NGF), fator ' neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neutrófico derivado da glia F (GDNF), neurotrofina 3 (NT-3), NT-5, fator la indutível por hipóxia (HIFIA), proteína 2 indutível por hipóxia (HIG2), heme oxigenase (deciclização) 1 (HMOXI), superóxido desmutase extracelular [Cu-Zn] (SOD3), catalase (CAT), fator de crescimento transformante B1 (TGFBI1), receptor do fator de crescimento transformante B1 (TGFBIR) e receptor do fator de crescimento de hepatócito (HGFR/c-met). Citometria de fluxo para avaliação da eficácia angiogênica de células aderentes derivadas do âmnio A citometria de fluxo foi usada como um método para quantificar marcadores fenotípicos de células aderentes derivadas do âmnio para definir a identidade das células. Amostras celulares foram obtidas dos estoques congelados. Antes do descongelamento e durante a preparação do reagente, as garrafas de célula foram mantidas em gelo seco. — Subsequentemente, as amostras foram descongeladas rapidamente usando um banho maria a 37 ºC.

As contagens de célula pré-congelada foram usadas para cálculos de diluições dependentes do número de célula após o descongelamente inicial.

Resumidamente, as criofrascos foram descongeladas em um banho maria a 37 ºC por aproximadamente 30 segundos com agitação “5 delicada Imediatamente após o descongelamento, aproximadamente 100-200 . ul de solução descongelada fria (2 a 8 ºC) (PBS com 2,5 % de albumina e 5 % de Gentran 40) foram adicionados no criofrasco e misturados.

Após a mistura delicada, o volume total nos criofrascos foi transferido em um tubo cônico de 15 mL contendo um volume igual de solução descongelada fria (2 a 8ºO) As células foram centrifugadas em um tubo cônico a 400 g por 5 minutos em temperatura ambiente, antes da remoção do sobrenadante.

O volume residual foi medido com uma pipeta (estimativa); o volume residual e o precipitado celular foram resuspensos em temperatura ambiente em FBS 1 % em PBS para atingir uma concentração celular de 250 x 10º células/100 uL “15 detampão.

Por exemplo, 1 x 10º células seriam re-suspensas em 400 uL de ” FBS 1 %. A suspensão celular foi colocada em tubos FACS de 5 mL pré marcados (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ). Para cada isotipo de anticorpo primário, 100 uL de suspensão celular foram aliquotadas em um tubo controle de isotipo.

Antes da análise do fenótipo, as concentrações de todos os anticorpos foram otimizadas para atingir bom sinal em razões espalhadas e detecção adequada de antígenos CD através uma faixa dinâmica de quatro log potencial.

O volume de cada isotipo e amostra de anticorpo que foi usado para corar cada amostra foi determinado.

Para padronizar a quantidade de anticorpo (em ug) nos tubos de isotipo e amostra, a — concentração de cada anticorpo foi calculada como (1 /contentração atual de anticorpo (pug/uL)) x (quantidade final desejada de anticorpo em ug para 2,5 x 10º células) = %& ul de anticorpo adicionado.

Uma mistura principal de anticorpos tanto para o isotipo quanto para a amostra foi preparada com a quantidade apropriada de anticorpo adicionada em cada tubo.

As células foram coradas por 15-20 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Após i corar, o anticorpo não ligado em cada amostra foi removido por centrifugação (400 g x 5 minutos) seguido por lavagem usando 2 mL de FBS 1 % PBS (temperatura ambiente) antes da ressuspensão em 150 uL de FBS PBS 1% “5 em temperatura ambiente.

As amostras foram então analisadas em citômetros ' de fluxo Becton Dickinson FACSCalibur, FACSCantol ou BD FACSCantoII preparados para uso por instruções do fabricante.

Conjuntos de dados de citometria de fluxo multi-paramétricos (dispesão lateral (SSC), dispersão sentido (FSC) e perfis de fluorescência integrados (FL)) foram adquiridos sem ajustar os parâmetros de compensação do instrumento dinamicamente.

Os parâmetros de compensação foram determinados após aquisição usando o software FACSDiva, de acordo com as instruções do fabricante.

Estes ajustes do instrumento foram aplicados em cada amostra.

Os conjugados fluoróforos usados nestes estudos foram aloficocianina (APC), AlexaFluor 647 (AF647), “15 isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) e proteína de peridinina , clorofila (PerCP), todos da BD Biosciences.

A tabela 2 sumariza a expressão de marcadores de superfície celular selecionados, incluindo marcadores angiogênicos.

Tabela 2: Expressão de marcador de superfície celular em células aderentes derivadas do âmnio da maneira determinada por citometria de fluxo. esrame fue | | E | Marcador AMDAC Positivo Negativo por citometria de finxo : o e . Nr NS RR O et epa ea epa A epa epa eae a aaa a CI esa A ea a epa a Cv eps a eras a ea Í ea eia ' pes | [| | * | (VE-caderina) [Le TD DI [Lens TI ea ear A PL epaoas a ea Cv epa II a ssa a VEGFR2/KDR) eat a vv epa A II eta A ss Micro+ ES Le. HLA-DR-DP-DQ+ a EEE a

NO RN A O

A coluna "Imunolocalização por citometria de fluxo" indica i que a presença ou ausência de marcadores particulares foi determinada por imunolocalização, especificamente por citometria de fluxo.

Em um outro experimento, as células AMDAC foram marcadas com CD49f anti-humano (Clone GoH3, conjugado de ficoeritrina; ' BD Farmingen Part No. 555736) e analisadas por citometria de fluxo.

Aproximadamente 96 % das AMDACs marcaram com anti-CD49f (isto é, foram CD49f)). Em outros experimentos, AMDACs foram observadas — adicionalmente por imunolocalização para expressar CD49a, CD106, CD1 19, CD 130, ce-met (receptor do fator de crescimento de hepatócito; HGFR), receptor 1 de quimiocina CXC (CXCRI), PDGFRA e PDGFRB por imunolocalização.

Também observou-se, por imunolocalização, que as AMDACs precisam da expressão de CD49e, CD62E, receptor do fator de “15 — crescimento de fibroblasto 3 (FGFR3), elemento da superfamília do receptor 4 do fator de necrose tumoral 12A (TNFRSF 124), receptor do fator de crescimento do tipo insulina 1 (IGF-IR), CXCR2, CXCR3, CXCRA4, CXCR6, receptor de quimiocina 1 (CCRI), CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRS9, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), receptor de insulina (CD220), receptor de interleucina 4 (ILA4-R; CD124), IL6-R (CD126), TNF-RIa e Ib (CD120a, b) e erbB2/Her2. Imunoistoquímica — (IHC)/Imunofluorquímica (IFC) para avaliação da eficácia angiogênica de células aderentes derivadas do âmnio As células aderentes derivadas do âmnio da passagem 6 foram — crescidas em aproximadamente 70 % de confluência lâminas com câmaras de 4 poços e fixas com uma solução de formalina a 4 % por 30 minutos cada.

Após a fixação, as lâminas foram rinsadas com PBS duas vezes por 5 minutos.

As lâminas foram então incubadas com soro normal a 10 % do mesmo hospedeiro do anticorpo secundário, caseína 2x e Triton 0,3 % X100 em PBS, por 20 minutos em temperatura ambiente em uma câmara úmida.

O i excesso de soro descartado e as lâminas foram incubadas com anticorpo primário (IgG policlonal de cabra (Santa Cruz; Santa Cruz, CA) em uma câmara umidificada.

O tempo e a temperatura para as incubações foram “5 determinados selecionando as condições ideais para o anticorpo que está ' sendo usado.

Em geral, os períodos de incubação foram 1 a 2 horas a 37 ºC ou por toda a noite a 4 ºC.

As lâminas foram então rinsadas com PBS três vezes por 5 minutos cada e incubadas por 20-30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara úmida com anticorpo secundário de anti- —imunoglobulina conjugada fluorescente direcionada contra o hospedeiro do anticorpo — primário (anticorpo coelho anticcabra (Santa Cruz)). Posteriormente, as lâminas foram rinsadas com PBS três vezes por 5 minutos cada, montadas com uma lamínula utilizando solução de montagem DAPI VECTASHIELDO (Vetor Labs) para contracorar os núcleos.

A coloração “15 celular foi visualizada utilizando um microscópio de fluorescência Nikon. v Todas as fotos foram obtidas em tempo de exposição igual normalizado contra o fundo do isotipo correspondente (cabra IgG (Santa Cruz)). A tabela 3 sumariza os resultados com relação à expressão de proteínas angiogênicas por células aderentes derivadas do âmnio.

Tabela 3: Marcadores angiogênicos presentes ou ausentes em células i aderentes derivadas do âmnio.

: EO TE ea epa LeveerR2aeDR Pal [emaness [AD | | Gatectia a CD ee As células aderentes derivadas do âmnio expressaram o marcador endotelial de tumor 7 do marcador angiogênico (TEM-7), uma das — proteínas mostradas na tabela 3. Ver figura 2.

. Proteômicos de membrana para avaliação da eficácia angiogênica de células aderentes derivadas do âmnio ' Purificação de proteina de membrana: As células na passagem 6 foram crescidas em aproximadamente 70 % de confluência em meio de crescimento, tripsinizadas e lavadas em PBS. As células foram então incubadas por 15 minutos com uma solução contendo coquetel de inibidor de protease (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) antes da lise celular. As células foram então lisadas pela adição de uma solução de HCl 10 mM (evitando assim o uso de detergentes) e centrifugadas por 10 minutos a 400 g para precipitar e remover os núcleos. O sobrenadante pós-nuclear foi transferido para um tubo de ultracentrifugação e centrifugado usando uma ultracentrífuga WX80 com um rotor T-1270 (Thermo Fisher Scientific, Asheville, NC) a 100.000 g por 150 minutos, gerando um precipitado de proteína de membrana.

Generação, imobilização e digestão de proteolipossomos: O precipitado de proteína de membrana foi lavado várias vezes usando tampão

Nanoxis (Tris 10 mM, NaCl 300 mM, ph 8). O precipitado de proteína de membrana foi suspenso em 1,5 mL de tampão Nanoxis e então sonicado inclinado usando um processador ultrassônico VIBRA-CELL'M VCS05 (Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT) por 20 minutos no gelo.

O tamanho dos proteolipossomos foi determinado corando com corante FM 1-43 ' (Invitrogen, Carlsbad, CA) e a visualização foi por meio de microscópio de fluorescância.

A concentração de proteínas da suspensão de proteolipossomo foi determinada por um ensalo BCA (Thermo Scientifio) Os proteolipossomos foram então injetados em uma célula LPITMFlow (Nanoxis AB, Gothenburg, Suécia) usando uma pipeta inclinada padrão e imobilizados naturalmente por 1 hora.

Após a imobilização, uma série de etapas de lavagem foi realizada e tripsina em 5 ug/mL (Princeton Separations, Adelfi, NJ) foi injetada diretamente na célula LPITMFIlow.

A ficha foi incubada por toda a noite a 37 ºC e os peptídeos trípticos foram eluídos apartir das fichas “15 de LPIM e então dessalinizados usando um cartucho Sep-Pak (Waters

. Corporation, Milford, MA). Análise de LC/MS/MS LTOQ de captura de íon linear: Cada amostra digerida tríptica foi separada em uma coluna 0,2 mm x 150 mm 3um 200 A MAGIC C18 (Michrom Bioresources, Inc., Auburn, CA) que foi colocada na interface diretamente em uma fonte de ionização de eletroaspersão nanocapilar assistida por dessolvatação axial a vácuo (ADVANCE) (Michrom Bioresources, Inc.) usando um gradiente de minuto 180 (Tampão A: água, ácido fórmico 0,1 %; Tampão B: Acetonitrila, ácido fórmico 0,1 %). O fontes de ADVANCE atinge uma sensibilidade que é — comparável ao nanoESI tradicional, funcionando ao mesmo tempo em uma vazão consideravelmente maior de 3 uL/min.

Os peptídeos eluídos foram analisados em um espectrômetro de massa de captura de íons linear LTQ (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) que empregou dez varreduras MS/MS dependentes de dados após cada espectro de massa de varreadura completo. Sete conjuntos de dados replicados analíticos foram coletados para cada amostra biológica. Bioinformática: Sete arquivos RAW que correspondem aos 7 conjuntos de dados replicados analíticos que foram coletados para cada S — linhagem celular foram pesquisados como uma pesquisa única contra a base ' de dados humana IPI usando uma implementação do algoritmo SEQUEST em uma estação de trabalho Sorcerer Solo"M (Sage-N Research, San Jose, CA). Uma tolerância de massa de peptídeo de 1,2 amu was especificada, a oxidação de metionina foi especificada como uma modificação diferencial e a —carbamidometilação foi especificada como uma modificação estática. À implementação do software de estrutura do Trans-Proteomic Pipeline (TPP) foi usada para classificar e analisar os dados proteômicos da membrana. As proteínas foram consideradas para análise se elas tiverem sido identificadas com uma probabilidade de peptídeo de 95 %, probabilidade de proteína de 95 “15 %el peptídeo exclusivo. As comparações entre os conjuntos de dados ' proteômicos de membrana foram realizadas usando roteiros Perl adaptados e desenvolvidos fora da indústria. Resultados: Da maneira mostrada na tabela 4, as células aderentes derivadas do âmnio expressaram vários marcadores angiogênicos e —cardiomiogênicos. Tabela 4: Marcadores cardiomiogênicos ou angiogênicos expressos por células aderentes derivadas do âmnio. Imunolocalização de N proteômicos de membrana Marcador AMDAC | Positivo | Negativo Receptor de activina tipo IB x x DA vb uv ae O | Angiotensinogênio qa ama AC nv | Receptor LDL acetilado de macrófago Tel x x

TS DO DN RO Cadeia pesada de PI

EEE TT —— tipo A Eeet o. | . | de miosina do tipo cardíaca x x mt A O |

Perfil de secretoma para avaliação da eficácia angiogênica de i células aderentes derivadas do âmnio

' Arranjos de proteína: Células aderentes derivadas do âmnio na passagem 6 foram plaqueadas em números iguais de célula no meio de crescimento e os meios condicionados foram coletados após 4 dias.

A análise | qualitativa simultânea de múltiplos fatores de citocinas/crescimento angiogênicos em meios condicionados por célula foi realizada usando arranjos de proteína de angiogênese RayBiotech (Norcross, GA). Resumindo, . os arranjos protéicos foram incubados com 2 mL de tampão de bloquio 1x .— 10 (Ray Biotech) em temperatura ambiente por 30 minutos (min) para bloqueio i das membranas.

Subsequentemente, o tampão de bloqueio decantou e as membranas foram incubadas com 1 mL de amostra (meio de crescimento : condicionado pelas respectivas células por 4 dias) em temperatura ambiente por 1 a 2 horas.

As amostras então decantaram e as membranas foram lavadas 3x5 min com 2 mL de tampão de lavagem I 1x (Ray Biotech) em temperatura ambiente com agitação.

A seguir, as membranas foram lavadas 2 x 5 min com 2 mL de tamapão de lavagem Il 1x (Ray Biotech) em temperatura ambiente com agitação.

Posteriormente, 1 mL de anticorpos conjugados com biotina diluídos (Ray Biotech) foi adicionado em cada membrana e incubada em temperatura ambiente por 1-2 horas e lavada com os tampões de lavagem, da maneira descrita anteriormente.

A estreptavidina conjugada com HRP diluída (2 mL ) foi então adicionada em cada membrana e as membranas foram incubadas em temperatura ambiente por 2 horas.

Finalmente, as membranas foram lavadas novamente, incubadas com o estojo de detecção ECLTM (Amersham), de acordo com as especificações, e os resultados foram visualizados e analisados usando o sistema de imageamento

Kodak Gel Logic 2200. A secreção de várias proteínas angiogênicas por AMDACSs é mostrada na figura 3. ELISAs: A análie quantitativa de fatores de crescimento/citocinas angiogênicos únicos em meios condicionados por célula foi realizada usando estojos disponíveis comercialmente da R&D 7 Systems (Minneapolis, MN). Resumindo, os ensaios de ELISA foram realizados de acordo com as instruções do fabricante e a quantidade dos respectivos fatores de crescimento angiogênicos nos meios condicionados foi normalizada em 1 x 10º células. As células aderentes derivadas do âmnio (n= 6) exibiram aproximadamente 4.500 pg de VEGF por milhão de células e aproximadamente 17.200 pg de IL-8 por milhão de células. Tabela 5: . Resultados de ELISA para marcadores angiogênico Análise de secretoma, ELISA e arranjos de - Marcador AMDAC | Positivo | Negativo proteína vd a uv e A e O uv e CI | Fotistarina es ro

CR a CI e nn ÇÕ epi O Ç"") e |

CR e uu Pv KO antes CN Ç e | Trombopotetima PÇ a gv a

AC Cu e uu Em um experimento separado, confirmou-se que as AMDACs também secretam angiopoietina-l, angiopoietina-2, PECAM-I (CD31; molécula de adesão de célula endotelial de plaqueta), laminina e fibronectina.

Expressão de RNAmicro em AMDAC confirma a atividade i angiogênica Este exemplo demonstra que AMDACs expressam níveis maiores de certos RNAmicros (RNAmis), e níveis menores de certos outros RNAmis, cada um dos quais correlacionado com a função angiogênica, do ' que as células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea.

Sabe-se que a função angiogênica regula Rmi-296 pró- angiogênico por meio de níveis de regulação dos receptores do fator de crescimento. Por exemplo, Rmi-296 em células endoteliais contribui —significativamente para a angiogênese alvejando diretamente o RNAm do fator de crescimento do substrato de tirosina quinase regulado por hepatócito - (HGS), levando à menores níveis de HGS e reduzindo por meio disso a degradação mediada por HGS dos receptores do fator de crescimento ' VEGFR2 e PDGFRb. Ver Wirdinger et al., Cancer Cell 14:382-393 (2008).

15º Além disso, Rmi-15b e Rmi-16 mostraram controlar a expressão de VEGF, um pró-fator angiogênico chave envolvido na angiogênese, e cuja redução induzida por hipóxia de Rmi-15b e Rmi-16 contribui para um aumento em VEGF, uma citocina pró-angiogênica. Ver Kuelbacher et al., Trends in Farmacological Sciences, 29(1):12-15 (2007).

AMDACs foram preparadas da maneira descrita no exemplo 1 anterior. AMDACSs e células BM-MSC (usadas como um comparador) foram submetidas à preparação de RNAmicro (RNAmi) usando um estojo de isolamento de RNAmi MIRV ANATYM (Ambion, Cattt 1560). 0,5 x 10º a 1,5 x 10º células foram rompidas em um tampão de lise desnaturante. A seguir, as amostras foram submetidas a extração ácido-fenol+clorofórmio para isolar RNA altamente enriquecido por espécies pequenas de RNA. Etanol 100 % foi adicionado para produzir as amostras em etanol 25 %. Quando esta mistura lisado/etanol passou por um fitro de fibra vítrea, RNAs maiores foram imobilizados, e espécies pequenas de RNA foram coletadas no filtrado. À concentração de etanol do filtrado foi então aumentada em 55 %, e a mistura passou por um segundo filtro de fibra vítrea, onde os RNAs pequenos se tornam imobilizados. Este RNA foi lavado e eluído em uma solução de baixa concentração iônica. A concentração e pureza do RNA pequeno recuperado “OS — foideterminada medindo sua absorbância em 260 e 280 nm.

' Observou-se que AMDACs expressam os RNAmi angiogênicos a seguir: Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi-19b, Rmi-92, Rmi-20a, Rmi-20b, (elementos do agrupamento de RNAmi angiogênico 17º 92), Rmi-296, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, Rmi-16. Também observou-se —queas AMDACSs expressam níveis maiores dos RNAmi angiogênicos a seguir quando comparadas às células tronco mensenquimais derivadas de medula . óssea (BM-MSCs): Rmi-17-3p, Rmi-l8a, Rmi-18b, Rmi-19b, Rmi-92 (elementos do agrupamento de RNAmi angiogênico 1792), Rmi-296. Estes Ã resultados estão bem relacionados com a observação de que AMDACs expressam altos níveis de VEGFR2/KDR (ver anteriormente). De maneira contrária, observou-se que AMDACs expressam menores níveis dos RNAmi angiogênicos a seguir quando comparadas às BM-MSCs: Rmi-20a, Rmi-20b, (elementos do agrupamento RNAmi angiogênico 1792), Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, Rmi-l16. A menor expressão de Rmi-l5b e Rmi-l16 está — correlacionada com os maiores níveis de expressão de VEGF observados em AMDACs. EXEMPLO 3: CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE

CÉLULAS ADERENTES DERIVADAS DO ÂMNIO Este exemplo demonstra diferentes características de —AMDACSs associadas à angiogênese e capacidade de diferenciação. Formação do tubo HUVEC para avaliação da eficácia angiogênica de células aderentes derivadas do âmnio Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram subcultivadas na passagem 3 ou menos em meio EGM-2 (Cambrex, East

Rutherford, NJ) por 3 dias, e coletadas em uma confluência de i aproximadamente 70 %-80 %. HUVEC foram lavadas uma vez com meio basal/antibióticos (DMEM/F12 (Gibco)) e re-suspensas no mesmo meio na concentração desejada. HUVEC foram usadas em 1 hora de preparação.

Colágeno placentário huano (HPC) foi obtido em uma concentração de 1,5 . mg/mL em HCl 10 mM (f 2.25), foi "neutralizado" com tampão em f 7.2 e mantido no gel a té ser usado. O HPC foi combinado com a suspensão de HUVEC em uma concentração final de células de 4.000 células/UL. A suspensão HUVEC/HPC resultante foi imediatamente pipetada em placas de 96 poços, em 3 uL por poço (o perímetro da placa tem que ser preenchido com PBS estéril para evitar, n = 5 por condição). Gotas de HUVEC foram - incubadas a 37 ºC e 5 % de CO, para 75-90 minutos sem adição de meio para permitir a polimerização de colágeno. Mediante preenchimento de incubação ] "seca", cada poço foi carregado delicadamente com 200 uL de meio condicionado com AMDAC (n = 5 linhagens celulares) ou meio controle (por exemplo, DMEM/F12 como o controle negativo, e EGM-2 como o controle positivo) e a placa foi incubada a 37 ºC e 5 % de CO, por 20 horas. O meio condicionado foi preparado incubando células aderentes derivadas do âmnio na passagem 6 em meio de crescimento por 4 - 6 horas; após anexação e - aspersão, o meio foi trocado para DMEMV/F12 por 24 horas. Após incubação, o meio foi removido dos poços sem derramar as gotas de HUVEC e os poços foram lavadas uma vez com PBS. As gotas de HUVEC foram então fixas por 10 segundos e coradas por 1 minuto usando um estojo de coloração de célula DIff-Quik e subsequentemente rinsadas 3 x vezes com água estéril. As gotas — coradas secaram naturalmente e as imagens de cada poço foram adquiridas usando o microscópio Zeiss SteReo Discovery V8. As imagens foram então analisadas usando o pacote de software de computador, "ImageJ" e/ou MatLab. As imagens foram convertidas de coloridas para imagens em escala de cinza de 8-bit e limiarizadas para converter em uma imagem preto e branco.

A imagem foi então analisada usando as características de análise de partícula, que forneceram dados de densidade pixel, incluindo contagem (número de partículas individuais), área total, tamanho médio (de partículas individuais) e fração da área, qua equivale à quantidade de formação do tubo S — endotelialno ensaio. ' O meio condicionado exerce um efeito angiogênico nas células endoteliais, demonstrado pela indução da formação do tubo em proliferação (ver figura 4). Ensaio de migração de HUVEC Este experimento demonstrou a capacidade angiogênica de células aderentes derivadas do âmnio.

HUVECs foram crescidas em . confluência comem uma placa de 12 poços revestida com fibronectina (FN) e a monocamada foi "ferida" com a ponta de uma pipeta de plástico de 1 mL ] para criar uma linhagem não celular através do poço.

A migração de HUVEC foitestada incubando as células "feridas" com meio condicionado sem soro (EBM2; Cambrex) obtido de 5 linhagens celulares aderentes derivadas de âmnio após 3 dias de crescimento.

O meio EB M2 sem células foi usado como o controle.

Após 15 horas, a migração celular na área acelular foi registrada (n = 3) usando um microscópio invertido.

As fotos foram então analisadas usando o pacote de software de computador, "ImageJ" e/ou MatLab.

As imagens foram convertidas de coloridas para imagens em escala de cinza de 8-bit e limiarizadas para converter em uma imagem preto e branco.

A imagem foi então analisada usando as características de análise de partícula, que forneceram dados de densidade em pixel, incluindo a contagem — (número de partículas individuais), área total, tamanho médio (de partículas individuais), e fração da área, que equivale à quantidade de migração endotelial no ensaio.

O grau de migração celular foi classificado contra o tamanho da linhagem ferida registrada inicialmente e os resultados foram normalizados para 1x10º células.

Os fatores tróficos secretados por células aderentes derivadas do âmnio exerceram efeitos angiogênicos nas células endoteliais, demonstrado pela indução da migração celular (figura 5). Em um experimento separado, HUVECs foram crescidas em sub-confluência em uma placa de 96 poços revestida com FN, e a indução de . proliferação foi testada incubando as células com meio condicionado sem soro de cada uma das 5 linhagens celulares aderentes derivadas de âmnio (meio EBM-2, 3 dias). O meio EBM-2 foi usado como o controle negativo, e EGM -2 foi usado como o controle positivo.

Após 48 horas, a proliferação celular foi classificada por medições de teor de DNA usando um ensaio de proliferação celular com solução um Promega Cell Titer 968 (Promega, " Madison, WD.

As barras de erro representam desvios padrões de aréplicas analíticas (n=3) e os resultados foram normalizados em 1 x 10º células.

Í Os fatores tróficos secretados por células aderentes derivadas 15º do âmnio resultaram em um aumento na concentração de DNA, que é indicativo da proliferação de HUVEC.

Ver figura 6, onde "CM" é meio condicionado.

Absorção de lipoproteíina de baixa densidade acetilada (AcCLDL) para avaliação da eficácia angiogênica de células aderentes — derivadas do âmnio As células endoteliais e células microgliais na cultura podem ser identificadas cada uma por sua capacidade de capturar AcCLDL fluorescente.

Se os resíduos de lisina de apoproteina de LDL forem acetilados, o complexo LDL não se liga mais ao receptor LDL e, ao contrário, — podem ser capturados por células endoteliais e macrófagos de uma maneira celular altamente específica.

As células aderentes derivadas do âmnio foram crescidas tanto em meio de crescimento sem VEGF, quanto em EGM2-MV (Cambrex) com VEGF, para avaliar a capacidade angiogênica de células aderentes derivadas do âmnio em geral, bem como o efeito de VEGF na diferenciação potencial de células aderentes derivadas do âmnio.

As células foram cultivadas em seus respectivos meios em placas de 12 poços por 4 a 7 dias até atingirem 70-80 % de confluência, e subsequentemente foram incubadas com um lO0pug/mL de LDL acetilado (Invitrogen) por toda a noite.

As células foram então . contracoradas com Calcein AM (Invitrogen) e avaliadas por sua absorção de LDL acetilado usando microscópio de fluorescência.

HUVECs como células controle para absorção de LDL acetilado foram crescidas em EGM2-MV e analizadas da maneira descrita anteriormente.

As células aderentes derivadas —doâmnio exibiram absorção mínima de LD1 acetilado em condições normais de crescimento, mas foram induzidas/diferenciadas para aumentar sua

- absorção por meio de estímulo com VEGF.

Ver figura 7. Formação do tubo para avaliação da eficácia angiogênica de

] células aderentes derivadas do âmnio

As células aderentes derivadas do âmnio foram crescidas tanto em meio de crescimento sem VEGF quanto EGM2-MV com VEGF para avaliar a capacidade angiogênica das células em geral, bem como o efeito de VEGF no potencial de diferenciação das células.

HUVECs, como células controle para a formação do tubo, foram crescidas em EGM2-MV.

As células foram cultivadas nos respectivos meios por 4 a 7 dias, até que eles atingiram 70-80 % de confluência.

Solução fria (4 ºC) de MATRIGEL'Y (50 uL; BD Biosciences) foi dispensada nos poços de uma placa de 12 poços e a placa foi incubada por 60 minutos a 37 ºC para permitir a solução em gel.

As células AMDACs e HUVEC foram tripsinizadas, re-suspensas nos meios apropriados —(comesem VEGF) e 100 uL de células diluídas (1 a 3 x 10º células) foram adicionadas a cada um dos poços contendo MATRIGELMY, As células no MATRIGEL'Y polimerizado, na presença ou ausência de 0,5 a 100 ng VEGF, foram colocadas por 4 a 24 horas em uma incubadores com 5 % de CO, a 37 ºC.

Após incubação, as células foram avaliadas com relação à sinais de formação do tubo usando microscópio de luz padrão.

As células aderentes derivadas do âmnio exibiram formação mínima do tubo na ausência de VEGF, mas foram induzidas/diferenciadas para formar estruturas do tipo tubo por meio do estímulo com VEGF. Ver figura 8.

. Responsividade à hipóxia para avaliação da eficácia angiogênica de células aderentes derivadas do âmnio Para avaliar a funcionalidade angiogênica de células endoteliais e/ou progenitoras endoteliais, as células podem ser avaliadas com relação à sua capacidade de secretar fatores de crescimento angiogênicos em condições hipóxicas e normóxicas. A cultura em condições hipóxicas induz . em geral uma maior secreção de fatores de crescimento angiogênicos tanto por células endoteliais quanto por células progenitoras endoteliais, que pode ' ser medida nos meio condicionados. As células aderentes derivadas do âmnio foram plaqueadas em números celulares iguais em seu meio de crescimento padrão e crescidas em aproximadamente 70-80 % de confluência. Subsequentemente, as células foram alternadas em meio sem soro (EBM-2) e incubadas em condições normóxicas (21 % de Oz) ou hipóxicas (1 % de Ox) por 48 horas. Os meios condicionados foram coletados e a secreção de fatores de crescimento angiogênicos foi analisada usando estojos comercialmente disponíveis de ELISA da R&D Systems. Os ensaios de ELISA foram realizados de acordo com as instruções do fabricante e a quantidade dos respectivos fatores de crescimento angiogênicos (VEGF e IL-8) nos meios condicionados foi normalizada em 1 x 10º células.

As células aderentes derivadas do âmnio exibiram elevada secreção de vários fatores de crescimento angiogênicos em condições hipóxicas. Ver figura 9.

Em um experimento separado, AMDACs foram plaqueadas em números celulares iguais em meio de crescimento padrão e crescidas em aproximadamente 70-80 % de confluência. Subsequentemente, as células foram alternadas em meio sem soro (EBM-2) e incubadas em condições normóxicas (21 % de Oz) ou hipóxicas (1 % de O») por 48 horas. As células foram submetidas a análises de citometria de fluxo com relação ao marcador “5 celular CD202b (também conhecido como Tie2, Tek, ou receptor de : angiopoietina-l), um receptor envolvido no desenvolvimento vascular e angiogênese. Os meios condicionados foram coletados, e a secreção de fatores de crescimento angiogênicos foi analisada usando estojos de ELISA disponíveis comercialmente (R&D Systems). As análise de citometria de fluxo foram realizadas de acordo com a maneira descrita anteriormente, e os ensaios de ELISA foram realizados de acordo com as instruções do . fabricante. A quantidade dos respectivos fatores de crescimento angiogênicos nos meios condicionados foi normalizada em 1 x 10º células. AMDACs i exibiram elevada expressão de CD202b em condições hipóxicas, comparadas àscondições normóxicas. Ver figura 10.

Diferenciação cardiomiogênica para avaliação da eficácia angiogênica de células aderentes derivadas do âmnio Para induzir a diferenciação de células progenitoras para uma linhagem de cardiomiócito, uma combinação de cultura de gota pendente (HD, para deter a proliferação das células e iniciar o processo de diferenciação) com tratamento subsequente das células presas ao crescimento com fatores específicos foi realizada em vários estágios. Após a cultura da gota pendente, as células foram induzidas com combinações de activina A, proteína morfogenética óssea 4 (BMP4), fator de crescimento de fibroblasto básico (DFGF, também conhecido como FGF2), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF, também conhecido como VEGFA) e homólogo de cabeça espessa 1 (DKK1) por um período de 16 dias. Resumindo, as células aderentes derivadas do âmnio foram crescidas em aproximadamente 70 % de confluência em meio de crescimento padrão. As células foram então tripsinizadas e lavadas em tampão da maneira previamente descrita. Gotas de 20 uL contendo 700 células foram suspensas no meio relevante e colocadas no lado interno da tampa de uma placa de Petri de 100 mm usando uma pipeta multicanal. A tampa foi cuidadosamente invertida e colocada sobre a placa, que continha 25 mL de PBS estéril, para manter as gotas secando. As culturas ' de gota pendente foram incubadas por 48 horas a 37 ºC em uma incubadora com 5 % de CO. Subsequentemente, os corpos agregados das células foram re-semeados em plates de cultura revestidas com meio de diferenciação específico para a linhagem contendo 0,1 % de gelatina para indução adicional. As etapas de estímulo continuam da maneira a seguir: Estágio 1, 4 dias BMP4 (0,5 ng/niL); Estágio 2, 5 dias BMP4 (10 ng/mL), bFGF (5 . ng/mL), Activina A (3 ng/mL); Estágio 3, 3 dias VEGF (10 ng/mL), DKK1 (150 ng/mL); Estágio 4, 4 dias VEGF (10 ng/mL), DKK1 (150 ng/mL), bEGF (5 gmL) (+/- 510 nM 5-AZA-citidina). Subsequentemente, o RNA total das células tratadas foi preparado e análises de qRT-PCR para marcadores cardiomiogênicos foram realizadas da maneira descrita previamente.

Os resultados mostraram que as células aderentes derivadas do âmnio podem ser induzidas/diferenciadas para expressar vários marcadores cardiomiociticos. Ver figura 11.

Resposta de HUVEC ao meio condicionado com AMDAC AMDACs foram cultivadas por 48 horas em meio de crescimento contendo DMEM- LG 60 % (Gibco); MCBD-201 40 % (Sigma); FBS 2 % (Hyclone Labs), insulina-transferrina-selênio 1x (ITS); 10 ng/mL de ácido linolêico-albumina bovina sérica (LA-BSA); 1 n- dexametasona (Sigma); 2-fosfato de ácido ascórbico 100 uM (Sigma); 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (R & D Systems); e 10 ng/ml de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF-BB) (R & D Systems), e então cultivadas por mais 48 horas adicionais em meios sem soro. O meio condicionado a partir de cultura de AMDAC foi coletado e usado para estimular HUVECs sem soro por 5, 15, e 30 minutos. As HUVECs foram subsequentemente lisadas e coradas com um estojo flexível de sinalização celular BDTM CBA (ensaio de microesfera citométrica) (BD Biosciences) para fosfoproteínas conhecidas para desempenhar um papel na sinalização da via angiogênica. Observou-se que as AMDACs são fortes ativadores de AKT-I ' (que inibe processos apoptóticos), AKT-2 (que é uma importante proteína de sinalização na via de sinalização de insulina, e vias de proliferação celular ERK 1/2 em HUVECs. Estes resultados demonstram adicionalmente a capacidade angiogênica de AMDAC's.

EXEMPLO 4: INDUÇÃO DE ANGIOGÊNESE POR

AMDACS . Este exemplo demonstra que AMDACs promovem angiogênese em um ensaio in vivo usando membrana corioalantóide de Í galinha (CAM).

Dois ensaios separados de CAM foram conduzidos. No primeiro ensaio de CAM, os precipitados celulares intactos de diferentes preparações de AMDACs foram avaliados. No segundo ensaio de CAM, sobrenadantes de diferentes preparações de AMDACs foram avaliados. Fator de crescimento de fibroblasto (DFGF) foi usado como um controle positivo, e células de câncer de mama humano MDA-MB-231 como uma referência (controle negativo). O ponto final do estudo foi determinar as densidades de vaso sanguíneo de todos os grupos de tratamento e controle.

Ensaio de CAM usando células Três preparações de células AMDACs, aqui referidas como Lote1l,Lote2 e Lote 3, preparadas da maneira descrita anteriormente e crioconservadas, foram usadas. AMDACSs foram descongeladas para dosagem e o número de células dosadas no CAM foi determinado.

Desenho do estudo: O estudo incluiu 7 grupos com 10 embriões em cada grupo. O desenho do estudo é descrito na tabela 6. Tabela

6: Grupos de estudo, ensaio de angiogênese de membrana corioalantóde de galinha.

Número do f de Tratamento Ponto final grupo embriões 1 'eículo controle (40 uL de mistura [Pontuação da densidade do vaso PBS/MATRIGEL"", 1:1 em volume) sanguíneo 7 PR 'ontrole positivo tratado com bFGF (100 O mesmo do grupo 1 Ig/CAM in 40 ul of DMEM/ MATRIGELTM imixture, 1:1 ' B ho -—— Meiocontrole(101AofDMEM BH ho — jAMDACS,.Lotl EB fo —— TAMDACS, Lot2 EB ho —— jAMDACS,Lot3 E do Células MDA-MB-231 P34, Lot No. 092608 Procedimento de ensaio de CAM: Ovos férteis frescos foram incubados por 3 dias em uma incubadora de ovos padrão a 37 ºC por 3 dias. —Nodia3,osovos foram quebrados em condições estéreis e os embriões foram : colocados em vinte placas de plástico de 100 mm e cultivados a 37 ºC em uma incubadora de embrião com um reservatório de água no fundo da Í prateleira.

O ar foi borbulhado continuamente no reservatório de água usando uma bomba pequena, de maneira tal que a umidade na incubadora fosse mantida constante.

No dia 6, um anel de silicone em "O" estéril foi colocado em cada CAM, e a seguir as AMDACs em uma densidade de 7,69 x 10º células/40 uL da mistura meio/MATRIGEL'Y (1:1) foram distribuídas em cada anel em "O" em um capuz estéril.

As tabelas 2A e 2B representam o número de células usado e a quantidade de meio adicionado em cada 15º preparação de célula para dosagem.

Os embriões do veículo controle receberam 40 uL de veículo (PBS/ MATRIGEL'Y, 1:1), os controle positivos receberam 100 ngml bLFGF em 40 ul da mistura de meio DMEM/MATRIGEL'Y (1:1), e os meios controle receberam 40 uL de meio DMEM sozinho.

Os embriões retornaram para a incubadora após cada dosagem ter terminado.

No dia 8, os embriões foram removidos da incubadora e mantidos em temperatura ambiente, enquanto a densidade do vaso sanguíneo foi determinada em cada anel em "O" usando um sistema de captura de imagem em uma magnificação de 100 X.

A densidade do vaso sanguíneo foi medida por um sistema de i classificação de angiogênese que usou números aritméticos O a 5, ou números exponenciais 1 a 32, para indicar o número de vasos sanguíneos presentes nos sítios de tratamento na CAM.

Números mais elevados de pontuação representaram maior densidade do vaso, enquanto O representou nenhuma ' angiogênese.

O percentual de inibição em cada sítio de dosagem foi calculado usando a classificação registrada para este sítio dividido pela classificação média obtida das amostras controle para cada experimento individual.

O percentual de inibição para cada dose de um dado composto foi calculado — agrupando todos os resultados obtidos para aquela dose de 8-10 embriões.

Tabela 7: Quantidade de meio adicionado a cada preparação de célula para . normalização da suspensão celular final para dosagem.

Linhagem celular | Tamanho do Normalização com DMEM e Volume final de suspensão | eme eioaão [Mame o [VE ' Todas as células foram usadas na passagem 6 Resultados Os resultados da densidade do vaso sanguíneo são apresentadas na figura 12. Os resultados indicam claramente que as classificações da densidade do vaso sanguíneo de membranas corioalantóide de galinha tratadas com cada uma das suspensões de célula tronco, ou 100 ng/nil. de bFGF, ou suspensões de célula de câncer de mama MDAMB?231, foram mais estatisticamente significantes comparadas aquelas CAMs do veículo controle (P < 0,001, teste "t" de Student). O meio usado para cultivar as células tronco não apresentou nenhum efeito na densidade do vaso sanguíneo.

Adicionalmente, a indução da densidade do vaso sanguíneo de preparações de AMDACs mostrou a mesma variação, mas as variações não foram estatisticamente significativas.

Isto conclui que a eficácia de indução de cada uma das preparações de 5 células tronco foi aproximadamente a mesma.

Ensaio de CAM usando sobrenadantes de células AMDACs Amostras do sobrenadante das células MDA-MB-231 e de cada uma das diferentes preparações de célula tronco descritas nos ensaios de CAM com AMDACs anteriores foram usadas em um segundo ensaio de —CAM.

Assim como no ensaio CAM das AMDACSs, células PFGF e MDA- 1 MB-231 foram usadas como controle positivos.

Desenho do estudo: O estudo incluiu 7 grupos com 10 embriões em cada grupo.

O desenho do estudo é descrito na tabela 8. Tabela 8: Desenho do estudo — ensaio de CAM usando —subrenadantes celulares 10 Veículo controle (40 uL de mistura Pontuação da densidade do vaso PBS/MATRIGEL”Y, 1:1 em volume) sanguíneo - 2 Controle positivo tratado com bFGF O mesmo do grupo 1 (100 ng/CAM em 40 IA de DMEM/ MATRIGEL"Y mistura, 1:1)

. 3 o Meio de controle (40 IA of DME) | 4 | 1 | Sobrenadantecontrolede AMDACs Lote] Ls | To À) Sobrenadantecontrolede AMDACs Lote? | 6 | 10 | Sobrenadantecontrolede AMDACSsLote3

7 As células AMDACSs foram usadas como O me: d 1 passagem 6 (P34) mesmo do grupo As células AMDACSs foram usadas como passagem 6. Procedimento de ensaio de CAM: O procedimento de ensaio foi o mesmo da maneira descrita anteriormente nos ensaios de CAM em AMDACs.

A única diferença foi que o sobrenadante de cada preparação de —célulatronco ou de células MDA-MB-231 foi usado como material teste.

Para a dosagem, cada sobrenadante foi misturado com MATRIGEL'YM (1:1 by volume) e 40 uL da mistura foi dosada em cada embrião.

Resultados As pontuações de densidade de vaso sanguíneo (ver figura 13) indicam que a indução de formação de vaso sanguíneo pelo sobrenadante de cada preparação de célula tronco foi diferente.

As amostras de sobrenadante dos três lotes de AMDACs mostraram efeitos significantes na indução do vaso sanguíneo com P < 0,01, P < 0,001, e P < 0,02 (teste "t"de Student)

respectivamente. Da maneira esperada, o controle positivo bFGF também mostrou potente indução de formação de vaso sanguíneo, da maneira observada anteriormente no ensaio CAM no. 1 (P < 0,001, teste "t" de Student). Entretanto, o sobrenadante de células de câncer de mama humano MDA-MB-231 não mostraram indução significativa na formação do vaso ' sanguíneo comparado aos veículos controle. Da maneira previamente mostrada, o meio de cultura sozinho não apresentou nenhum efeito.

EXEMPLO 5: AMDACS EXIBEM EFEITO

NEUROPROTETOR Este exemplo demonstra que as AMDACSs apresentam um efeito neuroprotetor em condições de baixo oxigênio e baixa glicose, usando . um ensaio insulto de privação de oxigênio-glicose (OGD), e reduzem espécies de oxigênio reativo. Como tal, estes resultados indicam que AMDACS seriam ' utilizadas para tratar condições isquêmicas, tal como acidente vascular ou doença vascular periférica, e protegeriam contra lesões por reperfusão que resultam de condições isquêmicas.

Neurônios humanos (ScienCell, catalog 4 1520) foram cultivados de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, os vasos de cultura foram revestidos com Poli-L-Lisina (2ug/mL) em água destilada estéril por 1 hora a 37.ºC. O vaso foi lavado com H,O bidestilada três vezes. O meio de neurônio (ScienCell) foi adicionado ao vaso e equilibrado a 37 ºC em uma incubadora. Os neurônios foram descongelados e adicionados diretamente nos vasos sem centrifugação. Durante cultivo subsequente, o meio foi trocado no dia após o início do cultivo e a cada dia — posteriormente. Os neurônios ficaram tipicamente prontos para insulto no dia

4.

O meio OGD (meio Eagle modificado por Dulbecco sem glicose) foi preparado aquecendo primeiro o meio em um banho maria, em parte para reduzir a solubilidade de oxigênio no meio líquido. 100 % de nitrogênio foi borbulhado por 30 minutos através do meio usando uma pedra de difusão de 0,5um para remover o oxigênio dissolvido. O Tampão HEPES foi adicionado em uma concentração final de 1 MM. O meio foi adicionado diretamente nos neurônios no final da pulverização. Uma amostra pequena do meio foi aliquotada para confirmação dos níveis de oxigênio usando um ' sensor de oxigênio do tipo imerso. Os níveis de oxigênio foram tipicamente reduzidos em 0,9 % a cerca de 5,0 % de oxigênio.

Uma câmara de hipóxia foi preparada colocando a câmara em uma incubadora a 37 ºC por pelo menos 4 horas (preferivelmente por toda a noite) antes da gazeificação. O meio nos vasos de cultura foi removido e substituído com o meio desgaseificado, e os vasos de cultura foram colocados . na câmara de hipóxia. A câmara de hipóxia foi então descarreagada com gás N; 95 %/CO, 5 % gas por meio do sistema em uma taxa de 20-25 Lpm por Í pelo menos 5 minutos. O sistema foi incubado na incubadora a 37 ºC por 4 horas, com desgaseificação da câmara mais uma vez após 1 hora.

Na conclusão do procedimento do insulto, o meio OGD aspirado e aquecido foi adicionado aos neurônios. Após 24-28 horas, AMDACSs e neurônios que foram plaqueados em números iguais a 100.000 células por poço de uma placa de 6 poços suspensos em meio de neurônio foram adicionados aos neurônios e co-cultivados por 6 dias.

Fotomicrografias foram obtidas de campos aleatórios em uma placa de 6 poços para cada condição. As células com uma morfologia típica de neurônio foram identificadas, e os tamanhos de neurite foram registrados. O tamanho médio das neurites correlacionaram-se positivamente com a saúde —do neurônio, e foram maiores em co-cultivos de neurônios e AMDACSs, indicando que as AMDACs foram protegidas das células do insulto.

Ensaio de espécies de oxigênio reativo AMDACs foram determinadas para expressar o gene de superóxido dismutase, catalase, e heme oxigenase durante hipóxia. A capacidade de AMDACSs de capturar espécies de oxigênio reativo, e proteger células de tais espécies, foi determinada em um ensaio usando peróxido de hidrogênio como um gerador de espécies de oxigênio reativo. Descrição do ensaio: Células alvo (Astrócitos, ScienCell “5 Research Laboratories) foram semaeadas em placas de poços negros de 96 ' poços pré-revestidos com poli-L-lisina em 6.000/cm”. Os astrócitos são anexados naturalmente por toda a noite em meio de crescimento a 37 ºC com % de dióxido de carbono. No dia seguinte, os meios de cultura foram removidos e as células foram incubadas com corante permeável de célula —DCFH-DA (diacetato de diclorofluorescina), que é uma sonda fluorogênica. O corante em excesso foi removido lavando com salina tamponada com « fosfato de Dulbecco ou solução de salina tamponada de Hank. As células foram então insultadas com espécies de oxigênio reativo por adição de Í peróxido de hidrogênio 1.000 uM por 30-60 minutos. O meio contendo peróxido de hidrogênio foi então removido e substituído por meio de crescimento sem soro e sem glicose. AMDACSs (ambas as células designadas como Lote 1 ou Lote 2), ou BM-MSC', foram adicionadas em 6.000/cm”, e as células foram cultivadas por mais 24 horas. As células foram então lidas em um leitor de placa fluorescente padrão em 480Ex e 530Em. O teor de espécies de oxigênio reativo do meio foi diretamente proporcional nos níveis de DCFH-DA no citossol da célula. O teor das espécies de oxigênio reativo foi medido por comparação em curva padrão DCF pré-determinada. Todos os experimentos foram realizados com N=24.

Para o ensaio, DCFH-DA 1x foi preparada imediatamente — antes do uso diluindo uma solução estoque de DCFH-DA 20x para 1x em meios de cultura de célula sem soro fetal bovino, e agitando para homogeneidade. As diluições de peróxido de hidrogênio (ELO) foram preparadas em DMEM ou DPBS da maneira necessária. Uma curva padrão foi preparada como uma diluição seriada 1:10 em variação da concentração de

0 uM a 10 uM diluindo DCF padrão ImM em meios de cultura de célula, transferindo 100 ul de DCF padrão para uma placa de 96 poços para medições fluorescentes, e adicionando 100 uL de tampão de lise celular. À fluorescência foi lida em 480Ex e 530Em. Resultados: Ambos os lotes de AMDACSs usados reduziram . significativamente a concentração de espécies de oxigênio reativo nas co- culturas de astrócito. Ver figuras 14A e 14B. Ao contrário, BM-MSCs não conseguiram reduzir significativamente as espécies de oxigênio reativo nas culturas de astrócito.

MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO CÉLULAS

ADERENTES DERIVADAS DO ÂMNIO s Tratamento de infarto do miocárdio Um indivíduo do sexo masculino por volta dos 50 apresenta Í dor no peito radiante para o braço esquerdo por mais de 20 minutos, falta de 15º respiração, náusea, palpitações, transpiração. Com os resultados do eletrocardiograma e altos e baixos nos níveis sanguíneos de creatine quinase, é realizado um diagnóstico dferencial de infarto do miocárdio (transmural) da parede anterior do coração. Após a estabilização do indivíduo com nitroglicerina e estreptoquinase, é administrado ao indivíduo 1 x 10º to 5 x 10º AMDACs em salina 0,9 % diretamente na área afetada usando uma seringa cardíaca com anestésico local. O indivíduo é monitorado em uma base de emergência nas próximas 72 horas. O indivíduo é monitorado adicionalmente pelos próximos três meses após o tratamento por eletrocardiograma e/ou técnicas de visualização de corante para avaliar a extensão da revascularização da área infartada. A eficiência terapêutica é estabelecida se os resultados do eletrocardiograma forem muito discerníveis do normal do que antes da administração das AMDACS, ou se a área infartada, da maneira visualizada, for discernivelmente revascularizada. Tratamento de cardiomiopatia

Um indivíduo apresenta falta de ar, inchaço das pernas e tornozelos, e batimentos cardíacos irregulares.

Após excluir outras causas, e com um eletrocardiograma confirmatório, um diagnóstico de cardiomiopatia é realizado.

Um sonograma confirma que o indivíduo apresenta cardiomiopatia —congestiva.

É administrado ao indivíduo 1 x 10º to 5 x 10º AMDACs em F salina 0,9 % diretamente na artéria cardíaca usando uma seringa cardíaca com anestésico local.

O indivíduo é monitorado pelos próximos três meses com relação à mudanças nas leituras do sonograma, indicando mais fluxo sanguíneo normal, e com relação a melhorias na sensação de falta de ar e redução no inchaço das pernas e tornozelos.

Eficiência terapêutica é estabelecida para os indivíduos se nenhum destes sinais mostra melhorias . durante o período de monitoramento.

Tratamento de doença vascular periférica Um indivíduo que apresenta pés frios com formigamento que —setornam vermelhos mediante balanço, e dor, fraqueza e cansaço nas pernas.

Após excluir diabetes, um diagnóstico de doença de artéria periférica é realizado.

É administrado ao indivíduo 1 x 10º a 5 x 10º AMDACs de maneira intravenosa em 450 mL de salina 0,9 %, e é monitorado pelos próximos três meses.

À eficiência terapêutica é estabelecida se quaisquer dos — sintomas descritos anteriormente melhoram período de monitoramento.

Tratamento de doença vascular periférica Um indivíduo apresenta pés frios com formigamento que se tornam vermelhos com o balanço, e dor, fraqueza e cansaço nas pernas.

É — administrado ao indivíduo 1 x 10º a 5 x 10º AMDACS intramuscularmente em S mL de salina 0,9 %, e/ou uma quantidade equivalente intravenosamente ou intra-arterialmente, localmente entre os dedos do pé, e é monitorado pelos próximos três meses.

A eficiência terapêutica é estabelecida se quaisquer dos sintomas descritos anteriormente melhoram o período de monitoramento.

Combinação de tratamento de doença vascular periférica Um indivíduo apresenta pés frios com formigamento que se tornam vermelhos com o balanço, e dor, fraqueza e cansaço nas pernas.

É “5 administrado ao indivíduo 1x 10º a 5x 10º AMDACSs intravenosamente em . 450 mL de salina a 0,9 %, e é monitorado pelos próximos três meses.

É também prescrito ao indivíduo Cilostazol, 100 mg, para ser tomado duas vezes ao dia.

Eficiência terapêutica é estabelecida se quaisquer dos sintomas descritos anteriormente melhoram o período de monitoramento.

Combinação de terapia de doença vascular periférica Um indivíduo apresenta pé frio com formigamento que se . torna vermelho com o balanço, e dor, fraqueza e cansaço na perna direita.

Após excluir diabetes, um diagnóstico de doença de artéria periférica é À realizado.

É administrado ao indivíduo que se submete a angioplastia e cirurgia implantar uma endoprose expansível na artéria femoral.

É subsequentemente administrado ao indivíduo 1 x 10º a 5 x 10º AMDACs intravenosamente em 450 mL de salina 0,9 %, e é monitorado pelos próximos três meses.

Tratamento de acidente vascular usando AMDACs Um indivíduo do sexo masculino de 52 anos apresenta hemiplegia no lado esquerdo do corpo e afasia parcial.

Um diagnóstico de acidente vascular isquêmico é realizado.

Após localizar a área de isquemia usando imageamento por ressonância magnética, o indivíduo é preparado para cirurgia para criar uma abertura no crânio no lado afetado.

Uma vez que a abertura é realizada, 5 x 10? a 1 x 10º AMDACs em 1- 2 mL de solução salina 0,9 % são administradas na área isquêmica.

O indivíduo é monitorado pelos próximos 7-14 dias quanto a sinais de melhorias em qualquer sintoma do acidente vascular, particularmente hemiplegia ou afasia.

A eficiência terapêutica é estabelecida se quaisquer dos sintomas descritos anteriormente Í melhoram o período de monitoramento. Tratamento de acidente vascular usando AMDACs Um indivíduo do sexo masculino de 52 anos apresenta hemiplegia no lado esquerdo do corpo e afasia parcial. Um diagnóstico de Wi acidente vascular isquêmico é realizado. Após localizar a área de isquemia usando imageamento por ressonância magnética, o indivíduo é preparado para cirurgia para criar uma abertura no crânio no lado afetado. Uma vez que a abertura é realizada, 1 x 10º a 5 x 10º AMDACs em 450 mL de solução salina 0,9% são administradas intravenosamente. O indivíduo é monitorado pelos próximos 7-14 dias com relação aos sinais de melhorias em qualquer sintoma A do acidente vascular, particularmente hemiplegia ou afasia. Eficiência terapêutica é estabelecida se quaisquer dos sintomas descritos anteriormente í melhoram o período de monitoramento. Equivalentes: A presente invenção não é limitada no escopo pelas modalidades específicas da maneira aqui descrita. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas descritas, se tornarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição precedente e figuras em anexo.

— Pretende-se que tais modificações estejam no escopo das reivindicações em anexo.

Várias publicações, patentes e pedidos de patente são aqui citados, cujas revelações são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.

Claims

REIVINDICAÇÕES i 1. Composição, caracterizada pelo fato que compreende uma . célula isolada aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para cultura de tecidos, e em que a dita célula é OCT-4' (proteína de ligação do octâmero 4) como determinada por RT-PCR e HLA-G,como determinada por RT-PCR.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita célula é adicionalmente CD49f', da maneira determinada por citometria de fluxo.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita célula é CD90”, CDI05* ou CDI117', da maneira determinada por citometria de fluxo.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a dita célula é CD90”, CD105* e CD117.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a dita célula é OCT-4' e HLA-G”, da maneira determinada por RT-PCR, e CD49f”, CD90*, CD105* e CD117' da maneira determinada por citometria de fluxo.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita célula é VEGFRI/FIt-I' (receptor do fator de crescimento endotelial vascular 1) e VEGFR2/KDR' (receptor do fator de i crescimento — endotelial vascular 2), da maneira determinada por : imunolocalização.
7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada — pelo fato de que a dita célula é uma ou mais de CD9”, CD10*, CD44”, CD54”, CD98*, Tie-2* (receptor de angiopoietina), TEM-7* (marcador endotelial de tumor 7), CD31', CD34, CD45', CD133”, CDI43' (enzima conversora de agiotensina 1, ACE), CD146' (molécula de adesão de célula de melanoma), ou
CXCR4 (receptor 4 de quimiocina (motivo C-X-C)) da maneira determinada K por imunolocalização. . 8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita célula é CD9* CDI0”, CD44”, CD54*, CD98*, Tie-2* — (receptor de angiopoietina), TEM-7* (marcador endotelial de tumor 7), CD31, CD34', CD45”, CD133”, CD143”, CD146' e CXCR4, da maneira determinada por imunolocalização.
9. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita célula é VE-caderina”, da maneira determinada por imunolocalização.
10. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita célula é adicionalmente positiva para CD105* e CD200”, da maneira determinada por imunolocalização.
11. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita célula não expressa CD34' da maneira detectada por imunolocalização após exposição a 50 ng/mL de VEGF por 7 dias.
12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma população isolada de células que compreendem a célula como definida nareivindicação 1.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, | caracterizada pelo fato de que pelo menos 50 % das células na dita população . são as células como definidas na reivindicação 1.
14. Composição de acordo com a reivindicação 12, — caracterizada pelo fato de que pelo menos 90 % das células na dita população são as células como definidas na reivindicação 1.
15. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma população isolada de células que compreendem a célula como definida na reivindicação 5.
16. Composição de acordo com a reivindicação 15, . caracterizada pelo fato de que pelo menos 50 % das células na dita população são as células como definidas na reivindicação 5.
17. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que pelo menos 90 % das células na dita população são as células como definidas na reivindicação 5.
18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula isolada aderente derivada de âmnio como definida na reivindicação 1 ou6.
19. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo tipo de célula, em que o dito segundo tipo de célula é uma célula tronco embrionária, uma célula sanguínea, uma célula tronco isolada do sangue periférico, uma célula tronco isolada do sangue placentário, uma célula tronco isolada de perfusado placentário, uma célula tronco isolada de tecido placentário, uma célula tronco isolada de sangue do cordão umbilical, uma célula tronco do cordão umbilical, uma célula tronco mesenquimal derivada de medula óssea, uma célula estromal mesenquimal derivada da medula óssea, uma célula tronco —hematopioética, uma célula tronco somática, um condrócito, um fibroblasto, uma célula muscular, uma célula endotelial, um angioblasto, uma célula À progenitora endotelial, um pericito, um cardiomiócito, um miócito, um : cardiomioblasto, um mioblasto, uma célula tronco embrionária, ou uma célula manipulada para se assemelhar a uma célula tronco embrionária.
20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50 % das células na dita população são as células como definidas na reivindicação 1.
21. Composição de acordo com a reivindicação 19,
caracterizada pelo fato de que o dito segundo tipo de célula compreende pelo menos 10 % das células na dita população. . 22. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o dito segundo tipo de célula compreende pelo —menos25% das células na dita população.
23. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o dito segundo tipo de célula é uma célula progenitora ou tronco hematopoiética.
24. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a dita célula tronco hematopoiética ou progenitora é uma célula CD34*.
25. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula isolada aderente derivada de âmnio, em que a dita célula é aderente ao plástico para cultura de tecidos, e em que a dita célula é OCT-4, da maneira determinada por RT-PCR, e CD49f”, HLA-G”, CD90*, CD105* e CD117', da maneira determinada por imunolocalização, e em que a dita célula: (a) expressa uma ou mais de CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRI/FIt-1, ou VEGFR2/KDR (CD309), da —maneiradeterminada por imunolocalização; (b) expressão ausente de CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, Í CD143, CD144, CD146, CD271, CXCRA4, HLA-G, ou VE-caderina, da . maneira determinada por imunolocalização, ou expressão ausente de SOX2, da maneira determinada por RT-PCR; (c) expressa RNAm para ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG, ANGPT1I, ANGPT2, ANGPTLI, ANGPTL2, ANGPTLA, BAII, CD44, CD200, CEACAMI1, CHGA, COLISAI, COLISAI, COL4AI, COL4A?2, COL4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDGI1,

EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLNS, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLTA4, FNI, FEST, | FOXC2, GRN, HGF, HEY 1, HSPG2, IFNBI], IL8, IL12A, ITGAA, ITGAV, : ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRPI, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINBS5,

5 —SERPINCI, SERPINFI, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, TIEI, TIE2/TEK, TNF, TNNIl, TNFSFIS, VASH1I, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFRI/FLTI1 ou VEGFR2/KDR;

(d) expressa uma ou mais das proteínas CD49d, Conexina-43, HLA-ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDL1, CDI106,

—Galectina-l, ADAM 17, precursor de angiotensinogênio, filamina A, alfa- actinina 1, megalina, receptor LDL acetilado de macrófago I e II, precursor do tipo IIB do receptor activina, proteína Wnt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrócito, proteína C de ligação à miosina, ou cadeia pesada de miosina tipo não muscular A;

(e) secreta VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, folistatina, G- CSF, EGF, ENA- 78, GRO, IL-6, MCP-I, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, ou Galectina-1 em meio de cultura no qual a célula cresce;

(D expressa micro RNAs Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi- 19b, Rmi-92, ou Rmi-296 em um nível maior que um número equivalente de

—célulastroncomensenquimais derivadas de medula óssea;

(g) expressa micro RNAs Rmi-20a, Rmi-20b, Rmi-221, Rmi- 222, Rmi-15b, ou Rmi-16 em um nível menor que um número equivalente de - células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea;

(b) expressa RNAsmi Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi-

—19b, Rmi-92, Rmi-20a, Rmi-20b, Rmi-296, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, ou Rmi-16; ou

(1) expressa níveis maiores de CD202b, IL-8 ou VEGF quando cultivada em menos que cerca de 5 % de O», comparada à expressão de

CD202b, IL-8 ou VEGF em 21 % de O;; e um veículo farmaceuticamente aceitável. .
26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a dita célula é OCT-4", da maneira determinada —porRT-PCR, e CD49f', HLA-G, CD90”, CDI05*, e CDI17”, da maneira determinada por imunolocalização, e em que a dita célula: (a) expressa CD9, CD10, CD44, CD54, CD98, CD200, Tie-2, TEM-7, VEGFRIFIt-l,/ e/ou VEGFR2/KDR (CD309), da maneira determinada por imunolocalização;

(b) expressão ausente de CD31, CD34, CD38, CD45, CD133, CD143, CD1I44, CD146, CD271, CXCR4, HLA-G, e/ou VE-caderina, da maneira determinada por imunolocalização, e/ou expressão ausente de SOX2, da maneira determinada por RT-PCR;

(c) expressa RNAm para ACTA2, ADAMTS1, AMOT, ANG,

ANGPTI, ANGPT2, ANGPTLI, ANGPTL2, ANGPTLA, BAII, CD44, CD200, CEACAMI, CHGA, COLISAI, COLISAI, COL4A1I, COL4A)?2, COLA4A3, CSF3, CTGF, CXCL12, CXCL2, DNMT3B, ECGF1, EDGI, EDIL3, ENPP2, EPHB2, FBLNS, F2, FGF1, FGF2, FIGF, FLTA4, FNI, FST, FOXC2, GRN, HGF, HEY 1, HSPG2, IFNB1, IL8, IL12A, ITGAA, ITGAV,

1ITGB3, MDK, MMP2, MYOZ2, NRPI, NRP2, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, PF4, PGK1, PROX1, PTN, SEMA3F, SERPINBS5,

i SERPINC1, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, TGFA, TGFB1, THBS1, THBS2, . TIEI, TIENTEK, TNF, TNNIl, TNFSFI5, VASHI, VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFRI/FLTI e/ou VEGFR2/KDR;

(d) expressa uma ou mais de CD49d, conexina-43, HLA-ABC, Beta 2-microglobulina, CD349, CD318, PDL1, CD106, Galectina-1, ADAM 17, precursor de angiotensinogênio, filamina A, alfa-actinina 1, megalina, receptor LDL acetilado de macrófago I e II, precursor do tipo IIB do receptor activina,

proteína Wnt-9, proteína acídica fibrilar glial, astrócito, proteína C de ligação à miosina, e/ou cadeia pesada de miosina, tipo não muscular A; . (e) secreta uma ou mais de VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, folistatina, G- CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-I, PDGF-BB, TIMP-2, uPARegalectina-l em meio de cultura no qual a célula cresce; (£) expressa micro RNAs Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi- 19b, Rmi-92, e/ou Rmi-296 em um nível maior que um número equivalente de células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea; | (g) expressa micro RNAs Rmi-20a, Rmi-20b, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, e/ou Rmi-16 em um nível menor que um número equivalente de células tronco mensenquimais derivadas de medula óssea; e (b) expressa RNAsmi Rmi-17-3p, Rmi-18a, Rmi-18b, Rmi-19b, Rmi-92, Rmi-20a, Rmi-20b, Rmi-296, Rmi-221, Rmi-222, Rmi-15b, e/ou Rmi- l6;e (1) expressa níveis maiores de CD202b, IL-8 e/ou VEGF quando cultivada em menos que cerca de 5 % de Ox, comparada à expressão de CD202b, 1IL-8 e/ou VEGF em 21 % de O;.
27. Composição, caracterizada pelo fato de compreende uma população isolada de células que compreende células como definidas na reivindicação 25 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
28. Composição, caracterizada pelo fato de compreende uma | população isolada de células que compreende células como definidas na . reivindicação 26 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
29. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma — população isolada de células, em que pelo menos 50 % das células na dita população são células humanas aderentes derivadas de âmnio, em que as ditas células aderentes derivadas de âmnio são aderentes ao plástico para cultura de tecidos, e em que as ditas células aderentes derivadas de âmnio são OCT-4"
(proteína de ligação do octâmero 4) da maneira determinada por RT-PCR, e ] CD49f', CD90* e HLA-G”, da maneira determinada por citometria de fluxo. , 30. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que em que pelo menos 70 % das células na dita população são — células aderentes derivadas de âmnio.
31. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que em que pelo menos 80 % das células na dita população são células aderentes derivadas de âmnio.
32. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que em que pelo menos 90 % das células na dita população são células aderentes derivadas de âmnio.
33. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que em que pelo menos 95 % das células na dita população são células aderentes derivadas de âmnio.
34. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que em que pelo menos 99 % das células na dita população são células aderentes derivadas de âmnio.
35. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma população isolada de células como definidas em qualquer uma das reivindicações 29-34.
36. Composição de acordo com qualquer uma das | reivindicações 29 a 34, caracterizada pelo fato de que compreende um . segundo tipo de célula, em que o dito segundo tipo de célula é uma célula tronco embrionária, uma célula sanguínea, uma célula tronco isolada do sangue periférico, uma célula tronco isolada do sangue placentário, uma célula tronco isolada de perfusado placentário, uma célula tronco isolada de tecido placentário, uma célula tronco isolada de sangue do cordão umbilical, uma célula tronco do cordão umbilical, uma célula tronco mesenquimal derivada de medula óssea, uma célula estromal mesenquimal derivada da ' medula óssea, uma célula tronco hematopioética, uma célula tronco somática, . um condrócito, um fibroblasto, uma célula muscular, uma célula endotelial, um angioblasto, uma célula progenitora endotelial, um perícito, um cardiomiócito, um miócito, um cardiomioblasto, um mioblasto, uma célula tronco embrionária, ou uma célula manipulada para se assemelhar a uma célula tronco embrionária.
37. Composição de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o dito segundo tipo de célula é uma célula —progenitora ou tronco hematopoiética.
38. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a dita célula tronco hematopoiética ou progenitora é uma célula CD34*.
39. Composição de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o dito segundo tipo de célula é um cardiomiócito ou um cardiomioblasto.
40. Composição de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o dito segundo tipo de célula é um condrócito, uma célula muscular, uma célula endotelial, uma célula progenitora —endotelial,ouum mioblasto.
41. Matriz ou estrutura sintética permanente ou decelularizada degradável, caracterizada pelo fato de que compreende a célula como definida em . qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 25 ou 26.
42. Matriz ou estrutura de acordo com a reivindicação 41, — caracterizada pelo fato de que a dita matriz ou estrutura é uma membrana amniótica; uma matriz extracelular desidratada; colágeno placentário ou membrana extracelular placentária.
43. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ' 25 ou 26, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição para . tratar uma doença ou distúrbio do sistema circulatório. |
44. Uso de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato — de queadita quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que resulta em uma melhoria detectável de um ou mais indícios de função cardíaca, em que os ditos indícios de função cardíaca são rendimento cardíaco torácico (CO), índice cardíaco (CI), pressão pulmonar arterial em cunha (PAWP), índice cardíaco (CD), % de encurtamento fracional (% de FS), fração de ejeção (EF), fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF); diâmetro diastólico final ventricular esquerdo (LVEDD), diâmetro sistólico final ventricular esquerdo (LVESD), contratilidade (dP/dt), uma diminuição no funcionamento atrial ou ventricular, um aumento na eficiência de bombeamento, uma diminuição na taxa de perda de eficiência de bombeamento, uma diminuição na perda de funcionamento hemodinâmico, ou diminuição nas complicações associadas à cardiomiopatia, comparado ao indivíduo antes da administração de células aderentes derivadas do âmnio.
45. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 25 ou 26, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição para tratar um indivíduo com uma interrupção do fluxo sanguíneo no ou em torno do CNS. í
46. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma . população de células como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou 26, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição para 25 tratar um indivíduo com uma interrupção do fluxo sanguíneo no ou em torno do membro.
47. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células como definidas em qualquer uma das reivindicações 12 a 17,
19-24 ou 27-34, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição ' para tratar uma doença ou distúrbio do sistema circulatório. , 48. Uso de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de quea dita quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que resulta em uma melhoria detectável de um ou mais indícios de função cardíaca, em que os ditos indícios de função cardíaca são rendimento cardíaco torácico (CO), índice cardíaco (CJ), pressão pulmonar arterial em cunha (PAWP), índice cardíaco (CJ), % de encurtamento fracional (% de FS), fração de ejeção (EF), fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF); diâmetro diastólico final ventricular esquerdo (LVEDD), diâmetro sistólico final ventricular esquerdo (LVESD), contratilidade (dP/dt), uma diminuição no funcionamento atrial ou ventricular, um aumento na eficiência de bombeamento, uma diminuição na taxa de perda de eficiência de bombeamento, uma diminuição na perda de funcionamento hemodinâmico, ou diminuição nas complicações associadas à cardiomiopatia, comparado ao indivíduo antes da administração de células aderentes derivadas do âmnio.
49. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células como definidas em qualquer uma das reivindicações 12 a 17, 19-24 ou 27-34, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição para tratar um indivíduo com uma interrupção do fluxo sanguíneo no ou em torno doCNS.
50. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma Á população de células como definidas em qualquer uma das reivindicações 12 a 17, , 19-24 ou 27-34, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição para tratar um indivíduo com uma interrupção do fluxo sanguíneo no ou em torno —domembro. :

una ooo. - 3 56855 go0'0 "| 1 000. E E. EL sont " EPT - s OQouUwUZMH e) 8 LAUZAR a |É $$23 £oo'o r ESTATE TETET) d10'0| & |8 EIS & 8 | aool

E o É s Í 2000.

. s gl 610'0 88) dono Ss, : sã A — S É 0000 " 3 = O CE : — E? dono! Ss.

o droo! 4 u. v o 2 n n 2 2 >< u = 2 7 ERR RS z EA Lo o ALA DAL: LL22225 o É EE G8R5 gs) | er Pd eo e ee t q o 2º e $* qo 3 Ee A ssa EA RS: 01DOTOM

Do 1 o - 2 1 S | o S SS S | E E - 2 - E S EP E * S ás . "o. CNS CA o [| ) E SS ANS SO [ SNS SNS FS SS RERSO SERSSS SS SNDRES | & SW ANOS SEE — <T DO || u

SS SS RREO S TESS e A NA AAA É

S SN AO A

7 Perfil de secreção de AMDACs 6) RENAN a AQQntolo Ss RA LM ADACPS (média, n=3 25 a

E E NOS — 8 BS e 1.) ur MM mM À mm mà. TIMP-A TIWP.2 — trombopoietina vVEGF VEGF-D Perfil de secreção de AMDACS 25,0 posses EEN SNL sc acao PE Es o pr A o D'Controle Ps A AAA , | [ EAWDACPS (média nes) [E A go Bo o A a

EMP O B Da Sa Lo 8 cc cc.) poe lo o A o NNE Lo e Ns 8 co a Ro e. À) angiogenina — EGF ENA-TR bFGF GRO FIGS. 3A, 3B

Perfil d e = NR secreção de AMDAC | 200 do sn. pa ea Da o ES - “s ALAS RN ne lepitina Perfil d le secreçã oa, reção de AMDACs = Fo DU si Hm O NS WB —— pd TT = Sd De : TRE Sa a 20) EA A AA 2 o = wi] E ost DU í

EN A MIO A 09 E E PE Ee: POCOS à o a - E

RANTES TGF beta 1 ,

a o fi = 38 o o Ss à 3S a. < [a o : z 2 : ê . = < << = É me e E = o - É â O 2 = — < o eee re) oe Lu. o + < o z Dee co > o É ã a = Ss | z - rea e : o s : < a o a = Ss < L Ls Be E Ly do E ds Rr RN BAR Ep OBÍLIA

- | Ni a | SS 7 = el m el uu mn À 3 e & ás -) => by << QN É neo ame eee s s < +H o Ss = . o N << = o mm er e CC LO . 8 Cs o < H o = S = $ 3 O bd — o mem eee eme o o Lu. 3 << & o o = o << 2 e me eme o o br < à o o = o < =? amem en ao o ã à a = o < = Po or ——) 2 e 2 2 2 2 2 e S o o o o o o o o o o o o Ut o o o o + oe o a qo PF e sejnjão ap oeyjiu/qu/2212 ep oBÍSes4 e E : ss e é Lo es | = 2 | E o o E | o O q os = 2o = e< Eo & E= 8 | o << 38 |: ' o 8 | oê = |: uu 8 : 38 es | oO 2% & | TC = É = os =| 85 3 é O se & — S es 8 E LL o s 2 z E) o se 2 s 3 É F z o se = ê 8

A Ê

SESSERHHSSA 32 3 8 SS SS SS SS vHOAON

SNS SS |

SS NS A SS

ASSES SS MOS SS S Ro

FS NS NS

O SANS SN SS

IT SS SRI NANA MH Lo Mo : NS SS A: ANN SANS o : e AS ASSES SNS à G: é ASS SE AS SE . é Ré SAS S é À SE : NE LOS Se

BN SN H

MN SS NES SERES SOS in = EA SNREAS

ASS SE PO

PO SS SS SNS

SS SS A SS SNS

SS SA NE SS AS SNS

SOS NS NAN SNS

SOS SS NO

NOSSA SN NS S SAS SSSSESSSSSSS SS SSSSSESS0000S

E RR A A o EA ANO to MEREERRA CEEE AE SRTA ao ETA RR RA SSSSIR A SENTADOS ESSE du cs AO REA Ao oo ai RES ERSSSRES CACSSSSNSS NIE as eia o aa MIN E as ss ASS SSSOOS

SAS Mo A o

CPO AS a A AO ATOR o CCR SS A a o ao SS NS, 2 ma SS qro eseemer comment ' À : | | Ss | E. o oa vv oO * A A x 4 Lg 8 = o E 8 <. 2 8 go | dz — : ix o : 3 É o 2 8 8 $$ 8 8 8 º 5 8 <c 2 5d 8 e ss [e>] ' o í seno 9v0L 19d 6d [8-7] is v IIDDDDDOOOOO—————: 2 ” 8 | 11 O & SS |ê 8 — o o E 8

FS EC no DE E o í io o Vo OO Ps 5 EM E & E) >= S | o. | í : : : : | | : : i

Í Í : | 3 : “ESSES SESSESOo (SSRSRERESSEÃS : í seniso 9,01 19d Bd T493A] Í [Sven nneadntrra manta ion unia near casa train antatneata nata naadeata e tenetrmamattcatanatare Rena nte:

e 8% Tie2 + 50 as SO 40 NO ao O o o SS SS SOS O SO OS Normóxia hipóxia

AMDAC FIG. 10

. 12/15 e , Indução da e: ão d Ç xpressão de gene cardiomiocítica em AMDACs - — x WS TNNC1 TNNT? Ss Troponina C lent; ii so 0.8 (Ireponina C lenta) (Troponina cardíaca [2 a BR o 8) po 1.2 E CN | DP 4 8 á . 238 pa ER (QB Rg = 37 EE Qseáe "º ES par À PN RS : Se <1. 88 (e BP8 04 oa e geo Ns Ro co) 2 ALIAEAi Ro o = O £ 3 O; DO SS E - É ES FIG. 11

. - - ; mo fa DA q = EETEITTTETTETIÇÇAATATA co — o Po LL.

Fm "os —— 28 >o o o O o Oo o o o o o a a has = Ag apepisuap ap saoóenuog

. > ; mm 7 FA ço = EMEA é posO —= e po dd O . 2 O EE Ss no Encotaaaa) = Oo o pet 2 o

A DO >o o o Oo [= Dn o o o co oÕ a NaN - R AQ opepisuap ap saosenuog

.

- O iso i X 160 Í E BECO : EB E : 3 E A : S EAN EA TT i m— .— ..—. . z2 E ed : É Too o O HAapenas 1000uM H202 insutto Astrócitos humanos + 1000uM Astrócitos humanos+ 1000uM Astrócitos humanos4 10900uM , H202 H202 +BM-MSC H202 + AMDACS LOT 1 z Amostras Q BA | É | E LR CCO | ge MA TA : O so da ESA a AS] i ED E E : E 2 | 3 IE Aa : =. [AA AS ASAS i HAGpenas 100DuM H2O2 insulto — Astrócitos humanos + 1000uM Astrócitos humanos + 1000uM —Astrócitos humanos + 1000uM H2o2 H202 + BM MSC H202 + AMDACS LOT 2 Amostras FIGS. 14A, 14B