TWI589698B - 間質幹細胞、其純株化擴張之方法、其分離方法及其應用 - Google Patents

間質幹細胞、其純株化擴張之方法、其分離方法及其應用 Download PDF

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Description

間質幹細胞、其純株化擴張之方法、其分離方法及其應用
本發明係關於一種幹細胞，特別是一種表現特殊受體的間質幹細胞。
幹細胞(Stem Cell)係為生物體內尚未分化的原生細胞，其具有可以長時間地不斷複製、更新，並分化衍生成具有特殊型態和功能的成熟細胞之能力。幹細胞依其來源主要可分成胚胎幹細胞(embryonic stem cells,ESCs)及成體幹細胞(adult stem cell)兩種，胚胎幹細胞取自囊胚裡的內細胞團，而成體幹細胞則來自各式各樣的組織。幹細胞又依其分化能力，主要可分成三大類，一為全能性幹細胞(totipotent stem cells)，全能性幹細胞具有完全能力，可分化發育成為完整胚胎或生物體；二為多能性幹細胞(pluripotent stem cells)，多能性幹細胞具有分化為三個胚層的能力，但無法發育成為完整胚胎或生物體，而可形成某種組織或器官之所有細胞；三為複效性幹細胞 (multipotent stem cells)，包括特定組織之幹細胞，如神經幹細胞、血球幹細胞、肝臟幹細胞、皮膚幹細胞等。
間質幹細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)為一種成體幹細胞，屬於多能性幹細胞，具有幹細胞增生及多向分化的能力，可分化成身體所需的神經細胞、血管細胞、膠質細胞、脂肪細胞或骨頭細胞等多種間質組織。間質幹細胞可由骨髓、脂肪、牙髓或臍帶等間質組織當中取得，依據取得來源的不同，也會有傾向分化為某些特定組織的能力，而當體內組織受損時，間質幹細胞能直接或間接進行修復。
間質幹細胞可應用於神經、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、骨骼、軟骨、視網膜受傷的修復，近年來更發現間質幹細胞具有免疫調整功能，可能有助於治療許多免疫異常的疾病。由於間質幹細胞的抗原性比其他幹細胞小，臨床運用時不像造血幹細胞在移植前必須先經過嚴格配對，亦不像胚胎幹細胞在使用時有倫理上的考量，因此是很好的細胞治療來源。在臨床的應用上，間質幹細胞的自我更新和多能性分化能力至為關鍵，因此與維持間質幹細胞多能性相關的細胞表面受體，已成為幹細胞醫療相關技術研發的主要課題之一。
依據本發明之一態樣是在提供一種經單離的間質幹細胞，其表現胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)。
依據前述經單離的間質幹細胞，其中經單離的間質幹細胞為多能性。
依據前述經單離的間質幹細胞，其中經單離的間質幹細胞可為人類細胞，更佳地可為臍帶間質幹細胞。
藉此，本發明之經單離的間質幹細胞係於細胞表面表現胰島素樣生長因子-1受體，其具有自我更新和多能性(pluripotent)分化的特性。
本發明之另一態樣是在提供一種間質幹細胞純株化擴張(clonogenic expansion)之方法，包含於含人類臍帶血血清的培養基中培養前述之經單離的間質幹細胞，其中經單離的間質幹細胞表現胰島素樣生長因子-1受體。
依據前述經單離的間質幹細胞純株化擴張之方法，其中培養基之人類臍帶血血清的濃度可為1~10%(v/v)，較佳地可為2%(v/v)。
藉此，本發明之間質幹細胞純株化擴張之方法中，培養基係使用人類臍帶血血清為原料，臍帶血血清中富含生長因子，可使間質幹細胞大量表現胰島素樣生長因子-1受體，並維持多能性分化能力，而使用人類臍帶血血清之培養基方便獲得，且可避免因使用非人類血清所引起的過敏反應及感染病毒或病原菌的危險。
本發明之再一態樣是在提供一種分離多能性的間質幹細胞之方法，包含提供來自哺乳動物組織之細胞混合物，進行分離步驟。分離步驟係自細胞混合物單離對於胰島素樣生長因子-1受體呈陽性之細胞，以獲得多能性的間質幹 細胞。
依據前述分離多能性的間質幹細胞之方法，其中分離步驟更包含單離對於介白素-22受體(interleukin 22 receptor alpha 1,IL22RA1)呈陽性之細胞。
依據前述分離多能性的間質幹細胞之方法，其中哺乳動物組織係選自骨髓、牙髓、胎盤、臍帶、臍帶血及脂肪所組成的族群中。
藉此，本發明之分離多能性間質幹細胞之方法，可自哺乳動物組織來源的細胞混合物中，篩選對於IGF1R呈陽性的細胞，更佳地，可再篩選對於IL22RA1呈陽性之細胞，篩選出的即為具多能性分化能力的間質幹細胞，故可快速且專一的純化多能性的間質幹細胞。
本發明之又一態樣是在提供一種前述之經單離的間質幹細胞之用途，其係用於製備治療缺血性心臟病之藥物。
依據前述經單離的間質幹細胞之用途，其中缺血性心臟病為心肌梗塞。
依據前述經單離的間質幹細胞之用途，其中缺血性心臟病之藥物可為減少因心肌梗塞引起的纖維化之藥物或減少免疫反應之藥物。
藉此，將本發明之經單離的間質幹細胞用於細胞治療時，其可以減輕心肌梗塞後左心室的功能障礙、降低梗塞面積、減少因心肌梗塞引起的纖維化之以及減少免疫反應，故可用以治療個體之缺血性心臟病。
本發明之又一態樣是在提供一種前述之經單離的間質幹細胞之用途，其係用於製備治療個體腦組織損傷之藥物。
依據前述經單離的間質幹細胞之用途，其中腦組織損傷係由腦缺血疾病造成，例如中風。
依據前述經單離的間質幹細胞之用途，其中腦組織損傷係由神經退化性疾病造成，例如帕金森氏症。
依據前述經單離的間質幹細胞之用途，其中治療個體腦組織損傷之藥物可為增加葡萄糖代謝活性之藥物、促進血管新生之藥物或促進神經突再生之藥物。
藉此，本發明之經單離的間質幹細胞用於細胞治療時，其可以增加葡萄糖的代謝活性、促進血管新生和加強神經突再生，故可用以治療腦組織損傷之個體。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖為臍帶間質幹細胞初代培養之顯微照片圖；第1B圖為本發明之經單離的間質幹細胞之胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)表現之結果圖； 第1C圖為本發明之經單離的間質幹細胞之介白素-22受體(interleukin 22 receptor alpha 1,1L22RA1)表現之結果圖；第1D圖和第1E圖為本發明之經單離的間質幹細胞之華頓氏膠中細胞的特異性細胞表面分子表現之結果圖；第1F圖為本發明之經單離的間質幹細胞之多能性標記表現之結果圖；第2圖為本發明之經單離的間質幹細胞之擴增指數圖；第3A圖為人類臍帶血血清(human cord blood serum,hUCS)和胎牛血清(Fetal Calf serum,FCS)的人類細胞激素晶片分析圖；第3B圖為hUCS和FCS的ELISA分析圖；第4A圖為本發明之經單離的間質幹細胞導入shRNA後IGF1R表現量分析圖；第4B圖為本發明之經單離的間質幹細胞之擴增趨勢圖；第4C圖為本發明之經單離的間質幹細胞之細胞增生分析圖；第5A圖為本發明之經單離的間質幹細胞之流式細胞儀雙染法分析圖；第5B圖為本發明之經單離的間質幹細胞之免疫螢光染色雙染法之顯微照片圖；第5C圖為間質幹細胞表現多能性標記之定量RT-PCR結果圖； 第6A圖為本發明之經單離的間質幹細胞分化為不同組織細胞之顯微照片圖；第6B圖為本發明之經單離的間質幹細胞分化為神經細胞之顯微照片圖；第7A圖為處理不同劑量的胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF1)至本發明之經單離的間質幹細胞後，其IGF1R和趨化因子CXCR4表現量的分析圖；第7B圖為處理不同劑量的血小板衍生的生長因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)至本發明之經單離的間質幹細胞後，其IGF1R和趨化因子CXCR4表現量的分析圖；第7C圖為同時處理不同劑量的IGF1和PDGF-BB至本發明之經單離的間質幹細胞後，其IGF1R表現量的分析圖；第7D圖為同時處理不同劑量的IGF1和PDGF-BB至本發明之經單離的間質幹細胞後，其磷酸化蛋白質激酶B(p-Akt)和磷酸化訊息傳遞轉錄活化基因-3(p-Stat3)表現量的分析圖；第8A圖為大鼠身體擺動測試的結果圖；第8B圖為阻斷試驗的大鼠身體擺動測試的結果圖；第9A圖為大鼠垂直活動測試的結果圖；第9B圖為大鼠垂直活動時間測試的結果圖；第9C圖為大鼠垂直運動數量測試的結果圖；第10圖為大鼠前肢抓握力測試的結果圖； 第11A圖為經細胞治療後大鼠的[18F]氟-2-脫氧葡萄糖正子造影(FDG-PET)影像圖；第11B圖為經細胞治療後大鼠的[18F]FDG-PET影像的量化圖；第12圖為經細胞治療後大鼠受損腦組織的抗凋亡蛋白表現量的分析圖；第13A圖為經細胞治療後大鼠腦組織中雙苯酰亞胺標定的細胞核和人類細胞核抗原共同表現(co-localization)的顯微照片圖；第13B圖為經細胞治療後大鼠腦組織中植入的本發明之經單離的間質幹細胞數量的顯微照片圖；第14A圖為植入中風大鼠受損腦組織的本發明經單離的間質幹細胞GFAP與IGF1R或CXCR4共同表現的顯微照片圖；第14B圖為植入中風大鼠受損腦組織的本發明經單離的間質幹細胞MAP-2與IGF1R或CXCR4共同表現的顯微照片圖；第14C圖為植入中風大鼠受損腦組織的本發明經單離的間質幹細胞NeuN與IGF1R或CXCR4共同表現的顯微照片圖；第15A圖為植入中風大鼠受損腦組織的本發明經單離的間質幹細胞vWF與IGF1R或CXCR4共同表現的顯微照片圖； 第15B圖為移植本發明經單離的間質幹細胞的中風大鼠FITC-葡聚醣灌流的結果圖；第15C圖為本發明經單離的間質幹細胞的中風大鼠血管密度測定的結果圖；第16圖為移植本發明經單離的間質幹細胞的中風大鼠缺血性腦的腦血流量結果圖；第17A圖為神經突再生體內試驗的結果圖；第17B圖為神經突再生體外試驗的結果圖；第18圖為移植本發明經單離的間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠的心肌梗塞面積圖；第19A圖為移植本發明經單離的間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠的心臟超音波圖；第19B圖為移植本發明經單離的間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠心臟超音波的量化圖；第20圖為移植本發明經單離的間質幹細胞3天後的急性心肌梗塞大鼠的免疫組織化學染色法結果圖；第21圖為移植本發明經單離的間質幹細胞3天後的急性心肌梗塞大鼠的免疫螢光染色法結果圖；第22圖為移植本發明經單離的間質幹細胞3天後的急性心肌梗塞大鼠促發炎因子表現量的分析圖；第23圖為移植本發明經單離的間質幹細胞28天後的急性心肌梗塞大鼠的梅生三色染色法結果圖。
本說明書揭露內容提出一種經單離的間質幹細 胞，其表達特定的細胞表面受體，且具自我更新能力和多能性(pluripotent)分化能力。本說明書揭露內容另提供一種間質幹細胞純株化擴張(clonogenic expansion)之方法，其可使前述之經單離的間質幹細胞大量表現特定的細胞表面受體，並維持多能性分化能力。本說明書揭露內容亦提供一種分離多能性的間質幹細胞之方法，其可由來自哺乳類動物組織的細胞混合物中，快速且專一性的篩選出具多能性分化能力的間質幹細胞。此外，本說明書揭露內容提供一種前述之經單離的間質幹細胞的用途，其可應用於製備治療缺血性心臟病之藥物或製備治療個體腦組織損傷之藥物。
更進一步說，本發明提供一種經單離的間質幹細胞，其表現胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)，下文中將以「IGF1R+間質幹細胞」表示本發明之經單離的間質幹細胞。IGF1R+間質幹細胞為多能性，其來源可為人類細胞，更佳地為臍帶間質幹細胞。而本發明之間質幹細胞純株化擴張之方法，係將IGF1R+間質幹細胞培養於含有人類臍帶血血清(human cord blood serum,hUCS)的培養基中，其中hUCS的濃度為1~10%(v/v)，更佳地，hUCS的濃度為2%(v/v)。而本發明之分離具多能性的間質幹細胞之方法，係自哺乳動物組織來源的細胞混合物中，篩選對於IGF1R呈陽性的細胞，更佳地，可再篩選對於介白素-22受體(interleukin 22 receptor alpha 1,IL22RA1)呈陽性的細胞，即可自細胞混合物中分離多能性的間質幹細胞，其中哺 乳動物組織係選自骨髓、牙髓、胎盤、臍帶、臍帶血及脂肪所組成的族群中。
本發明之IGF1R+間質幹細胞可應用於製備治療缺血性心臟病之藥物和製備治療個體腦組織損傷之藥物。更進一步地說，本發明之IGF1R+間質幹細胞可以減輕心肌梗塞後左心室的功能障礙、降低梗塞面積、減少因心肌梗塞引起的纖維化之以及減少免疫反應，故可用以治療個體之缺血性心臟病，其中缺血性心臟病可為心肌梗塞。另本發明之IGF1R+間質幹細胞可以增加葡萄糖的代謝活性、促進血管新生和加強神經突再生，並藉由IGF1R和趨化因子受體CXCR4的交互作用，具有神經重塑的效果，故可用以治療腦組織損傷之個體，其中腦組織損傷可為腦缺血疾病或神經退化性疾病，而腦缺血疾病可為中風，神經退化性疾病可為帕金森氏症。
以下為本說明書中所用特定名詞的說明：前述之「胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)」是胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1)的細胞表面受體，屬於酪氨酸激酶受體家族。其配體IGF1，是一種在分子結構上與多肽類激素胰島素類似的激素，在生長發育和成人的合成代謝中有重要作用。
前述之「介白素-22受體(interleukin 22 receptor alpha 1,IL22RA1)」是介白素-22(interleukin 22,IL22)的細胞表面受體，其配體IL-22是一種同時具有抗炎和促炎雙重特性的細胞因子，可由多種免疫細胞分泌。
前述之「趨化因子受體CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)」是基質細胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1a,SDF-1α)的特異受體，CXCR4在體內大部分組織和器官上都有表達，是由352個胺基酸組成的G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor,GPCR)，具有七次穿膜結構。其配體SDF-1α對淋巴細胞有強烈的趨化作用。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
<試驗例> 第一部分：本發明之IGF1R + 間質幹細胞 1.1：IGF1R + 間質幹細胞製備
為製備IGF1R+間質幹細胞，於本試驗例中所使用的哺乳動物組織為人類臍帶組織，而人類臍帶組織中的人類臍帶間質幹細胞源自華頓氏膠(Wharton's jelly)中。將所收集的人類臍帶組織先以不含Ca2+和Mg2+的PBS(DPBS，Life Technology)洗滌三次後，將人類臍帶組織在中線方向以剪刀剪開，並自華頓氏膠中抽出臍動脈血管、 臍靜脈血管和外膜。再將華頓氏膠的間質組織切割成小於0.5cm3的立方體，以膠原蛋白酶1型(Sigma)處理，並在37℃下於5% CO2、95%飽和濕度培養14-18小時後。再將外植體分別以含有2% hUCS或10%胎牛血清(Fetal Calf serum,FCS)的DMEM為細胞培養基，並在細胞培養基中加入抗生素，在37℃下於5% CO2、95%飽和濕度靜置培養5-7天。人類臍帶組織的外植體培養，將維持到發現有梭形貼壁細胞自外植體中向外生長。
請參照第1A圖，為臍帶間質幹細胞初代培養之顯微照片圖，其中黑色箭頭所指之處為外植體，在培養4至8代後，可見細胞自外植體中遷移，且細胞形態變為均勻的梭狀。
後續再以流式細胞儀分析前述初代培養的臍帶間質幹細胞的細胞表面分子。分析的細胞表面分子包含IGF1R、IL22RA1、華頓氏膠中細胞的特異性細胞表面分子以及多能性標記。華頓氏膠中細胞的特異性細胞表面分子包含CD13、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD117、CD166、HLA-ABC和HLA-DR。多能性標記包含Oct-4、Sox-2、Nanog和SSEA-4。
請參照第1B圖至第1F圖，第1B圖為本發明之經單離的間質幹細胞IGF1R表現之結果圖，第1C圖為本發明之經單離的間質幹細胞之IL22RA1表現之結果圖，第1D圖和第1E圖為本發明之經單離的間質幹細胞之華頓氏膠中細胞的特異性細胞表面分子表現之結果圖，第1F圖為本發 明之經單離的間質幹細胞之多能性標記表現之結果圖。
第1B圖中先以由流式細胞儀分析前述初代培養的臍帶間質幹細胞的IGF1R表現，再以西方墨點法分析不同來源的間質幹細胞的IGF1R表現，分析的細胞種類包含人類纖維母細胞、人類牙髓幹細胞、脂肪間質幹細胞、臍帶間質幹細胞以及骨髓間質幹細胞，第1B圖的結果顯示，不同來源的間質幹細胞皆可見IGF1R的表現。
第1C圖至第1F圖以流式細胞儀分析前述初代培養的臍帶間質幹細胞的IL22R1A表現、華頓氏膠中細胞的特異性細胞表面分子表現以及多能性標記表現。由第1C圖的結果顯示，前述初代培養的臍帶間質幹細胞可見IL22R1A的表現，與對照組相比約有45.4%的臍帶間質幹細胞表現IL22R1A。由第1D圖和第1E圖的結果顯示，前述初代培養的臍帶間質幹細胞可見CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和HLA-ABC的表現，而未見CD34、CD45、CD117和HLA-DR的表現，顯示前述初代培養的臍帶間質幹細胞並非造血幹細胞表現型。而由第1F圖的結果顯示，前述初代培養的臍帶間質幹細胞皆表現Oct-4、Sox-2、Nanog和SSEA-4代表多能性分化能力的多能性標記。
實驗上再自前述經流式細胞儀分析的細胞中分選出IGF1R+間質幹細胞。純化的方法如下：將細胞與抗IGF1抗體混合後，使用FACSTAR+流式細胞儀(Becton Dickinson)分選出染上抗IGF1抗體的細胞，再以錐藍質排 除測試(trypan blue exclusion test)分析分選出的細胞，細胞存活率大約為96%。
1.2：IGF1R + 間質幹細胞培養
分選出的IGF1R+間質幹細胞分別以含有2% hUCS或10% FCS的DMEM為細胞培養基，並在細胞培養基中加入抗生素，於37℃下於5%CO2、95%飽和濕度的環境培養。並分別分析培養於含hUCS和FCS的IGF1R+間質幹細胞的生長動力學。
請參照第2圖，為IGF1R+間質幹細胞之擴增指數圖。由第2圖的結果顯示，培養於含hUCS之培養基中的IGF1R+間質幹細胞分裂的速度，較培養於含FCS之培養基中的IGF1R+間質幹細胞還快，其倍增一代的時間為22小時，並可擴增超過150天而沒有衰老和自發分化的跡象。
為評估使用含hUCS之培養基培養IGF1R+間質幹細胞的優點，實驗上以人類細胞激素晶片(RayBiotechTM)分析比較hUCS和FCS中多個特定的細胞激素。於本試驗例中，共分析42種細胞激素，並透過光密度測定hUCS或FCS中細胞激素的表達水平。
請參照第3A圖，為hUCS和FCS的人類細胞激素晶片分析圖，其中P表示正對照，N表示負對照。由第3A圖的結果顯示，在hUCS中有5種細胞激素的表達水平顯著高於FCS，分別為表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF；方框1)、血管生成素(angiogenin,ANG；方框2)、巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein,MIP-1δ；方框3)、趨化激素RANTES(regulated-on activation,normal T-cell expressed and presumably secreted,RANTES；方框4)和血小板衍生的生長因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)，此5種細胞激素表達水平相差的倍數分別為2倍、3倍、3倍、2倍和4倍。相較之下，在hUCS和FCS中胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)的表現水平相似。
為了更準確地定量測定hUCS和FCS中PDGF-BB和IGF-1的濃度，本試驗例以hUCS和FCS為樣品，利用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)進行PDGF-BB和IGF-1濃度分析。
請參照第3B圖，為hUCS和FCS的ELISA分析圖，由第3B圖的結果顯示，2種血清中的IGF1表現水平相似，但在PDGF-BB的部分，hUCS中含有的PDGF-BB濃度顯著的高於FCS中的含量(p<0.05)。
1.3：IGF1R + 間質幹細胞之自我更新能力
為了探討IGF1R信息途徑是否有助於間質幹細胞自我更新的調控，實驗上使用慢病毒分別導入靶向IGF1R的shRNA(LV-IGF1R-sh,sc-29358-V,Santa Cruz Biotechnology)至以含hUCS或FCS之培養基培養的IGF1R+間質幹細胞中，以降低IGF1R+間質幹細胞中IGF1R的表現，實驗上亦使用慢病毒分別導入控制組的shRNA(LV-control-sh,Santa Cruz Biotechnology)至 以含hUCS或FCS之培養基培養的IGF1R+間質幹細胞中做為實驗對照組。並在感染慢病毒48小時後，利用西方墨點法分析導入shRNA後IGF1R+間質幹細胞的IGF1R的表現量。另分析導入shRNA後IGF1R+間質幹細胞的生長動力學。
請參照第4A圖至第4B圖，第4A圖為導入shRNA後IGF1R表現量分析圖，第4B圖為IGF1R+間質幹細胞之擴增趨勢圖。第4A圖中共有4個組別，分別為使用慢病毒分別導入LV-IGF1R-sh和導入LV-control-sh的IGF1R+間質幹細胞，以及未導入shRNA的IGF1R+間質幹細胞，在第4A圖中4個組別的IGF1R+間質幹細胞皆是以含hUCS之培養基培養。由第4A圖的結果顯示，在感染慢病毒48小時後，導入LV-IGF1R-sh的組別相較於導入LV-control-sh的組別，其IGF1R的表現量降低，而其它組別的IGF1R表現量相當。而第4B圖中共有4個組別，分別為以含hUCS之培養基培養並導入LV-control-sh的IGF1R+間質幹細胞(LV-control-sh U-IGF1R+間質幹細胞)、以含FCS之培養基培養並導入LV-control-sh的IGF1R+間質幹細胞(LV-control-sh F-IGF1R+間質幹細胞)、以含hUCS之培養基培養並導入LV-IGF1R-sh的IGF1R+間質幹細胞(LV-IGF1R-sh-U-IGF1R+間質幹細胞)，以及以含FCS之培養基培養並導入LV-IGF1R-sh的IGF1R+間質幹細胞(LV-IGF1R-sh-F-IGF1R+間質幹細胞)。由第4B圖的生長動力學結果顯示，不論是以含hUCS或FCS之培養基培養的 IGF1R+間質幹細胞，導入LV-IGF1R-sh後，皆會減緩IGF1R+間質幹細胞的增生。
本試驗例進一步利用尿密啶類似物(Bromodeoxyuridine,BrdU)標定DNA，以細胞增生分析法(BrdU proliferation assay)進行檢測，探討IGF1R+間質幹細胞的增殖潛力。實驗上先將IGF1R+間質幹細胞培養於未添加補充物的培養基中4至6小時，再將IGF1R+間質幹細胞分別培養於含2% hUCS、10% FCS或100ng/mL SDF-1α的培養基中2天，並分別導入LV-control-sh或LV-IGF1R-sh，再以BrdU chemiluminescence immunoassay kits(Roche)分析IGF1R+間質幹細胞的增生情況。
請參照第4C圖，為IGF1R+間質幹細胞之細胞增生分析圖。第4C圖中共有5個組別，分別為以添加SDF-1α之培養基培養的IGF1R+間質幹細胞作為正控制組、以含hUCS之培養基培養並導入LV-control-sh的IGF1R+間質幹細胞、以含FCS之培養基培養並導入LV-control-sh的IGF1R+間質幹細胞、以含hUCS之培養基培養並導入LV-IGF1R-sh的IGF1R+間質幹細胞，以及以含FCS之培養基培養並導入LV-IGF1R-sh的IGF1R+間質幹細胞。由第4C圖的結果顯示，以含hUCS的培養基培養的IGF1R+間質幹細胞，顯著地較以含FCS的培養基培養的IGF1R+間質幹細胞有更多的BrdU嵌入。相較之下，不論是以含hUCS或FCS之培養基培養的IGF1R+間質幹細胞，導 入LV-IGF1R-sh後，BrdU的嵌入量將大幅下降，顯示IGF1R為間質幹細胞增值時不可或缺的細胞表面受體。
1.4：IGF1R + 間質幹細胞之多能性
為探討IGF1R與IGF1R+間質幹細胞的多能性是否有關，實驗上分別將IGF1R+間質幹細胞雙染IGF1R/Oct-4抗體、IGF1R/Sox-2抗體、IGF1R/Nanog抗體、IGF1R/SSEA4抗體，再分別以流式細胞儀和免疫螢光染色法分析IGF1R和多能性標記共表達的情況。
請參照第5A圖和第5B圖，第5A圖為IGF1R+間質幹細胞之流式細胞儀雙染法分析圖，第5B圖為IGF1R+間質幹細胞之免疫螢光染色雙染法之顯微照片圖，其中IGF1R+間質幹細胞的細胞來自5個獨立的樣本。由第5A圖和第4E圖的結果顯示，IGF1R+間質幹細胞中IGF1R與多能性標記Oct-4、Sox-2、Nanog和SSEA-4共表達，而第5B圖的結果更顯示，IGF1R也與CXCR4共表達。
本試驗例進一步以定量RT-PCR(qRT-PCR)探討IGF1R+間質幹細胞和不表現IGF1R的間質幹細胞(IGF1R-間質幹細胞)其多能性標記的表現差異。請參照第5C圖，為IGF1R+間質幹細胞和IGF1R-間質幹細胞表現多能性標記之定量RT-PCR結果圖，其中試驗的細胞分別為IGF1R+間質幹細胞和IGF1R-間質幹細胞，並以人類纖維母細胞作為負向控制組，人類誘導性多功能幹細胞(induced pluripotent stem cell,iPS)作為正向控制組。結果顯示，不論Oct-4、Sox-2、SSEA-4或Nanog的表現， IGF1R+間質幹細胞皆較IGF1R-間質幹細胞的表現量高，顯示IGF1R為間質幹細胞維持多能性重要的細胞表面受體。
1.5：IGF1R + 間質幹細胞的分化能力
本試驗例以體外分化試驗進一步探討以含hUCS或FCS的培養基培養IGF1R+間質幹細胞，是否會影響其多能性分化能力。實驗上分別將培養於含hUCS或FCS培養基繼代5至10代的IGF1R+間質幹細胞，以5×103細胞/cm2的密度種於細胞培養皿中，並分別以含有10% FCS或2% hUCS不同的分化培養基培養IGF1R+間質幹細胞，引導其分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、血管形成和神經細胞，並在顯微鏡下觀察細胞型態，以及進一步以染色法確認分化後的細胞種類。
請參照第6A圖和第6B圖，第6A圖為IGF1R+間質幹細胞分化為不同組織細胞之顯微照片圖，第6B圖為IGF1R+間質幹細胞分化為神經細胞之顯微照片圖。
第6A圖中利用油紅組織染色(oil red O stain)確認分化後的細胞為脂肪細胞，利用茜素紅染色(Alizarin red S stain)確認分化後的細胞為成骨細胞，以及利用阿新藍染色(Alican blue stain)確認分化後的細胞為軟骨細胞，並以明視野下的細胞型態確認IGF1R+間質幹細胞是否會血管形成。由第6A圖的結果顯示，IGF1R+間質幹細胞在分化培養基的培養下，可以分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞以及血管形成。
第6B圖中明視野的顯微照片顯示，培養於神經 細胞分化培養基的IGF1R+間質幹細胞，可見擴展神經突狀結構細胞型態，顯示分化後的細胞為神經細胞。本試驗例更進一步以免疫螢光染色確認分化後的細胞是否表現成熟神經標記，成熟神經標記包含GFAP(glial fibrillary acidic protein)、MAP-2(microtubule-associated protein 2)、O4和Tuj-1(Neuron-specific class III beta-tubulin)。由第6B圖的結果顯示，分化後的細胞4種成熟神經標記皆有表現，證明分化後的細胞確實為神經細胞。
另請參照下表一，為以含有2% hUCS分化培養基或10% FCS分化培養基培養的IGF1R+間質幹細胞，4種成熟神經細胞標記的表現比例。結果顯示，以含2% hUCS分化培養基培養的IGF1R+間質幹細胞，不論是哪一種成熟神經標記的表現比例皆較以含10% FCS分化培養基培養的高，顯示以含hUCS培養基培養的IGF1R+間質幹細胞更容易分化為神經細胞。
1.6：IGF1R + 間質幹細胞的調控機制
本試驗例將探討IGF1R+間質幹細胞的IGF1R和CXCR4表現水平是否單獨受IGF1調控，或由IGF1和PDGF-BB(hUCS和FCS差異的關鍵成分)調控。實驗上先分別加入不同劑量的IGF1或不同劑量的PDGF-BB處理 IGF1R+間質幹細胞，並以西方墨點法偵測IGF1R和CXCR4的表現量。
請參照第7A圖至第7C圖，第7A圖為處理不同劑量的IGF1至IGF1R+間質幹細胞後，其IGF1R和CXCR4表現量的分析圖。第7B圖為處理不同劑量的PDGF-BB至IGF1R+間質幹細胞後，其IGF1R和CXCR4表現量的分析圖。第7C圖為同時處理不同劑量的IGF1和PDGF-BB至IGF1R+間質幹細胞後，其IGF1R表現量的分析圖。其中*表示實驗組(加入不同劑量IGF1或/和PDGF-BB的組別)和控制組(未加入IGF1和PDGF-BB的組別)相比P<0.05，**表示實驗組和控制組相比P<0.01。由第7A圖的結果顯示，加入IGF1會降低IGF1R+間質幹細胞的IGF1R表現，且兩者之間的關係呈現劑量依賴性，但加入IGF1會增加CXCR4的表現，且在加入IGF1濃度為5nM時，CXCR4的表現量最高。而由第7B圖的結果顯示，加入PDGF-BB會同時提高IGF1R和CXCR4的表現，且存在劑量依賴性。但由第7C圖的結果顯示，加入PDGF-BB至IGF1R+間質幹細胞中，可以有效抑制因IGF1引導的IGF1R表現降低。
為了進一步確定PDGF-BB是否比IGF1更有效地激活控制細胞增殖的信息途徑，IGF1R+間質幹細胞分別處理不同濃度的IGF1或不同濃度的PDGF-BB(在無血清的條件下)，並以西方墨點法偵測磷酸化蛋白質激酶(phosphorylated Akt,p-Akt)和磷酸化訊息傳遞轉錄活化基因-3(phosphorylated signal transducers and activator of transcription 3,p-Stat3)的表現水平。
請參照第7D圖，為同時處理不同劑量的IGF1和PDGF-BB至IGF1R+間質幹細胞後，其p-Akt和p-Stat3表現量的分析圖，其中*表示實驗組(加入不同劑量IGF1或/和PDGF-BB的組別)和控制組(未加入IGF1和PDGF-BB的組別)相比P<0.05。第7D圖的結果顯示，加入PDGF-BB顯著地增加p-Akt和p-Stat3的表現量，但加入IGF1則對增加p-Akt和p-Stat3表現量沒有效果。本試驗另分別加入p-Akt抑制劑(LY294002)和p-Stat3抑制劑(AG490)至IGF1R+間質幹細胞中，發現由PDGF-BB引導的Akt和Stat3磷酸化完全被抑制(結果未顯示)。上述結果顯示，PDGF-BB比IGF1更有效地激活下游重要的信息傳導途徑，亦顯示含hUCS的培養基比含FCS的培養基更適於做為間質幹細胞的培養基。
第二部分：IGF1R + 間質幹細胞用於治療腦組織損傷
根據前述已知IGF1R+間質幹細胞具有自我更新能力及多能分化能力，此部份之試驗例將探討將IGF1R+間質幹細胞用於治療腦組織損傷個體之效果。
2.1：IGF1R + 間質幹細胞移植改善中風大鼠模型的神經行為
本試驗例係以中風大鼠模型評估IGF1R+間質幹細胞在體內自我更新能力和的神經再生潛力，並透過3種神經功能缺損模式檢測中風前後大鼠的神經行為，以評估神經功能是否恢復。
中風大鼠模型採取腦缺血/再灌注模型(ischemia-reperfusion model)來模擬大鼠中暫時性局部腦缺血的症狀，所使用之試驗動物為體重250-300克雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠。大鼠的腦缺血/再灌注模型係以阻塞大鼠的雙側頸總動脈(common carotid arteries；CCA)及右側大腦中動脈(middle cerebral artery；MCA)誘發局部性腦缺血，阻塞90分鐘後解除以進行再灌注，1小時後再靜脈移植細胞至大鼠中，注射的細胞量為2×106。實驗上先將大鼠分成5組，分別注射5種不同細胞或載體進行細胞治療，組別1的細胞為培養於含hUCS培養基的IGF1R+間質幹細胞(U-IGF1R+間質幹細胞)，組別2的細胞為培養於含FCS培養基的IGF1R+間質幹細胞(F-IGF1R+間質幹細胞)，組別3的細胞為培養於含hUCS培養基的間質幹細胞(U-間質幹細胞)，組別4的細胞為培養於含FCS的培養基的間質幹細胞(F-間質幹細胞)，組別5則為注射PBS(載體)至大鼠體內作為對照組。而組別1的大鼠將另進行阻斷試驗，分別注射CXCR4抗體(R&D system)和IGF1R抑制劑(PPP,Santa Cruz Biotechnology)以阻斷CXCR4和IGF1R。CXCR4抗體以腹腔注射至大鼠體內2周，注射頻率為每周2次。PPP以腹腔注射至大鼠體內3天，注射量為20mg/kg/day。
神經行為的檢測時間點為腦缺血/再灌注前5天、細胞移植後第1天、第7天、第14天和第28天。3種神經功能缺損模式分別為評估大鼠的身體左右不對稱、活動能力和前肢抓握力。
i. 身體擺動測試
大鼠的身體左右不對稱係利用身體擺動測試評估，實驗上先將大鼠懸空放置在尾巴上方10公分的飼養籠底板上，並記錄大鼠的橫向移動次數，特別是缺血側對側的頭部擺動頻率是以連續20計數，並以基線評分進行標準化。
請參照第8A圖和第8B圖，第8A圖為大鼠身體擺動測試的結果圖，第8B圖為阻斷試驗的大鼠身體擺動測試的結果圖。由第8A圖的結果顯示，不論移植何種間質幹細胞的大鼠，相較於對照組有顯著的神經功能恢復。而移植以含hUCS培養基培養的間質幹細胞的組別(組別1和組別3)，大鼠神經功能恢復的狀況又較以含FCS培養基培養的間質幹細胞的組別(組別2和組別4)更好，其中又以組別1(移植U-IGF1R+ UMSCs)比其它組別有顯著的治療效果。而由第8B圖的結果顯示，加入CXCR4抗體或PPP阻斷CXCR4或IGF1R後，阻斷試驗組大鼠的神經功能恢復結果和對照組相當，顯示阻斷CXCR4或IGF1R會抑制移植U-IGF1R+間質幹細胞的治療效果。
ii. 活動能力測試
大鼠的活動能力係使用VersaMax動物活動監測系統(Accuscan Instruments)偵測大鼠2小時。VersaMax動物活動監測系統包含16水平紅外線感測器和8個垂直紅外感測器，垂直感測器分別位於腔室底板上方10mm處，大鼠的活動能力運動由腔室內大鼠因運動打斷光束的次數進行定量。測量的3個垂直運動參數為：垂直活動、 垂直活動時間以及垂直運動數量。
請參照第9A圖至第9C圖，第9A圖為大鼠垂直活動測試的結果圖，第9B圖為大鼠垂直活動時間測試的結果圖，第9C圖為大鼠垂直運動數量測試的結果圖。由第9A圖至第9C圖的結果顯示，移植間質幹細胞的大鼠相較於對照組有顯著的活動能力改善。而移植U-IGF1R+間質幹細胞的組別又較移植F-IGF1R+間質幹細胞的組別改善活動能力的程度又更大，但加入CXCR4抗體或PPP阻斷CXCR4或IGF1R的阻斷試驗組別，大鼠的活動能力的結果和對照組相當，顯示阻斷CXCR4或IGF1R會抑制移植U-IGF1R+間質幹細胞的治療效果。
iii. 前肢抓握力測試
大鼠的前肢抓握力測試係使用握力儀(TSE-Systems)偵測。實驗上分開測量大鼠每隻前肢的抓握力，計算大鼠拉20次抓握力的平均值，並計算同側：對側的抓握力比率。此外，本試驗例亦計算細胞治療前和細胞治療後大鼠抓握力的比率，以評估細胞治療後大鼠抓握力的改變。
請參照第10圖，為大鼠前肢抓握力測試的結果圖。由第10圖的結果顯示，移植IGF1R+間質幹細胞的大鼠相較於對照組的大鼠，在細胞治療後大鼠的前肢抓握力大幅度的改善。而移植U-IGF1R+間質幹細胞的組別又較移植F-IGF1R+間質幹細胞的組別改善前肢抓握力的程度又更大，但加入CXCR4抗體或PPP阻斷CXCR4或IGF1R的阻斷 試驗組別，大鼠的前肢抓握力和對照組相當，顯示阻斷CXCR4或IGF1R會抑制移植U-IGF1R+間質幹細胞的治療效果。
上述3個神經功能缺損模式試驗呈現相似的結果，顯示IGFR-1+間質幹細胞可改善中風大鼠的神經行為，而U-IGFR-1+間質幹細胞又較F-IGFR-1+間質幹細胞更具神經再生的潛力，且此神經再生係透過IGF1R和CXCR4受體途徑。
2.2：IGF1R + 間質幹細胞移植提高葡萄糖代謝
為了探討移植U-IGF1R+間質幹細胞是否影響腦缺血大鼠的葡萄糖代謝活性，本試驗例係使用小型動物專用正子掃描儀(microPET)以[18F]氟-2-脫氧葡萄糖正子造影(fluoro-2-deoxyglucose positron emission tomography,FDG-PET)檢測細胞治療後大鼠腦組織的葡萄糖代謝。
請參照第11A圖和第11B圖，第11A圖為經細胞治療後大鼠的[18F]FDG-PET影像圖，第11B圖為經細胞治療後大鼠的[18F]FDG-PET影像的量化圖，檢測的大鼠為經細胞治療後4週的大鼠，檢測的組別共5組，分別為移植U-IGF1R+間質幹細胞的大鼠(N=6)、移植F-IGF1R+間質幹細胞的大鼠(N=6)、移植U-IGF1R+間質幹細胞並注射PPP的大鼠(N=6)、移植U-IGF1R+間質幹細胞並注射CXCR4抗體的大鼠(N=6)以及對照組大鼠(注射PBS,N=6)。由第11A圖的結果顯示，移植IGF1R+間質幹細胞的 大鼠可增加受損腦組織(圖中右側腦)的葡萄糖代謝，而移植U-IGF1R+間質幹細胞的組別改善受損腦組織葡萄糖代謝的程度又較移植F-IGF1R+間質幹細胞的組別更大。第11B圖係將[18F]FDG-PET的影像圖進行半定量，由第11B圖的結果顯示，移植U-IGF1R+間質幹細胞增加的葡萄糖代謝活性，在注射PPP或CXCR4抗體阻斷CXCR4或IGF1R後，大鼠在受損腦組織的葡萄糖代謝活性與對照組相當，顯示阻斷CXCR4或IGF1R會抑制移植U-IGF1R+間質幹細胞增加葡萄糖代謝活性的效果。
2.3：靜脈移植IGF1R + 間質幹細胞增加抗凋亡蛋白的表達
為探討以U-IGF1R+間質幹細胞治療中風大鼠是否係藉由增加存活因子的表現改善的神經功能，實驗上使用西方墨點法檢測經細胞治療後大鼠受損腦組織中抗凋亡蛋白的表現，檢測的抗凋亡蛋白為Bcl-2(B-cell lymphoma 2)和Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large)。本試驗例亦檢測經細胞治療後大鼠受損腦組織中促凋亡蛋白的表現，檢測的促凋亡蛋白為Bax(BCL2-associated X protein)和Bad(Bcl-2-associated death promoter)。
請參照第12圖，為經細胞治療後大鼠受損腦組織的抗凋亡蛋白表現量的分析圖。由第12圖的結果顯示，經IGF1R+間質幹細胞治療的大鼠，在受損腦組織中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表現量增加，且以U-IGF1R+間質幹細胞治療的大鼠Bcl-2和Bcl-xL表現量增加更為顯著，其中 F-IGF1R+間質幹細胞組別(N=6)與對照組(N=6)相比p<0.05；U-IGF1R+間質幹細胞組別(N=6)與對照組(N=6)相比p<0.01。相較之下，經IGF1R+間質幹細胞(U-IGF1R+間質幹細胞和F-IGF1R+間質幹細胞)治療的大鼠，在受損腦組織中的促凋亡蛋白Bax和Bad的表現量和對照組相當。
2.4：IGF1R + 間質幹細胞治療增加體內的神經分化
為分析移植的IGF1R+間質幹細胞是否可以分化為神經膠質細胞，實驗上將經細胞治療後28天的中風大鼠，利用共軛焦雷射掃描顯微鏡，以免疫螢光染色法確認植入中風大鼠受損腦組織中IGF1R+間質幹細胞的數量，和以免疫螢光雙染法確定植入的IGF1R+間質幹細胞其分化的細胞型態。
請參照第13A圖和第13B圖，第13A圖為經細胞治療後大鼠腦組織中雙苯酰亞胺標定的細胞核和人類細胞核抗原共同表現(co-localization)的顯微照片圖，第13B圖為經細胞治療後大鼠腦組織中植入的IGF1R+間質幹細胞數量的顯微照片圖。由第13A圖的結果顯示，所有以雙苯酰亞胺標定的IGF1R+間質幹細胞皆表現人類細胞核抗原(hNA)，確認細胞的來源為人類組織。由第13B圖的結果顯示，移植U-IGF1R+間質幹細胞的組別(N=8)相較移植F-IGF1R+間質幹細胞的組別(N=8)，在受損腦組織中有更多的植入IGF1R+間質幹細胞(p<0.05)。但由阻斷試驗組別(同時移植U-IGF1R+間質幹細胞和注射PPP或同時移植U-IGF1R+間質幹細胞和注射CXCR4抗體)的結果顯示，植 入IGF1R+間質幹細胞數量的差異會因注射PPP或CXCR4抗體而消失。
為進一步確定植入的IGF1R+間質幹細胞分化的細胞型態，實驗上以免疫螢光雙染法標定特定細胞型態標記、IGF1R和CXCR4，以確認特定細胞型態標記與IGF1R共同表現的情況，以及特定細胞型態標記與CXCR4共同表現的情況，並以雙苯酰亞胺(bisbenzimide)標定細胞核，特定細胞型態標記包含星形膠質細胞標記GFAP(glial fibrillary acidic protein)、神經元特異性細胞骨架蛋白MAP-2(microtubule-associated protein 2)和神經核標記NeuN(neuronal nuclear antigen)。
請參照第14A圖至第14D圖，第14A圖為植入中風大鼠受損腦組織的U-IGF1R+間質幹細胞GFAP與IGF1R或CXCR4共同表現的顯微照片圖，第14B圖為植入中風大鼠受損腦組織的U-IGF1R+間質幹細胞MAP-2與IGF1R或CXCR4共同表現的顯微照片圖，第14C圖為植入中風大鼠受損腦組織的U-IGF1R+間質幹細胞NeuN與IGF1R或CXCR4共同表現的顯微照片圖。
由第14A圖至第14C圖的結果顯示，在植入U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠的受損腦組織區域中，一些雙苯酰亞胺標定且表現CXCR4的細胞，這些細胞分別共同表現神經細胞標記(GFAP、MAP-2和NeuN)。此外，也可見雙苯酰亞胺標定且表現IGF1R的細胞，這些細胞也分別共同表現神經細胞標記(GFAP、MAP-2和NeuN)。
另請參照下表二，為以免疫螢光雙染法標定植入的U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠腦組織(N=8)或F-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠腦組織(N=8)，並計算免疫螢光雙染法中被雙苯酰亞胺標定的細胞與GFAP、MAP-2和NeuN共同表現的比例。由表二的結果顯示，植入的U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠腦組織細胞，雙苯酰亞胺與GFAP、MAP-2或NeuN共同表現的比例(分別為9.5%、12%和10%)皆高於植入的F-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠腦組織細胞(分別為4%、5%和4%)，顯示以U-IGF1R+間質幹細胞治療中風大鼠，植入的IGF1R+間質幹細胞較易分化為神經細胞。
2.5：IGF1R + 間質幹細胞移植促進體內的血管新生
本試驗以免疫螢光雙染法、FITC-葡聚醣灌流和血管密度測定，探討植入U-IGF1R+間質幹細胞增加中風大鼠大腦缺血區域的血管生成。
實驗上以免疫螢光雙染法標定血管內皮細胞標記vWF(Von Willebrand factor)、IGF1R和CXCR4，以確認血管內皮細胞標記與IGF1R共同表現的情況，以及血管內皮細胞標記與CXCR4共同表現的情況，並以雙苯酰亞 胺標定細胞核。請參照第15A圖，為植入中風大鼠受損腦組織的U-IGF1R+間質幹細胞vWF與IGF1R或CXCR4共同表現的顯微照片圖，由第15A圖的結果顯示，在中風大鼠的缺血性腦半球的血管周圍細胞及內皮區域，可見一些被雙苯甲亞胺標定的細胞共同表現IGF1R或CXCR4，且這些細胞共同表現血管內皮細胞標記(vWF)。
本試驗進一步以FITC-葡聚醣灌流評估中風大鼠缺血腦組織中的微循環，以探討中風大鼠缺血組織中血管新生的狀況，評估的組別為移植U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠(N=6)、移植F-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠(N=6)以及注射PBS的對照組中風大鼠(N=6)。請參照第15B圖，為移植IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠FITC-葡聚醣灌流的結果圖，由第15B圖的結果顯示，移植U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠與其他組別(移植F-IGF1R+間質幹細胞或對照組)相較，顯著的增加腦微血管灌流。
本試驗例再進一步以免疫螢光染色法標定中風大鼠缺血腦組織切片中的血管內皮細胞標記CD31，以計算血管密度，評估的組別為移植U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠(N=6)、移植F-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠(N=6)以及注射PBS的對照組中風(N=6)。請參照第15C圖，為移植IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠血管密度測定的結果圖，由第15C圖的結果顯示，移植U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠於缺血腦組織中的血管密度高於其他組別，其中移植U-IGF1R+間質幹細胞與移植F-IGF1R+間質幹細胞相比 p<0.05，移植U-IGF1R+間質幹細胞與對照組相比p<0.01。
由上述結果顯示，移植IGF1R+間質幹細胞至中風大鼠體內進行細胞治療，可以增加中風大鼠缺血性腦組織中的血管新生，且移植以含hUCS培養基培養的IGF1R+間質幹細胞更具有增加缺血性腦組織中血管新生的潛力。
2.6：植入以含hUCS之培養基培養的IGF1R + 間質幹細胞增加缺血性腦的腦血流量
增加血管密度往往會增加腦血流量(cerebral blood flow,CBF)，進而可以更有效地提供氧氣、營養物質以及提高神經元的存活。因此本試驗例將進一步監測中風大鼠缺血性腦組織中的腦血流量。實驗上先將大鼠以水合氯醛(chloral hydrate)麻醉，以雷射杜卜勒微流儀(Moor Instrutments)監測中風大鼠缺血性腦組織局部血液灌流狀況，實驗的組別為移植U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠(N=6)、移植F-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠(N=6)以及注射PBS的對照組中風(N=6)。請參照第16圖，為移植IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠缺血性腦的腦血流量結果圖，由第16圖的結果顯示，移植IGF1R+間質幹細胞可增加中風大鼠缺血腦組織中的腦血流量，且移植U-IGF1R+間質幹細胞增加中風大鼠缺血腦組織中的腦血流量的幅度更大，其中移植U-IGF1R+間質幹細胞與移植F-IGF1R+間質幹細胞相比p<0.05，移植U-IGF1R+間質幹細胞與對照組相比p<0.01。
2.7：CXCR4和IGF1R的交互作用調節IGF1R + 間質幹細胞 引導的神經再生
本試驗例將定量中風大鼠缺血腦組織的神經突再生，以及間質幹細胞與初代大腦皮質細胞(primary cortical cells,PCC)共培養(co-culture)後的神經突再生，以探討IGF1R+間質幹細胞和神經組織的交互作用是否刺激體內和體外的神經突生長。
在體內試驗的部分，實驗上以靜脈移植IGF1R+間質幹細胞至中風大鼠體內，移植的細胞組別為U-IGF1R+間質幹細胞、F-IGF1R+間質幹細胞、阻斷試驗組和對照組，其中阻斷試驗組係移植導入LV-IGF1R-sh的U-IGF1R+間質幹細胞和導入LV-CXCR4-sh的U-IGF1R+間質幹細胞至中風大鼠體內，對照組則以靜脈注射PBS至中風大鼠體內。犧牲在移植IGF1R+間質幹細胞後28天的中風大鼠，將其腦組織切片進行免疫螢光染色以標定神經細胞特異性標記βIII-tubulin，並以影像分析軟體(SigmaScan)計算神經突的長度，並將神經細胞大於細胞體直徑2倍以上的細胞計算為神經突細胞(neurite-bearing cells)。
請參照第17A圖，為神經突再生體內試驗的結果圖，由第17A圖的結果顯示，移植IGF1R+間質幹細胞可改善中風大鼠缺血腦組織中的神經突再生，而移植U-IGF1R+間質幹細胞的中風大鼠，於缺血腦組織中的神經突再生數量顯著的高於其他組別，且其神經突長度也顯著的長於其他組別。但由組斷試驗組的結果顯示，阻斷IGF1R或CXCR4會抑制移植U-IGF1R+間質幹細胞所增加的神經 突長度和神經突細胞數量。
為了評估IGF1R+間質幹細胞是否能影響初代大腦皮質細胞氧氣和葡萄糖供應不足(oxygen glucose deprivation,OGD)的反應，本試驗例進一步將初代大腦皮質細胞與IGF1R+間質幹細胞共培養於氧氣和葡萄糖供應不足的環境，其中IGF1R+間質幹細胞包含U-IGF1R+間質幹細胞、F-IGF1R+間質幹細胞和阻斷試驗組，阻斷試驗組的細胞為導入LV-IGF1R-sh的U-IGF1R+間質幹細胞和導入LV-CXCR4-sh的U-IGF1R+間質幹細胞，實驗上另以於氧氣和葡萄糖供應不足的環境單獨培養的初代大腦皮質細胞作為對照組。再將共培養後的細胞以免疫螢光染色標定βIII-tubulin，依前述的方法測定神經突的再生和神經元的存活。
請參照第17B圖，為神經突再生體外試驗的結果圖，第17B圖的結果顯示，與IGF1R+間質幹細胞共培養可增加初代大腦皮質細胞在氧氣和葡萄糖供應不足情況下的神經突細胞數量和神經突長度，顯示IGF1R+間質幹細胞可幫助氧氣和葡萄糖供應不足下初代大腦皮層細胞的神經突再生，而共培養U-IGF1R+間質幹細胞的組別神經突再生數量顯著的高於其他組別，且其神經突長度也顯著的長於其他組別。但由組斷試驗組的結果顯示，阻斷IGF1R或CXCR4會抑制U-IGF1R+間質幹細胞所增加的神經突長度和神經突細胞數量。
由上述體內和體外神經突再生試驗的結果顯 示，IGF1R+間質幹細胞可幫助缺血缺氧性腦組織/腦細胞的神經突再生，且移植以含hUCS培養基培養的IGF1R+間質幹細胞更具有增加缺血缺氧性腦組織/腦細胞中神經突再生的潛力，且此神經突再生係透過IGF1R和CXCR4受體途徑。
第三部分：IGF1R + 間質幹細胞用於治療缺血性心臟病
根據前述試驗例已知IGF1R+間質幹細胞具有自我更新能力及多能分化能力，且IGF1R+間質幹細胞具有治療腦組織損傷個體的效果，此部份之試驗例將探討將IGF1R+間質幹細胞用於治療缺血性心臟病之效果。
3.1：施用IGF1R + 間質幹細胞降低心肌梗塞後的左室功能不全以及減少心肌梗塞後的梗塞面積
本試驗例係以急性心肌梗塞(acute myocardial infraction,AMI)大鼠模型，評估IGF1R+間質幹細胞移植是否改善心肌梗塞後的心肌功能恢復。
急性心肌梗塞大鼠模型係阻塞大鼠的左前下行(left anterior descending,LAD)冠狀動脈來模擬大鼠暫時性心臟缺血的症狀。本試驗中所使用之試驗動物為體重250-300克雄性SD大鼠，實驗上先將大鼠以2%異氟醚(於100%氧氣中)麻醉，全麻後仰置手術台上，口腔插入呼吸器(SN-480-7)，以1mL/100g的潮氣量以及80次/分鐘的呼吸頻率人工通氣。再使用肋骨牽開器(MY-9454S)沿胸骨左緣4、5肋間隙縱向切開，並將用左肺以浸泡生理食鹽水的紗 布放氣。剪開心包，然後使用6-0-聚乙烯縫合針線(Ethicon)阻塞左前下行冠狀動脈，肉眼觀察到阻塞區變白、心電圖T坡高聳，將胸部縫合前將肺重新充氣，即完成急性心肌梗塞大鼠模型。在將急性心肌梗塞大鼠分成3組，分別靜脈移植細胞數為2×106的間質幹細胞或IGF1R+間質幹細胞，另注射生理鹽水作為對照組。本試驗中另有假手術組(sham)的大鼠，其為經歷上述相同的手術步驟，但未阻塞假手術組的左前下行冠狀動脈。
請參照第18圖，為移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠的心肌梗塞面積圖。實驗上犧牲移植間質幹細胞後28天的急性心肌梗塞大鼠，將心臟組織切片浸泡於三苯基四氮唑氯化物(triphenyltetrazolium chloride)溶液中，再浸泡去氫酶(dehydrogenase)，可發現壞死區域呈現紅藍色，沒有梗塞的區域呈現磚紅色。由第18圖的結果顯示，移植間質幹細胞可改善急性心肌梗塞大鼠的心肌梗塞面積，也可使梗塞區域的動脈血管壁增厚，而移植IGF1R+間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠，其心肌梗塞面積減少的幅度和梗塞區域動脈血管壁增厚的幅度更高於移植間質幹細胞的組別。
本試驗例進一步藉由M模式的心臟超音波分析心肌梗塞後28天大鼠的左心室功能，以評估IGF1R+間質幹細胞治療缺血性心臟病的效果，分析的組別包含移植間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠、移植IGF1R+間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠、對照組大鼠以及假手術組大鼠。請參照第 19A圖和第19B圖，第19A圖為移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠的心臟超音波圖，第19B圖為移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠心臟超音波的量化圖。由第19A圖和第19B圖的結果顯示，移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞的組別相較於對照組，在心臟超音波分析中可偵測到較低的左心室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)/左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)，以及較高的射出分率(ejection fraction,EF)/部分縮短(fraction shortening,FS)，但不影響急性心肌梗塞大鼠的心跳速率，顯示移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞可改善急性心肌梗塞大鼠的左心室功能。其中又以移植IGF1R+間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠，其左心室功能改善的幅度更高於其他組別。
3.2：IGF1R + 間質幹細胞對缺血心肌的抗發炎影響
本試驗例將進一步探討移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞至急性心肌梗塞大鼠中，是否能抑制心肌梗塞後的炎症反應。實驗上犧牲移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞後3天的急性心肌梗塞大鼠，將心臟組織切片以免疫組織化學染色法偵測發炎的程度、以免疫螢光染色法偵測巨噬細胞的表現和以定量RT-PCR偵測促發炎因子的表現量。
請參照第20圖，為移植間質幹細胞和IGFIR+間質幹細胞3天後的急性心肌梗塞大鼠的免疫組織化學染 色法結果圖。在第20圖中，上圖為以蘇木素-伊紅染色(H&E stain)的急性心肌梗塞大鼠心臟組織切片的顯微照片圖，將心臟組織發炎的情形分為0-5級，級數越高表示發炎程度越嚴重，並將不同組別所拍攝的結果，依上述標準進行分類和統計，統計的結果如第20圖的下圖所示。第20圖的結果顯示，移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞可改善急性心肌梗塞大鼠心臟組織的發炎程度，且移植IGF1R+間質幹細胞改善急性心肌梗塞大鼠心臟組織發炎的能力更好，其中間質幹細胞組別與對照組相比p<0.05，IGF1R+間質幹細胞組別與對照組相比p<0.01。
為進一步偵測移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞後3天的急性心肌梗塞大鼠於心臟組織中巨噬細胞的表現，實驗上將急性心肌梗塞大鼠心臟組織切片以免疫螢光染色法標定巨噬細胞標記CD68，並以螢光顯微鏡觀察結果。請參照第21圖，為移植間質幹細胞和IGFIR+間質幹細胞3天後的急性心肌梗塞大鼠的免疫螢光染色法結果圖，由第21圖的結果顯示，移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞的組別相較於對照組，心肌梗塞後3天大鼠的心臟組織中，有較少的CD68+細胞浸潤在心肌梗塞周圍區域，其中移植IGF1R+間質幹細胞的組別，CD68+細胞表現量顯著少於其他組別。顯示移植IGF1R+間質幹細胞可以大幅改善急性心肌梗塞大鼠心臟組織的發炎程度。
在缺血心肌觀察到發炎細胞的浸潤通常會增加促發炎因子的表達，本試驗進一步以定量RT-PCR偵測心肌 梗塞後3天大鼠的心臟組織中促發炎因子的表現量，偵測的促發炎因子包含IL-1 β、IL-6、TNF-α和IFN-γ，本試驗例中另偵測抗發炎因子IL-10的表現量。請參照第22圖，為移植間質幹細胞和IGFIR+間質幹細胞3天後的急性心肌梗塞大鼠促發炎因子表現量的分析圖。由第22圖的結果顯示，移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞的組別相較於對照組，心肌梗塞後3天大鼠的心臟組織中，促發炎因子IL-1 β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表現量皆降低，其中移植IGF1R+間質幹細胞的組別，促發炎因子IL-1 β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表現量降低的幅度更大。而在抗發炎因子的表現量則與促發炎因子的表現量相反，移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞的組別增加抗發炎因子IL-10的表現量，其中移植IGF1R+間質幹細胞的組別，抗發炎因子IL-10表現量增加的幅度更大移植，此結果亦顯示移植IGF1R+間質幹細胞可以大幅改善急性心肌梗塞大鼠心臟組織的發炎程度。
3.3：IGF1R + 間質幹細胞治療減少心肌梗塞引起的纖維化
心臟的肌纖維與一般的肌纖維不同，能長時間工作把血液打到身體的每一部分。在心肌梗塞時心肌會產生不可逆的壞死，且壞死的部份會由纖維組織替代，在數週後纖維化。本試驗例將探討移植IGF1R+間質幹細胞是否能減少心肌梗塞引起的纖維化現象。實驗上犧牲移植間質幹細胞後28天的急性心肌梗塞大鼠，將心臟組織切片以梅生三色染色法(Masson's trichrome staining)觀察大鼠心臟組織 纖維化的情況，其中膠原纖維呈現藍色，肌肉纖維呈現紅色，分析的組別包含移植間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠、移植IGF1R+間質幹細胞的急性心肌梗塞大鼠、對照組大鼠以及假手術組大鼠。
請參照第23圖，為移植間質幹細胞和IGFIR+間質幹細胞28天後的急性心肌梗塞大鼠的梅生三色染色法結果圖。在第23圖中，上圖為以梅生三色染色法染色的急性心肌梗塞大鼠心臟組織切片的顯微照片圖，將心臟組織中纖維化的情形分為0-5級，級數越高表示纖維化程度越嚴重，並將不同組別所拍攝的結果，依上述標準進行分類和統計，統計的結果如第23圖的下圖所示。第23圖的結果顯示，移植間質幹細胞和IGF1R+間質幹細胞可改善急性心肌梗塞大鼠心臟組織的纖維化情況，且移植IGF1R+間質幹細胞改善急性心肌梗塞大鼠心臟組織纖維化的能力更好，其中間質幹細胞組別與對照組相比p<0.05，IGF1R+間質幹細胞組別與對照組相比p<0.01。
綜合上述，本發明之經單離的間質幹細胞係於細胞表面表現胰島素樣生長因子-1受體，其具有自我更新和多能性(pluripotent)分化的特性。本發明之間質幹細胞純株化擴張之方法中，培養基係使用hUCS為原料，hUCS中富含生長因子，特別是PDGF-BB，可使間質幹細胞大量表現胰島素樣生長因子-1受體，並維持多能性分化能力，而使用人類臍帶血血清之培養基獲得方便，且可避免因使用非人類血清所引起的過敏反應及感染病毒或病原菌的危險。本發 明之分離多能性間質幹細胞之方法，可自哺乳動物組織來源的細胞混合物中，篩選對於IGF1R呈陽性的細胞，更佳地，可再篩選對於IL22RA1呈陽性之細胞，篩選出的即為具多能性分化能力的間質幹細胞，故可快速且專一的純化多能性的間質幹細胞。將本發明之經單離的間質幹細胞用於細胞治療時，其可用於治療個體之腦組織損傷和個體之缺血性心臟病。進一步地說，在治療個體之腦組織損傷的部份，本發明之經單離的間質幹細胞可以增加葡萄糖的代謝活性、促進血管新生和加強神經突再生，並藉由IGF1R和CXCR4的交互作用，具有神經重塑的效果。而在治療個體之缺血性心臟病的部分，本發明之經單離的間質幹細胞可以減輕心肌梗塞後左心室的功能障礙、降低梗塞面積、減少因心肌梗塞引起的纖維化之以及減少免疫反應。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

Claims (17)

  1. 一種經單離的多能性間質幹細胞，該多能性間質幹細胞對細胞標記CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC、Oct-4、Sox-2、Nanog和SSEA-4呈陽性反應，對細胞標記CD34、CD45、CD117和HLA-DR呈陰性反應，且經由胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF1)抗體篩選表現胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)之細胞後培養於含一血小板衍生的生長因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)的一培養基而得。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之經單離的多能性間質幹細胞，其中該經單離的多能性間質幹細胞為人類細胞。
  3. 一種多能性間質幹細胞純株化擴張(clonogenic expansion)之方法，包含：於含一血小板衍生的生長因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)的一培養基中培養如申請專利範圍第1項所述之該經單離的間質幹細胞。
  4. 如申請專利範圍第3項之多能性間質幹細胞純株化擴張之方法，其中該血小板衍生的生長因子-BB 之濃度為5ng/ml至50ng/ml。
  5. 如申請專利範圍第3項之多能性間質幹細胞純株化擴張之方法，其中該血小板衍生的生長因子-BB之來源為一人類臍帶血血清。
  6. 一種分離具多能性的間質幹細胞之方法，包含：提供來自一哺乳動物組織之一細胞混合物；以及進行一分離步驟，該分離步驟係自該細胞混合物單離對於胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC、Oct-4、Sox-2、Nanog和SSEA-4呈陽性且對於CD34、CD45、CD117和HLA-DR呈陰性之細胞，以獲得該多能性的間質幹細胞。
  7. 如申請專利範圍第6項之分離具多能性的間質幹細胞之方法，其中該分離步驟更包含單離對於介白素22受體(interleukin 22 receptor alpha 1,IL22RA1)呈陽性之細胞。
  8. 如申請專利範圍第6項之分離具多能性的間質幹細胞之方法，其中該哺乳動物組織係選自牙髓、胎盤、臍帶、臍帶血及脂肪所組成的族群中。
  9. 一種如申請專利範圍第1項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其係用於製備治療缺血性心臟病之藥物。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其中該缺血性心臟病為心肌梗塞。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其中該治療缺血性心臟病之藥物包含減少因心肌梗塞引起的纖維化之藥物或減少免疫反應之藥物。
  12. 一種如申請專利範圍第1項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其係用於製備治療個體腦組織損傷之藥物。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其中該腦組織損傷係由腦缺血疾病造成。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其中該腦缺血疾病為中風。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其中該腦組織損傷係由神經退化性疾病造成。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其中該神經退化性疾病為帕金森氏症。
  17. 如申請專利範圍第12項所述之經單離的多能性間質幹細胞之用途，其中該治療個體腦組織損傷之藥物包含增加葡萄糖代謝活性之藥物、促進血管新生之藥物或促進神經突再生之藥物。
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