CN109852584B

CN109852584B - 具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物及应用

Info

Publication number: CN109852584B
Application number: CN201811628442.5A
Authority: CN
Inventors: 黄燕飞; 车七石; 刘少辉
Original assignee: Guangzhou Rainhome Pharm and Tech Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Rainhome Pharm and Tech Co Ltd
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109852584A

Abstract

本发明涉及一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物及应用。该组合物包括：0.15～1g维生素、0.53～5g胰岛素、0.1～1g枸橼酸三钠、0.25～1g透明质酸。将该组合物添加至高糖DMEM中形成的诱导培养基，用该诱导培养基能够刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。特别是在诱导培养的过程中配合适当的低氧处理，能进一步增强脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的量。

Description

具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物及应用。

背景技术

干细胞在稳定生长过程中，会分泌许多种细胞因子，以蛋白质多肽形式分泌到培养基上清中，通过收集处理培养干细胞之后的上清液，通过一系列处理，可以获得大量细胞因子，这些人源性因子包括EGF(表皮生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、HGF(肝脏生长因子)、PDGF(血小板衍生因子)、bFGF(成纤维细胞生长因子)等。这些因子大都具有与皮肤生长、血管生长、皮下组织再生有关的生物活性，能够有效调控机体细胞信号传导，活化人体细胞进而生理性修复或替代机体损伤、衰老细胞，促进改善皮肤再生修复。

传统技术通过向干细胞培养基中添加诱导成分，刺激干细胞分泌细胞因子，但还未有公开有诱导组合物，能够用于刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物。将该组合物添加至高糖DMEM中形成的诱导培养基，用该诱导培养基能够刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物，所述的组合物包括：0.15～1g维生素、0.53～5g胰岛素、0.1～1g枸橼酸三钠、0.25～1g透明质酸。

在其中一些实施例中，所述的组合物包括：0.15～0.65g维生素、0.53～3g胰岛素、0.5～1g枸橼酸三钠、0.25～0.55g透明质酸。

在其中一些实施例中，所述的组合物包括：0.55～0.65g维生素、2.5～3g胰岛素、0.5～0.8g枸橼酸三钠、0.5～0.55g透明质酸。

本发明的另一目的是提供上述的组合物在诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子中的应用。

本发明的再一目的是提供一种诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.15～1g的维生素、0.53～5g的胰岛素、0.1～1g的枸橼酸三钠、0.25～1g的透明质酸制备而成。

在其中一些实施例中，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.15～0.65g的维生素、0.53～3g的胰岛素、0.5～1g的枸橼酸三钠、0.25～0.55g的透明质酸制备而成。

在其中一些实施例中，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.55～0.65g的维生素、2.5～3g的胰岛素、0.5～0.8g的枸橼酸三钠、0.5～0.55g的透明质酸制备而成。

本发明的还一目的是提供一种诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，所述方法包括：

(1)获取脂肪间充质干细胞，于传代培养基中进行传代培养；

(2)弃去所述传代培养基，清洗所得脂肪间充质干细胞，更换至上述的培养基中进行诱导培养。

在其中一些实施例中，所述方法包括对所述诱导培养的脂肪间充质干细胞进行低氧处理；所述的低氧处理是指控制所述脂肪间充质干细胞的培养环境中含氧量不高于10％。

在其中一些实施例中，所述低氧处理是在所述诱导培养开始1h～3h开始进行；所述的含氧量为3％～8％；所述低氧处理的时间不超过84h。

在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述传代培养基为无血清脂肪培养基，传代培养至细胞生长密度达到50％～65％；步骤(2)中，所述清洗采用磷酸盐缓冲液。

与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：

本发明将维生素、胰岛素、枸橼酸三钠、透明质酸以合适用量配合，形成具有进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物。将该组合物添加至高糖DMEM中形成的诱导培养基，用该诱导培养基能够刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。特别是在诱导培养的过程中配合适当的低氧处理，能进一步增强脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的量。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明实施例采用的脂肪间充质干细胞可以但不局限于通过如下步骤分离：

(1)将无菌抽取的脂肪组织，浸泡于含P/S双抗的无菌盐水中，送入实验室；

(2)取出脂肪组织，无菌生理盐水，洗涤3遍，将脂肪组织转移至细胞培养皿，加入适量含有0.25％(w/v)EDTA、0.5％(w/v)蛋白酶复合酶的水溶液，放入37℃细胞培养箱消化3h；

(3)用含血清的培养基终止消化，用滤网过滤除去大块脂肪组织，所得滤液转至离心管内，1000rpm离心10min后除去上清液，沉淀细胞用PBS缓冲液洗涤3遍，以去除残留血清，LONZA无血清脂肪培养基重悬细胞后接种至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的培养瓶，放置于细胞培养箱内，37℃下5％CO₂进行培养，获得脂肪间充质干细胞。选用自体脂肪组织提取脂肪间充质干细胞，来源广泛，避免免疫原性。

实施例1

本实施例提供一种促进间充质干细胞分泌细胞因子的组合物及其应用。具体地，是将该组合物添加到高糖DMEM中制备脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基，用于刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。

一、脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基(见表1)：500mL高糖DMEM、0.65gVC、3g胰岛素、0.5g枸橼酸三钠、0.55g透明质酸。

二、脂肪间充质干细胞因子的制备：

(1)待脂肪间充质干细胞细胞长至85％左右，于LONZA无血清脂肪培养基中进行传代培养；

(2)将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用PBS洗三遍，换成脂肪干细胞分泌细胞因子诱导培养基进行培养，2h后，对细胞进行37℃，5％CO₂，5％O₂低氧处理，每隔12观察细胞的生长状况，连续培养72h；

(3)收集各个时间段的细胞上清液，10000rpm，4℃，离心10min，以除去细胞碎片；

(4)收集的上清液，经0.22μm滤膜过滤，然后通过40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100D超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液，即可；

(5)浓缩液可冷冻干燥，保存。

实施例2

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要包括：

1、脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基配方，本实施例中的培养基配方(见表1)具体如下：500mL高糖DMEM、0.15gVC、0.53g胰岛素、0.1g枸橼酸三钠、0.25g透明质酸。

2、步骤(2)中，将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用PBS洗三遍，换成脂肪干细胞分泌细胞因子诱导培养基进行培养，1h后，对细胞进行37℃，5％CO₂，10％O₂低氧处理，每隔12观察细胞的生长状况，连续培养84h；

其他操作同实施例1。

实施例3

1、脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基配方，本实施例中的培养基配方(见表1)具体如下：500mL高糖DMEM、1gVC、5g胰岛素、1g枸橼酸三钠、1g透明质酸。

2、步骤(2)中，将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用PBS洗三遍，换成脂肪干细胞分泌细胞因子诱导培养基进行培养，3h后，对细胞进行37℃，5％CO₂，3％O₂低氧处理，每隔12观察细胞的生长状况，连续培养60h；

其他操作同实施例1。

表1

对比例1

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处包括用LONZA无血清培养基代替脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养。即，步骤(2)：

将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，更换新鲜的LONZA无血清脂肪培养基继续进行培养，2h后，对细胞进行37℃，5％CO₂，5％O₂低氧处理，每隔12观察细胞的生长状况，连续培养72h。其他操作同实施例1。

对比例2

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处包括脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基配方，本对比例中的培养基配方(见表1)具体如下：500mL高糖DMEM、3g胰岛素、0.5g枸橼酸三钠、0.55g透明质酸。其他操作同实施例1。

对比例3

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处包括脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基配方，本对比例中的培养基配方(见表1)具体如下：500mL高糖DMEM、0.65gVC、0.5g枸橼酸三钠、0.55g透明质酸。其他操作同实施例1。

对比例4

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处包括脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基配方，本对比例中的培养基配方(见表1)具体如下：500mL高糖DMEM、0.65gVC、3g胰岛素、0.55g透明质酸。其他操作同实施例1。

对比例5

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处包括脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基配方，本对比例中的培养基配方(见表1)具体如下：500mL高糖DMEM、0.65gVC、3g胰岛素、0.5g枸橼酸三钠。其他操作同实施例1。

对比例6

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处包括步骤(2)中没有采用低氧处理。本对比例的步骤(2)如下：

将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用PBS洗三遍，换成脂肪干细胞分泌细胞因子诱导培养基进行培养，每隔12观察细胞的生长状况，连续培养72h；其他操作同实施例1。

对比例7

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处包括步骤(2)中采用的低氧处理的条件不同。本对比例的步骤(2)如下：

将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用PBS洗三遍，换成脂肪干细胞分泌细胞因子诱导培养基进行培养，4h后，对细胞进行37℃，5％CO₂，15％O₂低氧处理，每隔12观察细胞的生长状况，连续培养96h；其他操作同实施例1。

对比例8

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处包括步骤(2)中，不采用本发明的诱导培养基，也不用低氧处理。本对比例的步骤(2)包括：

将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用PBS洗三遍，换成新鲜的LONZA无血清脂肪培养基进行培养，37℃，5％CO₂连续培养72h。其他操作同实施例1。

测试例1、培养基配方对细胞因子分泌的影响测试

通过用实施例1至3及对比例1至5不同培养基刺激干细胞，并对细胞分泌细胞因子的影响情况进行检测。

用ELISA试剂盒对表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为代表的细胞因子进行检测。

表2

从上表可知：实施例1、实施例2、实施例3中的各细胞因子含量较高，其中实施例1相对较佳，这说明本发明提供的诱导培养基培养存在优选方案。对比例中的个细胞因子含量低于实施例，这说明，本发明提供的诱导培养配方能够明显提升细胞因子分泌，不采用本发明的诱导培养基或者诱导培养基中组分缺失，都起不到很好的增强细胞因子分泌的作用。

测试例2、培养条件对细胞因子分泌的影响测试

实施例1及对比例6-7不同培养条件对细胞分泌细胞因子的影响。用ELISA试剂盒对表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为代表的细胞因子进行检测。

表1

组别	实施例1	对比例6	对比例7	对比例8
					EGF(ng/mL)	65.45	60.54	55.38	20.34
FGF(ng/mL)	160.66	150.15	148.73	100.77
					VEGF(ng/mL)	76.88	70.43	66.16	25.56

从上表可知实施例1～3所制备的各细胞因子含量均高于对比例1，说明间充质干细胞处于本发明的诱导培养基和低氧环境下培养，细胞分泌细胞因子的能力增强，且实施例1两者联合刺激效果最佳。如果不采用低氧处理，或者低氧处理的条件超出本申请的限定，或者既不采用本发明的诱导培养基也不采用低氧处理，那么细胞因子的分泌都会受到影响。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，其特征在于，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.15~1g的维生素、0.53~5g的胰岛素、0.1~1g的枸橼酸三钠、0.25~1g的透明质酸制备而成。

2.根据权利要求1所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，其特征在于，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.15~0.65g的维生素、0.53~3g的胰岛素、0.5~1g的枸橼酸三钠、0.25~0.55g的透明质酸制备而成。

3.根据权利要求1或2所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，其特征在于，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.55~0.65g的维生素、2.5~3g的胰岛素、0.5~0.8g的枸橼酸三钠、0.5~0.55g的透明质酸制备而成。

4.一种诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）获取脂肪间充质干细胞，于传代培养基中进行传代培养；

（2）弃去所述传代培养基，清洗所得脂肪间充质干细胞，更换至权利要求1至3任一项所述的培养基中进行诱导培养。

5.根据权利要求4所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于，所述方法包括对所述诱导培养的脂肪间充质干细胞进行低氧处理；所述的低氧处理是指控制所述脂肪间充质干细胞的培养环境中含氧量不高于10%。

6.根据权利要求5所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于，所述低氧处理是在所述诱导培养开始1h~3h开始进行。

7.根据权利要求5所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于，所述的含氧量为3%~8%。

8.根据权利要求5所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于，所述低氧处理的时间不超过84h。

9.根据权利要求4所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述传代培养基为无血清脂肪培养基，传代培养至细胞生长密度达到50%~65%。

10.根据权利要求4所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述清洗采用磷酸盐缓冲液。