CN111484973B - 一种脂肪干细胞的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞的纯化方法，其包括制备单细胞悬液、处理单细胞悬液、培养原代脂肪干细胞和纯化原代脂肪干细胞等步骤，通过吸附柱网格过滤，使得纯化出的原代脂肪干细胞纯度高，活性高，杂质少；在培养脂肪干细胞过程中加入氨基纤维素和聚己内酯处理可使得杂质不易吸附在脂肪干细胞的表面，提高脂肪干细胞的纯度；增加红外光照射，使得纯化出的脂肪干细胞表型不发生改变，形状比较稳定，质量较佳。

Description

一种脂肪干细胞的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种脂肪干细胞的纯化方法。
背景技术
脂肪来源于间充质，类似于骨髓拥有丰富的基质。脂肪组织中脂肪细胞占50％～70％，除此之外还有脂肪祖细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、血管平滑肌细胞、基质细胞、免疫细胞和造血干细胞等。其中脂肪干细胞(adipose derivedstem cells，ADSCs)是一类具有良好自我复制、多向粉化潜能的成体间充质干细胞，其取材简单、组织来源较为丰富，经过分离纯化获得的ADSCs在特定条件下能够诱导分化为成骨细胞，从而促进骨的形成，为骨缺损修复提供了新方向。
中国专利CN108315297A公开了一种脂肪干细胞的分离、纯化方法，包括脂肪干细胞制备、脂肪间充质干细胞的传代培养、细胞收获。在培养基中加入5ng/ml，EGF+5ng/ml，FGF+5ng/ml，IFN-γ+5ng/ml，TNF-α+1％L-GlutaMAX，可快速获得优质的脂肪干细胞，缩短培养周期，节省了生产成本。
上述中的现有技术方案存在以下缺陷：在培养过程中发现容易出现较多的杂质混在脂肪干细胞当中，提取出来的细胞纯度较低，且跟随着传代次数的增加部分脂肪干细胞的表型在体外会发生变化，因此，亟需找到一种细胞纯度高、细胞表型不发生改变且提取过程中无污染情况的纯化方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种脂肪干细胞的纯化方法，该方法具有步骤简单，绿色环保的优点，纯化出的干细胞纯度高，活性高，杂质少，且干细胞的表型不发生改变。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种脂肪干细胞的纯化方法，包括以下步骤：
S1.制备单细胞悬液：在无菌条件下取小鼠腹股沟区脂肪组织，将脂肪组织剪碎至1～3mm3小组织块，剔除组织块中的血管、椭圆型结节和表面粘附的其他组织，放入含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，加入消化液对组织块进行消化制成单细胞悬液；
S2.处理单细胞悬液：往步骤S1得到的单细胞悬液加入分散剂，搅拌均匀，然后将单细胞悬液多次离心，利用直径为100～120μm的吸附柱网格第一次过滤细胞悬液，再用直径为60～80μm的吸附柱网格进行第二次过滤，最后用直径为40～50μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格收集吸附的细胞；
S3.培养原代脂肪干细胞：步骤S2得到的吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，期间进行细胞换液，待细胞长至80％时传代，获得原代脂肪干细胞；
S4.纯化原代脂肪干细胞：待原代脂肪干细胞长满后，增加红外光照射，然后加入胰酶消化，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去，多次传代。
通过采用上述技术方案，将取得的小鼠腹股沟区脂肪组织中的血管、椭圆型结节和表面粘附的其他组织剔除，减少组织中的杂质对分离纯化脂肪干细胞过程中的影响；在制成的单细胞悬液中加入分散剂，使得杂质不容易粘附在脂肪干细胞的表面，使得脂肪干细胞的纯度更高。将单细胞悬液进行多次离心后，然后利用由无纺纤维和聚乙烯织物构成的吸附柱网格第一次过滤掉单细胞悬液中的液体部分，脂肪干细胞贴壁至吸附柱网格上，由分散剂分散的杂质跟随液体部分除去，用直径为40～50μm的吸附柱网格进行第二次过滤，除去分子量更小的杂质，最后用直径为40～50μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格上收集吸附的脂肪干细胞，使得纯化脂肪干细胞纯度高，活性高，杂质少；将脂肪干细胞进行培养、纯化，得纯化原代脂肪干细胞，增加红外光照射，使得纯化出的干细胞表型不发生改变，形状比较稳定，本发明的方法步骤简单，可连续化生成，绿色环保。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S2中的分散剂包括聚己内酯和氨基纤维素。
通过采用上述技术方案，氨基纤维素是纤维素上的D-吡喃葡萄糖环上的一个或多个羟基被氨分子或者胺类化合物取代的一类物质，其具有良好的可生物降解性、生物兼容性、成膜性，可与重金属离子配位形成络合物和螯合物，可作为污水吸附材料。
本发明人经过大量的试验发现，在培养脂肪干细胞过程中加入氨基纤维素和聚己内酯处理可使得杂质吸附本氨基纤维素的表面，杂质不容易吸附在脂肪干细胞的表面，从而经过吸附柱网格被除去，多余的氨基纤维素和聚己内酯在经过吸附柱网格三次过滤可被完全去除，减少污染，降低对实验结果的影响。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述聚己内酯和氨基纤维素的质量比为1:(1～1.5)。
通过采用上述技术方案，聚己内酯和氨基纤维素的质量比为1:(1～1.5)，使得去除杂质的效果更佳，得到纯化原代脂肪干细胞纯度更高。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S4中红外光采用波长为700～1000nm的红外光，照射10～30s。
通过采用上述技术方案，步骤S4中红外光的波长为700～1000nm，红外光照射10～30s，通过在合适的照射时间对原代脂肪干细胞照射，使得纯化出的干细胞表型不发生改变，形状比较稳定。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S1中的青霉素的浓度为350IU/ml；所述链霉素的浓度为380μg/ml。
通过采用上述技术方案，青霉素的浓度为350IU/ml，链霉素的浓度为380μg/ml，减少杂菌对试验结果的影响，降低污染。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S2中，利用直径为105μm的吸附柱网格第一次过滤细胞悬液，再用直径为75μm的吸附柱网格进行第二次过滤，最后用直径为40μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格收集吸附的细胞。
通过采用上述技术方案，第一次过滤采用直径为105μm的吸附柱网格，第二次过滤采用75μm的吸附柱网格，第三次过滤采用40μm的吸附柱网格，使得后期纯化原脂肪干细胞纯度高，活性高，杂质少，通过细胞悬液经过第一次过滤至第三次过滤需要掌控时间，因为第一次过滤细胞悬液和第二次过滤细胞悬液时脂肪干细胞容易受到机械的损伤，所以要控制时间的间隔，直到细胞的表面没有明显的杂质再进行第三次吸附柱网格过滤，使得得到的原脂肪干细胞纯度较高，活性较高。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S3中得到的吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬后，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液反复冲洗2～3次，加入新鲜的完全培养基继续培养，培养36h后弃去完全培养基进行第二次洗涤，用磷酸盐缓冲液反复冲洗3～5次，加入新鲜的完全培养基继续培养。
通过采用上述技术方案，吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬后，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，使得杂细胞和组织除去，期间加入完全培养基补充细胞的营养成分，保证细胞的正常生理状态。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述完全培养基的组成成分包括：胎牛血清20％，青霉素150IU/ml，链霉素120μg/ml，L-谷氨酰胺1.5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，DMEM/F12补足至100％。
通过采用上述技术方案，在完全培养基中加入胎牛血清20％，青霉素150IU/ml，链霉素120μg/ml，L-谷氨酰胺1.5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，较好的补充原代脂肪干细胞的营养成分。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S1中的消化液中含0.075wt.％I型胶原酶、0.5wt.％II型胶原酶和0.1wt.％胰蛋白酶。
通过采用上述技术方案，消化液中含0.075～0.1wt.％I型胶原酶、0.5wt.％II型胶原酶和0.1wt.％胰蛋白酶，使得组织块消化的程度较好，减少其他组织对提取原代脂肪干细胞的影响。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S2中吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在6h～7h。
通过采用上述技术方案，吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液时，将时间控制在6h～7h，直到细胞的表面没有明显的杂质再进行第三次吸附柱网格过滤，使得得到的原脂肪干细胞纯度较高，活性较高，质量较好。
本发明还可以提供一种脂肪干细胞在成骨诱导上的应用。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1.本发明提供一种脂肪干细胞的纯化方法，通过吸附柱网格过滤，使得纯化出的原代脂肪干细胞纯度高，活性高，杂质少；
2.本发明提供一种脂肪干细胞的纯化方法，在培养脂肪干细胞过程中加入氨基纤维素和聚己内酯处理可使得杂质不容易吸附在脂肪干细胞的表面，提高脂肪干细胞的纯度；
3.本发明提供一种脂肪干细胞的纯化方法，在原代脂肪干细胞长满后，增加红外光照射，使得纯化出的干细胞表型不发生改变，形状比较稳定，质量较佳。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
实施例1
S1.制备单细胞悬液：取4周龄的ICR雄鼠(购自广东省医学实验动物中心)，颈椎脱臼处死，75％酒精全身浸泡消毒5min，75％酒精消毒腹部，无菌条件下取腹股沟处区脂肪组织，将脂肪组织剪碎至1～3mm3小组织块放置于试管中，在取脂肪组织时剔除组织时，剔除组织块中的血管、椭圆型结节和表面粘附的其他组织，往试管中放入含有浓度350IU/ml青霉素和浓度380μg/ml链霉素的磷酸盐缓冲液中清洗3次，加入含有0.075wt.％I型胶原酶、0.5wt.％II型胶原酶和0.1wt.％胰蛋白酶的消化液对组织块进行消化，37℃消化1h，期间每隔5min摇动试管，使得小组织块与消化液充分混匀，消化完后，用吸管反复吹打消化后的悬液，分散组织块，制成单细胞悬液，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况；
S2.处理单细胞悬液：往步骤S1得到的单细胞悬液加入质量比为1:1的聚己内酯和氨基纤维素的分散剂，搅拌速度120rpm/min，搅拌时间30min，搅拌均匀，然后将单细胞悬液多次离心，离心速度为1000rpm/min，离心时间为20min，利用直径为100μm的吸附柱网格第一次过滤离心后的细胞悬液，再用直径为60μm的吸附柱网格进行第二次过滤，最后用直径为40μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格收集吸附的细胞，吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在6h；
S3.培养原代脂肪干细胞：步骤S2得到的吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液反复冲洗2次，加入新鲜的完全培养基继续培养，培养36h后弃去完全培养基进行第二次洗涤，用磷酸盐缓冲液反复冲洗3次，加入新鲜的完全培养基继续培养，待细胞长至80％时传代，获得原代脂肪干细胞；
S4.纯化原代脂肪干细胞：待原代脂肪干细胞长满后，增加波长为700nm的红外光照射10s，然后加入胰酶消化2min，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去，多次传代。
在本实施例中，步骤S3中的完全培养基的的组成成分包括：胎牛血清20％，青霉素150IU/ml，链霉素120μg/ml，L-谷氨酰胺1.5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，DMEM/F12补足至100％。
实施例2
实施例2的步骤S1与实施例1的步骤S1相同，与实施例1的区别在于：
S2.处理单细胞悬液：往步骤S1得到的单细胞悬液加入质量比为1:1.25的聚己内酯和氨基纤维素的分散剂，搅拌速度150rpm/min，搅拌时间40min，搅拌均匀，然后将单细胞悬液多次离心，离心速度为1200rpm/min，离心时间为30min，利用直径为110μm的吸附柱网格第一次过滤离心后的细胞悬液，再用直径为70μm的吸附柱网格进行第二次过滤，最后用直径为45μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格收集吸附的细胞，吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在6.5h；
S3.培养原代脂肪干细胞：步骤S2得到的吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液反复冲洗3次，加入新鲜的完全培养基继续培养，培养36h后弃去完全培养基进行第二次洗涤，用磷酸盐缓冲液反复冲洗5次，加入新鲜的完全培养基继续培养，待细胞长至80％时传代，获得原代脂肪干细胞；
S4.纯化原代脂肪干细胞：待原代脂肪干细胞长满后，增加波长为800nm的红外光照射20s，然后加入胰酶消化2min，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去，多次传代。
本实施例步骤S3中的完全培养基的的组成成分与实施例1中完全培养基成分相同。
实施例3
实施例3的步骤S1和步骤S3与实施例1的步骤S1和步骤3相同，与实施例1的区别在于：
S2.处理单细胞悬液：往步骤S1得到的单细胞悬液加入质量比为1:1.5的聚己内酯和氨基纤维素的分散剂，搅拌速度180rpm/min，搅拌时间60min，搅拌均匀，然后将单细胞悬液多次离心，离心速度为1500rpm/min，离心时间为40min，利用直径为120μm的吸附柱网格第一次过滤离心后的细胞悬液，再用直径为80μm的吸附柱网格进行第二次过滤，最后用直径为50μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格收集吸附的细胞，吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在7h；
S4.纯化原代脂肪干细胞：待原代脂肪干细胞长满后，增加波长为1000nm的红外光照射30s，然后加入胰酶消化2min，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去，多次传代。
实施例4
实施例4的步骤S1和步骤S3与实施例1的步骤S1和步骤3相同，与实施例1的区别在于：
S2.处理单细胞悬液：往步骤S1得到的单细胞悬液加入质量比为1:1.2的聚己内酯和氨基纤维素的分散剂，搅拌速度160rpm/min，搅拌时间45min，搅拌均匀，然后将单细胞悬液多次离心，离心速度为1500rpm/min，离心时间为40min，利用直径为105μm的吸附柱网格第一次过滤离心后的细胞悬液，再用直径为75μm的吸附柱网格进行第二次过滤，最后用直径为40μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格收集吸附的细胞，吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在6h；
S4.纯化原代脂肪干细胞：待原代脂肪干细胞长满后，增加波长为850nm的红外光照射15s，然后加入胰酶消化2min，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去，多次传代。
对比例1
与实施例4类似，区别在于：步骤S2中不添加分散剂，其余参数与实施例4相同。
对比例2
与实施例4类似，区别在于：步骤S2中的分散剂仅含有100g聚己内酯，其余参数与实施例4相同。
对比例3
与实施例4类似，区别在于：步骤S2中的分散剂仅含有100g氨基纤维素，其余参数与实施例4相同。
对比例4
与实施例4类似，区别在于：步骤S2中，单细胞悬液多次离心后，利用直径为105μm的吸附柱网格第一次过滤离心后的细胞悬液，再用直径为75μm的吸附柱网格进行第二次过滤，不再进行第三次过滤，其余参数与实施例4相同。
对比例5
与实施例4类似，区别在于：步骤S2中，吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在4h，其余参数与实施例4相同。
对比例6
与实施例4类似，区别在于：步骤S4中，不增加红外光照射，其余参数与实施例4相同。
对比例7
与实施例4类似，区别在于：步骤S4中，波长为500nm的红外光照射15s，其余参数与实施例4相同。
对比例8
与实施例4类似，区别在于：步骤S4中，波长为1100nm的红外光照射15s，其余参数与实施例4相同。
试验一、脂肪干细胞表面标志物检测
取实施例1～4及对比例1～8纯化后的第3代脂肪干细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，PBS冲洗3遍，用100μLPBS重悬，经流式细胞分析仪检测充质来源细胞的表面抗原CD44、CD105、Sca-1，也检测了杂细胞表面标记的造血干细胞表面抗原CD44、内皮细胞表面抗原CD31、成纤维细胞表面抗原HLA-DR的表达率，见表1。
表1
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根据表1知，实施例1～4纯化得到的脂肪干细胞表面抗原CD44、CD105、Sca-1表达率较高，杂细胞表面抗原CD44、CD31和HLA-DR的表达率较低，代表纯化得到的脂肪干细胞纯度高，活性好，且杂质少，其中以实施例4为最佳实施例。
对比例1在不添加分散剂的情况下，杂细胞表面抗原CD44、CD31和HLA-DR的表达率较高，脂肪干细胞表面抗原表达率较低，纯化的原代脂肪干细胞纯度较低，活性较差，杂质较多；当分散剂为其中一种物质(聚己内酯或氨基纤维素)，纯化的原代脂肪干细胞纯度和活性均不及实施例5得到的原代脂肪干细胞，说明聚己内酯和氨基纤维素通过特定的比例添加至单细胞悬液，使得纯化得到的脂肪干细胞纯度高，活性好，杂质少。
对比例4单细胞悬液多次离心后，不再进行第三次过滤，脂肪干细胞表面会存在一定的杂质，影响脂肪干细胞的纯度。
对比例5吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在4h，脂肪干细胞的纯度微低，因为第一次过滤细胞悬液和第二次过滤细胞悬液时脂肪干细胞容易受到机械的损伤，通过细胞悬液经过第一次过滤至第三次过滤需要掌控时间，所以要控制时间的间隔，保证脂肪干细胞的质量要求。
对比例6不使用红外光照射，其中杂细胞表面抗原CD44、CD31和HLA-DR的表达率较高，脂肪干细胞表面抗原表达率较低，纯化的原代脂肪干细胞纯度较低，活性较差，杂质较多，细胞形态效果较差。
对比例7和对比例8增加或减少红外光的波长，对脂肪干细胞纯度和活性的有些影响，但是影响效果不及对比例4。
试验二、脂肪干细胞形态检测
在无菌的条件下，将纯化后的原代脂肪干细胞分别以1×104接种于24孔板，用倒置显微镜37XC(购买于北京上光仪器有限公司)观察细胞的形态，观察到原代脂肪干细胞呈长梭型，然后原代脂肪干细胞长满后，0.25％胰酶37℃消化2min，血清终止消化后，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，将已消化下来的细胞置于15ml离心管离心，离心速度1000rpm/min，离心时间5min，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10％血清的DMEM-L培养基继续培养，培养24h后，以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，继续观察细胞的形态，经过多次细胞传代，与原代脂肪干细胞形态进行对比，观察脂肪干细胞形态的结果。
结果：实施例1～4所取得脂肪干细胞在体外经过多次细胞传代，脂肪干细胞的表型不发生变化，呈长梭型，对比例1～5取得脂肪干细胞的表型不发生明显变化，脂肪干细胞表型呈长梭型。
对比例6不增加红外光照射，纯化的脂肪干细胞在体外经过多次细胞传代后，脂肪干细胞的表型发生明显变化，呈不规则形态，细胞的外表面杂质较多，说明增加红外光对脂肪干细胞表型有影响，增加700～1000nm的红外光照射原代脂肪干细胞10～30s，使得脂肪干细胞形状较为稳定，细胞表型不容易发生变化。
对比例7使用波长为500nm的红外光照射原代脂肪干细胞15s，对比例8使用波长为1100nm的红外光照射原代脂肪干细胞15s，脂肪干细胞的表型有些变化，因此需要掌控好红外光照射的波长范围，使得脂肪干细胞的表型不发生明显改变。
试验三、三系分化潜能检测
将实施例1～4纯化后的原代脂肪干细胞分别以1×104接种于24孔板，待细胞长到80％时，0.25％胰酶37℃消化3min，血清终止消化后，置于15ml离心管离心，离心速度1000rpm/min，离心时间5min，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10％血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液(购自GIBCO)进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周，用茜素红检测。骨诱导液的成分组成：dexamethasone(10-7M)，β-glycerol phosphate(10mM)，ascorbic acid(50ug/ml)。
结果表明显示，实施例1～4纯化后的原代脂肪干细胞在体外能够很好地分化为成熟的成骨细胞，具有良好的体外分化潜能。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.制备单细胞悬液：在无菌条件下取小鼠腹股沟区脂肪组织，将脂肪组织剪碎至1～3mm3小组织块，剔除组织块中的血管、椭圆型结节和表面粘附的其他组织，放入含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，加入消化液对组织块进行消化制成单细胞悬液；
S2.处理单细胞悬液：往步骤S1得到的单细胞悬液加入分散剂，搅拌均匀，然后将单细胞悬液离心，利用直径为105μm的吸附柱网格第一次过滤细胞悬液，再用直径为75μm的吸附柱网格进行第二次过滤，最后用直径为40μm的吸附柱网格进行第三次过滤，通过逆行流冲洗吸附柱网格收集吸附的细胞；
S3.培养原代脂肪干细胞：步骤S2得到的吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，期间进行细胞换液，待细胞长至80％时传代，获得原代脂肪干细胞；
S4.纯化原代脂肪干细胞：待原代脂肪干细胞长满后，增加红外光照射，然后加入胰酶消化，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去，多次传代；所述红外光采用波长为700～1000nm的红外光，照射10～30s；
所述步骤S2中的分散剂由聚己内酯和氨基纤维素按质量比为1:(1～1.5)组成；
所述步骤S2中吸附柱网格第一次过滤细胞悬液至吸附柱网格第三次过滤细胞悬液，整个过程时间控制在6h～7h。
2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述步骤S1中的青霉素的浓度为350IU/ml；所述链霉素的浓度为380μg/ml。
3.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述步骤S3中得到的吸附细胞用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬后，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液反复冲洗2～3次，加入新鲜的完全培养基继续培养，培养36h后弃去完全培养基进行第二次洗涤，用磷酸盐缓冲液反复冲洗3～5次，加入新鲜的完全培养基继续培养。
4.根据权利要求3所述的脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述完全培养基的组成成分包括：胎牛血清20％，青霉素150IU/ml，链霉素120μg/ml，L-谷氨酰胺1.5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，DMEM/F12补足至100％。
5.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述步骤S1中的消化液中含0.075wt.％I型胶原酶、0.5wt.％II型胶原酶和0.1wt.％胰蛋白酶。
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