CN101278045A - 干细胞和/或祖细胞的赋活剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种干细胞和/或祖细胞的赋活剂，该赋活剂包含类凝血酶，并可用于再生医学、特别是利用自身再生的再生医学中。该赋活剂能够根据再生医学应用的损伤器官和/或组织的进展状态及程度、快速而适度地发挥作用，且具有很小的副作用或者无副作用。本发明还提供了一种赋活动物干细胞和/或祖细胞的方法，该方法包含给予该动物所需要有效治疗剂量的类凝血酶，以及提供了类凝血酶用于赋活干细胞和/或祖细胞的用途。

Description

干细胞和/或祖细胞的赋活剂
技术领域
本发明涉及一种包含类凝血酶的干细胞和/或祖细胞的赋活剂，涉及一种包括对动物给予有效量的类凝血酶步骤的赋活该动物中的干细胞和/或祖细胞的方法，以及类凝血酶用于赋活干细胞和/或祖细胞的用途。
背景技术
发生于人类的疾病可大致分为器质性疾病和功能性疾病。在传统的医学中，内科治疗主要用于功能性疾病，而外科治疗和内科治疗用于器质性疾病。然而，大多数内科治疗是对症治疗，很多情况下不能根治疾病。此外，外科治疗是侵害性治疗方法，其通过摘除全部或者部分损伤的器官进行，从而导致器官功能的部分或者完全丧失。另一方面，器官移植和人工器官被作为外科治疗的替代医疗方法。然而，器官移植存在许多问题，例如技术问题，比如用于抑制排斥反应的免疫抑制剂引起的副作用，以及诸如捐献者严重短缺和卫生保健费增加等社会问题。此外，在使用人工器官治疗中也存在许多问题，其包括技术问题，比如不能代替该器官功能和生物相容性，以及诸如卫生保健费增加等社会问题。
再生医学作为解决这些问题的新的治疗方法在当前引起了关注。再生医学是指积极地利用细胞、对因疾病或意外事故引起功能紊乱或功能障碍的组织和器官进行结构再生和功能恢复的治疗方法。根据利用细胞的方式再生医学可大致分为以下三种类型：
(1)一种包括下述步骤的方法：从捐献者收集胚胎干细胞、胎盘血液来源单个核细胞、血液来源单个核细胞或者骨髓来源单个核细胞，在体外培养诱导细胞增殖和/或分化，并通过移植将所选的未分化的(干细胞和/或祖细胞)和/或已分化的细胞导入患者身体；
(2)一种包括下述步骤的方法：从该患者收集体干细胞(somatic stemcells)、血液来源单个核细胞或者骨髓来源单个核细胞，在体外培养诱导细胞增殖和/或分化，并通过移植将所选的未分化的(干细胞和/或祖细胞)和/或已分化的细胞导入患者自己的身体；和
(3)一种包括下述步骤的方法：刺激患者的身体(例如，通过给药、身体锻炼或者物理疗法等)以赋活存在于该患者损伤器官或组织原位的干细胞和/或祖细胞(被称作为内在(resident)干细胞和/或祖细胞)，和/或患者的血液来源或者骨髓来源干细胞和/或祖细胞，而不在体外培养诱导干细胞和/或祖细胞的增殖和/或分化。将该方法定义为“自身再生”(self-regeneration)。
当前再生医学的主流为涉及通过细胞移植从外部导入患者身体的方法(即，上述(1)和(2)的方法)。
其中将已分化的细胞从外部导入患者身体的方法用于皮肤病学、眼科学和整形外科领域，其目标组织或器官为由一种或极其有限种类细胞所构建的组织或器官(例如，皮肤、骨、软骨、角膜和肌肉组织)。然而，关于由多种类型的细胞所构建的实体器官(例如，心脏、肝、肺、肾和脑)，适宜地调控这些多种类型的已分化细胞行为的技术还有待充分建立，并且还没有达到实用水平。
另一方面，以下方法为已知的将未分化的细胞从患者身体外部导入的方法。
(1)血管新生(angiogenesis)的治疗方法，其涉及在严重的缺血性疾病和心血管病中从患者身体外部导入干细胞和/或血管内皮祖细胞以促进血管新生，并形成新的血管(Weissman IL：Translating stem andprogenitor cell biology to the clinic：Barriers and opportunities.Science287：1442-1446，2000)。
(2)血管形成(vasculogenesis)的方法，其利用从患者身体外部导入胚胎干细胞(ES细胞)(McCloskey KE等人：Use of embryonic stemcell-derived endothelial cells as a cell source to generate vessel structures invitro.Tissue Eng 11：497-505，2005)。该方法还没有达到实际应用，因为培养ES细胞、诱导细胞分化和获得已分化细胞等方法还没有充分建立。
(3)自体骨髓移植的方法，其利用从患者自身骨髓分离的骨髓来源单个核细胞，并直接将细胞导入病变部位来形成新的血管(Sato Y等人，Can a bone marrow cell contribute to organ regeneration？In vivoanalysis using transgenic rats with reporter genes.TransplantationProceedings 37：273-275，2005)。该方法存在诸如只能得到少量干细胞、以及因通过全身麻醉收集大量的骨髓对患者存在身体负担和危险等问题。再者，在调控移植细胞的分化中也存在相当大的困难。
此外，在使用有关从患者身体外部导入干细胞和/或祖细胞的方法的再生医学中，一个共同的问题是发生并发症的危险，该并发症可归因于移植细胞的过度再生和/或过度修复。
相对而言，利用“自身再生”的方法，即“赋活”本来存在于患者身体内部的干细胞和/或祖细胞(即，内在干细胞和/或祖细胞，和/或来自患者自身的血液来源或骨髓来源干细胞和/或祖细胞)再生损伤器官和/或组织从而可恢复其功能。
虽然内在干细胞和/或祖细胞已被皆知存在于有再生能力的器官肝脏中，但这样的具有再生能力的细胞最近被报导也存在于神经系统(尤其中枢神经系统如脑)、皮肤、脂肪组织、视网膜、角膜、骨骼肌甚至是心脏中(Garry DJ等人：Ponce de Leon′s fountain：stem cells and theregenerating heart.Am J Med Sci 329(4)：190-201，2005)。目前，认为内在干细胞和/或祖细胞存在于所有器官和组织中(Weissman IL：Translatingstem and progenitor cell biology to the clinic：Barriers and opportunities.Science 287：1442-1446，2000；Garry DJ等人：Ponce de leon′s fountain：stem cells and the regenerating heart.Am J Med Sci 329(4)：190-201，2005)。
从下面的文献已知内在干细胞和/或祖细胞、和/或血液来源或骨髓来源干细胞和/或祖细胞可分化成不同类型的组织细胞，细胞的分化类型取决于它们所存在的不同诱导微环境条件。如：不同类型的接触细胞、细胞外基质的内容物、诱导微环境条件中所含有的细胞因子和生长因子等。例如：
(1)当在神经营养因子或者生长因子存在下培养神经干细胞时，它们形成被称为神经球(neurosphere)的单个细胞来源的集落(即，自我复制(self-replication))，并且这些神经球根据不同的诱导微环境条件分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞(即，多潜能性(multipotency))。此外，当在体外传代培养神经球时，可以从神经球来源的单个细胞形成另一个神经球(Reynolds BA和Weiss S：Generation ofneurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian centralnervous system.Science 255：1707-1710，1992)；
(2)尽管当从成年大鼠脊髓得到的神经干细胞被移植到另一成年大鼠的脊髓中时，神经干细胞只分化成胶质细胞，但当它们被移植到海马齿状回时可分化成神经元(Shihabuddin LS等人：Adult spinal cordstem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus.The J Neuroscience 20：8727-8735，2000)；
(3)将神经干细胞与血管内皮细胞一起培养时，可促进神经干细胞的增殖并分化成神经元(Shen Q等人：Endothelial cells stimulateself-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.Science304：1338-1440，2004)。
另一方面，已知的以利用自身再生的再生医学为目的、用于增加内在干细胞和/或祖细胞，和/或血液来源或者骨髓来源干细胞和/或祖细胞的促进方法如下：
(1)对脑缺血模型动物给予EGF时，可促进神经干细胞增殖，且梗塞区约20％的损失细胞得到再生(Teramoto T等人：EGF amplifies thereplacement of parvalbumin-expressing striatal interneurons after ischemia.The J Clinical Investigation 111：1125-1132，2003)；
(2)当对动脉硬化患者给予高脂血症治疗药物斯达汀(statin，3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂)时，骨髓来源血液血管干细胞(hemangioblast)或内皮祖细胞在血液中增加(WalterDH等人：Statin therapy accelerates reendothelialization：A novel effectinvolving  mobilization and incorporation of bone marrow-derivedendothelial progenitor cells.Circulation 105：3017-3024，2002)；
(3)除了上述EGF外，多种生长因子如VEGF、FGF(b-FGF)、PDGF、NGF和HGF，细胞因子如G-CSF、GM-CSF、促红细胞生成素(EPO)，和其他生物活性物质如雌激素和脂类等也被报道用于增加干细胞和/或祖细胞(Takeyama K，Ohto H：PBSC mobilization.Transfus Apher Sci31：233-243，2004；Aicher A，Zeiher AM，Dimmeler S：Mobilizingendothelial progenitor cells.Hypertension 45：321-325，2005)。然而，仅有两、三种的上述物质被开发成了药物，如G-CSF和b-FGF。此外，G-CSF具有致癌作用的危险，而b-FGF如在静脉内注射的过程中有血管闭塞这样的副作用的危险。另外，考虑到归因于生长因子靶向多种类型细胞而引起副作用的多样性，VEGF和b-FGF作为具有靶向细胞类型少的生长因子被开发研究，但在临床研究中还未得到足够的疗效。此外，EPO具有包括血压升高的副作用。
另外，巴曲酶是已知的急性脑梗死等的治疗药物，在下面的中国网站报导在大鼠脑局部缺血的缺血组织中巴曲酶对CD34的表达有影响。
作者：蔡振利
标题：大鼠局灶脑缺血/再灌注模型CD34表达及巴曲酶对其表达的影响
相关网站：中国学位论文数据库(CDDB)，索引号Y653774
媒体类型：在线
出版商：万方数据
访问日：2005年7月28日
网址：URL:http://ww.wanfangdata.com.cn/
在该报导中，在含有血管不存在血液的脑组织标本(在采样前进行冠脉灌注从脑组织去除血液后得到的组织标本)中检测到细胞表面抗原CD34的表达。在这里，CD34不仅在存在于骨髓的血液血管干细胞、造血干细胞、血管EPC和间充质干细胞，以及存在于血液的血管EPC和间充质干细胞(两者都是未分化的细胞)中表达，而且在组成血管壁的成熟血管内皮细胞(已分化的细胞)中也表达(Ohsawa T等人编著：Encyclopedia of Immunology(2nd Edition)，p.327，Tokyo Kagaku Dozin，December 3，2001)。因此，尽管在使用骨髓和血液作为标本的情况下，未分化细胞(干细胞和祖细胞)为CD34阳性，但在使用含有血管而不存在血液的脑组织所组成的标本的情况下，只有已分化细胞为CD34阳性。因此，该报导未针对巴曲酶对干细胞和/或祖细胞的作用做任何评价。
另一方面，临床上需要能够通过利用自身再生的方法用于再生医学的物质，所述物质具有很小或者无副作用，且能够根据该再生医学所应用的损伤器官和/或组织的进展状态及程度、快速并适度地发挥作用(Kinnaird T等人：Bone-marrow derived cells for enhancing collateraldevelopment：mechanism，animal data and initial clinical experiences.CirRes 95(4)：354-363，2004)。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种能够用于再生医学、特别是利用自身再生的再生医学的干细胞和/或祖细胞的赋活剂。
为了解决上述问题、本发明的发明人对巴曲酶(一种类凝血酶)与干细胞及祖细胞赋活之间的关系进行了深入的研究。结果发现，通过使用巴曲酶赋活所述细胞，损伤器官和组织能够得到再生。本发明是根据此发现而完成的。
即，本发明涉及一种包含类凝血酶的干细胞和/或祖细胞赋活剂，涉及一种包括对所述动物给予有效量的类凝血酶步骤的赋活动物干细胞和/或祖细胞的方法，以及类凝血酶用于赋活干细胞和/或祖细胞的用途。
附图简述
图1显示的是与模型组比较时，巴曲酶组巢蛋白阳性细胞的相对数的直方图；
图2显示的是与模型组比较时，巴曲酶组BrdU阳性细胞的相对数目的直方图；
图3显示的是与模型组比较时，巴曲酶组GFAP阳性细胞的相对数目的直方图；
图4显示的是与模型组比较时，巴曲酶组BrdU阳性(迁移)细胞的相对数目的直方图；和
图5显示的是模型组(左)和巴曲酶组(右)SVZ区中BrdU阳性细胞分布的照片。箭头表示BrdU阳性细胞。
实施本发明的最佳方式
下面提供本发明的详细说明。
本发明的干细胞和/或祖细胞的赋活剂的特征是包含类凝血酶作为其活性成分。
类凝血酶的特定实例包括巴曲酶(batroxobin)、安克洛酶(ancrod)、克洛他酶(crotalase)等(Stocker KF：Snake venom proteins affectinghemostasis and fibrinolysis，in Medical Use of Snake Venom Proteins，Stocker KF，ed.，CRC Press，Boston，p130-131；1990)。巴曲酶是最有代表性的类凝血酶、且为最优选者。
巴曲酶是来自南美矛头蝮蛇(Bothrops atrox moojeni)毒液的类凝血酶丝氨酸蛋白酶。巴曲酶从纤维蛋白原中仅游离纤维蛋白肽A，结果形成des A纤维蛋白(即，纤维蛋白I)(Aronson DL：Comparison of theactions of thrombin and the thrombin-like venom enzymes Ancrod andBatroxobin.Thrombos Haemostas(stuttg)36：9-13，1976)。此外，在此前巴曲酶的一级结构已经被证实为由231个氨基酸组成的具有分子量约为36,000Da的单链糖蛋白(Itoh N等人：Molecular cloning and sequenceanalysis of cDNA for batroxobin，a thrombin-like snake venom enzyme.JBiol Chem 262：3132-3135，1987)。
巴曲酶是与凝血酶相同种类的丝氨酸蛋白酶。然而，与巴曲酶只从纤维蛋白原游离纤维蛋白肽A，形成des A纤维蛋白相比，凝血酶从纤维蛋白原游离纤维蛋白肽A和纤维蛋白肽B，在形成纤维蛋白这方面有所不同。此外，巴曲酶不作用于纤维蛋白原以外的凝血因子，但凝血酶却与其不同，会作用于其它凝血因子。
巴曲酶自身是已知的物质，且可根据日本专利申请公开号S57-10718(日本专利号1118129)中描述的方法制备。或者，其可以容易地从Tobishi Pharmaceutical Co.，Ltd.(日本东京)及其分公司北京托毕西药业有限公司(中国北京)得到。
安克洛酶是来自马来西亚蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma)毒液的类凝血酶丝氨酸蛋白酶。安克洛酶是分子量约为35,400Da的糖蛋白。与巴曲酶一样，安克洛酶只从纤维蛋白原游离纤维蛋白肽A，形成des A纤维蛋白(Stocker KF：Snake venom proteins affecting hemostasis andfibrinolysis，in Medical Use of Snake Venom Proteins，Stocker KF，ed.，CRC Press，Boston，p134-135；1990)。
克洛他酶是来自东部菱背响尾蛇(Crotalus adamanteus)毒液的类凝血酶丝氨酸蛋白酶。克洛他酶是分子量约为32,700Da的糖蛋白。与巴曲酶一样，克洛他酶只从纤维蛋白原游离纤维蛋白肽A，形成des A纤维蛋白(Stocker KF-Snake venom proteins affecting hemostasis andfibrinolysis，in Medical Use of Snake Venom Proteins，Stocker KF，ed.，CRC Press，Boston，p140-141，1990)。
上述类凝血酶如巴曲酶、安克洛酶和克洛他酶可以是天然物质或基因重组产品。
尽管本发明的目标干细胞和祖细胞的定义在相关技术领域中还没有完全标准化，但在本说明书中根据已获得共识的概念，将干细胞和祖细胞以下面的形式进行定义(Weissman IL：Translating stem andprogenitor cell biology to the clinic：Barriers and opportunities.Science287：1442-1446，2000；McKay R：Stem cells hype and hope.Nature406：361-364，2000)。
干细胞是具有自我复制能力(self-replication)和多潜能性(multipotency)的未分化细胞。干细胞的具体实例包括胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、体干细胞(成体干细胞)、血液血管干细胞(hemangioblast)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和其它细胞的干细胞(包括骨细胞、软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、神经元、腱细胞、脂肪细胞、胰腺细胞(pancreocyte)、肝细胞和肾原细胞)。
祖细胞是具有自我复制能力和多潜能性的未分化细胞，但其最终分化细胞的类型是已经决定的。祖细胞的具体实例包括血管内皮祖细胞(EPC)、神经祖细胞和造血祖细胞。
自我复制能力是鉴定干细胞和祖细胞的标准之一，可使用5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入DNA的试验来进行评价(Gould E & Gross CG：Neurogenesis in adult mammals：some progress and problems.The JNeuroscience 22(3)：619-623，2002)。
另外，可以根据干细胞和祖细胞表达的特征性标志物(marker)鉴定干细胞和祖细胞的类型。例如，巢蛋白在神经干细胞上的表达(Wiese，C.等人：Nestin expression-a property of multi-lineage progenitor cells？Cellular and Molecular Life Sciences，61：2510-2522，2004)，或者CD34和CD31在血管EPC上的表达(Asahara T等人：Isolation or putativeprogenitor endothelial cells for angiogenesis.Science 275：964-967，1997；Shi Q等人：Evidence for circulating bone marrow-derived endothelialcells.Blood 92(2)：362-367，1998)。
存在于成人身体中的干细胞和祖细胞可以根据它们的起源和位置分成内在细胞(即，内在干细胞和内在祖细胞)、血液来源细胞(即，血液来源干细胞和血液来源祖细胞)和骨髓来源细胞(即，骨髓来源干细胞和骨髓来源祖细胞)。
将内在细胞(resident cell)(内在干细胞和/或内在祖细胞)定义为本来存在于特定器官和/或组织中的具有自我复制能力和多潜能性的细胞，在所述器官和/或组织受到损伤的情况下，所述细胞有助于该器官和/或组织的再生。这些内在细胞的具体实例包括角膜干细胞、心脏干细胞、神经干细胞、血管EPC等。
将血液来源细胞(即，血液来源干细胞和血液来源祖细胞)定义为存在于循环血液中的具有自我复制能力和多潜能性的单个核细胞，在器官和/或组织受到损伤的情况下，所述细胞通过迁移并蓄积在所述器官和/或组织中，从而有助于该器官和/或组织的再生。在该情况下的血液包括外周血液、胎盘血液、动脉血液、静脉血液、采自心脏的血液和采自眼底的血液。血液来源单个核细胞的具体实例包括血管EPC、间充质干细胞等。
将骨髓来源细胞(即，骨髓来源干细胞和骨髓来源祖细胞)定义为本来存在于骨髓中的具有自我复制能力和多能性的细胞，在所述器官和/或组织受到损伤的情况下，所述细胞通过经由血液循环迁移并蓄积到所述器官和/或组织中，从而有助于该器官和/或组织的再生。骨髓来源细胞的具体实例包括血管EPC、间充质干细胞等。
本发明能够赋活这些内在细胞、血液来源细胞和骨髓来源细胞的每一种。
此外，干细胞和祖细胞可以分成活化状态细胞(处在该状态的细胞正在进行增殖、分化或迁移)和非活化状态细胞(处在该状态的细胞不在进行增殖、分化或迁移)。但本发明的赋活剂能够赋活活化状态和非活化状态的干细胞和祖细胞。
本发明的赋活剂赋活干细胞和/或祖细胞。这里，将“赋活”定义为下面指出的三种作用。
(1)促进干细胞和/或祖细胞增殖。
(2)促进干细胞和/或祖细胞迁移。将迁移定义为干细胞和/或祖细胞从骨髓、器官和/或组织移动到循环血液中；从循环血液蓄积到损伤的器官和/或组织中；或者在器官和/或组织内部的移动。
(3)促进干细胞和/或祖细胞分化。
本发明赋活剂的目标干细胞和/或祖细胞是应用再生医学(其中包括从患者身体外部导入细胞的再生医学和利用自身再生的再生医学)可以治疗的疾病的干细胞和/或祖细胞。
因此，本发明的赋活剂不仅可用于利用自身再生的再生医学(即，细胞原本为患者所拥有，且不于体外培养进行诱导增殖和/或分化)中使用的干细胞和/或祖细胞，而且可以用于从患者身体外部导入细胞的再生医学中使用的干细胞和/或祖细胞(即，细胞从患者身体外部导入)。本发明的赋活剂可以优选用于利用自身再生的再生医学中使用的干细胞和/或祖细胞。
对于再生医学所应用疾病(损伤的器官或损伤的组织)的原因、类型或程度没有具体限制。下面是这些疾病的具体实例。
皮肤疾病
创伤、烧伤、放射损伤、冻疮、紫外线损伤、电休克、外伤、皮肤溃疡、褥疮、接触性皮炎、大疱性皮炎、特应性皮炎、干皮病、糖尿病性皮肤溃疡、自体致敏性皮炎、红皮症、剥脱性皮炎、大疱性表皮松解症、光照性皮肤病、慢性色素性紫癜(Schamberg氏病)、口腔粘膜损伤、口炎、围口皮炎(peristomal dermatitis)、皮肤老化症状、秃顶、甲沟炎、嵌甲(unguis incarnatus)、胃肠粘膜糜烂、消化性溃疡、角膜糜烂、角膜溃疡、龋齿、牙髓炎、边缘性牙周炎、过敏性鼻炎、花粉病、春季结膜炎、痔、胃肠粘膜损伤、胃肠粘膜灼伤、支气管哮喘、舌炎、复发性口疮、口内口疮、口臭、口腔感觉异常、牙感染、口腔粘膜咬伤、舌咬伤、口腔粘膜灼伤和口腔粘膜溃疡。
脑神经疾病
中风、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、各种中枢神经系统疾病(例如，脊髓炎)、各种外周神经疾病(例如，多发性外周神经病)、脊髓病和各种类型的脑炎。
心血管疾病
心肌梗死、心绞痛、不稳定心绞痛、各种类型的心肌炎(例如，病毒性心肌炎)、急性心机能不全、慢性心机能不全、动脉粥样硬化、高血压、类风湿性心脏病、心律不齐、瓣膜性心脏病、感染性心内膜炎、心包炎、经皮冠状动脉介入和PTCA后再狭窄和再阻塞。
胃肠疾病
食管炎、急性胃炎、慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、各种类型的结肠炎(例如，溃疡性结肠炎)、肠结核、病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物诱导的肝炎、脂肪肝、肝硬变、胰腺炎和各种类型的胃肠癌(例如，肝癌、结肠癌和胃癌)的外科手术引起的器官病症。
呼吸疾病
各种类型的支气管炎(例如，细菌性支气管炎)、感染性肺炎、吸入性肺炎、肺栓塞、气胸和肺功能不全。
泌尿科疾病
膀胱炎、各种类型的肾炎(例如，慢性肾炎综合征、原发性肾小球疾病)、肾上腺炎、尿道炎、细菌和非细菌前列腺炎、高血压性肾病、糖尿病肾病和肾机能不全。
运动系统疾病
各种类型的关节炎(例如，类风湿性关节炎)、肌萎缩、神经外科颅骨切除术后的骨缺损、整形外科肿瘤切除术后的骨缺损、骨折后的骨缺损、牙科学领域牙周变性引起的骨缺损、软骨炎、各种关节的软骨缺损、各种损伤(例如，外伤或畸变)引起的腱损伤。
血管疾病
各种类型的动脉病(例如，闭塞性动脉硬化(ASO))、伯格氏病(闭塞性血栓性动脉炎(TAO))、各种类型的静脉病(例如，血栓性静脉炎)、血栓形成、循环障碍、深部静脉血栓形成(DVT)、伴随着外周循环障碍的各种类型的疾病(例如，突发性聋和振动病)和血管成形术后的再狭窄和再阻塞。
内分泌疾病
糖尿病及其并发症(例如，糖尿病性周围神经病变、糖尿病性足和糖尿病性溃疡)、高脂血症、甲状腺炎和肥胖症。
眼科疾病
各种类型的角膜炎(例如，碱性或者酸性化合物引起的角膜炎和外伤性角膜炎)，和糖尿病性视网膜炎。
除了上面列出的疾病外，用于能够通过赋活干细胞和/或祖细胞治疗疾病的再生医学(即，再生损伤器官和/或损伤组织)中的干细胞和/或祖细胞也是本发明赋活剂的使用对象。此外，对于再生医学应用疾病的进展状态没有具体限制。
此外，本发明的赋活剂能够根据再生医学应用的损伤器官和/或损伤组织的进展状态及程度、快速而适度地发挥作用。
本发明的赋活剂可以优选应用于患有皮肤疾病、运动系统疾病、内分泌疾病、呼吸疾病、泌尿科疾病、胃肠疾病、眼科疾病、脑神经疾病、心血管疾病和血管疾病的患者中存在的干细胞和/或祖细胞，且特别优选应用于患有脑神经疾病、心血管疾病、皮肤疾病和血管疾病的患者中存在的干细胞和/或祖细胞。
再者，本发明的赋活剂的副作用很小或无副作用。
此外，本发明赋活剂能够持续地发挥赋活作用。
本发明的赋活剂可为单独包含一种类凝血酶(例如巴曲酶单独)或者包含一种或多种类凝血酶，以及可为包含类凝血酶与类凝血酶以外的任何一种或多种其它活性物质的组合。
其他活性物质的实例包括生长因子，如VEGF、EGF、FGF、PGDF、NGF和HGF；细胞因子，如G-CSF、GM-CSF和EPO；及雌激素、脂类、他汀类(辅酶A还原酶抑制剂)、抗生长因子抗体、生长因子抑制剂、抗生长因子抑制剂抗体、细胞因子和抗细胞因子抗体(Takeyama K，OhtoH：PBSC mobilization.Transfus Apher Sci 31：233-243，2004；Aicher A，Zeiher AM，Dimmeler S：Mobilizing endothelial progenitor cells.Hypertension 45：321-325，2005)。
《日本药典制剂通则(Japanese Pharmacopoeia General Rules forPreparations)》中的任何剂型都能够作为本发明赋活剂的剂型。本发明赋活剂的剂型的实例包括直接用于体内的注射剂(包括混悬剂、乳剂)；软膏剂(包括油脂性软膏、乳剂型软膏(霜)、水溶性软膏等)、吸入剂、液体制剂(包括滴眼剂、滴鼻剂等)、栓剂、贴剂、糊剂、洗剂等外用剂；或片剂(包括糖衣、薄膜、胶衣)、液体制剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂(包括细粒剂)、丸剂、糖浆剂、含片等。这些制剂可按照日本药局方制剂总则等中记载的方法进行制备。
此外，本发明赋活剂还可以包括可药用的固态或液态载体或介入治疗材料。作为可药用的固态或液态载体，可列举溶剂、稳定剂、防腐剂、助溶解剂、乳化剂、悬浊剂、缓冲剂、等渗剂、着色剂、基质、增稠剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、矫味剂等。
具体实例包括水、乳糖、白糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖醇等糖·糖醇；结晶纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、羧基甲基乙基纤维素、乙酸邻苯二酸纤维素等纤维素及其相关衍生物；玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、糊精、预胶化淀粉、部分预胶化淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉钠、环糊精、支链淀粉等淀粉及其相关衍生物；琼脂、藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、胶原、虫胶、黄蓍胶、黄原胶等天然高分子(海藻类、植物粘质、蛋白质等)；聚乙烯吡咯烷酮、氨基烷基甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯醇、二甲基聚硅氧烷等合成高分子；橄榄油、可可油、巴西棕榈蜡、牛油、硬化油、大豆油、芝麻油、山茶油、石蜡、液体石蜡、黄蜂蜡、白色凡士林、椰子油、微晶蜡等油脂类；硬脂酸、硬脂酸铝、硬脂酸钙、硬脂酸镁、柠檬酸三乙酯、三乙酸甘油酯、中链脂肪酸三甘油酯、硬脂、肉豆蔻酸异丙酯等脂肪酸及其衍生物；甘油、硬脂醇、鲸蜡醇、丙二醇、聚乙二醇等醇和多元醇；氧化锌、磷酸氢钙、沉降碳酸钙、合成硅酸铝、硅酸酐、高岭土、干燥氢氧化铝凝胶、合成水滑石、氧化钛、滑石、膨润土、硅酸铝镁、硫酸铝钾、次没食子酸铋、次水杨酸铋、乳酸钙、碳酸氢钠等无机物质和金属盐化合物；蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸聚烃氧酯、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、倍半油酸脱水山梨醇酯、三油酸脱水山梨醇酯、单硬脂酸脱水山梨醇酯、单棕榈酸脱水山梨醇酯、单月桂酸脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、聚桂醇等表面活性剂；色素；香料等。
介入治疗材料的实例包括支架、人工血管、导管、球囊等。
例如，本发明赋活剂的产品可以在1ml总体积中含有下列成分和相应含量，如表1所示。
表1.巴曲酶产品的组成
  成分   含量
  巴曲酶(活性成分)   10BU
  氯丁醇(防腐剂)   3mg
  明胶水解产物(稳定剂)   0.1mg
  氯化钠(等渗剂)   9mg
  盐酸(pH调节剂)   适量
  用于注射的蒸馏水   加至1ml
  总体积   1ml
本发明赋活剂的给药剂量因患者的体重、疾病性质和状况而变化，但是在成人的情况下，例如为每日一次0.1至50巴曲酶单位(BU)的巴曲酶，优选隔日一次1至20BU巴曲酶。
本文描述的巴曲酶单位是代表巴曲酶的酶活性单位，并将在37℃的温度下，向0.3ml含有柠檬酸的标准人血浆中加入0.1ml巴曲酶溶液时，在19.0±0.2秒，使血浆凝固的活性量规定为2BU。
本发明赋活剂的给药通过用生理盐水适当稀释巴曲酶后，经由静脉点滴、静脉注射、动脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、心内注射、腹腔注射、鞘内注射、直肠给药、舌下给药、鼻腔给药、经皮给药、吸入或者局部给药到损伤的器官和/或组织。本发明赋活剂通常优选用100ml或更多生理盐水稀释后，在1小时或以上的期间内灌注。
巴曲酶在小鼠、大鼠、兔和狗的急性毒性(LD50(BU/kg))表示于下面的表2。急性毒性研究是根据文献中描述的方法(Ozaki M等人，Toxicity of the defibrase，Defibrinogen Batroxobin(First Report)，Pharmacometrics 25：339-346，1983)通过静脉内给予巴曲酶进行的。
表2巴曲酶的急性毒性(i.v.)
  动物种类   LD50值(BU/kg)
  小鼠(ddy)   192～210
  大鼠(Wistar)   105～110
  兔(NW)   ＞300
  狗(杂种)   190～208
本发明的赋活剂可以应用于具有干细胞和/或祖细胞的动物。动物的具体实例包括人、猴、狗、猪、猫、兔、大鼠和小鼠。其中，人是优选者。
虽然通过提供下面所示的实施例来详细说明本发明，但是本发明不局限于这些实施例。
                   实施例1
巴曲酶对脐带血液来源CD34阳性单个核细胞的赋活作用
在本实施例中，于体外评价了巴曲酶对脐带血液来源CD34阳性单个核细胞的赋活作用。
再者，已知脐带血液中存在的与CD34阳性单个核细胞一致的细胞由血管EPC和间充质干细胞组成(Murohara T等人：Transplanted cordblood-derived endothelial precursor cells augment postnatalneovascularization.J Clin Invest 105：1527-1536，2000)。因此，可以说本实施例中评价的人脐带血液来源CD34-阳性单个核细胞是血管EPC和间充质干细胞。
实验方法：
(1)人脐带血液单个核细胞的采集
选择足月产的正常妊娠，用肝素(20-30U/ml)作为促凝剂从脐带和胎盘收集40-60ml脐带血液。收集的脐带血与6％羟乙基淀粉(BectonDickinson，NJ，USA)以5∶1的比率混合并让其静置培养30分钟，除去沉淀的红细胞。接着，收集上层的液体并以2∶1的比率悬浮在淋巴细胞分离液(相对密度：1.077，中国医学科学院，天津，中国)中，将其在460xg条件下离心25分钟。收集中间细胞层中的单个核细胞，并在用于实验前用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次。
(2)CD34阳性单个核细胞的分离与鉴定
将上面实验方法(1)中得到的人脐带血液来源单个核细胞悬浮在PBS中制备成浓度为2×106个细胞/ml的细胞悬液。使用CD34阳性细胞单克隆免疫磁珠分离试剂盒(MACS，Milteny Biotech，BergischGladbach，德国)，根据随试剂盒提供的说明书从人脐带血液来源单个核细胞分离CD34阳性单个核细胞。使用FITC标记的抗CD34抗体(BectonDickinson，NJ，USA)，用流式细胞仪(Becton Dickinson FACS Vantage，Becton Dickinson，NJ，USA)评价所得CD34阳性单个核细胞的质量。所得CD34阳性细胞的纯度为98.5％或更高。
(3)细胞迁移试验
本试验使用由24孔培养板(Corning，NY，USA)和5μm transwell(Corning，NY，USA)组成的改良Boyden′s室(chamber)进行。改良的Boyden′s室被具有5μm(直径)孔径的聚碳酸酯膜滤器分成两个隔室。上面的隔室是滤器之上的空间，下面的隔室是滤器和孔之间的间隙。
向Boyden′s室下面的隔室加入各600μl各种浓度的、用0.25％BSAIMDM(Gibco，Los Angeles，USA)制备的巴曲酶(0(对照组)、0.1和0.2BU/ml)。接着，向每个Boyden′s室上面的隔室加入100μl细胞悬液，该细胞悬液为用IMDM培养基配制的浓度为1x105个细胞/ml的人脐带血液来源CD34阳性单个核细胞。将该系统在湿润培养箱中于37℃、5％CO2/95％空气的气体环境下静止状态培养6小时。培养后，将从上面的隔室通过滤器移动到下面隔室中的细胞定义为迁移细胞。收集迁移细胞并用流式细胞仪计算细胞数目。
根据所得到的迁移细胞的数目，以对照组的迁移细胞数目作为100％值，计算0.1BU/ml巴曲酶组及0.2BU/ml巴曲酶组的细胞迁移率。根据在相同条件下一式三份进行的两次实验中所得的数据，计算细胞迁移率的平均值±标准差(SD)(％)。
结果和讨论
当对照组(0BU/ml)中CD34阳性细胞的迁移率定义为100％时，0.1BU/ml巴曲酶组中的迁移率为149.37±6.82％，且0.2BU/ml巴曲酶组中的迁移率为254.26±17.44％。即，0.1和0.2BU/ml巴曲酶组都显示出比对照组明显高的迁移率。
那些结果表明巴曲酶显著地赋活了人脐带血液来源的CD34阳性单个核细胞(即，血管EPC和间充质干细胞)。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进血管EPC和间充质干细胞的迁移。
再者，本实施例虽然将脐带血液作为CD34阳性单个核细胞的来源，但已知CD34阳性单个核细胞也存在于成人外周血液、成人骨髓和胎儿骨髓中(Michejda M：Which stem cells should be used for transplantation？Fetal Diagn Ther 19：2-8，2004)。因此，巴曲酶也能够赋活存在于脐带血液以外的血液，以及骨髓中的CD34阳性单个核细胞。如成人外周血液、成人骨髓、胎儿骨髓及其他血液来源等。
                 实施例2
下肢深部静脉血栓形成患者的外周血液中CD34阳性细胞、CD34阳性/CD31阳性细胞和血管内皮钙粘附蛋白阳性细胞的赋活，以及巴曲酶对下肢深部静脉血栓形成患者损伤组织的功能恢复作用
在本实施例中，巴曲酶被使用于患有一种血管病-下肢深部静脉血栓形成(下肢DVT)的患者，以评价巴曲酶对外周血液中CD34阳性细胞、CD34阳性/CD31阳性细胞和血管内皮钙粘附蛋白(VE-Cadherin)阳性细胞的赋活作用，以及巴曲酶对血栓损伤血管的再生作用。
另外，已知那些在外周血液中存在的、被认为是CD34阳性单个核细胞的细胞是血管EPC和间充质干细胞(Zhao Y等人：A humanperipheral blood monocyte-derived subset acts as pleuripotent stem cells.Proc Natl Acad Sci USA 100：2426-31，2003)。因此，可以说本实施例中评价的外周血液中的CD34阳性单个核细胞是血管EPC和间充质干细胞。
此外，已知内皮祖细胞表达作为标志物的CD34(Michejda M：Whichstem cells should be used for transplantation？Fetal Diagn Ther 19：2-8，2004；Fadini GP等人：Circulating endothelial progenitor cells are reduced inperipheral vascular complications of tape 2 diabetes mellitus.J AmericanCollege of Cardiology 45：1449-1457，2005；Kuwana M等人：Humancirculating CD14+ monocytes as a source of progenitors that exhibitmesenchymal cell differentiation.J Leukoc Biol 74：833-845，2003)和CD31(Asahara T等人：Isolation of putative progenitor endothelial cells forangiogenesis.Science 275：964-967，1997；Hristov M，Weber C：Endothelialprogenitor cells：characterization，pathophysiology，and possible clinicalrelevance.J Cell Mol Med 8：498-508，2004)。还有，在血管EPC中，已知处于分化进展阶段、并能够粘附到血管状态的血管EPC也可表达血管内皮钙粘附蛋白(Hristov M，Weber C：Endothelial progenitor cells：characterization，pathophysiology，and possible clinical relevance.J CellMol Med 8：498-508，2004)。因此，可以说在本实施例中评价的外周血液中的CD34阳性/CD31阳性单个核细胞和血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞是血管EPC。
实验方法
(1)试验对象
试验对象由年龄为37到80岁(平均年龄：64岁)的11名男性和4名女性下肢DVT患者组成。在进行临床试验前，向所有试验对象解释该临床试验的目的、并得到他们的同意。
(2)给药方法
巴曲酶被连续14天静脉内点滴于患者，起始剂量为10BU/body/day(患者是早上住院的，则在住院当天给药，患者在下午住院的，则在住院的第二天给药)，之后的剂量为5BU/body/day。
(3)血液采样
使用低分子量肝素抗凝剂，于给药前(起始给药前)和给药后第7和14天，从每位患者的前臂肘正中静脉收集5ml外周血液。收集的血液立即保存在4℃并在收集后6小时内测量。在给药前和给药后第7天从所有15例下肢DVT患者收集血样，而在给药后第14天从15例下肢DVT患者中的10例收集血样。
(4)外周血液单个核细胞的分离
于上述实验方法(3)中得到的5ml血液中加入2.5ml淋巴细胞分离液(Ficoll，中国医学科学院，天津，中国)以制备悬浮液。在460xg条件下离心悬浮液后，回收中间细胞层作为外周血液来源单个核细胞。所得单个核细胞总数为每例患者约5～6×106个细胞。将所得的单个核细胞悬浮在磷酸缓冲盐水(PBS)中，制备成浓度为2×106个细胞/ml的细胞悬液。
(5)CD34阳性单个核细胞的分离
使用流式细胞仪通过免疫荧光染色分离CD34阳性单个核细胞。于上述实验方法(4)中得到的100μl单个核细胞悬液中加入20μl藻红蛋白标记的抗CD34抗体(Becton Dickinson，NJ，USA)，并使其在4℃下及黑暗条件下培养30分钟。接着，分离CD34阳性单个核细胞并通过流式细胞仪计数。根据下面的公式计算单个核细胞中CD34阳性单个核细胞的比率(％)。
CD34阳性单个核细胞(％)＝(CD34阳性单个核细胞数/单个核细胞总数)×100。
(6)CD34阳性/CD31阳性单个核细胞的分离
使用流式细胞仪，通过双重免疫荧光染色分离CD34阳性/CD31阳性单个核细胞。于上述实验方法(4)中得到的100μl单个核细胞悬液中加入20μl藻红蛋白标记的抗CD34抗体(Becton Dickinson，NJ，USA)和20μl FITC标记的抗CD31抗体(Becton Dickinson，NJ，USA)，并使其在4℃下及黑暗条件下培养30分钟。接着，分离CD34阳性/CD31阳性单个核细胞并通过流式细胞仪计数。根据下面的公式计算单个核细胞中CD34阳性/CD31阳性单个核细胞的比率(％)。
CD34阳性/CD31阳性单个核细胞(％)＝(CD34阳性/CD31阳性单个核细胞数/单个核细胞总数)×100。
(7)血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞的分离
使用流式细胞仪，通过免疫荧光染色分离血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞。于上述实验方法(4)中得到的100μl单个核细胞悬液中加入20μl FITC标记的抗VE钙粘附蛋白抗体(Becton Dickinson，NJ，USA)，并使其在4℃下及黑暗条件下培养30分钟。接着，分离VE钙粘附蛋白阳性单个核细胞并通过流式细胞仪计数。根据下面的公式计算单个核细胞中VE钙粘附蛋白阳性单个核细胞的比率(％)。
血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞(％)＝(血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞数/单个核细胞总数)×100。
(8)膝上和膝下围长的测量
下肢水肿是下肢DVT既典型又客观的症状。因此，以15例患者于给巴曲酶之前和之后测量的膝上20cm和膝下15cm处的下肢围长，评价下肢水肿的程度。
结果和讨论
(1)CD34阳性单个核细胞的赋活
表3.下肢DVT患者外周血液中CD34阳性单个核细胞
       的变化(平均值±SD，％)
  患者数   CD34阳性单个核细胞
  给药前   15   0.39±0.43
  给药后第7天   15   0.71±0.51*
  给药后第14天   10   1.10±0.66**
使用配对样品非参数检验，与给药前相比，*表示P＜0.05；及**表示P＜0.01
作为给予巴曲酶的结果，与给药前的值相比，外周血液中CD34阳性单个核细胞的百分比显著增加(表3)。
该结果表明巴曲酶赋活了下肢DVT患者外周血液的CD34阳性单个核细胞(即，血管EPC和间充质干细胞)。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进CD34阳性单个核细胞的增殖和迁移。
(2)CD34阳性/CD31阳性单个核细胞的赋活
表4.下肢DVT患者外周血液中CD34阳性/CD31阳性单个核细胞
        的变化(平均值±SD，％)
  患者数   CD34阳性/CD31阳性单个核细胞
  给药前   15   0.28±0.30
  给药后第7天   15   0.69±0.50**
  给药后第14天   10   1.07±0.66**
使用配对样品非参数检验，与给药前相比，*表示P＜0.05；及**表示P＜0.01
作为给予巴曲酶的结果，与给药前的值相比，外周血液中CD34阳性/CD31阳性单个核细胞的百分比显著增加(表4)。
该结果表明巴曲酶赋活了下肢DVT患者外周血液的CD34阳性/CD31阳性单个核细胞(即，血管EPC和间充质干细胞)。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进CD34阳性/CD31阳性单个核细胞的增殖、迁移和分化。
(3)血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞的赋活
表5.下肢DVT患者外周血液中血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞
        的变化(平均值±SD，％)
  患者数   血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞
  给药前   15   0.44±0.75
  给药后第7天   15   1.25±1.39*
  给药后第14天   10   1.61±2.60
使用配对样品非参数检验，与给药前相比*表示P＜0.05
作为给予巴曲酶的结果，与给药前的值相比，外周血液中血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞的百分比显著增加(表5)。
该结果表明巴曲酶赋活了下肢DVT患者外周血的血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞(即，血管EPC)。认为巴曲酶的赋活作用是促进血管内皮钙粘附蛋白阳性单个核细胞的增殖、迁移和分化。
(4)下肢DVT水肿症状的改善
表6.下肢DVT患者膝上和膝下围长的改变(平均值±SD，％)
  患者数   膝盖上围长   膝盖下围长
  给药前   15   55.7±6.2   38.1±4.2
  给药后第14天   15   51.8±6.0**   35.0±2.7##
**表示使用Wilcoxon氏检验，与给药前相比P＜0.01，##表示使用配对样本t检验，与给药前相比P＜0.01。
下肢水肿程度是以膝上20cm和膝下15cm处的下肢围长评价的。通过给予巴曲酶，显著缩短了膝上和膝下围长(表6)。
该结果表明通过给予巴曲酶赋活了干细胞和/或祖细胞。认为巴曲酶的赋活作用在于促进干细胞和/或祖细胞的增殖、迁移和分化，结果使损伤血管得到再生及下肢DVT患者水肿症状得到改善。
再者，当分析血浆纤维蛋白原水平作为巴曲酶药理学作用的指标时，发现在给予巴曲酶后第7和14天，纤维蛋白原水平显著降低(数据未显示)。这表明给予的巴曲酶在体内可非常好地发挥作用。
另外，尽管在给予巴曲酶之前、之后第7天和第14天分析了APTT、PT和TT参数，但在给予巴曲酶前、后之间没有显著性差异(数据未显示)。所述APTT、PT和TT参数作为给予作用于血液凝固和纤溶系统制剂(包括巴曲酶)期间监测副作用(如出血)的指标使用。这些结果表明给予巴曲酶没有发生副作用。
                    实施例3
在脑缺血/再灌注损伤模型中巴曲酶对神经干细胞和/或神经祖细胞的赋
                活及神经功能恢复的作用
在该实施例中，用大鼠脑缺血/再灌注损伤模型评价了巴曲酶对神经干细胞和/或神经祖细胞的赋活、及神经功能恢复的作用。
实验方法：
(1)动物
使用12周龄、体重250-280g的雄性Sprague-Dawley大鼠(ShanghaiAnimal Center，Chinese Academy of Medical Sciences，上海，中国)驯化1周后用于实验。
(2)建立脑缺血/再灌注损伤模型
首先按照Longa EZ等人(Longa EZ等人：Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke 20：84-91，1989)的方法建立大脑中动脉闭塞模型。更具体地，将0.36g/kg 10％水合氯醛(Shencheng Chemical Co.，Shanghai，China)腹腔内给予已经禁食12小时(但自由饮水)的大鼠以麻醉大鼠。接着，在颈部作中线切口以暴露右颈总动脉。然后，分离颈内动脉和颈外动脉，将后颈动脉(其是颈外动脉的分支)和甲状腺上动脉电凝切断，将颈外动脉在舌动脉和上颌动脉分支处结扎，在颈外动脉穿刺作一小孔，由该小孔将4-0尼龙缝合线送入颈总动脉，并逐渐插入到颈内动脉，直到有阻力为止。尼龙缝合线的长度从颈总动脉分支开始约为18～20mm。用尼龙缝合线堵塞大脑中动脉，使缺血状态维持2小时，制作大脑中动脉闭塞模型。
通过从闭塞模型的大脑中动脉中拔出尼龙缝合线并行血液再灌注建立脑缺血/再灌注损伤模型。
(3)对模型大鼠给予巴曲酶
将大鼠分成三组并分别以下述方式处理。
1)假手术组(75只大鼠)：对大鼠进行上述(2)的程序，仅分离颈内动脉和颈外动脉，不进行随后的大脑中动脉闭塞和再灌注程序。在巴曲酶组中所示的相同给药时间，对该组大鼠腹腔内给予相同体积的生理盐水代替巴曲酶。
2)模型组(75只大鼠)：这些动物已被建立脑缺血/再灌注损伤模型。在与巴曲酶组中所示的相同给药时间，对该组模型大鼠腹腔内给予相同体积的生理盐水代替巴曲酶。
3)巴曲酶组(75只大鼠)：这些动物已被建立脑缺血/再灌注损伤模型，在缺血发作后30分钟以20BU/kg/10ml的剂量腹腔内给予用生理盐水稀释的巴曲酶制剂，并进一步保持缺血1小时30分钟，然后拔去尼龙缝合线进行再灌注。另外，在建立缺血/再灌注损伤模型后的第2、4、6和8天还以20BU/kg/10ml的剂量腹腔内给予巴曲酶。
(4)神经功能评分
在缺血/再灌注损伤模型建立后，每天一次对每组15的只大鼠进行神经功能评分。使用下面的标准按照Longa EZ(Longa EZ等人-Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke 20：84-91，1989)的方法进行神经功能障碍评分。结果以中位数表示。
0：正常
1：梗塞灶对侧肢弯曲
2：当向后拉尾巴时，梗塞灶对侧肢体无力
3：当拉尾巴时，转向梗塞灶对侧
4：自发转向梗塞灶对侧
5：失去自发性动作
(5)巢蛋白阳性细胞的分析
分别在模型建立后第7、14和21天对每组的10只大鼠进行尸体解剖(每组动物总数为30只大鼠)。制备组织标本后，在显微镜下计数神经干细胞。
更具体地，在模型建立后第7、14和21天制备大鼠冷冻脑切片，并使用神经干细胞上表达的巢蛋白标志物，通过免疫组织化学染色测定脑室下区(SVZ)中巢蛋白阳性细胞的存在。使用小鼠抗大鼠巢蛋白单克隆抗体(Chemicon，Temecula，USA)分析巢蛋白阳性细胞的存在。
(6)BrdU阳性细胞和BrdU阳性/巢蛋白阳性细胞的分析
在模型建立后第5、6、12、13、19和20天，将50mg/kg 5-溴脱氧尿苷(BrdU，CalBiochem，San Diego，USA)腹腔注射到每组30只大鼠。因为BrdU是胸苷类似物，所以它可以在细胞增殖(DNA合成)期间掺入到细胞的DNA中。从而，通过检测细胞内BrdU的量可以分析细胞增殖。在模型建立后第7、14和21天对大鼠进行尸体解剖以制备冷冻脑切片。通过免疫化学染色分析BrdU阳性细胞的存在，并通过SVZ区中的双重免疫荧光染色分析BrdU阳性/巢蛋白阳性细胞的存在。
使用小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体(Oncogene，Westhaver，USA)分析BrdU阳性细胞的存在。
使用山羊抗大鼠BrdU多克隆抗体的第一抗体(Biodesign，Saco，USA)和FITC标记的兔抗山羊抗体的第二抗体(Pierce，Rockford，USA)的组合，以及小鼠抗大鼠巢蛋白单克隆抗体的第一抗体和Rho标记的兔抗小鼠抗体的第二抗体(Pierce，Rockford，USA)的组合，通过双重免疫荧光染色分析BrdU阳性/巢蛋白阳性细胞的存在。
(7)NeuN阳性细胞、GFAP阳性细胞和BrdU阳性/GFAP阳性细 胞的分析
在模型建立后第5、6、12、13、19和20天，将50mg/kg BrdU腹腔注射到每组30只大鼠。在模型建立后第7、14和21天对大鼠进行尸体解剖以制备冷冻的脑切片。通过免疫化学染色分析NeuN阳性细胞的存在，通过免疫化学染色分析神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞的存在，并通过SVZ区中双重免疫荧光染色分析BrdU阳性/GFAP阳性细胞的存在。NeuN是由神经干细胞分化的未成熟神经元表达的标志物。GFAP是也由神经干细胞分化的星形胶质细胞表达的标志物。
使用山羊抗NeuN单克隆抗体(Chemicon，Temecula，USA)分析NeuN阳性细胞的存在。使用山羊抗GFAP多克隆抗体(Sigma，St.Louis，USA)分析GFAP阳性细胞的存在。使用小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体的第一抗体和Rho标记的兔抗小鼠抗体的第二抗体的组合，以及山羊抗GFAP多克隆抗体的第一抗体和FITC标记的兔抗山羊抗体的第二抗体的组合，通过双重免疫荧光染色分析BrdU阳性/GFAP阳性细胞的存在。
(8)BrdU阳性(迁移)细胞的分析
各组的30只大鼠于模型建立后24小时内，经腹腔注射50mg/kgBrdU两次。在模型建立后第7、14和21天对大鼠进行尸体解剖以制备冷冻脑切片。使用小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体，通过免疫化学染色分析SVZ区中BrdU阳性细胞的存在。
结果和讨论
(1)神经功能的评价
缺血/再灌注损伤模型建立后每天检测评分直到第21天实验结束。
表7.神经功能评分随时间的变化(n＝15，中位数)
 第1天  第2天  第3天  第4天  第5天  第6天  第7天  第8天  第9天   第10天
  假手术组  0  0  0  0  0  0  0  0  0   0
  模型组  3  3  3  2  2  2  2  2  1   1
  巴曲酶组  3  3  2  2  1  1  1*  0*  0*   0
  第11天   第12天   第13天   第14天   第15天   第16天   第17天   第18天   第19天   第20天   第21天
  假手术组   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0
  模型组   1   1   1   1   1   1   1   1   1   1   1**
  巴曲酶组   0   0   0   0   0   0*   0   0   0   0   0**
使用Kruskal-Wallis检验，*表示与模型组相比P＜0.05，**表示与每组第一天相比P＜0.05。
在假手术组，没有观察到神经功能障碍。在其它两组中，与手术后第1天相比，在第21天观察到神经功能的明显恢复(P＜0.05)。
在巴曲酶组，观察到神经功能的恢复早于模型组。与模型组相比，在巴曲酶组中尤其在手术后第7、8、9和16天，观察到神经功能的显著恢复。
该结果表明，巴曲酶赋活神经干细胞和/或神经祖细胞，结果有助于神经功能障碍的改善。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进神经干细胞和/或神经祖细胞的增殖、迁移和分化。
(2)神经干细胞存在的证明
表8.SVZ区中巢蛋白阳性细胞的数目(平均值±SD，细胞数/mm2)
  第7天   第14天   第21天
  假手术组   42.1±5.86   12.3±1.58   1.97±0.82
  模型组   209.5±21.6**   76.5±12.3**   45.1±5.60**
  巴曲酶组   276.3±28.5***   97.2±13.7   59.2±6.84
使用Wilcoxon氏检验，**表示与假手术组相比P＜0.01，***表示在相同天与模型组相比P＜0.05。
根据表8中显示的数据，以模型组的值为100％，使用下面的公式计算巴曲酶组的巢蛋白阳性细胞数目的相对值(％)
BRt(％)＝(Bt-St)/(Mt-St)x100
BRt(％)：在时间t时巴曲酶组的巢蛋白阳性细胞的百分数；
Bt：在时间t时巴曲酶组的巢蛋白阳性细胞的平均数；
St：在时间t时假手术组的巢蛋白阳性细胞的平均数；
Mt：在时间t时模型组的巢蛋白阳性细胞的平均数；
t：第7天、第14天或第21天。
结果如图1所示。与假手术组相比，模型组的巢蛋白阳性细胞数目增加(巢蛋白是神经干细胞的标志物)(表8)。认为这归因于脑缺血/再灌注损伤的刺激在动物所诱导的代偿反应。
另一方面，在模型建立后第7、14和21天，与模型组相比，巴曲酶组的巢蛋白阳性细胞数目增加(表8，图1)。
这些结果表明巴曲酶赋活了巢蛋白阳性细胞(即，神经干细胞)。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进神经干细胞的增殖和迁移。
此外，尽管从模型建立第9天以后再没有给予巴曲酶，但在模型建立后第21天，与模型组相比，巴曲酶组的巢蛋白阳性细胞数显著增加(图1)。该结果表明巴曲酶对神经干细胞具有持续的赋活作用。
(3)增殖神经干细胞的存在和其自我复制能力的证明
1)增殖神经干细胞的存在的证明
在巴曲酶组中，通过双重免疫荧光染色证实在SVZ区中存在增殖的巢蛋白阳性/BrdU阳性细胞(即，神经干细胞)(数据未显示)。这表明在巴曲酶组中存在增殖神经干细胞。
2)神经干细胞自我复制能力的证明
表9.SVZ区中BrdU阳性细胞的数目(平均值SD，细胞数/mm2)
  第7天   第14天   第21天
  假手术组   51.7±3.76   32.8±2.82   21.9±1.87
  模型组   136.45±9.82**   327.6±12.4**   277.2±12.5**
  巴曲酶组   157.71±11.3   448.2±27.7***   358.2±18.6***
使用Wilcoxon氏检验，**表示与假手术组相比P＜0.01，***表示在相同天与模型组相比P＜0.01。
根据表9中显示的数据，以模型组的值为100％，使用下面的公式计算巴曲酶组的BrdU阳性细胞数目的相对值(％)
BRt(％)＝(Bt-St)/(Mt-St)x100
BRt(％)：时间t时巴曲酶组中BrdU阳性细胞的百分数；
Bt：在时间t时巴曲酶组的BrdU阳性细胞的平均数；
St：在时间t时假手术组的BrdU阳性细胞的平均数；
Mt：在时间t时模型组的BrdU阳性细胞的平均数；
t：第7天、第14天或第21天。
结果如图2所示。与假手术组相比，模型组的BrdU阳性细胞数目增加(BrdU是增殖细胞的标志物)(表9)。认为这归因于脑缺血/再灌注损伤的刺激在动物所诱导的代偿反应。
另一方面，在模型建立后第7、14和21天，与模型组相比，巴曲酶组的BrdU阳性细胞数目增加(表9，图2)。
因为脑组织中存在的BrdU阳性细胞只由具有自我复制能力可掺入BrdU的神经干细胞和神经祖细胞组成。所以，这些结果表明巴曲酶赋活了神经干细胞和/或神经祖细胞。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进神经干细胞和/或神经祖细胞的增殖和迁移。
此外，尽管从模型建立第9天以后再没有给予巴曲酶，但在模型建立后第21天，与模型组相比，巴曲酶组的BrdU阳性细胞数显著增加(图2)。该结果表明巴曲酶对神经干细胞和/或神经祖细胞具有持续的赋活作用。
(4)未成熟神经元和从神经干细胞分化的星形胶质细胞的存在以 及星形胶质细胞增加的证明
1)未成熟神经元存在的证明
证实在巴曲酶组中存在NeuN阳性细胞(数据未显示)。NeuN是从神经干细胞分化的未成熟神经元表达的标志物。因此，该结果表明在巴曲酶组中存在从神经干细胞分化的未成熟神经元。
2)从神经干细胞分化的星形胶质细胞存在的证明
使用双重免疫荧光染色证实在巴曲酶组的SVZ区中存在BrdU阳性/GFAP阳性细胞(数据未显示)。GFAP是在从神经干细胞分化的星形胶质细胞表达的标志物。因此，该结果表明在巴曲酶组中存在从神经干细胞分化的星形胶质细胞。然而，星形胶质细胞是神经组织中已分化的细胞，为什么BrdU掺入它们之中？认为检测到的BrdU是在分化成星形胶质细胞之前的干细胞和/或祖细胞状态时，就掺入到细胞中，并且持续存在的BrdU。
3)增加的星形胶质细胞存在的证明
表10.SVZ区中GFAP阳性细胞数目(平均值±SD，细胞数/mm2)
  第7天   第14天   第21天
  假手术组   2.2±0.18   1.3±0   0
  模型组   66.4±21.8**   57.6±16.4**   27.7±12.5**
  巴曲酶组   87.1±26.4***   68.2±17.7   34.9±16.8
使用Wilcoxon氏检验，**表示与假手术组相比P＜0.01，***表示在相同天与模型组相比P＜0.05。
根据表10中显示的数据，以模型组的值为100％，使用下面的公式计算巴曲酶组的GFAP阳性细胞数目的相对值(％)
BRt(％)＝(Bt-St)/(Mt-St)x100
BRt(％)：在时间t时巴曲酶组中GFAP阳性细胞的百分数；
Bt：在时间t时巴曲酶组的GFAP阳性细胞的平均数；
St：在时间t时假手术组的GFAP阳性细胞的平均数；
Mt：在时间t时模型组的GFAP阳性细胞的平均数；
t：第7天、第14天或第21天。
结果如图3所示。与假手术组相比，模型组的GFAP阳性细胞数目增加(GFAP是从神经干细胞分化的星形胶质细胞的标志物)(表10)。认为这归因于脑缺血/再灌注损伤的刺激在动物所诱导的代偿反应。
另一方面，在模型建立后第7、14和21天，与模型组相比，巴曲酶组的GFAP阳性细胞数目增加(表10，图3)。
这些结果表明巴曲酶赋活了GFAP阳性细胞(即，神经干细胞和/或神经祖细胞)。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进神经干细胞和/或神经祖细胞的增殖、分化和迁移，尤其在于促进上述细胞分化成星形胶质细胞。
此外，尽管从模型建立第9天以后再没有给予巴曲酶，但在模型建立后第21天，与模型组相比，巴曲酶组的GFAP阳性细胞数增加(图3)。该结果表明巴曲酶对神经干细胞和/或神经祖细胞分化成星形胶质细胞具有持续的赋活作用。
(5)迁移细胞存在的证明
表11.SVZ区中BrdU阳性细胞的数目(平均值±SD，细胞数/mm2)
  第7天   第14天   第21天
  假手术组   2.25±1.08   3.75±1.33   3.14±1.09
  模型组   122.3±14.2**   78.5±8.3**   33.6±5.37**
  巴曲酶组   136.7±15.3   102.7±11.2***   55.5±8.23
使用Wilcoxon氏检验，**表示与假手术组相比P＜0.01，***表示在相同天与模型组相比P＜0.05。
根据表11中的数据，以模型组的值为100％，使用下面的公式计算巴曲酶组的BrdU阳性细胞数目的相对值(％)
BRt(％)＝(Bt-St)/(Mt-St)x100
BRt(％)：在时间t时巴曲酶组的BrdU阳性细胞的百分数；
Bt：在时间t时巴曲酶组的BrdU阳性细胞的平均数；
St：在时间t时假手术组的BrdU阳性细胞的平均数；
Mt：在时间t时模型组的BrdU阳性细胞的平均数；
t：第7天、第14天或第21天。
结果如图4所示。在该实验中，于模型建立后24小时内，只腹腔内给予BrdU两次，且因在该时间以后再没有给予BrdU，所以模型建立后第7、14和21天分析的BrdU阳性细胞是在BrdU给药的时间存在的BrdU阳性细胞。因此，在模型建立后第7、14和21天分析的SVZ区中的BrdU阳性细胞数目的增加反映了已经迁移到SVZ区中的BrdU阳性细胞的数目。此外，SVZ区中的BrdU阳性细胞仅由具有自我复制能力能够掺入BrdU的神经干细胞和神经祖细胞组成。基于上述的内容，表11和图4表明神经干细胞和神经祖细胞在SVZ区内的迁移状态。
与假手术组相比，模型组的BrdU阳性细胞数目增加(表11)。认为这归因于脑缺血/再灌注损伤的刺激在动物所诱导的代偿反应。
另一方面，在模型建立后第7、14和21天，与模型组相比，巴曲酶组的BrdU阳性细胞数目增加(表11，图4)。这表明巴曲酶组迁移到SVZ区的神经干细胞和/或神经祖细胞的数目大于模型组。
这些结果表明巴曲酶赋活了神经干细胞和/或神经祖细胞。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进神经干细胞和/或神经祖细胞的迁移。
此外，尽管从模型建立第9天以后再没有给予巴曲酶，但在模型确立后第21天，与模型组相比，巴曲酶组的BrdU阳性细胞数增加(图4)。该结果表明巴曲酶对神经干细胞和/或神经祖细胞的迁移具有持续的赋活作用。
此外，通过免疫化学染色比较了模型组和巴曲酶组之间SVZ区中BrdU阳性细胞的分布。在模型组中，BrdU阳性细胞仅分布在SVZ区的表面(图5的左侧)，但在巴曲酶组中，BrdU阳性细胞广泛分布于SVZ区的表面到其内部(图5的右侧)。这表明由于给予巴曲酶，神经干细胞和/或神经祖细胞从SVZ区的表面迁移到内部，即，巴曲酶促进了脑组织中神经干细胞和/或神经祖细胞的原位迁移。
实施例3中的这些结果清楚地表明巴曲酶对神经干细胞和/或神经祖细胞具有持续的赋活作用。认为巴曲酶的赋活作用是在于促进神经干细胞和/或神经祖细胞的增殖、迁移和分化。
工业适用性
如上述实施例中所示，本发明赋活剂能够赋活干细胞和/或祖细胞。因此，本发明可以有利地用于再生医学、特别是利用自身再生的再生医学中。
由于使用本发明赋活剂进行的、利用自身再生的再生医学是使用患者身体内存在的干细胞和/或祖细胞，所以不需要从患者的身体外部导入细胞。因此，对患者的负担较轻并且诸如细胞移植期间的感染的危险也不存在，结果使利用自身再生的再生医学优于从患者身体外部导入细胞的再生医学。
此外，在使用本发明赋活剂进行的利用自身再生的再生医学中，干细胞和/或祖细胞的赋活特异地发生于患者的患病部位(即损伤的器官和/或组织)中，并且该再生仅取决于所要求的程度而发生。因此，利用自身再生的再生医学不会发生由患者身体外部导入细胞那样的、传统的再生医学主流方法的细胞移植的过度再生和/或过度修复而引起发生并发症的危险。
再者，包含类凝血酶的本发明赋活剂具有很小的副作用或者无副作用，能够根据再生医学应用的损伤器官和/或损伤组织的进展状态及程度、快速而适度地发挥作用，并且具有持续的赋活作用。因此，可以有利地用于再生医学。
所以，本发明能够用于再生医学、特别是利用自身再生的再生医学中，具有高度的工业适用性。

Claims (28)

1.一种包含类凝血酶的干细胞和/或祖细胞的赋活剂。
2.根据权利要求1的赋活剂，其中所述类凝血酶选自巴曲酶、安克洛酶和克洛他酶。
3.根据权利要求2的赋活剂，其中所述类凝血酶是巴曲酶。
4.根据权利要求1的赋活剂，其还包含一种或多种类凝血酶以外的活性物质。
5.根据权利要求4的赋活剂，其中所述类凝血酶以外的活性物质选自生长因子、细胞因子、雌激素、脂类、他汀类、抗生长因子抗体、生长因子抑制剂、抗生长因子抑制剂抗体和抗细胞因子抗体。
6.根据权利要求1至5任一项的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是应用于再生医学中的细胞。
7.根据权利要求6的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是应用于利用自身再生的再生医学中的细胞。
8.根据权利要求6或7的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是应用于再生医学中的细胞，且该再生医学是用于选自皮肤疾病、脑神经疾病、心血管疾病、胃肠疾病、呼吸疾病、泌尿疾病、运动系统疾病、血管疾病、内分泌疾病和眼科疾病中的疾病。
9.根据权利要求8的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是应用于再生医学中的细胞，且该再生医学是用于选自脑神经疾病、心血管疾病、皮肤疾病和血管疾病中的疾病。
10.根据权利要求1至9任一项的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是选自内在细胞、骨髓来源细胞和血液来源细胞中的细胞。
11.根据权利要求1至10任一项的赋活剂，其中所述赋活作用是选自干细胞和/或祖细胞的增殖促进、迁移促进和分化促进中的的作用。
12.根据权利要求1至11任一项的赋活剂，该赋活剂能够根据再生医学应用的损伤器官和/或组织的进展状态及程度、快速而适度地发挥作用。
13.根据权利要求12的赋活剂，该赋活剂具有持续的赋活作用。
14.根据权利要求12或13的赋活剂，该赋活剂具有很小的副作用或者无副作用。
15.根据权利要求1的赋活剂，该赋活剂促进血管内皮祖细胞和/或间充质干细胞的迁移。
16.根据权利要求1的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是应用于下肢深部静脉血栓形成的再生医学的细胞。
17.根据权利要求16的赋活剂，该赋活剂促进血管内皮祖细胞和/或间充质干细胞的增殖和/或迁移。
18.根据权利要求1的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是应用于缺血性脑血管疾病的再生医学的细胞。
19.根据权利要求18的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是应用于脑缺血/再灌注损伤的再生医学的细胞。
20.根据权利要求19的赋活剂，其中所述干细胞和/或祖细胞是神经干细胞和/或神经祖细胞。
21.根据权利要求20的赋活剂，该赋活剂促进神经干细胞和/或神经祖细胞的增殖和/或迁移和/或分化。
22.一种赋活动物干细胞和/或祖细胞的方法，该方法是包含给予该动物所需要有效治疗剂量的类凝血酶。
23.根据权利要求22的方法，其中所述动物是人。
24.根据权利要求22的方法，其中所述类凝血酶是巴曲酶。
25.类凝血酶用于赋活干细胞和/或祖细胞的用途。
26.根据权利要求25的用途，其中所述类凝血酶是巴曲酶。
27.类凝血酶用于制造干细胞和/或祖细胞赋活剂的用途。
28.根据权利要求27的用途，其中所述类凝血酶是巴曲酶。
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