JP5602364B2

JP5602364B2 - 幹細胞及び／又は前駆細胞の賦活剤

Info

Publication number: JP5602364B2
Application number: JP2008516658A
Authority: JP
Inventors: 博文千賀; 忠朝韓; 定芳蔡; 力栗
Original assignee: 東菱薬品工業株式会社
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-10-02
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2026-10-02
Also published as: CA2623950C; HK1114641A1; AU2006295607B2; KR101777414B1; EP1929006A1; EA014296B1; AU2006295607A1; CN101278045B; CA2623950A1; US20100034803A1; WO2007037561A9; EA200800722A1; CN101278045A; JP2009509914A; EP1929006B1; WO2007037561A1; KR20080036594A

Description

発明の詳細な説明

技術分野
本発明は、トロンビン様酵素を含んでなる幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活剤、有効量のトロンビン様酵素を動物に投与することを含んでなる動物における幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活化方法、及び、幹細胞及び/又は前駆細胞を賦活化するためのトロンビン様酵素の使用に関する。

背景技術
ヒトに生じる疾病は、器質的な疾病と機能的な疾病とに大別される。従来の医療では、機能的な疾病に対しては内科療法が主に利用され、器質的な疾病に対しては外科療法及び内科療法が利用されている。しかしながら、内科療法はその多くが対症的なものであるため、疾病が根治的に治ることが少ない。また、外科療法は傷害臓器の一部分或いは全部を摘出するため、臓器の機能が部分的に或いは完全に喪失する侵襲的な治療方法である。一方、外科療法に対する代替療法として臓器移植及び人工臓器を利用した治療法も行われている。しかしながら、臓器移植には拒絶反応を抑制するために用いる免疫抑制剤による副作用等の技術的課題や、深刻なドナー不足及び医療費高騰等の社会的問題が存在する。また、人工臓器を利用した治療についても、生体機能不代替性及び生体適合性等の技術的課題や、医療費高騰等の社会的問題が存在する。

これらの問題を解決する新しい治療法として、再生医療が注目されている。再生医療は、病気や事故により機能障害や機能不全に陥った組織及び臓器の再生（機能回復）を、細胞を積極的に利用して行う医療である。再生医療は、細胞の利用態様に基づいて下記の３つの方法に大別される。
（１）ドナーから胚性幹細胞、臍帯血由来単核細胞、血液由来単核細胞或いは骨髄由来単核細胞を採取し、インビトロ培養で細胞の増殖及び／又は分化を誘導し、選択された未分化細胞（幹細胞及び／又は前駆細胞）及び／又は分化細胞を移植により患者の体内へ導入する方法。
（２）患者本人から体性幹細胞、血液由来単核細胞或いは骨髄由来単核細胞を採取し、インビトロ培養で細胞の増殖及び／又は分化を誘導し、選択された未分化細胞（幹細胞及び／又は前駆細胞）及び／又は分化細胞を移植により当該患者の体内へ導入する方法。
（３）患者の体外で幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖及び／又は分化の誘導を行うことなしに、患者の生体を刺激（例えば、薬剤投与、身体の運動或いは理学療法等による刺激）して、患者の障害臓器又は組織に存在する幹細胞及び／又は前駆細胞（内在性（resident）の幹細胞及び／又は前駆細胞という）、及び／又は、患者の血液由来或いは骨髄由来の幹細胞及び／又は前駆細胞を賦活化する方法。以下、この方法を「自発的再生」（selfregeneration）という。

現在の再生医療の主流は、患者の体外から細胞を移植により導入する方法（すなわち、前述の（１）及び（２）の方法）である。
分化細胞を患者の体外から導入する方法は、単一種類又は非常に限られた種類の細胞から構築される組織又は臓器（例えば、皮膚、骨、軟骨、角膜及び筋肉組織）を対象とする皮膚科、眼科及び整形外科分野において用いられている。しかしながら、多種類の細胞から構築される実質臓器（例えば心臓、肝臓、肺、腎臓及び脳等）に対しては、当該多種類の分化細胞の挙動を適切に制御する技術が十分に確立されておらず、実用化には至っていない。

一方、未分化細胞を患者の体外から導入する方法としては、以下のものが知られている。
（１）重症虚血性疾患及び循環器系疾患に対して、患者の体外から幹細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を導入して血管新生を促進し、新しい血管を形成させる血管新生療法（Weissman IL: Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: Barriers and opportunities. Science 287:1442-1446,2000）。
（２）患者の体外からの胚性幹細胞（ES細胞）の導入を利用した血管形成法（McCloskey KE et al.: Use of embryonic stem cell-derived endothelial cells as a cell source to generate vessel structures in vitro. Tissue Eng 11:497-505,2005）。この方法は、ES細胞の培養法、分化誘導法及び分化細胞の取得方法等が十分に確立されていないため、実用化には至っていない。
（３）患者自身の骨髄から分離した骨髄由来単核細胞を利用し、これを患部へ直接導入して新生血管を形成させる自己骨髄細胞移植法（Sato Y et al.: Can a bone marrow cell contribute to organ regeneration? In vivo analysis using transgenic rats with reporter genes. Transplantation Proceedings 37:273-275,2005）。この方法には、得られる幹細胞数が少ないこと、及び、患者に全身麻酔を施して大量の骨髄を採取する必要があるため患者への身体的負担及び危険が生じるという問題がある。更に、移植した細胞の分化の制御が著しく困難であるという問題もある。

また、患者の体外から幹細胞及び／又は前駆細胞を導入する方法を用いた再生医療に共通する問題として、移植細胞の過剰再生及び／又は過剰修復に起因する合併症発症の危険性がある。

これに対し、「自発的再生」を利用する方法は、患者自身の体内に元々存在している幹細胞及び／又は前駆細胞（すなわち、内在性の幹細胞及び／又は前駆細胞、及び／又は、患者の血液由来或いは骨髄由来の幹細胞及び／又は前駆細胞）を「賦活化」することにより、傷害臓器及び／又は傷害組織を再生してその機能回復を図るものである。

内在性の幹細胞及び／又は前駆細胞は、再生能力を有する肝臓に存在することが従来知られていたが、これら再生能力を有する細胞は、近年では神経系（特に脳等の中枢神経系）、皮膚、脂肪組織、網膜、角膜、骨格筋等のみならず、心臓さえにも存在することが報告されている（Garry DJ et al.: Ponce de leon's fountain: stem cells and the regenerating heart. Am J Med Sci 329(4):190-201,2005）。現在では、内在性の幹細胞及び／又は前駆細胞は、全ての器官及び組織に存在すると考えられている（Weissman IL: Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: Barriers and opportunities. Science 287:1442-1446,2000及びGarry DJ et al.: Ponce de leon's fountain: stem cells and the regenerating heart. Am J Med Sci 329(4):190-201,2005）。

内在性の幹細胞及び／又は前駆細胞、及び／又は、血液由来或いは骨髄由来の幹細胞及び／又は前駆細胞が、当該細胞が存在する異なる誘導微小環境（異なるタイプの接触細胞、誘導微小環境条件に含まれる細胞外基質、サイトカイン及び成長因子の内容等）に依存して種々のタイプの組織細胞へと分化できることは、下記の文献等により知られている。
（１）神経幹細胞を、神経栄養因子・成長因子の存在下で培養すると、neurosphereとよばれる単一細胞由来のコロニーを形成し（すなわち、自己複製能）、更にneurosphereは、異なる誘導微小環境条件に基づいて神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトへ分化する（すなわち、多分化能）こと。また、neurosphere由来の細胞をインビトロで継代培養すると、単一のneurosphere由来細胞から別のneurosphereが形成すること（Reynolds BA and Weiss S: Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 255:1707-1710,1992）。
（２）成体ラット脊髄から得られた神経幹細胞を他の成体ラットの脊髄に移植するとグリア細胞のみに分化するが、海馬歯状回に移植すると神経細胞へ分化すること（Shihabuddin LS et al.: Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus. The J Neuroscience 20:8727-8735,2000）。
（３）神経幹細胞を血管内皮細胞と共に培養すると、神経幹細胞の増殖及び神経細胞への分化が促進されること（Shen Q et al.: Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science 304:1338-1440,2004）。

また、自発的再生を利用した再生医療を目的とする、内在性の幹細胞及び／又は前駆細胞、及び／又は、血液由来或いは骨髄由来の幹細胞及び／又は前駆細胞の増加を促進する方法としては、以下の方法が知られている。
（１）EGFを脳虚血モデル動物へ投与すると、神経幹細胞の増殖が促進されて、梗塞領域において失われた細胞の約２０％が再生すること（Teramoto T et al.: EGF amplifies the replacement of parvalbumin-expressing striatal interneurons after ischemia. The J Clinical Investigation 111:1125-1132,2003）。
（２）高脂血症治療剤であるスタチン(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitor)を動脈硬化患者へ投与すると、骨髄由来の血管血液幹細胞（hemangiolbast）又は内皮前駆細胞が血中で増加すること（Walter DH et al.: Statin therapy accelerates reendothelialization: A novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Circulation 105:3017-3024,2002）。
（３）上記のEGF以外の多数の成長因子（VEGF, FGF（b-FGF）, PDGF, NGF、HGF等）又はサイトカイン（G-CSF, GM-CSF、エリスロポエチン（EPO））、他の生理活性物質（エストロゲン、脂質）等が、幹細胞及び／又は前駆細胞の増加に有用であること（Takeyama K, Ohto H: PBSC mobilization. Transfus Apher Sci 31:233-243,2004及びAicher A, Zeiher AM, Dimmeler S: Mobilizing endothelial progenitor cells. Hypertension 45:321-325,2005）。しかしながら、上記の物質のうち薬剤として開発できたのはわずか二、三種類の物質（例えば：G-CSFとb-FGF）に止まっている。また、G-CSFについては癌促進作用が危惧されており、b-FGFについては静注時の血管閉塞等の副作用が懸念されている。また、多種類の細胞を標的とする成長因子に起因する副作用の多様性を鑑み、標的細胞の種類が少ない成長因子として開発されたVEGFやb-FGFでは、臨床試験で十分な治療効果が得られていない。更に、EPOには血圧上昇等の副作用がある。

また、急性脳梗塞等の治療剤として知られているバトロキソビン（Batroxobin）が、ラット局所脳虚血の虚血組織におけるCD34の発現に対して影響するという報告が下記の中国語インターネットホームページ
著者名：蔡振利
表題：ラット局所脳虚血／再灌流モデルにおけるCD34の発現及びバトロキソビンのその発現に対する影響
関連箇所：中国学位論文文摘数据(CDDB)、インデックス番号：Y653774
媒体のタイプ： online
掲載者：万方数据（WANFANG DATA）
検索日：2005年7月28日
アドレス： URL：http://www.wanfangdata.com.cn/
に掲載されている。この報告では、血液を有しない血管を含む脳組織標本（標本採集前に心臓灌流を行って、脳組織中の血液を除去した組織標本）中の細胞表面抗原CD34の発現を測定している。ここで、CD34は、骨髄中に存在する血管血液幹細胞（hemangioblast）、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞や、血液中に存在する血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞（いずれも、未分化細胞）だけではなく、血管壁を構成する成熟血管内皮細胞（分化細胞）においても発現する（大沢ら編集：免疫学辞典（第２版）、ｐ327、東京化学同人、2001年12月3日発行）。よって、骨髄や血液を検体とした場合は未分化細胞（幹細胞及び前駆細胞）がCD34陽性細胞となるが、血液を有しない血管を含む脳組織標本を検体とした場合は、CD34陽性細胞が分化細胞のみとなる。したがって、この報告では、幹細胞及び／又は前駆細胞に対するバトロキソビンの作用についてはなんら評価をしていない。

一方では、副作用の少ない又は副作用のない、かつ、再生医療の適用となる傷害臓器及び／又は傷害組織の進行段階や損傷の程度に応じて、迅速かつ必要程度に作用することができる、自発的再生を利用する方法に基づく再生医療に使用可能な物質が臨床上で求められている（Kinnaird T et al.: Bone marrow-derived cells for enhancing collateral development: mechanism，animal data, and initial clinical experiences. Cir Res 95(4):354-363,2004）。

発明の開示
したがって、本発明は、再生医療、特に自発的再生を利用する再生医療に使用することができる、幹細胞及び／又は前駆細胞の賦活剤を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明者らは、トロンビン様酵素の一種であるバトロキソビンと幹細胞及び前駆細胞の賦活化との関係について鋭意研究を行ったところ、バトロキソビンが当該細胞を賦活化して、傷害を受けた臓器及び組織を再生できることを見出した。本発明は、この知見に基づいてなされたものである。

すなわち、本発明は、トロンビン様酵素を含んでなる幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活剤、有効量のトロンビン様酵素を動物に投与することを含んでなる動物における幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活化方法、及び、幹細胞及び/又は前駆細胞を賦活化するためのトロンビン様酵素の使用に関する。

発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活剤はトロンビン様酵素を有効成分として含んでなることを特徴とする。

トロンビン様酵素の具体例には、バトロキソビン、アンクロッド（Ancrod）、クロタラーゼ(Crotalase)などが含まれる（Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p130-131;1990）。バトロキソビンは、トロンビン様酵素の最も代表的な酵素であり、特に好ましい。

バトロキソビンは、Bothrops atrox moojeniの毒液に由来するトロンビン様セリンプロテアーゼである。バトロキソビンは、フィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡ(fibrinopeptide A)のみを遊離し、des A フィブリン(フィブリンＩともいう)を生成する（Aronson DL: Comparison of the actions of thrombin and the thrombin-like venom enzymes Ancrod and Batroxobin. Thrombos Haemostas (stuttg) 36:9-13,1976）。また、バトロキソビンの一次構造は既に決定されており、バトロキソビンは２３１個のアミノ酸からなる分子量が約３６，０００Ｄａの単鎖の糖タンパクである。（Itoh N et al: Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for batroxobin, a thrombin-like snake venom enzyme. J Biol Chem 262:3132-3135,1987）。

バトロキソビンはトロンビンと同様にセリンプロテアーゼである。しかしながら、バトロキソビンは、フィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡのみを遊離してdes A フィブリンを生成するのに対し、トロンビンはフィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡ及びフィブリノペプチドＢを遊離して、フィブリンを生成する点でトロンビンとは相違する。また、バトロキソビンはフィブリノーゲン以外の血液凝固因子に作用しないが、トロンビンは他の血液凝固因子に作用する点でも相違する。

バトロキソビンは、それ自体公知物質であり、日本特許出願公告第５７−１０７１８号公報（日本特許第１１１８１２９号）に記載の方法に従い調製可能である。又は東菱薬品工業株式会社（東京、日本）及びその子会社であるBeijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. （北京、中国）より容易に入手可能である。

アンクロッドはAgkistrodon rhodostomaの毒液に由来するトロンビン様セリンプロテアーゼであり、分子量が約３５，４００Ｄａの糖タンパクである。アンクロッドはバトロキソビンと同様にフィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡのみを遊離し、des A フィブリンを生成する（Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p134-135;1990）。

また、クロタラーゼ（Crotalase）はCrotalus adamanteusの毒液に由来するトロンビン様セリンプロテアーゼであり、分子量が約３２，７００Ｄａの糖タンパクである。クロタラーゼはバトロキソビンと同様にフィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡのみを遊離し、des A フィブリンを生成する（Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p140-141;1990）。

これらのバトロキソビン、アンクロッド及びクロタラーゼなどのトロンビン様酵素は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え製品であってもよい。

本発明が対象とする幹細胞及び前駆細胞について、当該技術分野では両者の定義が完全に標準化されていないが、コンセンサスが得られている考え（Weissman IL: Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: Barriers and opportunities. Science 287:1442-1446,2000、及び、McKay R: Stem cellshype and hope. Nature 406:361-364,2000）に基づき、本明細書では以下の通りに定義する。

幹細胞とは、自己複製能及び多分化能を有する未分化細胞をいう。具体例としては、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell：EG細胞）、体性幹細胞（adult stem cells）、血管血液幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞や、種々の細胞（骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、神経細胞、腱細胞、脂肪細胞、膵細胞、肝細胞、腎細胞等）の幹細胞が挙げられる。

前駆細胞とは、自己複製能及び分化能を有するが、最終的に分化する細胞の種類が既に決定している未分化細胞をいう。具体例としては、血管内皮前駆細胞（vascular endothelial progenitor cells, vascular EPCs）、神経前駆細胞や造血前駆細胞が挙げられる。

幹細胞及び前駆細胞を識別する基準の一つである自己複製能は、5-bromodeoxyuridine（BrdU）のDNA中への取り込み試験（Gould E & Gross CG: Neurogenesis in adult mammals: some progress and problems. The J Neuroscience 22(3): 619-623,2002）を用いて評価することができる。

また、幹細胞及び前駆細胞における種類の識別は、各種幹細胞及び前駆細胞に固有のマーカー発現（例えば、神経幹細胞に対するネスチン（Nestin）の発現（Wiese，C. et al. Nestin expression―a property of multi-lineage progenitor cells? Cellular and Molecular Life Sciences, 61:2510-2522,2004）、血管内皮前駆細胞に対するCD34及びCD31の発現（Asahara T et al.: Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964-967,1997、及び、Shi Q et al.: Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 92(2):362-367,1998））に基づいて行うことができる。

成体内に存在する幹細胞及び前駆細胞は、その由来及び存在部位に基づいて、内在性細胞（すなわち、内在性幹細胞及び内在性前駆細胞）、血液由来細胞（すなわち、血液由来幹細胞及び血液由来前駆細胞）並びに骨髄由来細胞（すなわち、骨髄由来幹細胞及び骨髄由来前駆細胞）に分けることができる。

内在性細胞（すなわち、内在性幹細胞及び/又は内在性前駆細胞）とは、特定の臓器及び／又は組織に元々存在し、当該臓器及び／又は組織が傷害を受けた場合にその再生に貢献する自己複製能及び多分化能を有する細胞をいう。具体例としては、角膜幹細胞、心筋幹細胞、神経幹細胞及び血管内皮前駆細胞などが挙げられる。

血液由来細胞（すなわち、血液由来幹細胞及び血液由来前駆細胞）とは、循環血液中に存在するが、臓器及び／又は組織が傷害を受けた場合に当該傷害臓器及び/又は傷害組織へ遊走して集積し、その再生に貢献する自己複製能及び多分化能を有する単核細胞をいう。この場合の血液には、末梢血、臍帯血、動脈血、静脈血、心臓採血の血液や眼底採血の血液等が含まれる。具体例としては、血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞などが挙げられる。

骨髄由来細胞（すなわち、骨髄由来幹細胞及び骨髄由来前駆細胞）とは、元々は骨髄に存在しているが、臓器及び／又は組織が傷害を受けた場合に血液循環を経由して遊走し、当該傷害臓器及び/又は傷害組織へ集積して、その再生に貢献する自己複製能及び多分化能を有する細胞をいう。具体例としては血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞などが挙げられる。

本発明は、これらの内在性細胞、血液由来細胞及び骨髄由来細胞の何れをも賦活化することができる。

また、幹細胞及び前駆細胞は、活性化状態（細胞が増殖、分化又は遊走する状態）の細胞と非活性化状態（細胞が増殖、分化又は遊走してない状態）の細胞とにも分けることができるが、本発明はいずれの状態の幹細胞及び前駆細胞をも賦活化することができる。

本発明の賦活剤は、幹細胞及び／又は前駆細胞を賦活化する。ここで、「賦活化」とは、下記の３つの作用をいう。
（１）幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖を促進すること。
（２）幹細胞及び／又は前駆細胞の遊走を促進すること。遊走とは、幹細胞及び／又は前駆細胞が、骨髄、臓器及び／又は組織から循環血へ動員されること、循環血から傷害臓器及び／又は組織へ集積すること、或いは臓器及び／又は組織の内部で移動することをいう。
（３）幹細胞及び／又は前駆細胞の分化を促進すること。

本発明の賦活剤の対象となる幹細胞及び/又は前駆細胞は、患者の体外から細胞を導入する再生医療及び自発的再生を利用する再生医療を含む再生医療により治療可能な疾患へ適用される幹細胞及び/又は前駆細胞である。

したがって、本発明の賦活剤は、自発的再生を利用する再生医療において用いられる幹細胞及び/又は前駆細胞（すなわち、患者が元々有し、かつ、体外培養での増殖及び／又は分化の誘導に付されない細胞）だけではなく、患者の体外から細胞を導入する再生医療において用いられる幹細胞及び/又は前駆細胞（すなわち、患者の体外から導入される細胞）に対しても使用することができる。本発明の賦活剤は、自発的再生を利用する再生医療において用いられる幹細胞及び/又は前駆細胞に対して好適に使用することができる。

再生医療の適用となる疾患（傷害臓器又は傷害組織）の原因、種類及び程度については特に限定されない。以下に、疾患の具体例を例示する。

皮膚系疾患
創傷、熱傷、放射線障害、凍傷、紫外線障害、電撃症、外傷、皮膚潰瘍、褥瘡、接触性皮膚炎、水疱性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾皮症、糖尿病性皮膚潰瘍、自家感作性皮膚炎、紅皮症、剥脱性皮膚炎、表皮水疱症、光線過敏症、慢性色素性紫斑（シャンバーグ病）、口腔粘膜損傷、口内炎、口囲皮膚炎、皮膚の老化症状、脱毛症、爪囲炎、嵌入爪、消化管粘膜びらん、消化性潰瘍、角膜びらん、角膜潰瘍、う蝕、歯髄炎、辺縁性歯周組織炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、春季カタル、痔疾、消化管粘膜創傷、消化管粘膜熱傷、気管支喘息、舌炎、再発性アフタ、口腔内アフタ、口臭、口腔異常感症、歯性感染症、口腔粘膜咬傷、舌の咬傷、口腔粘膜熱傷、口腔粘膜潰瘍

脳神経系疾患
脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、各種中枢神経炎（例えば、脊髄炎）、各種末梢神経病（例えば、多発末梢神経炎）、脊髄病、各種脳炎

循環器系疾患
心筋梗塞、狭心症、不安定狭心症、各種心筋炎（例えば、ウイルス性心筋炎）、急性心機能不全、慢性心機能不全、粥状動脈硬化症、高血圧症、リューマチ性心臓病、不整脈、心臓弁膜性疾患、感染性心膜炎、心嚢炎、経皮的冠動脈介入療法、PTCA術後の再狭窄及び再閉塞

消化器系疾患
食道炎、急性胃炎、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、各種大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎）、腸結核、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、薬物性肝炎、脂肪肝、肝硬変、膵臓炎、各種消化器癌（例えば、肝癌、大腸癌、胃癌）の手術による臓器障害

呼吸器系疾患
各種気管支炎（例えば、細菌性気管支炎）、感染性肺炎、吸入性肺炎、肺塞栓症、気胸、肺不全

泌尿器系疾患
膀胱炎、各種腎炎（例えば、慢性腎炎症候群、原発性糸球体疾患）、副腎炎、尿道炎、細菌性及び非細菌性の前立腺炎、高血圧腎病、糖尿病性腎病、腎機能不全

運動器官系疾患
各種関節炎（例えば、リューマチ関節炎）、筋肉萎縮症、脳外科での開頭術後の骨欠損、整形外科での腫瘍切除後の骨欠損、骨折後の骨欠損、歯科での歯周病による骨欠損、軟骨炎、各種関節の軟骨欠損、各種損傷（例えば、外傷、捻挫）による靭帯損傷

血管系疾患
各種動脈疾患（例えば、閉塞性動脈硬化症(ASO) 、バージャー病(TAO)）、各種静脈疾患（例えば、血栓性静脈炎）、血栓症、血流障害、深部静脈血栓症（DVT）、末梢循環障害に伴う各種疾患（例えば、突発性難聴、振動病）、血管再建術後の再狭窄及び再閉塞

内分泌系疾患
糖尿病及びその各種合併症（例えば、糖尿性末梢神経症、糖尿病性足、糖尿病性潰瘍）、高脂血症、甲状腺炎、肥満症

眼科系疾患
各種角膜炎（例えば、アルカリ性又は酸性化合物による角膜炎、外傷性角膜炎）、糖尿病性網膜炎

上記以外の疾患について、幹細胞及び／又は前駆細胞の賦活化による治療（すなわち、傷害臓器及び／又は傷害組織の再生）が可能な疾患の再生医療に用いられる幹細胞及び／又は前駆細胞も本発明の賦活剤の対象となりうる。尚、再生医療の適用となる疾患の進行段階は特に限定されるものではない。

また、本発明の賦活剤は、再生医療の適用となる傷害臓器及び／又は傷害組織の進行段階や損傷の程度等に応じて、迅速かつ必要程度に作用することができる。

本発明の賦活剤は、好ましくは皮膚系疾患、運動器官系疾患、内分泌系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、消化器系疾患、眼科系疾患、脳神経系疾患、循環器系疾患及び血管系疾患の患者に存在する幹細胞及び／又は前駆細胞、特に好ましくは脳神経系疾患、循環器系疾患、皮膚系疾患及び血管系疾患の患者に存在する幹細胞及び／又は前駆細胞に適用することができる。

尚、本発明の賦活剤は、副作用が少ないか又は副作用がない。

更に、本発明の賦活剤は、賦活化効果を持続的に発揮することができる。

本発明の賦活剤は、トロンビン様酵素単独（例えば、バトロキソビン単独）又は１種類以上のトロンビン様酵素からなるものであってもよく、トロンビン様酵素と当該酵素以外の１種類或いは１種類以上のその他の活性物質とを組み合わせからなるものであってもよい。

その他の活性物質としては、VEGF、EGF、FGF、PDGF、NGF、HGF等の成長因子、G-CSF、GM-CSF、EPO等のサイトカイン、エストロゲン、脂質、スタチン(coenzyme A reductase inhibitor)、抗成長因子抗体、成長因子インヒビター、抗成長因子インヒビター抗体、抗サイトカイン抗体などが挙げられる（Takeyama K, Ohto H: PBSC mobilization. Transfus Apher Sci 31:233-243,2004、及び、Aicher A, Zeiher AM, Dimmeler S: Mobilizing endothelial progenitor cells. Hypertension 45:321-325,2005）。

本発明の賦活剤の剤型としては、日局製剤総則にあるあらゆる剤型を適用できる。例えば本発明の賦活剤の剤型は、直接体内に適用する注射剤（懸濁剤、乳剤を含む）；軟膏剤（油脂性軟膏、乳剤性軟膏（クリーム）、水溶性軟膏等を含む）、吸入剤、液剤（点眼剤、点鼻剤等を含む）、坐剤、貼付剤、パップ剤、ローション剤等の外用剤；又は、錠剤（糖衣、フィルム、膠衣を含む）、液剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤（細粒を含む）丸剤、シロップ剤、トローチ剤等の内用剤等を含む。これらの製剤は、日局製剤総則等に記載された方法で製剤化することができる。

また、本発明の賦活剤は、医薬的に許容しうる固体状若しくは液体状の担体又は介入治療基材を含んでいてもよい。医薬的に許容しうる固体状若しくは液体状の担体としては、溶剤、安定化剤、保存剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、着色剤、基剤、増粘剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、矯味剤等が挙げられる。

具体例としては、水、乳糖、白糖、果糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトールなどの糖・糖アルコール類、結晶セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース及びその関連誘導体、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、シクロデキストリン、プルランなどのデンプン及びその関連誘導体、カンテン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、セラック、トラガント、キサンタンガムなどの天然高分子（海草類、植物粘質物、タンパク質など）、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタアクリレートコポリマー、メタアクリル酸コポリマー、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ジメチルポリシロキサンなどの合成高分子、オリーブ油、カカオ脂、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、ダイズ油、ゴマ油、ツバキ油、パラフィン、流動パラフィン、ミツロウ、白色ワセリン、ヤシ油、マイクロクリスタリンワックスなどの油脂類、ステアリン酸、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、クエン酸トリエチル、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ハードファット、ミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸及びその誘導体、グリセリン、ステアリルアルコール、セタノール、プロピレングリコール、マクロゴールなどのアルコール及び多価アルコール、酸化亜鉛、リン酸水素カルシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、無水ケイ酸、カオリン、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ヒドロタルサイト、酸化チタン、タルク、ベントナイト、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、硫酸アルミニウムカリウム、次没食子酸ビスマス、次サリチル酸ビスマス、乳酸カルシウム、重炭酸ナトリウムなどの無機性物質及び金属塩化合物、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールなどの界面活性物質、色素、香料等が挙げられる。

介入治療基材としてはステント、人工血管、カテーテル、バルーン等が挙げられる。

本発明の賦活剤に関する製剤は、例えば、表１に示すように総量１ml中に下記の成分を下記の量で含むことができる。

表１バトロキソビン製剤の組成

本発明の賦活剤の投与量は、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、例えば、成人に１日１回投与する場合、バトロキソビンとして0.1〜50バトロキソビン単位(Batroxobin Unit, 略してBU)である。好ましい投与量は成人隔日1回、1回に1〜20BUである。

バトロキソビン単位は、バトロキソビンの酵素活性量を示す単位であり、37℃で、標準ヒトクエン酸加血漿0.3mlにバトロキソビン0.1mlを加えるとき、19.0±0.2秒で凝固する活性量を2BUとするものである。

本発明の賦活剤は、バトロキソビンを生理食塩水で適宜希釈し、次いで静脈内点滴投与、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、心臓内注射、腹腔内注射、くも膜下注射、直腸内投与、舌下投与、鼻粘膜投与、経皮投与、吸入、或いは傷害を受けた臓器及び／又は組織への局所投与により投与することができる。一般的には本発明の賦活剤を100ml以上の生理食塩水で希釈して、１時間以上点滴するのが好ましい。

バトロキソビンのマウス、ラット、ウサギ及びイヌに対する急性毒性(LD₅₀ (BU/kg))は以下の表２の通りである。急性毒性試験は、文献（Ozaki M et al.：脱フィブリノゲン薬Batroxobin(Defibrase)の毒性（第１報）．Pharmacometrics 25:339-346,1983）に記載の方法に従い、バトロキソビンの静脈内投与により行った。

表２．バトロキソビンの急性毒性（i.v.）

本発明の賦活剤は、幹細胞及び／又は前駆細胞を有する動物へ適用することができる。動物の具体例としてはヒト、サル、イヌ、ブタ、猫、ウサギ、ラット及びマウスが挙げられる。これらの中では、ヒトが好ましい。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。

［実施例１］臍帯血由来CD34陽性単核細胞の賦活化に対するバトロキソビンの影響
本実施例では、臍帯血由来CD34陽性単核細胞の賦活化に対するバトロキソビンの影響をインビトロで評価した。

尚、臍帯血中に存在する細胞のうち、CD34陽性単核細胞に該当するのは血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞であることが知られている（Murohara T et al.: Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J Clin Invest 105:1527-1536,2000）。したがって、本実施例で評価するヒト臍帯血由来CD34陽性単核細胞は血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞であるといえる。

実験方法
（１）ヒト臍帯血単核細胞の採取
正期産の正常妊娠を選択し、臍帯及び胎盤から抗凝固剤としてのヘパリン（20〜30U/ml）を用いて、40〜60mlの臍帯血を採取した。採取した臍帯血を6% Hydroethylstarch （Becton Dickinson, NJ, USA）と5:1の比率で混合して30分間静置し、沈降した赤血球を除去した。次いで、上層の液体を採取して、リンパ球分離液（相対密度が1.077、Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin，China）と2:1の比率で懸濁し、460×g条件下で25分間遠心分離に付した。中間層の単核細胞を採取して、リン酸緩衝液（PBS）で２回洗浄したものを実験に供した。

（２）CD34陽性単核細胞の分離及び同定
上記（１）で得たヒト臍帯血由来単球細胞をPBSで懸濁して、２×10⁶個/mlの細胞浮遊液を調製した。CD34陽性細胞モノクローナル免疫磁気ビーズ分離キット（MACS, Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Germany）を用いて、キットの説明書に準じて、ヒト臍帯血由来単核細胞からCD34陽性単核細胞を分離した。得られたCD34陽性単核細胞をFITC標識抗CD34抗体（Becton Dickinson, NJ, USA）を用いたフローサイトメトリー（Becton Dickinson FACS Vantage, Becton Dickinson, NJ, USA）に付したところ、CD34陽性細胞の純度は98.5％以上であった。

（３）細胞遊走試験
試験は、24ウェル培養プレート（Corning, NY, USA）及び5μm transwell（Corning, NY, USA）から作製した改良Boyden'sチャンバーを用いて行った。改良Boyden'sチャンバーは5μm(直径）の穴を有するポリカーボネート膜フィルターで２つの区画に分けられる。フィルター上方の空間を上槽と呼び、フィルターとウェルとの隙間を下槽と呼ぶ。

Boyden'sチャンバーの下槽へ、0.25％BSA IMDM（Gibco, Los angeles, USA）を用いて調製した各種濃度（0（対照群）、0.1及び0.2BU/ml）のバトロキソビンをそれぞれ600μl添加した。次いで、IMDM培地中の濃度が1x10⁵個/mlのヒト臍帯血由来CD34陽性単核細胞の細胞浮遊液100μlを各Boyden'sチャンバーの上槽へ添加した。この系を、5% CO₂/95%空気の雰囲気及び37℃の加湿インキュベーター中、静置状態で６時間培養した。培養終了後、上槽からフィルターを通って下槽へと移動した下槽の細胞を遊走細胞とした。遊走細胞を集め、フローサイトメトリーを用いて、その数を計数した。

得られた遊走細胞数の結果から、対照群の遊走細胞数を基準（100%）とする0.1BU/mlバトロキソビン投与群及び0.2BU/mlバトロキソビン投与群の細胞遊走率を算出した。細胞遊走率は、同一条件による三重の試験を2回行って得られた測定値に基づき、平均値±標準偏差（%）として算出した。

結果及び考察
対照群（0 BU/ml）のCD34陽性細胞の遊走率を100%としたとき、0.1BU/mlバトロキソビン投与群の遊走率は149.37±6.82%であり、0.2BU/mlバトロキソビン投与群の遊走率は254.26±17.44%であった。すなわち、バトロキソビンを投与した２群は、対照群と比べて顕著に高い遊走率を示した。

この結果は、バトロキソビンが、ヒト臍帯血由来CD34陽性単核細胞（すなわち、血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞）を有意に賦活化したことを示している。その賦活化作用は血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞に対する遊走の促進作用であると考えられる。

尚、本実施例では、CD34陽性単核細胞のソースとして臍帯血を利用したが、CD34陽性単核細胞は、成体の末梢血、成体の骨髄及び胎児骨髄等にも存在することが知られている（Michejda M: which stem cells should be used for transplantation? Fetal Diagn Ther 19:2-8,2004）。したがって、バトロキソビンは、臍帯血以外の血液（成体の末梢血を含むあらゆる由来の血液）及び骨髄（成体の骨髄及び胎児骨髄）に存在するCD34陽性単核細胞をも賦活化することができる。

［実施例２］下肢深部静脈血栓症患者の末梢血中のCD34陽性細胞、CD34陽性/CD31陽性細胞及びVEカドヘリン陽性細胞の賦活化、並びに、下肢深部静脈血栓症患者の傷害組織の機能回復に対するバトロキソビンの影響
本実施例では、血管系疾患である下肢深部静脈血栓症（以下、下肢DVTという）の患者へバトロキソビンを投与して、末梢血中のCD34陽性細胞、CD34陽性/CD31陽性細胞及びVEカドヘリン陽性細胞の賦活化に対するバトロキソビンの効果、並びに、血栓により傷害を受けた血管の再生に対するバトロキソビンの効果を評価した。

尚、末梢血中に存在する細胞のうち、CD34陽性単核細胞に該当するのは血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞であることが知られている（Zhao Y et al.: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 100: 2426-2431,2003）。したがって、本実施例で評価する末梢血中のCD34陽性単核細胞は血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞であるといえる。

また、内皮前駆細胞は、マーカーとしてCD34（Michejda M: which stem cells should be used for transplantation? Fetal Diagn Ther 19:2-8,2004、Fadini GP et al.: Circulating endothelial progenitor cells are reduced in peripheral vascular complications of tape 2 diabetes mellitus. J American College of Cardiology 45:1449-1457,2005、及び、Kuwana M et al.: Human circulating CD14⁺ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation. J Leukoc Biol 74:833-845,2003。）及びCD31（Asahara T et al.: Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964-967,1997、及び、Hristov M, Weber C:Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J Cell Mol Med 8:498-508,2004）を発現することが知られている。更に、分化が進んで血管へ接着できる状態にある血管内皮前駆細胞は、更にVEカドヘリンを発現することが知られている（Hristov M, Weber C:Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J Cell Mol Med 8:498-508,2004）。したがって、本実施例で評価する末梢血中のCD34陽性/CD31陽性単核細胞及びVEカドヘリン陽性単核細胞は血管内皮前駆細胞といえる。

実験方法
（１）試験対象者
37〜80歳（平均年齢64歳）の男性11名及び女性4名の下肢DVT患者。各試験対象者に対しては、臨床試験である旨を説明し、同意を得たうえで試験を行った。

（２）投薬方法
バトロキソビンを、初回（午前中入院の場合は入院日当日、又は午後入院の場合は入院翌日）のみ10BU／body／日、以後5BU／body／日の投与量で連続14日間、静脈点滴により患者へ投薬した。

（３）採血
投薬前（初回投薬前）、投薬後7日目、14日目に、低分子ヘパリン抗凝固剤を用いて患者の前腕の肘正中皮静脈から5mlの末梢血を採取した。採取した末梢血は直ちに4℃で保存し、6時間以内に測定に供した。15例の下肢DVT患者のうち、投薬前及び投薬後7日目には全15例において採血を行い、投薬後14日目には10例について採血を行った。

（４）末梢血単核細胞の分離
上記（３）で得た血液5mlへ、2.5mlのリンパ球分離液（Ficoll, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China）を添加して懸濁液を作製した。得られた懸濁液を460×gの条件下で遠心分離に付した後、中段細胞層を末梢血由来の単核細胞として回収した。得られた総単核細胞の数は、患者1名あたり約5〜6×10⁶であった。得られた単核細胞をリン酸緩衝液（PBS）で懸濁して、2×10⁶/mlの細胞懸濁液を調製した。

（５）CD34陽性単核細胞の分離
CD34陽性単核細胞の分離はフローサイトメトリーを用いた免疫蛍光染色法により行った。上記（４）で得た単核細胞懸濁液100μlへ、phycoerythrin標識抗CD34抗体（Becton Dickinson, NJ, USA）20 μlを添加し、4℃下かつ遮光下で30分間反応を行った。次いで、フローサイトメトリーによりCD34陽性単核細胞を分離し、計数した。単核細胞中のCD34陽性単核細胞の割合（％）を、下式にしたがい計算した。
CD34陽性単核細胞（％）＝（CD34陽性単核細胞数／総単核細胞数）X 100

（６）CD34陽性/CD31陽性単核細胞の分離
CD34陽性/CD31陽性単核細胞の分離はフローサイトメトリーを用いた二重免疫蛍光染色法により行った。上記（４）で得た単核細胞懸濁液を100μlへ、phycoerythrin標識抗CD34抗体（Becton Dickinson, NJ, USA）20μl及びFITC標識抗CD31抗体（Becton Dickinson, NJ, USA）20μlを添加し、4℃下かつ遮光下で30分間反応を行った。次いで、フローサイトメトリーによりCD34陽性/CD31陽性単核細胞を分離し、計数した。単核細胞中のCD34陽性/CD31陽性単核細胞の割合（％）を、下式にしたがい計算した。
CD34陽性/CD31陽性単核細胞(％)＝（CD34陽性/CD31陽性単核細胞数／総単核細胞数）X 100

（７）VE カドヘリン陽性単核細胞の分離
VE カドヘリン陽性単核細胞の分離はフローサイトメトリーを用いた免疫蛍光法染色法により行った。上記方法（４）で得た単核細胞懸濁液を100μlへ、FITC標識VE カドヘリン抗体（Becton Dickinson, NJ, USA）20μlを添加し、4℃下かつ遮光下で30分間反応を行った。次いで、フローサイトメトリーによりVE カドヘリン陽性単核細胞を分離し、計数した。単核細胞中のVE カドヘリン陽性単核細胞の割合（％）を、下式にしたがい計算した。
VE カドヘリン陽性単核細胞(％)＝（VE カドヘリン陽性単核細胞数／総単核細胞数）X 100

（８）膝上及び膝下周径の測定
下肢DVTの典型的かつ客観的な症状として下肢の浮腫がある。そこで、全15例の患者について、下肢の膝上20cm周径と下肢の膝下15cm周径を指標とした下肢浮腫の程度をバトロキソビン投薬前後において測定した。

結果及び考察
（１）CD34陽性単核細胞の賦活化
表3 下肢DVT患者末梢血中のCD34陽性単核細胞の変化
（平均値±標準偏差，％）

^*：P<0.05；^**：P<0.01
対応がある非パラメーター検定を用いて投薬前との比較

バトロキソビン投与により、末梢血中のCD34陽性単核細胞の比率が投薬前と比較して有意に増加した（表３）。
この結果は、バトロキソビンが、下肢DVT患者末梢血中のCD34陽性単核細胞（すなわち、血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞）を賦活化したことを示している。その賦活化作用はCD34陽性単核細胞の増殖及び遊走に対する促進作用であると考えられる。

（２）CD34陽性/CD31陽性単核細胞の賦活化
表４下肢DVT患者末梢血中のCD34陽性/CD31陽性単核細胞の変化
（平均値±標準偏差，％）

バトロキソビン投与により、末梢血中のCD34陽性/CD31陽性単核細胞の比率が投薬前と比較して有意に増加した（表４）。
この結果は、バトロキソビンが、下肢DVT患者末梢血中のCD34陽性/CD31陽性単核細胞（すなわち、血管内皮前駆細胞及び間葉幹細胞）を賦活化したことを示している。その賦活化作用はCD34陽性/CD31陽性単核細胞の増殖、遊走及び分化に対する促進作用であると考えられる。

（３）VE カドヘリン陽性単核細胞の賦活化
表５下肢DVT患者末梢血中のVE カドヘリン陽性単核細胞の変化
（平均値±標準偏差，％）

^*：P<0.05
対応がある非パラメーター検定を用いて投薬前との比較

バトロキソビン投与により、末梢血中のVE カドヘリン陽性単核細胞の比率が投薬前と比較して有意に増加した（表５）。
この結果は、バトロキソビンが、下肢DVT患者末梢血中のVE カドヘリン陽性単核細胞（すなわち、血管内皮前駆細胞）を賦活化したことを示している。その賦活化作用はVE カドヘリン陽性単核細胞の増殖、遊走及び分化に対する促進作用であると考えられる。

（４）下肢DVT患者における浮腫症状の改善
表６下肢DVT患者の膝上及び膝下周径の変化（平均値±標準偏差，ｃｍ）

^**：P<0.01、Wilcoxon検定を用いて投薬前と比較した。
^##：P<0.01、対応があるｔ検定を用いて投薬前と比較した。

下肢の膝上20cm周径と下肢の膝下15cm周径を指標として下肢浮腫の程度を評価した。バトロキソビンの投与により下肢の膝上周径及び膝下周径が有意に減少した（表６）。
この結果は、バトロキソビンの投与により、幹細胞及び／又は前駆細胞が賦活化され、傷害を受けた血管が再生され、下肢深部静脈血栓症患者の浮腫症状が改善したことを示している。この賦活化作用は幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖、遊走及び分化に対する促進作用であると考えられる。

尚、バトロキソビンの薬理作用の指標である血漿フィブリノーゲンを測定したところ、バトロキソビン投薬後7及び14日目に著しく減少していた（データは示さず）。これは、投与されたバトロキソビンが体内で効果をよく発揮していることを示している。

また、バトロキソビンを含む血液凝固・線溶系に働く製剤の投薬時に現れる副作用（出血等）の指標となる因子APTT、PT及びTTの測定をバトロキソビン投与前、投薬後7及び14日目に行ったが、有意差が認められなかった（データは示さず）。これは、バトロキソビン投与による副作用が生じなかったことを示している。

［実施例３］脳虚血再灌流傷害モデルにおける神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の賦活化並びに神経機能回復に対するバトロキソビンの影響
本実施例では、ラットの脳虚血再灌流傷害モデルを用いて、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の賦活化、並びに、神経機能回復に対するバトロキソビンの効果を評価した。

実験方法
（１）動物
12週齢、体重250〜280gのSprague-Dawley雄性ラット（Shanghai Animal Center，Chinese Academy of Medical Sciences, Shanghai, China)を、１週間順化した後に実験に供した。

（２）脳虚血再灌流傷害モデルの作製
はじめに、Longa EZらの方法に準じて中大脳動脈閉塞モデルを作製した（Longa EZ et al.: Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20:84-91,1989）。具体的には、12時間絶食（但し、飲水は自由であった）させたラットに、0.36g/kgの10％抱水クロラール（Shencheng Chemical Co., Shanghai, China）を腹腔内投与して、ラットを麻酔した。次いで、頚部の正中切開を行い、右総頚動脈を露出させた。次に、内頚動脈と外頚動脈とを分離し、外頚動脈の分枝である後頭動脈と上甲状腺動脈とを凝固切断し、次いで舌動脈と顎動脈との分枝部で外頚動脈を結紮し、外頚動脈に小さい切口を作り、4-0ナイロン糸を切口から総頚動脈を通し、抵抗があるまで徐々に内頚動脈に挿入した。ナイロン糸の長さは総頚動脈分枝部より約18〜20mmであった。ナイロン糸で中大脳動脈を塞ぐことにより、2時間の虚血状態に付して、中大脳動脈閉塞モデルを作製した。
得られた閉塞モデルの中大脳動脈からナイロン糸を抜いて血液再潅流を行うことにより、脳虚血再灌流傷害モデルを作製した。

（３）モデルラットへのバトロキソビン投与
ラットを3群に分け、それぞれ下記の処理を施した。
１）偽手術群（75匹）：ラットには前記（２）の手順のうち内頚動脈と外頚動脈との分離までは行ったが、続く中大脳動脈閉塞及び再潅流の操作手順は行わなかった。本群のラットには、バトロキソビン投与群に示されたのと同様な時間にバトロキソビンの代わりに等容量の生理食塩水を腹腔内投与した。
２）モデル群（75匹）：動物を用いて脳虚血再灌流傷害モデルを作製した。本群のラットには、バトロキソビン投与群に示されたのと同様な時間にバトロキソビンの代わりに等容量の生理食塩水を腹腔内投与した。
３）バトロキソビン投与群（75匹）：動物を用いて脳虚血再灌流脳傷害モデルを作製し、虚血30分の時点に生理食塩水で調整したバトロキソビン溶液を20BU/kg/10mlの投与量で腹腔内投与し、続けて1時間30分の虚血を行い、ナイロン糸を抜いて再灌流を行った。虚血再灌流傷害モデル作製後2、4、6及び8日目にも20BU/kg/10mlのバトロキソビン溶液を腹腔内投与した。

（４）神経機能スコアの評価
各群のラット（各群15匹ずつ）について、虚血再灌流傷害モデル作製後1日1回神経機能スコアの評価を行った。神経機能障害スコアの評価は、Longa EZの方法（Longa EZ et al.: Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20:84-91,1989）に準じて、下記の基準を用いて行った。結果は中央値で表した。

０点：正常
１点：梗塞巣の反対側の肢体が曲がる。
２点：尾を後ろに引っ張ると梗塞巣の反対側の肢体が無力状態である。
３点：尾を引っ張ると梗塞巣の反対側へ旋回する。
４点：自発的に梗塞巣の反対側へ旋回する。
５点：自力運動が不可能である。

（５）ネスチン陽性細胞の測定
各群30匹ずつのラットについて、モデル作製後7、14及び21日目に10匹ずつを剖検して、組織標本を作製し、顕微鏡下で神経幹細胞の存在を測定した。
具体的には、モデル作製後7、14及び21日目にラットの凍結脳切片を作製し、脳室下領域(以下、SVZ領域という)のネスチン陽性細胞の存在を神経幹細胞に発現するマーカーのネスチンを利用して、免疫組織化学染色法で測定した。ネスチン陽性細胞の存在は、Chemicon社（Temecula, USA）のマウス由来抗ラットネスチンモノクローナル抗体を用いて測定した。

（６）BrdU陽性細胞及びBrdU陽性/ネスチン陽性細胞の測定
各群30匹ずつのラットについて、モデル作製後5、6、12、13、19及び20日目に、50mg/kg 5-ブロモデオキシウリジン(BrdU）（CalBiochem, San Diego, USA) を腹腔内注射した。BrdUはチミジンの類似体であり、細胞増殖（DNA合成）過程に細胞のDNA中へ取り込まれるので、細胞内BrdU量を検出することによって、細胞増殖を検出することができる。モデル作製後7、14及び21日目にラットを剖検して、凍結脳切片を作製した。SVZ領域におけるBrdU陽性細胞の存在は免疫化学染色法で、BrdU陽性/ネスチン陽性細胞の存在は二重免疫蛍光染色法で測定した。
BrdU陽性細胞の存在は、マウス由来抗ラットBrdUモノクローナル抗体（Oncogene, Westhaver, USA）を用いて測定した。
BrdU陽性/ネスチン陽性細胞の存在は、一次抗体としてのヤギ由来抗ラットBrdUポリクローナル抗体（Biodesign，Saco，USA）と二次抗体としてのFITC標識ウサギ由来抗ヤギ抗体（Pierce, Rockford, USA）との組み合わせ、及び、一次抗体としてのマウス由来抗ラットネスチンモノクローナル抗体と二次抗体としてのRho標識ウサギ由来抗マウス抗体（Pierce, Rockford, USA）との組み合わせを用いた二重免疫蛍光染色法で測定した。

（７）NeuN陽性細胞、GFAP陽性細胞及びBrdU陽性/GFAP陽性細胞の測定
各群30匹ずつのラットについて、モデル作製後5、6、12、13、19及び20日目に50mg/kg BrdUを腹腔内注射した。モデル作製後7、14及び21日目にラットを剖検して、凍結脳切片を作製した。SVZ領域におけるNeuN陽性細胞とグリア線維性酸性蛋白質（glial fibrillary acidic protein(GFAP)）陽性細胞の存在は免疫化学染色法で、BrdU陽性/GFAP陽性細胞の存在は二重免疫蛍光染色法で測定した。NeuNは神経幹細胞から分化した未成熟神経細胞に発現するマーカーであり、GFAPは神経幹細胞から分化したアストロサイトに発現するマーカーである。
NeuN陽性細胞の存在は、Chemicon社（Temecula, USA）のヤギ由来抗NeuNモノクローナル抗体を用いて測定した。GFAP陽性細胞の存在は、ヤギ由来の抗GFAPポリクローナル抗体（Sigma, Louis, USA）を用いて測定した。BrdU陽性/GFAP陽性細胞の存在は、一次抗体としてのマウス由来抗ラットBrdUモノクローナル抗体と二次抗体としてのRho標識ウサギ由来抗マウス抗体との組み合わせ、及び、一次抗体としてのヤギ由来の抗GFAPポリクローナル抗体と二次抗体としてのFITC標識ウサギ由来抗ヤギ抗体との組み合わせを用いた二重免疫蛍光染色法で測定した。

（８）BrdU陽性（遊走）細胞の測定
各群30匹ずつのラットについて、モデル作製後24時間以内に50mg/kg BrdU を2回腹腔内注射した。モデル作製後7、14及び21日目にラットを剖検して、凍結脳切片を作製した。作製した凍結脳切片中のSVZ領域におけるBrdU陽性細胞の存在を、マウス由来抗ラットBrdUモノクローナル抗体を用いた免疫化学染色法で測定した。

結果及び考察
（１）神経機能の評価
神経機能スコアの測定はモデル作製後毎日行われ、実験終了の21日目まで続いた。
表７神経機能スコアの経時変化（n=15、中央値）

^*P<0.05、モデル群と比較；^**P<0.05、各群の1日目と比較
Kruskl-Wallis検定を用いた。

偽手術群では、神経機能の障害が観察されなかった。他の２群では、モデル作成後1日目と比べて術後21日目で神経機能の有意な回復が観察された（P<0.05）。
バトロキソビン投与群では、モデル群と比べて早い神経機能回復が観察された。特にモデル作成後7、8、9及び16日目のバトロキソビン投与群では、モデル群に対して有意な神経機能回復が観察された。
この結果は、バトロキソビンが、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を賦活化させ、障害を受けた神経機能の回復に貢献したことを示している。この賦活化作用は神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖、遊走及び分化に対する促進作用であると考えられる。

（２）神経幹細胞の存在についての証明
表８ SVZ領域におけるネスチン陽性細胞数（平均値±標準偏差、細胞数/mm²）

^**P<0.01、偽手術群との比較；^***P<0.05、同日のモデル群との比較
Wilcoxon's 検定を用いた。

表８の値に基づき、モデル群を基準（100％）としたバトロキソビン投与群におけるネスチン陽性細胞数の相対値（％）を下記の式に従い計算した。
BRｔ(％)＝(Bt-St)/(Mt-St)X100
BRｔ:ｔ時点のバトロキソビン群のネスチン陽性細胞率（％）
Bt：ｔ時点のバトロキソビン群のネスチン陽性細胞平均値
St：ｔ時点の偽手術群のネスチン陽性細胞平均値
Mt：ｔ時点のモデル群のネスチン陽性細胞平均値
t：7日目、14日目又は21日目
結果を図１に示す。偽手術群と比較して、モデル群ではネスチン陽性細胞数（ネスチンは、神経幹細胞のマーカーである）が増加した（表８）。これは、動物における脳虚血再灌流傷害の刺激により惹起された代償反応によるものと考えられる。
一方、バトロキソビン投与群は、モデル作製後7、14及び21日目のいずれの時点においても、モデル群と比較して増加したネスチン陽性細胞数を示した（表８、図１）。
これらの結果は、バトロキソビンが、ネスチン陽性細胞（すなわち、神経幹細胞）を賦活化したことを示している。この賦活化作用は神経幹細胞の増殖及び遊走に対する促進作用であると考えられる。

また、バトロキソビン投与群は、モデル作製後９日目以降はバトロキソビンを投与していないにもかかわらず、モデル作製後21日目の時点においても、モデル群と比較して有意に増加したネスチン陽性細胞数を示した（図１）。これは、バトロキソビンが神経幹細胞に対して持続的な賦活化作用を有することを示している。

（３）増殖中神経幹細胞の存在及びその自己複製能についての証明
１）増殖中神経幹細胞の存在についての証明
バトロキソビン投与群において、SVZ領域で増殖中のネスチン陽性/BrdU陽性細胞（すなわち、神経幹細胞）の存在が二重免疫蛍光染色法で確認された（データは示さず）。これは、バトロキソビン投与群において、増殖中の神経幹細胞が存在することを示している。

２）神経幹細胞の自己複製能についての証明
表９ SVZ領域におけるBrdU陽性細胞数（平均値±標準偏差、細胞数/mm²）

^**P<0.01、偽手術群との比較；^***P<0.01、同日のモデル群との比較
Wilcoxon's 検定を用いた。

表９の値に基づき、モデル群を基準（100％）としたバトロキソビン投与群におけるBrdU陽性細胞数の相対値（％）を下記の式に従い計算した。
BRｔ(％)＝(Bt-St)/(Mt-St)X100
BRｔ:ｔ時点のバトロキソビン群のBrdU陽性細胞率（％）
Bt：ｔ時点のバトロキソビン群のBrdU陽性細胞平均値
St：ｔ時点の偽手術群のBrdU陽性細胞平均値
Mt：ｔ時点のモデル群のBrdU陽性細胞平均値
t：7日目、14日目又は21日目

結果を図２に示す。偽手術群と比較して、モデル群ではBrdU陽性細胞数（BrdUは、増殖している細胞のマーカーである）が増加した（表９）。これは、動物における脳虚血再灌流傷害の刺激により惹起された代償反応によるものと考えられる。
一方、バトロキソビン投与群は、モデル作製後7、14及び21日目のいずれの時点においても、モデル群と比較して増加したBrdU陽性細胞数を示した（表９、図２）。
脳組織中に存在するBrdU陽性細胞は、自己複製能を有することによりBrdUを取り込むことができる神経幹細胞及び神経前駆細胞のみである。したがって、これらの結果は、バトロキソビンが、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を賦活化したことを示している。この賦活化作用は神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖及び遊走に対する促進作用であると考えられる。
また、バトロキソビン投与群は、モデル作製後９日目以降はバトロキソビンを投与していないにもかかわらず、モデル作製後21日目の時点においても、モデル群と比較して有意に増加したBrdU陽性細胞数を示した（図2）。これは、バトロキソビンが神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞に対して持続的な賦活化作用を有することを示している。

（４）未成熟神経細胞及び神経幹細胞より分化したアストロサイトの存在、並びにアストロサイト増加についての証明
１）未成熟神経細胞の存在についての証明
バトロキソビン投与群において、NeuN陽性細胞の存在が確認された（データは示さず）。NeuNは神経幹細胞から分化した未成熟神経細胞に発現するマーカーであるため、これは、バトロキソビン投与群において、神経幹細胞から分化した未成熟神経細胞が存在することを示している。

２）神経幹細胞より分化したアストロサイトの存在についての証明
バトロキソビン投与群において、BrdU陽性/GFAP陽性細胞の存在が二重免疫蛍光染色法で確認された（データは示さず）。GFAPは神経幹細胞から分化したアストロサイトに発現するマーカーであるため、これは、バトロキソビン投与群において、神経幹細胞から分化してきたアストロサイトが存在することを示している。しかしながら、アストロサイトは神経組織における分化細胞であるところ、何故、BrdUがアストロサイトに取り込まれたのか？これは、アストロサイトへ分化する前の幹細胞及び／又は前駆細胞の状態にあったときにBrdUが取り込まれ、引き続き存在し検出されたためであると考えられる。

３）アストロサイト増加についての証明
表１０ SVZ領域におけるGFAP陽性細胞数（平均値±標準偏差、細胞数/mm²）

表１０の値に基づき、モデル群を基準（100％）としたバトロキソビン投与群におけるGFAP陽性細胞数の相対値（％）を下記の式に従い計算した。
BRｔ(％)＝(Bt-St)/(Mt-St)X100
BRｔ:ｔ時点のバトロキソビン群のGFAP陽性細胞率（％）
Bt：ｔ時点のバトロキソビン群のGFAP陽性細胞平均値
St：ｔ時点の偽手術群のGFAP陽性細胞平均値
Mt：ｔ時点のモデル群のGFAP陽性細胞平均値
t：7日目、14日目又は21日目

結果を図３に示す。偽手術群と比較して、モデル群ではGFAP陽性細胞数（GFAPは、神経幹細胞から分化したアストロサイトのマーカーである）が増加した（表１０）。これは、動物における脳虚血再灌流傷害の刺激により惹起された代償反応によるものと考えられる。
一方、バトロキソビン投与群は、モデル作製後7、14及び21日目のいずれの時点においても、モデル群と比較して増加したGFAP陽性細胞数を示した（表１０、図３）。
これらの結果は、バトロキソビンが、GFAP陽性細胞（すなわち、神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞）を賦活化したことを示している。このバトロキソビンの賦活化作用は神経幹細胞及び/又は神経前駆細胞の増殖、分化及び遊走に対する促進作用であり、特に上記の細胞からアストロサイトへの分化促進に対するものと考えられる。

また、バトロキソビン投与群は、モデル作製後９日目以降はバトロキソビンを投与していないにもかかわらず、モデル作製後21日目の時点においても、モデル群と比較して増加したGFAP陽性細胞数を示した（図３）。これは、バトロキソビンが神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞のアストロサイトへの分化に対して持続的な賦活化作用を有することを示している。

（５）遊走細胞についての証明
表１１ SVZ領域におけるBrdU陽性細胞数（平均値±標準偏差、細胞数/mm²）

表１１の値に基づき、モデル群を基準（100％）としたバトロキソビン投与群におけるBrdU陽性細胞数の相対値（％）を下記の式に従い計算した。
BRｔ(％)＝(Bt-St)/(Mt-St)X100
BRｔ:ｔ時点のバトロキソビン群のBrdU陽性細胞率（％）
Bt：ｔ時点のバトロキソビン群のBrdU陽性細胞平均値
St：ｔ時点の偽手術群のBrdU陽性細胞平均値
Mt：ｔ時点のモデル群のBrdU陽性細胞平均値
t：7日目、14日目又は21日目

結果を図４に示す。本実験では、モデル作製後24時間以内に２回のみBrdUを腹腔内投与し、その後はBrdUを投与していないので、モデル作製後7日目、14日目及び21日目に測定されたBrdU陽性細胞はBrdU投与時点において存在していたBrdU陽性細胞である。したがって、モデル作製後7日目、14日目及び21日目にSVZ領域で測定されたBrdU陽性細胞の増加は当該SVZ領域へ遊走したBrdU陽性細胞を反映している。更に、SVZ領域に存在するBrdU陽性細胞は、自己複製能を有することによりBrdUを取り込むことができる神経幹細胞及び神経前駆細胞のみである。以上より、表１１及び図４は、神経幹細胞及び神経前駆細胞のSVZ領域への遊走状況を示している。
偽手術群と比較して、モデル群ではBrdU陽性細胞数が増加した（表１１）。これは、動物における脳虚血再灌流傷害の刺激により惹起された代償反応によるものと考えられる。
一方、バトロキソビン投与群は、モデル作製後7、14及び21日目のいずれの時点においても、モデル群と比較して増加したBrdU陽性細胞数を示した（表１１、図４）。これは、バトロキソビン投与群では、SVZ領域へ遊走した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数がモデル群と比較して多いことを示している。
これらの結果は、バトロキソビンが、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を賦活化したことを示している。その賦活化作用は神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞に対する遊走促進の作用であると考えられる。

また、バトロキソビン投与群では、モデル作製後９日目以降はバトロキソビンを投与していないにもかかわらず、モデル作製後21日目の時点においても、モデル群と比較してBrdU陽性細胞の増加が認められた（図４）。これは、バトロキソビンが神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の遊走に対して持続的な賦活化作用を有することを示している。

尚、免疫化学染色法を用い、SVZ領域におけるBrdU陽性細胞の分布についてモデル群とバトロキソビン投与群とを比較したところ、モデル群ではBrdU陽性細胞がSVZ領域の表面にのみ分布していた（図５左図）が、バトロキソビン投与群ではBrdU陽性細胞がSVZ領域の表面から内部へと広く分布していた（図５右図）。これは、バトロキソビンの投与によって神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞がSVZ領域の表面から内部へ遊走したこと、すなわち、バトロキソビンが神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の脳組織内での遊走を促進したことを示している。

実施例３の結果は、バトロキソビンが神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞に対して持続的な賦活化作用を有することを明確に示している。この賦活化作用は神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞に対する増殖、遊走及び分化に対する促進作用であると考えられる。

産業上の利用可能性
本発明の賦活剤は、前述の実施例で示されるように、幹細胞及び／又は前駆細胞を賦活化することができる。したがって、本発明は再生医療、特に自発的再生を利用する再生医療に有利に使用することができる。

本発明の賦活剤を用いて行われる自発的再生を利用する再生医療は、患者の体内に存在する幹細胞及び／又は前駆細胞を利用するため、体外からの細胞導入を必要としない。したがって、患者にかかる負担が少なく、かつ、細胞移植時に生じる感染等のリスクもない。これは、自発的再生を利用する再生医療を、体外から細胞を導入する再生医療と比較して優れたものとしている。

また、本発明の賦活剤を用いて行う自発的再生を利用した再生医療では、幹細胞及び／又は前駆細胞の賦活化が、患者の疾患部位（すなわち、傷害を受けた臓器及び／又は組織）で特異的に起こり、かつ、その再生が必要程度に起こる。したがって、かかる再生医療には、従来の再生医療の主流である患者の体外から細胞を導入する再生医療において起こる移植細胞の過剰再生及び／又は過剰修復に起因する合併症発症の危険性がない。

更に、本発明のトロンビン様酵素を含んでなる賦活剤は、副作用が少ない又は副作用がなく、再生医療の適用となる傷害臓器及び／又は傷害組織の進行段階や損傷の程度等に応じて、迅速かつ必要程度に作用することができ、かつ、その賦活化効果が持続するので、再生医療に有利に使用することができる。

したがって、本発明は、再生医療、特に自発的再生を利用する再生医療に利用可能であり、高い産業上の利用可能性を有する。

図１は、モデル群を基準としたバトロキソビン投与群におけるネスチン陽性細胞数の相対値を示す棒グラフである。図２は、モデル群を基準としたバトロキソビン投与群におけるBrdU陽性細胞数の相対値を示す棒グラフである。図３は、モデル群を基準としたバトロキソビン投与群におけるGFAP陽性細胞数の相対値を示す棒グラフである。図４は、モデル群を基準としたバトロキソビン投与群のBrdU陽性（遊走）細胞数の相対値を示す棒グラフである。図５は、モデル群（左）及びバトロキソビン投与群（右）におけるSVZ領域中のBrdU陽性細胞の分布を示す写真である。矢印はBrdU陽性細胞を指している。

Claims

バトロキソビンを含んでなる、ＣＤ３４又はネスチンを発現する幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活剤であって、該幹細胞及び／又は前駆細胞が、再生医療に適用される細胞であり、該賦活が、該幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖促進、遊走促進及び分化促進からなる群より選ばれる、賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、自発的再生を利用する再生医療に適用される細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、皮膚系疾患、脳神経系疾患、循環器系疾患、消化器系疾患、呼吸器系疾患、泌尿器系疾患、運動器官系疾患、血管系疾患、内分泌系疾患及び眼科系疾患からなる群より選ばれる疾患の再生医療に適用される細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、脳神経系疾患、循環器系疾患、皮膚系疾患及び血管系疾患からなる群より選ばれる疾患の再生医療に適用される細胞である、請求項３に記載の賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、内在性細胞、骨髄由来細胞及び血液由来細胞からなる群より選ばれる細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載の賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、下肢深部静脈血栓症の再生医療に適用される細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、血管内皮前駆細胞及び／又は間葉幹細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、虚血性脳血管病の再生医療に適用される細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、脳虚血再灌流傷害の再生医療に適用される細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
幹細胞及び／又は前駆細胞が、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞である、請求項１に記載の賦活剤。
ＣＤ３４又はネスチンを発現する幹細胞及び/又は前駆細胞の賦活剤を製造するためのバトロキソビンの使用であって、該幹細胞及び／又は前駆細胞が、再生医療に適用される細胞であり、該賦活が、該幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖促進、遊走促進及び分化促進からなる群より選ばれる、使用。