WO2023181830A1 - 細胞製剤 - Google Patents

細胞製剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2023181830A1
WO2023181830A1 PCT/JP2023/007766 JP2023007766W WO2023181830A1 WO 2023181830 A1 WO2023181830 A1 WO 2023181830A1 JP 2023007766 W JP2023007766 W JP 2023007766W WO 2023181830 A1 WO2023181830 A1 WO 2023181830A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
positive
cell preparation
cell
preparation according
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/007766
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
明彦 田口
由佳 沖中
優子 小川
貴文 木村
光信 田中
一太 保井
晶弘 渕崎
Original Assignee
公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公益財団法人神戸医療産業都市推進機構 filed Critical 公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
Publication of WO2023181830A1 publication Critical patent/WO2023181830A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to cell preparations and the like for treating diseases that can be expected to be treated by promoting tissue regeneration.
  • Non-Patent Document 1 describes that administration of bone marrow mononuclear cells obtained by specific gravity centrifugation to myocardial infarction generates a new cardiac microvascular network and improves cardiac function.
  • Non-Patent Document 2 states that administration of peripheral blood-derived CD34-positive cells purified using a specific cell surface antigen to treat limb ischemia generates new limb microvascular networks and improves ischemic symptoms. is listed.
  • Non-Patent Document 3 describes that administration of bone marrow mononuclear cells obtained by specific gravity centrifugation for limb ischemia generates new microvascular networks in the limbs and improves ischemic symptoms.
  • Non-Patent Document 4 describes that administration of CD34-positive cells derived from umbilical cord blood purified using a specific cell surface antigen to treat cerebral infarction generates a new brain microvascular network and improves neurological function.
  • Non-Patent Document 5 describes that administration of bone marrow mononuclear cells obtained by specific gravity centrifugation to cerebral infarction generates a new microvascular network in the brain and improves neurological function.
  • Non-Patent Document 6 describes that allogeneic hematopoietic stem cell transplantation damages the microvascular network, leading to worsening of symptoms after myocardial infarction.
  • Non-Patent Document 7 describes that allogeneic hematopoietic stem cell transplantation damages the microvascular network, leading to worsening of symptoms after cerebral infarction.
  • Non-Patent Documents 8, 9 the number of neurons does not increase in the adult human and rodent brains, but in recent years it has been found that new neurons are constantly born in the hippocampus.
  • Newly produced neurons function by being incorporated into neural networks.
  • the frequency of neurogenesis (neurogenesis) in the hippocampus increases during learning and in an enriched environment.
  • Non-patent Documents 10, 11 A research group at the University of Illinois at Chicago, The University of British Columbia, and Rush University Medical Center reported that neurogenesis in the hippocampus persists in adults, but dramatically decreases in old age, and that neurogenesis is correlated with cognitive status. suggested (Non-patent Document 12).
  • Non-Patent Documents 13, 14 It has been reported that neurogenesis in the brain is reduced in psychiatric diseases such as depression and schizophrenia, and its involvement in the pathology of these diseases has been suggested. Neurogenesis in the hippocampus is suppressed by stress, which is considered a risk factor for the onset of depression, and conversely promoted by chronic administration of antidepressants (Non-Patent Documents 13, 14).
  • Non-patent Document 15 Non-patent Document 15
  • the present invention has been made in view of these problems, and aims to provide a cell preparation that has an effective therapeutic effect on diseases that can be expected to be treated by promoting tissue regeneration.
  • the cell preparation according to the present invention is characterized by having CD18-positive cells.
  • a cell preparation having an effective therapeutic effect on ischemic diseases can be obtained. Further, according to the present invention, neurogenesis in the hippocampus can be effectively promoted.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the therapeutic effects of cord blood mononuclear cells with and without aggregates.
  • FIG. 2 is a diagram comparing the therapeutic effects of heparin treatment and ACD treatment on cord blood mononuclear cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes in the expression of various adhesion factors related to cell-to-cell bonding before and after heparin treatment.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between therapeutic effects and CD18 in cord blood mononuclear cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between therapeutic effects and connexin 43 or Glut1.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in the expression of CD18 in cord blood mononuclear cells before freezing and after freezing and thawing.
  • FIG. 2 is a diagram showing that CD34-positive cells express Jagged1.
  • FIG. 2 is a diagram showing that stimulation with Jagged1 promotes VEGF uptake by HUVECs.
  • FIG. 3 is a diagram showing quantitative evaluation of the number of newly born neurons in the hippocampal dentate gyrus. It was found that administration of CD18-positive cells resulted in a statistically significant increase in both Nestin-positive cells (A) and DCX-positive cells (B).
  • the cell preparation according to the present invention is characterized by having CD18-positive cells.
  • the CD18-positive cells are stem cells.
  • Stem cells are cells that have the ability to differentiate into various cells and the ability to self-renew. Examples include adult stem cells and pluripotent stem cells.Adult stem cells exist in each tissue of an adult. , are stem cells that have not completed their final differentiation and have a certain degree of multipotency, such as hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, intestinal epithelial stem cells, hair follicle stem cells, and pigment stem cells.
  • Pluripotent stem cells have the ability to differentiate into all types of cells that make up a living body, and continue to proliferate indefinitely while maintaining pluripotency when cultured in vitro under appropriate conditions.
  • Examples of such cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ stem cells (EG cells), germline stem cells (GS cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • the stem cells are preferably hematopoietic stem cells.
  • Hematopoietic stem cells are cells that have multipotency that can differentiate into all blood cell differentiation lineages, and are capable of self-renewal while maintaining their multipotency.
  • Hematopoietic stem cells are usually isolated from the tissue using the expression of a surface marker specific to the cells (hematopoietic stem cell-specific marker) as an indicator. Regarding the expression of such markers, hematopoietic cells of human origin are usually characterized as CD34 positive. More specifically, hematopoietic stem cells are CD34 positive (+) CD38 negative (-) CD90 positive (+) CD45RA negative (-) cells, preferably CD34 + CD38 - CD90 + CD45RA - CD49f + cells.
  • tissue from which hematopoietic stem cells are derived is not particularly limited as long as the cells are present, but hematopoietic tissues are preferred, and examples include bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, liver, and the like.
  • CD34-positive cells refer to cells enriched for CD34-positive cells, and can be obtained from samples such as bone marrow, peripheral blood, placenta, umbilical cord blood, etc., by enriching CD34-positive cells according to methods well known in the art. I can do it. Enrichment of CD34-positive cells can be performed using, for example, CD34-immobilized beads or a cell sorter. A preferred example of CD34-positive cells is CD34-positive mononuclear cells.
  • hematopoietic stem cells of the present invention are allogeneic cells for medical convenience, they do not exclude autologous cells.
  • hematopoietic stem cells are prepared from an allogeneic cord blood sample of the pharmaceutical composition of the invention, and in another embodiment, hematopoietic stem cells are prepared from a banked cell population.
  • Integrins are molecules that are expressed in various cells and play an important role in cell adhesion. Integrin is a dimeric cell membrane-spanning protein consisting of an ⁇ chain and a ⁇ chain, and 24 types of integrins are formed from 18 ⁇ chains and 8 ⁇ chains.
  • CD18 is also called leukocyte integrin and is specifically expressed on leukocytes.
  • the present inventors focused on the fact that CD18 is expressed in hematopoietic stem cells other than leukocytes, and found that CD18 plays an important role in cell adhesion of hematopoietic stem cells.
  • CD18 normally cannot bind to a ligand, but upon activation it undergoes a reversible steric structural change and becomes able to bind to a ligand.
  • CD18-positive cells are a cell population in which the proportion of cells exhibiting a CD18-positive reaction as determined by flow cytometry analysis is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more.
  • CD18-positive cells have an MIF of CD18 antigen that is at least 2 times, preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more the MIF (mean fluorescence intensity) when reacting with an isotype control antibody. It is possible to create a cell population that can be maintained.
  • Glucose transporter (Glut) is a membrane protein called a sugar transport carrier on the cell membrane that is required for glucose to pass through biological membranes.
  • 13 types of Glut have been reported (GLUT-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, HMIT).
  • Glut 1 to Glut 4 which belong to class I, are relatively well understood, and each has a molecular weight of approximately 50 kDa and can penetrate the cell membrane 12 times. They have a common structure.
  • Type I glucose transporter (Glut1) plays an important role in transporting glucose from cerebral blood vessels to the brain, and the present inventors have discovered that Glut1 is deeply related to the expression of effects of hematopoietic stem cells.
  • Connexin 43 is a general term for a family of connecting membrane proteins that constitute gap junctions. More than 12 subtypes of connexins have been discovered, depending on their molecular weight. The one with a molecular weight of 26 kDa is called connexin 26, and the one with a molecular weight of 43 kDa is called connexin 43. Connexin 43, a member of the connexin family, is present in large quantities in the central nervous system and cardiac muscle cells, and a decrease in its amount is presumed to have adverse effects such as arrhythmia. The present inventors have discovered that connexin 43 is deeply related to the expression of effects on hematopoietic stem cells.
  • Jagged1 is a ligand for the Notch receptor.
  • the Notch signaling pathway is very important in intercellular communication.
  • Jagged1 is deeply related to the expression of effects on hematopoietic stem cells.
  • the mechanism by which hematopoietic stem cells promote vascular regeneration is a simple cell-cell interaction (interaction between hematopoietic stem cells and damaged vascular endothelial cells) immediately after cell administration, which promotes engraftment, proliferation, and differentiation of transplanted stem cells. is not necessary.
  • CD18 is expressed, the administered hematopoietic stem cells will effectively adhere to vascular endothelial cells. If Connexin is expressed, the administered hematopoietic stem cells will effectively connect to vascular endothelial cells through gap junctions.
  • glucose transporters When glucose transporters (Glut) are expressed, energy is effectively provided from glucose-rich hematopoietic stem cells to vascular endothelial cells via gap junctions. If Jagged1 is expressed, intercellular communication between the administered hematopoietic stem cells and vascular endothelial cells becomes effective.
  • cell preparations that can be expected to have excellent therapeutic effects are cell preparations that are characterized by having CD18-positive cells.
  • the CD18-positive cells preferably express the glucose transporter Glut (particularly preferably Glut1), and the CD18-positive cells preferably express connexin (particularly preferably Connexin43);
  • the positive cells preferably express Jagged1.
  • Glut glucose transporter
  • connexin as an indicator of the ability to promote VEGF uptake
  • cell preparations that can be expected to have excellent therapeutic effects are (Connexin)-positive cells (preferably Connexin43-positive cells).
  • a cell preparation that can be expected to have an excellent therapeutic effect is a cell preparation characterized by having Jagged1-positive cells.
  • the cell preparation according to the present invention is for the treatment and/or prevention of diseases that can be treated by tissue neogenesis.
  • treatment includes curing symptoms, improving symptoms, and suppressing the progression of symptoms.
  • prevention includes suppressing and delaying the onset of a disease, and includes not only prevention before a disease develops, but also prevention against recurrence of a disease after treatment.
  • the cell preparation according to the present invention also targets ischemic diseases, and target diseases include, for example, cerebral infarction, myocardial infarction, limb ischemia, renal infarction, pulmonary infarction, splenic infarction, intestinal infarction, and the like.
  • target diseases include, for example, cerebral infarction, myocardial infarction, limb ischemia, renal infarction, pulmonary infarction, splenic infarction, intestinal infarction, and the like.
  • the cell preparation according to the present invention generates new microvessels in the ischemic periphery by administering stem cells that highly express CD18, thereby resolving ischemic diseases. It is not limited to those described in the examples.
  • the cell preparation according to the present invention when used for cerebral infarction, it can be used in any of the hyperacute, acute, subacute, and chronic stages; It can be suitably used for ischemic diseases, especially in the acute phase and subacute phase.
  • the hyperacute phase is the period within 12 hours after the onset of symptoms, and is a period when it is highly likely that tissue cell death can be prevented by stent surgery, thrombolytic therapy, thrombus removal, etc.
  • the acute phase is the period from 12 hours to 7 days after the onset of symptoms, and the subacute phase is from 1 week to 4 weeks after the onset of symptoms.
  • the chronic phase is a period of one month or more after the onset of symptoms.
  • it can be suitably used for ischemic diseases that progress chronically, such as limb ischemia due to chronic circulatory disorders, regardless of the timing.
  • the cell preparation according to the present invention is also targeted at diseases in which neurogenesis in the hippocampus contributes to treatment. That is, the cell preparation according to the present invention is a neurogenesis-promoting agent that is characterized by having CD18-positive cells and enables neurogenesis in the hippocampus.
  • the hippocampus is located at the base of the inferior horn of the lateral ventricle in the medial part of the temporal lobe of the brain, and is a cortical region essential for the formation of explicit memories such as episodic memories.
  • the dentate gyrus is an appendage of the hippocampus, and is referred to herein as part of the hippocampus.
  • the dentate gyrus consists of three layers: the central layer is the granule cell layer, the molecular layer with extremely low cell density is located immediately above, and the layer below is the granule cell layer. It is a polymorphic cell layer in which cells appear sparse.
  • the CD18-positive cells are connexin 43-positive. All tissues and organs of the adult have various types of connections between adjacent cells in order to maintain homeostasis as a tissue.
  • Connexin 43 is an important molecule for gap junctions between cells, and is expressed, for example, in osteoblasts, osteocytes, intravascular cells, nerve cells, etc. The present inventors have discovered that connexin 43-positive cells play an important role in neurogenesis in the hippocampus (particularly in the dentate gyrus). Connexin 43-positive cells are a cell population that highly expresses connexin 43.
  • Highly expressing connexin 43 is not particularly limited, but for example, the percentage of cells showing a positive reaction for connexin 43 in flow cytometry analysis is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more. % or more, more preferably 90% or more.
  • Preferred routes for administering the cell preparation of the present invention include intravenous administration, intraarterial administration, intraportal administration, and local tissue administration.
  • the number of cells to be administered is not particularly limited, and is appropriately set depending on the age, weight, disease or symptom of the target patient, and administration method.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains approximately 10 4 to 10 6 hematopoietic stem cells/Kg, preferably 10 4 or more/Kg, and more preferably 5 ⁇ 10 4 hematopoietic stem cells.
  • the dosage is prepared so that at least 5 x 10 5 cells/Kg, more preferably at least 5 x 10 5 cells/Kg, and if necessary 2 x 10 6 cells/Kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has hematopoietic stem cells of about 10 4 to 10 6 cells/Kg, preferably 10 4 cells/Kg or more, more preferably 5 ⁇ 10 4 cells/Kg.
  • the degree is prepared to be administered.
  • the total cell number is approximately 100 times greater than the above-mentioned number of hematopoietic stem cells.
  • angiogenesis promoting factor is not particularly limited, and for example, VEGF, angiopoietin, PDGF, TGF- ⁇ , FGF, PlGF, matrix metalloprotease, plasminogen activator, etc. can be used. , preferably angiopoietin.
  • Angiopoietin is a glycoprotein growth factor that promotes vasculogenesis or angiogenesis.
  • ANG4 angiopoietin-related proteins
  • ANGPTL angiopoietin-related protein, or angiopoietin-like protein).
  • additives commonly used in the art can be used as appropriate.
  • additives include tonicity agents, stabilizers, buffers, preservatives, chelating agents, antioxidants, solubilizing agents, and the like.
  • tonicity agent include sugars such as glucose, sorbitol, and mannitol, sodium chloride, glycerin, propylene glycol, and polyethylene glycol.
  • stabilizer include sodium sulfite.
  • the buffer include borate buffer, phosphate buffer, citrate buffer, tartrate buffer, acetate buffer, and the like.
  • Examples of the preservative include paraoxybenzoic acid ester, benzyl alcohol, chlorocresol, phenethyl alcohol, and benzethonium chloride.
  • Examples of the chelating agent include sodium edetate and sodium citrate.
  • Examples of the antioxidant include sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, sodium ascorbate, and sodium thiosulfate.
  • solubilizing agents include dextran, polyvinylpyrrolidone, sodium benzoate, ethylenediamine, salicylic acid amide, nicotinic acid amide, and polyoxyethylene hydrogenated castor oil derivatives.
  • Cell preparations containing highly CD18-expressing cells are manufactured by the following method, although not particularly limited.
  • a buffy coat layer from a sample containing hematopoietic stem cells
  • a step of obtaining mononuclear cells by removing inhibitory cells that inhibit the therapeutic effect from the buffy coat layer and a step of obtaining CD18 from the mononuclear cells.
  • obtaining highly expressing CD18high mononuclear cells obtaining highly expressing CD18high mononuclear cells.
  • a step of obtaining a buffy coat layer from a sample containing hematopoietic stem cells a step of obtaining mononuclear cells by removing inhibitory cells that inhibit the therapeutic effect from the buffy coat layer, and a step of obtaining CD34 from mononuclear cells.
  • the method includes a step of obtaining positive CD34 + mononuclear cells, and a step of obtaining CD34 + CD18high mononuclear cells highly expressing CD18 from the CD34-positive mononuclear cells.
  • the method also includes the steps of selecting a sample containing many CD18-highly expressing cells from a plurality of blood samples collected from a plurality of patients, and removing inhibitory cells that inhibit the therapeutic effect from the blood sample.
  • a step of increasing CD18-high expressing cells by applying a cytokine such as TNF ⁇ to the collected blood sample, and a step of increasing the CD18-high-expressing cells and removing inhibitory cells that inhibit the therapeutic effect from the blood sample. has.
  • umbilical cord blood, blood, and bone marrow fluid tend to coagulate, so heparin is often used as an anticoagulant.
  • heparin is not used, and coagulation is prevented by dilution with physiological saline and a divalent ion chelating agent. suppressed.
  • umbilical cord blood As a sample containing hematopoietic stem cells, umbilical cord blood, bone marrow fluid, or peripheral blood samples can be used, and umbilical cord blood samples are preferred.
  • Mononuclear cells that accumulate in the buffy coat are obtained from the cord blood sample by density gradient centrifugation.
  • density gradient centrifugation it is suitable to use commercially available media for density gradient centrifugation, such as Ficoll (registered trademark) and Percoll (registered trademark).
  • the buffy coat may contain inhibitory cells that inhibit the effectiveness of the therapeutic effect of the cell preparation. Therefore, it is desirable to remove inhibitory cells in the buffy coat.
  • Inhibitory cells in the buffy coat are neutrophils and dead cells.
  • the centrifugal force for separating inhibited cells is, for example, an upper limit of 1000 g, 900 g, 800 g, 700 g, 600 g, and a lower limit of 500 g, 400 g, such as 400-1000 g, 400-900 g, 400-800 g, 400 g. ⁇ 700g, 400 ⁇ 600g.
  • 400 to 800g more preferably 500 to 800g.
  • the sedimentation of the centrifuged buffy coat layer results in a fraction enriched with neutrophils and dead cells in the upper layer, and a fraction enriched with mononuclear cells in the lower layer.
  • neutrophils and dead cells in the upper layer of the sediment can be selectively removed.
  • hematopoietic stem cells are obtained from the mononuclear cells in the buffy coat.
  • Hematopoietic stem cells are obtained by enriching cells for CD34 positivity according to well-known methods. Enrichment of CD34-positive cells can be performed using CD34-immobilized beads or a cell sorter.
  • CD18-positive cells are obtained by concentrating CD34-positive mononuclear cells in the buffy coat.
  • cells highly expressing CD18 can be obtained using CD18-immobilized beads or a cell sorter.
  • CD34 + CD18 high mononuclear cells are obtained.
  • the order of CD34 + CD18 high is not limited to this embodiment; cells that highly express CD18 are first obtained from mononuclear cells in the buffy coat, and then CD34-positive cells are further concentrated from there. It is also possible.
  • Mononuclear cells were purified by Ficoll-Paque density centrifugation from cord blood in which no aggregates were generated and cord blood in which large aggregates were generated, and after washing with PBS, a co-culture test with HUVEC was conducted (Figure 1 ). Note that in FIG. 1, CBMNC indicates human umbilical cord blood-derived mononuclear cells.
  • the co-culture test was conducted as follows. Briefly, cord blood was gently layered onto an equal volume of Ficoll Paque and centrifuged at 400 g for 30 minutes. At this time, the accelerator and brake settings of the centrifuge were set to the minimum values. The buffy coat layer was collected from the cord blood sample after centrifugation, an equivalent amount of PBS containing 10% anticoagulant-citric acid-dextrose solution (ACD solution) was added, and the mixture was centrifuged again at 400 g for 5 minutes. The accelerator and brake settings of the centrifugal separator at this time do not need to be at the minimum values.
  • ACD solution anticoagulant-citric acid-dextrose solution
  • the sedimentation of the centrifuged buffy coat layer results in a fraction enriched with neutrophils and dead cells in the upper layer and a fraction enriched with mononuclear cells in the lower layer, so when removing the supernatant, gradually remove the container.
  • Neutrophils and dead cells in the upper layer of the precipitate were selectively removed by horizontally dissolving the precipitate.
  • HUVECs were cultured in HuMedia-EB2 medium with serum and growth additives according to the manufacturer's protocol, and then detached with trypsin and collected.
  • Allophycocyanin (APC)-labeled vascular endothelial growth factor (VEGF, final concentration 3 ⁇ g/mL) and the above cord blood mononuclear cells (1 X 10 6 cells) were added to the collected HUVECs (1 Incubate for 3 hours at 37°C, 5% CO2 in well plates.
  • the cell mixture was washed twice with phosphate buffered saline (PBS), and Phycoerythrin (PE)-labeled anti-human CD31 antibody (BD Bioscience), FITC (Fluorescein isothiocyanate)-labeled anti-human CD45 antibody purchased from BD Bioscience, and The cells were stained with 7AAD (7-Aminoactinomycin D), and the level of APC-labeled VEGF incorporated into vascular endothelial cells (CD31 positive, CD45 negative, and 7AAD negative) was evaluated using a FACS Canto II cell analyzer (BD Bioscience).
  • PBS phosphate buffered saline
  • PE Phycoerythrin
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • Vascular endothelial cells in which angiogenesis has occurred take in VEGF from outside the cell, so cord blood with a higher value of VEGF strongly promotes angiogenesis.In other words, cord blood is considered to be highly effective in treating cerebral infarction. Ta.
  • umbilical cord blood was gently layered onto an equivalent amount of Ficoll Paque and centrifuged at 400 g for 30 minutes. At this time, the accelerator and brake settings of the centrifuge were set to the minimum values. After centrifugation, separate the buffy coat layer from the cord blood sample, add PBS containing heparin to a final concentration of 2 units/mL, centrifuge again at 400 g for 5 minutes, and remove the buffy coat layer. was precipitated. Furthermore, to remove neutrophils and dead cells contained in the mononuclear class fraction, it was centrifuged at 400 g for 5 minutes and passed through a 40 ⁇ m filter. The above-mentioned co-culture test was conducted on the cord blood mononuclear cells thus obtained.
  • umbilical cord blood was layered on an equivalent amount of Ficoll Paque and centrifuged at 400 g for 30 minutes.
  • the buffy coat layer was separated from the cord blood sample after centrifugation, an equivalent amount of PBS containing 10% anticoagulant-citric acid-dextrose solution (ACD solution) was added, and the mixture was centrifuged again at 400 g for 5 minutes.
  • ACD solution anticoagulant-citric acid-dextrose solution
  • To collect the precipitate from the buffy coat layer remove the supernatant by gradually leveling the container, resuspend the precipitate in PBS, centrifuge at 400 g for 5 minutes, and pass through a 40 ⁇ m filter. did.
  • the mononuclear cell suspension after passing through the filter was aliquoted and centrifuged at 400 g for 5 min.
  • the adhesion factors whose expression was significantly changed by heparin treatment were integrin ⁇ 5, C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4), and CD18, and among these molecules, heparin treatment significantly reduced the expression of some molecules and others that did not significantly reduce the expression. existed.
  • CD18 showed a significant change in expression upon heparin treatment.
  • umbilical cord blood was layered on an equivalent amount of Ficoll Paque and centrifuged at 400 g for 30 minutes.
  • the buffy coat layer was separated from the cord blood sample after centrifugation, an equivalent amount of PBS containing 10% anticoagulant-citric acid-dextrose solution (ACD solution) was added, and the mixture was centrifuged again at 400 g for 5 minutes.
  • the precipitate of the buffy coat layer was separated by removing the supernatant by gradually leveling the container.
  • the precipitate was resuspended in PBS, centrifuged at 400 g for 5 minutes, passed through a 40 ⁇ m filter, and resuspended in PBS.
  • a portion of the same suspension was collected and stained with PE-labeled anti-human CD34 antibody, 7AAD, FITC-labeled anti-human CD45 antibody, and APC-labeled CD18 antibody.
  • HUVECs (1 x 10 5 cells) were incubated with allophycocyanin (APC)-labeled vascular endothelial growth factor (VEGF, final concentration 3 ⁇ g/mL) and cord blood mononuclear cells (1 x 10 4 CD34-positive cells). The test was carried out under the conditions that the number of cells included) was added.
  • APC allophycocyanin
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the left side of Figure 4 shows the difference in VEGF uptake ability of HUVECs for each type of co-cultured cord blood.
  • the right side of FIG. 4 shows the correlation between the expression of CD18 in hematopoietic stem cells (CD34 positive and 7AAD negative) and the VEGF uptake ability of HUVEC in a co-culture experiment.
  • the buffy coat layer precipitate was resuspended in PBS, passed through a 40 ⁇ m filter after centrifugation at 400 g for 5 min, resuspended in PBS, and then a portion of the same suspension was was fractionated and stained with PE-labeled anti-human CD34 antibody, 7AAD, FITC-labeled anti-human CD45 antibody, and APC-labeled glucose transporter (Glut1) antibody. Furthermore, a co-culture test with HUVEC (see (1) above) was conducted using the remaining suspension.
  • HUVECs (1 x 10 5 cells) were incubated with allophycocyanin (APC)-labeled vascular endothelial growth factor (VEGF, final concentration 3 ⁇ g/mL) and cord blood mononuclear cells (1 x 10 4 CD34-positive cells).
  • APC allophycocyanin
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the test was carried out under the conditions that the number of cells included) was added.
  • the right side of FIG. 5 shows the correlation between the expression of glucose transporter (Glut1) in hematopoietic stem cells (CD34 positive, CD45 positive, and 7AAD negative) and the VEGF uptake ability of HUVEC in a coculture experiment. It was found that the expression intensity of glucose transporter (Glut1), which is an indicator of the ability to promote VEGF uptake, is useful as a marker for selecting mononuclear cells with high therapeutic efficacy.
  • the buffy coat layer precipitate was resuspended in PBS, passed through a 40 ⁇ m filter after centrifugation at 400 g for 5 min, resuspended in PBS, and then a portion of the same suspension was was fractionated and stained with PE-labeled anti-human CD34 antibody, 7AAD, FITC-labeled anti-human CD45 antibody, and APC-labeled connexin 43 (Connexin43) antibody. Furthermore, a co-culture test with HUVEC (see (1) above) was conducted using the remaining suspension.
  • HUVECs (1 x 10 5 cells) were incubated with allophycocyanin (APC)-labeled vascular endothelial growth factor (VEGF, final concentration 3 ⁇ g/mL) and cord blood mononuclear cells (1 x 10 4 CD34-positive cells).
  • APC allophycocyanin
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the test was carried out under the conditions that the number of cells included) was added.
  • the left side of FIG. 5 shows the correlation between the expression of connexin 43 in hematopoietic stem cells (CD34 positive, CD45 positive, and 7AAD negative) and the VEGF uptake ability of HUVEC in a co-culture experiment. It was found that the expression intensity of connexin 43 (Connexin 43), which is an indicator of the ability to promote VEGF uptake, is useful as a marker for selecting mononuclear cells with high therapeutic efficacy.
  • a mononuclear cell fraction was collected from the umbilical cord blood by the Ficoll-Paque density centrifugation method described above, and the mononuclear cell fraction was divided into equal parts.
  • CD34 positive, CD45 positive, and 7AAD negative levels were assessed with a FACS Canto II Cell Analyzer (BD Bioscience).
  • cryoprotectant Cell Banker
  • cord blood mononuclear cells that highly express CD18 decreased significantly before freezing and after freezing and thawing, whereas the cord blood mononuclear cells that express low CD18 CD18 expression remained low before freezing and after freezing and thawing.
  • the highly therapeutically effective cell collection method of the present invention had the following steps. That is, a cell collection method comprising a collection step of collecting human bone marrow fluid using a diluted solution that does not contain heparin, and a separation step of adding a specific gravity centrifugation solution that does not contain heparin to the collected human bone marrow fluid and performing density centrifugation.
  • a cell collection method comprising a collection step of collecting human bone marrow fluid using a diluted solution that does not contain heparin, and a separation step of adding a specific gravity centrifugation solution that does not contain heparin to the collected human bone marrow fluid and performing density centrifugation.
  • the specific details in this example were as follows. 2 ml of physiological saline and a 23G injection needle were set in a 2.5 ml syringe.
  • Both ends of the mouse femur were cut with surgical scissors, a syringe needle was inserted into one end of the bone marrow cavity, and physiological saline was rapidly injected to obtain bone marrow fluid flowing out from the other end.
  • physiological saline is rapidly injected to obtain bone marrow fluid flowing out from the other end.
  • bone marrow fluid is easily coagulated, so anticoagulants such as heparin are often used, but in the present invention, heparin was not used, and coagulation of bone marrow fluid was suppressed only by dilution with physiological saline.
  • Bone marrow fluid whose coagulation was inhibited by diluting with physiological saline was layered on a specific gravity centrifugal solution (Ficoll-premium manufactured by GE), and after centrifugation at 600g for 20 minutes, the cell population in the buffy coat layer was collected.
  • Dead cells were excluded from the analysis using the 7AAD (7-Amino-Actinomycin D; manufactured by BD Bioscience, product number 559925, dilution factor 50 times) reagent. Each Iso type control was used as a negative control.
  • flow cytometry analysis confirmed that more than 90% of the cells expressed the CD18 antigen (Figure 7).
  • Analysis by flow cytometry is an analysis in which an antibody is directly or indirectly fluorescently labeled, a target cell population is measured with a flow cytometer, and the percentage of cells showing a positive reaction is calculated.
  • a positive reaction by flow cytometry means that the intensity of fluorescence at a specific wavelength emitted by the fluorescent dye used for labeling is higher than the background intensity measured without using the primary antibody. This refers to the case where it is included.
  • the brain was removed, fixed with 2% paraformaldehyde, sectioned with a thickness of 20 ⁇ m using a vibratome (Leica), and treated with anti-Nestin antibody (Merck Millipore, product). No.
  • DCX anti-Doublecortin antibody
  • DCX anti-Doublecortin antibody
  • DAPI for nuclear staining manufactured by Thermo Fisher, product number D1306, dilution factor 1:1,000 Staining was performed (CD18 cell-administered mice: 7 mice, 22 total sections; PBS-administered mice: 6 mice, 20 total sections).
  • Neurogenesis in the hippocampus is impaired in patients with diseases associated with impaired neurological function due to aging, but the present invention promotes neurogenesis in the hippocampus, making it possible to prevent and/or treat such diseases. Even in cases where neural function has declined due to aging, the present invention can improve and delay aging because neurogenesis in the hippocampus is promoted.
  • It can be used to treat cerebral infarction and age-related neurological disorders.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

虚血性疾患に対する効果的な治療効果を有する細胞製剤を提供する。CD18陽性細胞を有する細胞製剤である。この細胞製剤は、造血幹細胞を含む試料からバフィーコート層を取得し、バフィーコート層から治療効果を阻害する阻害細胞を除去することで単核球細胞を取得し、単核球細胞からCD34陽性であるCD34＋単核球細胞を取得し、CD34陽性単核球細胞からCD18を高発現しているCD34＋CD18high単核球細胞を取得することで製造される。

Description

細胞製剤
　本発明は、組織新生を促進することにより治療が期待できる疾患を治療するための細胞製剤等に関する。
　虚血性疾患により障害された組織の機能回復には、組織新生が重要であり、近年この機能回復には細胞移植が有効であることが判明している。非特許文献１には、心筋梗塞に対する、比重遠心法で得られた骨髄単核球細胞の投与が、心臓の微小血管網を新生し心機能の向上をもたらすことが記載されている。非特許文献２には、四肢虚血に対する、特異的細胞表面抗原を用いて精製された末梢血由来のCD34陽性細胞の投与が、四肢の微小血管網を新生し虚血症状の改善をもたらすことが記載されている。また非特許文献３には、四肢虚血に対する、比重遠心法で得られた骨髄単核球細胞の投与が、四肢の微小血管網を新生し虚血症状の改善をもたらすことが記載されている。非特許文献４には脳梗塞に対する、特異的細胞表面抗原を用いて精製された臍帯血由来のCD34陽性細胞の投与が、脳の微小血管網を新生し神経機能の向上をもたらすことが記載されている。また非特許文献５には、脳梗塞に対する、比重遠心法で得られた骨髄単核球細胞の投与が、脳の微小血管網を新生し神経機能の向上をもたらすことが記載されている。
　一方、自家造血幹細胞を用いた虚血性疾患の治療にはいくつかの問題点も存在する。例えば、急性期の虚血性脳梗塞患者では、血圧、心拍、呼吸状態や各種生理機能を含めた全身状態が不安定である。また、患者の意識レベルが低下していることも多く、通常は骨髄細胞採取に困難を伴う。そのため、麻酔科医や血液内科医の応援が困難な状況や自家骨髄液採取に伴う病状悪化や有害事象発生等のリスクが高い症例では、前記治療は困難である。このように、幹細胞輸注による虚血性疾患治療の普及には、採取法と調製・保存法が確立されている他家造血幹細胞の利用が理想的と考えられる。
　もっとも他家造血幹細胞の虚血性疾患治療への応用に際し、効果的な治療効果を示す細胞とそうではない細胞とが混在していることが知られている。非特許文献６には、他家造血幹細胞移植により微小血管網が障害され心筋梗塞後の症状悪化をもたらすことが記載されている。非特許文献７には、他家造血幹細胞移植により微小血管網が障害され脳梗塞後の症状悪化をもたらすことが記載されている。以上より、細胞移植、特に他家細胞移植による治療効果の発現のためには、効果的な治療効果を示す細胞とそうでない細胞とを選別し、有益な細胞の単離あるいは有害な細胞の除去による細胞製剤が必要となる。
　また、脳神経分野においても新生の重要性が示唆されている。これまでヒトやげっ歯類の成体の脳では神経細胞は増えることはないと考えられていたが、近年、海馬では絶えず新しいニューロンが生まれることが解った(非特許文献8,9)。
　新たに産み出されたニューロンは、神経ネットワークに組み込まれて機能する。海馬におけるニューロン新生(神経新生)は学習や豊かな環境下でその頻度が上昇する。
　しかしながら逆に加齢によって低下することが報告されている(非特許文献10,11)。University of Illinois at Chicago, The University of British Columbia, Rush University Medical Centerの研究グループは、海馬におけるニューロン新生が成人でも持続するが老齢者では激減することを報告し、ニューロン新生と認知状態が相関することを示唆した(非特許文献12)。
　うつ病や統合失調症等の精神疾患でも、脳内における神経新生が低下していることが報告され、これらの疾患の病態への関与が示唆されている。海馬における神経新生は、うつ病発症の危険因子とされるストレスによって抑制され、逆に抗うつ薬を慢性投与することによって促進される(非特許文献13,14)。
　アルツハイマー病では、海馬における神経新生が低下していることが報告され、病態に関与していることが示唆されている。アルツハイマー病に関連が深いアミロイド前駆蛋白遺伝子（APP）の遺伝子改変マウスを用いた検討により、アミロイドβ（Aβ）が海馬の神経新生低下に関与していることが示唆された(非特許文献15)。
　従って、海馬における神経新生を促進させることができれば、加齢に伴う神経機能低下に対しても、精神疾患に対しても、そして、認知症に対しても、新しい治療法の可能性が示唆されることになる。
Autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells improved heart function after myocardial infarction. Lin et al.  Acta Pharmacol Sin 2004 Jul; 25 (7): 876-886 Autologous transplantation of peripheral blood endothelial progenitor cells (CD34+) for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Kudo et al. Int Angiol. 2003 Dec;22(4):344-8 Therapeutic Angiogenesis by Autologous Bone-marrow Transplantation in a General Hospital Setting. Taguchi et al. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2003 Mar;25(3):276-8 Administration of CD34+cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model. Taguchi et al. J Clin Invest. 2004 Aug;114(3):330-8 Bone marrow mononuclear cells promote proliferation of endogenous neural stem cells through vascular niches after cerebral infarction. Nakano-Doi et al. Stem Cells. 2010 Jul;28(7):1292-302 A novel sialyl LewisX analog attenuates neutrophil accumulation and myocardial necrosis after ischemia and reperfusion. Lefer et al. Circulation. 1994 Nov;90(5):2390-401 Polymorphonuclear leukocytes occlude capillaries following middle cerebral artery occlusion and reperfusion in baboons. del Zoppo et al. Stroke. 1991 Oct;22(10):1276-83 Volume reduction in subcortical regions according to severity of Alzheimer’s disease. Roh et al. Neurol. 2011. 258:1013-1020 Dopamine depletion impairs precursor cell proliferation in Parkinson disease. Hoglinger et al. Nat. Neurosci. 2004. 7: 726-735 Hippocampal atrophy in recurrent major depression. Sheline et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. 93: 3908-3913 Neural stem cell proliferation is decreased in schizophrenia, but not in depression. Reif et al. Mol. Psychiatry 2006. 11: 514 - 522 Human Hippocampal Neurogenesis Persists in Aged Adults and Alzheimer’s Disease Patients. Tobin et al. Cell Stem Cell 2019. 24, 974-982.e1-e3 Adult neurogenesis in humans. Bergmann et al. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015 Jul 1;7(7):a018994. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Ernst et al. Cell 2014. 156, 1072-1083 Comparison of the value of PCNA and Ki-67 as markers of cell proliferation in ameloblastic tumors. Bologna-Molina et al. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal 2013. 18, e174-e179
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、組織新生を促進することにより治療が期待できる疾患に対する効果的な治療効果を有する細胞製剤を提供することを目的とする。
　本発明にかかる細胞製剤は、CD18陽性細胞を有することを特徴とする。
　本発明によれば、虚血性疾患に対して効果的な治療効果を有する細胞製剤が得られる。また、本発明によれば、海馬での神経新生を効果的に促進させることができる。
臍帯血単核球において、凝集塊ありと凝集塊なしの場合とで治療効果を比較する図である。 臍帯血単核球において、ヘパリン処理の場合とACD処理の場合とで治療効果を比較する図である。 ヘパリン処理の前後で、細胞と細胞との結合に関する各種接着因子の発現変化を示す図である。 臍帯血単核球において、治療効果とCD18との関係を示す図である。 治療効果とコネキシン43又はGlut1との関係を示す図である。 臍帯血単核球において、凍結前と凍結融解後とでCD18の発現変化を示す図である。 FACSによる細胞表面マーカー解析を示す図である。生細胞中、90％以上の細胞がCD18陽性であり(A)、60％以上の細胞がCX43陽性であることが示されている(B)。 CD34陽性細胞がJagged1を発現していることを示す図である。 Jagged1による刺激でHUVECによるVEGFの取り込みが促進されることを示す図である。 海馬歯状回における新生ニューロン数の定量的評価を示す図である。CD18陽性細胞投与により、Nestin陽性細胞(A)およびDCX陽性細胞(B)の両者が、統計学的にも有意に増加することが判明した。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本発明にかかる細胞製剤は、CD18陽性細胞を有することを特徴とする。CD18陽性細胞は幹細胞であることが好ましい。
　(1)幹細胞
　幹細胞は、様々な細胞への分化能、及び自己複製能を持つ細胞であり、例えば、成体幹細胞及び多能性幹細胞等が挙げられる
　成体幹細胞は、成体の各組織中に存在し、最終分化が未完了で、ある程度の多分化能を有する幹細胞であり、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、腸管上皮幹細胞、毛包幹細胞、色素幹細胞等が挙げられる。
　多能性幹細胞は、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能を有し、適切な条件下のインビトロでの培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞であり、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖幹細胞(EG細胞)、生殖系幹細胞(GS細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)等が挙げられる。
　本発明にかかる細胞製剤において、幹細胞は、好ましくは、造血幹細胞である。
　造血幹細胞は、血球の全ての血液細胞分化系列に分化し得る多分化能を有し、かつその多分化能を維持したまま自己複製することが可能な細胞である。
　造血幹細胞は、通常当該細胞に特異的な表面マーカー(造血幹細胞特異的マーカー)の発現を指標として、前記組織から単離される。かかるマーカーの発現に関し、ヒト由来の造血細胞は、通常、CD34陽性で特徴づけられる。より具体的には造血幹細胞は、CD34陽性(+)CD38陰性(-)CD90陽性(+)CD45RA陰性(-)細胞であり、好ましくは、CD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49f+細胞である。
　造血幹細胞が由来とする組織としては、当該細胞が存在する限り特に制限はないが、造血組織であることが好ましく、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、肝臓等が挙げられる。
　CD34陽性細胞は、CD34陽性について富化された細胞を意味し、骨髄、末梢血、胎盤、臍帯血等の試料から、当該分野で周知の方法に従い、例えばCD34陽性細胞を濃縮することにより得ることができる。CD34陽性細胞の濃縮は、例えばCD34固定化ビーズやセルソーターを使用して行うことができる。CD34陽性細胞の好ましい一例はCD34陽性単核球細胞である。
　本発明の造血幹細胞は、医療の利便性からは他家細胞であるが、自家細胞を排除するものではない。ある実施形態では、造血幹細胞は、本発明の医薬組成物の他家臍帯血試料から調製され、別な実施形態では、造血幹細胞は、バンク化された細胞集団から調製される。
　(2-1)CD18
　CD18はβ2インテグリン(integrin)ともいわれる。インテグリンはさまざまな細胞に発現をしている細胞接着に重要な役割を果たす分子である。インテグリンはα鎖とβ鎖からなる２量体の細胞膜貫通型蛋白質であり、18個のα鎖と8個のβ鎖から24種類のインテグリンが形成される。
　CD18は白血球インテグリンともよばれ、白血球に特異的に発現する。しかしながら本発明者はCD18が白血球以外の造血幹細胞等でも発現することに着目し、造血幹細胞の細胞接着に重要な役割を果たすことを見いだした。CD18は通常はリガンド結合ができないが、活性化を受けると可逆的な立体的な構造変化を起こしてリガンドに結合できるようになる。
　CD18陽性細胞は、例えばフローサイトメトリーによる解析でCD18陽性反応を示す細胞割合が60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90％以上である細胞集団である。
　また例えばCD18陽性細胞は、フローサイトメトリーアッセイにおいて、アイソタイプコントロール抗体を反応させた場合のMIF(平均蛍光強度)の2倍以上、好ましくは3倍以上、より好ましくは4倍以上のCD18抗原のMIFが維持できている細胞集団とすることが可能である。
　(2-2)グルコーストランスポーター(Glut)
　グルコーストランスポーター(Glut)は、グルコースが生体膜を通過するために必要とされる細胞膜上の糖輸送担体と呼ばれる膜タンパク質である。Glutには、現在13種類(GLUT-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, HMIT)が報告されているが、その発現部位や役割が比較的よく解明されているのはクラスIに属するGlut 1からGlut4の4種類の分子であり、その分子量はいずれも約50kDaで、細胞膜を12回貫通する共通した構造を有している。I型グルコーストランスポーター(Glut1)は脳の血管内から脳へブドウ糖を運ぶ重要な役割をしており、本発明者はGlut1が造血幹細胞の効果発現に深く関係することを見いだした。
　(2-3)コネキシン43(Connexin43)
　コネキシンは、ギャップ結合を構成する結合膜タンパク質ファミリーの総称である。コネキシンは、その分子量の違いによって、12を越えるサブタイプが発見されている。分子量が26kDaのものをコネキシン26、43kDaのものをコネキシン43と称されている。コネキシン43は、コネキシンファミリーの中で、中枢神経や心筋細胞に多く存在しており、その量が減少すると、不整脈などの悪影響を及ぼすと推定されている。本発明者はコネキシン43が造血幹細胞の効果発現に深く関係することを見いだした。
　(2-4)Jagged1
　Jagged1はNotch受容体のリガンドである。Notchシグナリング経路は細胞間情報伝達において非常に重要である。本発明者はJagged1が造血幹細胞の効果発現に深く関係することを見いだした。
　(2-5)
　即ち、造血幹細胞の血管再生促進メカニズムは、細胞投与直後のシンプルな細胞-細胞相互作用(造血幹細胞と障害を受けた血管内皮細胞との相互作用)であり、移植幹細胞の生着・増殖・分化は不要である。CD18が発現していれば投与された造血幹細胞が血管内皮細胞に効果的に接着する。コネキシン(Connexin)が発現していれば投与された造血幹細胞は血管内皮細胞にギャップ結合により効果的に連結する。グルコーストランスポーター(Glut)が発現していればグルコースを豊富に有する造血幹細胞から血管内皮細胞にギャップ結合を介して効果的にエネルギーが供与される。Jagged1が発現していれば投与された造血幹細胞と血管内皮細胞との細胞間情報伝達が効果的に可能となる。
　ゆえに優れた治療効果が期待できる細胞製剤は、CD18陽性細胞を有することを特徴とする細胞製剤である。CD18陽性細胞はグルコーストランスポーターGlut(特に好ましくはGlut1である。)を発現していることが好ましく、CD18陽性細胞はコネキシン(特に好ましくはConnexin43である。)が発現していることが好ましく、CD18陽性細胞はJagged1が発現していることが好ましい。
　また後述するように、VEGF取込み促進能の指標としてのグルコーストランスポーター(Glut)の発現強度は、治療効果の高い単核球の選別マーカーとして有用である。従って、優れた治療効果が期待できる細胞製剤は、Glut陽性細胞(好ましくはGlut1陽性細胞である。)を有することを特徴とする細胞製剤である。
　また後述するように、VEGF取込み促進能の指標としてのコネキシン(の発現強度は、治療効果の高い単核球の選別マーカーとして有用である。従って、優れた治療効果が期待できる細胞製剤は、コネキシン(Connexin)陽性細胞(好ましくはConnexin43陽性細胞である。)を有することを特徴とする細胞製剤である。
　また後述するように、幹細胞におけるJagged1の発現が再生促進作用に重要であることが確認されてる。従って、優れた治療効果が期待できる細胞製剤は、Jagged1陽性細胞を有することを特徴とする細胞製剤である。
　(3)細胞製剤
　本発明にかかる細胞製剤は組織新生により治療が期待できる疾患の治療及び／又は予防の為のものである。本明細書において「治療」には、症状を治癒すること、症状を改善すること及び症状の進行を抑えることが含まれる。一方「予防」には疾患の発症を抑えること及び遅延させることが含まれ、疾患になる前の予防だけでなく、治療後の疾患の再発に対する予防も含まれる。
　本発明にかかる細胞製剤は、虚血性疾患も対象としており、対象となる疾患は、例えば脳梗塞、心筋梗塞、四肢虚血、腎梗塞、肺梗塞、脾梗塞、腸管梗塞等である。本発明にかかる細胞製剤は、CD18を高発現する幹細胞を投与することにより、虚血周囲部での微小血管を新生させ、これにより虚血性疾患を解消するものであり、対象となる疾患は実施例記載のものに限定されるものではない。
　本発明にかかる細胞製剤を脳梗塞に使用する場合、超急性期、急性期、亜急性期、及び、慢性期の何れにおいても使用可能であるが、急性心筋梗塞や脳梗塞等、急性発症する虚血性疾患に対しては特に急性期及び亜急性期において好適に使用可能である。ここで、超急性期は発症してから12時間以内の期間であり、ステント術や血栓溶解療法、血栓除去等により組織細胞死を阻止できる可能性が高い時期である。急性期は発症してから12時間～７日以内の期間であり、亜急性期は発症してから１週～４週以内の期間である。慢性期は発症してから１か月以上の期間である。一方、慢性循環障害による四肢虚血等、慢性的に経過する虚血性疾患に対しては、時期に関係なく好適に使用可能である。
　本発明にかかる細胞製剤は、海馬での神経新生が治療に貢献する疾患も対象としている。即ち、本発明にかかる細胞製剤は、CD18陽性細胞を有することを特徴とし海馬での神経新生を可能とする神経新生促進剤である。
　近年では特定の脳領域である海馬においては成熟期においても神経幹・前駆細胞が存在し、それらが増殖、分化することにより神経細胞が新生されることが明らかにされている。新生された神経細胞は、神経ネットワークを形成し、記憶形成に関わる等重要な役割を果たしている。
　しかし加齢によって海馬における神経新生が阻害され、高齢者の神経機能の低下の一因となることが示唆されている。
　また、ストレスはうつ病等の精神疾患発症の危険因子と考えられているが、動物に拘束ストレスのような物理的・精神的ストレスを負荷した場合だけでなく、resident -intruder stress といった精神的ストレスのみを負荷した場合でも海馬神経幹・前駆細胞が減少することから、海馬神経新生の抑制がうつ病等の精神疾患の病因に関与している可能性が示唆されている。
　神経変性疾患に伴う認知症は、海馬における神経新生が低下していることが報告され、これらの疾患の病態への関与が示唆されている。
　従って、海馬での神経新生を促進させることにより、加齢による神経機能の低下の予防及び／又は治療が可能となり、また、加齢による神経機能の障害に伴う疾患の予防及び／又は治療が可能となる。更には、神経変性疾患に伴う認知症の予防及び／又は治療が可能となり、また、精神疾患の予防及び／又は治療が可能となる。
　海馬は大脳側頭葉の内側部で側脳室下角底部に位置し、エピソード記憶等の顕在性記憶の形成に不可欠な皮質部位である。歯状回は海馬の付属物であるが本明細書では海馬の一部とする。歯状回は三層からなり、中心をなす層として顆粒細胞層(granule cell layer)があり、すぐ上に位置するのが細胞密度の極めて低い分子層(molecularlayer)、そして下に位置する層は細胞がまばらに見える多形細胞層(polymorphic cell layer)である。
　CD18陽性細胞はコネキシン43陽性であることが好ましい。成体のあらゆる組織、臓器はその組織としての恒常性を維持するために隣接する細胞間にさまざまな形態の結合を有する。コネキシン43は細胞と細胞とのギャップ結合に重要な分子であり、例えば骨芽細胞、骨細胞、血管内細胞、神経細胞等において発現している。本発明者はコネキシン43陽性細胞が海馬における神経新生(特に歯状回における神経新生)に重要な役割を果たすことを見いだした。コネキシン43陽性細胞とは、コネキシン43を高発現している細胞集団である。コネキシン43を高発現しているとは、特に限定されるものではないが例えば、フローサイトメトリーによる解析でコネキシン43陽性反応を示す細胞割合が60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上である細胞である。
　本発明にかかる細胞製剤の投与経路は、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、局所組織投与が好適である。投与される細胞数は、特に限定されるものではなく、対象患者の年齢、体重、疾患や症状、投与方法に応じて適宜設定される。例えば、四肢虚血の場合であれば、本発明の医薬組成物は、造血幹細胞として、１０４個～１０６個／Ｋg程度、好ましくは１０４個／Ｋg以上、より好ましくは５×１０４個／Ｋg以上、さらに好ましくは５×１０５個／Ｋg以上、必要に応じて２×１０６個が投与されるように調製される。脳梗塞の場合であれば、本発明の医薬組成物は、造血幹細胞として、１０４個～１０６個／Ｋg程度、好ましくは１０４個／Ｋg以上、より好ましくは５×１０４個／Ｋg程度が投与されるように調製される。総細胞数(単核球細胞)は、上記造血幹細胞の数値よりも約１００倍多くなる。
　本発明においては、更に血管新生促進因子を含有することも可能である。血管新生促進因子は、特に限定されるものではないが、例えば、VEGF、アンジオポエチン(angiopoietin)、PDGF、TGF-β、FGF、PlGF、マトリックスメタロプロテアーゼ、プラスミノーゲンアクチベータ等を使用することができるが、好ましくはangiopoietinである。angiopoietinは、脈管形成(vasculogenesis)あるいは血管新生(angiogenesis)を促進する糖タンパク質の成長因子であり、angiopoietinには、アンジオポエチン1(Ang1)、アンジオポエチン2(Ang2)、アンジオポエチン3(Ang3)、アンジオポエチン4(Ang4)の4種類があるだけでなく、類似のタンパク質として6種類のアンジオポエチン関連タンパク質(ANGPTL：angiopoietin-related protein、または、angiopoietin-like protein)がある。
　本発明にかかる細胞製剤を注射用製剤とする場合は、当技術分野で通常使用されている添加剤を適宜用いることができる。添加剤としては、例えば、等張化剤、安定化剤、緩衝剤、保存剤、キレート剤、抗酸化剤、又は溶解補助剤等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、ソルビトール、マンニトール等の糖類、塩化ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。安定化剤としては、例えば亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、酢酸緩衝剤等が挙げられる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル、ベンジルアルコール、クロロクレゾール、フェネチルアルコール、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。キレート剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、デキストラン、ポリビニルピロリドン、安息香酸ナトリウム、エチレンジアミン、サリチル酸アミド、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体等が挙げられる。
　(4)細胞製剤の製造方法
　CD18高発現細胞を有する細胞製剤の場合、特に限定されるものではないが下記方法によって製造される。
　例えば、造血幹細胞を含む試料からバフィーコート層を取得する工程と、バフィーコート層から治療効果を阻害する阻害細胞を除去することで単核球細胞を取得する工程と、単核球細胞からCD18を高発現しているCD18high単核球細胞を取得する工程と、を有する。
　また例えば、造血幹細胞を含む試料からバフィーコート層を取得する工程と、バフィーコート層から治療効果を阻害する阻害細胞を除去することで単核球細胞を取得する工程と、単核球細胞からCD34陽性であるCD34＋単核球細胞を取得する工程と、CD34陽性単核球細胞からCD18を高発現しているCD34＋CD18high単核球細胞を取得する工程と、を有する。
　また例えば、複数の患者から採取した複数の血液試料からCD18高発現細胞を多く含む試料を選択する工程と、その血液試料から治療効果を阻害する阻害細胞を除去する工程と、を有する。
　また例えば、採取した血液試料にTNFα等のサイトカインを作用させることによりCD18高発現細胞を増加させる工程と、そのCD18高発現細胞を増加させ血液試料から治療効果を阻害する阻害細胞を除去する工程と、を有する。
　一般に臍帯血や血液、骨髄液は凝固しやすいためヘパリンを抗凝固剤として用いることが多いが、本発明ではヘパリンを使用せず、生理食塩水による希釈および二価イオンのキレート剤で、凝固を抑制した。
　造血幹細胞を含む試料として、臍帯血、骨髄液、又は末梢血試料を使用でき、好ましくは臍帯血試料である。
　臍帯血試料につき密度勾配遠心分離法によりバフィーコートに集積する単核球細胞を得る。密度勾配遠心分離法には、例えば、市販のフィコール(登録商標)、パーコール(登録商標)等の密度勾配遠心用媒体を用いることが好適である。
　バフィーコート中には細胞製剤の治療効果の有効性を阻害する阻害細胞が包含される場合がある。そのためバフィーコート中の阻害細胞を除去することが望ましい。バフィーコート中の阻害細胞は好中球や死細胞である。
　バフィーコート中の阻害細胞を除去するためには、バフィーコート層にバフィーコート層と等量のPBSを添加し、遠心分離をすることで阻害細胞を分離する。阻害細胞を分離するための遠心力は、例えば、上限は、1000g、900g、800g、700g、600gであり、下限は500g、400gであり、例えば400～1000g、400～900g、400～800g、400～700g、400～600g、の範囲である。好ましくは400～800g、より好ましくは500～800gである。
　遠心分離したバフィーコート層の沈殿は、上層に好中球や死細胞が濃縮された分画、下層に単核球が濃縮された分画となる。遠心分離後に上清を除去する時に、容器を徐々に水平にしていくことで、沈殿上層部分の好中球や死細胞が選択的に除去される。さらに、単核級分画中に含まれる好中球や死細胞を除去するために、同条件での遠心分離及び40μmのフィルターを通すのが望ましい。
　次にバフィーコート中の単核球細胞から造血幹細胞を得る。造血幹細胞は、周知の方法にしたがって、CD34陽性について細胞を濃縮することにより得る。CD34陽性細胞の濃縮は、CD34固定化ビーズやセルソーターを使用して行うことができる。
　次にバフィーコート中のCD34陽性単核球細胞からCD18陽性細胞を濃縮することにより得る。CD18陽性細胞の濃縮は、CD18固定化ビーズやセルソーターを使用してCD18が高発現している細胞を得ることができる。
　このようにしてCD34+CD18high単核球細胞を得る。なおCD34+CD18highの順はこの実施形態に限定されず、バフィーコート中の単核球細胞からまずCD18が高発現している細胞を得た後に、次にそこから更にCD34陽性細胞を濃縮することも可能である。
　(1)臍帯血単核球治療における凝集塊の影響
　骨髄単核球を用いた脳梗塞治療において、凝集塊が発生したロットでは著しく脳梗塞治療効果が低下することを見出している。そこで、臍帯血単核球においても同様のことが起こるのかを確かめる実験を行った。
　凝集塊が発生しなかった臍帯血と大きな凝集塊が発生した臍帯血からそれぞれ単核球をフィコールパーク比重遠心法で精製し、PBSで洗浄後、HUVECとの共培養試験を実施した(図１)。なお図１においてCBMNCはヒト臍帯血由来単核細胞を示す。
　共培養試験は下記のように実施した。即ち、臍帯血を当量のフィコールパーク上に静かに上層し、400 gで30分間遠心分離した。この時の遠心分離機のアクセル、ブレーキの設定は最小値で実施した。遠心分離後の臍帯血検体からバフィーコート層を分取し、当量の10%の抗凝固剤-クエン酸-デキストロース溶液(ACD液)を含むPBSを加え、再び400 gで5分間遠心分離した。この時の遠心分離機のアクセル、ブレーキの設定は最小値である必要はない。遠心分離したバフィーコート層の沈殿は、上層に好中球や死細胞が濃縮された分画、下層に単核球が濃縮された分画となるため、上清を除去する時に、容器を徐々に水平にしていくことで、沈殿上層部分の好中球や死細胞が選択的に除去した。さらに、単核級分画中に含まれる好中球や死細胞を除去するために400 gで5分間での遠心分離し、40μmのフィルターを通した。次に、HUVECをメーカーのプロトコルに従いHuMedia-EB2培地に血清及び増殖添加剤共に培養した後、トリプシンで剥離し回収した。回収したHUVEC(1 X 105個)にAllophycocyanin(APC)ラベルした血管内皮細胞増殖因子(VEGF、終濃度3μg/mL)及び上記の臍帯血単核球(1 X 106個)を加え、24ウェルプレートで37℃、5％CO2で、3時間インキュベートした。細胞混合物をリン酸緩衝液食塩水(PBS)で2回洗浄し、BD Bioscience 社から購入したPhycoerythrin(PE)標識抗ヒトCD31抗体(BD Bioscience)、FITC(Fluorescein isothiocyanate)標識抗ヒトCD45抗体、及び7AAD(7-Aminoactinomycin D)で染色し、血管内皮細胞中(CD31陽性、CD45陰性及び7AAD陰性)に取り込まれたAPCラベル化したVEGFのレベルをFACS Canto IIセルアナライザー(BD Bioscience)で評価した。血管新生が発生した血管内皮細胞は、細胞外からVEGFを取込むため、この数値が高かった臍帯血ほど血管新生を強く促す、別の言い方をすれば、脳梗塞治療効果の高い臍帯血と考えた。
　図１に示されるように、凝集塊が発生しなかったCBNMCの場合、CBNMCが存在することにより血管内皮細胞は多くVEGFを取り込んだ。しかしながら凝集塊が発生したCBNMCの場合、CBMNCが存在しても血管内皮細胞はVEGFをほとんど取り込むことはなかった。これにより臍帯血単核球も骨髄単核球と同様に、凝集塊が存在した単核球では、VEGF取込みを強く促進するものは一つもないと判明した。
　(2)ヘパリン処理による治療効果の低下
　共培養試験において、10%の抗凝固剤-クエン酸-デキストロース溶液(ACD液)を含むPBSを添加することを誤って、ヘパリンを終濃度2 unit/mLになるように調製したPBSを添加した。
　即ち臍帯血を当量のフィコールパーク上に静かに上層し、400 gで30分間遠心分離した。この時の遠心分離機のアクセル、ブレーキの設定は最小値で実施した。遠心分離後の臍帯血検体からバフィーコート層を分取し、誤って、ヘパリンを終濃度2 unit/mLになるように調製したPBSを加え、再び400 gで5分間遠心分離し、バフィーコート層を沈殿させた。さらに、単核級分画中に含まれる好中球や死細胞を除去するために400 gで5分間遠心分離し、40μmのフィルターを通した。このようにして得られた臍帯血単核球に対して、前述の共培養試験を実施した。
　ヘパリン処理の場合、通常のACD液を添加したPBSの場合と比較して、その臍帯血単核球を用いた共培養試験では、凝集塊が発生した場合と同等のVEGF取込みの低下が観察された(図２)。
　(3)接着因子の重要性の発見
　図２の結果から、造血幹細胞とHUVECとの細胞・細胞結合が重要と考えられる。そこで、造血幹細胞において、細胞・細胞結合に関与する各種接着因子の発現変化を、ヘパリン処理前後で比較した(図３)。
　即ち、臍帯血を当量のフィコールパーク上に上層し、400 gで30分間遠心分離した。遠心分離後の臍帯血検体からバフィーコート層を分取し、当量の10%の抗凝固剤-クエン酸-デキストロース溶液(ACD液)を含むPBSを加え、再び400 gで5分間遠心分離した。バフィーコート層の沈殿の分取は、上清除去は容器を徐々に水平にしていくことで実施し、同沈殿をPBSに再懸濁し、400 gで5分間の遠心分離後に40μmのフィルターを通した。フィルター通過後の単核球懸濁液を等分し、400 gで5分間遠心分離した。上清除去後、一方をPBSで、他方をヘパリンを終濃度2 unit/mLになるように調製したPBSでそれぞれ懸濁し、室温で５分間インキュベートした。次に、細胞懸濁液をPBSで洗浄し、PE(phycoerythrin)標識抗ヒトCD34抗体(BD Bioscience)、7AAD(7-Aminoactinomycin D) (BD Bioscience)、FITC(Fluorescein isothiocyanate)標識抗ヒトCD45抗体(BD Bioscience)、APC(allophycocyanin)標識した各種接着因子抗体〔インテグリンα4抗体(Beckman Coulter)、インテグリンα5抗体(Beckman Coulter)、CD18抗体(Beckman Coulter)、もしくはCXCR4抗体(MBL)で染色し、造血幹細胞(CD34陽性及び7AAD陰性)での各種接着因子の発現レベルをFACS Canto IIセルアナライザー(BD Bioscience)で評価した。
　図３に示されるように、造血幹細胞のホーミング、細胞接着に機能する代表的な接着因子であるインテグリンα4はヘパリン処理によって発現に有意な変化が認められなかった。
　ヘパリン処理によって有意に発現を変化させた接着因子は、インテグリンα5、C-X-Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)、CD18で、これら分子にもヘパリン処理によってその発現を大きく減ずるものと発現をほとんど低下させないものが存在した。とりわけ、ヘパリン処理によって大きな発現変化を示したのがCD18であった。
　(4)治療効果の高い単核球の選別マーカーの発見
　このようにVEGF取込みを強く促進する臍帯血単核球とそうでないものとが観察された。これら臍帯血造血幹細胞でのCD18の発現とVEGF取込み促進能との関係を調べたところ、両者には強い正相関が認められた(図４)。
　即ち、臍帯血を当量のフィコールパーク上に上層し、400 gで30分間遠心分離した。遠心分離後の臍帯血検体からバフィーコート層を分取し、当量の10%の抗凝固剤-クエン酸-デキストロース溶液(ACD液)を含むPBSを加え、再び400 gで5分間遠心分離した。バフィーコート層の沈殿は、上清除去は容器を徐々に水平にしていくことで上清を除去し分取した。同沈殿をPBSに再懸濁し、400 gで5分間の遠心分離後に40μmのフィルターを通し、再度PBSに懸濁した。次に、同懸濁液の一部を分取し、PE標識抗ヒトCD34抗体、7AAD、FITC標識抗ヒトCD45抗体、APC標識CD18抗体で染色した。
　さらに、残りの懸濁液を用いてHUVECとの共培養試験(前述の(1)参照)実施した。共培養実験は、HUVEC(1 X 105個)にAllophycocyanin(APC)ラベルした血管内皮細胞増殖因子(VEGF、終濃度3μg/mL)及び臍帯血単核球(CD34陽性細胞が1 X 104個含まれている細胞数)を加える条件で実施した。
　図4左は共培養した臍帯血ごとのHUVECでのVEGF取込み能の違いを示している。図４右は造血幹細胞(CD34陽性及び7AAD陰性)におけるCD18の発現と共培養実験におけるHUVECのVEGF取込み能との相関を示したものである。偶然のヘパリン処理という誤操作によって見出されたVEGF取込み促進能の指標としてのCD18の発現強度は、治療効果の高い単核球の選別マーカーとして有用であることが見出された。
　また、前述の実験において、バフィーコート層の沈殿をPBSに再懸濁し、400 gで5分間の遠心分離後に40μmのフィルターを通し、再度PBSに懸濁し、次に、同懸濁液の一部を分取し、PE標識抗ヒトCD34抗体、7AAD、FITC標識抗ヒトCD45抗体、APC標識グルコーストランスポーター(Glut1)抗体で染色した。さらに、残りの懸濁液を用いてHUVECとの共培養試験(前述の(1)参照)実施した。共培養実験は、HUVEC(1 X 105個)にAllophycocyanin(APC)ラベルした血管内皮細胞増殖因子(VEGF、終濃度3μg/mL)及び臍帯血単核球(CD34陽性細胞が1 X 104個含まれている細胞数)を加える条件で実施した。図５右は造血幹細胞(CD34陽性、CD４５陽性及び7AAD陰性)におけるグルコーストランスポーター(Glut1)の発現と共培養実験におけるHUVECのVEGF取込み能との相関を示したものである。VEGF取込み促進能の指標としてのグルコーストランスポーター(Glut1)の発現強度は、治療効果の高い単核球の選別マーカーとして有用であることが見出された。
　また、前述の実験において、バフィーコート層の沈殿をPBSに再懸濁し、400 gで5分間の遠心分離後に40μmのフィルターを通し、再度PBSに懸濁し、次に、同懸濁液の一部を分取し、PE標識抗ヒトCD34抗体、7AAD、FITC標識抗ヒトCD45抗体、APC標識コネキシン43(Connexin43)抗体で染色した。さらに、残りの懸濁液を用いてHUVECとの共培養試験(前述の(1)参照)実施した。共培養実験は、HUVEC(1 X 105個)にAllophycocyanin(APC)ラベルした血管内皮細胞増殖因子(VEGF、終濃度3μg/mL)及び臍帯血単核球(CD34陽性細胞が1 X 104個含まれている細胞数)を加える条件で実施した。図５左は造血幹細胞(CD34陽性、CD４５陽性及び7AAD陰性)におけるコネキシン43(Connexin43)の発現と共培養実験におけるHUVECのVEGF取込み能との相関を示したものである。VEGF取込み促進能の指標としてのコネキシン43(Connexin43)の発現強度は、治療効果の高い単核球の選別マーカーとして有用であることが見出された。
　(5)臍帯血単核球における凍結前と凍結融解後とでのCD18の発現
　実際、臍帯血単核球の凍結前と凍結融解後のCD18の発現を調べたところ、ヘパリン処理の場合と同様に、大きく発現低下するものと、ほとんど変化しないものがあった。前者はCD18を高発現しており、後者は発現が低いものであった(図６)。
　即ち、臍帯血から上述のフィコールパーク比重遠心法で単核球分画を分取し、その単核球分画を等分した。
　一方の単核球分画をPE標識抗ヒトCD34抗体、7AAD、FITC標識抗ヒトCD45抗体、APC標識CD18抗体で染色し、造血幹細胞(CD34陽性、CD４５陽性及び7AAD陰性)でのCD18抗原の発現レベルをFACS Canto IIセルアナライザー(BD Bioscience)で評価した。
　次に、残りの単核球分画に凍害保護液(Cell Banker)を加え、program freezerで凍結させ、液体窒素中で保存した。１週間後に凍結保存した単核球を解凍し、上記と同様の方法で造血幹細胞でのCD18抗原の発現レベルを評価した。
　図６に示されるように、CD18を高発現している臍帯血単核球は凍結前と凍結融解後でCD18の発現が大きく低下したが、CD18を低発現している臍帯血単核球は凍結前と凍結融解後でCD18の発現は低いままであった。
　次にCD18陽性細胞の有用性をさらに検証するために、下記の検討を行った。
　(6)CD18陽性細胞の採取
　本発明における治療効果の高い細胞回収方法は下記工程を有するものであった。即ち、ヘパリンを包含しない希釈液にてヒト骨髄液を採取する採取工程と、採取したヒト骨髄液にヘパリンを包含しない比重遠心液を加えて比重遠心を行う分離工程と、を有する細胞回収方法である。本実施例において具体的には以下であった。2.5mlシリンジに、2mlの生理食塩水及び23G注射針をセットした。マウス大腿骨の両端を手術用ハサミで切断し、骨髄腔の一端に注射針を差し込み、生理食塩水を素早く注入することにより、反対側の端より流出した骨髄液を得た。一般に骨髄液は凝固しやすいためヘパリン等の抗凝固剤を用いることが多いが、本発明ではヘパリンを使用せず、生理食塩水による希釈だけで、骨髄液の凝固を抑制した。
　生理食塩水で希釈し凝固を抑制した骨髄液を、比重遠心液(Ficoll-premium　GE製)に重層し、600gで20分間遠心後、バフィーコート層にある細胞集団を回収した。
　(7)CD18陽性細胞の検定
　細胞集団回収後、FACS(BD FACSCalibur)で、抗CD18抗体を用いて表面マーカー解析を行った。
　死細胞は7AAD(7-Amino-Actinomycin D; BD Bioscience製、製品番号559925、希釈倍率50倍)試薬を用いて、解析から除外した。ネガティブコントロールにはそれぞれのIso typeコントロールを用いた。
　細胞集団の特徴として、フローサイトメトリーによる解析で90％以上の細胞がCD18抗原を発現していることが確認できた(図７)。フローサイトメトリーによる解析とは、抗体を直接的又は間接的に蛍光標識し、対象となる細胞集団をフローサイトメータで測定して、陽性反応を示す細胞割合を算出する解析である。フローサイトメトリーによる反応が陽性というのは、標識に用いた蛍光色素が発光する特有の波長の蛍光の強度の中で、一次抗体を用いずに計測したバックグラウンドの強度より高い強度の蛍光域に含まれる場合をいう。
　同じように、細胞集団回収後、FACS(BD FACSCalibur)で、抗Jagged1抗体を用いて表面マーカー解析を行った。CD34陽性細胞は、Jagged1を発現していることが判明している(図８)。そこで、Jagged1分子の、再生促進効果に関して、検討を行うため、HUVECの培養液にJagged1活性を有するJagged1ペプチド(H-Cys-Asp-Asp-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Phe-Gly-Cys-Asn-Lys-Phe-Cys-Arg-Pro-Arg-OH)を添加し、そのVEGF取込促進作用を検討した。
　その結果、無刺激では1.04％のHUVECがVEGFを取り込んでいるのに対して、Jagged1による刺激で、5.30％のHUVECがVEGFを取り込むことが判明した(図９)。これらの結果より、幹細胞におけるJagged1の発現が、再生促進作用に重要であることが、確認された。
　(8)CD18陽性細胞の加齢マウスに対する投与
　上記細胞1x105個を、100 μlのPBSに懸濁し、尾静脈より合計5回、80週令以上のCB－17マウス(高齢マウス)に隔日投与した。コントロールは同量のPBSを静注した。
　最後の静脈内投与から24時間後に、脳を取り出し、2％のパラフォルムアルデヒドで固定後、ビブラトーム(ライカ製)で、厚さ20 μmの切片を作成し、抗Nestin抗体 (Merck Millipore製,製品番号MAB5326、希釈倍率1:200), 抗Doublecortin抗体 (DCX; Merck Millipore製, 製品番号AB2253、希釈倍率1:350)及び核染色用DAPI (Thermo Fisher製, 製品番号D1306、希釈倍率1:1,000)で、染色を行った(CD18細胞投与マウス：マウス７匹、総切片２２枚、PBS投与マウス：マウス６匹、総切片２０枚)。
　共焦点イメージはキーエンス製蛍光顕微鏡(BZ-X810)で撮像し、海馬歯状回の顆粒細胞層における新生ニューロンマーカー(Nestin)陽性細胞、及び顆粒細胞層における新生ニューロン(DCX)陽性細胞を評価した。CD18陽性細胞投与の効果を定量的に評価するために、各新生ニューロンマーカー陽性細胞数をカウントした結果、CD18陽性細胞投与により、切片一枚あたりのNestin陽性細胞(図１０A)及びDCX陽性細胞(図１０B)の両者が、統計学的にも有意に増加することが判明した。
　加齢による神経機能の障害に伴う疾患患者では、海馬における神経新生が障害されているが本発明によれば海馬における神経新生が促進されるのでかかる疾患の予防及び／又は治療が可能となる。加齢により神経機能が低下している場合でも、本発明によれば海馬における神経新生が促進されるので老化を改善できるしまた老化を遅延させることができる。
　脳梗塞治療や加齢による神経障害の治療に利用できる。

Claims (26)

  1. 　CD18陽性細胞を有することを特徴とする細胞製剤。
  2. 　前記CD18陽性細胞はグルコーストランスポーター(Glut)が発現していることを特徴とする請求項１に記載の細胞製剤。
  3. 　前記グルコーストランスポーターはI型グルコーストランスポーター(Glut1)であることを特徴とする請求項２に記載の細胞製剤。
  4. 　前記CD18陽性細胞はコネキシン(Connexin)が発現していることを特徴とする請求項１に記載の細胞製剤。
  5. 　前記コネキシン(Connexin)はコネキシン43(Connexin43)であることを特徴とする請求項４に記載の細胞製剤。
  6. 　前記CD18陽性細胞はJagged1が発現していることを特徴とする請求項１に記載の細胞製剤。
  7. 　前記CD18陽性細胞は、グルコーストランスポーター(Glut1)及びコネキシン43(Connexin43)が発現していることを特徴とする請求項１に記載の細胞製剤。
  8. 　前記CD18陽性細胞は、グルコーストランスポーター(Glut1)、コネキシン43(Connexin43)及びJagged1が発現していることを特徴とする請求項１に記載の細胞製剤。
  9. 　前記CD18陽性細胞は幹細胞であることを特徴とする請求項１記載の細胞製剤。
  10. 　前記幹細胞は成体幹細胞であることを特徴とする請求項９に記載の細胞製剤。
  11. 　前記成体幹細胞は造血幹細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞製剤。
  12. 　前記造血幹細胞はCD34陽性骨髄単核球細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の細胞製剤。
  13. 　前記造血幹細胞はCD34陽性臍帯血単核球細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の細胞製剤。
  14. 　前記細胞製剤は、脳機能改善剤、脳代謝賦活剤、脳循環改善剤、神経伝達機能改善剤、脳保護剤、又は、記憶障害改善剤であることを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１項に記載の細胞製剤。
  15. 　前記CD18陽性細胞は、フローサイトメトリーによる解析でCD18陽性反応を示す細胞割合が90％以上である細胞集団であることを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１項に記載の細胞製剤。
  16. 　CD18陽性細胞を有することを特徴とする、海馬での神経新生促進剤。
  17. 　前記海馬は海馬歯状回であることを特徴とする請求項１６に記載の神経新生促進剤。
  18. 　前記CD18陽性細胞は、コネキシン43(Connexin43)陽性であることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の神経新生促進剤。
  19. 　前記CD18陽性細胞は、フローサイトメトリーによる解析でコネキシン43陽性反応を示す細胞割合が60％以上である細胞集団であることを特徴とする請求項１８に記載の神経新生促進剤。
  20. 　加齢による神経機能の低下の予防及び／又は治療に用いられることを特徴とする請求項１６乃至１９の何れか１項に記載の神経新生促進剤。
  21. 　加齢による神経機能の障害に伴う疾患の予防及び／又は治療に用いられることを特徴とする請求項１６乃至１９の何れか１項に記載の神経新生促進剤。
  22. 　精神疾患の予防及び／又は治療に用いられることを特徴とする請求項１６乃至１９の何れか１項に記載の神経新生促進剤。
  23. 　前記精神疾患は、うつ病、統合失調症、双極性障害、又は、自閉スペクトラム症の何れかから選択されることを特徴とする請求項２２に記載の神経新生促進剤。
  24. 　認知症の予防及び／又は治療に用いられることを特徴とする請求項１６乃至１９の何れか１項に記載の神経新生促進剤。
  25. 　前記認知症は、アルツハイマー型認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、大脳皮質基底変性症、進行性核上性麻痺、又は、パーキンソン病の何れかから選択される神経変性疾患である請求項２４記載の神経新生促進剤。
  26. 　ヒト骨髄液を採取し、比重遠心によりヒト骨髄液由来の細胞集団を分離する、細胞回収方法であって、
    　ヘパリンを包含しない希釈液にてヒト骨髄液を採取する採取工程と、
    　採取したヒト骨髄液にヘパリンを包含しない比重遠心液を加えて比重遠心を行う分離工程と、
    を有することを特徴とする細胞回収方法。
PCT/JP2023/007766 2022-03-23 2023-03-02 細胞製剤 WO2023181830A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-046721 2022-03-23
JP2022046721 2022-03-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023181830A1 true WO2023181830A1 (ja) 2023-09-28

Family

ID=88100694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/007766 WO2023181830A1 (ja) 2022-03-23 2023-03-02 細胞製剤

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023181830A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070031387A1 (en) * 2005-08-08 2007-02-08 Kyoto University Method for treating and/or preventing spinal cord injury
US20070248998A1 (en) * 2004-09-03 2007-10-25 Li Zhang Integrin CD18 is a Novel Stromal Stem Cell Marker and Functions to Promote Osteogenesis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070248998A1 (en) * 2004-09-03 2007-10-25 Li Zhang Integrin CD18 is a Novel Stromal Stem Cell Marker and Functions to Promote Osteogenesis
US20070031387A1 (en) * 2005-08-08 2007-02-08 Kyoto University Method for treating and/or preventing spinal cord injury

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIHIKO TAGUCHI, TOSHIHIRO SOMA, HIDEKAZU TANAKA, TAKAYOSHI KANDA, HIROYUKI NISHIMURA, HIROO YOSHIKAWA, YOSHITANE TSUKAMOTO, HIROY: "Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model", THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 114, no. 3, 1 August 2004 (2004-08-01), GB , pages 330 - 338, XP008146070, ISSN: 0021-9738, DOI: 10.1172/JCI20622 *
MESA-NÚÑEZ CRISTINA, LEON-RICO DIEGO, ALDEA MONTSERRAT, DAMIÁN CARLOS, SANCHEZ-BALTASAR RAQUEL, SANCHEZ REBECA, ALBERQUILLA OMAIRA: "The downregulated membrane expression of CD18 in CD34+ cells defines a primitive population of human hematopoietic stem cells", STEM CELL RESEARCH & THERAPY, vol. 11, no. 1, 1 December 2020 (2020-12-01), pages 1 - 9, XP093095764, DOI: 10.1186/s13287-020-01672-0 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shafei et al. Mesenchymal stem cell therapy: A promising cell‐based therapy for treatment of myocardial infarction
Tobin et al. Activated mesenchymal stem cells induce recovery following stroke via regulation of inflammation and oligodendrogenesis
EP2874634B1 (en) Use of preparations comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells (mscs) in the prevention and therapy of inflammatory conditions
Ballard et al. Vascular tenascin‐C regulates cardiac endothelial phenotype and neovascularization
CN103702674B (zh) 血小板裂解物的组合物、用途和制备
KR101730052B1 (ko) 심근경색의 수복 재생을 유도하는 다능성 간세포
US10869886B2 (en) Cell suspension for use in the treatment of lower extremity peripheral artery disease
RU2403906C2 (ru) Способ лечения ретинопатии при недоношенности и родственных ретинопатических заболеваний
JPWO2009020201A1 (ja) 単離された細胞集団
AU2007322084B2 (en) Isolated myeloid-like cell populations and methods of treatment therewith
WO2005007176A1 (ja) 間葉系細胞を有効成分とする体内投与用脳神経疾患治療薬
JP2010518004A (ja) 幹細胞ホーミングの増強および臓器機能障害または臓器不全の治療
US8574899B2 (en) Methods for augmentation collection of placental hematopoietic stem cells and uses thereof
Gortner et al. Regenerative therapies in neonatology: clinical perspectives
JP2017511125A (ja) 内皮コロニー形成細胞様細胞の生成方法
JP5602364B2 (ja) 幹細胞及び／又は前駆細胞の賦活剤
AU2006229687B2 (en) Isolated myeloid-like bone marrow cell populations and methods of treatment therewith
JP2007528229A (ja) 臍帯血から分離された多能性幹細胞及びこれを含有する虚血性壊死疾患治療用細胞治療剤
WO2023181830A1 (ja) 細胞製剤
JP7176766B2 (ja) Ｃｄ３１陽性ｃｄ４５陰性ｃｄ２００陽性の哺乳動物細胞からなる細胞集団、およびその利用
JPWO2015174087A1 (ja) 脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬
JP2022517531A (ja) 神経学的疾患のための二重幹細胞治療
Wang et al. Human Adipose Tissue Lysate‐Based Hydrogel for Lasting Immunomodulation to Effectively Improve Spinal Cord Injury Repair
JP2016506954A (ja) 神経変性の治療のための細胞療法
WO2022109446A1 (en) Extracellular vesicles derived from cardiosphere-derived cells as anti-shock therapeutics

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23774429

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1