CN113633663A - 诱导性多能干细胞分化来源的epc在制备脑卒中治疗剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了诱导性多能干细胞分化来源的EPC在制备脑卒中治疗剂中的应用。本发明通过将内皮祖细胞静脉注射到脑卒中动物模型中发现这一方式可通过抑制动脉粥样硬化、降低脑梗死水平、促进病灶脑组织血管新生、改善病灶脑组织炎症反应、修复神经损伤以及脑损伤从而达到治疗脑卒中的目的。本发明的上述研究成果为临床上治疗脑卒中提供了一种新的治疗方式。

Description

诱导性多能干细胞分化来源的EPC在制备脑卒中治疗剂中的 应用

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，涉及诱导性多能干细胞分化来源的EPC在制备脑卒中治疗剂中的应用。

背景技术

脑卒中（Stroke），又名中风，是一种突然起病的脑循环障碍性疾病，具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点。据2015年全球疾病负担报告的分析资料表明，在世界范围内，脑卒中已成为全球第二大致死疾病。我国现幸存脑卒中患者近 1250万，其中致残率高达75%，约有450万患者不同程度地丧失劳动能力或生活不能自理。缺血性脑卒中（Ischemic Stroke，IS）是最常见的脑卒中类型，占我国脑卒中的69.6~70.8%，其中，约80％的IS患者伴有颅内外动脉病变，大动脉粥样硬化性病变危害最大。大动脉硬化病变因局部急性血栓形成或栓子栓塞导致局限性脑组织缺血性坏死、功能障碍。大动脉粥样硬化型IS相较其它类型IS，复发率、致残率、致死率更高。西方国家IS患者大动脉粥样硬化以颅外动脉为主，而我国则以颅内动脉为主（intracranial atherosclerosis，ICAS）。

脑卒中是由血管、环境和遗传因素导致的多因素多基因的复杂疾病。脑动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS) 是缺血性脑卒中的主要原因。AS 是由于血管内皮细胞功能受损后，多种细胞及细胞因子参与的血管慢性炎症性病理过程。在病变进程中，单核细胞、巨噬细胞及T细胞介导的内皮损害，最终导致了粥样易损斑块的形成。易损斑块多具有脂质中心大、纤维帽薄、平滑肌细胞和胶原含量少、炎症细胞和炎症介质水平较高等特点。因其具有易损性而容易导致斑块破裂，以及破裂后形成血栓，造成血管腔阻塞。因此，稳定斑块是防治IS的有效途径。

目前对于缺血性脑卒中治疗手段十分有限，急性期最有效的治疗方法是溶栓治疗，但由于受到时间窗的限制，只有少数患者能从中受益，多数存活患者残留不同程度的功能障碍。其它常规手段包括药物治疗，如抗血小板聚集、他汀类药物降血脂、控制血压和血糖等，手术治疗，如颅内外血管内支架植入术、颈动脉内膜剥除术等。据2015年王拥军团队发表的文献显示，我国经阿司匹林进行治疗急性缺血性脑卒中的患者，1年内复发率为14%。2016年冯芹进行了288例阿司匹林治疗大动脉粥样硬化型缺血性脑卒中的研究中显示，阿司匹林单一治疗组的致残率仍高达52%。因此，临床上迫切需要新的干预手段治疗缺血性脑卒中。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种治疗脑卒中的方法，该方法包括使用iPSC（induced pluripotent stem cell，诱导性多能干细胞）分化的EPC（endothelial progenitor cell，内皮祖细胞）及EC（endothelial cell，内皮细胞）注射。本发明的方法可通过抑制动脉粥样硬化、降低脑梗死水平、促进病灶脑组织血管新生、改善病灶脑组织炎症反应、修复神经损伤以及脑损伤从而达到治疗脑卒中的目的。

根据本发明的一个方面，本发明提供了iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞在制备降低脑梗死水平的细胞治疗剂中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞在制备修复神经功能损伤的细胞治疗剂中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞在制备增加病灶脑组织免疫浸润的M2小胶质细胞数量的细胞治疗剂中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞在制备修复脑损伤的细胞治疗剂中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞在制备治疗脑卒中的细胞治疗剂中的应用。

进一步，所述脑卒中包括缺血性脑卒中与出血性脑卒中。

更进一步，所述缺血性脑卒中包括短暂性脑缺血发作、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、脑栓塞。

更进一步，所述出血性脑卒中包括脑出血、蛛网膜下腔出血。

在本发明的具体实施方案中，所述脑卒中是缺血性脑卒中，优选急性缺血性脑卒中。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞在制备BDNF中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞在制备促进M1型小胶质细胞向M2型小胶质细胞转换的细胞治疗剂中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞在制备激活小胶质细胞的细胞治疗剂中的应用。

iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞可以与载体一起以适合的形态进行剂型化，该载体为常用于细胞治疗的药学上允许的载体。故本发明的前面所述的细胞治疗剂包含内皮祖细胞或内皮细胞和药学上允许的载体。所谓“药学上允许的”是指生理学上允许的、且向人类给药时通常不会引起胃肠障碍、眩晕等过敏反应或与此类似反应的组合物。作为药学上允许的载体，例如有：水、合适的油、生理盐水、水溶性葡萄糖及乙二醇等非口服给药用载体等，还可进一步包括稳定剂及保存剂。合适的稳定剂为，亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸等抗氧化剂。合适的保存剂为，苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇。作为其它药学上允许的载体，可参考以下文献中记载的内容(Remington'sPharmaceutical Sciences,19th ed., Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。

本发明的细胞治疗剂通常以注射剂等非口服制剂的形态使用。作为非口服制剂中能够使用的载体，可列举例如生理盐水、含有葡萄糖、D-山梨糖醇等的等渗液等水性载体。

具体地，本发明注射剂中包含注射液，如生理盐水、乳酸钠林格液、复方电解质注射液、5％葡萄糖注射液、20％HSA 注射液、琥珀酰明胶注射液、琥珀酰明胶MIX注射液、MZJ注射液1、MZJ注射液2、MZJ注射液3、人血清蛋白注射液、勃脉力A、氯化钾注射液、硫酸镁注射液、碳酸氢钠注射液、葡萄糖氯化钠注射液、复方氯化钠注射液(林格氏液)、右旋糖酐20葡萄糖注射 液(小分子)、氨基酸注射液、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、 羟乙基淀粉40氯化钠注射液、注射用低分子量肝素钙、肝素钠注射液、注射用辅酶A、三磷酸胞苷二钠、注射用盐酸赖氨酸、维生素C注射液、胞磷胆碱氯化钠、注射用脂溶性维生素Ⅱ、注射用还原型谷胱甘肽、注射用脑蛋白水解物、脱氧核苷酸钠注射液、多种微量元素注射液Ⅱ、甘露醇注射液、盐酸精氨酸注射液、氯化钾注射液、注射用三磷酸胞苷二钠、注射用门冬氨酸鸟氨酸等。

所述注射剂中含有等渗或高渗溶液；优选地，所述溶液选自NaCl注射液(例如0.9％～2.7％NaCl注射液)、葡萄糖注射液(例如4％～5％葡萄糖注射液)、乳酸 钠林格注射液、复方电解质注射液、HSA注射液(例如10％～20％HSA注射液)、琥珀酰明胶 注射液(例如4％～5％琥珀酰明胶注射液)及其任意组合。

本发明的细胞治疗剂除了注射液之外还可以含有一种或多种注射剂附加剂，例如选自增溶剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、助悬剂、螯合剂、抗氧剂、抑菌剂、局麻剂、等渗调节剂、填充剂、保护剂及其任意组合。

进一步，本发明的所述细胞治疗剂还可以包括下述功能性成分中的任意一种或多种：

1）维持内皮祖细胞或内皮细胞活性的成分；

2）促进内皮祖细胞或内皮细胞增殖的成分；

3）促进内皮祖细胞分化的成分。

上述所述功能性成分包括血清替代物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、L- 丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、生长因子及其任意组合。

进一步，所述功能性成分包括KOSR、MSC无血清添加剂、UltroserTM G、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF及其任意组合。

作为另外一个替代方案，本发明的细胞治疗剂包含iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞的分泌物。

所述分泌物可以是iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞的培养上清，也可以是经过纯化的培养上清中含有的iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞的分泌因子。

包含分泌物的细胞治疗剂可以配制为医学领域已知的任何形式。例如，所述可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。注射剂的限定同前，此处不再赘述。

在本发明的具体实施方案中，所述细胞治疗剂为内皮祖细胞或内皮细胞与生理盐水的混合液。

本发明的细胞治疗剂可以经由任何常规途径给药，只要它能够达到目标组 织。另外，细胞治疗剂可以通过任何能能够将活性成分递送至靶细胞的设备给药。本发明的细胞治疗剂为非口服制剂的情况下，可以列举例如血管内给药(优选静脉内给药)、腹腔内给药、肠道内给药、皮下给药、被膜下给药等局部给药(被膜的意思是被覆各种器官的膜组织)。一个优选实施方式中，本发明的细胞治疗剂通过静脉内给药而对生物体给药。

本发明的细胞治疗剂可以通过以黏附在三维培养载体上的形态粘贴于生物体内发生疾病的部位、存在发生可能的部位或构成疾病的原因的部位或它们附近而对生物体局部给药。本实施方式中，形成三维培养载体的纤维的材料优选为生物相容性材料，特别优选为生物降解性聚合物。

本发明的细胞治疗剂可以以治疗有效量给药，本文使用的短语“治疗有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可能因多种因素而异，所述多种因素包括个体的类型、严重程度、年纪和性别，药物活性、药物敏感度、给药时间、给药途径、排放系数(discharge ratio)、治疗周期和共给药的药物以及医学领域周知的其他因素。

典型地，当有关疾病用包含未分化的细胞或者分化细胞作为活性成分的细胞治疗剂进行治疗时，所述细胞治疗剂依据细胞类型被分离，然后经由注射器被给予个体损伤部位。根据细胞类型分离细胞治疗剂的理由是防止细胞治疗剂效果下降，所述下降是由共给予细胞以及经由注射器的常规注射所致。

在某些实施方案中，所述细胞治疗剂的给药剂量不少于1×10⁴个/mL(例如不少于1×10⁴个/ml，不少于3×10⁴个/ml，不少于5×10⁴个/ml，不少于7×10⁴个/ml，不少于1×10⁵个/ml，不少于3×10⁵个/ml，不少于5×10⁵个/ml，不少于7×10⁵个/ml，不少于1×10⁶个/ml，不少于3×10⁶个/ml，不少于5×10⁶个/ml，不少于7×10⁶个/ml，不少于1×10⁶个/ml，不少于3×10⁶个/ml，不少于5×10⁶个/ml，不少于7×10⁶个/ml，不少于1×10⁶个/ml，不少于3×10⁶个/ml，不少于5×10⁶个/ml，不少于7×10⁶个/ml，不少于1×10⁶个/ml，不少于3×10⁶个/ml，不少于5×10⁶个/ml，不少于7×10⁶个/ml，不少于1×10¹⁰个/ml，不少于3×10¹⁰个/ml，不少于5×10¹⁰个/ml或不少于7×10¹⁰个/ml，又例如 1×10⁵-1×10⁸、7×10⁵-7×10⁶、1×10⁶-5×10⁶个/ml。

在某些实施方案中，所述细胞治疗剂的给药剂量不少于1×10³个/kg(例如不少于1×10³个/kg，不少于3×10³个/kg，不少于5×10³个/kg，不少于7×10³个/kg，不少于1×10⁴个/kg，不少于3×10⁴个/kg，不少于5×10⁴个/kg，不少于7×10⁴个/kg，不少于1×10⁵个/kg，不少于3×10⁵个/kg，不少于5×10⁵个/kg，不少于7×10⁵个/kg，不少于1×10⁶个/kg，不少于2×10⁶个/kg，不少于5×10⁶个/kg，不少于7×10⁶个/kg，不少于1×10⁷个/kg，不少于3×10⁷个/kg，不少于5×10⁷个/kg，不少于7×10⁷个/kg，不少于1×10⁸个/kg，不少于3×10⁸个/kg，不少于5×10⁸个/kg，不少于7×10⁸个/kg，不少于1×10⁹个/kg，不少于3×10⁹个/kg，不少于5×10⁹个/kg，不少于7×10⁹个/kg，不少于1×10¹⁰个/kg，不少于3×10¹⁰个/kg，不少于5×10¹⁰个/kg或不少于7×10¹⁰个/kg，又例如 1×10⁵-1×10⁸、7×10⁵-7×10⁶、1×10⁶-5×10⁶个/kg。

本发明的细胞治疗剂可以单独给予或与其他疗法联合给予。本发明的治疗剂与其他疗法的共给予可以同时地或者相继地进行。单个或者多个剂量均是可以的。重要的是，使用足以获得最大疗效而无副作用的最小可能量，在考虑所有因素的情况下。

脑卒中的其他疗法包括药物治疗或外科治疗。药物治疗主要分为溶栓类药物治疗，神经保护类药物，钙通道阻断剂和脑代谢激活剂治疗。

溶栓类药物包括阿替普酶，尿激酶，链激酶，重组链激酶，蚓激酶，克栓酶等。

神经保护类药物包括胞磷胆碱，脑蛋白提取物，小牛血清去蛋白提取物，神经节苷脂，还有抗氧化剂依达拉奉。

钙通道阻断剂包括尼莫地平，桂利嗪，氟桂利嗪等。

脑代谢激活剂比拉西坦，奥拉西坦，茴拉西坦等。

本发明的细胞治疗剂的用药方法是：

将0.1-0.2ml的细胞治疗剂以每分钟60滴的速度静脉注射完毕。

进一步，本发明的细胞治疗剂的静脉注射时间可以是脑卒中发病1天、2天、3天或多天。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种体外制备BDNF的方法，所述方法包括培养iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞。

进一步，所述方法包括获取iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞的培养上清。

进一步，所述方法包括从培养上清中分离纯化BDNF。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种体外促进M1型小胶质细胞转换为M2型小胶质细胞的方法，所述方法包括将M1型小胶质细胞与iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞接触，或将M1型小胶质细胞与iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞的分泌物接触，或将M1型小胶质细胞与前面所述的细胞治疗剂接触。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种治疗脑卒中的方法，所述方法包括给有需要者施用本发明前面所述的iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞、前面所述的iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞的分泌物、前面所述的细胞治疗剂。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如鼠、人。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本文使用的术语“内皮祖细胞”意指其分化指向内皮细胞的细胞。内皮祖细胞可通过分析转录因子或细胞表面抗原的表达模式来确认。例如，单独或组合测量转录因子或细胞表面抗原的表达模式，其中其表达水平未被检测到或低(即使在诱导分化之前被检测到)，并且在诱导分化之后显著增加。有效用于确认内皮祖细胞的标志物包括UBXN11，LRRC75A，MMACHC，FXYD5，VMP1，KRT18，YIPF2，CNP，SPATA21，SAP30L-AS1，SLC12A6，ANP32E，CTNNB1，VIM，CNN3，RPL8，YWHAH，SDC4，HIST1H4I，SRPX2，DNASE1，MYO19，SH3KBP1，ASAP1，RNF24，SPNS2，S100A11，SOX4，RNF214，PLP2，PIH1D2，SGPL1，ELK3，F3，UGDH，RBMS2，FMNL3，RPL6，ATP2A1，EFCAB10，SLC12A2，UCKL1-AS1，ARHGAP18，RPE，SFT2D2，CXCL16，PAICS，ZBTB11-AS1，CLIC1，CERS5，CCDC85C，DHRS7，CTRL，TYMS，SPCS1，IFITM3，RPS27，RPL34，MZF1-AS1，TRAM1，SUPT7L，NOL9，MFSD11，PLD4，NQO1，NEAT1，GNAS，LDHA，UNKL，LDHB，CENPK，C1orf174，HSP90B1，TCF7L2，LENG8，IQGAP3，ANKRD13D，NPC1，MYH11，ATP2B4，FANCD2，TNRC6B，DDX17，TIRAP，HERC4，DSTN，FOXP3，ABL2，KDELR2，CCDC50，PARK7，CAPN2，ACAP1，SLC13A4，SEPT11，RAPH1，KRT8，LMO3，CIRBP，CYP20A1，LY6E，FAM69A，PRSS3，MEST，NPB，CLMP，MSN，SUCLA2，PCMTD1，PSMC3，TOMM7，GCHFR，MEIS1，TRIAP1，USP34，SPAG1，RPL39L，PDK1，LARS，MAP4K4，QTRT1，CLK1，TSC22D1-AS1，IL1B，MKRN2OS，ARL16，TSPAN13，HMGCS1，PSAP，SLC44A2，TNFRSF10B，MSC，ENG，TLDC2，TRIM41，CPM，CREB3L2，NSUN6，AHCY，NCBP1，N4BP2L2，RAB31，RNF149，SRPK2，SBDS，NAMPT，AES，SERPINF1，RPS27L，HAUS2，AP4B1-AS1，KDM2B，USP6NL，TONSL，FBLIM1，SLC31A2，ADGRL1，EFHC1，SMAD9，SLC7A11，LPIN1，DDAH2，PID1，SCAF11，BBS1，PCYOX1，CD55，PMEL，TOR1B，UBQLN1，DUSP5，CUEDC2，FKBP5，LMF2，LYRM7，NSG1，SAT2，LMAN1，NFX1，COMMD1，CCPG1，NINJ1，RNASEH1，SPATA5，CENPW，DNAJC4，PTTG1，TMEM109，MCTS1，TMEM63A，FBN1，TPM1，MAVS，ADPRHL2，CTSK，INSIG1，C16orf74，MAZ，MEG3，RFTN2，AGAP6，GPC6，PDLIM5，SLC25A5-AS1，RSL1D1，FAM219B，CFLAR，GNPTAB，PIGU，ITGB3BP，NTM，ZNF106，RPRD1B，ETS1，ITGAE，ECSCR，SND1，TRIO，ANGPTL1，SEC61G，CDR2，CRMP1，PNISR，OXLD1，PRKACA，NFKBIZ，MORN2，RAB3D，CRKL，MSL1，TMPO，GALNT2，CRELD2，ETS2，ALKBH4，PHF19，POLH，TRRAP，NET1，ADGRE5，GAS6，VEZF1，BMPR2，SMAD3，GFOD1，RABGAP1L，SLC39A7，TCTN1，CSRNP1，LRRN3，TNRC6A，MFAP2，TMEM98，SPATC1L，LINC00476，CENPQ，CSTF3，SLC8A1，E2F7，RPL7L1，ZFHX4，TXNDC11，STK4，STX16，TMEM11，PTK6，ZFAS1，U2AF2，TRIM16，ZBTB7A，P3H3，TMCO3，C15orf39，ACVRL1，SHQ1，GNS，SPRY1，DIAPH2，DLC1，TCF3，FAM229A，PTGES3L，RRP7A，MGRN1，GIT2，UBE2T，CSGALNACT2，EFEMP2，CSNK1E，MAGED2，C5AR1，ARHGAP45，CDKN2B-AS1，TMEM234，RNF213，SIDT2，TEX2，MCM3，TMEM67，ZKSCAN1，SLC2A1，MAD2L1，MGLL，NR3C1，PHGDH，SYT1，RERE，KIF1B，NCAPD3，NADK，FOXRED2，GNB5，TMEM204，USP24，KIF20B，GADD45B，ZNF135，TACC3，FOSB，ACOT9，EBF1，MYO1E，PPP1R10，NFKBIB，ROBO4，TPGS1，CFD，KIF22，EIF4A3，RNF14，NPAT，STX11，CDCA7，ST6GALNAC4，RBL1，NIF3L1，GLCE，CDCA7L，RASA3，STK10，EDNRA，ICA1L，DCTN5，GNG2，PTPN2，BST1，BMP1，RPS6KA2，SEC11C，TRMU，H1F0，STXBP5L，AP5B1，STAM，MCM2，ALDH3B1，SLC23A2，TNFAIP3，KLF7，DIP2C，KMT2B，GALNT7，NUAK2，PLXNA4，MRI1，FLNB，MBOAT2，TMEM136，AP3M2，ACSS2，AARS，DUS3L，NGLY1，ZNF274，ICAM1，FAM129A，PPP6R1，TIE1，NUMBL，PLXND1，ENC1，CCDC142，BCAN，PRR15，FLRT2，NUCB2，TARS2，POLB，RAB24，KBTBD6，SLC38A4，MAP2，PMP22，TOP3A，VAMP2，UBTD2，PLK4，MAPK8IP3，APBA2，TBC1D17，ZNF444，PLEKHG4B，MTOR，STIL，GBA，IFT88，B9D1，RAMP1，S1PR3，SHISA9，MOCS3，CEP104，TIAM1，KIF15，ZNF793，ZNF865，ABCB10，ANKHD1-EIF4EBP3，CMPK2，SYTL3，SHROOM1，SPATA6，PPP2R3B，TNFSF13B，FKBP7，CNTROB，PEX11A，LHFPL2，DOK3，ARMC9，RANBP10，ZNF561，SCAMP5，ARHGAP39，DENND3，ATP9A，DCPS，ZNF302，ARHGAP9，IP6K1，ADAM22，EMCN，CYFIP2，WDR90，PPM1M，C1QTNF6，DACH1，BMF，SETD4，TBC1D9，PIK3IP1，P4HTM，CD101，SCPEP1，TLDC1，GTPBP10，TAP2，

内皮祖细胞的分离、纯化、离体培养和特征在Hill等，N.Engl.J.Med.：593-600(2003)；Assmus等，Circulation 106：3009-16(2002)；王等，J.Am.Coll.Cardiol.4949：1566-71(2007)；和Kalka等，P.N.A.S.97：3422-7(2000)中被描述，其内容通过整体引用并入本文。

内皮祖细胞和内皮祖细胞子代可以通过任何本领域已知的方法进行冷冻保存直至需要它们。(参见，例如，美国专利第5071741号，PCT国际专利申请WO93/14191、WO95/07611、WO96/27287、WO96/29862和WO98/14058，Karlsson等，65Biophysical J.2524-2536(1993))。可以将EPC悬浮在含有特定冷冻保存剂的等渗溶液中，优选细胞培养基。这种冷冻保存剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油等。这些冷冻保存剂以5-15％(例如，8-10％)的浓度被使用。细胞被逐渐冷冻到-10℃至-150℃的温度(例如，-20℃至-100℃、或-70℃至-80℃)。

体内分离的自然存在的内皮祖细胞的来源包括外周血、骨髓、脐血。

本发明的iPSC可以来源于体细胞，由体细胞诱导分化而成。

所述体细胞可以是干细胞或成熟细胞。这些细胞可以被称为“供体细胞”。成体干细胞是遍布全身的未分化细胞。它们可以通过细胞分裂增殖以补充死细胞并再生受损的组织。已在许多器官和组织中鉴定出成体或体干细胞，这些器官和组织包括脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮肤、牙齿、心脏、肠、肝、卵巢上皮和睾丸。它们被认为位于每个组织中被称为“干细胞巢”的特定区域并仅为那个组织提供细胞来源。成体干细胞的类型包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞。

如果收获成熟细胞作为供体细胞，则它们可以来自任何组织、器官、体液或身体分泌物。因此，细胞可以是皮肤细胞、毛囊细胞、血细胞、从尿液中提取的细胞、通过活检之类从任何组织或器官中收集的细胞，这些组织或器官包括但不限于骨骼、牙齿、牙齿组织、心脏、肺、脑、胰腺、肝、肾脏、膀胱、子宫、肠、胃、胆囊、肌肉、脂肪、睾丸、粘膜、眼、包皮、前列腺、脾或任何其他组织。

如本文中所使用的，术语“培养物”是指，将细胞(例如，本发明的内皮祖细胞或内皮细胞)在培养基中培养后获得的产物。

如本文中所使用的，术语“培养上清”是指，对细胞(例如，本发明的内皮祖细胞或内皮细胞) 进行培养而得到的不含细胞本身的培养液。因而，例如可以通过在培养后分离去除细胞成分来得到可用于本发明的培养上清。该培养上清也可以经过其他处理，例如离心、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存等。

术语“受试者”包括但不限于各种动物，例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如，猕猴或食蟹猴)或人。

本发明的优点和有益效果：

本发明利用iPSC诱导分化形成的EPC相比体内自然存在的EPC具有更强的BDNF分泌能力；

本发明利用iPSC诱导分化形成的EPC相比体内自然存在的EPC在治疗脑卒中方面具有更强的治疗效果。

附图说明

图1显示球囊损伤模型的实验结果，其中A：假手术组；B：对照组；C：治疗组；

图2显示CD31表达情况的统计图；

图3显示IgG表达情况的统计图；

图4显示iPSC分化来源的EPC和自然来源的EPC的对比结果图。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1 诱导性多能干细胞分化成内皮祖细胞

步骤2-5所描述细胞在5%氧气，5%二氧化碳的缺氧孵箱里培养。

步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液；

步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm²的胞细培养板底面积铺种2万-5万个细胞的比例，移入含有TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632混合溶液的细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；

步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，并用DPBS冲洗细胞培养板1次，按照每10cm²的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养16-24小时；所述第一N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4、CHIR-99021和Activin A，其中BMP4的浓度为20-40ng/mL，CHIR-99021的浓度为6-12µM，Activin A的浓度为30-80ng/mL；

步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用DPBS冲洗细胞培养板1次，按每10cm²的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞；所述第二N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4和CHIR-99021，其中BMP4的浓度为20-40ng/mL，CHIR-99021的浓度为6-12µM；

步骤5：移去步骤4中含有中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用DPBS冲洗细胞培养板1次，按照每10cm²的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro-34培养基，然后置于细胞培养箱中培养16-24小时；重复步骤5一次，在细胞培养板中诱导得到内皮祖细胞；所述第一StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA、Forskolin和SB431542，其中VEGFA的浓度为100-300ng/mL，Forskolin的浓度为1-4µM，SB431542的浓度为5-15µM；

步骤6：移去步骤5中含有内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用DPBS冲洗细胞培养板2次，按照每10cm²的细胞培养板底面积加液量为0.4-0.6 mL的比例，加入第二细胞酶解消化液，进行酶解消化，随后加入上述酶解消化液4倍体积的DMEM/F12培养基进行中和，并转移到离心管中，得到酶解后的内皮祖细胞；

步骤7：将步骤6得到的酶解后内皮祖细胞，离心，移去上清，并按照每10cm²的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，得到内皮祖细胞重悬液；所述第二StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA、PluriSIn-I，其中，VEGFA的浓度为30-80ng/mL、PluriSIn-I的浓度为15-30µM；

步骤8：将步骤7得到的内皮祖细胞重悬液，按照每1cm²的细胞培养板底面积铺种6万-10万个细胞的比例，移入含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；

步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用DPBS冲洗细胞培养板2次，按照每10cm²的细胞培养板底面积加液量为0.4-0.6 mL的比例，加入第二细胞酶解消化液，进行酶解消化，随后加入上述酶解消化液4倍体积的DMEM/F12培养基进行中和，并转移到离心管中；酶解后得到的内皮祖细胞悬液进行离心、洗涤和冻存，即为临床级内皮祖细胞原液；

步骤10：步骤9中冻存的内皮祖细胞原液，可经复苏、离心、洗涤后，进一步制备成注射型新鲜回输制剂用于临床使用。

实施例2 构建球囊损伤模型研究内皮祖细胞功能

1、方法

选用 SD大鼠30只，雌、雄各半，设对照组、假手术组和 EPC（endothelialprogenitor cell，内皮祖细胞）低剂量组（0.75×10⁶cell/只）、中剂量组（1.0×10⁶cell/只）、高剂量组（1.5×10⁶cell/只），每组 6只，雌雄各半，环磷酰胺（120mg/kg）腹腔注射，建立大鼠免疫抑制，然后利用经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)球囊建立球囊损伤模型，及时输注iPSC分化来源的EPC及等量的溶媒，14天后解剖动物，观察血管的形态，检测内膜厚度，以及EPC在损伤部位的定植。

假手术组：动物麻醉后切开皮肤及肌肉等，分离暴露颈外动脉即可，不做损伤，分层缝合复原。尾静脉注射生理盐水。

对照组和治疗组：动物麻醉后用切开皮肤及肌肉等，分离暴露颈外动脉，显微剪在颈外动脉中远1/3处横向剪开一小口，自此逆行将PTCA导管从切口插入至颈总动脉2~2.5cm，缓慢来回抽动3次剥脱内膜，结扎颈外动脉近段（距离分叉至少2mm），查看颈总动脉和颈内动脉是否良好搏动。逐层缝合皮下组织及皮肤。

治疗组动物尾静脉回输不同剂量的EPC（细胞溶于生理盐水，滴注0.1ml或0.2ml，每分钟输注60滴），对照组动物回输相同体积的生理盐水。回输前一天环磷酰胺（120mg/kg）腹腔注射，建立大鼠免疫抑制。

2、结果

颈动脉内皮损伤手术后饲养2周，光镜下可见假手术组大鼠动脉各层结构完整，管腔面积无缩小，内膜光滑无增生，中膜平滑肌细胞排列整齐（图1A）。对照组大鼠损伤部位均见大量新生内膜形成，内膜明显增厚，血管管腔狭窄（图1B）。治疗组大鼠血管内膜增厚和血管管腔狭窄等均较对照组显著减轻（图1C）。低剂量组的内膜厚度/对照组厚度比为0.22，中剂量组为0.16，高剂量组为0.11。损伤内皮处可见人源性EPC。

上述结果表明EPC可定植在损伤部位，有效的促进动脉损伤部位的内皮进行再内皮化，从而减少新生内膜的形成，维持动脉管腔形态，防止动脉粥样硬化的产生，即可预防脑卒中的发生。同时EPC移植数量与内膜损伤血管的修复程度相关。

实施例3 构建MCAO模型研究EPC功能

1、模型构建方法

大鼠在实验前一晚禁食，使用混合麻醉剂（舒泰50:盐酸赛拉嗪，10:1混合液）麻醉后呈仰卧状态固定于手术板上，于颈部纵切，切口约3cm，暴露并钝性分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），于颈总动脉（CCA）近心端打活结暂时阻断血供，颈外动脉（ECA）打双结并在双结中间用显微剪剪开小口穿入硅胶包被尼龙线栓（头端硅胶包被长度为4.5mm，线头直径0.34±0.02mm，线头30-50mm），从双结中间离断颈外动脉（ECA），调整线栓方向使之进入颈内动脉（ICA），以颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）分叉处为参考位置，线栓插入到预设刻度，感到阻力，提示线栓头部已到达大脑中动脉（MCA），打结固定线栓，于手术切口处放置浸有生理盐水的卫生棉保持湿润。栓塞1h后，将线栓拔出，松掉颈总动脉活结，用缝合线缝合切口，待动物自然苏醒。

2、 MCAO模型评价指标

2.1 神经行为学评分

（1）Longa 5分法：

0分：活动正常，无神经功能缺损症状；

1分：提尾时瘫侧前肢内收、不能全伸直，轻度神经功能缺损；

2分：行走时，大鼠向瘫侧旋转，中度神经功能缺损；

3分：行走时，大鼠站立不稳，向瘫痪侧倾倒，重度神经功能缺损；

4分：不能自主行走或昏迷；

（2）mNSS 18分评分法：

改良神经系统严重程度评分(mNSS评分，modified Neurological SeverityScore Points)，包括感觉、运动、平衡和反射4项，总分18分，神经功能损伤越严重分值越高。

表 1 mNSS 18分评分法评分标准

2.2 大脑TTC染色及梗死面积计算

原理：TTC（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride）与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织因组织坏死脱氢酶活力丧失，不能与TTC反应，故呈苍白色。

染色方法：处死动物后立即从左心室快速灌注生理盐水冲洗2min，快速断头打开颅骨取出完整大脑，于冰上将大脑从前往后切成5片厚度约为2 mm的冠状切片，用2% TTC溶液于37℃避光染色30min，后洗去多余染料，用4%多聚甲醛固定后拍照。正常组织染色结果为红色，缺血组织染色结果呈白色。选取中间一张脑片照片使用ImageJ图像分析软件（1.5e；NIH，Bethesda，MD，USA）分析，对TTC染色情况进行统计分析，计算梗死面积（白色区域）面积像素和正常脑组织（红色区域）面积像素值。计算脑梗死面积比例公式：脑梗死面积比例=切面中的梗死面积像素/总面积像素。

3、体内药效方案

大鼠进行MCAO模型手术24h后进行神经功能评分（mNSS评分法和Longa评分法），选择Longa 5评分法评定为2分且mNSS 18分法评定在7~10分之间的MCAO模型大鼠进行分组，共3组：G1-G3组，每组12只动物，G1组设3只动物作为假手术组，G2组尾静脉注射含3%白蛋白的生理盐水，G3组尾静脉注射内皮祖细胞（iPSC分化来源的EPC 2x10⁶个细胞/kg，EPC注射方式同前）。

4、结果

1）iPSC分化来源的EPC治疗降低脑梗死水平

EPC给药窗口为2天时（动物模型建模成功后2天，及脑卒中发病2天），治疗1天和7天时脑部梗死比例分别是0.38±0.09和0.20±0.03，治疗后分别是0.07±0.03和0.09±0.04，溶媒对照组分别是0.49±0.03和0.24±0.04。治疗后1天的脑部梗死比例显著低于同期溶媒对照组（0.07±0.03 vs 0.49±0.03，p<0.001）；治疗后7天的脑部梗死比例显著低于同期溶媒对照组（0.09±0.04 vs 0.24±0.04，p<0.05）。该结果显示EPC治疗可显著降低大鼠MCAO的脑部梗死比例，并呈现一定的剂量反应趋势。

2）神经行为改善水平（Longa 5分法和mNSS评分）

iPSC分化来源的EPC给药窗口为1天时（动物模型建模成功后1天，及脑卒中发病1天），给药后3天、7天时，溶媒对照组Longa5评分均为2.0±0.0，治疗组分别为1.5±0.2和1.2±0.2。与溶媒对照组相比，治疗组该评分降低，给药后7天呈显著性降低（p<0.01）。给药后7天，治疗组的mNSS评分较对照呈现显著性增加（5.7±2.2 vs 7.7±0.2，p<0.01）。该结果表明给药能够改善模型组神经功能损伤。

iPSC分化来源的EPC治疗后7天，给药窗口为1天、2天和3天时mNSS评分别为4.8±0.5，5.7±0.2，6.2±0.5，均显著低于同期溶媒对照组（7.7±0.2，G4，G5，p<0.01；G6，p<0.05）。该结果显示不同时间窗口给药均能降低大鼠的神经功能评分。

3）iPSC分化来源的EPC促进MCAO大鼠病灶脑组织的血管新生

EPC治疗后1天和7天MCAO大鼠病灶部位脑组织CD31表达均升高，其中治疗后7天时CD31表达显著高于溶媒对照组（p<0.05）(图2)。此外，EPC治疗后1天病灶脑组织的VEGFmRNA表达显著高于溶媒对照组（p<0.05）。结果显示，EPC治疗促进病灶脑组织的血管新生。

4） EPC降低MCAO大鼠梗死大脑的炎性和脑损伤

iPSC分化来源的EPC治疗后1天时，MCAO大鼠病灶脑组织IL-6和TNF-α的mRNA表达显著低于溶媒对照组（p<0.05，p<0.01）。此外，EPC治疗后1天、7天，病灶脑组织CD68表达呈现下降趋势。

5）iPSC分化来源的EPC/EC移植对小胶质细胞/巨噬细胞的影响

脑卒中的病理过程中，神经的病理反应首先表现为脱髓鞘，随着病程发展继而出现神经轴突损伤和神经元损伤坏死。小胶质细胞有两种主要表型M1和M2, 它们都会影响髓鞘再生，而损伤后有效的髓鞘修复需要小胶质细胞（M2表型）的亲再生反应。为了评估iPSC分化来源的EC对小胶质细胞表型的改变，在病变区域用Arg1双标记了小胶质细胞/巨噬细胞(CD11b +)。免疫组化学表明，iPSC分化来源的EC移植后，病变区域Arg1+CD11b+双标记细胞密度显著增加(control：27.28/mm² vs iPSC分化来源的EC：57.54/mm²，p<0.01)，Arg1标记Arg1+在总CD11b+细胞中的比例也增加(48.38% vs 65.88%，p<0.05)。这些数据表明，iPSC分化来源的EC调节了小胶质细胞/巨噬细胞的激活，并促进了表型M1切换为M2，这对OPC的分化和成熟有益。

在小胶质细胞M2类型的数量以及梗死区域的减少方面，自然来源的EPC只有在极高剂量10⁷个细胞/kg才具有iPSC分化来源的EPC 200万个细胞/kg发挥功效的 1/3（p <0.05%)。

6） iPSC分化来源的EPC降低MCAO大鼠血脑屏障通透性

iPSC分化来源的EPC治疗后1天和7天MCAO大鼠病灶脑组织IgG表达均降低，其中治疗后7天时IgG水平显著低于溶媒对照组（p<0.05）。该结果显示EPC治疗可降低MCAO大鼠血脑屏障通透性（图3）。

实施例4 iPSC分化来源的EPC和自然来源的EPC功效对比

1、收集自然来源的EPC

采用脐带血来源的EPC，EPC的分离和培养方法如文献所述（Hypertension 201259(5):1037-43)。

2、检测EPC分泌BDNF量

步骤：分别将iPSC分化来源的EPC和自然来源的EPC采用4%多聚甲醛固定20分钟，随后用BSA封闭30分钟，接着加入BDNF鼠源一抗4℃条件下过夜孵育，洗涤后继续室温孵育携带绿色荧光的抗鼠二抗1小时，洗涤后采用共聚焦荧光显微镜观察荧光强度并拍照。

3、球囊损伤模型

按照实施例2的方式将自然来源的EPC应用于实验。

4、MCAO模型

按照实施例3的方式将自然来源的EPC应用于实验。

5、结果

iPSC分化来源的EPC和自然来源的EPC在球囊损伤模型中修复和中风后小血管生成的结果类似（p>0.05%)，但自然来源的EPC的BDNF的分泌量仅是iPSC来源EPC的0.7倍（p<0.05%)。在小胶质细胞M2类型的数量以及梗死区域的减少方面，自然来源的EPC只有在极高剂量10⁷个细胞/kg才具有iPSC分化来源的EPC 200万个细胞/kg发挥功效的 1/3（p<0.05%)，上述对比结果见图4，其中图中的iPS-EPC代表是iPSC（诱导性多能干细胞）分化来源的EPC，EPC是指自然来源的EPC。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞的应用，所述应用包括以下任一项：

1）在制备降低脑梗死水平的细胞治疗剂中的应用；

2）在制备修复神经损伤的细胞治疗剂中的应用；

3）在制备增加病灶脑组织免疫浸润的M2型小胶质细胞数量的细胞治疗剂中的应用；

4）在制备激活小胶质细胞的细胞治疗剂中的应用；

5）在制备促进M1型小胶质细胞向M2型小胶质细胞转换的细胞治疗剂中的应用；

6）在制备修复脑损伤的细胞治疗剂中的应用；

7）在制备治疗脑卒中的细胞治疗剂中的应用；

8）在制备BDNF中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞治疗剂包含iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞，以及药学上允许的载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞治疗剂为iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞，与生理盐水的混合液。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞治疗剂包含内皮祖细胞或内皮细胞的分泌物，以及药学上允许的载体。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞治疗剂为静脉注射剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗剂的用药方法是：

将0.1-0.2ml的细胞治疗剂以每分钟60滴的速度静脉注射完毕。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述细胞治疗剂还包括下述功能性成分中的任意一种或多种：

1）维持内皮祖细胞或内皮细胞活性的成分；

2）促进内皮祖细胞或内皮细胞增殖的成分；

3）促进内皮祖细胞分化的成分。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述功能性成分包括血清替代物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、L- 丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、生长因子及其任意组合。

9.一种体外制备BDNF的方法，其特征在于，所述方法包括培养iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞。

10.一种体外促进M1型小胶质细胞转换为M2型小胶质细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将M1型小胶质细胞与iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞接触，或将M1型小胶质细胞与iPSC分化来源的内皮祖细胞或内皮细胞的分泌物接触。

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