CN101613717B

CN101613717B - 用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法

Info

Publication number: CN101613717B
Application number: CN2009100387475A
Authority: CN
Inventors: 裴端卿; 米盖尔·埃斯特班; 徐建勇; 赖良学; 杨佳银; 彭梅秀
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Hangzhou Jianlai Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2029-04-17
Also published as: CN101613717A

Abstract

本发明公开了用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法。该方法包括如下步骤：(1)用包含多能性干细胞因子的cDNA导入猪成纤维细胞；(2)培养步骤(1)得到的猪成纤维细胞；(3)鉴定多能性干细胞克隆。本发明成功诱导了ES样细胞，具有体外分化潜能，易于基因操作；本发明的猪iPS细胞为遗传操作提供了便利，可以进一步开展分化研究及疾病模型的建立；还可以以猪为模型检测iPS细胞的安全性问题，为优化iPS诱导策略，加速人类iPS细胞的临床应用提供科学数据。

Description

用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞领域，特别涉及用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法。

背景技术

干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somatic stem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的。

1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。随后，牛、羊等大动物的ES细胞分离和培养也相继获得成功。

人类胚胎干细胞(hES细胞)研究的应用前景主要是移植治疗，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。

一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：(1)供体卵母细胞的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，体细胞核移植术(SCNT技术)的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题。(4)体外维持hES风险。

为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达Oct4。

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)。

2007年，Yamanaka研究小组进一步用Nanog代替Fbx15进行筛选，得到了Nanog+的iPS细胞系，该iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、标志物表达、移植到小鼠皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相同。此外，研究还发现重新激活原癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因；而转染的上述4个基因在iPS细胞中并没有表达，表明这些基因只在诱导过程中起作用，iPS细胞保持多潜能性状态的原因是内源性转录因子Nanog基因的表达。同时独立发表的另一篇来自美国科学家的研究论文同样证实了上述4个转录因子足以使小鼠成纤维细胞在体外诱导重构成为类似小鼠ES细胞的iPS细胞。

新近报道了小鼠肝细胞和胃上皮细胞同样也可被重构成为iPS细胞，遗传学细胞谱系示踪分析显示，iPS细胞源自谱系定型的体细胞的直接重构，而未发现逆转录病毒整合到特定的基因位点与细胞核重构相关。

还有研究者利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人类皮肤成纤维细胞中，也成功获得了iPS细胞。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型。与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导。

Park IH等人利用来自胎儿、新生儿及成人的皮肤或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现Oct4和Sox2在诱导重构为iPS细胞过程中是必需的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和c-Myc的作用是改变染色质的结构，从而有利于Oct4和Sox2的结合，以提高诱导的效率。此外，这项研究的重要意义在于将取自皮肤活检的成纤维细胞诱导为iPS细胞。上述研究表明，从活检人类皮肤组织中提取体细胞后进行诱导以制备患者特异性的干细胞是可行的，因而有望克服细胞移植治疗中存在的免疫排斥反应。鉴于导入c-Myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20％，可能会阻碍其未来的临床应用。因此，Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染c-Myc以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到iPS细胞。去除c-Myc基因尽管可使未来临床应用的安全性显著提高，但形成iPS细胞的效率却明显降低。虽然嵌合体小鼠在100天内没有肿瘤发生，但逆转录病毒的再激活仍有导致肿瘤发生的潜在风险。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。

尽管科学家们在人类ES细胞方面做出了显著的成绩，但从ES细胞，或者说iPS细胞到可以移植的组织和器官，路途仍然艰辛而遥远。从另一个角度来讲，部分科学家已经开始寻找可以直接移植的器官。但由于人体器官来源的局限性，其它物种的器官开始进入研究者的视野中，而猪就是其中一个典型的例子。由于猪在器官体积及生理方面与人的相似性，在过去的几十年中，对于猪的科学研究已经取得了可喜进步。由于ES细胞可作为良好的研究模型，许多科学家曾尝试分离猪的ES细胞，但都以失败而告终。因此，目前对于猪细胞的遗传操作都基于核移植技术。但由于核移植对于细胞核的重编程不彻底，因此即使产生后代，其也多有畸形，且核移植操作繁琐，周期长，因此效率低、费时费力。此外，将人类iPS细胞应用到临床之前，安全问题，即成瘤性问题需要被严格检测。由于小鼠的寿命较短，而猴的饲养又较为困难。因此，猪作为另一个可候选的生物模型来检测iPS安全性，极具应用前景。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法。

为实现该目的，采用如下技术方案：

本发明的用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法包括如下步骤：

(1)用包含多能性干细胞因子的cDNA导入猪成纤维细胞；

(2)培养步骤(1)得到的猪成纤维细胞；

(3)鉴定多能性干细胞克隆。

所述多能性干细胞因子为对于干细胞多能性维持关键的因子。

所述多能性干细胞因子包括Oct4、Sox2、Sox1、C-myc、L-Myc、N-Myc、Klf4、Klf5和Klf2中的一种或多种。

其中，所述多能性因子为对于干细胞多能性维持关键的因子，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)。最优选地，所述多能性因子包括Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。上述多能性因子可以是任何来源的，优选为小鼠和人的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登录号为NM_011443.3(小鼠)和NM_003106.2(人)；Oct4，NCBI登录号为NM_013633.2(小鼠)和NM_002701.4(人)；Klf4，NCBI登录号为NM_010637.2(小鼠)和NM_004235.4(人)；c-Myc，NCBI登录号为NM_010849.4(小鼠)和NM_002467.3(人)；Sox1，NCBI登录号为NM 009233.3，(小鼠)和NM_005986.2(人)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2(小鼠)和NM_016270.2(人)；Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4(小鼠)和NM_001730.3(人)。C-Myc还可以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2(小鼠)和NM_001033081.1(人))；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3(小鼠)和NM_005378.4(人))。

本发明所述的“诱导的多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与人ES细胞非常相似。本文所述的术语“诱导重编程”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

与现有技术公开的其它可以被诱导为iPS的细胞不同，本发明中由猪成纤维细胞诱导形成的iPS细胞，为该物种的进一步研究提供了良好的细胞模型。鉴于目前仍然没有分离得到猪ES细胞，猪iPS细胞为遗传操作提供了便利，可以进一步开展分化研究及疾病模型的建立。此外，还可以以猪为模型检测iPS细胞的安全性问题，为优化iPS诱导策略，加速人类iPS细胞的临床应用提供科学数据。本发明利用外源基因高表达的方式，将猪成纤维细胞诱导为干细胞样细胞(iPS)，并证明了其具有分化多能性，为该物种的进一步科学研究提供了良好的细胞模型。同时，本发明基于iPS技术，成功诱导了ES样细胞，具有体外分化潜能，易于基因操作，为科学研究提供了良好的平台。

附图说明

图1是猪成纤维细胞iPS诱导过程的示意图；

图2是猪iPS细胞系的形态示意图和外源基因整合分析；

图3是猪iPS细胞系的多能性标记鉴定图；

图4是猪iPS细胞系畸胎瘤分化鉴定和核型分析。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，ALABORATORY MANUAL and ANIMAL CELLCULTURE(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French Anderson等人，HANDBOOKOF STEM CELLS，卷2。

本发明的用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法的优选实施例的过程如下，图1为从体外转染到获得iPS克隆的猪iPS细胞系IPS诱导过程概览。使用5天大的西藏小型猪，与我们实验使用的品系类似，如图左所示。获得使用GFP对照逆转录病毒和SKOM感染后6天的猪胚胎成纤维细胞，在特定培养基中培养，使用荧光显微镜观察到GFP有100％的感染率。早期的典型形态改变(与人和鼠的iPS诱导类似，细胞变得圆而紧密)只出现在SKOM感染的细胞克隆中。具体过程如下：

细胞培养：

分离猪胚胎成纤维细胞，37天的胚胎在HEPES缓冲液培养基中搅碎，39℃胶原酶消化4小时。用吸液管多次吹打混合，用PEF培养基1∶1稀释(DMEM- 高葡萄糖，青霉素/链霉素双抗，以及10％Hyclone胎牛血清)。样品在700rpm转速下离心10分钟，在PEF培养中集中吹打重悬。只有早期的几代细胞用于iPS诱导。用丝裂霉素C处理过的鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞。HEK293T细胞用作逆转录病毒的包装细胞系。以上3种细胞型均在与猪胚胎成纤维细胞相同的细胞中培养。所有细胞一直在39℃培养(逆转录病毒包装及感染除外)。

逆转录病毒感染

使用含有Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc的pMX质粒和EGFP的质粒以及人因子的质粒(购自Adgene)。HEK293T细胞使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染。2轮(一次24小时)，停止转染后收集上清液，过滤(0.45m微孔直径)，加入到提前一天分离的猪胚胎成纤维细胞中；加入聚凝胺(8g/ml，Sigma)以提高转染效率。iPS细胞培养基成份为：DMEM-高糖，抗生素，谷氨酰胺(2mM，Gibco)，丙酮酸盐(2mM，Gibco)，非必须氨基酸(1％，Gibco)，beta巯基乙醇(0.1mM，Sigma)，bFGF(4ng/ml，Invitrogen)，Lif(1000U/ml，Millipore)以及15％提纯胎牛血清(dFBS，Hyclone)。iPS克隆先使用巴氏吸管传代，然后使用中性蛋白酶(1mg/ml，Invitrogen)传代，iPS诱导和维持的培养基每日更新。

相关结果见图2-4，图2中，图2A为猪iPS细胞形态图，由图可见，第16天出现与胚胎干细胞(ESC)类似的克隆，并观察到多种非ESC形态的其他类型细胞。图2B为挑取单克隆的图片，在多次传代后，猪iPS克隆仍然保持最初的形态，并且呈现AP染色阳性。图2C是半定量RT-PCR的凝胶电泳图，显示外源的鼠或者人因子成功整合进了猪iPS的基因组DNA中，包括了阳性对照(C+，病毒感染6天的MEF)对照和阴性对照(未被感染的PEF)。DNA抽提使用Wizard

基因组DNA纯化试剂盒(Promega)。检测鼠外源因子整合进基因组的引物和衡量基因沉默的引物相同(如下)。用于人因子的引物如下：

pMX载体：

上游引物：5’-GCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTC-3’，

human Sox2上游引物：5’-CTTGGCTCCATGGGTTCG-3’，

human Oct4上游引物：5’-GAGAACCGAGTGAGAGGCAAC-3’，

human Klf4上游引物：5’-TCTCTTCGTGCACCCACTTG-3’，

human c-Myc上游引物：5’-AGAGTCTGGATCACCTTCTGCTG-3’。

图2D是TERT基因的实时定量RT-PCR结果，与未感染的PEF比较，显示在挑选的猪ips克隆中得到高表达。荧光定量PCR使用SYBR Green(Takara)和ABI7300仪器，数值使用18S标准化。引物如下：

反相端粒酶逆转录酶(TERT，NCBI NO：AY785158)：

上游引物：5’-TGCTCGCCAACGTTTACA-3’；

下游引物：5’-CAAGCCGGAGGAAAAATG-3’；

18S(NR_002170)：

上游引物：5’-ACCCACGGAATCGAGAAA-3’；

下游引物：5’-GCCTGCGGCTTAATTTGA-3’。

猪iPS细胞使用的是猪iPS克隆的第9代(mouse SKOM)和15代(humanSKOM)。

图3A为免疫荧光显微观察。iPS细胞系在有滋养层细胞包被的载玻片中生长2-3天，然后使用4％多聚甲醛固定。玻片使用Triton X100通透，然后使用封闭试剂(含5％FBS的PBS溶液)孵育30分钟。抗SSEA4的抗体以及二抗(山羊抗鼠TRITC)分别购于Invitrogen以及中山金桥生物技术有限公司，抗Nanog和Rexl的抗体购自Abcam。室温一抗一个小时以上，二抗一小时或少于一小时。DAPI购自Sigma，盖玻片用甘油和指甲油封片至于载玻片上，使用常规的荧光显微镜观察。结果显示iPS克隆表达ES细胞多能性标记SSEA4，Nanog和Rexl。

图3B为半定量RT-PCR鉴定多能性标记。使用Trizol(MRC)提取RNA。反转录的半定量PCR使用降落PCR技术和LA Taq聚合酶(Takara)。猪序列的引物如下：

外源的Sox2(NCBI accession number NM_001123197)

上游引物：5’-GGTTACCTCTTCTTCCCACTCCA-3’；

下游引物：5’-CAAAAATAGTCCCCCCAAAAGAAG-3’；

Nanog(NM_001129971)：

上游引物：5’-CTTATTCAGGACAGCCCTGATTCTTC-3’；

下游引物：5’-AAGACGGCCTCCAAATCACTG-3’；

Lin28(NM_001123133)：

上游引物：5’-TCAACGTGCGCATGGGGTTCGGCTTCCTGT-3’；

下游引物：5’-GTGGACGTCTTTGTGCACCAGAGTAAGCTG-3’；

beta actin(AY550069)：

上游引物：5’-CCGTGAGAAGATGACCCAGATCATGT-3’；

下游引物：5’-CGTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3’；

Sox2、Lin28和Nanog扩增子克隆进pMD18-T(TAKARA)并测序。证明与预测序列100％吻合，此外在NCBI和Sanger猪基因组数据库中没有其他可吻合序列。用5-azad处理含有人因子C13和C17iPS克隆没有进一步增加ESC marker的表达(如图右所示)。使用猪iPS克隆的第9代(鼠SKOM)和第15代(人SKOM)。

图3C为外源转基因沉默程度检测，其引物为：

pMX载体上游引物：

5’-GCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTC-3’，

mouse Sox2下游引物：5’-GCTTCAGCTCCGTCTCCATCATGTTATACAT-3’，

mouse Oct4下游引物：5’-AGTATGCCATCCCTCCGCAGAACTCGTATG-3’，

mouse Klf4下游引物：5’-AGGATAAAGTCTAGGTCCAGGAGGTCGTTG-3’，

mouse c-Myc下游引物：5’-AGTCGTAGTCGAGGTCATAGTTCCTGTTGG-3’，

human Sox2下游引物：5’-TGACCACCGAACCCATGGAGCCAAGAG-3’，

human Oct4下游引物：5’-GTTGCTCTCCACCCCGACTCCTGCTTC-3’，

human Klf4下游引物：5’-GGAGGATGGGTCAGCGAATTGGAGAGA-3’，

human c-Myc下游引物：5’-AGGACGGAGAGAAGGCGCTGGAGTCTTG-3’。

半定量RT-PCRs使用上述的逆转录样品。使用半定量RT-PCR检测显示挑选的iPS细胞系与对照感染细胞的mRNA产物相比有低程度的沉默，水作为PCR 反应的的阴性对照。

图4是猪iPS细胞系具有多能性的分析图。图4A表示在免疫缺陷的小鼠中形成的畸胎瘤分化成了3个胚层。猪iPSCs使用中性蛋白酶收获，100万个细胞皮下注射进裸鼠的拱侧翼。8-9周后，小鼠被处死，畸胎瘤嵌入石蜡中，使用hematoxilin/eosin切片染色后进行组织结构上地分析。使用细胞系为hs SKOMC13(第16代)和hs SKOM C17(第16代)。图4B为iPS细胞的核型分析。细胞在培养瓶(Corning，美国)中培养至指数生长期，加入秋水仙素(Dahui biotech)终浓度50μg/ml，然后细胞用胰蛋白酶处理，2,000rpm离心5min，在8ml的0.075MKCl重悬，在37℃中孵育20分钟。加入固定液(由1份醋酸和3份甲醇)至10ml，轻柔混合，37℃孵育10分钟。离心，并弃上清，加入冰冻固定溶液(由1份醋酸和3份甲醇)至10ml。细胞由高处滴落至冰冻载玻片，75℃孵育3h。显带时用胰蛋白酶和着色剂处理，并且用Olympus BX51显微镜分析分裂中期的状态。通过核型分析显示出，两个不同的人SKOM ips细胞系(第18代)拥有与对照组PEF细胞等量的染色体(19对)。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<120>用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法

<160>25

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>30

<212>人工序列

<213>pMX载体上游引物

<400>1

gccgacacca gactaagaac ctagaacctc 30

<210>2

<211>18

<212>人工序列

<213>human Sox2上游引物

<400>2

cttggctcca tgggttcg 18

<210>3

<211>21

<212>人工序列

<213>human Oct4上游引物

<400>3

gagaaccgag tgagaggcaa c 21

<210>4

<211>20

<212>人工序列

<213>human Klf4上游引物

<400>4

tctcttcgtg cacccacttg 20

<210>5

<211>23

<212>人工序列

<213>human c-Myc上游引物

<400>5

agagtctgga tcaccttctg ctg 23

<210>6

<211>18

<212>人工序列

<213>TERT上游引物

<400>6

tgctcgccaa cgtttaca 18

<210>7

<211>18

<212>人工序列

<213>TERT下游引物

<400>7

caagccggag gaaaaatg 18

<210>8

<211>18

<212>人工序列

<213>18S上游引物

<400>8

acccacggaa tcgagaaa 18

<210>9

<211>18

<212>人工序列

<213>18S下游引物

<400>9

gcctgcggct taatttga 18

<210>10

<211>23

<212>人工序列

<213>外源Sox2上游引物

<400>10

ggttacctct tcttcccact cca 23

<210>11

<211>24

<212>人工序列

<213>外源Sox2下游引物

<400>11

caaaaatagt ccccccaaaa gaag 24

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>Nanog上游引物

<400>12

cttattcagg acagccctga ttcttc 26

<210>13

<211>18

<212>人工序列

<213>Nanog下游引物

<400>13

aagacggcct ccaaatcact g 21

<210>14

<211>30

<212>人工序列

<213>Lin28上游引物

<400>14

tcaacgtgcg catggggttc ggcttcctgt 30

<210>15

<211>30

<212>人工序列

<213>Lin28下游引物

<400>15

gtggacgtct ttgtgcacca gagtaagctg 30

<210>16

<211>26

<212>人工序列

<213>beta actin上游引物

<400>16

ccgtgagaag atgacccaga tcatgt 26

<210>17

<211>24

<212>人工序列

<213>beta actin下游引物

<400>17

cgtgatctcc ttctgcatcc tgtc 24

<210>18

<211>31

<212>人工序列

<213>mouse Sox2下游引物

<400>18

gcttcagctc cgtctccatc atgttataca t 31

<210>19

<211>30

<212>人工序列

<213>mouse Oct4下游引物

<400>19

agtatgccat ccctccgcag aactcgtatg 30

<210>20

<211>30

<212>人工序列

<213>mouse Klf4下游引物

<400>20

aggataaagt ctaggtccag gaggtcgttg 30

<210>21

<211>30

<212>人工序列

<213>mouse c-Myc下游引物

<400>21

agtcgtagtc gaggtcatag ttcctgttgg 30

<210>22

<211>27

<212>人工序列

<213>human Sox2下游引物

<400>22

tgaccaccga acccatggag ccaagag 27

<210>23

<211>27

<212>人工序列

<213>human Oct4下游引物

<400>23

gttgctctcc accccgactc ctgcttc 27

<210>24

<211>27

<212>人工序列

<213>human Klf4下游引物

<400>24

ggaggatggg tcagcgaatt ggagaga 27

<210>25

<211>28

<212>人工序列

<213>human c-Myc下游引物

<400>25

aggacggaga gaaggcgctg gagtcttg 28

Claims

1.一种用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用小鼠或人的多能性干细胞因子的cDNA导入猪成纤维细胞，其中所述的多能性干细胞因子为Oct4、Sox2、C-myc和Klf4；

(2)培养步骤(1)得到的猪成纤维细胞；其中，诱导的多能性干细胞的细胞培养基成份为：DMEM-高糖，抗生素，2mM的谷氨酰胺，2mM的丙酮酸盐，1％的非必须氨基酸，0.1mM的beta巯基乙醇，4ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，1000U/ml的白血病抑制因子以及15％提纯胎牛血清；感染后第16天，选择与人类胚胎干细胞相似的胚胎干细胞样克隆扩大培养；

(3)鉴定多能性干细胞克隆。