CN108624556A - 一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法 - Google Patents
一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108624556A CN108624556A CN201810473962.7A CN201810473962A CN108624556A CN 108624556 A CN108624556 A CN 108624556A CN 201810473962 A CN201810473962 A CN 201810473962A CN 108624556 A CN108624556 A CN 108624556A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- low alkalinity
- mesenchymal stem
- stem cells
- mescenchymal stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明实施例提供一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，涉及生物技术领域，体外实验揭示疾病来源的间充质干细胞分化能力异常，微芯片发现分化能力异常的间充质干细胞的细胞内经典Wnt信号通路受到抑制，利用经典Wnt信号通路的激活剂LiCl作用于分化能力异常的间充质干细胞，使已经阻断的下游通路重新启动，恢复了分化能力异常的间充质干细胞分化特性。所述恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法包括：从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离间充质干细胞，得到分化能力异常的间充质干细胞；利用小分子化合物LiCl处理分化能力异常的间充质干细胞，恢复间充质干细胞分化能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法。
背景技术
低碱性磷酸酯酶症(Hypophosphatasia，HPP)是由于肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因（ALPL）突变导致其编码的组织非特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecific alkalinephosphatase，TNAP）蛋白活性缺陷造成的骨骼及牙齿骨量下降的遗传性疾病。低碱性磷酸酯酶症发病率高，轻中度为4/1000，重度为1/100000，重者可出现骨骼畸形、高钙血症、严重癫痫及出现呼吸系统并发症导致围产期死亡，严重威胁着人类的健康和生存质量。目前，临床治疗低碱性磷酸酯酶症主要围绕如何减少患者骨量丢失和防止癫痫发生，如：利用特立帕肽结合维生素B6 治疗。现有的治疗方案仅能减缓HPP 发病的时间，不能有效逆转骨量减少的事实，因此不能从根本上解决骨形成和骨再生缺陷这一首要问题。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞在治疗骨组织、软骨、牙周及神经等组织缺损再生过程发挥重要作用。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是从骨髓组织中分离培养的具有向成骨细胞细胞、成软骨细胞、脂肪肪细胞和成纤维细胞等多向分化潜能的干细胞，与骨组织发育和骨组织损伤修复密切相关。低碱性磷酸酯酶症患者体内的间充质干细胞由于ALPL突变可能导致细胞增殖、凋亡和多向分化潜能出现异常，导致使个体的骨骼系统和牙齿发育出现异常。我们研究团队发现低碱性磷酸酯酶症患者的骨髓间充质干细胞成骨细胞分化能力减弱，相反成脂肪细胞分化能力加强，这与低碱性磷酸酯酶症患者骨质下降密切相关。因此，以低碱性磷酸酯酶症患者的间充质干细胞作为寻找治疗低碱性磷酸酯酶症疾病药物的模型，筛选出有效改善或恢复低碱性磷酸酯酶症患者的间充质干细胞分化能力，为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症提供方法。
发明内容
本发明实施例提供了一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，体外实验揭示疾病来源的间充质干细胞分化能力异常，微芯片发现分化能力异常的间充质干细胞的细胞内经典Wnt信号通路受到抑制，利用经典Wnt信号通路的激活剂LiCl作用于分化能力异常的间充质干细胞，使已经阻断的下游通路重新启动，恢复了分化能力异常的间充质干细胞分化特性。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明实施例提供一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，该方法包括：
从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离间充质干细胞，得到分化能力异常的间充质干细胞；
利用小分子化合物LiCl处理分化能力异常的间充质干细胞，恢复间充质干细胞分化能力。
进一步地，所述从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离间充质干细胞，得到分化能力异常的间充质干细胞，具体包括：
从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离间充质干细胞；
将分离得到的间充质干细胞经体外扩增培养得到分化能力异常的间充质干细胞。
其中，上述分化能力异常的离体间充质干细胞可来源于低碱性磷酸酯酶症患者组织，如手术弃掉的骨碎片、生化检测弃用的骨髓组织样本、脱落的牙齿样本等。
上述分化能力异常的离体间充质干细胞可为基因突变发生于ALPL基因编码区的任一单个位点或多个位点突变所致碱性磷酸酯酶酶活力缺陷。本发明的实施例中，上述所用的分化能力异常的离体间充质干细胞包含2个突变位点的ALPL基因。
上述分化能力异常的离体间充质干细胞的特征体现在：与正常离体间充质干细胞相比，细胞的碱性磷酸酯酶酶活力低下、细胞的成骨细胞分化能力减弱、细胞的成脂肪细胞分化能力增强、细胞内经典Wnt信号通路异常。
上述方法中，所述体外扩增培养为贴壁培养，并传代培养3-5代。所述培养皿为细胞或细菌培养皿所述细胞或细菌培养皿的材质具体为塑料或玻璃。
上述小分子化合物LiCl纯度标准要求≥99%，等级要求细胞/组织培养用；
上述方法实施中需持续给予LiCl作用，LiCl使用前进行无菌处理，LiCl浓度为10mM。
本发明的实施例中LiCl恢复分化能力异常的离体间充质干细胞具体如下：
1)恢复离体间充质干细胞向成骨细胞分化能力,在成骨诱导液中添加LiCl溶液，配制成含有10mM LiCl的成骨诱导液；
当细胞融合度到达90%以上，去除正常细胞培养液，更换含LiCl的成骨诱导液；
上述方法中，所述更换成骨诱导液为每隔3天更换新鲜成骨诱导液，向成骨细胞诱导分化21天以上。
2) 恢复离体间充质干细胞向成脂肪细胞分化能力，在成脂肪诱导液中添加LiCl溶液，配制成含有10mM LiCl的成脂肪诱导液；
当细胞融合度到达95%以上，去除正常细胞培养液，更换含LiCl的成脂肪诱导液；
上述方法中，所述更换成脂肪诱导液为每隔3天更换新鲜成脂肪诱导液，向成脂肪细胞诱导分化14天以上。
上述方法中，恢复分化能力异常的间充质干细胞的分化能力体现在激活分化能力异常的间充质干细胞的经典Wnt信号通路、促进分化能力异常的间充质干细胞向成骨细胞的分化能力/抑制分化能力异常的间充质干细胞向成脂肪细胞分化能力。
所述与分化能力相关基因为RUNX2、SP7、PPAR-γ、LPL、p-GSK3β、active-β-catenin。
由上述的方法得到的恢复分化能力异常的间充质干细胞分化能力是本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症提供临床依据/方法。
本发明提供的方法，包括上述的方法步骤。
本发明的实验证明，本发明提供了一种恢复低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞分化能力的方法，ALPL缺陷的分化能力异常的间充质干细胞骨向分化能力减弱而脂向分化能力增强，细胞内经典Wnt信号通路受到抑制，具体采用LiCl持续作用于分化能力异常的间充质干细胞，通过恢复细胞经典Wnt信号通路调控下游靶基因的表达，促进分化能力异常的间充质干细胞向成骨细胞的分化能力，抑制分化能力异常的间充质干细胞向成脂肪细胞分化能力；而且本方法采用了一种常见小分子化合物，具有操作简单、成本低廉、效果显著的特点，实现了恢复低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞分化能力，为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症患者提供潜在的治疗策略。
附图说明
图1为间充质干细胞形态观察示意图；
图2为间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；
图3为间充质干细胞成脂肪分化能力检测示意图；
图4为间充质干细胞的细胞内经典Wnt信号通路检测示意图；
图5 为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的形态和细胞毒性检测示意图；
图6为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的经典Wnt信号通路恢复检测示意图；
图7为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成骨分化能力恢复检测示意图；
图8为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞可以按照如下方法制备：将临床上废弃的患者骨髓组织利用Percoll分离液(美国Pharmacia, S17-0891-01)进行白膜层细胞分离。步骤如下：将稀释好的Percoll工作液与骨髓样本混匀，2000rpm离心20min；离心后液体出现分层，用枪吸取白膜层细胞至新的离心管中，加入PBS洗涤，1000rpm离心10min；离心后弃掉上清液再次用PBS洗涤细胞，8000rpm离心5min；离心后用细胞培养液悬浮细胞,接种至细胞培养皿中放置细胞培养箱进行培养、传代、扩增。
下述实施例中细胞培养皿购自美国Corning公司。
下述实施例中的PBS缓冲液购自北京康为世纪生物科技有限公司(CW0040S)。
下述实施例中的细胞培养基(α-MEM培养基)购自美国gibco公司(11900-024)。
下述实施例中LiCl购自Sigma公司。
下述实施例中细胞成骨诱导液可以按如下方法配制:含10nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、 0.05g/L维生素C、1%青霉素-链霉素、5% 胎牛血清的α-MEM培养基。
下述实施例中细胞成脂肪诱导液可以按如下方法配制：60uM吲哚美辛、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10ug/mL胰岛素、0.1mM维生素C、0.5uM氢化可的松、1%青霉素-链霉素、5% 胎牛血清的α-MEM培养基。
下述实施例中的消化液为胰酶，溶于pH值为7.4的PBS缓冲液得到浓度为0.25%的溶液(质量百分含量) 。
下述实施例中细胞培养条件可采用：CO2浓度为5%，O2浓度为20%，温度为37℃的加湿细胞培养箱。
下述实施例中基因表达采用实时荧光定量PCR法检测，实施按如下方法进行：利用TRIzol（TaKaRa）提取细胞总RNA，应用TaKaRa公司PrimeScript™ RT Master Mix(RR036A)试剂盒将RNA反转录成cDNA；采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq II RR820A试剂盒在BIO-RAD CFX96 Real-time System进行实时荧光定量PCR反应。反转录反应：37℃ 5min，85℃ 5s；实时荧光定量PCR反应：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火60s，40个循环进行PCR扩增。GAPDH作为内参,采用△△Ct方法进行分析。PCR采用的引物见表1。
表1 实时定量PCR引物列表
下述实施例中蛋白表达采用WesternBlot法检测，实施按如下方法进行：采用碧云天的Western及IP细胞裂解液(P0013)裂解细胞提取细胞总蛋白，碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)进行蛋白定量；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，采用湿转方法200毫安2h将蛋白转移至pvdf膜，室温5%BSA封闭1h，抗体孵育4℃过夜，二抗37℃孵育2h，采用化学发光法在天能化学发光仪检测。抗体具体稀释浓度：Runx2 (1:1000，Abcam)， SP7 (1:1000，Abcam), PPAR-γ (1:500，Abcam)， LPL (1:500，Santa Cruz Biotechnology)，RANKL (1:1000，Abcam)，GSK-3β (1:1000，Abcam)，p-GSK-3 (1:1000，Abcam)，β-catenin(1:1000，Abcam)， active-β-catenin (1:500，Millipor) and β-actin (1:4000，Abcam)。
下述实施例中ALP染色采用碧云天碱性磷酸酶染色试剂盒。
下述实施例中茜素红染色检测，实施按如下方法进行：细胞用4%多聚甲醛国定20min，PBS洗涤2次，1%茜素红染色37℃孵育30min，双蒸馏水洗涤2次,相机拍照。
下述实施例中油红O染色检测，实施按如下方法进行：细胞用4%多聚甲醛国定20min，PBS洗涤2次，加入油红O工作液室温染色10min，PBS洗涤2次，显微镜下拍照。
实施例1
低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞分化能力检测
一、低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的获得
将离体的低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞在含有5-10%的胎牛血清的α-MEM培养基(货号)中贴壁培养，每次传代时间为2-3天，得到3-5代的分化能力异常的间充质干细胞。
二、低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞分化能力的检测
1) 、贴壁后低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞形态观察
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3代间充质干细胞消化后细胞计数以5×104接种在12孔板中培养过夜(12h)，第二天普通光学显微镜10×物镜观察:结果如图1A-B所示，从结果中可以看出正常和疾病来源的间充质干细胞的都呈现多角的菱形细胞形状,细胞大小并无显著变化。
2)、贴壁后低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞成骨分化能力检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3代间充质干细胞消化后细胞计数分别以5×104和2×105接种到12孔板和6孔板中培养，培养至显微镜下观察细胞融合度达到90%以上，利用成骨诱导液向成骨细胞方向分化,成骨诱导分化1周进行ALP染色、成骨分化相关基因mRNA和蛋白水平检测;成骨诱导分化3周进行茜素红染色。结果如图2A-B显示，低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的ALP染色和矿化结节数量较正常对照组明显减少；基因表达检测结果如图2C-D显示，成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平上显著下降。
3)、贴壁后低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞成脂肪分化能力检测
采用2)中同样的方法接种细胞，待细胞融合度达到95%以上，利用成脂肪诱导液向脂肪细胞方向分化，成脂肪诱导分化1周进行成脂肪分化相关基因mRNA和蛋白水平检测；成脂肪诱导分化3周进行油红O染色。油红O染色结果如图3A显示，低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞较正常对照组相比，其油红O染色阳性的含脂滴细胞增多；基因表达检测结果如图3B-C显示成脂肪分化相关基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平上显著上升。
三、低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的细胞内经典Wnt信号通路检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3-5代间充质干细胞消化后细胞计数以2×105接种在6孔板中培养48h，提取总RNA和蛋白进行经典Wnt通路中关键调控因子和下游靶基因表达。信号通路相关结果如图4A-B显示，低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的细胞内p-GSK3β、active-β-catenin水平显著下降，同时下游靶基因c-Myc、RUNX2、CyclinD表达减少，以上结果提示分化能力异常的间充质干细胞经典Wnt信号通路受到抑制。
实施例2
恢复低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞分化能力
一、LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的形态和细胞毒性检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3-5代间充质干细胞消化后细胞计数分别以5×104和3×103接种在12孔板中培养过夜(12h)，和96孔板中培养1、3、5、7天，贴壁后第1天加入10mM LiCl，培养24h普通光学显微镜10×物镜观察细胞形态变化，第1、3、5、7天利用MTT方法检测LiCl对细胞的增殖活性影响。形态学观察结果如图5A-B显示，LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞并无明显影响，MTT实验如图5C显示，LiCl对两种间充质干细胞的细胞增殖并无显著毒副作用。
二、LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的分化能力恢复检测
1) 、LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的经典Wnt信号通路恢复检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3-5代间充质干细胞消化后细胞计数分别以2×105以合适密度接种在6孔板中培养过夜（12h），次日加入10mM LiCl培养24h，提取总RNA和蛋白检测经典Wnt通路中关键调控因子和下游靶基因表达。结果如图6A-B显示, LiCl处理后的低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的细胞内p-GSK3β、active-β-catenin水平显著上升，同时下游靶基因c-Myc、RUNX2、Cyclin D表达增加，提示分化能力异常的间充质干细胞经典Wnt信号通路激活。
2)、LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成骨分化能力恢复检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3代间充质干细胞消化后细胞计数分别以5×104和2×105接种到12孔板和6孔板中培养，培养至显微镜下观察细胞融合度达到90%以上向成骨细胞诱导分化，成骨诱导分组为：正常诱导组、疾病组和疾病+LiCl诱导组，诱导期间每3天跟换新鲜成骨诱导液；待成骨诱导分化1周进行ALP染色、成骨分化相关基因mRNA和蛋白水平检测；待成骨诱导分化3周进行茜素红染色。结果如图7A-D显示，疾病+LiCl组相比疾病对照组，其ALP染色和矿化结节数量明显增加，成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平上显著升高。提示LiCl具有恢复低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞成骨分化能力。
3)、LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测
采用上述2)中同样的方法接种细胞,待细胞融合度达到95%以上向脂肪细胞方向分化，成脂肪诱导分组为：正常诱导组、疾病组和疾病+LiCl组，诱导期间每3天跟换新鲜成骨诱导液；待成脂肪诱导分化1周进行成脂肪分化相关基因mRNA和蛋白水平检测; 待成脂肪诱导分化3周进行油红O染色。结果如图8A-C显示，疾病+LiCl组相比疾病对照组,其油红O染色阳性的含脂滴细胞数量明显减少，且成脂肪分化相关基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平上显著下降。提示LiCl具有恢复低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞成脂肪分化能力。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，所述方法包括：
从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离间充质干细胞，得到分化能力异常的间充质干细胞；
利用小分子化合物LiCl处理所述分化能力异常的间充质干细胞，恢复间充质干细胞分化能力。
2.根据权利要求1所述的恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，所述从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离间充质干细胞，得到分化能力异常的间充质干细胞，具体包括：
从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离间充质干细胞；
将分离得到的间充质干细胞经体外扩增培养得到分化能力异常的间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，所述低碱性磷酸酯酶症患者的临床生化检测血清中碱性磷酸酯酶活力低于正常参考范围，且患者外周血DNA基因测序发现肝/骨/肾型碱性磷酸酯酶基因(ALPL)存在突变。
4.根据权利要求2或3所述的恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，所述体外扩增培养为贴壁培养，并传代培养3-5代。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，所述患者离体间充质干细胞体外培养细胞增殖正常，成骨细胞诱导分化能力下降，成脂肪细胞诱导分化能力增强；基因表达检测，患者离体间充质干细胞的细胞内经典Wnt信号通路受到抑制。
6.根据权利要求1所述的恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，所述小分子化合物LiCl的浓度为10mM。
7.根据权利要求1或6所述的恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，
小分子化合物LiCl在成骨细胞诱导分化过程需持续给药，每3天更换新鲜培养液；
小分子化合物LiCl在成脂肪细胞诱导分化过程需持续给药，每3天更换新鲜培养液。
8.根据权利要求7所述的恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，
离体间充质干细胞成骨细胞诱导分化需3周以上；
离体间充质干细胞成脂肪细胞诱导分化需2周以上。
9.根据权利要求1-3中任意一项所述的恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于，所述恢复低碱性磷酸酯酶症患者来源的间充质干细胞能力体现在恢复细胞内经典Wnt通路中p-GSK3β、active-β-catenin等水平，促进RNUX2等基因表达提升成骨细胞分化能力或降低PPAR-γ基因表达抑制成脂肪细胞分化能力。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810473962.7A CN108624556A (zh) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | 一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法 |
| CN201910415384.6A CN110499285A (zh) | 2018-05-17 | 2019-05-17 | Alpl基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用 |
| CN201910413677.0A CN110499283A (zh) | 2018-05-17 | 2019-05-17 | Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用 |
| CN201910415382.7A CN110499284A (zh) | 2018-05-17 | 2019-05-17 | Wnt信号通路激活剂在制备治疗基因ALPL敲除小鼠牙硬组织矿化异常产品中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810473962.7A CN108624556A (zh) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | 一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108624556A true CN108624556A (zh) | 2018-10-09 |
Family
ID=63693629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810473962.7A Pending CN108624556A (zh) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | 一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108624556A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110499283A (zh) * | 2018-05-17 | 2019-11-26 | 西安组织工程与再生医学研究所 | Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用 |
-
2018
- 2018-05-17 CN CN201810473962.7A patent/CN108624556A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110499283A (zh) * | 2018-05-17 | 2019-11-26 | 西安组织工程与再生医学研究所 | Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用 |
| CN110499285A (zh) * | 2018-05-17 | 2019-11-26 | 西安组织工程与再生医学研究所 | Alpl基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | miRNA expression profile during osteogenic differentiation of human adipose‐derived stem cells | |
| Pagella et al. | A single-cell atlas of human teeth | |
| Ragni et al. | Interaction with hyaluronan matrix and miRNA cargo as contributors for in vitro potential of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of human osteoarthritic synoviocytes | |
| Wu et al. | Regenerative potentials of platelet-rich plasma enhanced by collagen in retrieving pro-inflammatory cytokine-inhibited chondrogenesis | |
| Lee et al. | Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction | |
| Moritani et al. | Spheroid culture enhances osteogenic potential of periodontal ligament mesenchymal stem cells | |
| Abo-Aziza et al. | The impact of confluence on bone marrow mesenchymal stem (BMMSC) proliferation and osteogenic differentiation | |
| Teixeira et al. | Mechanisms of muscle wasting in sarcopenia | |
| Xie et al. | Low‐intensity pulsed ultrasound promotes the proliferation of human bone mesenchymal stem cells by activating PI3K/AKt signaling pathways | |
| Zhao et al. | CircMACF1 attenuates acute myocardial infarction through miR-500b-5p-EMP1 axis | |
| Miyagawa et al. | A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation | |
| Gabler et al. | Stage-specific miRs in chondrocyte maturation: differentiation-dependent and hypertrophy-related miR clusters and the miR-181 family | |
| Liu et al. | Comparison of the biological characteristics of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and skin | |
| Takebe et al. | Cryopreservation method for the effective collection of dental pulp stem cells | |
| CN110499283A (zh) | Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用 | |
| Deng et al. | MFN2 knockdown promotes osteogenic differentiation of iPSC-MSCs through aerobic glycolysis mediated by the Wnt/β-catenin signaling pathway | |
| Mao et al. | MiR-183-5p overexpression in bone mesenchymal stem cell-derived exosomes protects against myocardial ischemia/reperfusion injury by targeting FOXO1 | |
| Ragni et al. | miR-103a-3p and miR-22-5p are reliable reference genes in extracellular vesicles from cartilage, adipose tissue, and bone marrow cells | |
| Jeske et al. | Bioreactor expansion reconfigures metabolism and extracellular vesicle biogenesis of human adipose-derived stem cells in vitro | |
| Yuan et al. | Muscone promotes the adipogenic differentiation of human gingival mesenchymal stem cells by inhibiting the Wnt/β-Catenin signaling pathway | |
| CN108624556A (zh) | 一种恢复低碱性磷酸酯酶症间充质干细胞分化能力的方法 | |
| Yang et al. | Inhibition of RIP3 increased ADSC viability under OGD and modified the competency of adipogenesis, angiogenesis, and inflammation regulation | |
| Zhu et al. | Bidirectional ephrinB2‑EphB4 signaling regulates the osteogenic differentiation of canine periodontal ligament stem cells | |
| CN104388384B (zh) | 氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用 | |
| Georgi et al. | MicroRNA levels as prognostic markers for the differentiation potential of human mesenchymal stromal cell donors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20181009 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |