CN113249332A - 一种alpl基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法，具体步骤包括：1）根据ALPL基因序列，设计sgRNA序列；2）sgRNA活性检测，确定最优sgRNA，最优sgRNA序列为GATGGACAAGTTCCCCTTCG；3）将步骤2）中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK‑puro质粒电转到骨髓间充质干细胞；4）基因敲除验证；5）将基因敲除质粒进行测序，利用本发明方法构建的ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞，可用于筛选促成骨形成药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法。
背景技术
骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）为一种具有多向分化潜能的干细胞，具有跨胚层分化的能力，其自身具有极强的自我更新能力和分化潜能，在体外培养可向成骨和软骨分化，是一种理想的细胞替代治疗资源。
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)是在全身广泛分布的一组同工酶，广泛分布于肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织，在骨质形成和肝肾代谢中发挥重要作用，其编码基因ALPL突变会导致不同程度的低碱磷酯酶症。轻症表现为牙齿发育异常和骨质疏松，重症者表现为发育畸形，甚至围产期死亡。ALP的高表达是成骨细胞分化的特异性标志，对骨骼的发育起到关键作用。
将骨髓间充质干细胞的ALPL基因缺失，可以抑制其向成骨细胞分化，利用此模型，可以筛选促成骨形成药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种ALPL基因缺失的骨髓间充质干细胞的建立方法；
本发明的制备过程如下：
本发明提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，其序列为5’-ACACCGATGGACAAGTTCCCCTTCGG-3’(Seq ID No.26)，5’-AAAACCGAAGGGGAACTTGTCCATCG-3’(Seq ID No.27)，使用该试剂盒可以用于ALPL基因表达的沉默。
进一步的，本发明提供一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法，所述制备方法包括：
1.根据ALPL基因序列，设计sgRNA序列；
在NCBI上查询人ALPL基因序列（KR711653.1，Seq ID No.82），根据CRISPR/Cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx上设计ALPL靶位点；
2.sgRNA活性检测，确定最优sgRNA；
根据sgRNA订购oligo1和oligo2；oligo1和oligo2退火形成寡核苷酸双链；将寡核苷酸双链连接到pX330载体上；再将连接产物转化至E coli DH5α感受态细胞中，经含氨苄抗性的平板37℃过夜生长，之后挑取单克隆至含氨苄抗性的LB培养基中，于37℃摇床过夜扩大培养，之后按照Tiangen小提质粒试剂盒的说明书提取质粒，最后将质粒测序；为检测sgRNA的切割效率，采用lipo3000脂质体转染法，将测序正确的质粒与Cas9载体一起转染至27组293T细胞中，转染后6-8h换液，细胞转染36h后收集细胞，加入裂解液，反复吹打混匀，56℃ 2h，99℃ 10min，提取转染后293T细胞mRNA，反转录为cDNA，以此为DNA模板，用设计好的引物进行PCR，PCR体系如下：2×Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase 1μL，dNTP Mix 1μL，PrimersF 2μL，PrimersR 2μL，PrimerF:CGTGGCTAAGAATGTCATC(Seq ID No.83)，PrimerR:GCATCTCGTTGTCTGAGT(Seq ID No.84)，cDNA 1μL，加ddH2O补至50μL，PCR程序如下：98℃预变形3min；（98℃变性15s；65℃退火15s；72℃ 延伸1min；2-4步共35个循环）；72℃延伸5min；PCR产物大小430bp左右，将PCR产物跑胶后按照Magen胶回收试剂盒说明书进行回收，得到回收产物，取800ng回收产物，2μL 10×NEB bufferⅡ，加ddH2O补至20μL，梯度退火：95℃，10min；95℃至85℃ Ramp：2.0℃/s；85℃至25℃ Ramp 0.2℃/s；16℃ forever；向退火后的产物中加0.5μL T7核酸内切酶Ⅰ，37℃水浴30min，之后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，通过是否有切开后的相对小的两条目的条带以及被切开的条带所占的比例选择切割效率最高的sgRNA；
3.将步骤2）中切割效率最高的重组质粒和嘌呤霉素抗性的PGK-puro质粒电转到骨髓间充质干细胞；
待骨髓间充质干细胞密度为70%-80%时，按照Lonza电转说明书，将切割效率最高的重组质粒和嘌呤霉素抗性的PGK-puro质粒共转染到骨髓间充质干细胞中，待转染48h后，将细胞传代至10cm细胞培养皿培养，待细胞贴壁后加入嘌呤霉素（1μg/mL）进行筛选3d，经过2周的培养后挑选细胞克隆，并扩大培养；
4.基因敲除验证；
取ALPL基因敲除的骨髓间充质干细胞，收集到离心管中，用裂解液反复吹打混匀，56℃，2h；99℃，10min，然后提取mRNA，反转录为cDNA，以此为DNA模板，用设计好的引物进行PCR扩增，PCR扩增引物、体系、程序同步骤2，将PCR产物跑胶后按照Magen胶回收试剂盒说明书进行回收，得到回收产物，取800ng回收产物，2μL 10×NEB bufferⅡ，加ddH2O补至20μL，梯度退火：95℃，10min；95℃至85℃ Ramp：2.0℃/s；85℃至25℃ Ramp 0.2℃/s；16℃forever；向退火后的产物中加0.5μL T7核酸内切酶Ⅰ，37℃水浴30min，之后用2%琼脂糖凝胶电泳检测；
5.将基因敲除质粒进行测序；
将PCR鉴定已敲除的细胞，提取DNA，交生物公司测序。
本发明的有益效果和优点在于：
本发明提供一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法，根据所述方法构建的ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞，在成骨诱导培养液下不分化为成骨细胞，可用于筛选促成骨形成药物。
附图说明
图1：基因敲除验证
图2：基因敲除序列与野生型序列比对
图3：正常骨髓间充质干细胞与ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞成骨分化对比。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1：ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法
本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；
表1 材料和试剂
| 仪器名称 | 购买公司 |
| 人骨髓间充质干细胞 | 武汉普诺赛生命科技有限公司 |
| pX330载体 | 湖南丰晖生物科技有限公司 |
| 质粒小提试剂盒 | 天根生化科技有限公司 |
| 氨苄青霉素 | 上海善然生物科技有限公司 |
| 考马斯亮蓝R-250 | 上海联硕生物科技有限公司 |
| 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 | 大连宝生物工程有限公司 |
| 限制性内切酶 | 大连宝生物工程有限公司 |
| PCR试剂盒 | 北京索莱宝科技有限公司 |
表2 实验仪器
| 仪器名称 | 购买公司 |
| PCR仪 | 力康生物医疗科技控股有限公司 |
| DYY-6D型核酸电泳仪 | 北京市六一仪器厂 |
| GelDoc凝胶成像系统 | 美国Bio-Rad公司 |
| 紫外可见光分光光度计 | 上海谱元仪器有限公司 |
| 微量高速离心机 | 上海富雪生物科技有限公司 |
| 恒温培养摇床 | 常州润华电气有限公司 |
| 生化培养箱 | 苏州江东精密仪器有限公司 |
1.在NCBI上查询人ALPL基因序列（KR711653.1，Seq ID No.82），根据CRISPR/Cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx上设计ALPL靶位点，见表3；
表3 靶位点序列
| 序号 | sgRNA | Oligo1 | Oligo2 |
| sgRNA1 | GATTTCACCATTCTTAGTAC（Seq No ID.1） | ACACCGATTTCACCATTCTTAGTACG（Seq No ID.2） | AAAACGTACTAAGAATGGTGAAATCG（Seq No ID.3） |
| sgRNA2 | GTCATCATGTTCCTGGGAGA（Seq No ID.4） | ACACCGTCATCATGTTCCTGGGAGAG（Seq No ID.5） | AAAACTCTCCCAGGAACATGATGACG（Seq No ID.6） |
| sgRNA3 | GATGGGTGTCTCCACAGTGA（Seq No ID.7） | ACACCGATGGGTGTCTCCACAGTGAG（Seq No ID.8） | AAAACTCACTGTGGAGACACCCATCG(Seq No ID.9) |
| sgRNA4 | GACGGCTGCCCGCATCCTCA（Seq No ID.10） | ACACCGACGGCTGCCCGCATCCTCAG（Seq No ID.11） | AAAACTGAGGATGCGGGCAGCCGTCG(Seq No ID.12) |
| sgRNA5 | GGTCAGCTCCACCACAACCC（Seq No ID.13） | ACACCGGTCAGCTCCACCACAACCCG（Seq No ID.14） | AAAACGGGTTGTGGTGGAGCTGACCG(Seq No ID.15) |
| sgRNA6 | GTCAGCTCCACCACAACCCT（Seq No ID.16） | ACACCGTCAGCTCCACCACAACCCTG（Seq No ID.17） | AAAACAGGGTTGTGGTGGAGCTGACG(Seq No ID.18) |
| sgRNA7 | GCTCCACCACAACCCTGGGG（Seq No ID.19） | ACACCGCTCCACCACAACCCTGGGGG（Seq No ID.20） | AAAACCCCCAGGGTTGTGGTGGAGCG(Seq No ID.21) |
| sgRNA8 | GGAGGAGACCAGGCTGGAGA（Seq No ID.22） | ACACCGGAGGAGACCAGGCTGGAGAG（Seq No ID.23） | AAAACTCTCCAGCCTGGTCTCCTCCG(Seq No ID.24) |
| sgRNA9 | GATGGACAAGTTCCCCTTCG（Seq No ID.25） | ACACCGATGGACAAGTTCCCCTTCGG（Seq No ID.26） | AAAACCGAAGGGGAACTTGTCCATCG(Seq No ID.27) |
| sgRNA10 | GACGTACAACACCAATGCCC（Seq No ID.28） | ACACCGACGTACAACACCAATGCCCG（Seq No ID.29） | AAAACGGGCATTGGTGTTGTACGTCG(Seq No ID.30) |
| sgRNA11 | GTCCTTACAGCCCTGGCTCA（Seq No ID.31） | ACACCGTCCTTACAGCCCTGGCTCAG（Seq No ID.32） | AAAACTGAGCCAGGGCTGTAAGGACG(Seq No ID.33) |
| sgRNA12 | GCCCTGGCTCAAGGCCTCAG（Seq No ID.34） | ACACCGCCCTGGCTCAAGGCCTCAGG（Seq No ID.35） | AAAACCTGAGGCCTTGAGCCAGGGCG(Seq No ID.36) |
| sgRNA13 | GTCAGCCGAGTGGGCGTAGG（Seq No ID.37） | ACACCGTCAGCCGAGTGGGCGTAGGG（Seq No ID.38） | AAAACCCTACGCCCACTCGGCTGACG(Seq No ID.39) |
| sgRNA14 | GAGTGGGCGTAGGCGGCGCT（Seq No ID.40） | ACACCGAGTGGGCGTAGGCGGCGCTG（Seq No ID.41） | AAAACAGCGCCGCCTACGCCCACTCG(Seq No ID.42) |
| sgRNA15 | GTGGGCGTAGGCGGCGCTGG（Seq No ID.43） | ACACCGTGGGCGTAGGCGGCGCTGGG（Seq No ID.44） | AAAACCCAGCGCCGCCTACGCCCACG(Seq No ID.45) |
| sgRNA16 | GCTGTCAGGGACCTGGGCAT（Seq No ID.46） | ACACCGCTGTCAGGGACCTGGGCATG（Seq No ID.47） | AAAACATGCCCAGGTCCCTGACAGCG(Seq No ID.48) |
| sgRNA17 | GGCATTGGTGTTGTACGTCT（Seq No ID.49） | ACACCGGCATTGGTGTTGTACGTCTG（Seq No ID.50） | AAAACAGACGTACAACACCAATGCCG(Seq No ID.51) |
| sgRNA18 | GGTGTTGTACGTCTTGGAGA（Seq No ID.52） | ACACCGGTGTTGTACGTCTTGGAGAG（Seq No ID.53） | AAAACTCTCCAAGACGTACAACACCG(Seq No ID.54) |
| sgRNA19 | GTCTTGGAGAGGGCCACGAA（Seq No ID.55） | ACACCGTCTTGGAGAGGGCCACGAAG（Seq No ID.56） | AAAACTTCGTGGCCCTCTCCAAGACG(Seq No ID.57) |
| sgRNA20 | GAACTTGTCCATCTCCAGCC（Seq No ID.58） | ACACCGAACTTGTCCATCTCCAGCCG（Seq No ID.59） | AAAACGGCTGGAGATGGACAAGTTCG(Seq No ID.60) |
| sgRNA21 | GGAGCTGACCCTTGAGGATG（Seq No ID.61） | ACACCGGAGCTGACCCTTGAGGATGG（Seq No ID.62） | AAAACCATCCTCAAGGGTCAGCTCCG(Seq No ID.63) |
| sgRNA22 | GAGCTGACCCTTGAGGATGC（Seq No ID.64） | ACACCGAGCTGACCCTTGAGGATGCG（Seq No ID.65） | AAAACGCATCCTCAAGGGTCAGCTCG(Seq No ID.66) |
| sgRNA23 | GATGCGGGCAGCCGTCACTG（Seq No ID.67） | ACACCGATGCGGGCAGCCGTCACTGG（Seq No ID.68） | AAAACCAGTGACGGCTGCCCGCATCG(Seq No ID.69) |
| sgRNA24 | GATGACATTCTTAGCCACGT（Seq No ID.70） | ACACCGATGACATTCTTAGCCACGTG（Seq No ID.71） | AAAACACGTGGCTAAGAATGTCATCG(Seq No ID.72) |
| sgRNA25 | GTTGAGCTTCTGAAGCTCCA（Seq No ID.73） | ACACCGTTGAGCTTCTGAAGCTCCAG（Seq No ID.74） | AAAACTGGAGCTTCAGAAGCTCAACG(Seq No ID.75) |
| sgRNA26 | GCTTGGTCTCGCCAGTACTT（Seq No ID.76） | ACACCGCTTGGTCTCGCCAGTACTTG（Seq No ID.77） | AAAACAAGTACTGGCGAGACCAAGCG(Seq No ID.78) |
| sgRNA27 | GTTAGTAAGGCAGGTGCCAA（Seq No ID.79） | ACACCGTTAGTAAGGCAGGTGCCAAG（Seq No ID.80） | AAAACTTGGCACCTGCCTTACTAACG(Seq No ID.81) |
2.根据sgRNA订购oligo1和oligo2；
3.oligo1和oligo2退火形成寡核苷酸双链；用ddH2O分别将oligo1和oligo2溶解为10μM的溶液，正链与负链各3μL，10×NEB Buffer Ⅱ5μL，ddH2O补足至50μL，混匀后置于PCR仪中，设置退火程序：95℃ 10:00min；95℃到85℃ Ramp:1.0℃/sec；85℃到25℃ Ramp:0.1℃/sec；16℃ forever；
4.将寡核苷酸双链连接到pX330载体上；酶切pX330载体，琼脂糖凝胶电泳酶切产物，胶回收酶切载体，微量分光光度计测量回收后载体浓度，取回收后的载体50ng，与退火后的sgRNA寡核苷酸双链连接，再将连接产物转化至E coli DH5α感受态细胞中，经含氨苄抗性的平板37℃过夜生长，之后挑取单克隆至含氨苄抗性的LB培养基中，于37℃摇床过夜扩大培养，之后按照Tiangen小提质粒试剂盒的说明书提取质粒，最后将质粒测序；
5.sgRNA活性的检测
为检测sgRNA的切割效率，采用lipo3000脂质体转染法，将测序正确的质粒与Cas9载体一起转染至27组293T细胞中，转染后6-8h换液，细胞转染36h后收集细胞，加入裂解液，反复吹打混匀，56℃ 2h，99℃ 10min，提取转染后293T细胞mRNA，反转录为cDNA，以此为DNA模板，用设计好的引物进行PCR，PCR反应体系如下：2×Phanta Max Buffer 25μL，PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，dNTP Mix 1μL，PrimersF 2μL，PrimersR 2μL，PrimerF:CGTGGCTAAGAATGTCATC(Seq ID No.83)，PrimerR:GCATCTCGTTGTCTGAGT(Seq IDNo.84)，cDNA 1μL，加ddH2O补至50μL，PCR程序如下：98℃预变形3min；（98℃变性15s；65℃退火15s；72℃ 延伸1min；2-4步共35个循环）；72℃延伸5min；PCR产物大小430bp左右，将PCR产物跑胶后按照Magen胶回收试剂盒说明书进行回收，得到回收产物，取800ng回收产物，2μL 10×NEB bufferⅡ，加ddH2O补至20μL，梯度退火：95℃，10min；95℃至85℃ Ramp：2.0℃/s；85℃至25℃ Ramp 0.2℃/s；16℃ forever；向退火后的产物中加0.5μL T7核酸内切酶Ⅰ，37℃水浴30min，之后用2%琼脂糖凝胶电泳检测（图1），通过是否有切开后的相对小的两条目的条带以及被切开的条带所占的比例选择切割效率最高的sgRNA，实验结果见表4，计算公式如下：
表4 sgRNA切割效率（%）
| 编号 | 切割效率 | 编号 | 切割效率 | 编号 | 切割效率 |
| sgRNA1 | 3.58 | sgRNA10 | 58.57 | sgRNA19 | 59.31 |
| sgRNA2 | 70.19 | sgRNA11 | 18.83 | sgRNA20 | 62.69 |
| sgRNA3 | 9.27 | sgRNA12 | 26.48 | sgRNA21 | 55.35 |
| sgRNA4 | 14.54 | sgRNA13 | 70.76 | sgRNA22 | 34.58 |
| sgRNA5 | 1.67 | sgRNA14 | 33.23 | sgRNA23 | 25.35 |
| sgRNA6 | 20.50 | sgRNA15 | 35.47 | sgRNA24 | 51.23 |
| sgRNA7 | 3.52 | sgRNA16 | 68.85 | sgRNA25 | 11.16 |
| sgRNA8 | 40.97 | sgRNA17 | 54.90 | sgRNA26 | 19.94 |
| sgRNA9 | 78.96 | sgRNA18 | 12.09 | sgRNA27 | 14.78 |
最终选择sgRNA9：GATGGACAAGTTCCCCTTCG；
6.将步骤5）中切割效率最高的重组质粒和嘌呤霉素抗性的PGK-puro质粒电转到骨髓间充质干细胞；
待骨髓间充质干细胞密度为70%-80%时，按照Lonza电转说明书，将重组质粒（sgRNA9）和嘌呤霉素抗性的PGK-puro质粒共转染到骨髓间充质干细胞中，待转染48h后，将细胞传代至10cm细胞培养皿培养，待细胞贴壁后加入嘌呤霉素（1μg/mL）进行筛选3d，经过2周的培养后挑选细胞克隆，并扩大培养；
7.基因敲除验证；取ALPL基因敲除的骨髓间充质干细胞，收集到离心管中，用裂解液反复吹打混匀，56℃，2h；99℃，10min，然后提取细胞mRNA，反转录为cDNA，以此为DNA模板，用设计好的引物进行PCR扩增，PCR扩增引物、体系、程序同步骤5，将PCR产物跑胶后按照Magen胶回收试剂盒说明书进行回收，得到回收产物，取800ng回收产物，2μL 10×NEBbufferⅡ，加ddH2O补至20μL，梯度退火：95℃，10min；95℃至85℃ Ramp：2.0℃/s；85℃至25℃ Ramp 0.2℃/s；16℃ forever；向退火后的产物中加0.5μL T7核酸内切酶Ⅰ，37℃水浴30min，之后用2%琼脂糖凝胶电泳检测；
8.将PCR鉴定已敲除的细胞，提取DNA，交生物公司测序，敲除细胞与野生型序列对比见图2。
实施例2 骨髓间充质干细胞诱导成骨分化
分别取野生型和基因缺失型第3代骨髓间充质干细胞，按1×104密度接种于12孔板，培养24h细胞贴壁后换用含1×107μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、10mmol/L β-甘油磷酸钠、体积分数为0.07肽牛血清的成骨诱导液培养，每隔3d换液，第20天茜素红染色。
实验结果显示野生型骨髓间充质干细胞在成骨诱导液的作用下，向骨细胞分化，但是基因缺失型骨髓间充质干细胞则不分化(图3)。
序列表
<110> 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院）
<120> 一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatttcacca ttcttagtac 20
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaccgattt caccattctt agtacg 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaacgtact aagaatggtg aaatcg 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcatcatgt tcctgggaga 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acaccgtcat catgttcctg ggagag 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaactctcc caggaacatg atgacg 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatgggtgtc tccacagtga 20
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acaccgatgg gtgtctccac agtgag 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaactcact gtggagacac ccatcg 26
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacggctgcc cgcatcctca 20
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acaccgacgg ctgcccgcat cctcag 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaactgagg atgcgggcag ccgtcg 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtcagctcc accacaaccc 20
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acaccggtca gctccaccac aacccg 26
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaaacgggtt gtggtggagc tgaccg 26
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
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gtcagctcca ccacaaccct 20
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
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<400> 17
acaccgtcag ctccaccaca accctg 26
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<211> 26
<212> DNA
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<400> 18
aaaacagggt tgtggtggag ctgacg 26
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 19
gctccaccac aaccctgggg 20
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acaccgctcc accacaaccc tggggg 26
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<211> 26
<212> DNA
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<400> 21
aaaaccccca gggttgtggt ggagcg 26
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggaggagacc aggctggaga 20
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acaccggagg agaccaggct ggagag 26
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaaactctcc agcctggtct cctccg 26
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gatggacaag ttccccttcg 20
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acaccgatgg acaagttccc cttcgg 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaaaccgaag gggaacttgt ccatcg 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gacgtacaac accaatgccc 20
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acaccgacgt acaacaccaa tgcccg 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaaacgggca ttggtgttgt acgtcg 26
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtccttacag ccctggctca 20
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acaccgtcct tacagccctg gctcag 26
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aaaactgagc cagggctgta aggacg 26
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gccctggctc aaggcctcag 20
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acaccgccct ggctcaaggc ctcagg 26
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aaaacctgag gccttgagcc agggcg 26
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtcagccgag tgggcgtagg 20
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acaccgtcag ccgagtgggc gtaggg 26
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aaaaccctac gcccactcgg ctgacg 26
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gagtgggcgt aggcggcgct 20
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acaccgagtg ggcgtaggcg gcgctg 26
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aaaacagcgc cgcctacgcc cactcg 26
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtgggcgtag gcggcgctgg 20
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acaccgtggg cgtaggcggc gctggg 26
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aaaacccagc gccgcctacg cccacg 26
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gctgtcaggg acctgggcat 20
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acaccgctgt cagggacctg ggcatg 26
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
aaaacatgcc caggtccctg acagcg 26
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ggcattggtg ttgtacgtct 20
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acaccggcat tggtgttgta cgtctg 26
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aaaacagacg tacaacacca atgccg 26
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggtgttgtac gtcttggaga 20
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acaccggtgt tgtacgtctt ggagag 26
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aaaactctcc aagacgtaca acaccg 26
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
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<400> 55
gtcttggaga gggccacgaa 20
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acaccgtctt ggagagggcc acgaag 26
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aaaacttcgt ggccctctcc aagacg 26
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gaacttgtcc atctccagcc 20
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
acaccgaact tgtccatctc cagccg 26
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
aaaacggctg gagatggaca agttcg 26
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ggagctgacc cttgaggatg 20
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acaccggagc tgacccttga ggatgg 26
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
aaaaccatcc tcaagggtca gctccg 26
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gagctgaccc ttgaggatgc 20
<210> 65
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acaccgagct gacccttgag gatgcg 26
<210> 66
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aaaacgcatc ctcaagggtc agctcg 26
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gatgcgggca gccgtcactg 20
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
acaccgatgc gggcagccgt cactgg 26
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
aaaaccagtg acggctgccc gcatcg 26
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gatgacattc ttagccacgt 20
<210> 71
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acaccgatga cattcttagc cacgtg 26
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
aaaacacgtg gctaagaatg tcatcg 26
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gttgagcttc tgaagctcca 20
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acaccgttga gcttctgaag ctccag 26
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
aaaactggag cttcagaagc tcaacg 26
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gcttggtctc gccagtactt 20
<210> 77
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
acaccgcttg gtctcgccag tacttg 26
<210> 78
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
aaaacaagta ctggcgagac caagcg 26
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gttagtaagg caggtgccaa 20
<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
acaccgttag taaggcaggt gccaag 26
<210> 81
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
aaaacttggc acctgcctta ctaacg 26
<210> 82
<211> 1707
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 82
gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag 60
ttggcaccat gatttcacca ttcttagtac tggccattgg cacctgcctt actaactcct 120
tagtgccaga gaaagagaaa gaccccaagt actggcgaga ccaagcgcaa gagacactga 180
aatatgccct ggagcttcag aagctcaaca ccaacgtggc taagaatgtc atcatgttcc 240
tgggagatgg gatgggtgtc tccacagtga cggctgcccg catcctcaag ggtcagctcc 300
accacaaccc tggggaggag accaggctgg agatggacaa gttccccttc gtggccctct 360
ccaagacgta caacaccaat gcccaggtcc ctgacagcgc cggcaccgcc accgcctacc 420
tgtgtggggt gaaggccaat gagggcaccg tgggggtaag cgcagccact gagcgttccc 480
ggtgcaacac cacccagggg aacgaggtca cctccatcct gcgctgggcc aaggacgctg 540
ggaaatctgt gggcattgtg accaccacga gagtgaacca tgccaccccc agcgccgcct 600
acgcccactc ggctgaccgg gactggtact cagacaacga gatgccccct gaggccttga 660
gccagggctg taaggacatc gcctaccagc tcatgcataa catcagggac attgacgtga 720
tcatgggggg tggccggaaa tacatgtacc ccaagaataa aactgatgtg gagtatgaga 780
gtgacgagaa agccaggggc acgaggctgg acggcctgga cctcgttgac acctggaaga 840
gcttcaaacc gagacacaag cactcccact tcatctggaa ccgcacggaa ctcctgaccc 900
ttgaccccca caatgtggac tacctattgg gtctcttcga gccgggggac atgcagtacg 960
agctgaacag gaacaacgtg acggacccgt cactctccga gatggtggtg gtggccatcc 1020
agatcctgcg gaagaacccc aaaggcttct tcttgctggt ggaaggaggc agaattgacc 1080
acgggcacca tgaaggaaaa gccaagcagg ccctgcatga ggcggtggag atggaccggg 1140
ccatcgggca ggcaggcagc ttgacctcct cggaagacac tctgaccgtg gtcactgtgg 1200
accattccca cgtcttcaca tttggtggat acaccccccg tggcaactct atctttggtc 1260
tggcccccat gctgagtgac acagacaaga agcccttcac tgccatcctg tatggcaatg 1320
ggcctggcta caaggtggtg ggcggtgaac gagagaatgt ctccatggtg gactatgctc 1380
acaacaacta ccaggcgcag tctgctgtgc ccctgcgcca cgagacccac ggcggggagg 1440
acgtggccgt cttctccaag ggccccatgg cgcacctgct gcacggcgtc cacgagcaga 1500
actacgtccc ccacgtgatg gcgtatgcag cctgcatcgg ggccaacctc ggccactgtg 1560
ctcctgccag ctcggcaggc agccttgctg caggccccct gctgctcgcg ctggccctct 1620
accccctgag cgtcctgttc ttgccaactt tcttgtacaa agttggcatt ataagaaagc 1680
attgcttatc aatttgttgc aacgaac 1707
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
cgtggctaag aatgtcatc 19
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gcatctcgtt gtctgagt 18
Claims (6)
1.一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 根据ALPL基因序列，设计sgRNA序列；
2) sgRNA活性检测，确定最优sgRNA，最优sgRNA序列为GATGGACAAGTTCCCCTTCG，具体步骤包括：
a.将寡核苷酸双链连接到pX330载体上，再将连接产物转化至E coli DH5α感受态细胞中，扩大培养，提取质粒；
b.将步骤a构建好的质粒与Cas9载体一起转染至27组293T细胞中；
c.提取步骤b转染后293T细胞mRNA，反转录为cDNA，以此为DNA模板，用设计好的引物进行PCR；
d.酶切步骤c中的PCR产物；
e.通过是否有切开后的相对小的两条目的条带以及被切开的条带所占的比例选择切割效率最高的sgRNA；
3) 将步骤2）中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK-puro质粒电转到骨髓间充质干细胞；
4) 基因敲除验证；
5) 将基因敲除质粒进行测序。
2.根据权利要求1所述的一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤2) c中所述的PCR引物序列为PrimerF:CGTGGCTAAGAATGTCATC，PrimerR:GCATCTCGTTGTCTGAGT。
3.根据权利要求1所述的一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤2) c中PCR反应体系为2×Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase 1μL，dNTP Mix 1μL，PrimersF 2μL，PrimersR 2μL，cDNA 1μL，加ddH2O补至50μL。
4.根据权利要求1所述的一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应程序为：98℃预变形3min；(98℃变性15s；65℃退火15s；72℃ 延伸1min；2-4步共35个循环)；72℃延伸5min。
5.根据权利要求1所述的一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤2）d中使用T7核酸内切酶Ⅰ进行酶切验证。
6.根据权利要求1所述的一种ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞的应用，其特征在于，所述的ALPL基因缺失骨髓间充质干细胞，用于筛选促成骨形成药物。
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|---|---|---|---|
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