CN112126621A - Ampk激活剂在制备改善骨髓间充质干细胞内ampk信号通路异常产品中的应用 - Google Patents

Ampk激活剂在制备改善骨髓间充质干细胞内ampk信号通路异常产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了AMPK激活剂在制备改善骨髓间充质干细胞内AMPK信号通路异常产品中的应用。体外实验证实低碱性磷酸酯酶症患者或ALPL敲除小鼠来源的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力异常，信号通路蛋白芯片发现成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞的细胞内AMPK蛋白磷酸化显著下降，利用AMPK激活剂二甲双胍作用于成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞，使阻断的下游通路重新启动，恢复了成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞的成骨分化特性。

Description

AMPK激活剂在制备改善骨髓间充质干细胞内AMPK信号通路异 常产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及AMPK激活剂在制备改善骨髓间充质干细胞内AMPK信号通路异常产品中的应用。
背景技术
组织非特异性碱性磷酸酯酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNAP)是由肝/ 骨/肾型碱性磷酸酶基因(liver/bone/kidney alkaline phosphatase，ALPL)编码的一种组织非特 异性的碱性磷酸酶，主要通过水解焦磷酸或多磷酸盐的磷酸酯键释放单磷酸发挥去磷酸化作 用。研究证实，组织非特异性碱性磷酸酯酶在生物体内利用磷酸酶特性通过去除LPS磷酸基 团达到去毒素作用。此外组织非特异性碱性磷酸酯酶水解焦磷酸盐释放的单磷酸盐结合钙离 子沉积在骨细胞外基质并结晶即骨骼矿化。组织非特异性碱性磷酸酯酶在维持机体骨骼矿化 和骨稳态发挥重要作用，同样在骨发育和骨缺损再生修复过程扮演重要角色。临床上ALPL 基因突变导致低碱性磷酸酯酶症(Hypophosphatasia，HPP)发生，患者临床表型主要伴随机体 骨骼发育畸形，存在骨骼严重矿化不足。由于HPP潜在致病的分子机理尚不十分清楚，目前 临床上治疗HPP患者采用的常规方案只能减缓或推迟骨量下降，不能从根本上解决骨发育缺 陷这一首要问题。
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)是存在骨组织中 的一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，是骨组织中成骨细胞的祖细胞决定骨发育的 命运，其在骨折和骨缺损修复再生中也发挥关键作用。低碱性磷酸酯酶症患者骨髓内的骨髓 间充质干细胞由于ALPL突变可能导致细胞多项分化潜能和免疫调节等生物学特性出现异常， 尤其是分化为成骨细胞能力不足致使机体的骨骼发育出现异常。我们前期研究证实低碱性磷 酸酯酶症患者或ALPL敲除小鼠的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力明显下降，这与低碱性 磷酸酯酶症患者或ALPL敲除小鼠骨量下降相吻合。同时，经信号通路蛋白芯片筛选发现 ALPL基因突变或ALPL敲除的骨髓间充质干细胞细胞内的AMPK信号及下游靶基因出现异 常。因此，以AMPK作为靶点通过小分子药物纠正骨髓间充质干细胞细胞内AMPK异常状 态，进而筛选出有效改善或恢复ALPL基因突变或ALPL敲除骨髓间充质干细胞的成骨分化 能力。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了AMPK激活剂在制备改善骨髓间充质干细胞 内AMPK信号通路异常产品中的应用。体外实验证实低碱性磷酸酯酶症患者或ALPL敲除小 鼠来源的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力异常，信号通路蛋白芯片发现成骨分化能力异常 的骨髓间充质干细胞的细胞内AMPK蛋白磷酸化显著下降，利用AMPK激活剂二甲双胍作 用于成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞，使阻断的下游通路重新启动，恢复了成骨分化 能力异常的骨髓间充质干细胞的成骨分化特性。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明第一方面，提供了AMPK激活剂在制备改善骨髓间充质干细胞内AMPK信号通路异常产品中的应用，所述AMPK激活剂为二甲双胍。
本发明第二方面，提供了二甲双胍在调控基因RUNX2和OCN表达水平方面的应用。
本发明第三方面，提供了二甲双胍在制备骨相关疾病治疗药物制剂方面的应用。
优选地，所述骨相关疾病包括成骨形成相关疾病和软骨相关疾病，所述成骨形成相关 疾病包括低碱性磷酸脂酶症、成骨不全、骨质疏松、派杰氏病(paget's)或溶骨性骨转移；所述 软骨相关疾病包括软骨发育不良、软骨肉瘤、骨软化或骨关节炎。
所述派杰氏病又称湿疹样癌，英文译为：Paget‘s disease。分为乳腺派杰氏病(mammary Paget s disease，MPD)和乳腺外派杰氏病(extramammary Paget S disease，EMPD)。
本发明第四方面，提供一种产品，所述产品包括骨相关疾病治疗有效量的二甲双胍。
本发明第五方面，提供一种组合物，所述组合物包括二甲双胍和成骨诱导液。
优选地，所述二甲双胍的纯度标准要求≥99％，等级要求细胞培养用；所述二甲双胍 使用前进行无菌处理，所述二甲双胍的浓度为0.1mM。
优选地，所述成骨诱导液为包含10nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠、0.05g/L 维生素C、1％青霉素-链霉素、5％胎牛血清的α-MEM培养基。
本发明第六方面，提供了所述的产品、或所述的组合物在改善骨髓间充质干细胞内 AMPK信号通路异常方面的应用。
本发明第七方面，提供了一种改善骨髓间充质干细胞内AMPK信号通路异常的方法， 包括以下步骤：获取AMPK信号通路异常的骨髓间充质干细胞，使用权利要求5所述的产品 或权利要求6所述的组合物对所述成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞进行诱导分化。
本发明第八方面，提供了一种调控基因RUNX2和OCN表达水平的方法，包括以下步骤：获取RUNX2和OCN表达水平降低的骨髓间充质干细胞，使用上述的产品或上述组合物 对所述基因RUNX2和OCN表达水平降低的骨髓间充质干细胞进行诱导分化。
优选地，所述诱导分化过程为：将离体的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞传代 培养1-3代，当所述骨髓间充质干细胞的融合度到达90％以上，去除正常细胞培养液，更换 含二甲双胍的成骨诱导液，向成骨细胞诱导分化，每隔3天更换新鲜含二甲双胍的成骨诱导 液，向成骨细胞诱导分化21天以上。
所述成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞可为基因突变发生于ALPL基因编码区的 任一单个位点或多个位点突变所致组织非特异型碱性磷酸酯酶酶活力缺陷；或成骨分化能力 异常的离体骨髓间充质干细胞可为全基因组敲除或间充质干细胞条件敲除ALPL所致组织非 特异型碱性磷酸酯酶酶活力缺陷。本发明的优选实施例中，上述所用的成骨分化能力异常的 离体骨髓间充质干细胞包含2个突变位点人源的ALPL基因或小鼠全基因组敲除ALPL基因。
上述成骨分化能力异常的离体骨髓间充质干细胞的特征体现在：与正常离体骨髓间充 质干细胞相比，细胞的组织非特异型碱性磷酸酯酶酶活力低下且蛋白表达量减低、、细胞的成 骨细胞分化能力减弱、细胞内AMPK信号通路异常。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明通过实验证明，组织非特异性碱性磷酸酯酶功能缺陷的骨髓间充质干细胞骨向分化能 力减弱，细胞内AMPK信号通路受到抑制，本发明采用二甲双胍持续作用于成骨分化能力异 常的骨髓间充质干细胞，通过恢复细胞AMPK信号通路重新启动已经阻断的下游靶基因表达， 促进成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化能力；而且本发明采用了一种 临床上常用于治疗糖尿病的小分子化合物二甲双胍，具有操作简单、成本低廉、安全可靠、 效果显著等特点，实现了恢复组织非特异性碱性磷酸酯酶功能缺陷骨髓间充质干细胞成骨分 化能力，同时为临床上低碱性磷酸酯酶症患者治疗提供潜在的思路和方案。
附图说明
图1A实施例1中为正常组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周进行茜素红染色结果 示意图；
图1B实施例1中为HPP组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周进行茜素红染色结果示意图；
图2为实施例1中正常组和HPP组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周基因表达检测结果对 照图；
图3为实施例1中正常组和HPP组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周成骨分化相关基因 RUNX2、OCN在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图4为实施例1中正常组和HPP组骨髓间充质干细胞AMPK信号通路检测结果；
图5A为实施例1中正常组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周进行茜素红染色结果示意图；
图5B为实施例1中HPP组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周进行茜素红染色结果示意图；
图5C为实施例1中HPP+Met组成骨诱导分化3周进行茜素红染色结果示意图；
图6为实施例1中正常、HPP、HPP+Met三个组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周成骨分化相关基因RUNX2、OCN在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图7为实施例1中正常、HPP、HPP+Met三个组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周基因表达检测结果对照图；
图8为实施例1中正常、HPP、HPP+Met三个组骨髓间充质干细胞AMPK信号通路检测结果。
图9A为实施例2中ALPL+/+骨髓间充质干细胞成骨诱导分化2周进行茜素红染色结果 示意图；
图9B为实施例2中ALPL+/-骨髓间充质干细胞成骨诱导分化2周进行茜素红染色结果示意图；
图10为实施例2中ALPL+/+组和ALPL+/-组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周基因表达检 测结果对照图；
图11为实施例2中ALPL+/+组和ALPL+/-组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化2周成骨分化相 关基因RUNX2、OCN在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图12为实施例2中ALPL+/+组和ALPL+/-组骨髓间充质干细胞AMPK信号通路检测结果。
图13A为实施例2中ALPL+/+组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周进行茜素红染色结果示意图；
图13B为实施例2中ALPL+/-组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周进行茜素红染色结果示 意图；
图13C为实施例2中ALPL+/-+Met组成骨诱导分化3周进行茜素红染色结果示意图；
图14为实施例2中ALPL+/+、ALPL+/-、ALPL+/-+Met三个组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周成骨分化相关基因RUNX2、OCN在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图15为实施例2中ALPL+/+、ALPL+/-、ALPL+/-+Met三个组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化3周基因表达检测结果对照图；
图16为实施例2中ALPL+/+、ALPL+/-、ALPL+/-+Met三个组骨髓间充质干细胞AMPK信号通路检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中组织非特异性碱性磷酸酯酶成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞可 以按照如下方法制备：
1.HPP患者骨髓间充质干细胞的获取：将临床上废弃的患者骨髓组织利用Percoll分离液(美 国Pharmacia)进行白膜层细胞分离。步骤如下：将稀释好的Percoll工作液与骨髓样本混匀， 2000rpm离心20min；离心后液体出现分层，用移液器吸取白膜层细胞至新的离心管中，加 入PBS洗涤，1000rpm离心10min；离心后弃掉上清液再次用PBS洗涤细胞，8000rpm离心 5min；离心后用细胞培养液悬浮细胞,接种至细胞培养皿中放置细胞培养箱进行培养、传代、 扩增。
2.ALPL敲除小鼠骨髓间充质干细胞的获取：麻药麻醉ALPL敲除小鼠，颈椎脱臼处死小鼠，经75％酒精浸泡消毒处理，采用眼科剪分离小鼠股骨，剔除股骨上的肌肉及韧带组织并将骨头两端去除使骨髓腔暴露，用1mL注射器将骨髓组织冲出，用移液器反复吹打数次使骨髓组织分散，最后接种至细胞培养皿中放置细胞培养箱进行培养、扩增和传代。
下述实施例中细胞培养皿购自美国Corning公司。
下述实施例中的PBS缓冲液购自北京康为世纪生物科技有限公司。
下述实施例中的细胞培养基(α-MEM培养基)购自美国gibco公司。
下述实施例中二甲双胍购自Sigma公司。
下述实施例中细胞成骨诱导液可以按如下方法配制:
人骨髓间充质干细胞成骨诱导液：含10nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠、0.05g/L维生素C、1％青霉素-链霉素、5％胎牛血清的α-MEM培养基。
小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导液含10nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠、 0.05g/L维生素C、1％青霉素-链霉素、10％胎牛血清的α-MEM培养基。
下述实施例中的消化液为胰酶，溶于pH值为7.4的PBS缓冲液得到浓度为0.25％的溶液(质量百分含量)。
下述实施例中细胞培养条件可采用：CO2浓度为5％，O2浓度为20％，温度为37℃的加湿细胞培养箱。
下述实施例中基因表达采用实时荧光定量PCR法检测，实施按如下方法进行：利用RNAiso plus(TAKARA)提取细胞总RNA，应用TAKARA公司PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒将RNA反转录成cDNA；采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq II试剂盒在BIO-RADCFX96Real-time System进行实时荧光定量PCR反应。反转录反应：37℃5min，85℃5s； 实时荧光定量PCR反应：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火60s，40个循环进行PCR 扩增。Actin作为内参,采用△△Ct方法进行分析。PCR采用的引物见表1。
表1实时定量PCR引物列表
Figure BDA0002106006170000061
下述实施例中蛋白表达采用Immunoblotting法检测，实施按如下方法进行：采用碧云天的 Western&IP细胞裂解液(P0013)裂解细胞提取细胞总蛋白，碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒 (P0012S)进行蛋白定量；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，采用恒压湿转法100伏特 1h将蛋白转移至PVDF膜上，室温5％BSA封闭1h，一抗抗体孵育4℃过夜，二抗抗体37℃ 孵育2h，采用化学发光法在天能化学发光仪检测。具体抗体稀释浓度：Runx2(1:1000，Cell Signaling)，OCN(1:1000，Sigma)，AMPK(1:1000，Cell Signaling)，p-AMPK(1:1000，Cell Signaling)，ACC(1:1000，Cell Signaling)，p-ACC(1:1000，Cell Signaling)，β-actin(1:4000， 康为世纪)。
下述实施例中ALP染色采用碧云天碱性磷酸酶染色试剂盒。
下述实施例中茜素红染色检测，实施按如下方法进行：细胞用4％多聚甲醛室温固定 10min，PBS洗涤2次，1％茜素红染色室温1-3min，双蒸馏水洗涤2次。
实施例1
一、低碱性磷酸酯酶症患者来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞成骨分化能力检测 1.低碱性磷酸酯酶症患者来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞的获得
将离体的低碱性磷酸酯酶症患者的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞在含有10％的胎牛 血清的α-MEM培养基中贴壁培养，每次传代时间为2-3天，得到1-3代的分化能力异常的骨 髓间充质干细胞。
2.低碱性磷酸酯酶症患者来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞成骨分化能力 的检测
1)贴壁后低碱性磷酸酯酶症患者来源成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞成骨分化能力检 测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病(HPP)来源的p3代间充质干细胞消化后细胞计数分别以2 ×104和1×105接种到24孔板和6孔板中培养，待细胞融合度达到90％以上利用成骨诱导液 进行成骨细胞方向诱导分化,成骨诱导分化1周进行ALP染色和成骨分化相关基因检测；成骨 诱导分化3周进行茜素红染色。结果如图1A和图1B显示，低碱性磷酸酯酶症来源的成骨分 化能力异常的骨髓间充质干细胞的ALP染色和矿化结节数量较正常对照组明显减少；基因表 达检测结果如图2-3显示，成骨分化相关基因RUNX2、OCN在mRNA和蛋白水平上显著下 降。
2)低碱性磷酸酯酶症患者来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞的细胞内 AMPK信号通路检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的p3代间充质干细胞消化后细胞计数以1×105接种在6 孔板中培养至细胞融合度达到80％以上，提取蛋白检测AMPK和下游靶基因ACC的表达。 蛋白检测结果如图4显示，低碱性磷酸酯酶症患者来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干 细胞的细胞内p-AMPK和p-ACC表达水平显著下降，以上结果提示成骨分化能力异常的骨髓 间充质干细胞胞内AMPK信号通路受到抑制。
二、二甲双胍对低碱性磷酸酯酶症患者来源的成骨分化能力异常的骨髓成骨分化能力 恢复检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的p3代间充质干细胞消化后细胞计数分别以2×104和1 ×105接种到24孔板和6孔板中培养，培养至显微镜下观察细胞融合度达到90％以上向成骨 细胞诱导分化，成骨诱导分组为：正常组、HPP组和HPP+Met组。其中，HPP+Met组是指使用带有二甲双胍的成骨诱导液对所述低碱性磷酸酯酶症疾病来源的p3代间充质干细胞进 行成骨诱导分化。成骨诱导分化期间每周更换2-3次新鲜成骨诱导液；待成骨诱导分化1周 进行ALP染色、成骨分化相关基因和AMPK通路相关基因检测；待成骨诱导分化3周进行茜素红染色。结果如图5A-图7所示，HPP+Met组相比HPP对照组，其茜素红染色明显增加， 成骨分化相关基因RUNX2、OCN在mRNA和蛋白水平上显著升高。此外，HPP+Met组相比 HPP对照组，p-AMPK和p-ACC表达明显增加。以上提示二甲双胍通过恢复低碱性磷酸酯酶 症来源的骨髓间充质干细胞细胞内AMPK信号通路恢复成骨分化能力异常的骨髓间充质干细 胞成骨分化能力。
实施例2
一、ALPL敲除小鼠来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞成骨分化能力检测
1.ALPL敲除小鼠来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞的获得
将离体的ALPL敲除小鼠来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞在含有20％的胎牛血 清的α-MEM培养基中贴壁培养，得到0-3代的分化能力异常的骨髓间充质干细胞。
2.ALPL敲除小鼠来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞成骨分化能力的检测 将正常和ALPL敲除小鼠来源的p0代间充质干细胞消化后细胞计数分别以1×105和5×105接种到24孔板和6孔板中培养，待细胞融合度达到90％以上利用成骨诱导液进行成骨细胞方 向诱导分化,成骨诱导分化1周进行ALP染色和成骨分化相关基因检测；成骨诱导分化2周进 行茜素红染色。基因表达检测结果如图9A、图9B和图10所示，成骨分化相关基因RUNX2、 OCN在mRNA和蛋白水平上显著下降。
3.ALPL敲除小鼠来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞的细胞内AMPK信号 通路检测
将正常和ALPL敲除小鼠来源的p0代间充质干细胞消化后细胞计数以5×105接种在6孔板 中培养至细胞融合度达到80％以上，提取蛋白检测AMPK和下游靶基因ACC的表达。蛋白检测结果如图11显示，低碱性磷酸酯酶症患者来源的成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞 的细胞内p-AMPK和p-ACC表达水平显著下降，以上结果提示成骨分化能力异常的骨髓间充 质干细胞胞内AMPK信号通路受到抑制。
二、二甲双胍对ALPL敲除小鼠来源的成骨分化能力异常的骨髓成骨分化能力恢复检 测
将正常和ALPL敲除小鼠来源的p0代间充质干细胞消化后细胞计数分别以1×105和5×105接种到24孔板和6孔板中培养，培养至显微镜下观察细胞融合度达到90％以上向成骨细胞诱 导分化，成骨诱导分组为：正常组、ALPL+/-组和ALPL+/-+Met组。其中，ALPL+/-组使用ALPL 敲除小鼠来源的p0代间充质干细胞进行成骨诱导分化；ALPL+/-+Met组对ALPL敲除小鼠来 源的p0代间充质干细胞使用添加有二甲双胍的成骨诱导液进行诱导分化。成骨诱导分化期间 每周更换2-3次新鲜成骨诱导液；待成骨诱导分化1周进行ALP染色、成骨分化相关基因和 AMPK通路相关基因检测；待成骨诱导分化2周进行茜素红染色。结果如图12-图14显示，ALPL+/-+Met组相比ALPL+/-组，其茜素红染色明显增加，成骨分化相关基因RUNX2、OCN在mRNA和蛋白水平上显著升高。此外，ALPL+/-+Met组相比ALPL+/-组，p-AMPK和p-ACC 表达明显增加，参考图15。以上提示二甲双胍通过恢复ALPL敲除小鼠来源的骨髓间充质干 细胞细胞内AMPK信号通路恢复成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞成骨分化能力。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在 本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请 的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.AMPK激活剂在制备改善骨髓间充质干细胞内AMPK信号通路异常产品中的应用，其特征在于，所述AMPK激活剂为二甲双胍。
2.二甲双胍在调控基因RUNX2和OCN表达水平方面的应用。
3.二甲双胍在制备骨相关疾病治疗药物制剂方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述骨相关疾病包括成骨形成相关疾病和软骨相关疾病，所述成骨形成相关疾病包括低碱性磷酸脂酶症、成骨不全、骨质疏松、派杰氏病或溶骨性骨转移；所述软骨相关疾病包括软骨发育不良、软骨肉瘤、骨软化或骨关节炎。
5.一种产品，其特征在于，所述产品包括骨相关疾病治疗有效量的二甲双胍。
6.组合物，其特征在于，所述组合物包括二甲双胍和成骨诱导液。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述成骨诱导液为包含10 nM地塞米松、10 mMβ-甘油磷酸钠、 0.05 g/L维生素C、1%青霉素-链霉素、5%胎牛血清的α-MEM培养基。
8.权利要求5所述的产品、或权利要求6所述的组合物在改善骨髓间充质干细胞内AMPK信号通路异常方面的应用。
9.改善骨髓间充质干细胞内AMPK信号通路异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：获取AMPK信号通路异常的骨髓间充质干细胞，使用权利要求5所述的产品或权利要求6所述的组合物对所述成骨分化能力异常的骨髓间充质干细胞进行诱导分化。
10.调控基因RUNX2和OCN表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：获取RUNX2和OCN表达水平降低的骨髓间充质干细胞，使用权利要求5所述的产品或权利要求6所述组合物对所述基因RUNX2和OCN表达水平降低的骨髓间充质干细胞进行诱导分化。
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