JP5514110B2 - 歯欠損部の修復方法及び修復材料の製造方法 - Google Patents
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Description
歯胚の再生方法としては、例えば、特開2004−331557号公報には、生体から単離された歯胚細胞を、線維芽細胞増殖因子等の生理活性物質の存在下で培養することが記載されている。また、特開2004−357567号公報には、生体から単離された歯胚細胞及びこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を、フィブリンを含む担体と一緒に培養することが提案されており、ここでフィブリンを含む担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記載されている。
また特開2005−013261号公報では、生体内に埋め込まれた使用されるインプラント材料として、コロイダルシリカ粒子を材料表面に付着させた人工生体材料を開示している。
本発明の第一の態様は、口腔内の歯欠損部を修復するために用いられる修復材料の製造方法であって、いずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方でそれぞれ構成された第1の細胞集合体及び第2の細胞集合体を、混合することなく密着させて支持担体内部に配置して培養し、再構成された歯胚又は歯を形成させること、歯の先端部を口腔内側として埋設し得るように、前記培養によって形成された前記再構成された歯胚又は歯の方向性を確認すること、を含み、方向性が確認された前記歯胚又は歯は、前記歯欠損部において、欠損した歯の等価物を得るための修復材料として用いられるものであり、前記歯の等価物は、対合歯と咬合可能な歯の長さを有する当該製造方法を提供する。
なお本発明における「再構成歯胚形成工程」は、修復材料の製造方法及び歯欠損部の修復方法の双方で適用される。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書における数値範囲を示す表現は、その前後の数値を含むものとする。
以下、本発明について説明する。
また、歯の方向性は、歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。
また本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層の形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者には、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
この再構成歯胚形成工程としては、国際公開第2006/129672号に記載されている方法をそのまま適用することができる。
また、歯胚以外に由来する上皮系細胞としては、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞であり、好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、更に好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞を生み出しうる未熟な上皮系前駆細胞、たとえば非角化上皮系細胞やその幹細胞等を挙げることができる。
培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)等を用いることができ、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばFGF、EGF、PDGF等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常10%とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば37℃の温度で5%CO2濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
なお、ここで支持担体は、第1及び第2の細胞集合体が担体内部で成育することができる程度の厚みを有すればよく、目的とする組織の大きさ等によって適宜設定することができる。
遠心分離による沈殿物とした場合には、沈殿物をそのまま支持担体の内部に配置すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分(例えば、培養液、緩衝液、支持担体等)は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことを最も好ましい。このような高密度の細胞集合体では、細胞が緊密に接触しており、細胞間相互作用が効果的に発揮される。特に目的とする細胞以外の成分が極端に少ない細胞集合体を支持担体の内部に配置すると、支持担体の固化等によって更に凝集し、より一層緊密状態となる。
また、この培養期間を延長させることによって、象牙質及びエナメル質の蓄積、歯冠形成、及び歯根の形成のように、再構成歯胚の形成過程が進行する。このため、この再構成歯胚形成のための培養期間は、実施条件、動物種、再構成歯胚の状態等に応じて適宜調整可能であり、例えば、後述する器官培養の場合には7日、場合によって6日で次の埋設工程に移行してもよく、或いは、再構成歯胚の状態や他の培養法によっては30日超、場合によって50日超、100日超又は300日超としてもよい。
支持担体内部における培養を支持担体のみによる培養とした場合には、動物細胞の培養に用いられる通常の条件下での培養とすることができる。ここでの培養は、一般に動物細胞での培養条件をそのまま適用すればよく、前述した条件をそのまま適用することができる。また培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが既知の各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、FGF、BMP等を挙げることができる。
器官培養による培養期間としては、1日間から7日間程度とすればよく、好ましくは3〜6日とすることができる。
また、第1の細胞集合体と第2の細胞集合体を共に単一細胞の集合体とした場合には、歯特有の細胞配置を有する複数の歯による歯の集合体が得られるため好ましい。この歯の集合体が得られた場合には、個々の歯を集合体から分離して用い得る。
即ち、方向性確認後の歯胚又は歯を含む修復材料は、歯欠損部への埋設に用いられる。修復材料中の歯胚又は歯は、その後、時間の経過と共に欠損部内で成長し、歯の等価物として萌出する。修復材料中の歯胚又は歯の状態や大きさ等によって異なるが、萌出した歯等価物の先端部(咬頭)は周囲の歯の先端部とほぼ同じ位置(咬合平面)に達し、それ以上、延長することはない。萌出、咬合までの埋設期間は、動物種又は埋設された歯胚若しくは歯の状態によって異なる。
この際、歯胚又は歯の埋設方向としては、上述した修復材料の製造方法の方向確認工程と同様に、歯冠の形成が認められれば歯冠を、歯冠の形成が認められない場合には、歯冠相当部の上皮細胞層又は再構成歯胚の上皮細胞層を口腔内側となるように配置すること、或いは再構成歯胚の上皮・間葉細胞層の開放部分を口腔内とは反対側となるように配置することが好ましい。これにより、歯等価物の先端部(歯冠)が口腔内側となって、周囲の歯と同様の向きに揃えることができる。
このような欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。また歯が喪失することによって歯槽骨量が低下している場合には、この欠損部位に対して、GTR法(guided tissue regeneration:組織再生誘導法)など、インプラントの埋設のために臨床で用いられている公知の方法により骨の再生を行って骨量を増加させてもよい。歯胚又は歯を孔部へ配置した後は、通常の処理に従って縫合等を行うことが好ましい。
このため、生活の質を維持することができるので、審美分野において良好に用いられる。また口腔内の歯欠損部の存在に起因した健康状態の悪化を避けることができるので、ウシ、ウマ、ブタなどの家畜や、イヌ、ネコなどのペットなど、ヒト以外の哺乳動物の健康状態を維持することができる。
(1)歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞の調製
歯の形成を行うために歯胚の再構築を行った。この実験モデルとしてマウスを用いた。
C57BL/6Nマウス(日本クレアから購入)の胎齢14.5日、胚仔から下顎臼歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。下顎臼歯歯胚組織をCa2+,Mg2+不含リン酸緩衝液(PBS(−))で洗浄し、PBS(−)に最終濃度1.2U/mlのDispase II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて12.5分間処理した後、10%FCS(JRH Biosciences, Lenexa, KS)を添加したDMEM(Sigma, St. Louis, MO)で3回洗浄した。さらにDNase I溶液 (Takara, Siga, Japan)を最終濃度70U/mlになるよう添加し歯胚組織を分散させ、25G注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織と歯胚間葉組織を分離した。
一方、歯胚間葉系細胞は、歯胚間葉組織をPBS(−)で3回洗浄し、0.25%Trypsin (Sigma)、50U/mlのCollagenase I (Worthington)を含むPBS(−)で処理した。70U/mlのDNase I (Takara)を添加して、ピペッティングにより単一の歯胚間葉系細胞を得た。
次に、上記で調製された歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いて、歯胚再構築を行った。シリコングリースを塗布した1.5mLマイクロチューブ (Eppendorf, Hamburg, Germany)に、10%FCS(JRH) 添加DMEM(Sigma)で懸濁した歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞を入れ、遠心分離により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液を GELoader Tip 0.5−20μL (eppendorf) を用いて完全に除去した。その後、タッピングあるいはピペッティングにより細胞を分散させて、再構成歯胚作製に用いる細胞を準備した。
器官培養2〜5日目において歯胚が複数発生している再構成歯胚を、実体顕微鏡下で注射針とピンセットを用いて外科的に個別の歯胚に分離した。シリコングリースを塗布したペトリディッシュにCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を30μL滴下してコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、上記個別分離歯胚を入れ、CO2インキュベーターに10分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固形化し、10%FCS(JRH) 添加DMEM(Sigma)にセルカルチャーインサート(ポアサイズが0.4ミクロンのPETメンブレン;BD, Franklin Lakes, NJ)が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、個別分離歯胚を支持担体である周囲のゲルと共に移して、18〜24時間、器官培養した。
上記に従って作製した個別分離歯胚から周囲のゲルを注射針とピンセットで外科的に除去し、個別分離歯胚を、腎皮膜下へ移植せずにそのまま7〜10週齢C57BL/6の上顎第一臼歯(M1)部歯槽骨に移植した。本発明により口腔内において個別の歯を萌出させ、咀嚼などの口腔機能を実現させた。
(1)個別分離歯胚の作製
実施例1(1)〜(2)と同様にして器官培養を行い、器官培養2〜5日目において歯胚が複数発生している再構成歯胚を、実体顕微鏡下で注射針とピンセットを用いて外科的に個別に分離した。個別分離歯胚の場合、シリコングリースを塗布したペトリディッシュにCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を30μL滴下してコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、上記個別分離歯胚を入れ、CO2インキュベーターに10分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固形化し、10%FCS(JRH) 添加DMEM(Sigma)にセルカルチャーインサート(ポアサイズが0.4ミクロンのPETメンブレン;BD, Franklin Lakes, NJ)が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、個別分離歯胚を支持担体である周囲のゲルと共に移して、5日間、器官培養し、複数の再構成歯胚が形成された場合には、外科的に単一の再生歯胚に分離した。培養後、周囲のゲルを注射針とピンセットで外科的に除去し、8週齢C57BL/6の上顎M1部歯槽骨に移植した。
口腔内移植の3日前にジエチルエーテルで吸引麻酔した8週齢C57BL/6に、5mg/mlのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重20gに対して240μlの割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスの上顎M1を、ピンセットを用いて上顎からM1を抜歯し、残根のないことを確認し、噴出してくる血液を脱脂綿で拭き取り止血した。食物摂取について、粉末状に砕いた飼育用の餌を毎日与えた。3週間以上、飼育して抜歯窩の治癒をはかり、M1欠損のC57BL/6を作製した。
これらの結果から、再生歯は正常歯と同様に安定した咬合関係を形成し咀嚼機能を有することが明らかになった。
個別分離歯胚を移植した上顎骨を含んだ頭部を摘出し、頭部全体を4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で12時間固定した後、inspeXio SMX-90CT(島津製作所 社製)でCT撮影を行った。CT撮影時の設定は、ビュー数を600、アベレージを10、スキャンを1、画像を512×512、スケーリングを50、スライス厚を1、BHCをなしに設定し、撮影を行った。CT撮影して得たデータは、解析ソフトImaris(Zeiss社製)を用いて3次元立体再構築し、マイクロCTの断面画像の作成を行った。
実施例2(1)において口腔内に発生させた個別の歯を摘出し、その歯のエナメル質と象牙質の硬度を同一歯で3点以上測定した。
測定は微小硬さ試験機(HM-102 ミツトヨ社製)に二つの対稜角172°30′と130°のヌープ硬さ測定用四角錐ダイヤモンド圧子(19BAA061 ミツトヨ社製)を装着したもので行った。再生歯へ圧子を負荷10g、10秒間圧接して、それにより生じた7.11:1の菱形圧痕の長辺の長さから硬度を求めた。再生歯は金属板に歯科用レジン(ユニファストIII ジーシー社製)を用いて固定した。エナメル質は地面と水平な部分において測定を行い、象牙質は歯科技工用エンジン(ULTIMATE 500 ナカニシ社製)にて地面と水平に切削し、被検面を露出させて測定を行った。ヌープ硬度測定の結果を図2に示す。
移植後約20日から50日経過すると、M1歯肉部より再生歯の咬頭が認められ、萌出が開始した。萌出状況を観察して、萌出前、萌出直前、萌出直後、萌出中、咬合面到達状態の上顎骨を摘出した。4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で16時間固定した後、22.5%のギ酸で72時間脱灰し、常法によりパラフィン包埋して、10μmの切片を作製した。脱灰液は上顎骨2つにつき50mlとし、脱灰48時間目に全量を交換した。組織学的解析のためには常法に従い、ヘマトキシリン−エオジン染色を行った。
歯は歯根膜を介して周囲の歯槽骨と結合しているため、歯に矯正力を与えると、歯根膜によってメカニカルストレスが周囲環境に伝達される。矯正力によって圧迫された歯根膜部位では歯槽骨の破骨細胞による吸収が、牽引された歯根膜部位では骨芽細胞による骨形成が行われ、歯と歯槽骨の間の空間的距離を一定に保つようになっている。このような歯根膜の機能を評価するために、再生歯に矯正力を加え、正常な歯の移動で見られる圧迫側での破骨細胞の出現、牽引側での骨芽細胞の出現といった骨のリモデリングを確認するために、以下の解析を行った。
その結果、頬側において、歯根膜腔が狭窄して歯根膜線維が圧縮する歯根膜の圧迫が認められた(図4Aの黒枠Bと図4B参照)。一方、逆側の舌側では、歯根膜腔が拡大して歯根膜線維が緊張する歯根膜の牽引が認められた(図4Aの黒枠Cと図4C参照)。また、歯根膜の牽引側の歯槽骨壁に添って一層の細胞の配列が認められたため、骨を形成する骨芽細胞(図4C矢印頭 参照)の出現が示唆された。さらに、牽引側の反対側の圧迫側では、細胞体に多数の核を含む多核巨細胞が歯槽骨に認められ、窩状な骨の吸収像が認められたので、破骨細胞(図4B矢印 参照)の発現と骨の吸収が示唆された。
これらの結果から、再生歯が正常歯と同様に、矯正力などのメカニカルストレスによって歯根膜が応答し、骨のリモデリング現象が誘起されることが示唆された。
歯の圧迫による痛みは矯正などによってよく知られており、特に歯根膜に存在する神経が媒介し、延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域の神経細胞でのc-Fosタンパク質の産生が上昇することが明らかにされている(Byers MR. et al., Crit Rev Oral Biol Med 10, 4-39, 1999. Deguchi T. et al. J Dent Res 82:677−681, 2003.、Fujiyoshi, Y. et al., Neuroscience Letters 283, 205-208, 2000.)。また歯髄の露出による痛みは露髄処理などによってよく知られており、矯正による痛みと同様に、特に歯髄に存在する神経が媒介し、延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域の神経細胞でのc-Fosタンパク質の産生が上昇することが明らかにされている(Byers MR. et al., Crit Rev Oral Biol Med 10, 4-39, 1999. Deguchi T. et al. J Dent Res 82:677−681, 2003.)そこで再生歯の神経機能を解析する目的で、マウスの再生歯に矯正と同様の圧迫刺激、および象牙質に歯科用ドリルで穴をあける露髄処理を行い、延髄三叉神経脊髄路核尾側亜核領域においてc-Fosタンパク質の発現が上昇するかどうかを解析した。
上記の方法にて矯正力活性後2時間と48時間、および露髄処理を行った2時間後で、C57BL/6を4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で灌流固定した。摘出した延髄を4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で16時間固定した後、常法によりOCT compound(Miles Inc., Naperville, IL)に包埋して、クリオスタット (Leica, Wetzlar, Germany)で50μmの切片を作製した。作製した切片は、c-fos(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC., Santa Cruz, Calfornia, USA)を1次抗体として、Goat IgG fraction to rabbit IgG (CAPPEL, Aurora, Ohio, USA)を2次抗体、Rabbit peroxidase anti-Peroxidase を(CAPPEL, Aurora, Ohio, USA)3次抗体として用いて免疫染色し、延髄の三叉神経路核における発現を比較した。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (6)
- 口腔内の歯欠損部を修復するために用いられる修復材料の製造方法であって、
いずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞とのいずれか一方でそれぞれ構成された第1の細胞集合体及び第2の細胞集合体を、混合することなく密着させて支持担体内部に配置して培養し、再構成された歯胚を形成させること、
歯の先端部を口腔内側として前記歯欠損部に埋設し得るように、前記培養によって形成された前記再構成された歯胚の方向性を確認すること、
を含み、方向性が確認された前記歯胚は、前記歯欠損部において、欠損した歯の等価物を得るための修復材料として用いられるものであり、前記歯の等価物は、対合歯と咬合可能な歯の長さを有する当該製造方法。 - 前記欠損した歯の等価物が、300〜600KHNのエナメル質のヌープ硬度及び60〜120KHNの象牙質のヌープ硬度を備えたものである請求項1記載の修復材料の製造方法。
- 前記培養が器官培養であり、前記修復材料が、器官培養後の再構成された歯胚と支持担体とを含む請求項1又は請求項2記載の修復材料の製造方法。
- 前記間葉系細胞及び上皮系細胞が共に歯胚由来である請求項1〜請求項3のいずれかに記載の修復材料の製造方法。
- 前記第1の細胞集合体及び第2の細胞集合体が共に単一細胞集合体である請求項1〜請求項4のいずれかに記載の修復材料の製造方法。
- 前記支持担体が、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、エラスチン、フィブリン、ファイブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、乳酸/グリコール酸共重合体(PLGA)、セルマトリクス(商品名)、メビオールゲル(商品名)及びマトリゲル(商品名)からなる群より選択された少なくとも1種である請求項1〜請求項5のいずれかに記載の修復材料の製造方法。
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