JP2005145926A - 歯の再生方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 歯を再生する方法を提供すること、より具体的には、歯槽膿漏やう蝕などの歯科疾患により歯牙を欠損又は損傷した患者を治療することを可能にする歯の再生方法を提供すること
【解決手段】 生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を移植動物の顎骨内に移植し、該顎骨内において上記細胞から歯を再生することを含む、歯の再生方法。
【選択図】 なし
【解決手段】 生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を移植動物の顎骨内に移植し、該顎骨内において上記細胞から歯を再生することを含む、歯の再生方法。
【選択図】 なし
Description
本発明は、歯の再生方法に関する。より詳細には、本発明は、顎骨において歯胚細胞から象牙質等の歯を再生する方法に関する。
現代社会は高齢化社会であり、数年後には日本国民人口の約20%が65歳以上の高齢者になることが予想されている。これら高齢者の大多数は、何らかの理由により一部又は全部の歯牙を喪失しており、多くの人は可綴式義歯(いわゆる入れ歯)を使用している。従来の義歯は、着脱が必要で装着感もよくないなどの実際的問題のみならず、心理的にも老化の象徴といった印象があり、できれば義歯を使用したくないというのが患者の一般的認識である。さらに、全ての歯牙を喪失した場合に、総義歯を装着すると、その咀嚼能力は通常の天然歯牙の約5分の1となることが知られている。多くの高齢者にとって楽しみの一つである食事が歯の喪失のため苦痛となる場合も少なくない。さらに、脳に対する咀嚼刺激は痴呆防止の効果があり、咀嚼力の低下は痴呆の促進になることが明らかになってきている。
これに対して近年、人工歯根が開発され臨床に応用されている。人工歯根の応用により義歯が固定され、維持がよくなり、咀嚼力も改善される。しかし、審美性、装着感に関しては未だ満足のいくものではない。また、手術が必要であること、一定量の骨が必要であり、全身状態によっても制限されること、さらに多額の費用がかかり、信頼できる医療機関も限られることなどの理由から、未だインプラント義歯は広く普及しているとは言えない。その結果、義歯に不満を感じている患者が少なくないにもかかわらず、インプラント義歯の使用者は義歯使用者のうちの極わずかである。
一方、他家移植による歯牙移植の報告はあるが、移植できる健康な抜去歯牙を確保することは困難であるのみならず、感染症の危険もあり、一般的な治療とはなっていない。義歯に不満を感じながらインプラントに踏み込めないか、あるいは条件的にインプラント治療が困難な多数の患者が存在している。
現在までに、歯科に関する再生の研究は、歯周組織の再生に注目が置かれ、骨の再生、歯根膜の再生を中心に研究されてきた。これらの研究の成果として、GTR法(Guided Tissue Regeneration法)が開発された。GTR法とは、例えばミリポアフィルター(MILLIPORE FILTER,ミリポア社商品名)などの膜によって、歯根面への上皮細胞等の侵入を抑制し、歯根膜細胞の増殖に必要な空間を形成させる方法である。GTR法は、歯周病に罹患した歯牙周囲に歯槽骨と歯根膜を再生させることを目的とするものであり、軽症例では大きな成果を挙げている。また、近年、歯根膜再生を可能にするタンパク質が開発され、実用化されている。しかしながら、GTR法は、歯牙喪失の原因となる高度の歯槽骨の吸収には応用できず、またう蝕による歯牙の崩壊を修復することはできない。
上記した問題点を根本的に解決する方策として、歯胚そのものを再生する方法が提案され、検討が行われているが(非特許文献1;および非特許文献2)、未だ小さな組織が形成できたのみで、実際の治療に供することが可能な程の大きさの組織形成はできていなかった。
また、米国特許出願公開US2002/0119180A1には、生分解性ポリマーから成る多孔質担体を用いて歯の組織を再生する方法が記載されているが、採取している細胞数が少なく、十分な再生は達成できていない。
C.S.Young et al J. Dent. Res. 81 (10), 695-2000, 2002
Tissue Engineering , Vol.7 , Number 5, 624 , October 2001
米国特許出願公開US2002/0119180A1
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、歯を再生する方法を提供すること、より具体的には、歯槽膿漏やう蝕などの歯科疾患により歯牙を欠損又は損傷した患者を治療することを可能にする歯の再生方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明は特に、歯胚細胞から歯を簡便に再生する方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、移植動物の顎骨において歯胚細胞から象牙質等の歯を再生できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を移植動物の顎骨内に移植し、該顎骨内において上記細胞から歯を再生することを含む、歯の再生方法が提供される。
好ましくは、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を、腹腔内の胃大網など血流の豊富な部位に移植することなく、移植動物の顎骨内に直接移植する。
好ましくは、上記少なくとも1種類の細胞は、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄あるいは歯乳頭細胞、歯嚢細胞、またはこれらの前駆細胞である。
好ましくは、上記少なくとも1種類の細胞は、生体から採取した組織を細片化し酵素処理してから分離回収して得る。
好ましくは、細胞を採取する生体と移植動物は、同一の動物個体である。
好ましくは、移植動物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。
好ましくは、上記少なくとも1種類の細胞は、生体から採取した組織を細片化し酵素処理してから分離回収して得る。
好ましくは、細胞を採取する生体と移植動物は、同一の動物個体である。
好ましくは、移植動物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。
好ましくは、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を機械的刺激の存在下で培養した後に、移植動物の顎骨内に移植する。
好ましくは、機械的刺激は、振盪培養、超音波処理、伸展刺激又は加圧下培養の何れかである。
好ましくは、機械的刺激は、振盪培養、超音波処理、伸展刺激又は加圧下培養の何れかである。
好ましくは、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を担体上に播種し、該担体上で機械的刺激を与えながら培養する。
好ましくは、上記担体として、移植先の生体に対する親和性と生体吸収性を有する材料から成り、その形状は再生する目的形状であり、かつ血行の導入部分を有する担体を用いる。
好ましくは、上記担体として、移植先の生体に対する親和性と生体吸収性を有する材料から成り、その形状は再生する目的形状であり、かつ血行の導入部分を有する担体を用いる。
好ましくは、上記担体は、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ(DL−ラクチドーコーグリコリド)(PLGA)、ポリ(DL−ラクチド)(PLLA)、カプロラクトン、コラーゲン、又は象牙質のうちの少なくとも1つからなる。
好ましくは、上記担体中に、メッシュ形態、スポンジ形態、又はゲル形態のうち少なくとも1つの形態部分が含まれている。
好ましくは、上記担体中に、メッシュ形態、スポンジ形態、又はゲル形態のうち少なくとも1つの形態部分が含まれている。
好ましくは、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を担体上に播種し、該担体上で約10〜100回/分の振動数で振盪培養することで機械的刺激を与えながら培養する。
本発明の方法を利用して、移植動物の顎骨内において歯胚細胞から象牙質などの歯胚組織を形成することにより、歯根または歯牙を再生させることができる。この結果、歯牙を欠損した患者の咀嚼能力の回復に極めて有効な治療となる。また、審美的な回復も見込まれ、患者のQuality of Life(QOL)の向上に大きく貢献する。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による歯の再生方法は、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を移植動物の顎骨内に移植し、該顎骨内において上記細胞から歯を再生することを特徴とするものである。本発明においては、生体から採取した上記細胞は、直接、移植動物の顎骨内に移植される。従来の方法によれば、生体から採取した細胞を、一旦、移植動物(ラットやブタなど)の腹腔内の胃大網など血流の豊富な部位に移植し、そこで歯胚を形成した後に、治療の対象となる移植動物の顎骨内に移植していた。これに対し、本発明においては、移植動物(ラットやブタなど)の腹腔内の胃大網など血流の豊富な部位に移植する工程を行なわないことを特徴としている。これにより、従来の方法と比較して、安全かつ速やかに歯を再生することが可能になった。
本発明による歯の再生方法は、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を移植動物の顎骨内に移植し、該顎骨内において上記細胞から歯を再生することを特徴とするものである。本発明においては、生体から採取した上記細胞は、直接、移植動物の顎骨内に移植される。従来の方法によれば、生体から採取した細胞を、一旦、移植動物(ラットやブタなど)の腹腔内の胃大網など血流の豊富な部位に移植し、そこで歯胚を形成した後に、治療の対象となる移植動物の顎骨内に移植していた。これに対し、本発明においては、移植動物(ラットやブタなど)の腹腔内の胃大網など血流の豊富な部位に移植する工程を行なわないことを特徴としている。これにより、従来の方法と比較して、安全かつ速やかに歯を再生することが可能になった。
本発明で用いる歯胚細胞としては、歯胚を構成する細胞あるいはこれらの細胞に分化することができる細胞であれば特にその種類は限定されず、例えば、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄あるいは歯乳頭細胞、歯嚢細胞、又はこれらの前駆細胞を使用することができる。これらの細胞は、1種類の細胞から成る単一の細胞として培養してもよいし、2種類以上の細胞から成る細胞混合物として培養してもよい。
歯胚細胞は、哺乳動物(例えば、ヒト、豚など)の下顎骨から採取することができる。埋伏歯を無菌的に取り出し、Phosphate Buffered Saline(PBS)溶液又はHanks balanced salt solution(HBSS)溶液などの適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き,メスにて組織を小片にして、PBS溶液又はHBSS溶液などを用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼ又はディスパーゼなどを用いて組織を酵素処理することが好ましい。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。
上記方法により回収した細胞は、歯科患者(即ち、歯牙の欠損又は損傷を有する患者)に移植することにより、該患者の治療のために用いられる。この場合、移植に伴う生体適合性などの観点から、再生に用いる歯胚細胞は、該患者に由来する自分の歯胚細胞を用いることが好ましい。歯胚を構成する細胞あるいは歯胚に分化する細胞は、親知らず(智歯)からも採取することができる。
また、歯牙は、発生から成熟するまでに5つの段階を経て形成されることが知られている。第一期は、開始期と呼ばれ、基底膜に上皮組織と間葉組織が誘導される。第二期は、蕾状期と呼ばれエナメル器が作られる。第三期は帽状期と呼ばれ、歯乳頭が形成され、歯胚が形成される。第四期は鐘状期と呼ばれ、歯胚からエナメル質を形成する細胞への分化と歯乳頭から象牙質と歯髄を形成する細胞への分化が開始される。第五期は成熟期と呼ばれ、エナメル質と象牙質と歯髄などの歯牙を構成する組織へと分化する。本発明においては、これらのうちの好適な時期の細胞を採取して用いることができる。また、歯胚が存在していない症例では、歯根より歯髄や歯根膜を摘出して細胞を分離採取することができる。なお、歯牙からの歯髄の摘出は、About I.,他 Experimental cell research. 258. 33-41, 2000に記載の方法に従って行うことができる。
また、本発明で言う「歯の再生」とは、上記5段階のうちの第二期以降の歯胚を再生することを言う。歯胚は、通常、歯髄、象牙質、エナメル質、及びセメント質から構成されるが、本発明で言う「歯の再生」とは、歯胚を構成する歯髄、象牙質、エナメル質、及びセメント質の少なくとも一部を再生することを言う。
本発明の好ましい態様によれば、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を機械的刺激の存在下で培養した後に、移植動物の顎骨内に移植する。機械的刺激は、例えば、細胞を振盪培養したり、細胞に超音波処理を施したり、伸展刺激あるいは加圧下で培養することなどにより与えることができる。好ましくは、細胞を振盪培養する。振盪培養は、細胞と培地を含む容器を振盪器の上に設置して、適当な速度(例えば、10〜100回/分程度)で振盪しながら細胞を培養することで行うことができる。
細胞の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件(例えば、室温から37℃の温度;5%CO2インキュベーター内など)の下で行なうことができる。
本発明において歯胚細胞に刺激を与える場合、歯胚細胞の培養は担体上で行ってもよいし、担体なしで培養してもよいが、歯胚細胞は担体上で培養されることが好ましい。担体の使用は、細胞から歯胚組織を形成するのに有用である。担体としては、歯胚の形成に必要とされる時間を耐久することができ、かつその後、速やかに吸収されるものが好ましい。即ち、顎骨内などの生体内において適切な吸収速度と特性を有し、かつ細胞と高い親和性を有する材料から成る担体を使用することが好ましい。
担体の素材は、上記特性を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ポリグリコール酸(polyglycolic acid(PGA))、ポリ(DL−ラクチド−コ−グリコシド)(PLGA)、カプロラクトン、またはコラーゲンなどを使用することができ、あるいは象牙質などの天然材料を使用することもできる。
PGAは、Albany International Research Co.などから購入することができ、またPLGAはSigma(cat.P1816)から購入することができる。PGAの場合、吸収速度が速いため、ポリ(DL−ラクチド)(PLLA)を表面にコートして吸収期間を遅らせることもできる。さらに、PGA、PLGAまたはカプロラクトンなどの合成材料を使用する場合には、細胞の接着性を高めるために、表面にコラーゲン溶液をコートして使用することができる。
上記の担体の形態としては、メッシュ形態、スポンジ形態、ゲル形態などが可能である。中でも、ゲル形態の担体は、メッシュ形態やスポンジ形態の担体と比較して、細胞同士の接触が容易になるため歯胚細胞の培養のための担体として有用である。
担体は細胞を移植しやすい形状に加工したものが好ましく、板状、球状あるいは中空で一端が開放されており、周囲から血行が導入されやすい部位を有することが好ましい。
担体は、目的に適合した形態のものを作製することが好ましい。このためには、目的とする形態をレジンで作製した後に印象材を用いて型を取得する。その後、レジンの型を取り出し、担体を構成する合成材料を流しこむことによって目的の形態を再現することができる。
上記した担体を使用して歯胚細胞の培養を行なう場合、歯胚細胞はできるだけ高密度で担体上に播種することが好ましい。具体的には、1×106個/100μl以上の細胞を担体上に播種することが好ましく、より好ましくは2×106個/100μl以上の細胞を担体上に播種することができる。
本発明の方法では、好ましくは、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を機械的刺激を与えながら培養した後に、該培養細胞を直接患者(移植動物)の顎骨に移植する。好ましくは、歯胚細胞の培養の際に用いた担体も歯胚細胞と一緒に、移植動物の顎骨内に移植される。
移植動物の種類は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ヒト、犬、ネコ、ブタ、ラット、ウサギ又はマウスなどを使用することができる。
上記の通り、生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を機械的刺激を与えながら培養した後に、該培養細胞を直接、歯牙の欠損又は損傷を有する歯科患者(移植動物)の顎骨に移植することにより、顎骨内において、歯を再生することができ、これにより、該歯科患者を治療することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例1:
生後9週齢のビーグル犬より、無菌的に埋伏歯を取り出し、10%抗生剤入りPhosphate Buffered Saline(PBS)溶液にて保存した。埋伏歯を取り出す際、ビーグル犬を吸引麻酔下に置き、疼痛管理を行なった後、埋伏歯の取り出しを行なった。歯胚の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を約2mmの小片にした。PBS溶液にて小片にした組織を5回洗浄した。2mg/mlコラゲナーゼを10%牛血清と2%の抗生剤を含むDulbecco's Modified Eagle Medium (以下、DMEMとする)培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。
生後9週齢のビーグル犬より、無菌的に埋伏歯を取り出し、10%抗生剤入りPhosphate Buffered Saline(PBS)溶液にて保存した。埋伏歯を取り出す際、ビーグル犬を吸引麻酔下に置き、疼痛管理を行なった後、埋伏歯の取り出しを行なった。歯胚の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を約2mmの小片にした。PBS溶液にて小片にした組織を5回洗浄した。2mg/mlコラゲナーゼを10%牛血清と2%の抗生剤を含むDulbecco's Modified Eagle Medium (以下、DMEMとする)培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。
得られた組織を10ml用のピペットにて10分間ピペッティングした後、遠心分離(1500rpm、5分)を行い、上澄みの酵素溶液を取り除いた。DMEM培地にて3回洗浄し、70μmのフィルターにて細胞外基質を取り除き、細胞を回収した。
回収した細胞をDMEM培地にて4×106個/100μlの細胞懸濁液に調製し、PGAメッシュ担体(体積密度50%〜60%、厚さ2mm、Albanyl International Research社製(MA, USA))に播種した。
細胞を播種した担体は37℃、CO25%存在下のインキュベーターにて1時間静置培養を行なった後、恒温振盪器(37℃)にて24時間振盪させた(50回/分)。24時間恒温振盪器にて培養後、ビーグル犬の埋伏歯を取り出した位置に細胞を播種した担体を移植した。移植の際は、ケタラール麻酔下で疼痛管理を行なった後、担体の移植を行なった。
その後は、経時的(移植直後、移植後13週、及び移植後24週)にX線撮影を行なった(図1)。移植した担体は、移植後24週で摘出した。μCT撮影(図2)したところ、顎骨に生着しかつ、顎骨と適切な距離を保っていることから、癒着していないことが確認された。常法に従い、パラフィン包埋し切片を作成した後、ヘマトキシリン−エオジン染色(H−E染色)を施した(図3)。その結果、明瞭な象牙細管が存在しており、象牙質が再生されたことが確認された。
Claims (4)
- 生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を移植動物の顎骨内に移植し、該顎骨内において上記細胞から歯を再生することを含む、歯の再生方法。
- 上記少なくとも1種類の細胞は、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄あるいは歯乳頭細胞、歯嚢細胞、またはこれらの前駆細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の歯の再生方法。
- 上記少なくとも1種類の細胞は生体から採取した組織を細片化し酵素処理してから分離回収して得ることを特徴とする、請求項1又は2に記載の歯の再生方法。
- 生体から採取した歯胚細胞又は歯胚細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を機械的刺激の存在下で培養した後に、移植動物の顎骨内に移植する、請求項1から3の何れかに記載の歯の再生方法。
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JP2003389434A JP2005145926A (ja) | 2003-11-19 | 2003-11-19 | 歯の再生方法 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010213631A (ja) * | 2009-03-17 | 2010-09-30 | Japan Health Science Foundation | 細胞分化装置、細胞分化方法、及び象牙芽細胞 |
-
2003
- 2003-11-19 JP JP2003389434A patent/JP2005145926A/ja active Pending
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