JP4723937B2 - 細胞の播種方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の播種方法に関する。より詳細には、本発明は、歯根の表面に歯根膜細胞などの細胞を播種する方法、並びに当該方法で播種して作製された歯牙及び人工歯根に関する。

歯牙の喪失に対して、人工歯根や、天然歯を再移植する治療法がある。しかし、人工歯根は、直接骨に埋め込むために過剰の負荷が骨にかかりやすく、そのため骨吸収や噛み心地の悪さという欠点があり、天然歯根の再移植には歯根の骨との癒着と吸収を防ぐ必要がある。上記問題は、歯根膜組織を歯根と歯槽骨の間に作ることによって解決できると考えられており、歯根表面に歯根膜細胞を播種して歯根膜組織を作る方法が検討されている。播種する方法として歯根膜細胞を歯根の上で培養して表面を覆う方法、細胞シートとして利用する方法、ゲルやメッシュ等の生体吸収性材料に細胞を播種して、その材料で歯根を覆う方法等がある。

また、特許文献１には、歯根膜並びに神経及び血管の細胞成分を除去した同種又は異種の永久歯の歯根管内に抽出コラーゲンが充填された層を有すると共に該細胞成分が除去された歯根膜をその上に有する歯根の表面に抽出コラーゲンの膜を有する人工歯が記載されている。

さらに、特許文献２には、抜歯した歯から採取した人の歯根膜細胞を培養し、培養された歯根膜細胞を更に重層培養して形成した疑似歯根膜を人工歯根と歯槽骨または人工歯根と顎骨の接合面の間に介在させ、人工歯根を歯槽骨または顎骨に定着する方法が記載されている。

歯根表面は歯根膜細胞でムラなく均一に、細胞の生存率を上げるために薄く覆われていることが望ましく、さらに複根でも簡便に覆うことができ、その後の操作が容易であることが望ましい。しかし、これらを十分に満たす技術はない。

特開２００２−１１０２３号公報 特開平６−７３８１号公報

本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、歯根表面を歯根膜細胞でムラなく均一に、薄く、さらに複根でも簡便に覆うことが可能であり、さらに細胞を播種した歯根の移植操作が容易である、細胞の播種方法を提供すること解決すべき課題とした。さらに、本発明は、上記した細胞播種方法により細胞を播種して作製された歯牙及び人工歯根を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、凝固前には形態を自由に変形することができ、凝固後は形態を保持できるゲルの特性に注目し、その形態を制御する方法を見出すことにより、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、歯根の凹型を用いて、生体より採取した歯根または人工歯根の表面に、ゲルに懸濁した細胞を播種することを含む、細胞の播種方法が提供される。
好ましくは、歯根の凹型に、細胞を懸濁したゲルを流し込み、次いで、ゲルが凝固する前に歯根を当該凹型に入れ、歯根表面にゲルを凝固させることにより細胞を播種する。

好ましくは、ゲルは生体吸収性ゲルである。
さらに好ましくは、ゲルはフィブリンゲルである。
好ましくは、凝固したゲルの厚みは２０μｍ〜１ｍｍである。
好ましくは、細胞は、歯根膜細胞、歯肉線維芽細胞、歯乳頭細胞、歯髄細胞または間葉系幹細胞である。

本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法で細胞を播種することにより作成される歯牙および人工歯根が提供される。

本発明により、歯根の形状に拘わらず、全体に薄く細胞を容易に播種する方法と、その方法により細胞を播種して作製された歯牙および人工歯根が提供される。本発明により短時間で播種できることから臨床において時間の短縮や、また細胞の播種後の操作が容易であることから術式の簡便化が図れ、非常に有用である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による細胞の播種方法は、歯根の凹型を用いて、生体より採取した歯根または人工歯根の表面に、ゲルに懸濁した細胞を播種することを特徴とする。

細胞を播種する歯根としては、人工歯根又は天然歯根のいずれでもよい。また天然歯根を使用する場合、歯根を採取する動物種は特に限定されないが、好ましくはヒトである。

歯根の凹型は、歯根膜細胞を播種する歯根に合わせて、その都度作成してもよいし、または、あらかじめ多種類の凹型を用意しておき、その中から適当なものを選択してもよい。型の大きさは歯根表面をゲルが覆うことを考え、ゲルの厚みだけ大きくすることが好ましい（図１を参照）。ゲルの厚みは２０μｍ〜１ｍｍが好ましい。歯根の凹型は常法により作成することができる。例えば、シリコンを適当量用意し、型を取る歯根部をシリコンへ入れ、シリコンが固化したのち歯牙を取り出することにより、歯根凹型を作成することができる。

播種する細胞は歯根膜由来の細胞が好ましいが、間葉系細胞、歯髄細胞、歯肉線維芽細胞、歯乳頭細胞、歯槽骨由来細胞でもよい。また細胞は培養・増殖したものでも、培養・増殖していないものでもよく、また凍結保存したもの、凍結保存していないものでもよい。さらに、自己細胞が好ましいが、可能であれば他家細胞でもよい。さらに好ましくは、ヒト由来である。

細胞を懸濁するゲルの種類は、形状を保持する強度があれば特に限定されないが、ゲルは生体吸収性であることが好ましい。ゲルとしては、好ましくは、フィブリンゲル、アガロース、コラーゲンなどを使用することができる。さらに、フィブリンゲルを使用する場合は、自己由来のものを使用することが好ましい。

ゲルに懸濁した細胞の濃度はいかなる濃度でもよいが、１×１０⁴〜１×１０⁸／ｍｌの範囲が好ましい。細胞を懸濁したゲル溶液は、ゲルが凝固する以前に必要濃度になるように細胞をゲルに懸濁することにより作成することができる。フィブリンゲルの場合、トロンビン溶液とフィブリノゲン溶液を混合することにより凝固が始まる。そのため、細胞を懸濁したゲルを作成するためにはトロンビン溶液に細胞を懸濁し、ついでフィブリンゲル溶液を加えることが好ましい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

歯根の凹型の作製は以下の通り行った。ヒト知歯歯牙から歯根膜等の細胞成分を取り除き歯根表面に厚みが２０μｍ〜１ｍｍになるように薄いビニール箔を巻き付けた。型を取るシリコン（ＪＭシリコン、株式会社モリタ）を適当量用意し、先に用意したヒト知歯の歯根部をシリコンへ入れた。シリコンが固化したのち歯牙を取り出し、これを歯根凹型とした。

ヒト歯根膜由来細胞は次の通りに用意した。抜歯したヒト歯牙よりメスで歯根膜を採取、細かくした後、コラゲナーゼ溶液（２ｍｇ／ｍｌ濃度でＤＭＥＭ・１０％ＣＳに溶解）で３７℃で１時間酵素処理をした。酵素処理後１５００ｒｐｍで５分間、遠心をしてコラゲナーゼ溶液を除去して、沈殿した細胞をＤＭＥＭ・１０％ＣＳ培地に懸濁、３ｃｍ培養皿で初代培養を行った。サブコンフルエントに達したら継代を行い、１×１０⁵個を１０ｃｍ培養皿に播種した。歯根膜由来細胞は数継代したものを使用した。

ボルヒール（藤沢薬品工業）のプロトコールに従い、トロンビン溶液とフィブリノゲン溶液を調整し、ヒト歯根膜由来細胞を１×１０⁷／ｍｌでトロンビン溶液に懸濁した。先に用意したシリコンの凹型に細胞を懸濁したトロンビン溶液を１００μｌ入れ、ついでフィブリノゲン溶液を等量入れすばやくピペッティングし、型を作成するときに使用したヒト知歯歯牙を型へ入れ、フィブリンゲルが固まるまで静置した。しばらくしたら、シリコンの型より歯牙を取り出した（図２）。

ゲルが播種された歯根は容易にピンセット等で挟んで移動させることが可能で、ゲルが剥がれることもなかった。また、フィブリンゲルの厚みはほぼ１ｍｍ以下であった。

図１は、歯根凹型と歯根の概略図を示す。 図２は、歯根を細胞を懸濁したフィブリンゲルで覆った結果を示す。

符号の説明

１ 歯牙
２ 凹型
３ ヒト歯牙
４ ヒト歯根膜細胞を懸濁したフィブリンゲル

Claims (3)

1. 歯根の凹型に、細胞を懸濁したフィブリンゲルを流し込み、次いで、フィブリンゲルが凝固する前に、生体より採取した歯根または人工歯根を当該凹型に入れ、歯根表面にフィブリンゲルを凝固させることによって歯根表面に細胞を播種することを含み、凝固したゲルの厚みが２０μｍ〜１ｍｍである、細胞の播種方法。
2. 細胞が、歯根膜細胞、歯肉線維芽細胞、歯乳頭細胞、歯髄細胞または間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 請求項１又は２に記載の方法で細胞を播種することにより作成される歯牙および人工歯根。