DE69231128T2

DE69231128T2 - Domänen von extrazellulären bereichen von menschlichen blutplättchen abstammenden wachstumsfaktor rezeptor-polypeptiden

Info

Publication number: DE69231128T2
Application number: DE69231128T
Authority: DE
Inventors: A. Escobedo; J. Fretto; A. Giese; E. Tomlinson; T. Williams; David Wolf
Original assignee: University of California; COR Therapeutics Inc; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; COR Therapeutics Inc; University of California Berkeley
Priority date: 1991-01-31
Filing date: 1992-01-28
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2012-01-29
Also published as: AU1411092A; US5872218A; US5891652A; IE920317A1; EP0584082B1; EP0584082A1; JPH06507543A; WO1992013867A1; NZ241480A; AU5580496A; CA2100559C; ATE193553T1; GR3034267T3; DK0584082T3; ES2147729T3; AU709177B2; DE69231128D1; US5686572A; CA2100559A1; EP0584082A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, insbesondere Rezeptoren eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (hPDGF-R). Insbesondere stellt sie verschiedene zusammengesetzte Konstrukte von Rezeptoren eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors bereit, wobei diese Konstrukte Ligandenbindungsbereiche beibehalten, die im natürlichen extrazellulären Bereich der Rezeptoren zu finden sind. Sie stellt auch rekombinante Nucleinsäuren, die diese Polypeptide codieren, welche typischerweise auch einen Promotor für die Expression umfassen, und Fusionspeptide am Amino- oder Carboxyende der exprimierten extrazellulären Verbundstruktur bereit. Antikörper werden bereitgestellt, die Epitope erkennen, welche Aminosäuren enthalten, die in verschiedenen Domänen des extrazellulären Bereichs enthalten sind. Zellen, die diese Polypeptide und Nucleinsäuren enthalten, und diagnostische Anwendungen dieser Reagenzien werden ebenfalls bereitgestellt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Polypeptid-Wachstumsfaktoren sind Mitogene, die durch spezifische Bindung an Rezeptoren, die sich auf der Zellplasmamembran befinden, auf Zellen einwirken. Der von Blutplättchen abstammende Wachstumsfaktor (PDGF) stimuliert eine verschiedenartige Gruppe von biochemischen Reaktionen, beispielsweise Änderungen der Ionenflüsse, Aktivierung von verschiedenen Kinasen, Veränderung der Zellform, Transkription von verschiedenen Genen und Modulation von Enzymaktivitäten, die mit dem Phospholipidstoffwechsel verbunden sind. Siehe beispielsweise Beil et al. (1989) "Effects of Platelet Factors an Migration of Cultured Bovine Aortic Endothelial and Smooth Muscle Cells", Circulation Research 65: 1057-1065.
Von Blutplättchen abstammende Wachstumsfaktoren sind in höheren Tieren, insbesondere in Warmblütern, z. B. Säugern, zu finden. In vitro ist der PDGF ein Hauptpolypeptidmitogen im Serum für Zellen von mesenchymalem Ursprung, wie z. B. Fibroblasten, Glattmuskelzellen und Gliazellen. In vivo zirkuliert der PDGF normalerweise nicht frei in Blut, sondern wird in den Alphagranula von zirkulierenden Blutplättchen gelagert. Während der Blutgerinnung und Blutplättchenadhäsion werden die Granula freigesetzt, häufig an Stellen von verletzten Blutgefäßen, wodurch der PDGF bei der Reparatur von Blutgefäßen involviert wird. Der PDGF kann die Wanderung von arteriellen Glattmuskelzellen von der Mittel- zur Innenschicht der Arterie stimulieren, wo die Muskelzellen proliferieren können. Dies ist wahrscheinlich eine frühe Reaktion auf eine Verletzung.
Der PDGF besitzt auch Bedeutung bei der Wundheilung, bei der Atherosklerose, bei myeloproliferativer Krankheit und bei der Stimulierung von Genen, die mit der Krebstransformation von Zellen verbunden sind, insbesondere c-myc und c-fos.
Der von Blutplättchen abstammende Wachstumsfaktor besteht aus zwei homologen Polypeptidketten; er ist ein Dimer von 16-Kilodalton-Proteinen, die durch ein Disulfid verbunden sind. Diese Polypeptide sind von zwei Typen, der Kette vom Typ B und der Kette vom Typ A. Drei Formen des Wachstumsfaktordimers sind zu finden, entsprechend einem Homodimer aus zwei Ketten vom Typ A, einem Homodimer aus zwei Ketten vom Typ B und einem Heterodimer aus der Kette vom Typ A und der Kette vom Typ B. Jede dieser drei verschiedenen Kombinationen wird als PDGF-Isoform bezeichnet. Für einen Überblick über den PDGF, siehe Ross et al. (1986) "The Biology of Platelet-Derived Growth Factor", Cell 46: 155-169. Die Wachstumsfaktorsequenzen von der Maus und vom Menschen sind stark homolog.
Der PDGF wirkt durch Binden an den Rezeptor des von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (PDGF-R). Der Rezeptor ist typischerweise auf Zellen von mesenchymalem Ursprung zu finden. Der funktionelle Rezeptor wirkt, während er sich in einer Form mit zwei Transmembran- Glycoproteinen befindet, von denen jedes etwa ein Molekulargewicht von 180 Kilodalton besitzt. Zwei verschiedene Polypeptide wurden isoliert, ein Rezeptorpolypeptid vom Typ B und ein Rezeptorpolypeptid vom Typ A.
Eine Sequenz eines Rezeptorpolypeptids vom Typ B des Rezeptorpolypeptids eines von Mäuse-Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors ist in Yarden et al. (1986) Nature 323: 226-232, veröffentlicht. Eine Sequenz eines Polypeptids eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (hPDGF-R) vom Typ A ist in Matsui et al. (1989) Science 243: 800-803 offenbart.
Diese PDGF-Rezeptoren weisen gewöhnlich drei identifizierbare Hauptbereiche auf. Der erste ist ein Transmembranbereich (TM), der die Plasmamembran einmal durchspannt, wobei er die Bereiche des Rezeptors außerhalb der Zelle von den Bereichen innerhalb der Zelle trennt. Der zweite Bereich ist ein extrazellulärer Bereich (XR), der die Domänen enthält, die den Polypeptid-Wachstumsfaktor binden (d. h. die Ligandenbindungsdomänen). Der dritte ist ein intrazellulärer Bereich (IR), der eine Tyrosinkinaseaktivität besitzt. Diese Tyrosinkinasedomäne ist insofern bemerkenswert, daß sie ein Insert von etwa 100 Aminosäuren aufweist im Vergleich zu den meisten anderen Rezeptor-Tyrosinkinasedomänen, die zusammenhängend sind oder kürzere Insertsegmente aufweisen.
Die kompletten Sequenzen der menschlichen Rezeptorpolypeptide vom Typ B und Typ A sind anderswo angegeben, z. B. U. S. S. N. 07/309 322, welches hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Für viele Zwecke wäre jedoch ein kleineres funktionsfähiges Protein oder eines mit einer geringeren als der vollen Länge erwünscht. Kleinere Moleküle können beispielsweise leichter auf Bereiche mit beeinträchtigter Durchblutung gerichtet werden oder weisen weniger Epitope oder fremde Domänen auf, die nicht mit verschiedenen interessierenden Aktivitäten in Zusammenhang stehen. Funktionsfähige Analoge mit einem geringfügig modifizierten Aktivitätsspektrum oder einer anderen Spezifität wären sehr nützlich.
Somit besitzt die Verwendung von neuen zusammengesetzten Konstrukten, die ebenso wie die Polypeptide eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors eine biologische Aktivität aufweisen, eine bedeutende Verwendung als Forschungsreagenzien, diagnostische Reagenzien und therapeutische Reagenzien. Insbesondere gestattet die Identifikation von wichtigen Polypeptidmerkmalen im extrazellulären Bereich der Polypeptide des Rezeptors des von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors Substitutionen und Deletionen von speziellen Merkmalen der Domänen. Überdies stellt die Verwendung eines in vitro Testsystems die Fähigkeit bereit, zytotoxische oder die Membran aufbrechende Verbindungen zu testen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden definierte Konstrukte von modifizierten Polypeptiden eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors bereitgestellt. Die Strukturen der Domänen des extrazellulären Bereichs werden identifiziert und Modifikationen und kombinatorische Umordnungen der Rezeptorsegmente werden geliefert. Sowohl zellgebundene als auch lösliche Formen von modifizierten Segmenten werden zur Verfügung gestellt, ebenso wie Verfahren für Tests unter Verwendung derselben, wodurch eine Selektion von Ligandenanalogen ermöglicht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Fragment eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (hPDGF-R) aus zwischen etwa 8 und 400 Aminosäuren bereit, welches einen oder mehrere Ligandenbindungsbereiche (LBR's) aus den extrazellulären Domänen D1, D2 oder D3 für einen von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF) umfaßt, wobei das Fragment einen von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor-Liganden bindet. Im allgemeinen weist das Fragment eine Bindungsaffinität von etwa 5 nM oder besser auf und weist eine Sequenz von mindestens etwa 6 oder 8 benachbarten Aminosäuren, vorzugsweise mindestens etwa 15 oder mehr benachbarten Aminosäuren von einem Intracysteinbereich der Domäne D3 auf. Dem Fragment fehlt häufig ein Transmembranbereich. In anderen Ausführungsformen ist das Fragment löslich, ist im wesentlichen rein oder weist mindestens einen Ligandenbindungsbereich auf, der von einer Domäne D3 abgeleitet ist. Das Fragment kann von einem PDGF-R-LBR- Fragment vom Typ B oder vom Typ A, beispielsweise aus Tabelle 1 oder Tabelle 2, abgeleitet sein. In speziellen Ausführungsformen ist das Fragment aus der Gruppe von Formeln ausgewählt, die aus:
a) Xa-Dm-XC;
b) Xa-Dm-X1-Dn-Xc;
c) Xa-Dm-X1-Dn-X2-Dp-Xc; und
d) Xa-Dm-X1-Dn-X2-Dp-X3-Dq-Xc;
e) Xa-Dm-X1-Dn-X2-Dp-X3-Dq-X4-Dr-Xc;
besteht,
wobei das Fragment nicht D1-D2-D3-D4-D5 ist;
jedes von Xa, X1, X2, X3 und Xc, falls vorhanden, ein Polypeptidsegment ist, dem eine D-Domäne fehlt; und
jedes von Dm, Dn, Dp und Dq unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus D1, D2, D3, D4 und D5 besteht. Bevorzugte Fragmente sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus:
a) D1-D2-D3 oder D3-D4-D5; und
b) D1-D2-D3-D4 oder D2-D3-D4-D5
besteht.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein lösliches Fragment eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (hPDGF-R) aus zwischen etwa 10 und 350 Aminosäuren, welches mindestens einen Ligandenbindungsbereich (LBR) von einer Domäne D3 für einen von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF) umfaßt, wobei das Fragment spezifisch an einen von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor-Liganden bindet.
Gewöhnlich umfaßt das Fragment eine Sequenz von mindestens etwa 15 benachbarten Aminosäuren von dem Intracysteinteil der Domäne D3 und weist eine Bindungsaffinität von mehr als etwa 5 nM auf. Weitere brauchbare Ausführungsformen eines Fragments sind löslich, im wesentlichen rein oder ein PDGF- R-LBR vom Typ B oder Typ A, beispielsweise aus Tabelle 1 oder Tabelle 2.
Die Erfindung umfaßt auch Nucleinsäuresequenzen, einschließlich jener, die die vorstehend beschriebenen Polypeptidfragmente codieren. Häufig schließen die Nucleinsäuresequenzen einen Promotor ein, der im allgemeinen steuerbar mit der die Fragmente codierenden Sequenz verbunden ist.
Zellen, die die Nucleinsäuren oder Peptide der Erfindung enthalten, sind ebenfalls eingeschlossen. In speziellen Zellausführungsformen ist die Zelle eine Säugerzelle und enthält häufig sowohl eine Nucleinsäure als auch ein Proteinexpressionsprodukt der Nucleinsäure.
Die vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen stellen Antikörper bereit, die ein Epitop eines beschriebenen PDGF- R-Fragments erkennen, aber kein natürliches PDGF-R-Epitop. Der Antikörper ist häufig ein monoklonaler Antikörper.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Messen der PDGF-Rezeptor-Bindungsaktivität einer biologischen Probe bereit, welches die folgenden Schritte umfaßt:
a) in Kontakt bringen einer aliquoten Menge einer Probe mit einem PDGF-Liganden in Gegenwart eines beschriebenen PDGF-R-Fragments in einer ersten Analyse;
b) in Kontakt bringen einer aliquoten Menge der Probe mit einem PDGF-Liganden in Abwesenheit des PDGF-R-Fragments in einer zweiten Analyse; und
c) Vergleichen des Ausmaßes an Bindung in den zwei Analysen.
In einigen Fällen ist das PDGF-R-Fragment an eine Zelle oder ein festes Substrat, beispielsweise eine Mikrotiterschale, angeheftet.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Messen des PDGF-Ligandengehalts einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt:
a) in Kontakt bringen einer aliquoten Menge der Probe mit einem Ligandenbindungsbereich (LBR) in Gegenwart eines beschriebenen PDGF-R-Fragments in einer ersten Analyse;
b) in Kontakt bringen einer aliquoten Menge der Probe mit einem LBR in Abwesenheit des PDGF-R-Fragments in einer zweiten Analyse; und
c) Vergleichen des Ausmaßes an Bindung in den zwei Analysen.
In einigen Ausführungsformen werden die Kontaktierungsschritte gleichzeitig durchgeführt.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt eine Strategie für eine Oligonucleotidortsspezifische in vitro Deletionsmutagenese von löslichen extrazellulären hPDGF-R-Domänen dar. Viele dieser Konstrukte sind lösliche Peptide oder können zu solchen modifiziert werden.
Die verwendeten Abkürzungen sind folgende:
PR = PDGF-R; intakt
P = PDGF-R; extrazellulärer Bereich
TM = Transmembran
K = Kinase
S = Signalsequenz
Fig. 2 stellt die Struktur eines von pcDL-Sα296 abstammenden Plasmids dar, das zum Exprimieren von verschiedenen Deletionspolypeptiden verwendet wird.
Fig. 3 stellt die Struktur eines von pcDLα296 abstammenden Plasmids pBJΔ dar. Siehe Takabe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472.
1. Das pcDL-SRα296 wird mit XhoI geschnitten.
2. Ein Polylinker (XhoI-XbaI-SfiI-NotI-EcoRI- EcoRV-HindIII-ClaI-SalI) wird in den mit XhoI geschnittenen Vektor eingefügt.
3. SalI ist mit der XhoI-Stelle kompatibel; und erzeugt sowohl eine SalI- als auch eine XhoI- Stelle.
4. Die SV40 16s Spleißstelle liegt nicht mehr vor.
Fig. 4 stellt die Inhibierung der Rezeptorphosphorylierung durch ein menschliches PDGF-Rezeptorpolypeptid vom Typ B dar. Die Markierung mit einem Reagens, das an phosphoryliertes Tyrosin bindet, zeigt, daß die Phosphorylierungsaktivität in Gegenwart des Rezeptorpolypeptidfragments vermindert ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

I. Allgemeine Beschreibung

A. PDGF-R
1. Strukturmerkmale
a. Extrazelluläre Domäne (XR)
i. Signalsequenz
ii. D-Domänen (Ig-artig)
b. Transmembransegment (TM)
c. Intrazelluläre Domäne (IR)
i. Tyrosinkinase
ii. Insert
2. Funktion
a. Bindung von Liganden (PDGF-Analoge)
b. Tyrosinkinaseaktivität
c. Bindung an PDGF-R-Peptid (Dimerbildung)
d. Phosphorylierte Segmente
B. Physiologische Funktionen
1. Zellulär
2. Gewebedifferenzierung
3. Organismal

II. Polypeptide

A. D-Domänen
1. β-Faltblatt-Stränge
2. Cysteinreste
B. Lösliche Formen, extrazellulärer Bereich
C. Gekürzte/Deletionsformen
D. Fusionsproteine
E. Genetische Varianten (ortsspezifisch mutagenisiert)
F. Zusammensetzungen, die Proteine umfassen

III. Nucleinsäuren

A. Isolierte Nucleinsäuren
B. Rekombinante Nucleinsäuren
C. Zusammensetzungen, die Nucleinsäuren umfassen

IV. Verfahren zur Herstellung von PDGF-R-Konstrukten

A. Proteinreinigung
1. Affinität zu derivatisiertem PDGF
2. Verschiedene Liganden, gleicher Rezeptor
B. Expression von Nucleinsäuren
C. Synthetische Verfahren

V. Antikörper

VI. Verfahren zur Verwendung

A. Diagnostisch
B. Therapeutisch

I. Allgemeine Beschreibung

A. Rezeptor eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (PDGF-R)

Der Rezeptor eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (hPDGF-R) umfaßt typischerweise zwei Polypeptide. Diese Polypeptide, die identisch oder nur geringfügig verschieden sein können, assoziieren während der funktionellen Aktivitäten der Ligandenbindung und der Transduktion des Ligandenbindungssignals in die Zelle.
Der Rezeptor des von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors wurde insofern identifiziert, als er eine Hauptkomponente eines Proteins mit ungefähr 180 Kilodalton, welches glycosyliert ist, aufweist. Dieses Glycoprotein wurde als Polypeptid eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors identifiziert. Es wurde von Primärstrukturen von zwei homologen Formen von Polypeptiden berichtet. Eine Rezeptor-Nucleinsäure vom Typ B und ihre entsprechende Polypeptidsequenz von einer Maus sind in Yarden et al. (1986) Nature 323: 226-232 angegeben; und eine homologe genetische Sequenz wurde aus Menschen isoliert. Siehe U. S. S. N. 07/309, 322. Eine menschliche Rezeptorsequenz vom Typ A ist in Matsui et al. (1989) Science 243: 800-803 angegeben. Obwohl die zwei verschiedenen Formen der Rezeptorpolypeptide homolog sind, werden sie durch zwei separate Gene codiert.
Der funktionsfähige Rezeptor beinhaltet anscheinend ein Dimer dieser Polypeptide, entweder Homodimere des Rezeptorpolypeptids vom Typ B oder des Rezeptorpolypeptids vom Typ A oder ein Heterodimer des Rezeptorpolypeptids vom Typ B mit einem Rezeptorpolypeptid vom Typ A. Die Spezifität der Bindung von jeder dieser Formen des Rezeptors ist für jede der verschiedenen Formen eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (PDGF), der Formen AA, BB oder AB (entweder von einer Maus oder vom Menschen oder vermutlich anderen Säugern), unterschiedlich.
Der PDGF-R ist ein Mitglied einer Familie von verwandten Rezeptoren. Siehe z. B. Yarden et al. supra. Jedes dieser Rezeptorpolypeptide weist einen hydrophoben, die Membran durchspannenden Bereich (TM für Transmembran), einen großen extrazellulären Bereich (XR) mit in regelmäßigen Abständen angeordneten Cysteinresten und einen zytoplasmatischen intrazellulären Bereich (IR) mit intrazellulärer Tyrosinkinaseaktivität auf. Der XR des PDGF-R weist eine vorhergesagte Struktur auf, die 5 an β-Strängen reiche Immunoglobulin (Ig)-artige Domänen enthält. Jede dieser Ig- artigen Domänen besteht aus etwa 100 Aminosäuren, die insbesondere im Bereich von etwa 88 bis etwa 114 Aminosäuren liegen, und enthält, abgesehen von der vierten Domäne, in regelmäßigen Abständen angeordnete Cysteinreste. Viele der Strukturmerkmale der verschiedenen Wachstumsfaktorrezeptoren sind homolog, einschließlich der Mäuse- und menschlichen Versionen des PDGF-R. Somit sind viele der hierin definierten Strukturmerkmale mit anderen verwandten Proteinen gemeinsam. In den meisten Fällen ist jedoch die Funktionsbeziehung zu speziellen Strukturmerkmalen unbekannt.
Der intrazelluläre Bereich (IR) ist jenes Segment des PDGF- R, das carboxynah zum Transmembran (TM)-Segment ist. Der intrazelluläre Bereich ist teilweise durch die Anwesenheit einer gespaltenen Tyrosinkinase-Strukturdomäne charakterisiert. In dem menschlichen Rezeptorpolypeptid vom Typ B ist die Tyrosinkinasedomäne etwa 244 Aminosäuren lang mit einem Insert von etwa 104 Aminosäuren. Siehe Tabelle 1. In dem menschlichen Rezeptorpolypeptid vom Typ A ist die Domäne etwa 244 Aminosäuren lang mit einem Kinaseinsert von etwa 103 Aminosäuren. Siehe Tabelle 2. Funktionell ist diese Domäne teilweise durch ihre Tyrosinkinaseaktivität definiert, die typischerweise durch eine Ligandenbindung an Bindungsstellen, welche im extrazellulären Bereich anzutreffen sind, moduliert wird, und scheint in einem Dimerzustand zu wirken. Das Substrat für die Phosphorylierung umfaßt verschiedene Tyrosinreste an der zugehörigen Rezeptorpolypeptidkette und andere Proteine, die mit dem Rezeptor assoziieren. Die Tyrosinkinasedomäne ist ebenfalls teilweise durch ihre Homologie zu ähnlichen Domänen in anderen Tyrosinkinaseaktivität enthaltenden Proteinen definiert. Siehe z. B. Yarden et al. (1986) Nature 323: 226-232. Jedes IR-Segment des dimerisierten Rezeptorkomplexes scheint spezifische Tyrosinreste an der anderen Polypeptidkette zu phosphorylieren.
Jedes Transmembransegment der menschlichen Rezeptorpolypeptide ist etwa 24 oder 25 Aminosäuren lang und ist durch hydrophobe Aminosäurereste charakterisiert. Diese Segmente weisen Sequenzen auf, die für Membran durchspannende Segmente charakteristisch sind. In dem menschlichen Rezeptorpolypeptid vom Typ B scheint der Transmembranbereich etwa 25 Aminosäuren lang zu sein, welche sich von etwa val(500) bis trp(524) erstrecken, während im menschlichen Rezeptorpolypeptid vom Typ A das Transmembransegment etwa 24 Aminosäuren lang zu sein scheint, welche sich von etwa leu(502) bis trp(526) erstrecken. Siehe z. B. Claesson-Welsh et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86: 4917-4921.
Ein Polypeptid oder eine Nucleinsäure ist eine "menschliche" Sequenz, wenn es bzw. sie von einer natürlichen menschlichen Quelle abgeleitet ist oder teilweise von dieser abstammt. Von menschlichen Zellen abgeleitete oder ursprünglich durch eine menschliche genetische Sequenz codierte Proteine sind beispielsweise menschliche Proteine. Eine Sequenz ist ebenfalls menschlich, wenn sie auf der Basis ihrer starken Ähnlichkeit zu einer Sequenz, die in einer natürlichen menschlichen Probe zu finden ist, ausgewählt ist oder daraus abgeleitet ist.
Ein Fusionspolypeptid oder eine Fusionsnucleinsäure ist ein Molekül, das aus der Fusion von Segmenten aus Sequenzen, die natürlicherweise nicht aufeinander folgen, entsteht. Somit ist ein chimäres Protein oder eine chimäre Nucleinsäure ein Fusionsmolekül. Ein heterologes Protein ist ein Protein, das von einer anderen Quelle abstammt.

B. Physiologische Funktionen

Der PDGF-R scheint mindestens vier unterschiedliche biologische Hauptfunktionen zu besitzen. Die erste ist die Bindung von Liganden, gewöhnlich den mitogenen PDGF- Proteinen oder ihrer Analogen. Diese Liganden und Analogen können auch entweder als Agonisten oder Antagonisten dienen. Die Ligandenbindungsstellen, die aus Ligandenbindungsbereichen (LBR's) bestehen, befinden sich im extrazellulären Bereich (XR). Der funktionsfähige Rezeptor transduziert ein Signal als Reaktion auf die Ligandenbindung und die resultierende Reaktion ist eine durch den Liganden modulierte Aktivität. Da der wahrscheinliche Ligand ein PDGF oder ein Analogon ist, wird das Signal gewöhnlich PDGF-moduliert sein.
Eine zweite biologische Aktivität betrifft die Tyrosinkinase-Enzymaktivität. Diese Aktivität wird typischerweise intrazellulär als Reaktion auf die Ligandenbindung aktiviert. Da diese Rezeptoren jedoch anscheinend in einem dimeren Zustand wirken, können die Bindungswechselwirkungen zwischen Ketten als dritte biologische Aktivität betrachtet werden, die durch Blocker vermittelt werden kann. Die Blockierung oder Störung der Dimerisierungswechselwirkungen kann durch Rezeptorproteinfragmente vermittelt werden, insbesondere bei der funktionellen Ligandenbindung oder den Tyrosinkinaseaktivitäten. Somit kann die Einführung von Analogen der Rezeptordomänen zu natürlichen oder anderen Rezeptorpolypeptiden als zusätzliches Mittel zum Bewirken einer PDGF-Vermittlung von durch Liganden vermittelten Aktivitäten dienen.
Die vierte Funktion des PDGF-Rezeptors ist als Bindungssubstrat für andere Proteine, z. B. die PI3-Kinase. Insbesondere wird der PDGF-Rezeptor als Reaktion auf die Ligandenbindung oder andere Ereignisse an verschiedenen Positionen phosphoryliert. Diese Bindungswechselwirkung aktiviert eine Enzymaktivität an dem Teil des Bindungsproteins, der weitere Zellen- oder Stoffwechselreaktionen aktiviert.
Der Begriff "Ligand" bezieht sich auf die Moleküle, gewöhnlich Mitglieder der Familie der von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktoren, die durch die Ligandenbindungsbereiche (LBR's) gebunden werden. Die Bindungsbereiche sind typischerweise im XR zu finden. Ein Ligand ist auch ein Molekül, das entweder als natürlicher Ligand, an den der Rezeptor bindet, oder als ein funktionelles Analogon eines Liganden dient. Das Analogon kann als Agonist oder Antagonist dienen. Typischerweise sind Liganden Moleküle, die gemeinsame Strukturmerkmale eines natürlichen PDGF aufweisen, z. B. Polypeptide mit ähnlichen Aminosäuresequenzen oder anderen Molekülen, die gemeinsame molekulare Merkmale mit einem Liganden aufweisen. Die Bestimmung, ob ein Molekül als Ligand dient, hängt von der Messung eines Parameters oder einer Reaktion ab, der bzw. die sich bei der Bindung dieses Liganden ändert, wie z. B. Dimerisierung oder Tyrosinkinaseaktivität. Siehe beispielsweise Gilman et al. (Hrsg.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. Ausg., Pergamon Press, das durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
Der Rezeptor weist Ligandenbindungsbereiche (LBR) oder Bereiche, die bei der Bestimmung von sowohl der Affinität als auch der Spezifität der Bindung des Liganden, z. B. PDGF und seine Analogen, wichtig sind, auf. Die Ligandenbindungsbereiche bestimmen die Bindungswechselwirkungen zwischen den Rezeptoren und dem Liganden. Typischerweise sind diese Bereiche jene Kontaktpunkte zwischen dem Ligandenmolekül und dem Rezeptor. Diese molekularen Wechselwirkungen können durch kristallographische Verfahren oder durch Testen, welche Bereiche des Rezeptors bei der Ligandenwechselwirkung wichtig sind, bestimmt werden. Verschiedene Segmente des extrazellulären Bereichs des PDGF-Rezeptors bilden die Ligandenbindungsbereiche, während andere Segmente strukturelle Segmente bilden, die die LBR's in zweckmäßiger Anordnung räumlich orientieren, um die Liganden zweckmäßig zu binden.
Im allgemeinen besitzt das Fragment eine Sequenz von mindestens etwa 6 benachbarten Aminosäuren, gewöhnlich mindestens etwa 8 benachbarten Aminosäuren, üblicher mindestens etwa 10 benachbarten Aminosäuren, vorzugsweise mindestens etwa 13 benachbarten Aminosäuren und bevorzugter mindestens etwa 15 oder mehr benachbarten Aminosäuren. Gewöhnlich befinden sich die LBR's innerhalb der Intracystein- (oder äquivalenten) Reste von jeder Ig- artigen Domäne, z. B. den Domänen D1, D2, D3, D4 und D5. Sie sind vorzugsweise von D3-Sequenzen abgeleitet, aber von D1 und D2 abgeleitete Sequenzen sind ebenfalls üblich. Gelegentlich stellen Sequenzen von D4, D5 oder anderen Proteinen eine LBR-Funktion bereit.
Die Extracystein- (oder äquivalenten) Bereiche stellen strukturelle Funktionen bereit, ebenso wie Spacer-Segmente zwischen den Domänen. Die Intracysteinabschnitte oder -segmente sind in den Tabellen 4 und 5 angegeben und umfassen die mit C, C', C", D und E bezeichneten Segmente zusammen mit Abschnitten der B- und F-Segmente, wie angegeben. Die Extracysteinreste umfassen die mit A und G bezeichneten Segmente und Abschnitte von B und F.
Die Ligandenbindungsbereiche sind teilweise durch die Bedeutung ihrer Anwesenheit oder ihre Wirkung auf die Affinität der PDGF-Ligandenbindung definiert. Der natürliche, native PDGF-R mit voller Länge bindet mit einer Kd von etwa 0,2 mM. Siehe z. B. Duan et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 413-418, welches hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Ein LBR ist ein Segment eines Polypeptids, dessen Anwesenheit die Ligandenbindung signifikant beeinflußt, im allgemeinen um mindestens etwa einen Faktor von zwei, gewöhnlich um mindestens etwa einen Faktor von vier, üblicher um mindestens einen Faktor von etwa acht und vorzugsweise um mindestens etwa einen Faktor von zwölf oder mehr. Ein Fragment dieser Erfindung, das an den PDGF-Liganden bindet, bindet im allgemeinen mit einer Kd von weniger als etwa 10 uM, gewöhnlicher weniger als etwa 1 uM, üblicherweise weniger als etwa 0,1 uM, üblicher weniger als etwa 10 nM, vorzugsweise weniger als etwa 1 nM und bevorzugter weniger als etwa 0,5 nM.
Ein Epitop ist eine Antigendeterminante, die möglicherweise oder tatsächlich eine Antikörperreaktion hervorgerufen hat. Es kann sich auch auf ein Strukturmerkmal beziehen, das durch einen Antikörperbindungsbereich oder sein Äquivalent definiert ist. Ein Epitop muß nicht notwendigerweise immunisierend sein, sondern dient als Bindungsstelle für ein Antikörpermolekül oder sein Äquivalent.

II. Polypeptide

Tabelle 1 offenbart die Sequenz eines Allels eines Polypeptids eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors vom Typ B. Sowohl eine Nucleinsäuresequenz als auch ihre entsprechende Proteinsequenz werden bereitgestellt. Die Nucleinsäuresequenz entspricht Seq. ID Nr. 1. Die Aminosäuresequenz entspricht Seq. ID Nr. 2. Eine homologe Mäusesequenz wurde in Yarden et al. (1988) Nature 323: 226- 232 angegeben. Die Sequenz eines PDGF-Rezeptorpolypeptids einer Maus weist ebenfalls Strukturmerkmale ebenso wie die Bereiche, die Domänen und die β-Strang-Segmente der menschlichen Rezeptorpolypeptide auf. Die Mäusepolypeptide und diejenigen von anderen verwandten Rezeptoren dienen als Quelle für ähnliche Domänen, homologe β-Strang-Segmente und Sequenzen zwischen den Segmenten und Sequenzen mit Homologie für allgemeinen Austausch oder Substitutionen. TABELLE 1 Sequenz eines Allels und eines Proteins eines Polypeptids eines Rezeptors eines menschlichen PDGF vom Typ B Tabelle 1, Seite 2 Tabelle 1, Seite 3 Tabelle 1, Seite 4 Tabelle 1, Seite 5
Tabelle 2 offenbart die Sequenz eines Allels eines Polypeptids eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors vom Typ A. Sowohl eine Nucleinsäuresequenz als auch ihre entsprechende Proteinsequenz werden bereitgestellt. Die Nucleinsäuresequenz entspricht Seq. ID Nr. 5. Die Aminosäuresequenz entspricht Seq. ID Nr. 4. Eine weitere menschliche Allelsequenz vom Typ A ist in Matsui et al. (1989) Science 243: 800-803 angegeben. TABELLE 2 Sequenz eines Allels und eines Proteins eines Polypeptids eines Rezeptors eines menschlichen PDGF vom Typ A Tabelle 2, Seite 2 Tabelle 2, Seite 3 Tabelle 2, Seite 4 Tabelle 2, Seite 5
Ein Polypeptid oder eine Nucleinsäure ist im wesentlichen rein oder im wesentlichen gereinigt, wenn es bzw. sie mindestens etwa 30% des jeweiligen Polymers in einer Zusammensetzung, typischerweise mindestens etwa 50%, typischer mindestens etwa 70%, gewöhnlich mindestens etwa 80%, üblicher mindestens etwa 90%, vorzugsweise mindestens etwa 95% und bevorzugter etwa 98% oder mehr umfaßt.
Die löslichen Fragmente des extrazellulären Bereichs sind im allgemeinen weniger als etwa 400 Aminosäuren, gewöhnlich weniger als etwa 350 Aminosäuren, üblicher weniger als etwa 300 Aminosäuren, typischerweise weniger als etwa 200 Aminosäuren und vorzugsweise weniger als etwa 150 Aminosäuren.

A. D-Domänen

Auf der Basis von mehreren Beobachtungen umfaßt der extrazelluläre Bereich (XR) dieser PDGF-Rezeptorpolypeptide 5 Immunoglobulin-artige Domänen. Erstens enthält die Aminosäuresequenz 5 Segmente, die für Strukturen einer Ig- artigen Domäne charakteristisch sind, wobei jedes der Segmente eine geeignete Größe für eine Immunoglobulindomäne aufweist. Jedes Segment, außer dem vierten, weist charakteristisch beabstandete Cysteinreste auf, die ein diagnostisches Merkmal einer Immunoglobulin-artigen Domäne sind. Die Rezeptorpolypeptidsequenz zeigt weitere Merkmale einer Struktur einer Immunoglobulin-artigen Domäne, z. B. die Anwesenheit von charakteristisch angeordneten Tryptophan- und Tyrosinresten. Direkte Sequenzvergleiche von Segmenten der Rezeptorpolypeptide mit entsprechenden Segmenten von echten Immunoglobulindomänen zeigen eine statistisch signifikante Ähnlichkeit zwischen PDGF- Rezeptorpolypeptiddomänen und Immunoglobulindomänen. Siehe beispielsweise Williams (1989) Science 243: 1564-1570. Das Argument, daß die Rezeptorpolypeptiddomänen das Faltungsmuster von Immunoglobulindomänen annehmen, kann durch Untersuchen der vorhergesagten Sekundärstruktur der Rezeptorpolypeptide bestärkt werden.
Wenn eine Homologiekartierungsanalyse durchgeführt wird, zeigt das PDGF-Rezeptorpolypeptid fünf Ig-artige Domänen im extrazellulären Bereich, wobei jede Domäne eine statistisch signifikante Homologie zu definierten Ig-artigen Domänen zeigt. Siehe beispielsweise Williams und Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol. Biochem. 6: 381-405. Bereiche mit Homologie zeigen eine signifikante Sequenzhomologie zu speziellen Ig-artigen Domänen und weisen spezielle sekundäre und tertiäre Strukturmotive auf, die für Ig- artige Domänen charakteristisch sind. Die Domänenstrukturen sind vorzugsweise jene Segmente mit Grenzen, die ungefähr den Grenzen der Domänenstrukturen entsprechen. Die Grenzen passen vorzugsweise innerhalb von etwa 9 Aminosäuren, typischerweise innerhalb von etwa 7 Aminosäuren, typischer innerhalb von etwa 5 Aminosäuren, gewöhnlich innerhalb von etwa 3 Aminosäuren und üblicher innerhalb von 1 Aminosäure. Siehe beispielsweise Cantor und Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, Bände I-III, Freeman and Co., San Francisco; Creighton (1984), Proteins: Structure and Molecular Properties, Freeman and Co., New York; und Watson et al. (1987) The Molecular Biology of the Gene, Bände 1 und 2, Benjamin, Menlo Park, Kalifornien; von denen jedes hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
Die Sequenzen der menschlichen Rezeptorpolypeptide vom Typ B und Typ A können analysiert werden, um ihre Betastrangtopologie vorherzusagen. Die Kombination einer Fourieranalyse eines hydrophoben Sequenzmusters und eines Garnier-Robson-Algoritbmus, siehe z. B. Garnier et al. (1978) J. Mol. Biol. 120: 97, mit einem Windungsvorhersageprogramm, wie in Cohen et al. (1986) Biochemistry 25: 266 berichtet, erzeugt ein charakteristisches Strukturmuster. Dieses Muster weist Consensus-β-Strang-Segmente in jeder Domäne auf, wenn es wie beschrieben analysiert wird.
Die ersten zwei Ig-artigen Domänen der PDGF- Rezeptorpolypeptide, D1 und D2, weisen etwa sieben β- Strang-Segmente auf, die als A-, B-, C-, D-, E-, F- und G- Segmente bezeichnet sind, aufgelistet von der aminonahen zur carboxynahen Richtung. Die dritten, vierten und fünften Ig-artigen Domänen D3, D4 und D5 sind lang genug, um ein zusätzliches β-Strang-Segment einzuschließen, das mit C' bezeichnet ist. Die fünfte Domäne D5 ähnelt in der Länge am ehesten einer variablen Domäne einer schweren Kette. Das Rezeptorpolypeptid D5 vom Typ B umfaßt ferner ein zusätzliches β-Strang-Segment, das als C" bezeichnet ist. Diese Merkmale und Bezeichnungen basieren teilweise auf der Homologie der Segmente zwischen den Domänen und Segmenten in den hPDGF-R-Polypeptiden vom Typ B und Typ A und mit dem PDGF-Rezeptorpolypeptid vom Typ B einer Maus und basieren auch auf der Homologie zu anderen Ig-artigen Segmenten, die in anderen Proteinen anzutreffen sind, insbesondere anderen Wachstumsfaktor-Rezeptorproteinen. Der Rezeptor csf-1 und das Protoonkogen c-kit weisen ähnliche Ig-artige Domänenorganisationen auf. Siehe beispielsweise Williams (1989) Science 243: 1564-1570.
Die Domänenstruktur basiert teilweise auf Merkmalen, die mit Ig-artigen Domänen gemeinsam sind, welche in anderen Proteinen zu finden sind, einschließlich verwandten Rezeptoren. Siehe beispielsweise Ullrich und Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212; und Yarden und Ullrich (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 443-78. Die Domänengrenzen für die zwei hierin offenbarten Allele sind nachstehend identifiziert, aber verschiedene Allele können geringfügig unterschiedliche Positionen für die Grenzen aufweisen. Siehe Tabelle 14.
Die Ig-artigen Domänen (D-Domänen) sind durch die Regelmäßigkeit des Abstands der Cysteinreste im extrazellulären Bereich charakterisiert. Diese fünf D- Domänen, die jeweils etwa 100 Aminosäuren lang sind, weisen β-Faltblatt-reiche Strukturen auf, die variablen oder konstanten Immunoglobulinbereichen ähneln. Siehe Williams (1989) Science 243: 1964-1570. Die natürlichen XR-Domänen sind von der aminonahen Domäne D1 der Reihe nach bis D5 am carboxynahen Ende des XR numeriert.
Die Exon-Struktur des PDGF-Rezeptorpolypeptidgens vom Typ B von einer Maus entspricht ebenfalls mit angemessener Genauigkeit dieser Domänenstruktur. Die Korrelation zwischen der Intron-Exon-Struktur und Funktionseinheiten unterstützt weiter die Hypothese, daß die Grenzen Funktionseinheiten des Polypeptids definieren. Siehe beispielsweise Williams und Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol. Biochem. 6: 381-405. Die Grenzen für jedes dieser Segmente sind nachstehend für die zwei hierin offenbarten Allele angegeben und ähnliche Grenzen sind in anderen Allelen an Stellen mit Sequenz- und funktioneller Homologie zu finden.
Die aminonahe Ig-artige Domäne der Polypeptide eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors ist mit D1 bezeichnet. Die Domäne D1 erstreckt sich von etwa leu(1) bis pro(91) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ B und von etwa gln(1) bis pro(101) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ A. Siehe Tabelle 14. Die Domäne D1 weist anscheinend etwa sieben β- Faltblatt-Segmente auf. TABELLE 14 Ungefähre Grenzen des β-Strang-Segments des menschlichen Rezeptorpolypeptids vom Typ B Ungefähre Grenzen des β-Strang-Segments des menschlichen Rezeptorpolypeptids vom Typ A
Die nächste Ig-artige Domäne in der carboxynahen Richtung der natürlichen Polypeptide eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors ist mit D2 bezeichnet. Die Domäne D2 erstreckt sich von etwa thr(92) bis ser(181) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ B und von etwa asp(102) bis ser(189) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ A. Die Domäne D2 weist anscheinend auch etwa sieben β-Faltblatt-Stränge auf, die mit A, B, C, D, E, F und G bezeichnet sind.
Die dritte Ig-artige Domäne, die an natürlichen menschlichen PDGF-Rezeptorpolypeptiden anzutreffen ist, ist mit D3 bezeichnet. Die Domäne D3 erstreckt sich von etwa 11e(182) bis gly(282) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ B und von etwa glu(190) bis gly(290) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ A. Die Domäne D3 weist anscheinend etwa acht β-Faltblatt-Stränge auf, die mit A, B, C, C', D, E, F und G bezeichnet sind.
Die vierte Ig-artige Domäne, die in den natürlichen menschlichen PDGF-Rezeptorpolypeptiden zu finden ist, ist mit D4 bezeichnet. Die Domäne D4 erstreckt sich von etwa tyr(283) bis pro(384) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ B und von etwa phe(291) bis pro(391) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ A. Die Domäne D4 weist anscheinend etwa acht β-Faltblatt-Stränge auf. Man beachte, daß den Domänen D4 die charakteristischen Cysteinreste fehlen, die val(306) und met(364) in der gezeigten Sequenz vom Typ B und val(313) und 11e(371) in der gezeigten Sequenz vom Typ A entsprechen.
Die fünfte Ig-artige Domäne ist mit D5 bezeichnet. Die Domäne D5 erstreckt sich von etwa val(385) bis lys(499) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ B und von etwa ser(392) bis glu(501) in dem Rezeptorpolypeptid vom Typ A. Die D5 des Rezeptorpolypeptids vom Typ B weist etwa neun vermutliche β-Faltblatt-Strang-Segmente auf, die mit A, B, C, C', C", D, E, F und G bezeichnet sind, während das Rezeptorpolypeptid vom Typ A nur etwa acht β-Strang- Segmente aufweist, denen ein C"-Segment fehlt.
Die ungefähren Grenzen der Domänen und β-Strang-Segmente sind in Tabelle 14 aufgelistet. Die scheinbaren Anordnungen der Segmente sind in den Tabellen 4 und 5 dargestellt. Andere Allele der Rezeptorpolypeptide können durch entweder Homologie- oder die Strukturanalyse, wie vorstehend beschrieben, ebenfalls analysiert werden. TABELLE 4 Aminosäuresequenz eines Rezeptorpolypeptids vom Typ B mit vergleichender Anordnung der β-Strang-Segmente TABELLE 5 Aminosäuresequenz eines Rezeptorpolypeptids vom Typ A mit vergleichender Anordnung der β-Strang-Segmente
Die prototypischen Domänen D1 sind jene Sequenzen des menschlichen Rezeptorpolypeptids vom Typ B und des menschlichen Rezeptorpolypeptids vom Typ A, wie beschrieben. Es können jedoch kompatible Aminosäure- Substitutionen, -Insertionen und -Deletionen, die die gewünschten Ligandenbindungsfunktionen bewahren, vorgenommen werden. Die Funktion wird gewöhnlich durch Beibehalten der LBR-Segmente in der korrekten Orientierung unter Verwendung von geeigneten strukturierten Segmenten bewahrt. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Die Substitution oder der Austausch von β-Faltblatt-Segmenten oder Sequenzen zwischen den Segmenten von verschiedenen Domänen kann durchgeführt werden, einschließlich zwischen Rezeptorpolypeptiden vom Typ B und A oder zwischen verschiedenen Domänen eines anderen verwandten Rezeptorpolypeptids. Segmente außerhalb der prototypischen Cysteine innerhalb von β-Segmenten B und F (bis auf val(306) und met(364) in der D4 vom Typ B und val(313) und 11e(371) in der D4 vom Typ A) sind gewöhnlich weniger kritisch als die Sequenzen zwischen jenen Resten, z. B. die β-Strang-Segmente C, C', C", D; und E. Segmente, die zu diesen offenbarten Segmenten homolog sind, können ebenfalls substituiert werden, einschließlich jenen mit kompatiblen Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und -Deletionen. Quellen für ähnliche Domänen und Segmente schließen verwandte Rezeptorpolypeptide von menschlichen oder anderen Säugerspezies ein. Nicht-Säuger-Rezeptorpolypeptide können ebenfalls eine signifikante Homologie aufweisen und als Quellen für ähnliche Segmente dienen. Andere Ig-artige Domänen und Segmente können ebenfalls substituiert werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Polypeptide, die eine Homologie zu den offenbarten und beschriebenen Segmenten und Domänen aufweisen. Sie umfaßt Segmente, die benachbarte Aminosäuren der offenbarten Sequenzen, typischerweise mindestens etwa 8 benachbarte Aminosäuren, typischer mindestens etwa 11 benachbarte Aminosäuren, gewöhnlich mindestens etwa 14 benachbarte Aminosäuren, üblicher mindestens etwa 17 benachbarte Aminosäuren und vorzugsweise mindestens etwa 21 oder mehr benachbarte Aminosäuren enthalten. Konstrukte, die die LBR-Segmente beibehalten, sind am nützlichsten. Die Erfindung umfaßt auch Modifikationen von diesen Sequenzen, einschließlich Insertionen, Deletionen, und Substitutionen gegen andere Aminosäuren. Glycosylierungsmodifikationen, entweder verändert, mit erhöhten Mengen oder verminderten Mengen, sowie andere Sequenzmodifikationen werden in Betracht gezogen. Somit sind die modifizierten Proteine mit diesen Aminosäuresequenzen, z. B. Analoge, gewöhnlich entweder in der Funktion oder der Struktur im wesentlichen äquivalent zu diesen Proteinen.
Die β-Faltblatt-Stränge können durch jeweilige Insertionen oder Deletionen in der Polypeptidsequenz geringfügig verlängert oder verkürzt werden. Somit weisen bestimmte Ausführungsformen eine geringfügig verlängerte oder verkürzte spezielle Domäne auf, indem spezielle Sequenzen der β-Faltblatt-Stränge oder Sequenzen zwischen den Strängen hinzugefügt oder deletiert werden. Segmente können eingefügt oder deletiert werden, die den strukturellen Anforderungen des Beibehaltens der zweckmäßigen Wechselwirkungen in den und zwischen den Domänen genügen. Insbesondere werden Änderungen, die die Sekundär- und Tertiärstruktur des Proteins unterbrechen, abgelehnt. Siehe beispielsweise Cantor und Schimmel (1990) und Creighton (1984). Außerdem können in den Bereichen außerhalb der β- Faltblatt-Stränge und zwischen den Domänen Aminosäuren oder Segmente eingefügt oder deletiert werden. Typischerweise erfolgen die Substitutionen mit Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften und Additionen oder Deletionen würden vorzugsweise unter jenen ausgewählt werden, die biologische Rezeptorfunktionen, z. B. die Ligandenbindung, beibehalten.
Die Sequenz eines β-Faltblatt-Segments unterscheidet sich typischerweise nicht von einer Sequenz von einem menschlichen Polypeptid vom Typ B oder einem menschlichen Polypeptid vom Typ A um mehr als etwa 50%, typischer weniger als etwa 39%, gewöhnlich weniger als etwa 29% und üblicher weniger als etwa 20%. Vergleichbare Ähnlichkeiten über jedem der Nicht-β-Faltblatt-Stränge jeder Domäne sind bevorzugt.
Die Grenzen zwischen den Domänen sind teilweise durch die Definitionen für Domänen in den Ig-artigen Domänen definiert. Beispiele von ähnlichen Domänen sind in Immunoglobulin- und Wachstumsfaktorrezeptorpolypeptiden zu finden. Die Domänengrenzen zwischen D1 und D2; D2 und D3; D3 und D4; und D4 und D5 entsprechen ungefähr den Exon- Stellen, was den Vorschlag weiter unterstützt, daß die Domänenstrukturen Entwicklungs- und Funktionseinheiten entsprechen. Siehe beispielsweise Watson et al. (1987) The Molecular Biology of the Gene, Bände 1 und 2, Benjamin, Menlo Park, Kalifornien.
Die Domänen D2 weisen ähnliche Eigenschaften auf wie die Domänen D1, wie durch die in den Tabellen 4 und 5 dargestellten ausgerichteten Anordnungen gezeigt. Beide Domänen weisen β-Faltblatt-Segmente auf, die mit A, B, C, D, E, F und G bezeichnet sind. Die Segmente der Domäne 3 oder D3 weisen ebenfalls eine Homologie auf, weisen jedoch ein zusätzliches β-Strang-Segment auf, das mit C' bezeichnet ist. Die D4-Segmente oder D4 weisen Nicht- Cystein-Reste an den Positionen auf, die typischerweise den Cysteinen in den anderen Domänen entsprechen. In dem gezeigten Allel vom Typ B sind die Reste val(306) und met(364), während in dem gezeigten Allel vom Typ A die Reste val(313) und 11e(371) sind. Die Domänen D4 weisen auch β-Strang-Segmente auf, die mit C' bezeichnet sind. Die Domäne 5 oder D5 weist die Consensus-Cysteinreste und die zusätzlichen β-Strang-Segmente C' auf, und das Rezeptorpolypeptid vom Typ B weist ein zusätzliches β- Strang-Segment C" auf.
Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene Konstrukte, einschließlich Ligandenbindungskonstrukten, die typischerweise im wesentlichen intakte Domänen einschließen, bereit. Diese Konstrukte besitzen verschiedene Anwendungen, beispielsweise zum Binden von Liganden oder Substituieren gegen intakte Rezeptorpolypeptide. Beispielsweise kann jede der separaten Domänen ein separates Polypeptid allein umfassen oder kann mit einem anderen Peptid fusioniert sein, wie z. B. den TM- und IR-Bereichen eines Rezeptorpolypeptids, beispielsweise hPDGF-R. Siehe beispielsweise Tabelle 6. Diese individuellen Polypeptide mit einzelner Domäne weisen eine spezifische Aktivität auf, die zu diesen spezifischen Domänen gehört, vorzugsweise als Agonist oder Antagonist für die Ligandenbindung, vorzugsweise mit Eigenschaften, die sie mit dem intakten Rezeptorpolypeptid oder xR gemeinsam haben. Die Domänen können auch vorzugsweise als kompetitive Inhibitoren von PDGF-R-Polypeptiden dienen, wobei sie mit natürlichen PDGF-Rezeptoren um das Binden von Liganden konkurrieren. Die vorliegende Erfindung stellt auch repetitive Sequenzen einer einzelnen Domäne bereit. Beispielsweise wird eine Domäne D1 allein bereitgestellt, ein D1-D1-Dimer in einem einzelnen Polypeptid wird bereitgestellt, eine D1-D1-D1-Triplettwiederholung wird ebenfalls bereitgestellt. Ebenso bis zu einer großen Anzahl von Domänen D1, die viele Funktionen aufweisen, beispielsweise immunologische Eigenschaften, die für verschiedene natürliche PDGF-R-Sequenzen charakteristisch sind. Ähnliche Konstrukte von jedem von D2, D3, D4 und D5 werden zusammen mit Kombinationen bereitgestellt. Siehe Tabellen 6, 7, 8, 9 und 10. Diese sind häufig lösliche Fragmente des XR oder können mit anderen Polypeptiden fusioniert werden, einschließlich eines PDGF-R-TM-Segments, vorzugsweise auch mit einem IR-Segment. TABELLE 6 XR-Domänenstruktur von Formen mit einer einzigen Domäne TABELLE 7 XR-Domänenstruktur von Formen mit zwei Domänen TABELLE 8 XR-Domänenstruktur von Formen mit drei Domänen
wobei W jede der in TABELLE 7 aufgelisteten 25 möglichen Kombinationen ist, was in dieser Tabelle insgesamt 125 Elemente ergibt. TABELLE 9 XR-Domänenstruktur von Formen mit vier Domänen
wobei X jede der in TABELLE 8 aufgelisteten 125 möglichen Kombinationen ist, was in dieser Tabelle insgesamt 625 Elemente ergibt. TABELLE 10 XR-Domänenstruktur von Formen mit fünf Domänen
wobei Y jede der in TABELLE 9 aufgelisteten 625 möglichen Kombinationen ist, aber nicht die Kombination D1-D2-D3-D4- D5 einschließt, was in dieser Tabelle insgesamt 3124 Elemente ergibt.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ähnliche Strukturen mit Spacer-Bereichen zwischen den Domänenstrukturen bereit. Insbesondere sind die Bereiche, die den Intracysteinresten der in den Tabellen 4 und 5 gezeigten Domänen entsprechen, brauchbar. Beispielsweise kann ein Spacer-Polypeptid zwischen benachbarte Domänen oder in Zwischenräume zwischen den wichtigen Ligandenbindungssegmenten eingefügt werden, welche typischerweise innerhalb der beschriebenen Intracysteinsegmente zu finden sind, beispielsweise den β- Strang-Segmenten B, C, C', C", D, E und F. Somit wird beispielsweise ein Polypeptid der Struktur D1-X1-D2 bereitgestellt, wobei X1 ein Spacer-Segment ist, das keine D-Domäne ist. Die Reihenfolge der Domänen kann umgekehrt werden, und die Erfindung stellt auch Polypeptide wie z. B. D2-D1 oder D2-X1-D1 bereit. Insbesondere wird der Nicht-D- Domänencharakter von X1 bereitgestellt, um zu vermeiden, daß das Peptid D1-X1-D3 D1-D2-D3 beschreibt oder umfaßt.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Polypeptid mit der beschriebenen Domänenstruktur des extrazellulären Bereichs, kombiniert mit anderen Segmenten eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors, insbesondere dem Transmembransegment (TM) und dem intrazellulären Bereich (IR). Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Rezeptorpolypeptid bereit, das entweder eine modifizierte Reihenfolge der Domänen des extrazellulären Bereichs in der Amino-Carboxy-Richtung, beispielsweise ein D5-D4-D3-D2-D1-TM-IR-Polypeptid, oder in einigen Fällen eine Umkehr von verschiedenen Domänen aufweist. Sie stellt auch ein Rezeptorpolypeptid mit einer deletierten intakten Domäne und ein Rezeptorpolypeptid mit einer zusätzlichen zu ihm hinzugefügten Domäne bereit. Beispiele schließen D1-D2- D3-TM-IR oder D1-D2-D3-D4-TM-IR ein. Insbesondere sind Fusionen mit den in den Tabellen 6, 7, 8, 9 und 10 beschriebenen XR-Segmenten bevorzugte Ausführungsformen.
Von den modifizierten Kombinationen der D-Domänen wird erwartet, daß sie sowohl dem natürlichen Rezeptor ähneln als auch sich von diesem unterscheiden. In einigen Ausführungsformen würde erwartet werden, daß das modifizierte Polypeptid eine modifizierte Bindungsaffinität, beispielsweise eine höhere oder niedrigere Affinität, aufweist oder ein anderes Spektrum der Bindung an verschiedene Liganden oder Ligandenanaloge aufweist. Sie können auch eine veränderte Ligandenbindungs- Transduktionseffizienz oder eine modifizierte Assoziationsaffinität zwischen den Ketten aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt das Mittel zum Bestimmen der minimalen Strukturmerkmale, die erforderlich sind, um verschiedene Funktionen des extrazellulären Bereichs von Rezeptoren eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors, vorzugsweise menschlichen Rezeptoren, zu erfüllen, bereit. Obwohl ähnliche Bestimmungen in Mäuse- oder anderen Säugerspezies durchgeführt werden können, ist der menschliche Rezeptor typischerweise für diagnostische oder therapeutische Zwecke bevorzugt.
Um den minimalen Bereich zu bestimmen, der für eine funktionale Aktivität, z. B. die Ligandenbindung, erforderlich ist, wird ein Test für diese Aktivität entwickelt. Die Hauptrezeptorfunktionen, wie vorstehend angegeben, umfassen die Ligandenbindung, Tyrosinkinaseaktivität und Rezeptordimerisierung. Einfache und schnelle Tests für jede dieser molekularen Funktionen können entwickelt werden. Ligandenbindungstests sind z. B. in Gronwald et al. (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 3435-3439; Heldin et al. (1988) EMBO J. 7: 1387-1393; und Escobedo et al. (1988) Science 240: 1532-1534 beschrieben. Rezeptordimerisierungstests sind beispielsweise in Yarden und Schlessinger (1987) Biochemistry 26: 1434-1442 und 1443- 1451 beschrieben.
Als alternatives Mittel zur Bestimmung von Stellen, die mit spezifischen anderen Proteinen in Wechselwirkung treten, stellt eine physikalische Strukturbestimmung, z. B. Röntgenkristallographie oder 2-dimensionale NMR-Verfahren, eine Orientierung hinsichtlich dessen bereit, welche Aminosäurereste die Molekülkontaktbereiche bilden. Für eine ausführliche Beschreibung der Proteinstrukturbestimmung siehe beispielsweise Blundell und Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York, das hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
Ligandenbindungstests können die Bindung eines markierten Liganden oder Konkurrenztests für die Bindung beinhalten. Die Signaltransduktion kann durch Messen einer durch die Ligandenbindung modulierten Aktivität, beispielsweise Tyrosinkinaseaktivität, oder irgendeines Maßes für eine Konformations- oder andere Änderung in der Rezeptorstruktur indirekt untersucht werden. Beispielsweise kann ein Antikörper oder ein anderes Bindungsprotein, der oder das das Rezeptorpolypeptid spezifisch bindet oder von diesem dissoziiert nach der Ligandenbindung, verwendet werden. Die Rezeptordimerisierung kann durch einen Schnelltest, einschließlich Fluoreszenzlöschung oder einer anderen spektroskopischen Messung, gemessen werden. Es sind verschiedene Schnelltests bekannt, siehe beispielsweise Ullrich und Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212; Yarden und Schlessinger (1987) Biochemistry 26: 1434-1942 und 1443- 1451; von denen jedes hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
Wenn ein Test einmal entwickelt wurde, können verschiedene Kombinationen einer Domäne oder von anderen Segmenten, beispielsweise LBR's, auf die Beeinflussung dieser Aktivität hin getestet werden. Ein Konkurrenzinhibierungstest erfaßt die Konstrukte, die den Liganden binden können. Die ersten zu prüfenden Domänenstrukturen sind gewöhnlich die einzelnen Domänen, entweder allein oder mit chimären Proteinen oder dem TM-IR- Segment des Rezeptors verbunden. Verschiedene Allele, Modifikationen an den einzelnen Domänen oder verwandte chimäre Domänen würden getestet werden. Sowohl Deletions- als auch chimäre Proteine werden konstruiert.
Verschiedene Kombinationen jeder Domäne werden konstruiert und getestet, um diejenigen auszuwählen, die die gemessene Aktivität beeinflussen. Wiederholungen dieser Domänen sollten getestet werden, z. B. D1-D1. Wenn keine einzelne Domäne die Funktion beeinflußt, dann würden verschiedene Konstrukte aus 2 Domänen der Reihe nach geprüft werden, z. B. D1-D2-TM-IR, D2-D3-TM-IR, D3-D4-TM-IR und D4-D5-TM-IR. Ausgewählte Kombinationen, die in den Tabellen 6, 7, 8, 9 und 10 aufgelistet sind, werden konstruiert und getestet.
Um lösliche Formen herzustellen, ist es häufig erwünscht, geeignete Amino-endständige Segmente anzuheften, von denen einige voraussichtlich in der Domäne D1 oder in der Vorläuferform vorliegen würden. Die richtige Sekretion und Reifung kann von verschiedenen Amino-nahen Merkmalen, wie z. B. Signalsequenzen, und anderen Merkmalen, die für eine korrekte Zielbestimmung und Reifung wesentlich sind, abhängen. Siehe beispielsweise Watson et al. (1987) The Molecular Biology of the Gene, Bände 1 und 2, Benjamin, Menlo Park, Kalifornien.
Wenn korrekte Domänen ausgewählt wurden, die besonders wirksam sind bei der Modulation oder Konkurrenz von definierten Funktionen, könnte eine detailliertere Analyse auf dem Niveau der β-Strang-Segmente angegangen werden. Verschiedene chimäre, Deletions-, Insertions- oder Substitutionskonstrukte von jedem β-Strang-Segment oder Segment zwischen den Strängen können erzeugt und getestet werden, wie vorstehend beschrieben. Jedes Konstrukt könnte unter Verwendung von Verfahren der Standardgentechnik, insbesondere unter Verwendung von synthetischen Primern, hergestellt werden. Verfahren zur Verwendung solcher Reagenzien sind beispielsweise in Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Bände 1-3, Cold Spring Harbor Press, und Ausubel et al. (Hrsg.) (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, beschrieben, von denen jedes hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.

B. Lösliche Formen

In einigen Ausführungsformen wird nur der extrazelluläre Bereich bereitgestellt. Somit ist der extrazelluläre Bereich allein ohne das Transmembransegment häufig ein lösliches Polypeptid. Es wurde nachgewiesen, daß der gesamte extrazelluläre Bereich, der von einem Transmembranbereich und einem intrazellulären Bereich getrennt ist und dem diese Bereiche fehlen, dennoch als Ligandenbindungspolypeptid dient. Insbesondere wurde von dem löslichen Polypeptid D1-D2-D3-D4-D5 gezeigt, daß es verschiedene PDGF-Formen bindet. Obwohl die Bindungsspezifität für die PDGF-Form in einem gewissen Umfang von den enthaltenen spezifischen Domänen abhängt, können Modifikationen der Spezifität der Ligandenbindung durch entweder Substituieren von mehreren unterschiedlichen Domänen oder Umordnen der Domänen bewirkt werden. Die Substitution gegen andere homologe Segmente kann ebenfalls durchgeführt werden, z. B. Substituieren einer Ig-artigen Domäne von einem Antikörpermolekül, wie z. B. einem Antikörper, der einen von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor bindet. Alternativ kann eine Domäne von einem anderen verwandten Wachstumsfaktor oder Ligandenrezeptor substituiert werden, beispielsweise von einem FGF-Rezeptor oder einem anderen PDGF-Rezeptor. Die Reihenfolge der Domänen kann ebenfalls modifiziert werden, z. B. D5-D4-D3-D2-D1.
Insbesondere betreffen die Aktivitäten, die bei den extrazellulären Konstrukten gewöhnlich von sehr großer Bedeutung sind, die Bindung des Liganden. Es wurde beispielsweise entdeckt, daß die Domänen D4 und D5 für die Ligandenbindung eines löslichen PDGF-R-Polypeptids des extrazellulären Bereichs nicht wesentlich sind. Wenn die Domäne D3 von den Domänen D1 und D2 getrennt wird, bindet von den restlichen Domänen das Konstrukt D1-D2 den Liganden nur mit geringer Affinität, aber ein D1-D2-D3-Konstrukt bindet den Liganden mit hoher Affinität.
Eine typische hPDGF-R-Nucleinsäuresequenz codiert eine Amino-endständige hydrophobe Zwischensequenz, die gewöhnlich während des Membrantranslokationsvorgangs abgespalten wird. Die klassische Funktion einer Signalsequenz besteht darin, die naszierende Polypeptidkette zu membrangebundenen Ribosomen zu leiten, was zur Membrantranslokation oder zu gezieltem Zelleinbau führt. Da die Signalsequenz jedoch typischerweise bei dem Translokationsvorgang entfernt wird, fehlt die Signalsequenz gewöhnlich in einem gereiften Polypeptid. Häufig wird eine Signalsequenz stromaufwärts eines gewünschten löslichen Peptids dieser Erfindung angeheftet.
Die Löslichkeit eines Polypeptids hängt von der Umgebung und vom Polypeptid ab. Viele Parameter beeinflussen die Polypeptidlöslichkeit, einschließlich der Temperatur, der Elektrolytumgebung, der Größe und der Moleküleigenschaften des Polypeptids und der Art des Lösungsmittels. Typischerweise liegt die Temperatur, bei der das Polypeptid verwendet wird, im Bereich von etwa 4ºC bis etwa 65ºC. Gewöhnlich ist die Temperatur bei der Verwendung höher als etwa 18ºC und üblicher höher als etwa 22ºC. Für Diagnosezwecke ist die Temperatur gewöhnlich etwa Raumtemperatur oder wärmer, aber geringer als die Denaturierungstemperatur der Komponenten in dem Test. Für therapeutische Zwecke ist die Temperatur gewöhnlich Körpertemperatur, typischerweise etwa 37ºC für Menschen, obwohl in gewissen Situationen die Temperatur in situ oder in vitro erhöht oder gesenkt werden kann.
Die Elektrolyte nähern sich gewöhnlich in situ physiologischen Bedingungen, können jedoch zu einer höheren oder niedrigeren Ionenstärke modifiziert werden, wenn es vorteilhaft ist. Die tatsächlichen Ionen können modifiziert werden, um Standardpuffern, die in physiologischen oder analytischen Zusammenhängen verwendet werden, zu entsprechen.
Die Größe und Struktur des Polypeptids sollte in einem im wesentlichen stabilen und globulären Zustand und gewöhnlich nicht in einem denaturierten Zustand vorliegen. Das Polypeptid kann mit anderen Polypeptiden in einer Quartärstruktur assoziiert werden, beispielsweise um Löslichkeit zu verleihen.
Das Lösungsmittel ist gewöhnlich ein biologisch verträglicher Puffer einer Art, die zur Bewahrung von biologischen Aktivitäten verwendet wird, und nähert sich gewöhnlich einem physiologischen Lösungsmittel. Bei gewissen Gelegenheiten wird ein Detergens zugegeben, typischerweise ein mildes, nicht denaturierendes.
Die Löslichkeit wird gewöhnlich in Svedberg-Einheiten gemessen, die ein Maß für die Sedimentationsgeschwindigkeit eines Moleküls unter speziellen Bedingungen sind. Die Bestimmung der Sedimentationsgeschwindigkeit wurde klassisch in einer analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt, wird jedoch nun typischerweise in einer Standard-Ultrazentrifuge durchgeführt. Siehe Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2. Ausg.), W. H. Freeman, und Cantor und Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, Teile 1- 3, W. H. Freeman & Co., San Francisco, von denen jedes hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Als Rohbestimmung wird eine Probe, die ein "lösliches" Polypeptid enthält, in einer Standard-Ultrazentrifuge mit voller Größe mit etwa 50000 U/min für etwa 10 Minuten geschleudert, und lösliche Moleküle bleiben im überstand. Ein lösliches Teilchen oder Polypeptid ist typischerweise weniger als etwa 30S, typischer weniger als etwa 15S, gewöhnlich weniger als etwa 10S, üblicher weniger als etwa 6S und in bevorzugten Ausführungsformen vorzugsweise weniger als etwa 4S und bevorzugter weniger als etwa 3S.
Diese Erfindung stellt Polypeptide und Proteine eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors mit einer Bindungsaktivität für einen Liganden des Rezeptors des von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors bereit. Die Rezeptoren der vorliegenden Erfindung umfassen PDGF- Rezeptor-Aminosäuresequenzen, wie z. B. jene, die in den Tabellen 6, 7, 8, 9 und 10 dargestellt sind. Es werden auch homologe Sequenzen, Allelvariationen, induzierte Mutanten, alternativ exprimierte Varianten und Proteine, die durch DNA codiert werden, die unter stark stringenten Bedingungen mit PDGF-Rezeptor codierenden Nucleinsäuren, welche von natürlich vorkommendem Material wiedergewonnen werden, hybridisieren, bereitgestellt.
Die Peptide des Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors der vorliegenden Erfindung weisen mindestens etwa 80% Homologie zu natürlich vorkommenden Domänen von hPDGF-Rezeptorsequenzen in den Domänen D1, D2, D3, D4 und D5, typischerweise mindestens etwa 85% Homologie zu einer natürlichen Form einer Rezeptorsequenz, typischer mindestens etwa 90% Homologie, gewöhnlich mindestens etwa 95% Homologie und üblicher mindestens etwa 97% Homologie auf.
Die Homologie für Polypeptide wird typischerweise unter Verwendung einer Sequenzanalyse-Software gemessen, siehe beispielsweise das Sequenzanalyse-Softwarepaket der Genetics Computer Group, Universität von Wisconsin, Biotechnologie-Center 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. Die Proteinanalyse-Software vergleicht ähnliche Sequenzen unter Verwendung eines Homologiemaßes, das zu verschiedenen Substitutionen, Deletionen, Substitutionen und anderen Modifikationen gehört. Ähnliche oder homologe Substitutionen für LBR-Segmente werden in bekannten Sequenzen durchgeführt, wodurch neue Bindungsmoleküle mit modifizierter Affinität oder Spezifität für die Ligandenbindung hergestellt werden.
Verschiedene andere Softwareanalyseprogramme können die Konformationsstruktur eines Polypeptids analysieren. Eine Homologe Konformation kann auch durch geeignete Insertion, Deletion, Substitution oder Modifikation von Aminosäuresequenzen erreicht werden. Da die Konformationsstruktur der Domänen und β-Strang-Segmente nur teilweise klar ist, umfaßt die vorliegende Erfindung auch verschiedene Modifikationen an den offenbarten Sequenzen, die diese Strukturmerkmale beibehalten.
Insbesondere wird angenommen, daß sich die Ligandenbindungsfunktion in der extrazellulären Domäne, insbesondere den LBR's, befindet, und die löslichen Formen behalten vorzugsweise diese spezielle Funktion bei. Lösliche Fragmente von PDGF-Rezeptoren sind nützlich bei der Substitution gegen oder zur Störung, beispielsweise Blockierung, durch Konkurrieren um die PDGF-Bindung, die bzw. der Funktionen des natürlichen Rezeptors sowohl in vitro als auch in vivo. Alternativ können lösliche Formen die Dimerisierung von PDGF-Rezeptorpolypeptiden stören, da die Proteine normalerweise in einer Dimerform vorliegen oder in dieser wirken können. Die Rezeptordimerisierung kann für eine zweckmäßige physiologische Signaltransduktion wesentlich sein, und die Einführung von Fragmenten kann zur Unterbrechung dieser Vorgänge durch Blockieren ihrer Dimerisierung wirken.
PDGF-Rezeptorpolypeptide können unter Verwendung von Verfahren der klassischen Proteinchemie gereinigt werden, siehe beispielsweise Deutscher (Hrsg.) (1990) Guide to Purification; Methods in Enzymology, Band 182, welches hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Alternativ kann ein Lectin-Affinitätschromatographie- Schritt oder ein Verfahren einer stark spezifischen Ligandenaffinitätschromatographie, beispielsweise eines, das einen durch Cysteinreste des Proteinmitogens zu Biotin konjugierten PDGF verwendet, verwendet werden. Gereinigte PDGF-Rezeptorpolypeptide können auch durch ein Verfahren erhalten werden, wie z. B. PDGF-Affinitätschromatographie unter Verwendung von aktivierter CH-Sepharose, gekoppelt mit PDGF durch primäre Aminogruppen, wie in Imamura et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155: 583-590 beschrieben.
In Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern können spezifische PDGF-Rezeptorpeptid- Konstrukte auch unter Verwendung einer Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden. Wie nachstehend beschrieben präparierte Antikörper können an einer inerten Substanz immobilisiert werden, um eine stark spezifische Immunoaffinitätssäule zu erzeugen. Siehe beispielsweise Harlow und Lane (1990) Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, welches hiermit durch den Hinweis hierin auf genommen wird.
Verschiedene Zellen oder Gewebe können als Ausgangsmaterialien ausgewählt werden, wobei sie gewöhnlich auf der Basis einer ergiebigen Expression des gewünschten Rezeptorkonstrukts oder Polypeptids ausgewählt werden. Starke Expressionspromotorsequenzen können steuerbar mit einer rekombinanten Sequenz, vorzugsweise einem induzierbaren Promotor, verbunden werden. Der Promotor ist steuerbar verbunden, wenn er als Startstelle für die Transkription der Sequenz wirkt. Geeignete Zellen, die relativ große Mengen des Rezeptorproteins enthalten, wie durch die Bindung des PDGF mit hoher Affinität bestimmt, können mit Varianten der PDGF-Rezeptorpolypeptide transformiert werden. Diese können verwendet werden, um die natürliche Form des PDGF-Rezeptors gegen ein Konstrukt mit einer Deletion oder Insertion auszutauschen.
Die Ligandenbindungsbereiche (LBR's) oder anderen Segmente können zwischen verschiedenen neuen Fusionskonstrukten oder -fragmenten "vertauscht" werden. Somit können neue chimäre Polypeptide, die neue Kombinationen von Segmenten aufweisen, aus der strukturellen Verbindung von verschiedenen funktionellen Domänen entstehen. Ligandenbindungsbereiche, die gewünschte oder modifizierte Spezifitäten verleihen, können mit anderen Domänen kombiniert werden, die eine andere Funktion besitzen, beispielsweise könnte jede Ig-artige Domäne gegen eine ähnliche Domäne von anderen verwandten Polypeptiden substituiert werden, oder LBR's zwischen verschiedenen Allelen oder ähnlichen Rezeptoren können kombiniert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Fusionspolypeptide zwischen den Rezeptorpolypeptiddomänen und anderen homologen oder heterologen Proteinen bereit. Homologe Proteine können Fusionen zwischen ähnlichen, aber verschiedenen Wachstumsfaktorrezeptoren sein, die zu beispielsweise einem Hybridprotein, das eine Ligandenspezifität von einem Rezeptor mit einer intrazellulären Domäne eines anderen aufweist, oder einem Rezeptor, der eine veränderte Affinität oder eine erweiterte oder eingeschränkte Bindungsspezifität aufweisen kann, führen. Ebenso können heterologe Fusionen konstruiert werden, die eine Kombination von Eigenschaften oder Aktivitäten der Derivatproteine aufweisen. Typische Beispiele sind Fusionen eines Reporterpolypeptids, beispielsweise Luciferase, mit einer Domäne eines Rezeptors, beispielsweise einer Ligandenbindungsdomäne aus dem extrazellulären Bereich eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors, so daß die Anwesenheit oder Stelle eines gewünschten Liganden leicht bestimmt werden kann. Siehe beispielsweise Dull et al., US-Patent Nr. 4 859 609, welches hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Andere Genfusionspartner schließen bakterielle β-Galactosidase, trpE, Protein A, β-Lactamase, α-Amylase, Alkoholdehydrogenase und Hefe-α-Paarungsfaktor ein. Siehe beispielsweise Godowski et al., (1988) Science 241: 812- 816. Zusätzliche Sequenzen mit verschiedenen definierten Funktionen sind durch Durchsuchen der Sequenz-Datenbank GenBankTM (National Institutes of Health) zu finden. Ein heterologes Fusionsprotein ist eines, das Sequenzen enthält, die in Verbindung miteinander nicht natürlich zu finden sind. Somit kann ein heterologes Fusionsprotein eine Fusion von zwei ähnlichen und homologen Sequenzen sein.
Fusionsproteine würden typischerweise durch entweder Verfahren mit rekombinanten Nucleinsäuren mit Expression oder durch Verfahren mit synthetischen Polypeptiden hergestellt werden. Verfahren für die Nucleinsäuremanipulation sind im allgemeinen beispielsweise in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg.), Bände 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben, welches hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Verfahren zur Synthese von Polypeptiden sind beispielsweise in Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2456; Atherton et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; und Merrifield (1986) Science 232: 341-347; beschrieben, von denen jedes hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
Die rekombinanten Nucleinsäuresequenzen, die zur Herstellung von Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können aus natürlichen oder synthetischen Sequenzen abgeleitet werden. Viele natürliche Gensequenzen sind aus verschiedener cDNA oder aus genomischen Bibliotheken unter Verwendung von geeigneten Proben erhältlich, siehe beispielsweise GenBankTM, National Institutes of Health.
Typische Proben zur Isolation von Genen eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors können aus den Sequenzen der Tabellen 1 und 2 gemäß Standardverfahren ausgewählt werden. Geeignete synthetische DNA-Fragmente können beispielsweise durch das von Beaucage und Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862 beschriebene Phosphoramidit-Verfahren hergestellt werden. Ein Doppelstrangfragment kann dann durch entweder Synthetisieren des komplementären Strangs und Hybridisieren der Stränge zusammen unter geeigneten Bedingungen oder durch Hinzufügen des komplementären Strangs unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz erhalten werden.

III. Nucleinsäuren

Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuresequenzen bereit, die verschiedene vorstehend beschriebene PDGF- Rezeptorsequenzen codieren. Die Tabellen 1 und 2 legen jeweils die entsprechenden cDNA-Sequenzen dar, die menschliche PDGF-Rezeptorpolypeptide vom Typ B und Typ A codieren.
Eine wesentliche Homologie in dem Nucleinsäurezusammenhang bedeutet entweder, daß die Segmente oder ihre komplementären Stränge beim Vergleich dieselben sind, wenn sie zweckmäßig vergleichend angeordnet sind, mit entsprechenden Nucleotid-Insertionen oder -Deletionen, in mindestens etwa 60% der Reste, typischerweise mindestens etwa 70%, typischer mindestens etwa 80%, gewöhnlich mindestens etwa 90% und üblicher mindestens etwa 95 bis 98% der Nucleotide. Geeignete Nucleotid-Insertionen oder -Deletionen schließen Sequenzen zwischen den Domänen oder jene außerhalb der Cysteine innerhalb einer Domäne ein, aber die Beibehaltung der Sequenzen innerhalb der gepaarten Cysteine (oder ihrer Äquivalente in den Domänen D4) ist häufig sehr wichtig. Eine strukturelle Homologie existiert, wenn mindestens etwa 55% Homologie über einen Abschnitt von mindestens etwa 14 Nucleotiden, typischerweise mindestens etwa 65%, typischer mindestens etwa 75%, gewöhnlich mindestens etwa 90% und üblicher mindestens etwa 95% oder mehr vorhanden ist.
Alternativ existiert eine wesentliche Homologie, wenn die Segmente unter selektiven Hybridisierungsbedingungen zu einem Strang oder seinem Komplement, typischerweise unter Verwendung einer Sequenz aus mindestens etwa 20 benachbarten Nucleotiden, die aus Tabelle 1 oder 2 abgeleitet sind, hybridisieren. Größere Segmente wären jedoch gewöhnlich bevorzugt, beispielsweise mindestens etwa 30 benachbarte Nucleotide, üblicher mindestens etwa 40 und vorzugsweise mehr als etwa 50. Eine Selektivität der Hybridisierung existiert, wenn eine Hybridisierung auftritt, die selektiver ist als ein vollständiger Mangel an Spezifität. Siehe Kanehisa (1984) Nucleic Acids Res. 12: 203-213, welches durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
Stringente Hybridisierungsbedingungen beinhalten normalerweise Salzkonzentrationen von weniger als etwa 1 M, typischerweise weniger als etwa 700 mM, typischerweise weniger als etwa 500 mM, gewöhnlich weniger als etwa 400 mM, üblicher weniger als etwa 300 mM und vorzugsweise weniger als etwa 200 mM. Die Temperaturbedingungen sind typischerweise höher als etwa 20ºC, typischer höher als etwa 25ºC, gewöhnlich höher als etwa 30ºC, üblicher höher als etwa 37ºC und vorzugsweise oberhalb von etwa 40ºC, in Abhängigkeit von der speziellen Anwendung. Da andere Faktoren die Stringenz der Hybridisierung signifikant beeinflussen können, einschließlich unter anderem der Basenzusammensetzung und Größe der komplementären Stränge, der Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln und des Ausmaßes einer Basenfehlpaarung, ist die Kombination der Parameter wichtiger als das absolute Maß von irgendeinem.
Proben können auf der Basis der Sequenz der den PDGF- Rezeptor codierenden Sequenzen, die in den Tabellen 1 und 2 bereitgestellt sind, hergestellt werden. Die Proben können zur Isolierung von anderen PDGF-Rezeptor- Nucleinsäuresequenzen durch Standardverfahren verwendet werden. Siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Bände 1-3, CSH Press, N. Y., welches hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Andere ähnliche Nucleinsäuren können unter Verwendung von homologen Nucleinsäuren ausgewählt werden. Alternativ können Nucleinsäuren, die eben diese oder ähnliche Rezeptorpolypeptide codieren, synthetisiert oder ausgewählt werden, indem man von der Redundanz in dem genetischen Code Gebrauch macht. Verschiedene Codonsubstitutionen können eingeführt werden, beispielsweise stille Änderungen, wodurch verschiedene zweckmäßige Restriktionsstellen bereitgestellt werden, oder um die Expression für ein spezielles System zu optimieren, beispielsweise um an die optimale Codonverwendung anzupassen. Mutationen können eingeführt werden, um die Eigenschaften der Rezeptoren zu modifizieren, vielleicht um die Ligandenbindungsaffinitäten, die Affinitäten zwischen den Ketten oder den Polypeptidabbau oder die Umsatzrate zu ändern.
Die DNA-Zusammensetzungen dieser Erfindung können aus genomischer DNA oder cDNA abgeleitet werden, durch Synthese hergestellt werden oder können ein Hybrid der verschiedenen Kombinationen sein. Rekombinante Nucleinsäuren mit Sequenzen, die ansonsten in der Folge nicht natürlich vorkommen, werden von dieser Erfindung ebenfalls bereitgestellt. Eine isolierte DNA-Sequenz umfaßt irgendeine Sequenz, die durch Primer- oder Hybridisierungsreaktionen erhalten wurde oder einer Behandlung mit Restriktionsenzymen oder dergleichen unterzogen wurde.
Synthetische Oligonucleotide können durch das Triesterverfahren gemäß Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 oder durch andere Verfahren wie z. B. kommerzielle automatisierte Oligonucleotid- Synthesevorrichtungen formuliert werden. Oligonucleotide können durch überschüssige Polynucleotidkinase gekennzeichnet werden (z. B. werden etwa 10 Einheiten zu 0,1 Nanomol Substrat in Verbindung mit 50 mM Tris, pH 7,6, 5 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl&sub2;, 1-2 mM ATP, 1,7 pMol ³²P-ATP (2,9 mCi/mMol) 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA verwendet). Proben können ebenfalls durch Nick-Translation, Klenow- Auffüllreaktion oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Siehe beispielsweise Sambrook et al.
cDNA oder genomische Bibliotheken von verschiedenen Arten können nach neuen Allelen oder verwandten Sequenzen selektiert werden. Die Wahl der cDNA-Bibliotheken entspricht normalerweise einer Gewebequelle, die reich an mRNA für die gewünschten Rezeptoren ist. Phagenbibliotheken sind normalerweise bevorzugt, aber Plasmidbibliotheken können ebenfalls verwendet werden. Klone von einer Bibliothek werden auf Platten verteilt, auf ein Substrat zum Selektieren überführt, denaturiert und auf die Anwesenheit von gewünschte Sequenzen geprüft.
Bei einem Plaque-Hybridisierungsverfahren wird beispielsweise jede Platte, die Bacteriophagenplaques enthält, auf Nitrocellulose-Vervielfältigungsfilterpapiere (Millipore-HATF) repliziert. Die Phagen-DNA wird mit einem Puffer, wie z. B. 500 mM NaOH, 1,5 M NaCl für etwa 1 Minute denaturiert und mit beispielsweise 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, 1,5 M NaCl (3mal für jeweils 10 Minuten) neutralisiert. Die Filter werden dann gewaschen. Nach dem Trocknen werden die Filter typischerweise durch Wärme getrocknet, beispielsweise für 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen. Die Vervielfältigungsfilter werden bei 42ºC für 4-24 Stunden mit 10 ml pro Filter von DNA-Hybridisierungspuffer (20-50% Formamid, 5X SSC, pH 7,0, 5X Denhardt's Lösung (Polyvinylpyrrolidon, plus Ficoll und Rinderserumalbumin; jeweils 1X = 0,02%), 50 mM Natriumphosphat-Puffer mit pH 7,0, 0,2% SDS und 50 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA) vorhybridisiert: Die Hybridisierung mit einer geeigneten Probe kann bei 42ºC für 16 h mit 10 ml/Filter 1 · 10&sup6; cpm/ml DNA-Hybridisierungspuffer, der eine radioaktiv markierte Probe enthält, durchgeführt werden. Die Endkonzentration an Formamid wird gemäß der Länge der Probe und dem gewünschten Grad an Stringenz verändert. Siehe beispielsweise Wetmur und Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370; und M. Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203- 213, von denen jedes durch den Hinweis hierin aufgenommen wird, für eine Erörterung von Hybridisierungsbedingungen und Sequenzhomologie.
Eine Oligonucleotidprobe auf der Basis der offenbarten Aminosäuresequenzen kann verwendet werden, um rekombinante Fusions- oder Deletionskonstrukte ortsspezifisch zu mutieren oder zu erzeugen. Siehe beispielsweise Tabellen 11 und 12 für bevorzugte Oligonucleotidreagenzien. Verfahren wie z. B. jene, die von Kimbel et al. (1987) Methods in Enzymology 154: 367 beschrieben wurden, können verwendet werden. Die Sequenzen PΔ1 bis PΔ9 entsprechen jeweils Seq. ID Nr. 6 bis 14, und die Sequenzen PΔ101 bis PΔ109 entsprechen jeweils Seq. ID Nr. 15 bis 23. TABELLE 11 MUTAGENESEOLIGOMERE FÜR DEN MENSCHLICHEN PDGF-R VOM TYP B TABELLE 12 VORGESCHLAGENE MUTAGENESEOLIGOMERE FÜR DEN MENSCHLICHEN PDGF-R VOM TYP A
Gemäß dieser Erfindung kann irgendeine isolierte DNA- Sequenz, die eine vollständige PDGF-R-Struktursequenz im wesentlichen codiert, als Probe verwendet werden. Alternativ kann irgendeine DNA-Sequenz, die eine hydrophobe PDGF-R-Signalsequenz und ihre Translationsstartstelle codiert, verwendet werden. Eine isolierte DNA-Teilsequenz, die im wesentlichen intakte Domänen codiert, welche eine PDGF-R-Aktivität (z. B. Liganden- oder PDGF-R-Bindung) aufweisen, ist ebenfalls ein Teil dieser Erfindung. Bevorzugte Proben sind cDNA-Klone von PDGF- Rezeptorpolypeptiden.
Die in dieser Erfindung verwendeten DNA-Sequenzen umfassen gewöhnlich Strukturen von intakten Domänen, typischerweise mindestens etwa 5 Codons (15 Nucleotide), typischer mindestens etwa 9 Codons, gewöhnlich mindestens etwa 13 Codons, üblicher mindestens etwa 18 Codons, vorzugsweise mindestens etwa 25 Codons und bevorzugter mindestens etwa 35 Codons. Ein oder mehrere Introns können ebenfalls vorliegen. Diese Anzahl an Nucleotiden ist gewöhnlich etwa die minimale Länge, die für eine erfolgreiche Probe erforderlich ist, die spezifisch mit einer PDGF- Rezeptorsequenz hybridisieren würde. Epitope, die für einen PDGF-R charakteristisch sind, können beispielsweise in kurzen Peptiden codiert werden. Gewöhnlich wird die Wildtyp-Sequenz verwendet, in einigen Fällen können eine oder mehrere Mutationen, wie z. B. Deletionen, Substitutionen, Insertionen oder Inversionen, eingeführt werden. Diese Modifikationen können zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz führen, stille Mutationen bereitstellen, eine Restriktionsstelle modifizieren oder spezifische Mutationen bereitstellen. Die genomische Sequenz übersteigt gewöhnlich etwa 200 kb nicht, übersteigt üblicher etwa 100 kb nicht, vorzugsweise ist sie nicht größer als etwa 0,5 kb.
Teile der DNA-Sequenz mit mindestens etwa 10 Nucleotiden aus einer DNA-Sequenz, die ein PDGF-Rezeptorpeptid codiert, wird typischerweise verwendet, typischer mindestens etwa 15 Nucleotide, gewöhnlich mindestens etwa 20 Nucleotide, üblicher mindestens etwa 25 Nucleotide und vorzugsweise mindestens etwa 30 Nucleotide. Die Proben sind typischerweise kürzer als etwa 6 kb, gewöhnlich kürzer als etwa 3,0 kb und vorzugsweise kürzer als etwa 1 kb. Die Proben können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob mRNA, die einen spezifischen PDGF-R codiert, in einer Zelle oder anderen Geweben vorliegt.
Die natürlichen oder synthetischen DNA-Fragmente, die ein gewünschtes Fragment eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors codieren, werden gewöhnlich in DNA-Konstrukte eingebaut, die zur Einführung in eine und zur Expression in einer in vitro Zellkultur in der Lage sind. Häufig sind die DNA-Konstrukte für eine Replikation in einem einzelligen Wirt, wie z. B. Hefe oder Bakterien, geeignet, können aber auch zur Einführung, mit und ohne Integration innerhalb des Genoms, in kultivierte Säuger- oder Pflanzen- oder andere eukaryotische Zellinien vorgesehen sein. Menschliche Zellen können bevorzugte Wirte sein. Höhere eukaryotische Wirtszellen sind häufig bevorzugt, da ihre Glycosylierungs- und Proteinreifungsmuster mit höherer Wahrscheinlichkeit der menschlichen Reifung ähneln. DNA-Konstrukte, die zur Einführung in Bakterien oder Hefe hergestellt sind, umfassen typischerweise ein Replikationssystem, das vom Wirt erkannt wird, wobei das vorgesehene DNA-Fragment das gewünschte Rezeptorpolypeptidkonstrukt codiert, wobei Transkriptions- und Translationsstartregulationssequenzen steuerbar mit dem das Polypeptid codierenden Segment verbunden werden und Transkriptions- und Translationsendregulationssequenzen steuerbar mit dem das Polypeptid codierenden Segment verbunden werden. Die Transkriptionsregulationssequenzen umfassen typischerweise einen heterologen Verstärker oder Promotor, der vom Wirt erkannt wird. Die Auswahl eines geeigneten Promotors hängt vom Wirt ab, aber Promotoren wie z. B. trp, lac und Phagenpromotoren, tRNA-Promotoren und Glycolyseenzympromotoren sind bekannt und erhältlich. Siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989). Günstig erhältliche Expressionsvektoren, die das Replikationssystem und Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen zusammen mit der Insertionsstelle für die DNA-Sequenz des Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors enthalten, können verwendet werden. Beispiele von verarbeitbaren Kombinationen von Zellinien und Expressionsvektoren sind beispielsweise in Sambrook et al. (1989) beschrieben; siehe auch Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36.
Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen enthalten, wie z. B. einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor, einen Verstärker und notwendige Reifungsinformationsstellen, z. B. Ribosombindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminierungssequenzen. Vorzugsweise sind die Verstärker oder Promotoren diejenigen, die natürlicherweise mit den Genen assoziiert sind, welche die PDGF- Rezeptorpolypeptide codieren, obwohl es selbstverständlich ist, daß in vielen Fällen andere gleich oder besser geeignet sind. Andere bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind Verstärker oder Promotoren, die von Viren abgeleitet sind, wie z. B. SV40, Adenovirus, Rinder-Papillomavirus und dergleichen.
Ebenso sind bevorzugte Promotoren jene, die natürlicherweise in Immunoglobulin erzeugenden Zellen zu finden sind, siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 663 281, welches durch den Hinweis hierin aufgenommen wird, aber SV40, Polyomavirus, Zytomegalie-Virus (menschlich oder von der Maus bzw. Ratte) und der LTR von verschiedenen Retroviren, beispielsweise Mäuse- bzw. Rattenleukämievirus, Mäuse- bzw. Ratten- oder Rous-Sarkomvirus und HIV, können verwendet werden, ebenso wie Promotoren, die zu PDGF-R- Genen endogen sind. Siehe Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, (1983) Cold Spring Harbor Press, N. Y., welches durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
Die Vektoren, die die interessierenden DNA-Segmente enthalten, beispielsweise ein PDGF-Rezeptorpolypeptidgen oder eine cDNA-Sequenz, können in die Wirtszelle durch gut bekannte Verfahren transferiert werden, welche in Abhängigkeit von der Art des zellulären Wirts variieren. Die Kalziumchlorid-Transfektion wird beispielsweise allgemein für prokaryotische Zellen verwendet, wohingegen eine Kalziumphosphatbehandlung für andere zelluläre Wirte verwendet werden kann. Siehe im allgemeinen Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg.) CSH Press, welches durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Der Begriff "transformierte Zelle" soll auch die Abkömmlinge einer transformierten Zelle einschließen.
Wie bei den gereinigten Polypeptiden sind die mit dem Ligandenbindungssegment, der extrazellulären Domäne und der intrazellulären Domäne assoziierten Nucleinsäuresegmente besonders nützlich. Diese Gensegmente werden als Proben zum Selektieren von neuen Genen verwendet, welche ähnliche biologische Aktivitäten aufweisen, obwohl die Kontrollelemente dieser Gene auch von Bedeutung sein können.

IV. Verfahren zur Herstellung von PDGF-Rezeptorpolypeptid- Konstrukten

DNA-Sequenzen können auch verwendet werden, um PDGF-R- Polypeptide zu exprimieren. Beispielsweise kann eine DNA- Sequenz aus etwa 21 Nucleotiden (die etwa 7 Aminosäuren codieren) bis etwa 2,1 kb (etwa 700 Aminosäuren) verwendet werden, um ein Polypeptid mit einer spezifischen PDGF- Rezeptor-Aktivität, typischerweise einer Ligandenbindung, zu exprimieren. Insbesondere sind Konstrukte, die die Ligandenbindungsbereiche beibehalten, nützlich, da diese Konstrukte eine Bindungsaktivität besitzen.
Insbesondere können verschiedene synthetische Linker und Proben konstruiert werden, um die Gentechnik der PDGF-R- Nucleinsäuresequenzen zu erleichtern. Verfahren einer Polymerasekettenreaktion (PCR) können zur Herstellung von großen Mengen von Fragmenten oder Segmenten, die bei der zweckmäßigen Manipulation der Sequenzen, die die Konstrukte codieren, nützlich sind, angewendet werden. Siehe beispielsweise Innis et al. (1990) PCR Protocols, Academic Press. Alternativ können Nucleinsäuresynthetisatoren ausreichend große Mengen von Fragmenten zur Hybridisierung zu irgendeiner vorgewählten Sequenz, beispielsweise aus Tabelle 1 oder 2, oder zur Manipulation der Sequenz, um spezifische Domänen oder Segmente hinzuzufügen oder zu deletieren, erzeugen. Besonders wichtige Segmente sind die LBR's.
Große Mengen der Rezeptorproteine können durch Expression des gesamten Rezeptors oder von Teilen des Rezeptors, die in den Expressionsvehikeln in verträglichen Wirten, wie z. B. E, coli, Hefe, Säugerzellen, Insektenzellen oder Froscheizellen, enthalten sind, hergestellt werden. Die Expressionsvehikel können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren, wie z. B. Kalziumphosphatausfällung (nachstehend erörtert), Lipofectin-Elektroporation oder DEAE-Dextrantransformation, in die Zellen eingeführt werden.
Gewöhnlich sind die Säugerzellenwirte immortalisierte Zellinien. Zur Untersuchung der Eigenschaften eines PDGF-R und seines entsprechenden Liganden ist es nützlich, Säugerzellen, die geringe Mengen eines PDGF-Rezeptors aufweisen oder denen dieser fehlt, zu transfizieren oder zu transformieren. Vorzugsweise kann eine Signalsequenz zur Sekretion dienen und dazu dienen, das Peptid zu der Zellmembran zu leiten. Zellen, denen signifikante Mengen an PDGF-Rezeptoren fehlen, umfassen Eizellen vom Chinesischen Hamster (CHO), die meisten Epithelzellinien und verschiedene menschliche Tumorzellinien.
Transformierte oder transfizierte Zellen können ausgewählt werden, die eine DNA-Sequenz beinhalten, welche einen Rezeptor codiert, der zu einem Wildtyp-Rezeptor funktionell äquivalent ist, wodurch eine PDGF-empfindliche mitogene Reaktion verliehen wird. Solche Zellen ermöglichen die Analyse der Bindungseigenschaften von verschiedenen hinzugefügten PDGF-Rezeptorpolypeptiden. Transfizierte Zellen können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Zusammensetzung oder eines Arzneimittels als PDGF- Antagonist oder -Agonist zu bewerten. Der Grad der Rezeptor-Tyrosinkinaseaktivität oder die Geschwindigkeit der Nucleinsäuresynthese kann durch in Kontakt bringen von transfizierten Zellen mit Arzneimitteln oder Liganden und Vergleichen der Wirkungen von verschiedenen Ligandenanalogen gegen die Kontrollen bestimmt werden. Obwohl die üblichsten Prokaryotzellen, die als Wirte verwendet werden, Stämme von E. coli sind, können auch andere Prokaryoten, wie z. B. Bacillus subtilis oder Pseudomonas, verwendet werden. Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, einschließlich Fragmenten oder Teilen der Sequenz, die Rezeptorpolypeptide mit intakten strukturellen Domänen codiert, eines Teils des Rezeptors oder eines Polypeptids mit einer PDGF-R-Aktivität, können verwendet werden, um ein Expressionsvehikel oder -konstrukt für ein PDGF-R-Polypeptid oder ein Polypeptid mit einer PDGF-R-Aktivität herzustellen. Gewöhnlich ist die Kontrollsequenz ein eukaryotischer Promotor für die Expression in einer Säugerzelle. In einigen Vehikeln können auch die eigenen Kontrollsequenzen des Rezeptors verwendet werden. Ein üblicher prokaryotischer Plasmidvektor zur Transformation von E. coli ist pBR322 oder seine Derivate, beispielsweise das Plasmid pkt279 (Clontech), siehe Bolavar et al. (1977) Gene, 2: 95. Die prokaryotischen Vektoren können auch prokaryotische Promotoren für die Transkriptionsauslösung, gegebenenfalls mit einem Operator, enthalten. Beispiele von am häufigsten verwendeten prokaryotischen Promotoren umfassen Beta-Lactamase (Penicillinase); Lactose- (lac) Promotor, siehe Cheng et al. (1977) Nature, 198: 1056; Tryptophanpromotor (trp), siehe Goeddell et al. (1980) Nucleic Acid Res., 8: 457; PL- Promotor; und die N-Gen-Ribosom-Bindungsstelle, siehe Shimatake et al. (1981) Nature, 292: 128-; von denen jedes hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
In Verbindung mit Hefe verwendete Promotoren können Promotoren sein, die von dem Enolasegen abstammen, siehe Holland et al. (1981) J. Biol. Chem., 256: 1385; oder der Promotor für die Synthese von Glycolyseenzymen, wie z. B. 3- Phosphoglyceratkinase, siehe Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem., 255:.
Geeignete nicht native Säugerpromotoren umfassen die frühen und späten Promotoren von SV40, siehe Fiers et al. (1978) Nature, 273: 113; oder Promotoren, die vom Mäuse- bzw. Ratten-Muloney-Leukämievirus, vom Mäuse-Brusttumorvirus, von Vogel-Sarkomviren, vom Adenovirus II, vom Rinder- Papillomavirus oder Polyoma abgeleitet sind. Außerdem kann das Konstrukt mit einem amplifizierbaren Gen, z. B. Dihydrofolatreductase (DHFR), verbunden werden, so daß mehrere Kopien des PDGF-Rezeptorgens hergestellt werden können. Siehe beispielsweise Kaufman et al. (1985) Mol. and Cell. Biol. 5: 1750-1759; und Levinson et al. EPO- Veröffentlichung Nrn. 0117059 und 0117060, von denen jedes durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.
Prokaryoten können durch verschiedene Verfahren transformiert werden, einschließlich unter Verwendung von CaCl&sub2;, siehe Cohen (1972) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 69: 2110; oder des RbCl-Verfahrens, siehe Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Hefe kann beispielsweise unter Verwendung eines Verfahrens, das von Van Solingen et al. (1977) J. Bacteriol. 130: 946; oder Hsiao et al. (1979) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 76: 3829 beschrieben wurde, transformiert werden. Bezüglich Eukaryoten können Säugerzellen unter Verwendung eines Kalziumphosphat-Ausfällungsverfahrens, siehe z. B. Graham und Van der Eb (1978) Virology, 52: 546; oder durch Lipofektin (BRL) oder retrovirale Infektion, siehe beispielsweise Gilboa (1983) Experimental Manipulation of Gene Expression, Kap. 9, Academic Press P. 175, transfiziert werden. Die tatsächlichen Expressionsvektoren, die geeignete Sequenzen enthalten, können gemäß Standardverfahren, die Ligations- und Restriktionsenzyme beinhalten, hergestellt werden. Siehe beispielsweise Maniatis supra. Kommerziell erhältliche Restriktionsenzyme zum Aufspalten von spezifischen Stellen der DNA können von New England BioLabs, Beverly, Massachusetts, erhalten werden.
Spezielle Cotransformationen mit anderen Genen können besonders nützlich sein. Es kann beispielsweise erwünscht sein, die Nucleinsäure mit einem anderen Reifungsenzym zu koexprimieren. Solche Enzyme schließen Signalpeptidase, Tertiärkonformation verleihende Enzyme oder Glycosylierungsenzyme ein. Dieses Expressionsverfahren kann Reifungsfunktionen bereitstellen, die ansonsten im Expressionswirt fehlen könnten, beispielsweise säugerartige Glycosylierung in einem Prokaryotexpressionssystem. Alternativ kann die zur Expression ausgewählte Wirtszelle auf der Basis der natürlichen Expression dieser Reifungsenzyme ausgewählt werden.
Zellklone werden unter Verwendung von Markern in Abhängigkeit von der Art der Vektorkonstruktion ausgewählt. Der Marker kann auf demselben oder einem anderen DNA- Molekül, vorzugsweise demselben DNA-Molekül, sein. Bei Säugerzellen kann das Rezeptorgen selbst der beste Marker sein. In prokaryotischen Wirten kann die Transformante durch Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin oder andere Antibiotika ausgewählt werden. Die Herstellung eines speziellen Produkts auf der Basis der Temperaturempfindlichkeit oder Kompensation kann als geeignete Marker dienen. Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um das PDGF-R-Rezeptorprotein oder Peptidfragment zu ernten und zu reinigen. Das Peptid kann aus einem Lysat des Wirts isoliert werden. Das Peptid kann aus dem Zellüberstand isoliert werden, wenn das Peptid sezerniert ist. Das PDGF-R-Peptid wird dann wie vorstehend erörtert unter Verwendung von HPLC, Elektrophorese oder Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffinität oder Ligandenaffinität, weiter gereinigt.
Ein weiteres Verfahren, das verwendet werden kann, um cDNA- Klone von PDGF-R-verwandten Spezies zu isolieren, beinhaltet die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR). Siehe beispielsweise Saiki et al. (1985) Science 230: 1350. Bei dieser Vorgehensweise werden zwei Oligonucleotide, die verschiedenen Bereichen der PDGF-R- Sequenz entsprechen, synthetisiert und dann bei der PCR- Reaktion verwendet, typischerweise um Rezeptor-verwandte mRNA-Transkripte von einer mRNA-Quelle zu amplifizieren. Das Anlagern der Oligonucleotide und die PCR-Reaktionen werden unter Bedingungen von verminderter Stringenz durchgeführt. Die resultierenden amplifizierten Fragmente werden subkloniert und die resultierenden rekombinanten Kolonien werden mit ³²P-markierter PDGF-R-cDNA mit voller Länge geprüft. Klone, die unter niedrigen, aber nicht hohen Stringenzbedingungen hybridisieren, stellen PDGF-R- verwandte mRNA-Transkripte dar. Diese Vorgehensweise kann auch verwendet werden, um PDGF-R-cDNA-Variantenspezies zu isolieren, die infolge eines alternativen Spleißens entstehen, siehe Frohman et al. (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85: 8998.

V. Antikörper

Polyklonale und/oder monoklonale Antikörper für die verschiedenen PDGF-Rezeptorkonstrukte, Rezeptorpeptide und Peptidfragmente können ebenfalls hergestellt werden. Peptidfragmente können synthetisch in einem Peptidsynthetisator hergestellt und mit einem Trägermolekül (d. h. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin) gekoppelt und über mehrere Monate in Kaninchen injiziert werden. Die Kaninchensera werden auf Immunreaktivität auf das PDGF- Rezeptorprotein oder -fragment getestet. Monoklonale Antikörper können hergestellt werden, indem Mäusen PDGF-R- Protein, PDGF-R-Polypeptide oder Mäusezellen, die hohe Level des geklonten PDGF-Rezeptors auf ihrer Zellenoberfläche exprimieren, injiziert werden. Monoklonale Antikörper werden durch ELISA selektiert und auf spezifische Immunreaktivität mit dem PDGF-Rezeptorprotein oder Polypeptiden davon getestet. Siehe Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSHarbor Press, welches hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Diese Antikörper sind in Tests sowie Arzneimitteln nützlich.
Wenn einmal eine ausreichende Menge des gewünschten PDGF- Rezeptorpolypeptid-Konstrukts erhalten wurde, kann das Protein für verschiedene Zwecke verwendet werden. Eine typische Anwendung ist die Herstellung von Antikörpern, die für die Bindung an Epitope, die für diese Rezeptoren charakteristisch sind, spezifisch sind. Diese Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein und können durch in vitro oder in vivo Verfahren hergestellt werden.
Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern wird ein geeignetes Zielimmunsystem ausgewählt, typischerweise eine Maus oder ein Kaninchen. Das im wesentlichen gereinigte Antigen wird dem Immunsystem in einer Weise präsentiert, die durch Verfahren bestimmt ist, welche für das Tier und andere Parameter, die Immunologen gut bekannt sind, geeignet sind. Typische Stellen zur Injektion befinden sich in den Fußsohlen, intramuskulär, intraperitoneal oder intradermal. Eine andere Spezies kann natürlich gegen eine Maus oder ein Kaninchen ausgetauscht werden, typischerweise ein Säuger, aber möglicherweise ein Vogel oder ein anderes Tier.
Eine immunologische Reaktion wird gewöhnlich mit einem Immuntest geprüft. Normalerweise beinhalten solche Immuntests eine gewisse Reinigung einer Antigenquelle, die beispielsweise durch dieselben Zellen und in derselben Weise hergestellt wird wie das Antigen hergestellt wurde. Der Immuntest kann ein Radioimmuntest, ein enzymgekoppelter Test (ELISA), ein Fluoreszenztest oder irgendeine von vielen anderen Wahlmöglichkeiten sein, von denen die meisten funktional äquivalent sind, aber unter spezifischen Bedingungen spezielle Vorteile aufweisen können.
Monoklonale Antikörper mit Affinitäten von mindestens etwa 10&sup6; M&supmin;¹, vorzugsweise 10&sup8;, 10¹&sup0; oder mehr, werden durch Standardverfahren hergestellt, wie beispielsweise in Harlow und Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; oder Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ausg.), Academic Press, New York, beschrieben, welche hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen werden. Kurz gesagt, werden geeignete Tiere ausgewählt und dem gewünschten Immunisierungsprotokoll wird gefolgt. Nach dem geeigneten Zeitraum wird die Milz solcher Tiere herausgeschnitten und einzelne Milzzellen typischerweise mit immortalisierten Myelomzellen unter geeigneten Selektionsbedingungen fusioniert. Anschließend werden die Zellen klonal getrennt und die Überstände von jedem Klon werden auf ihre Produktion eines geeigneten Antikörpers hin, der für den gewünschten Bereich des Antigens spezifisch ist, getestet.
Andere geeignete Verfahren umfassen die in vitro Aussetzung von Lymphozyten den Antigenpolypeptiden oder alternativ der Auswahl von Bibliotheken von Antikörpern in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al. "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275-1281 (1989), welches hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper durch entweder covalentes oder nicht-covalentes Verbinden einer Substanz, die ein erfaßbares Signal bereitstellt, markiert. Eine breite Vielfalt von Markern und Konjugationsverfahren sind bekannt und von ihnen wurde ausführlich sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur berichtet. Geeignete Marker umfassen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzmittel, Chemilumineszenzmittel, magnetische Teilchen und dergleichen. Patente, die die Verwendung von solchen Markern lehren, umfassen US-Patent Nrn. 3 817 837; 3 850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 277 437; 4 275 149; und 4 366 241. Rekombinante Immunoglobuline können ebenfalls hergestellt werden, siehe Cabilly, US-Patent Nr. 4 816 567.
Antikörper von besonderem Interesse sind jene, die gegen die Ligandenbindungsbereiche hervorgebracht worden sind. Diese umfassen gewisse Antikörper, die als Liganden wirken. Oder Antikörper können verwendet werden, um Verbindungen auszuwählen, die als Liganden für modifizierte Rezeptoren dienen könnten. Siehe beispielsweise Meyer (1990) Nature 347: 424-425; und Pain et al. (1990) Nature 347: 444-447; von denen jedes hiermit durch den Hinweis hierin aufgenommen wird.

VIII. Verfahren zur Verwendung

Die vorliegende Erfindung stellt Reinigungsverfahren für Polypeptide eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (PDGF-R) sowie Verfahren zur Synthese von PDGF-Rezeptoren innerhalb von Zellen bereit. Ebenfalls bereitgestellt werden homogene Rezeptoren, die durch diese Verfahren hergestellt werden, Nucleinsäuresequenzen, die die Rezeptoren oder Teile der Rezeptoren codieren, sowie Expressionsvehikel, die diese Sequenzen enthalten, Zellen mit den PDGF-Rezeptoren und Antikörper für die Rezeptoren. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Testen der Bindung und anderer Aktivitäten von rezeptorartigen Proteinen mit umgeordneten Kombinationen der Domänen bereit.
Der extrazelluläre Bereich des menschlichen PDGF- Rezeptorproteins vom Typ B wurde verwendet, um erfolgreich einen PDGF-BB-Liganden in einem Rezeptoraktivierungstest zu binden. Die PDGF-BB-Ligandenbindung an mit NIH3T3-Zell- assoziierten PDGF-Rezeptoren wird gemessen. Die Ligandenbindung verursacht eine Phosphorylierung (Aktivierung) der mit Zellen assoziierten Rezeptoren. Die Rezeptorphosphorylierung wird in einem mehrstufigen Prozeß verfolgt, welcher zuerst die Solubilisierung von NIH3T3- Zellen und die Trennung von Zellproteinen durch Elektrophorese von Zellextrakten auf Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelen beinhaltet. Die Gele werden auf Nitrocellulose geblottet und mit monoklonalen Antiphosphotyrosin-Antikörpern behandelt, um die Erkennung des phosphorylierten PDGF-Rezeptors zu unterstützen. Monoklonale Antikörper werden durch Autoradiographie von mit Antikörpern assoziiertem 125-I Protein A, das in der Endstufe des Tests eingeführt wurde, sichtbar gemacht.
Wenn das menschliche Rezeptorprotein vom Typ B (mit etwa einem 60fachen molaren Überschuß zum PDGF-BB-Liganden) mit einem Liganden für 1 Stunde vor der Inkubation mit NIH3T3- Zellen vorinkubiert wird, liegt keine mit den Zellen assoziierte PDGF-Rezeptor-Phosphorylierung vor. Dies zeigt, daß das menschliche PDGF-Rezeptorprotein vom Typ B den PDGF-BB-Liganden in Lösung bindet und verhindert, daß der Ligand mit Zellen assoziierte PDGF-Rezeptoren aktiviert. Somit können Polypeptide, die LBR's enthalten, zum Blockieren der normalen PDGF-Reaktionen verwendet werden.
Die Domäne, die Strukturen der vorliegenden Erfindung enthält, findet sowohl als diagnostisches als auch als therapeutisches Reagenz Verwendung. Die Rezeptorpolypeptide können als Affinitätsreagenzien zum Erkennen oder Binden eines Liganden sowie zur Wechselwirkung mit rezeptorartigen Proteinen, beispielsweise Beeinflussung der Rezeptorprotein-Dimerisierung, verwendet werden. Die Polypeptide sind auch als Reagenzien zum Erkennen oder Reinigen anderer Proteine, die mit den Rezeptoren oder Fragmenten derselben assoziieren, nützlich.
Die Rezeptorpolypeptide finden auch Verwendung bei der Erzeugung von anderen Reagenzien, beispielsweise Antikörpern, die zum Binden von Epitopen, die für die modifizierten Rezeptoren eigentümlich sind, spezifisch sind. Insbesondere können Antikörper, die gegen neu gebildete die Ligandenbindung bestimmende Segmente hervorgebracht worden sind, als Liganden für die modifizierten Rezeptoren dienen. Diese Verfahren können die Trennung von verschiedenen Funktionalitäten der Rezeptoren bereitstellen, wodurch jede der verschiedenen Effektorfunktionen als Reaktion auf die PDGF-Bindung von anderen isoliert wird.
Die modifizierten Rezeptoren der vorliegenden Erfindung stellen auch Verfahren zum Testen von Liganden für diese bereit. Lösliche Ligandenbindungsfragmente sind beispielsweise als konkurrierende Stellen für die Ligandenbindung nützlich, eine nützliche Eigenschaft in einem Ligandenbindungstest. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen Test zum Selektieren nach PDGF- Bindungsinhibierung bereit, was die Selektion einer großen Anzahl von Verbindungen ermöglicht. Diese Verbindungen können in vitro getestet werden, was das Testen von zytotoxischen oder die Membran aufbrechenden Verbindungen ermöglicht. Das vorliegende Festphasensystem gestattet reproduzierbare, empfindliche, spezifische und leicht automatisierte Testverfahren. Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen können mit dem geeigneten Konstrukt mit LBR's beschichtet werden, um die Ligandenbindungsaktivität zu testen.
Überdies führen Modifikationen an den Ligandenbindungsdomänen zu Bindungsbereichkombinationen mit verschiedenen Ligandenbindungsaffinitäten. Somit kann die Modulation der durch den Liganden bewirkten Reaktion leicht durch den Einschluß des geeigneten hinsichtlich der Affinität modifizierten Analogons erreicht werden.
Festphasentests unter Verwendung dieser modifizierten Rezeptoren können ebenfalls entwickelt werden, welche eine größere Empfindlichkeit oder verbesserte Kapazität gegenüber unmodifizierten Bindungsbereichen bereitstellen.
Diagnosesätze, die diese Reagenzien umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt. Der Satz umfaßt typischerweise ein in Kammern aufgeteiltes Gehäuse, beispielsweise ein Kunststoffsubstrat mit daran angehefteten diagnostischen Reagenzien der Erfindung. Die Packung umfaßt typischerweise auch verschiedene Puffer, Markierungsreagenzien und andere Reagenzien, die für den durchzuführenden Diagnosetest geeignet sind. Anweisungen zur Verwendung der betreffenden Reagenzien und zur Interpretation der Ergebnisse werden bereitgestellt.
Insbesondere wird das wichtige funktionelle Segment der extrazellulären Domäne gewöhnlich an ein Kunststoff- oder anderes Festphasensubstrat angeheftet. Die Bindungsbereiche werden gewöhnlich für eine Kombination der Affinität und des Ligandenbindungsspektrums der modifizierten Bindungssegmente ausgewählt, Geeignete Liganden werden häufig eingeführt, um die Ligandenbindungsaktivität und -affinität zu bestimmen. Verschiedene LBR-Kombinationen werden verwendet und können zum Testen auf unterschiedlich modifizierte, beispielsweise markierte, Liganden verwendet werden.
Außerdem sind die Peptide zur therapeutischen Verabreichung nützlich. Die Mengen der Reagenzien, die für eine wirksame Therapie erforderlich sind, hängen von vielen verschiedenen Faktoren ab, einschließlich des Verabreichungsmittels, der Zielstelle, des physiologischen Zustands des Patienten und anderen verabreichten Medikamenten. Somit sollten die Behandlungsdosierungen titriert werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Typischerweise können in vitro verwendete Dosierungen eine nützlich Anleitung hinsichtlich der für eine in situ Verabreichung dieser Reagenzien nützlichen Mengen bereitstellen. Tierversuche von wirksamen Dosen zur Behandlung von speziellen Leiden stellen eine weitere Vorhersageangabe der menschlichen Dosierung bereit. Verschiedene Erwägungen sind beispielsweise in Gilman et al. (Hrsg.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Ausg., Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Sciences, (1985) 7. Ausg., Mack Publishing Co., Easton, Penn.; beschrieben, von denen jedes hiermit durch den Hinweis aufgenommen wird. Verfahren zur Verabreichung werden darin erörtert, beispielsweise zur oralen, intravenösen, intraperitonealen oder intramuskulären Verabreichung, transdermalen Diffusion und weitere. Pharmazeutisch zulässige Träger umfassen Wasser, Salzlösung, Puffer und andere Verbindungen, die beispielsweise in Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey, beschrieben sind. Aufgrund der Bindung mit hoher Affinität zwischen PDGF und seinen Rezeptoren würde anfänglich erwartet werden, daß niedrige Dosierungen dieser Reagenzien wirksam wären. Somit würde gewöhnlich erwartet werden, daß Dosierungsbereiche in Mengen mit geringeren Konzentrationen als 1 mM, typischerweise geringeren Konzentrationen als etwa 10 um, gewöhnlich geringer als etwa 100 nM, vorzugsweise geringer als etwa 10 pM (pikomolar) und am meisten bevorzugt geringer als etwa 1 fM (femtomolar), mit einem geeigneten Träger liegen würden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden durch parenterale, äußerliche, orale oder lokale Verabreichung, wie z. B. durch Aerosol oder transdermal, für eine prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung verabreicht. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Einheitsdosierungsformen in Abhängigkeit von dem Verabreichungsverfahren verabreicht werden. Einheitsdosierungsformen, die sich zur oralen Verabreichung eignen, umfassen beispielsweise Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln und Dragees.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen intravenös verabreicht. Somit stellt diese Erfindung Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung bereit, die eine Lösung der Verbindung gelöst oder suspendiert in einem zulässigen Träger, vorzugsweise einem wässerigen Träger, enthalten. Eine Vielzahl von wässerigen Trägern können verwendet werden, beispielsweise Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, gut bekannte Sterilisierungsverfahren sterilisiert werden oder können steril filtriert werden. Die resultierenden wässerigen Lösungen können zur Verwendung so verpackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wässerigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch zulässige Hilfsstoffe enthalten, wie es zur Annäherung an physiologische Bedingungen erforderlich ist, wie z. B. pH-Einstell- und Puffermittel, Tonizitätseinstellmittel, Benetzungsmittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw.
Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche nicht- toxische feste Träger verwendet werden, die beispielsweise pharmazeutische Grade von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen umfassen. Zur oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch zulässige nichttoxische Zusammensetzung durch Eingliedern von irgendeinem der normalerweise verwendeten Exzipienten, wie z. B. jene Träger, die vorher aufgelistet wurden, und im allgemeinen 10-95% des aktiven Bestandteils, vorzugsweise etwa 20%, gebildet (siehe Remington's supra).
Zur Aerosolverabreichung werden die Verbindungen vorzugsweise in fein verteilter Form zusammen mit einem oberflächenaktiven Stoff und einem Treibmittel zugeführt. Der oberflächenaktive Stoff darf natürlich nicht toxisch sein und muß vorzugsweise in dem Treibmittel löslich sein. Repräsentativ für solche Mittel sind die Ester oder Teilester von Fettsäuren, die 6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Capron-, Octan-, Laurin-, Palmitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Ölester- und Ölsäuren mit einem aliphatischen mehrwertigen Alkohol oder seinem cyclischen Anhydrid, wie beispielsweise Ethylenglycol, Glycerin, Erythritol, Arabitol, Mannitol, D-Sorbitol, den Hexitolanhydriden, die von D-Sorbitol abgeleitet sind, und den Polyoxyethylen- und Polyoxypropylenderivaten von diesen Estern. Gemischte Ester, wie z. B. gemischte oder natürliche Glyceride können verwendet werden. Der oberflächenaktive Stoff kann 0,1-20 Gewichts% der Zusammensetzung, vorzugsweise 0,25-5%, bilden. Der Rest der Zusammensetzung ist gewöhnlich ein Treibmittel. Verflüssigte Treibmittel sind typischerweise Gase bei Umgebungsbedingungen und werden unter Druck kondensiert. Unter geeigneten verflüssigten Treibmitteln befinden sich die niedereren Alkane, die bis zu 5 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Butan und Propan; und vorzugsweise Fluor- oder Fluorchloralkane. Gemische der obigen können ebenfalls verwendet werden. Bei der Herstellung des Aerosols wird ein Behälter, der mit einem geeigneten Ventil ausgestattet ist, mit dem geeigneten Treibmittel gefüllt, das die fein verteilten Verbindungen und den oberflächenaktiven Stoff enthält. Die Bestandteile werden somit unter einem erhöhten Druck gehalten, bis sie durch Betätigung des Ventils freigesetzt werden.
Die Zusammensetzungen, die die Verbindungen enthalten, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen an einen Patienten verabreicht, der bereits unter einer Krankheit leidet, wie vorstehend beschrieben, in einer Menge, die ausreicht, um die Symptome der Krankheit und ihre Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zu hemmen. Eine angemessene Menge, um dies zu bewerkstelligen, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die für diese Anwendung wirksam sind, hängen von der Schwere der Krankheit und dem Gewicht und allgemeinen Zustand des Patienten ab.
Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, die die Verbindungen der Erfindung enthalten, an einen Patienten verabreicht, der für eine spezielle Krankheit anfällig oder anderweitig gefährdet ist. Eine solche Menge ist als "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Bei dieser Anwendung hängen die genauen Mengen wieder vom Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten ab.
Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden erläuternden Beispiele besser verstanden. Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Begrenzung geboten.

EXPERIMENTE

Im allgemeinen sind in verschiedenen Veröffentlichungen, beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2 und Ergänzungsbände; und Wu und Grossman (Hrsg.) (1987) Methods in Enzymology, Band 53 (Recombinant DNA Part D); von denen jedes durch den Hinweis hierin aufgenommen wird, Standardverfahren der DNA-Rekombinationstechnik beschrieben.

I. Menschlicher extrazellulärer Bereich

Äquivalente Verfahren zur Konstruktion, Expression und Bestimmung der physiologischen Wirkung von Kürzungs- oder Deletionsanalogen der löslichen extrazellulären Rezeptorfragmente von dem menschlichen Rezeptor können unter Verwendung der Nucleinsäure, des Polypeptids und anderer hierin bereitgestellter Reagenzien durchgeführt werden.

A. Segmente vom Typ B

Konstrukte von Rezeptorpolypeptiden vom Typ B wurden folgendermaßen hergestellt:
Das 3,9 kb EcoRI-Hind III cDNA-Fragment des menschlichen hPDGF-R vom Typ B wurde in die EcoRI-Hind-III-Stelle von M13 Mp18 subkloniert, um einen Vektor Mp18PR zu erzeugen. Für Verfahren siehe Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., welches durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Die Überprüfung der Subklonierung wurde durch Restriktionsenzym-Verdauungsanalyse und Didesoxykettenabbruch-Sequenzanalyse durchgeführt, wie von Sanger et al. (1977) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 74: 5463 beschrieben. Eine Oligonucleotid-ortsspezifische in vitro Mutagenese wurde gemäß dem von Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol., 154: 367, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Strategie für die Oligonucleotid-ortsspezifische in vitro Deletionsmutagenese von Mp18PR ist in Fig. 1 skizziert.
Kurz gesagt, wurde eine Reihe von Oligonucleotiden dazu ausgelegt, einen verschachtelten Satz von löslichen extrazellulären Bereichen des hPDGF-Rezeptors vom Typ B durch Deletionsmutagenese zu erzeugen. Diese Domänen sind mit Domäne 1 bis Domäne 5 (D1-D5) bezeichnet, wobei sie sich zur Expression in einem geeigneten eukaryotischen Expressionssystem eignen. Eine Beschreibung der mutagenen Oligonucleotide, die auf die entsprechenden Bereiche des menschlichen PDGF-Rezeptors ausgerichtet sind, ist in Tabelle 11 aufgelistet. Die resultierenden Konstrukte sind wie in Tabelle 13 angegeben bezeichnet. Der Gegensinn- Strang wurde durchweg zur Mutagenese verwendet. Die Mutagenese von PΔ1, PΔ2, PΔ3, PΔ4 und PΔ5 verwendete Mp18PR als Matrize und die Mutagenese von PΔ6, PΔ7, PΔ8 und PΔ9 verwendete MP 18 PΔ1 als Matrize. PΔ1, ein 41 bp Oligomer, führte ein TAG-Stoppcodon nach Lysin&sub4;&sub9;&sub9; (K&sub4;&sub9;&sub9;) von D5 ein und entfernte die Transmembran (TM) sowie die gesamte intrazelluläre Kinasedomäne (K), was ein Mp18 PΔ1 (siehe Fig. 1) erzeugte. PΔ1 codiert 530aa 148'aa Vorstufenproteine.

TABELLE 13

MENSCHLICHE PDGF-R-EXPRESSIONSKONSTRUKTE VOM TYP B

löslich membrangebunden pBJPR
pBJPΔ1
pBJPΔ2
pBJPΔ3
pBJPΔ4
pBJPΔ5
pBJPΔ6
pBJPΔ7
pBJPΔ8
pBJPΔ9
Die menschlichen PDGF-Rezeptorkonstrukte wurden anschließend in die EcoRI-Hind-III-Stelle von pBJ1, einer Derivatisierung von pCDL-SRα296, subkloniert, wie in Takabe et al. (1988) Molec. Cell Biol. 8: 466, beschrieben, und mit pSV2NEO, wie von Southern und Berg (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1: 327, beschrieben, in Eizellen vom Chinesischen Hamster (CHO) cotransfiziert. Siehe Fig. 2 und 3.
Die Funktion der Konstrukte wurde folgendermaßen nachgewiesen:
Eine Probe von 0,33 nM PDGF-BB-Ligand wird für 1 h bei 4ºC unter den folgenden Bedingungen vorinkubiert:
1. ein polyklonaler Antikörper für den menschlichen PDGF (dieser Antikörper erkennt den menschlichen PDGF AA, PDGF BB und PDGF AB);
2. 18 nM (60facher molarer Überschuß zu PDGF BB) menschlicher PDGF-Rezeptor vom Typ B;
3. phosphatgepufferte Salzlösung, in der der Rezeptor und der Antikörper vorliegen; oder
4. keine Zugaben, sondern der Ligand selbst.
In einem doppelten Satz von Versuchen werden 0,33 nM PDGF AA mit drei der vorstehenden Vorinkubationsbedingungen, beispielsweise 2, 3 und 4 oben, inkubiert. Der menschliche PDGF-Rezeptor vom Typ B erkennt PDGF AA nicht deutlich, aber dieser Ligand aktiviert dennoch den mit Zellen assoziierten menschlichen PDGF-Rezeptor vom Typ A von NIH3T3-Zellen und ist somit eine Kontrolle für die Spezifität des menschlichen PDGF-Rezeptors vom Typ B und die von PDGF BB abhängige Aktivierung als Funktion der nicht spezifischen allgemeinen zellulären Wirkung, beispielsweise Zytotoxizität.
Die vorinkubierten Materialien lagen in einem Endvolumen von 0,5 ml vor. Sie wurden in jeweils eine Vertiefung einer Gewebekulturschale mit sechs Vertiefungen gegeben, die eine Kontaktschicht von an Serum armen (ruhigen) NIH3T3-Zellen, die auf 4ºC abgeschreckt wurden, enthielt. Die Zellen und Inkubationsgemische wurden bei 4ºC für 2 h bewegt, beispielsweise geschüttelt. Sie wurden dann zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung mit 4ºC gewaschen. Vierzig ul 125 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), pH 6,8, 20% (Volumen/Volumen) Glycerol, 2% (Gewicht/Volumen) Natriumdodecylsulfat (SDS), 2% (Volumen/Volumen) 2- Mercaptoethanol und 0,001% Bromphenolblau (bekannt als SDS- Probenpuffer) wurden pro Mikrotitervertiefung zugegeben, gefolgt von 40 ul 100 mM Tris, pH 8,0, 30 mM Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumfluorid, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 5 mM Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure, 1% (Gewicht/Volumen) SDS, 100 mM Dithiothreitol, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 200 uM Natriumvanadat wurden zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden solubilisiert und 40 ul zusätzlicher SDS- Probenpuffer wurde zu dem Solubilisat zugegeben. Dieses Material wurde 5 Minuten sieden lassen und auf eine einzelne Gelprobenvertiefung eines 7,5%igen Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gels gegeben - Zelluläre Proteine wurden durch Elektrophorese getrennt.
Die getrennten Proteine wurden durch Elektrotransfer auf Nitrocellulose transferiert und der resultierende "Western- Blot" wurde mit 3 Wechseln von 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid, 5 mg/ml Rinderserumalbumin, 50 mM Tris, pH 7,5, (als Blockierungspuffer bezeichnet) jeweils für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Eine 1/1000 Verdünnung von PY20 (ein kommerziell erhältlicher monoklonaler Antikörper für Phosphotyrosin [ICN]) in Blockierungspuffer wurde mit dem Blot über Nacht bei 4ºC inkubiert. Der Blot wurde 3mal für jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer gewaschen. Der Blot wurde mit 4 uCi/40 ml ¹²&sup5;I-Protein A [Amersham] in Blockierungspuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und 3mal für jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer gewaschen. Der Blot wurde für 48 h einem Röntgenfilm mit einem Verstärkungsschirm bei -70ºC ausgesetzt und mit Standardreagenzien entwickelt.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse des Autoradiogramms mit den vorstehend erwähnten Bedingungen plus der zusätzlichen Bedingung von keinem zugegebenen Liganden (kein PDGF). Diese zusätzliche Bedingung definiert den Grad der Aktivierung des mit Zellen assoziierten Rezeptors (beispielsweise Phosphorylierung) in Abwesenheit irgendeines zugegebenen Liganden. Sowohl der Antikörper als auch der menschliche PDGF-Rezeptor vom Typ B neutralisierten die Aktivierung des mit Zellen assoziierten PDGF-Rezeptors durch PDGF BB. Dies liegt anscheinend an der direkten Bindung und Komplexbildung des Liganden, was ihn für die PDGF-Rezeptoraktivierung unverfügbar macht. p185 zeigt die Rezeptorposition.

B. Sequenz vom Typ A

Ähnliche Manipulationen unter Verwendung der mutagenen Oligonucleotide von Tabelle 12 werden verwendet, um die in Tabelle 15 aufgelisteten Konstrukte vom Typ A zu konstruieren. Man beachte, daß die Konstrukte vom Typ A nicht tatsächlich hergestellt wurden, sondern sich durch diese Verfahren leicht herstellen lassen würden. Ähnliche Tests werden verwendet, um die Funktion der Konstrukte zu testen.

TABELLE 15

VORGESCHLAGENE MENSCHLICHE PDGF-R-EXPRESSIONSKONSTRUKTE VOM TYP A

Typ A
löslich membrangebunden pARSR
pARSΔ1
pARSΔ2
pARSΔ3
pARSΔ4
pARSΔ5
pARSΔ6
AARSΔ7
pARSΔ8
pARSΔ9

C. PDGF-Plattentest

Polystyrol-Mikrotiterplatten (Immulon, Dynatech Laboratories) wurden mit dem Fragment des extrazellulären Bereichs des menschlichen PDGF-Rezeptors vom Typ B (vorstehend beschrieben) durch Inkubieren von ungefähr 10- 100 ng dieses Proteins pro Vertiefung in 100 ul 25 mM Tris, 75 mM NaCl, pH 7,75 für 12 bis 18 h bei 4ºC beschichtet. Das Protein wurde in transfizierten CHO-Zellen exprimiert und in serumfreien Medien (Gibco MEMα) mit einer Konzentration von 0,2-1 ug/ml mit einer Gesamtproteinkonzentration von 150-300 ug/ml gesammelt.
Das Fragment des extrazellulären Bereichs des menschlichen PDGF-Rezeptors vom Typ B wurde konzentriert und teilweise gereinigt durch Leiten der Medien über Weizenkeim- Agglutinin-Sepharose bei 4ºC (mit 48 ml/h) in Anwesenheit von 1 mM PMSF. Nach ausgedehntem Waschen wurde das Protein in 0,3 M N-Acetylglucosamin, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 7,4, eluiert. Diese Fraktion wurde dann auf Sephacryl S-200 HR (Pharmacia), das in 0,15 M Ammoniumbicarbonat, pH 7,9, äquilibriert wurde, aufgebracht. Die Rezeptor enthaltenden Fraktionen (3-10 ng/ul) wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting mit einem durch Standardverfahren hergestellten polyklonalen Kaninchenantikörper gegen ein Segment der Domäne 1 (D1) aus dem externen Rezeptorbereich erfaßt. Diese Fraktionen (3- 10 ng/ul) wurden verwendet, um die Mikrotitervertiefungen wie vorstehend beschrieben zu beschichten. Die Vertiefungen wurden dann entwässert, einmal mit jeweils 200 ul 0,5% Gelatine (Bio-Rad, EIA-Grad), 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7,4, gespült und für 1-2 h bei 24ºC mit 150 ul eben dieser Lösung inkubiert. Die Vertiefungen wurden entwässert und zweimal mit 0,3% Gelatine, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7,4 (jeweils 150 ul) gespült. 90 ul der 0,3%igen Gelatinelösung wurden in jede Vertiefung gegeben (die zum Testen der unspezifischen Bindung verwendeten Vertiefungen erhielten nur 80 ul und dann 10 ul 0,01 mg/ml nicht markierten PDGF in der 0,3%igen Gelatinelösung). PDGF BB (Amgen) wurde bei 4ºC auf 52000 CPM/ng mit Dijod-Bolton-Hunter-Reagens (Amersham) jodiert und ungefähr 40000 CPM wurden pro Vertiefung in 10 ul zugegeben, enthaltend 0,024% BSA, 0,4% Gelatine, 20 mM Hepes, 80 mM NaCl, 70 mM Essigsäure, pH 7,4. Die Platte wurde für 2-3 h bei 24ºC inkubiert, wonach die Vertiefungen dreimal mit jeweils 150 ul 0,3% Gelatine, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7,4, gewaschen wurden. Die restliche gebundene Radioaktivität wurde aus den Vertiefungen in 200 ul 1% SDS, 0,5% BSA solubilisiert und in einem Gammazähler gezählt. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart eines 150fachen Überschusses von unmarkiertem PDGF BB (Amgen) bestimmt und betrug etwa 7% des gesamten gebundenen ¹²&sup5;I-pDGF.
Ähnliche Tests sind unter Verwendung von Rezeptorfragmenten vom Typ A möglich. Die Rezeptorfragmente vom Typ A sind jedoch empfindlicher für die Anwesenheit von anderen Proteinen als die Fragmente vom Typ B und scheinen ein anderes Vertiefungsbeschichtungsreagens als die Gelatine zu benötigen. Hämoglobin wird in den Puffern gegen Gelatine mit etwa denselben Konzentrationen ausgetauscht. Andere Blockierungsproteine sind nützlich, die beispielsweise ausgewählt werden von der Sigma Chemical Company. Titrationen zum Optimieren des Proteintyps und der Konzentration werden durchgeführt, um Proteine zu finden, die die Rezeptorproteinbindung nicht beeinflussen.
Die vorliegenden Tests erfordern weniger als 5 ng/Vertiefung von löslicher Rezeptorform, die in transfizierten CHO-Zellen exprimiert wurde und teilweise durch Affinitäts- und Gelchromatographie gereinigt wurde. Unter Verwendung von jodiertem PDGF-BB kann die spezifische Bindung von weniger als 10 pg Ligand in einem Testvolumen von 100 ug/Vertiefung erfaßt werden. Bei 4ºC ist die Bindung von ¹²&sup5;I-PDGF BB an einen immobilisierten Rezeptor sättigbar und von hoher Affinität. Die Kd durch Scatchard- Analyse war etwa 1 nM mit 1,8 · 10¹&sup0; Stellen pro Vertiefung. Die unspezifische Bindung, die in Gegenwart eines 100fachen Überschusses von kaltem PDGF BB bestimmt wurde, war gewöhnlich nur etwa 5-10% der gesamten Bindung. Die Bindung war ebenfalls spezifisch für die Isoform des Liganden, insofern als überschüssiger kalter PDGF AA die ¹²&sup5;I-PDGF-BB-Bindung nicht inhibierte. Ferner konkurriert der externe Bereich des PDGF-Rezeptors vom Typ B in Lösung mit seiner immobilisierten Form um die Bindung von jodiertem PDGF BB (IC&sub5;&sub0; = 5 nM). Der nach 4 h bei 4ºC gebundene ¹²&sup5;I-pDGF BB ist in Bindungspuffer nur langsam dissoziierbar (t1/2 > 6 h), wird jedoch durch die Zugabe eines 150fachen Überschusses von unmarkiertem PDGF BB vollständig verdrängt (t1/2 < 1 h).
Diese Untersuchungen wurden durch die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktorpräparaten ohne Verunreinigung mit anderen Wachstumsfaktoren und durch die Verwendung eines Rezeptorexpressionssystems, in dem alle der gemessenen PDGF-Reaktionen dieser einzelnen transfizierten Rezeptor- cDNA zugeschrieben werden konnten, möglich gemacht.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen hierin werden durch einen Hinweis in demselben Umfang aufgenommen, als ob von jeder einzelnen Veröffentlichung oder Patentanmeldung speziell und individuell angegeben worden wäre, daß sie durch einen Hinweis aufgenommen wird. Da die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, wird es für einen Fachmann ersichtlich sein, daß viele Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Gedanken oder Schutzbereich der beigefügten Ansprüche abzuweichen.

"SEQUENZAUFLISTUNG"

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Wolf, David Tomlinson, James E. Fretto, Larry J. Giese, Neill A. Escobedo, Jaime A. Williams, Lewis T.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: DOMÄNEN VON EXTRAZELLULÄREN BEREICHEN VON VON MENSCHLICHEN BLUTPLÄTTCHEN ABSTAMMENDEN WACHSTUMSFAKTOR REZEPTOR-POLYPEPTIDEN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 23
(iv) POSTADRESSE:
(A) ADRESSAT: TOWNSEND and TOWNSEND
(B) STRASSE: Steuart Street Tower, 20. Etage / One Market Plaza
(C) STADT: San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) ZIP: 94105
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Ausgabe #1.0, Version # 1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) BEVOLLMÄCHTIGTER/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: Ching, Edwin P.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 34090
(C) AKTENZEICHEN/REGISTERNUMMER: 12418-14
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (415) 326-2400
(B) TELEFAX: (415) 326-2422

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5427 BASENPAARE
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(B) STAMM: lambda gt10
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 187..3504 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 1:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1106 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 2:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4100 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
(B) STAMM: lambda gt10
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 129..3395 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 3:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 4:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1089 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 4:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 5:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 6375 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
(B) STAMM: lambda gt10
(ix) MERKMAL.
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 129..3395
(D) WEITERE INFORMATION: /Anmerkung: "Nucleotid Nummer 1 dieser Sequenz ist identisch zum Nucleotid Nummer 1 der vorherigen 4100 langen Sequenz." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 5:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 6:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 41 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) GEGENSINN: NEIN

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 6:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 41 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 7:

TCCTTCGACC TACAGATCAA TTAGCTTCCT GTAGGGGGCT G 41

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 8:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 8:

ATCACCGTGG TTGAGAGCGG CTAGCTTCCT GTAGGGGGCT G 41

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 9:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 9:

TACAGACTCC AGGTGTCATC CTAGCTTCCT GTAGGGGGCT G 41

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 10:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 44 Basenpaare
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 10:

CTCTACATCT TTGTGCCAGA TCCCTAGCTT CCTGTAGGGG GCTG 44

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 11:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 11:

CAGATCTCTC AGGGCCTGGT CACCGTGGGC TTCCTCCCTA ATCAT 45

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 12:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 48 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 12:

CAGATCTCTC AGGGCCTGGT CATCAACGTC TCTGTGAACG CAGTGCAG 48

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 13:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 13:

CAGATCTCTC AGGGCCTGGT CTACGTGCGG CTCCTGGGAG AGCTG 45

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 14:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 14:

CAGATCTCTC AGGGCCTGGT CGTCCGAGTG CTGGAGCTAA GT 42

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 15:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 41 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
(B) STAMM: lambda gt10

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 15:

GCTCCCACCC TGCGTTCTGA ATAACTGGCG GATTCGAGGG G 41

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 16:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 41 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
GAACTGTTAA CTCAAGTTCC TTAACTGGCG GATTCGAGGG G 41

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 17:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 41 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
(B) STAMM: lambda gt10

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 17:

ATTTCTGTCC ATGAGAAAGG TTAACTGGCG GATTCGAGGG G 41

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 18:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 18:

TATGCTTTAA AAGCAACATC ATAACTGGCG GATTCGAGGG G 41

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 19:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 44 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
(B) STAMM: lambda gt10

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 19:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
(B) STAMM: lambda gt10

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 20:

AGCCTAATCC TCTGCCAGCT TGATGTAGCC TTTGTACCTC TAGGA 45

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 21:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 48 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
(B) STAMM: lambda gt10

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 21:

AGCCTAATCC TCTGCCAGCT TGAGCTGGAT CTAGAAATGG AAGCTCTT 48

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 22:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 22:

AGCCTAATCC TCTGCCAGCT TTTCATTGAA ATCAAACCCA CCTTC 45

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR.: 23:

(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: JA
(iv) GEGENSINN: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo Sapiens
(B) STAMM: lambda gt10

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 23:

AGCCTAATCC TCTGCCAGCT TTCATCCATT CTGGACTTGG TC 42

Claims

1. Fragment eines Rezeptors eines von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (hPDGF-R) vom Typ B oder Typ A, das aus einer oder zwei extrazellulären Domänen besteht, wobei die Domänen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem oder zwei von lediglich D1, D2 und D3 besteht, wobei das Fragment eine Bindungsaktivität für einen Liganden des Rezeptors des von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors aufweist, wobei das Fragment den von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF)-Liganden mit einer KD von weniger als 10 uM bindet.

2. hPDGF-R-Fragment vom Typ B oder Typ A, wobei das Fragment aus den extrazellulären Domänen D1 und D2 besteht und wobei das Fragment eine Bindungsaktivität für einen Liganden eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors aufweist und einen von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF)-Liganden mit einer KD von weniger als 10 uM bindet.

3. hPDGF-R-Fragment vom Typ B oder Typ A, wobei das Fragment aus den extrazellulären Domänen D1, D2 und D3 besteht und wobei das Fragment eine Bindungsaktivität für einen Liganden eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors aufweist und einen von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor(PDGF)- Liganden mit einer KD von weniger als 10 uM bindet.

4. hPDGF-R-Fragment nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Fragment eine Affinität von 5 nM aufweist.

5. hPDGF-R-Fragment nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei das Fragment mindestens etwa 15 benachbarte Aminosäuren von einem Intracysteinbereich der Domäne D3 umfaßt.

6. hPDGF-R-Fragment nach einem vorangehenden Anspruch, wobei das Fragment löslich ist.

7. hPDGF-R-Fragment nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei zumindest eine der Domänen eine Domäne D3 ist.

8. hPDGF-R-Fragment nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das hPDGF-R-Fragment vom Typ B eine zusammenhängende Sequenz in Tabelle 1 von Position 1 (Leu) bis Position 282 (Gly) ist oder wobei das hPDGF-R-Fragment vom Typ A eine zusammenhängende Sequenz in Tabelle 2 von Position 1 (Gly) bis Position 290 (Gly) ist.

9. hPDGF-R-Fragment vom Typ A oder B, wobei das Fragment aus der Gruppe von Formeln ausgewählt ist, die aus:

a) X1-Dm-X1;

b) X1-Dm-X1-Dn-X1; und

c) X1-Dm-X1-Dn-X1-Dp-X1;

besteht, wobei:

X1, falls vorhanden, ein Spacer-Segment ist, das sich vor oder nach einer D-Domäne befindet; und jedes von Dm, Dn, und Dp, falls vorhanden, unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus D1, D2 und D3 besteht, wobei das Fragment eine Bindungsaktivität für einen Liganden eines Rezeptors eines von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors aufweist und einen von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor mit einer KD von weniger als 10 uM bindet.

10. hPDGF-R-Fragment nach Anspruch 1, 2, 3 oder 9, wobei das Fragment rein ist.

11. Nucleinsäuresequenz, die ein hPDGF-R-Fragment nach Anspruch 1, 2, 3 oder 9 codiert.

12. Nucleinsäure nach Anspruch 11, wobei die codierende Sequenz steuerbar mit einem Promotor verbunden ist.

13. Zelle mit einem hPDGF-R-Fragment nach Anspruch 1, 2, 3 oder 9.

14. Säugerzelle mit einer Nucleinsäure nach Anspruch 11.

15. Zelle mit sowohl einer Nucleinsäure nach Anspruch 11 als auch einem Proteinexpressionsprodukt der Nucleinsäure.

16. Verfahren zum Messen der PDGF-Ligandenbindungsaktivität einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) in Kontakt bringen einer aliquoten Menge der Probe mit einem PDGF-Liganden in Gegenwart eines hPDGF-R-Fragments nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 in einer ersten Analyse;

b) in Kontakt bringen einer aliquoten Menge der Probe mit einem PDGF-Liganden in Abwesenheit des hPDGF-R-Fragments in einer zweiten Analyse; und

c) Vergleichen des Ausmaßes der PDGF-Ligandenbindung in den zwei Analysen.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das hPDGF-R-Fragment an eine Zelle angeheftet ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das hPDGF-R-Fragment an ein festes Substrat angeheftet ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das feste Substrat eine Mikrotiterschale ist.

20. Verfahren zum Messen des PDGF-Ligandengehalts einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) in Kontakt bringen einer aliquoten Menge der Probe mit einem Ligandenbindungsbereich (LBR) in Gegenwart eines hPDGF-R-Fragments nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 in einer ersten Analyse;

b) in Kontakt bringen einer aliquoten Menge der Probe mit einem LBR in Abwesenheit des hPDGF-R-Fragments in einer zweiten Analyse; und

c) Vergleichen des Ausmaßes an Bindung in den zwei Analysen.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Kontaktierungsschritte gleichzeitig ausgeführt werden.