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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine stabil transformierte Zell-Linie,
umfassend einen β1-adrenergen Rezeptor
und einen zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Sensor, der mindestens
eine cAMP-Bindestelle, oder vorzugsweise nur eine cAMP-Bindestelle
und mindestens zwei nachweisbare Markierungen aufweist, wobei die
erste der zwei nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus und
die zweite der nachweisbaren Markierungen am Amino-Terminus der
cAMP-Bindeeinheit lokalisiert ist. Die stabil transformierte Zell-Linie
ermöglicht erstmals eine uniforme, sensitive Nachweismethode
von cAMP-Konzentrationen. Des Weiteren sind Nukleinsäuremoleküle
beschrieben, die sowohl den β1-adrenergen
Rezeptor, als auch den cAMP-Sensor codieren. Die vorliegende Erfindung
stellt auch Verfahren dar, die unter Verwendung der stabil transformierten
Zell-Linie, eine deutlich uniformere, einheitlichere Detektion und
damit Identifikation von Molekülen oder Verbindungen ermöglichen,
die Bildung von cAMP oder die biologische und/oder pharmakologische Funktion
von Adenylatzyklasen oder Phosphodiesterasen zu modifizieren. Schließlich
wird ein Kit offenbart, das die Verbindungen der vorliegenden Erfindung
umfasst.
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Die
erfindungsgemäße Zell-Linie, die sowohl einen β/β1-adrenergen Rezeptor, als auch einen cAMP-Sensor
stabil exprimiert ist in einer Vielzahl von pharmakologisch relevanten
Nachweismethoden einsetzbar, beispielweise zum Screenen von Molekülen
und Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP oder
die biologische und/oder pharmakologische Funktionen von Adenylatzyklasen
oder Phosphodiesterasen zu modifizieren.
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Ein
Guaninnukleotid (G)-Protein gekoppeltes Signal kann über
die entsprechenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) viele
zelluläre Reaktionen auslösen, die von der Regulation
intrazellulärer Spiegel von, cAMP bis hin zur Stimulierung
der Gentranskription reichen. Die Mitglieder dieser Rezeptorfamilie
wurden in Abhängigkeit von den jeweiligen G-Protein-Subtypen,
mit denen sie vorwiegend interagieren, in verschiedene Kategorien gruppiert.
So stimulieren Rezeptoren, die an Gs-Proteine koppeln, in vielen
Zellen Adenylatzyklase, wohingegen an Gq/11 gekoppelte
Rezeptoren über die Aktivierung von Phospholipase C intrazelluläres Kalzium
(Ca2 +) mobilisieren
können. Eine Vielzahl von physiologischen Signalen wie
z. B. Neurotransmitter, Hormone und Licht wird von Mitgliedern der
Familie dieser Sieben-Transmembrandomänen-Rezeptoren erfasst.
Diese GPCRs aktivieren G-Proteine, indem sie die Bindung von Guanosintriphosphat
(GTP) im Austausch für Guanosindiphosphat (GDP) fördern.
Sowohl Gα- als auch Gβγ-Untereinheiten
aktivierter G-Proteine regulieren stromabwärts gelegene
Effektoren wie z. B. Adenylzyklasen, Phospholipasen oder Ionenkanäle.
Ein bei der Signalweiterleitung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
beteiligtes Signalmolekül stellt das AMP dar.
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cAMP
ist ein ubiquitärer intrazellulärer sekundärer
Botenstoff, der Informationen auf Proteine überträgt,
wozu zyklische Nukleotide gesteuerte Ionenkanäle, Proteinkinase
A (PKA) und „exchange Protein activated by cAMP” (Epac)
gehören. Diese Effektoren. regulieren wiederum zelluläre
Funktionen wie Ca2+-Einstrom, Erregbarkeit
und Genexpression, als auch Zell-spezifische Prozesse wie Glykogenolyse
und Lipolyse. Die Enzyme, von denen man weiß, dass sie
den cAMP-Spiegel regulieren, Adenylatzyklase und Phosphodiesterase,
sind eingehend untersucht worden (Hepler, Trends Biochem.
Sci. 17 (10): 383–7 (1992); Exton, Annu Rev
Pharmacol. Toxicol. 36: 481–509 (1996); Beavo,
Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3 (9): 710–8 (Sep 2002); Ishikawa,
Cardiovasc. Pharmacol. 41: 1–4 (2003)).
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Ferner
gilt cAMP neben Ca2+ als universeller Mediator
(sekundärer Botenstoff) der bei der Signalweiterleitung
von G-gekoppelten Rezeptoren beteiligt ist. G-Protein gekoppelte
Rezeptoren spielen bei der Signalweiterleitung einer Vielzahl von
biologischen Prozessen, wie Stoffwechsel, Zellwachstum, Zellmigration,
Immunabwehr oder Kontraktion von Myokardzellen eine wichtige Rolle
(McKnight, Recent Prog Horm Res 53: 139–59; 160–1
(1998); Prasad, A review Apoptosis 8(6): 579–86
(2003); Torgersen, Cell Signal 14(1): 1–9
2002 Jan; Bailey, Proc Natl Acad Sci USA. 93(24):
13445–52 (1996); Wang, Mol. Pharmacol.
63(3): 463–368 (2003); Evans DB, J Cardiovasc
Pharmacol.; 8 Suppl 9: 22–29 (1986)). Eine Krankheit,
die u. a. durch einen erhöhten intrazellulären
Anstieg von cAMP und Ca2+ gekennzeichnet
ist, stellt die idiopathische dilatative Kardiomyopathie dar.
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Die
idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist definiert als
Erkrankung des Herzmuskels, die durch eine Dilatation zumindest
des linken Ventrikels gekennzeichnet ist.
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Ferner
ist DCM mit einer eingeschränkten systolischen Pumpfunktion
des Herzens verbunden. DCM stellt in westlichen Industrienationen
die Hauptursache für Herzversagen bei jungen Erwachsenen
dar, mit einer Inzidenz von 50–100 Patienten und einer
Prävalenz von 300–400 Patienten pro 1 Million
Einwohner (Jhund, Circ. 119: 516–523, (2009)).
Aufgrund des Mangels an Therapiemöglichkeiten ist die Herztransplantation
noch immer als „ultima ratio” bei fortgeschrittener
Herzinsuffizienz anzusehen. Etwa ein Drittel der DCM-Erkrankungen
wird durch Genmutationen und kardiotoxische Substanzen verursacht,
die Ätiologie der verbleibenden zwei Drittel der DCM-Fälle
wird hingegen bisher nur unvollständig verstanden. Das
häufigste klinische Erscheinungsbild der DCM ist eine Herzinsuffizienz.
Durch eine Reduktion des Herzzeitvolumens droht den verschiedenen
Organen eine Minderperfusion, woraufhin verschiedene Kompensationsmechanismen
durch Aktivierung von Barorezeptoren eingeleitet werden. Durch die
Aktivierung des sympathischen Nervensystems werden Adrenalin und
Noradrenalin aus dem Nebennierenmark freigesetzt. Diese Botenstoffe
stimulieren β1-adrenerge Rezeptoren,
was an Kardiomyozyten einen positiv ino-, chrono-, bathmo- und dromotrope
Effekt zur Folge hat. Diese Effekte beruht auf einem intrazellulären
Anstieg von cAMP mit Erhöhung der intrazellulären
Ca1+-Konzentration. Bei einer Vielzahl von
DCM Patienten können herzspezifische Auto-antikörper
(AAk) nachgewiesen werden, die sich gegen Membranproteine (wie z.
B. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren), mitochondriale Proteine oder
Strukturproteine der Kardiomyozyten richten. Zur Klärung
der Frage einer möglichen kausalen Bedeutung von anti-β1-Antikörper (anti-β1-AK) bei kardiovaskulären Erkrankungen
hat der Erfinder die Witebsky'schen Postulate für eine
Autoimmunerkrankung in einem human-analogen Rattenmodell umgesetzt
(Jahns, J. Clin. Invest. 113: 1419–1429 (2004)).
Alle gegen die zweite extrazelluläre Domäne des humanen β1-Antikörpers (β1-ECII; 100% Homologie
Mensch/Ratte) immunisierten Tiere entwickelten hohe anti-β1-Antikörper Titer und nach circa
8–9 Monaten eine progrediente Herzinsuffizienz. Die klinische
Bedeutung funktioneller anti-β1-Autoantikörper
und die klinische Relevanz dieser Autoantikörper-Effekte
sind aber weiterhin unklar. Dies liegt teilweise auch an den völlig
unterschiedlichen Nachweismethoden und damit einer uneinheitlichen
Definition von anti-β1-Autoantikörper
(Jahrs, Trends Cardiovasc Med. 16: 20–24 (2006)).
Das postulierte Modell des Wirkmechanismus funktionell aktiver β1-Autoantikörper geht davon aus,
dass agonistisch wirkende Autoantikörper an die β1-ECII Domäne
binden und eine Konformationsänderung des Rezeptors induzieren,
die ähnlich wie bei der Aktivierung durch einen partiellen Agonisten,
eine Dissoziation der alpha-Untereinheit von der beta/gamma-Untereinheit
des signalvermittelnden GS-Proteins auslöst.
Hierdurch wird die Adenylatzyklase aktiviert, die die cAMP-Bildung
katalysiert. Eine Erhöhung des intrazellulären
cAMP-Spiegels führt zur Aktivierung der cAMP-abhängigen
Proteinkinase (PKA) und im weiteren Verlauf der Signalkaskade zu
einer Erhöhung des zytosolischen Ca2+-Spiegels.
Das Ergebnis der Aktivierung dieser Signalkaskade ist eine erhöhte
Inotropie und Lusitropie des Herzens. Die chronische Aktivierung
des β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten
Signalwegs kann zur progredienten Herzschwäche führen.
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In
der Entwicklung von Screeningverfahren auf β-adrenerge
Autoantikörper, hat man bisher einige begrenzte Ansätze
verfolgt. So wurde bisher u. a. ein aufwendiger dreistufiger Screeningtest
eingesetzt, in welchem ein Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest
(ELISA), indirekte Immunofluoreszenzmikroskopie an Sf9-Zellen, die
den β
1-adrenergen Rezeptor exprimieren,
sowie ein funktioneller radioaktiver cAMP/PKA Assay mit β
1-adrenergen Rezeptor exprimierenden CHW-Zellen
benutzt (
Jahrs, Circulation. 99: 649–654 (1999);
Jahrs,
J. Am. Coll. Cardiol. 34: 1545–1551 (1999)). Jedoch
wurde es erst mit der Entwicklung von cAMP-Sensoren möglich,
cAMP-vermittelte pharmakologisch relevante Prozesse zu untersuchen,
siehe
WO 2005/052186 .
In einem solchen System wird der Fluoreszenzresonanz-Energietransfer
(FRET) genutzt, d. h. es wurde ein Fluoreszenz-cAMP-Sensor hergestellt,
bei dem die cAMP-bindende Domäne eines direkt durch cAMP
aktivierten Regulatorproteins (Epac1) eingesetzt wurde, an das C-terminal
das verstärkte cyan fluoreszierende Protein (eCFP) und
N-terminal an das verstärktegelb fluoreszierende Protein
(eYFP) gekoppelt wurde. Dieser Sensor (Epac1-camps) kann in Säugerzellen
transient exprimiert werden und weist bei Belichtung mit einer Wellenlänge
von 436 nm einen strahlungslosen Energietransfer von eCFP zu eYFP
auf, der eine Emission von Licht der Wellenlänge 542 nm
zur Folge hat. Bindet cAMP an den Sensor, verändert er
seine Konformation und die Distanz zwischen den beiden Fluorophoren
wird vergrößert, womit der Energietransfer verringert
wird, die Emission bei 542 nm abnimmt und die Emission bei 483 nm
zunimmt.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es Verfahren und Mittel zur Untersuchung
pathogener Prozesse, insbesondere Herzkrankheiten wie z. B. idiopathischer
dilatativer Kardiomyopathie (DCM) über einen längeren
Zeitraum, durch Messung der sequenziell zu verschiedenen Zeitpunkten
entnommen Proben zu verfolgen. Das technische Problem wird durch
die Bereitstellung einer Zell-Linie gelöst, welche sowohl
den β1-adrenergen Rezeptor, als
auch einen cAMP-Sensor stabil exprimiert. Ein erkennbarer Nachteil
der im Stand der Technik verwendeten Verfahren, in denen cAMP-Sensoren
transient exprimiert werden, ist, dass das Expressionsniveau der
Zellen unterschiedlich ist und aufgrunddessen das Verhältnis
zwischen der Sensorkonzentration und der Konzentration der übrigen
Komponenten des Signalweges nicht konstant bleibt. Die Reaktion
der einzelnen Zellen auf Agonisten ist innerhalb eines Experiments
nicht einheitlich und die Ergebnisse sind an unterschiedlichen Messtagen
auch nur bedingt vergleichbar, da die Transfektion der Zell-Linie,
z. B. von HEK293-Zellen für jeden Messtag erneut durchgeführt
werden muss. Im Gegensatz dazu kann die erfindungsgemäß stabil
transformierte Zell-Linie verwendet werden, um pathologische Zustände
zu untersuchen, bei denen man eine mögliche vom β/β1-adrenergen Rezeptor vermittelte abnorme
cAMP-Signalgebung als pathophysiologisch relevant vorgeschlagen
hat oder ansieht. Der Krankheits- bzw. Behandlungsverlauf kann durch sequenzielle
Messungen von „Follow-up”-Proben verfolgt werden,
wobei erst die erfindungsgemäße stabil transformierte
Zell-Linie gewährleistet, dass die an verschiedenen Tagen
durchgeführte Messungen untereinander vergleichbar sind.
Solche Krankheiten umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Herzkrankheiten, umfassend infektiöse und nicht-infektiöse
Herzkrankheiten, ischämische und nicht-ischämische
Herzkrankheiten, inflammatorische Herzkrankheiten und Myocarditis,
Herzdilatation, idiopathische Kardiomyopathie, idiopathische dilatative
Kardiomyopathie (DCM), immunologische-Kardiomyopathie, und jede
Herzrhythmusstörung einschließlich ventrikulärer
und supraventrikulärer Extrasystolen, sowie atrialer Rhythmusstörungen
einschließlich Vorhofflimmern und Vorhofflattern.
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Somit
betrifft die vorliegende Erfindung eine stabil transformierte Zell-Linie,
die sowohl einen β-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor
stabil exprimiert.
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Der
Begriff „cAMP-Sensor” umfasst dabei ein chimäres
Peptid, mit einer cAMP-Bindeeinheit mit mindestens einer cAMP-Bindestelle
und mindestens einer nachweisbaren Markierung, wobei die nachweisbaren Markierungen
am Carboxy-Terminus oder am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit
lokalisiert ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst
der cAMP Sensor dabei ein chimäres Peptid mit mindestens
einer cAMP-Bindeeinheit und mit zwei nachweisbaren Markierungen,
wobei eine erste der beiden nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus
oder am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit lokalisiert ist. In
einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der cAMP-Sensor
dabei ein chimäres Peptid, mit einer cAMP-Bindeeinheit
mit nur einer cAMP-Bindestelle und zwei nachweisbaren Markierungen,
wobei eine der beiden nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus
lokalisiert ist und eine zweite der zwei nachweisbaren Markierungen
am Amino-Terminus lokalisiert ist. Der Begriff „chimäres
Peptid” bezieht sich gemäß dieser Erfindung auf
ein proteinhaltiges Fusionsprotein, umfassend eine cAMP-Bindeeinheit
und mindestens einer nachweisbaren Markierung wie hierin beschrieben.
Die erfindungsgemäß stabil transformierte Zell-Linie
ist besonders nützlich bei der direkten Bestimmung von β/β1-adrenerg vermittelten cAMP-Konzentrationen
in vitro über einen längeren Zeitraum von beispielsweise
48 Monaten, 24 Monaten, 12 Monaten, oder vorzugsweise 9 Monaten. Demzufolge
kann die vom β/β1-adrenergen
Rezeptor vermittelte cAMP-Konzentration beispielsweise nach 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 30, 36, 42 oder 48 Monaten ermittelt und unter-/miteinander
verglichen werden.
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Wie
in den beiliegenden Beispielen illustriert, zeigt eine stabil transformierte
Zell-Linie, die sowohl einen β/β1-adrenergen
Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor codiert, der ein chimäres
Peptid mit nur einer cAMP-Bindestelle enthält, die von
zwei Fluoreszenzproteinen am Carboxy- und Amino-Terminus flankiert
ist, einen mittels FRET gemessenen Änderung der cAMP-Konzentration
in vitro. Im Gegensatz zu einer transient transformierten Zell-Linie
ist die Reaktivität der stabil transformierten Zellen auf
einen Aktivator (Agonisten) wesentlich uniformer (siehe z. B. 1).
Die hierin bereitgestellte stabil transformierte Zell-Linie mit
mindestens einer cAMP-Bindungsdomäne, vorzugsweise mit
nur einer cAMP Bindestelle, ist besonders nützlich bei
der Bestimmung der β/β1-adrenerg
vermittelten Reaktionen von cAMP. Die erfindungsgemäß stabil
transformierte Zell-Linie basiert auf einer einzelnen cAMP-Bindungsdomäne
(die nur eine einzige cAMP-Bindestelle umfasst). Wie nachstehend
dokumentiert ist, ist die erfindungsgemäß stabil
transformierte Zell-Linie besonders nützlich bei der Untersuchung
von pharmakologischen Ansätzen und/oder Screening-Ansätzen.
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Im
Hinblick auf die Bedeutung des sekundären Botenstoff-Systems
von cAMP hat man mehrere in vitro Ansätze entwickelt, um
die cAMP-Spiegel zu bestimmen. Anfänglich beruhten einige
dieser Nachweismethoden auf Verfahren zum indirekten Nachweis von
cAMP, wie z. B. der Radioimmunassay (RIA), bei dem der cAMP-Gehalt
mittels anti-cAMP-Antikörper bestimmt wurden (
Kariv,
J. Biomol. Screen. 4 (1): 27–32 (1999)). Ein alternatives Verfahren,
zur Detektion von cAMP in vitro und/oder in vivo wurde unter Verwendung
eines Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)-basierendes Testsystem,
das cAMP-bindende Proteine wie z. B. Epac benutzt, entwickelt (
WO 2005/052186 ). In
diesem Testsystem wird der Fluoreszenzresonanz-Energietransfer zwischen
den fluoreszierenden Proteinen (blaugrün fluoreszierendes
Protein (CFP) und gelb-fluoreszierendes Protein (YFP), oder Varianten
davon (eCFP; eYFP)), die in eine cAMP-Bindedomäne flankieren,
genutzt.
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Wie
hierein dargestellt, bezieht sich der Begriff „cAMP-Bindedomäne
mit nur einer cAMP-Bindestelle” auf eine cAMP-Bindeeinheit,
die ziemlich klein ist (ungefähr 100 bis 200 Aminosäuren,
bevorzugt 120 bis 200, am meisten bevorzugt etwa 130 bis 180 Aminosäuren
und die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst (umfassend ungefähr
10 bis 20 Aminosäurereste, bevorzugt 12 bis 18 Aminosäurereste
und besonders bevorzugt 13 bis 15 Amimosäurereste). Alternativ
ist es vorgesehen, dass der in der erfindungsgemäßen
Zell-Linie enthaltene cAMP-Sensor mindestens eine, vorzugsweise
2 cAMP-Bindestellen beinhaltet. Es ist auch vorgesehen, dass die
in der erfindungsgemäßen stabil transformierten
Zell-Linie enthaltene cAMP-Bindeeinheit nur eine begrenzte und geringe
Zahl zusätzlicher Aminosäurereste neben der darin
enthaltenen cAMP-Bindestelle umfasst.
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Demzufolge
umfasst der cAMP-Sensor, wie er in einem chimären Peptid/Konstrukt
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nur eine cAMP-Bindestelle,
was auch vom Fachmann leicht zu erkennen ist. Wie vorstehend angeführt
worden ist, umfasst eine bevorzugte cAMP-Bindestelle 10 bis 20 Aminosäuren,
stärker bevorzugt 13 bis 15 Aminosäuren.
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Speziell
können, analog zu
WO
2005/052186 , monomolekulare cAMP-Sensoren hergestellt werden, die
nur eine cAMP Bindestelle enthalten, in denen an bestimmten Positionen
der cDNA der cAMP-Bindungsdomänen von menschlichem Epac1
(wie dargestellt in SEQ ID NO: 1), Maus-Epac2 oder der regulatorischen Untereinheit
II der Maus-PKA Fluoreszenzproteine eingesetzt werden.
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Der
Begriff „β-adrenerge Rezeptoren (β-AR)” wie
hierin verwendet bezieht sich vorzugsweise auf einen β1-adrenergen Rezeptor, der für den
Fachmann allgemein bekannt sind. So kann beispielweise die codierende
Sequenz des humanen β1-adrenergen
Rezeptors aus einer für den Fachmann bekannten Datenbank erhalten
werden. So kann beispielweise die hierin verwendete Sequenz (SEQ
ID NO: 4/SEQ ID NO: 5) des humanen β1-AR
(auch bekannt als adrenerger β1-Rezeptor
(ADRB1)) vom Datenbank Eintrag NM_000684 oder NP_000675 erhalten
werden.
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Der
Begriff „β-adrenerger Rezeptor” (β-AR),
wie hierin beschrieben, bezieht sich vorzugsweise auf β1-adrenerge Rezeptoren, wobei der β1-adrenergen Rezeptor vorzugsweise ein humaner β1-adrenerger Rezeptor ist.
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Wie
vorstehend diskutiert, ist der β1-adrenerge
Rezeptor in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform
der stabil transformierten Zell-Linie der Erfindung aus der unten
aufgeführten Gruppe ausgewählt. Der bevorzugte β1-adrenerge Rezeptor ist ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus:
- (a) einem Polypeptid,
umfassend eine Aminosäuresequenz die durch ein Nukleinsäuremolekül
codiert wird, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4
- (b) einem Polypeptid das die Aminosäuresequenz hat,
wie dargestellt in SEQ ID NO: 5
- (c) einem Polypeptid, das von einem Nukleinsäuremolekül
codiert wird, das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz
codiert, wie dargestellt in SEQ ID NO: 5
- (d) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz,
die durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird,
das unter stringenten Bedingungen zu dem komplementären
Strang der Nukleinsäure, wie definiert in (a) oder (c)
hybridisiert, wobei dieses Nukleinsäuremolekül
einen β-adrenergen Rezeptor oder ein funktionelles Fragment
davon codiert;
- (e) einem Polypeptid, die von einem Nukleinsäuremolekül
codiert wird, das eine Aminosäuresequenz codiert, das zumindest
zu 70% identisch ist mit einem Polypeptid wie definiert in (a) bis
(d) und ein β-adrenerger Rezeptor ist;
- (f) einem Polypeptid gemäß (a) bis (e), wobei
zumindest eine Aminosäure deletiert, ausgetauscht, eingefügt oder
hinzugefügt, wobei das Polypeptid oder ein fuktionelles
Fragment davon ein β-adrenerger Rezeptor ist;
- (g) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz,
die durch eine Nukleinsäure codiert wird, die zu einer
Nukleinsäuresequenz wie definiert in (a), (c) und (d) degeneriert
ist.
- (h) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, das
von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das eine
Aminosäuresequenz codiert wie hinterlegt mit der Nummer
DSM ACC 2985.
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Diese
Konstrukte sind auch besonders nützlich in den hierin bereitgestellten
Verfahren und können in den nachstehend beschriebenen Kits
enthalten sein.
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Nach
Transfektion, Selektion und Vereinzelung wurde FRET in der stabil
transformierten Zell-Linie gemessen wie es nachstehend ausführlicher
beschrieben ist. Zugabe eines Akivators, wie z. B. Isoprenalin führte zu
einer Abnahme von FRET zwischen den Fluorophoren, was auf eine cAMP-induzierte
Konformationsänderung hindeutet, die zu einer Vergrößerung
der Distanz zwischen den Fluorophoren führte.
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In Übereinstimmung
mit dem Vorstehenden erleichtert die stabil transformierte Zell-Linie,
die neben dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid einen β/β1-adrenergen Rezeptor exprimiert, den Nachweis
einer Konformationsänderung innerhalb des chimären
Peptids der Erfindung auf die Bindung von cAMP hin, was wiederum
zu einer Veränderung der Lichtintensität führt,
die von den nachweisbaren Markierungen ausgesendet wird. Somit stellt
die erfindungsgemäße, stabil transformierte Zell-Linie
ein Testsystem dar, das besonders geeignet ist, die vom β/β1-adrenergen Rezeptor vermittelten cAMP-Spiegel
zu messen.
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Wie
in den Beispielen illustriert, kann zu der wie nachstehend definierten
stabil transformierten Zell-Linie ein Aktivator (Agonist) hinzugegeben
werden und man kann die cAMP-Konzentration in dieser Zell-Linie nach
Zugabe des Aktivators durch Aufzeichnen von FRET oder BRET (Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer)
graphisch verfolgen. In einer weiteren Ausführungsform
kann in den hierein beschriebenen Verfahren der cAMP-Gehalt von
einer unbekannten Substanz oder Verbindung gemessen werden, und
mit dem cAMP-Gehalt einer Standardkurve (z. B. vom Aktivator) verglichen
werden, wodurch anschließend der durch den Aktivator vermittelte
cAMP-Gehalt mit dem cAMP-Gehalt einer unbekannten Verbindung oder
Substanz in Relation gesetzt werden kann. Somit stellt die Verwendung
der vorliegenden Zell-Linie eine allgemein anwendbare, auf Fluoreszenz
basierende Technik zur zuverlässigen, uniformen und sequenziellen
Bestimmung von cAMP in der stabil transformierten Zell-Linie dar.
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Wie
nachstehend dargelegt ist, stellt die vorliegende Erfindung darüber
hinaus Verfahren zur Identifizierung und zum Screening von Molekülen
und Verbindungen bereit, die in der Lage sind, durch die Bindung an
den β/β1-adrenergen Rezeptor
den Gehalt von cAMP und somit die biologische und/oder pharmakologische Funktion
von β/β1-adrenergen Rezeptoren
zu modifizieren.
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Insbesondere
entwickelten die Erfinder eine stabil transformierte Zell-Linie
für die Bestimmung des intrazellulären cAMP-Spiegels
in Zellen der stabil transformierten Zell-Linie nach Applikation
eines β/β1-Agonisten,
welches die Nachteile der transient transformierten Zell-Linie überwindet,
die im Stand der Technik beschrieben ist.
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Wie
vorstehend diskutiert, ist es unter der Verwendung der stabil transformierten
Zell-Linie, vorzugsweise mit nur einer cAMP-Bindestelle mit einer
hohen Affinität, möglich den β/β1-adrenerg vermittelten cAMP-Gehalt über
einen längeren Zeitraum (z. B. von mehreren Monaten) sequentiell
(longitudinal) reproduzierbar zu messen.
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Der „Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer
(FRET)” wie hierin verwendet bezieht sich auf einen nicht-strahlenden
Transfer von Anregungsenergie von einem Donor (erster dem Nachweis
dienender Teil) auf einen Akzeptor (zweiter dem Nachweis dienender
Teil). Die Konformationsänderung der cAMP-Bindeeinheit auf
die Bindung von cAMP hin führt zu einer nachweisbaren Veränderung
des FRET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen. Falls FRET
zum Beispiel erhöht ist, nimmt der Emission-Peak des Akzeptors
zu und der Emission-Peak des Donors ist verringert. Demnach ist
das Verhältnis der Emissionsintensität des Akzeptors
zu der des Donors ein Hinweis auf die Höhe des FRET zwischen
den dem Nachweis dienenden Teilen. Die Konformationsänderung
des chimären Peptids der Erfindung auf die Bindung von
cAMP führt zu einer einer Zunahme der Distanz zwischen
den dem Nachweis dienenden Teilen.
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Der
Begriff „chimär” wie hierin verwendet
bezieht sich auf ein Molekül, das Sequenzen enthält,
die von zwei, drei oder mehr verschiedenen Genen abgeleitet worden
sind, die von einer, zwei, drei oder mehr verschiedenen Spezies
abgeleitet sein können.
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Der
Begriff „Peptid” wie hierin verwendet bezieht
sich auf ein Polypeptid oder ein Protein, das aus Aminosäuren
zusammengesetzt sein kann, die durch Peptidbindungen oder modifizierte
Peptidbindungen, d. h. Peptidisostere miteinander verbunden sind
und die andere als die 20 Gen-codierten Aminosäuren enthalten können.
Die Polypeptide können entweder durch natürliche
Prozesse wie z. B. durch post-translationelle Prozessierung modifiziert
werden oder durch chemische Modifikationsmethoden, die auf dem Fachgebiet
wohlbekannt sind. Solche Modifikationen sind in Grundlagentexten
und in ausführlicheren Monographien gut beschrieben, ebenso
wie in einer umfangreichen Forschungsliteratur. Modifikationen können
an beliebigen Stellen in einem Polypeptid vorkommen, wozu das Peptidgerüst,
die Aminosäureseitenketten und die Amino- oder Carboxy-Termini
gehören. Es ist ersichtlich, dass dieselbe Art von Modifikationen
in gleichen oder unterschiedlichen Maßen an mehreren Stellen
in einem vorgegebenen Polypeptid vorliegen kann. Ein vorgegebenes
Polypeptid kann auch viele Arten von Modifikationen enthalten. Polypeptide
können verzweigt sein, zum Beispiel infolge von Ubiquitinierung,
und sie können zyklisch sein, mit oder ohne Verzweigung.
Zyklische, verzweigte und zyklische verzweigte Polypeptide können
aus natürlichen posttranslationalen Prozessen herrühren
oder durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Modifikationen
umfassen Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung,
kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer Häm-Gruppe,
kovalente Bindung eines Nukleotids oder eines Nukleotidderivats,
kovalente Bindung eines Lipids oder eines Lipidderivats, kovalente
Bindung von Phosphatidylinosit, Vernetzung, Zyklisierung, Bildung
von Disulfidbindungen, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzungen,
Bildung von Cystein, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gammacarboxylierung,
Glycosylierung, Bildung von GPI-Ankern, Hydroxylierung, Jodierung,
Methylierung, Myristylierung, Oxidation, Pegylierung, proteolytische
Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung,
Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Hinzufügung von
Aminosäuren zu Proteinen wie z. B. Arginylierung und Ubiquitinierung.
(siehe z. B. Seiter, Meth. Enzymol. 182: 626–646
(1990); Rattan, Ann NY Acad Sci 663: 48–62
(1992)).
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Der
Begriff „chimäres Peptid” oder der Begriff „cAMP-Sensor” wie
hierin verwendet bezieht sich auf Polypeptid- oder Protein-Konstrukte,
die das Ergebnis der Kombination mehrerer Proteine, Proteindomänen und/oder
Linkersequenzen zum Zweck des Erreichens der kombinierten Funktionen
der Domänen und/oder Linkersequenzen sind, wie nachstehend
ausführlicher dargelegt ist. Dies kann durch molekulare
Klonierung der Nukleotidsequenzen erreicht werden, die solche Domänen
codieren, um eine neue Polynukleotidsequenz zu erzeugen, die das
gewünschte chimäre Peptid wie hierin verwendet
codiert. Alternativ lässt sich die Erzeugung eines chimären
Peptids durch chemisches Verbinden von zwei oder mehr Proteinen
bewerkstelligen.
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Speziell
kann der Begriff „chimäres Peptid” oder
der Begriff „cAMP-Sensor” wie hierin verwendet
die Struktur A-B-C umfassen, wobei A eine erste nachweisbare Markierung
darstellt, B eine cAMP-Bindeeinheit mit nur einer cAMP-Bindestelle
darstellt und C eine zweite nachweisbare Markierung darstellt. Zum
Beispiel kann die cAMP-Bindeeinheit von der regulatorischen Untereinheit
(R) einer cAMP-abhängigen Proteinkinase (wie z. B. PKA)
sein, von einem Guanin-Nukleotidaustauschfaktor (z. B. Epac), einem
Katabolit-Genaktivator-Protein aus E. coli, einem durch cAMP gesteuerten
Ionenkanal, einem durch ein zyklisches Nukleotid gesteuerten Kanal
(z. B. HCN), der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) oder dem cAMP-Rezeptor
von Dictyostelium. Bevorzugt ist die cAMP-abhängige Proteinkinase
PKA, der Guanin-Nucleotidaustauschfaktor Epac1 oder Epac2, der von
einem zyklischen Nukleotid gesteuerte Kanal HCN2 (durch Hyperpolarisierung
aktivierter durch zyklische Nukleotide gesteuerter K+-Kanal),
das katabole Genaktivator-Protein ist von E. coli abgeleitet, der
durch cAMP gesteuerte Ionenkanal ist vom Menschen abgeleitet, die
Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) ist vom Menschen abgeleitet und
der cAMP-Rezeptor ist von Dictyostelium. Was PKA anbelangt, können
die regulatorischen Untereinheiten von PKA I alpha-A oder B; PKA
I beta A oder B; PKA II alpha A oder B oder PKA II beta A oder B
verwendet werden. Noch stärker bevorzugt sind PKA, Epac1
oder Epac2 von menschlichem Ursprung, von Maus oder von Ratte.
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Der
Begriff „und/oder” wie er hierin verwendet wird,
umfasst die Bedeutung von „und”, „oder” insgesamt
oder jede andere Kombination der Elemente, die durch diesen Begriff
verknüpft sind.
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Der
Begriff „mindestens zwei nachweisbare Markierungen” wie
hierin verwendet bedeutet, dass das chimäre Peptid der
Erfindung zwei, drei, vier, fünf oder mehr nachweisbare
Markierungen umfassen kann, am meisten bevorzugt sind jedoch Konstrukte,
die zwei nachweisbare Markierungen enthalten. Die nachweisbaren
Markierungen werden hierin nachfolgend ausführlich beschrieben
und können insbesondere Fluoreszenzproteine ebenso wie
bin-lumineszente Substanzen umfassen. Gemäß
WO 2005/052186 sind
jedoch zwei nachweisbare Markierungen auf einem chimären
Peptid der Erfindung am meisten bevorzugt.
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Die
Begriffe „Amino-Terminus” oder „Carboay-Terminus” wie
hierein verwendet beziehen sich auf den Amino-Terminus und den Carboay-Terminus
der cAMP-Bindeeinheit des chimären Peptids.
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Bei
dem Begriff „nachweisbare Markierung” handelt
es sich bevorzugt um fluoreszente Markierungen oder um biolumineszente
Markierungen. Die nachweisbaren Markierungen umfassen auch genetisch
codierte und an technisch bearbeiteten Stellen bindende Markierungen
(FlAsH-Technologie; siehe unter anderem Adams, J. Am. Chem.
Soc. 124: 6063–6076 (2002) oder Griffin,
Meth. Enzymol. 327: 565–578 (2000).
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Wie
hierin diskutiert ist die erfindungsgemäße stabil
transformierte Zell-Linie besonders nützlich bei der Bestimmung
des cAMP-Gehaltes. Demzufolge ermöglichen die dem Nachweis
dienenden Teile/Markierungen, die in dem chimären Peptid
der Erfindung vorhanden sind, den Nachweis einer Konformationsänderung innerhalb
des chimären Peptids hin, was wiederum ein Hinweis auf
eine Veränderung der emmitierten Lichtintensität
des Konstrukts ist. Zum Beispiel kann der wie vorstehen definierten
stabil transformierten Zell-Linie eine Substanz oder Verbindung
hinzugefügt werden und die Änderung des cAMP Gehaltes
durch das Messen und/oder Erfassen von FRET oder BRET erfolgen,
indem man die Intensitäten der Fluoreszenzemissionen mit einer
Standardkurve vergleicht, die unter Abwesenheit der Verbindung/Substanz
gemessen wurde. Alternativ kann eine solche Standardkurve auch unter
der Verwendung eines Aktivators (Agonisten) erhalten werden. Wie
die Beispiele zeigen kann Isoprenalin als ein Aktivator (Agonist)
von Gs-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine Erhöhung von
cAMP in der Zelle induzieren. Direkte Aktivatoren, welche zur Gruppe
der Katecholamine gehören, erzeugen ein nachweisbares FRET-Signal.
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Stärker
bevorzugt handelt es sich bei dem verwendeten Aktivator (Agonist)
um Noradrenalin, Adrenalin, Isoprenalin, Denopamin, Dobutamin.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem
verwendeten Katecholamin um Isoprenalin.
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Bei
der Probe, wie sie hierin definiert ist, kann es sich zum Beispiel
um eine Zelle handeln, um ein Zell-Lysat, einen Rohextrakt von Zellen,
eine Membranpräparation, ein Gewebe oder Bioflüssigkeiten.
Bioflüssigkeiten wie hierin verwendet beziehen sich bevorzugt
auf Körperflüssigkeiten wie z. B. Samen, Lymphe,
Seren, Plasma, Urin, Gelenkflüssigkeit oder Liquor.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probe Blut,
Plasma oder Serum. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird eine weitere Aufreinigung der hierin beschriebenen Probe durchgeführt. Insbesondere
wird eine Aufreingung der ImmunglobulinG-Fraktion durch Caprylsäurefällung
und/oder Antikörper bindende Aufreinigungssäulchen
bevorzugt.
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In
einer Ausführungsform der stabil transformierten Zell-Linie
sind diese Nachweismarkierungen Teile eines geteilten fluoreszierenden
Proteins (CAMP-Sensors). Bevorzugt handelt es sich bei diesem geteilten
fluoreszierenden Protein um ein geteiltes grün fluoreszierendes
Protein (geteiltes GFP). Der Begriff „grün fluoreszierendes
Protein” oder „GFP”, wie überall
in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich auf das GFP,
das ursprünglich von Prasher (Prasher, Gene 111:
229–233 (1992)) aus Aequorea victoria cloniert
worden ist, und Mutanten davon, die GFP-Aktivität zeigen.
Der Begriff „GFP-Aktivität” bezieht sich
auf die bekannten Eigenschaften eines GFP, d. h. Fluoreszenzemission
auf Anregung mit einem geeigneten Licht hin, die Fähigkeit
zu autokatalytischer Reifung, was Faltung in Tertiärstruktur
und die Bildung des Chromophors beinhaltet sowie die Unabhängigkeit
von irgendwelchen Cofaktoren oder der Versorgung mit metabolischer
Energie um die Fluoreszenz ebenso wie die autokatalytische Reifung
durchzuführen. Diese Eigenschaften sind auf dem Fachgebiet
wohlbekannt und sind zum Beispiel in einem Übersichtsartikel
von Tsien (Tsien, Ann. Rev. Biochem. 67: 509–544
(1998)) dargestellt. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung kann, sofern nichts Anderweitiges angegeben ist, jede
nachweisbare Emissionwellenlänge einer GFP-Mutante nützlich
sein, um das chimäre Peptid der Erfindung anzuwenden. Im
Stand der Technik sind viele GFP-Mutanten beschrieben, in denen
spezifische Aminosäurereste substituiert sind, was sich
in einer verbesserten Fluoreszenzeffizienz und/oder einer verschobenen
Anregungs- und/oder Emissionswellenlänge auswirkt (siehe
z. B. Heim, Meth. Enymol. 302: 408–423 (1999); Heikal,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 11996–12001 (2000)).
So kann insbesondere die Mutation von Glutamin an Position 69 zu
Methionin die inhärente pH- und Halogenid-Sensitivität von
eYFP verringern (Griesbeck, J. Biol. Chem. 276: 29188–29194
(2001)). Demnach ist es, falls eYFP oder ein Derivat davon,
das im Wesentlichen dasselbe Anregungs- und Emissionsspektrum aufweist,
als ein dem Nachweis dienender Teil des Fusionsproteins der Erfindung
verwendet wird, bevorzugt, dass das eYFP oder das Derivat davon
diese Mutation aufweist. Dennoch ist, wie es in den beigefügten
Beispielen gezeigt ist, YFP gemäß dieser Erfindung
ebenfalls nützlich. Beispiele für GFP-Mutanten,
die für die Anwendung der Erfindung nützlich sind,
schließen verstärktes gelb fluoreszierendes Protein
((e)YFP), verstärktes blaugrün fluoreszierendes
Protein ((e)CFP), (verstärktes) blau fluoreszierendes Protein
((e)BFP), verstärktes grün fluoreszierendes Protein
((e)GFP), dsRed, Citrin und Saphir ein. Innerhalb des Gültigkeitsbereichs
der vorliegenden Erfindung kann jede beliebige GFP-Mutante oder
funktionelles Analog von GFP verwendet werden. In einer alternativen Ausführungsform
kann innerhalb des Gültigkeitsbereichs der vorliegenden
Erfindung jede beliebige GFP-Mutante oder funktionelles Analog von
GFP verwendet werden, solange es Fluoreszenzaktivität zeigt.
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Bevorzugt
sind solche GFP-Varianten/Mutanten von einem Nukleinsäuremolekül
codiert, das, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, mit der Nukleotidsequenz
hybridisiert, die das Wildtyp-GFP codiert, oder mit Polynukleotiden,
die Varianten/Mutanten codieren wie die in
WO 2005/052186 dargestellten Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind
diese GFP-Mutanten/Varianten verstärktes blaugrün fluoreszierendes
Protein (eCFP) und verstärktes gelb fluoreszierendes Protein
(eYFP).
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In
diesem Kontext bedeutet der Begriff „Hybridisierung” unter üblichen
Hybridisierungsbedingungen. Diese können niedrig stringente,
bevorzugt stringente (d. h. hoch stringente) Hybridisierungsbedingungen sein,
wie z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, a. a. O. beschrieben. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform bedeutet der Begriff „Hybridisierung”,
dass die Hybridisierung unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen” stattfindet,
was sich auf eine Übernachtinkubation bei 42 Grad Celsius
bezieht, in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC
(750 mM NaCl, 75 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH
7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und
20 μg/ml denaturierte, einem Scherprozess unterzogene Lachsrogen-DNA
enthält, gefolgt von Waschen der Filter in 0,1 × SSC
bei etwa 65 Grad Celsius.
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Der
Begriff „geteiltes fluoreszierendes Protein” bezieht
sich auf ein fluoreszierendes Protein, dessen Aminosäuresequenz
in zwei Teile geteilt ist, wobei das geteilte fluoreszierende Protein
auf Grund einer sekundären räumlichen Verbindung
dieser Teile eine dreidimensionale Struktur annimmt, die es ihm
ermöglicht, Fluoreszenz zu emittieren, wenn es durch Licht
einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird. Es wird zum
Beispiel in Erwägung gezogen, dass es sich bei dem geteilten
fluoreszierenden Protein um ein geteiltes GFP handelt, wie es von
Baird (Baird, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96: 11241–11246
(1999)) beschrieben worden ist. Gemäß den
Lehren des Stands der Technik ist es für einen Fachmann
auf dem Gebiet möglich, ein GFP in zwei geteilte GFP-Teile
zu teilen um diese zu dem chimären Peptid der Erfindung
zu fusionieren. Es ist des Weiteren vorstellbar, dass andere fluoreszierende
Proteine als GFP, z. B. diejenigen, die nachstehend erwähnt
sind, geteilt werden können, so dass sie auf dieselbe Weise
wie das hierin beschriebene geteilte GFP zwei dem Nachweis dienende
Teile darstellen.
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In
einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
handelt es sich bei der ersten Nachweismarkierung um einen Energie
emittierenden und fluoreszierenden Proteinteil und bei der zweiten
Nachweismarkierung um eine fluoreszierende Protein-Markierung oder
anders herum. In Verbindung mit dieser Ausführungsform
ist es nicht wichtig, auf welchem Teil des chimären Peptids
der erste dem Nachweis dienende Teil in Bezug auf den anderen hierin
definierten Teil lokalisiert ist, d. h. ob die Nachweismarkierung
am Amino- oder am Carboxy-Terminus der cAMP-Bindeeinheit des chimären
Peptids der Erfindung lokalisiert ist, ob sie direkt fusioniert
ist oder über einen Linker wie vorstehend ausgeführt.
Wie vorstehend diskutiert kann eine der Nachweismarkierungen auch
innerhalb der cAMP-Bindeeinheit/Domäne platziert sein,
wie hierin beschrieben ist. Der Begriff „Messen oder Nachweisen
einer Änderung der Lichtintensität” bezieht
sich auf nachweisbare Markierungen (Proteine), die zur Emission
von Strahlungsenergie fähig sind, die (i) Energie in einer
geeigneten Form aufnehmen können und (ii) zumindest einen
Teil dieser Energie durch Resonanz-Energietransfer (RET) auf die
zweite Nachweismarkierung übertragen können, die
ein Teil eines fluoreszierenden Proteins ist, welches dadurch zur
Emission von Energie angeregt wird. Die Form der Energieaufnahme
kann auf eine beliebige Art und Weise vor sich gehen, die für
den Fachmann auf dem Gebiet vorstellbar ist, und kann z. B. eine
chemische Reaktion (Chemilumineszenz oder Biolumineszenz) oder die
Absorption von Strahlung (Fluoreszenz oder Phosphoreszenz) beinhalten.
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Der
Begriff „Teil eines fluoreszierenden Proteins” bezieht
sich auf Proteine, die in der Lage sind, zu fluoreszieren, d. h.
Energie von Strahlung einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren,
z. B. ultraviolettes oder sichtbares Licht, und diese Energie oder
einen Teil davon durch Strahlung zu emittieren, wobei die emittierte
Strahlung eine längere Wellenlänge hat als die
anregende Strahlung. Es gibt viele Beispiele von fluoreszierenden
Proteinen, die in der Literatur beschrieben sind, die in Verbindung
mit der vorliegenden Erfindung nützlich sein können,
wie z. B. die vorstehend erwähnten GFPs, fluoreszierende Proteine
aus nicht-biolumineszenten Organismen der Klasse Anthozoa (
WO 00/34318 ,
WO 00/34319 ,
WO 00/34320 ,
WO 00/34321 ,
WO 00/34322 ,
WO 00/34323 ,
WO 00/34324 ,
WO 00/34325 ,
WO 00/34326 ,
WO 00/34526 ) oder das fluoreszierende
Protein bmFP aus Photobacterium phosphoreum (
Karatani, Photochem.
Photobiol. 71: 230 (2000)). Bevorzugt sind jedoch fluoreszierende
Proteine, die ein eYFP und eCFP sind, wie sie in den beigefügten
Beispielen verwendet werden.
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Der
Begriff „Fluoreszenz Resonanz-Energietransfer” (FRET)
bezieht sich wie vorstehend angegeben auf einen nicht durch Strahlung
ablaufenden Transfer von Anregungsenergie von einem Donor- (erster
dem Nachweis dienender Teil) auf ein Akzeptor-Molekül (zweiter
dem Nachweis dienender Teil) (Heyduk, Curr. Opin. Biotechnol.
13 (4): 292–6 (2002); Truong, Curr. Opin.
Struct. Biol. 11 (5): 573–8 (2001); Issad,
Diabetes Metab. 29 (2 Pt 1): 111–7 2003); Boute,
Trends Pharmacol. Sci. 23 (8): 351–4 (2002)).
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Darüber
hinaus können FRET oder BRET wie in den folgenden Figuren
und Beispielen gezeigt bestimmt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der stabil transformierten
Zell-Linie bindet die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit cAMP
mit hoher Affinität. Bevorzugt bindet die cAMP-Bindestelle
der cAMP-Bindeeinheit cAMP mit einem Kd im
Bereich von 1 nM bis 50 μM, stärker bevorzugt
im Bereich von 1 nM bis 50 μM, stärker bevorzugt
im Bereich von 5 nM bis 40 μM, stärker bevorzugt
im Bereich von 100 nM bis 30 μM, stärker bevorzugt
im Bereich von 200 nM bis 20 μM.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform der stabil transformierten
Zell-Linie ist die cAMP-Bindeeinheit des chimären Peptids
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der regulatorischen
Untereinheit (R) einer cAMP-abhängigen Proteinkinase, einem
Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, einem Katabolit-Genaktivator-Protein,
einem cAMP-gesteuerten Ionenkanal, einem durch ein zyklisches Nukleotid
gesteuerten Ionenkanal, der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) und
dem cAMP-Rezeptor von Dictyostelium.
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Die
Familie der cAMP-bindenden Proteine umfasst mehr als zehn Proteinsequenzen,
die Proteine mit bekannten Funktionen codieren, ebenso wie mehrere
Sequenzen, die von einer Suche in Datenbanken nach potenziellen
Bindungsstellen für zyklische Nukleotide abgeleitet sind
(Dremier, FEBS Lett. 546 (1): 103–7 (2003)).
Bis 1998, als Epac1 kloniert und charakterisiert wurde (de
Rooij, Nature 396 (6710): 474–7 (1998)), war Proteinkinase
A (PKA) als ein einzigartiger cAMP-Effektor in der Zelle allgemein
anerkannt. Nach heutigem Kenntnisstand binden mehrere Proteine cAMP
und regulieren Zellfunktionen, z. B. Epac1 und 2, durch zyklische
Nukleotide gesteuerte Kanäle (CNGC), kataboles Genaktivatorprotein
in E. coli (CAP), Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE). Man hat eine
Reihe von Sequenzen identifiziert, die Proteine mit potenzieller cAMP-Bindungsaktivität
codieren, aber deren Funktion bleibt schwer fassbar: ein EST-Sequenz
von Maus-Embryo (AI595216), die menschliche Sequenz KIAA0313 (AB002311),
die Sequenz Im493605 (Dremier, FEBS Lett. 546 (1): 103–7
(2003)). Wie es einem Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich
ist, können auch diese Sequenzen für die Konstruktion
des chimären Peptids der Erfindung verwendet werden.
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Bevorzugt
stammt die cAMP-Bindeeinheit von PKA, Epac1, Epac2, dem Katabolit-Genaktivator-Protein
von E. coli, dem cAMP-gesteuerten Ionenkanal, sowie HCN2 (durch
Hyperpolarisierung aktivierter durch zyklische Nukleotide gesteuerter
K+-Kanal 2), Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE)
und dem cAMP-Rezeptor von Dictyostelium. Die cAMP-Bindeeinheit von
PKA, Epac1, Epac2 oder HCN2 ist bevorzugt menschlichen oder murinen
Ursprungs. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt
die cAMP Bindeeinheit von Epac1 von menschlichem Ursprung wie hierein
dargestellt unter SEQ ID NO: 1. Die cAMP-Bindeeinheit wie hierin
verwendet entspricht bevorzugt den Aminosäuresequenzen,
die in den folgenden Sequenzen des Sequenzprotokolls gezeigt sind;
die Aminosäurereste 203 bis 323 oder bevorzugt 157 bis
316 von Epac1 (SEQ ID NO: 1). Ferner ist dem Fachmann bekannt das
Epac1 zusätzlich am N-terminalen Bereich der Aminosäuresequenz
(wie hierin dargestellt als SEQ ID NO: 1) eine Polypeptidsequenz
umfassen kann wie in dem Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 8 gezeigt.
So kann beispeilsweise die hierin verwendete Epac1 Sequenz (SEQ
ID NO: 1) zuzüglich eine N-terminalen Polypeptidsequenz
(SEQ ID NO: 8) umfassen und vom Datenbankeintrag NM_001098531 erhalten
werden.
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Die
der Veranschaulichung dienenden, beispielhaften hierin verwendeten
chimären Peptide/Konstrukte sind auch in dem beigefügten
Sequenzprotokoll dokumentiert. Demzufolge bezieht sich SEQ ID NO:
3 oder SEQ ID NO: 7 auf ein chimäres Konstrukt, das eine
cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst
und von Epac1 abgeleitet ist (Aminosäuren E157–E316).
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform des chimären
Peptids der Erfindung sind die nachweisbaren Markierungen fluoreszierende
Markierungen, biolumineszierende Markierungen oder biarsensiche-Markierungen
(Jahnke, Chembiochem. 3 (2–3): 167–173
(2002)). Bevorzugt sind diese fluoreszierenden Markierungen
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GFP, YFP, CFP,
BFP, Cytrin, Saphir und dsRed, FIAsH, ReAsH, oder Derivate davon.
Die biolumineszierende Markierung ist bevorzugt Luciferase, wie
z. B. Renilla-Luciferase oder Glühwürmchen-Luciferase.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist enthält
die hierin beschriebene stabil transformierte Zell-Linie fluoreszierenden
Markierungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend
aus GFP, YFP, CFP, BFP, Citrin, Saphir und dsRed, FIAsH, ReAsH,
oder wobei die biolumineszierenden Markierungen Luciferase (wie z.
B. Renilla-Luciferase oder Glühwürmchen-Luciferase)
ist.
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Wie
vorstehend diskutiert ist die cAMP-Bindeeinheit in einer am meisten
bevorzugten Ausführungsform des chimären Peptids
der Erfindung aus der unten folgenden Gruppe ausgewählt.
Die bevorzugte cAMP-Bindeeinheit ausgewählt ist aus der
Gruppe bestehend aus:
- (a) einer cAMP-Bindeeinheit
eines Polypeptides wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO:
6; und
- (b) einer cAMP-Bindeeinheit, die zumindest zu 70% mit der cAMP-Bindeeinheit
mit der cAMP-Bindeeinheit von (a) identisch ist.
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In
einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform ist der cAMP-Sensor
als chimäres Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe
bestehend aus:
- (a) einem chimären
Peptid, das von einem Nukleinsäuremolekül wie
dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 codiert;
- (b) einem chimären Peptid, das von einer Aminosäuresequenz
wie dargestellt in einem der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 7;
- (c) einem chimären Peptid, das von einem Nukleinsäuremolekül
codiert wird, das ein Polypeptid codiert, das zumindest zu 70% identisch
ist mit einem Polypeptid wie definiert in (a) oder (b) und zur direkten
Bestimmung der cAMP Konzentration verwendet werden kann;
- (d) einem chimären Peptid, das eine Aminosäuresequenz,
das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird,
das eine Aminosäuresequenz codiert wie hinterlegt mit der
Nummer DSM ACC 2985; und
- (e) einem chimären Peptid, das durch ein Nukleinsäuremolekül
codiert wird, das zu einer DNA-Sequenz, wie definiert in (a) und
(c) degeneriert ist.
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Diese
Konstrukte sind auch besonders nützlich in den hierin bereitgestellten
Verfahren und können in den nachstehend beschriebenen Kits
enthalten sein.
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Der
Begriff „Nukleinsäuremolekül” wie
hierin verwendet bedeutet DNA oder RNA oder beide in Kombination
oder eine beliebige Modifikation davon, die im Stand der Technik
bekannt ist (siehe z. B.
US 5,525,711 ,
US 4,711,955 ,
US 5,792,608 oder
EP 302175 für Beispiele für
Modifikationen). Ein solches (solche) Nukleinsäuremolekül(e)
ist (sind) einzel- oder doppelsträngig, linear oder ringförmig
und ohne jede Größenlimitierung. Die Nukleinsäuremoleküle
der Erfindung können zum Beispiel aus natürlichen
Quellen gewonnen werden oder können synthetisch oder mittels
rekombinanter Methoden hergestellt werden, wie z. B. durch PCR.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäuremoleküle
der Erfindung DNA-Moleküle, speziell genomische DNA oder
cDNA, oder RNA-Moleküle. Bevorzugt ist das Nukleinsäuremolekül
als doppelsträngige DNA. Speziell sind die in
WO 2005/052186 offenbarten Nukleinsäuremoleküle,
die Polypeptidsequenzen codieren, die in den SEQ ID NOs: 8 bis 20,
d. h. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und/oder 20 sowie
den Polypeptidsequenzen SEQ ID NOs: 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53,
55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73 im weiteren Sinne der
Erfindung bevorzugt.
-
Das
Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz
umfasst, die es codiert, ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül,
d. h. ein Nukleinsäuremolekül, das mittels einer
Technik hergestellt worden ist, die nützlich ist, um Nukleinsäuremoleküle
oder Teile davon künstlich zu kombinieren, die vorher nicht
wie in dem so erhaltenen chimären Peptid verknüpft
waren. Geeignete Methoden sind zum Beispiel im Stand der Technik
verfügbar, wie durch Sambrook und Russell (2001),
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press und Ausubel, Current
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and
Wiley Interscience, N. Y. (1989) ebenso wie Vilardaga,
Biotechniques 18: 605–606 (1995) dargestellt.
Darüber hinaus sind die entsprechenden Methoden in den
beigefügten Beispielen erläutert. Diese Methoden
umfassen insbesondere Orts-spezifische Mutagenese.
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Für
die Konstruktion des chimären Peptids kann eine Polynukleotidsequenz
verwendet werden, die eine cAMP-Bindeeinheit codiert, wobei die
Polynukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens
70%, 80%, 90% oder 95% mit einer Nukleotidsequenz aufweist, welche
die cAMP-Bindeeinheit einer Polypeptidsequenz codiert wie sie in
den vorstehend aufgeführt enthalten ist. Mit einer Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz aufweist, die eine Sequenzidentität
von zum Beispiel mindestens 95% zu einer in der vorliegenden Erfindung
beschriebenen Nukleotidsequenz hat, ist es beabsichtigt, dass die
Nukleinsäure identisch mit der Referenzsequenz ist, außer
dass die Nukleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro
jeweils 100 Nukleotide der Referenznukleotidsequenz enthalten kann,
die das Polypeptid codiert. In anderen Worten, um eine Nukleinsäure
zu erhalten, die eine Nukleotidsequenz hat, die eine Sequenzidentität
von mindestens 95% zu einer Referenznukleotidsequenz aufweist, dürfen
bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz deletiert oder mit
einem anderen Nukleotid ausgetauscht sein, oder es kann eine Zahl
von Nukleotiden von bis zu 5% der Gesamtnukleotide in der Referenzsequenz
in die Referenzsequenz eingefügt werden.
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Wie
vorstehend dargelegt worden ist, ist der Fachmann auf dem Gebiet
leicht dazu in der Lage, aus einer vorgegebenen Aminosäuresequenz
oder einer vorgegebenen Nucleotidsequenz eine „cAMP-Bindeeinheit/Domäne” und/oder
die cAMP-Bindestelle abzuleiten. Entsprechende Verfahren umfassen
unter anderem das Verfahren, das in
Dremier, FEBS Letters
546: 103–107 (2003);
Rehmann, Nat. Struct.
Biol. 10: 25–32 (2003) oder
Kawasaki,
Science 282: 2275–2279 (1998) offenbart worden
ist. Die entsprechenden Verfahren umfassen demzufolge Datenbank-Suchen,
entweder allein oder in Kombination mit biologischen und/oder biochemischen
Assays, z. B. Restriktionsenzymverdau-Assays (und folgende Bindungsstudien
von exprimierten Proteinabschnitten/fragmenten an cAMP in vitro
und in vivo), Bindungsassays, Kompetitionsassays (zum Beispiel mit
markiertem, z. B. radioaktivem cAMP) und dergleichen. Man sollte
beachten, dass eine „cAMP-Bindestelle” in der
Literatur auch als „PBC” oder „Phosphatbindungskassette” bekannt
ist. Eine entsprechende „cAMP-Bindestelle” kann
mit Hilfe von analogen Verfahren abgeleitet werden und umfasst normalerweise
einen relativ kurzen Abschnitt von Aminosäureresten (bevorzugt
zwischen 13 und 15 Aminosäuren, meistens 14 und beginnt
normalerweise mit „F” (Phenylalanin) und endet
mit einem „A” (Alanin); siehe auch
14 von
WO
2005/052186 oder
Rehmann (2003), a. a. O.).
Ein bevorzugtes Computerprogramm im Zusammenhang mit der Bestimmung
von funktionellen Teilen einer gegebenen Aminosäuresequenz
ist TBLASTN; siehe auch den Algorithmus, der von
Dremier
(2003), a. a. O. bekannt ist).
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Wie
die Bestimmung von „cAMP-bindenden Domänen/Einheiten” und/oder „cAMP-Bindestellen” kann auch
die Identifizierung von Nukleinsäuremolekülen
und/oder Polypeptiden, die eine Sequenzidentität von mindestens
70%, 80%, 90% oder 95% mit einer Nukleotidsequenz oder einer Aminosäuresequenz
aufweisen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, eine
herkömmliche Bestimmung mit bekannten Computerprogrammen
umfassen. Eine bevorzugte Methode zur Bestimmung der besten Gesamtübereinstimmung
zwischen einer Suchsequenz (einer Sequenz der vorliegenden Erfindung)
und einer Zielsequenz, die man auch als globale Sequenzanordnung
bezeichnet, kann mit dem FASTDB-Computerprogramm bestimmt werden, das
auf dem Algorithmus von Brutlag et al. (Comp. App. Biosc.
6: 237–245 (1990)) beruht. In einer Sequenzanordnung
sind die Suchsequenz und die Zielsequenz beide DNA-Sequenzen. Eine
RNA-Sequenz kann man vergleichen, wenn man U's zu T's umwandelt.
Das Ergebnis dieser globalen Sequenzanordnung wird in Prozent Identität
angegeben. Bevorzugte Parameter, die in einer FASTDB-Anordnung von
DNA-Sequenzen verwendet werden um den Prozentsatz der Identität
zu berechnen, sind: Matrix = einheitlich, k-Tupel = 4, Mismatch-Strafwert
= 1, Verbindungs-Strafwert = 30, Länge der Randomisierungsgruppe
= 0, Randwert = 1, Lückenstrafwert = 5, Strafwert für
Lückengröße = 0,05, Fenstergröße
= 500 oder die Länge der zu testenden Nucleotidsequenz,
was immer kürzer ist.
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In Übereinstimmung
mit dem Vorstehenden kann für die Erzeugung des chimären
Peptids eine cAMP-Bindeeinheit verwendet werden, die eine Sequenzidentität
von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% zu einer cAMP-Bindeeinheit
eines Polypeptids aufweist wie es in den SEQ ID NOs: 2 oder 6 gezeigt
oder wie in
WO 2005/052186 aufgeführt
ist. Besonders bevorzugte sind hierin vorstehend angegeben und umfassen unter
anderem die Aminosäurereste 157–316 von Epac1,
oder die Aminosäurereste 281–445 von Epac2 (Domäne
B), die Aminosäurereste 203–323 von Epac1, die
Aminosäurereste 274–416 der regulatorischen Untereinheit
II beta von PKA, die Aminosäurereste 544–661 des
durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kaliumkanals 2, die Aminosäurereste
12–98 des Katabolit- Genaktivatorproteins, die Aminosäurereste
473–568 der Neuropathie-Ziel-Esterase oder die Aminosäurereste
628–767 des durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kanals
4 (CNG-4).
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Der
Begriff „zumindest zu 70%” wie hierin verwendet
bezieht sich auf eine Sequenzidentität von 70% oder mehr.
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Außer
dem Nukleinsäuremolekül oder der Expressionskassette
der Erfindung kann der wie in den Beispielen beschrieben Vektor
(wie z. B. pCEP4-Epac1) weitere Gene enthalten, wie z. B. Markergene,
die eine Selektion dieses Vektors in einer geeigneten Wirtszelle
und unter geeigneten Bedingungen erlauben. Im Allgemeinen enthält
der Vektor auch einen oder mehrere Replikationsursprünge.
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Vorteilhafterweise
sind die Nukleinsäuremoleküle, die in den Vektoren
enthalten sind, funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft,
die Expression ermöglichen, d. h. Transkription und Synthese
einer translatierbaren RNA in prokaryontischen und eukaryontischen
Zellen sicherstellen.
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Die
Expression des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden
Erfindung erfolgt in einer stabilen Zelllinie. Prozeduren zur Selektion
von stabil transfizierten Zelllinien sind auf dem Fachgebiet bekannt;
siehe unter anderem Vilardaga, J. Biol. Chem. 276: 33435–33443
(2001). Bevorzugte Zell-Linien sind CHO-Zellen, HEK 293-,
Cos 7-, HeLa-, PC12-, B35-, CHW-, BHK-21, HUVEC-, MyEnd-, HL-1,
oder NIH 3T3-Zellen oder sogar primäre Zellen wie primäre
Kardiomyozyten, Fibroblasten, Endothel- oder embryonale Stammzellen,
wobei es sich bei diesen primären Zellen nicht um menschliche
Embryonalzellen handelt.
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Der
Bergriff „stabil transformierte Zell-Linie” oder „stabile
Zell-Linie”, beschreibt die Integration eines DNA-Fragmentes
in das Genom einer Zelle. Im Allgemeinen werden bei der Transformation
Gene, d. h. nackte DNA übertragen und in das Genom einer
Zelle stabil und über einen längeren Zeitraum,
vorzugsweise dauerhaft integriert. Durch diesen Einbau erhält
die transformierte Zelle (Expressionssystem) einen neuen Genotyp und
kann durch Aktivierung der stabil eingebauten DNA-Fragmente einen
neuen Phänotyp zeigen. Im Gegensatz dazu beschreibt der
Begriff „transient” oder „transient transformierte
Zell-Linie”, die Übertragung nackter DNA in eine
Zelle, die nicht stabil eingebaut ist.
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Der
Begriff „Transfektion” und „Transformation” wird
hierin als synonym verwendet, und beschreibt den Einbau von DNA-Fragmenten
in Zellen.
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Eine
erfindungsgemäß Zell-Linie, die neben dem β1-adrenergen Rezeptor einen cAMP-Sensor stabil exprimiert,
wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ), Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig am 10.
Dezember 2008 von der Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Sanderring
2, 97070 Würzburg hinterlegt. Die von der Internationalen
Hinterlegungsstelle (DSMZ) zugeteilte Eingangsnummer lautet DSM
ACC 2985.
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Eine
klassische Übersicht über verschiedene Expressionssysteme
ist zum Beispiel in Methods in Enzymology 153: 385–516
(1987); in Bitter, Methods in Enzymology 153: 516–544
(1987) und in Sauvers, Applied Microbiology and
Biotechnology 46: 1–9 (1996), Billman-Jacobe,
Curr. Opin. Biotechnol. 7: 500–504 (1996), Hockney,
Trends in Biotechnology 12: 456–463 (1994), Griffiths,
Methods in Molecular Biology 75: 427–440 (1997) enthalten.
Ein Überblick über Hefe-Expressionssysteme wird
zum Beispiel von Hensing, Antoine van Leuwenhoek 67: 261–279
(1995), Bussineau, Developments in Biological Standardization
83: 13–19 (1994), Gellissen, Antoine van
Leuwenhoek 62: 79–93 (1992), Fleer, Curr.
Opin. Biotechnol. 3: 486–496 (1992), Vedvick
(Curr. Opin. Biotechnol. 2: 742–745 (1991) und Buckholz,
Bio/Technology 9: 1067–1072 (1991) gegeben. Besonders
bevorzugte Expressionssysteme umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Sf9-Zellen, E. coli-Zellen oder Sängerzellen wie z.
B. CHO-Zellen, HEK 293-, Cos 7-, HeLa-, PC12-, B35-, CHW-, BHK-21,
HUVEC-, MyEnd-, HL-1, oder NIH 3T3-Zellen.
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Die
stabile Transformation der Zell-Linie mit einem Nukleinsäuremolekül
oder Vektor kann mittels Standardmethoden durchgeführt
werden, wie sie zum Beispiel in Sambrook und Russell (2001),
a. a. O. beschrieben sind. Die Zell-Linie wird in Nährmedium
gezüchtet, das die Erfordernisse der jeweils verwendeten Zell-Linie
erfüllt, insbesondere im Hinblick auf den pH-Wert, Temperatur,
Salzkonzentration, Belüftung, Antibiotika, Vitamine, Spurenelemente
etc. Bevorzugt stammt die Zell-Linie aus einer Sängerzelle,
einer Amphibienzelle, einer Fischzelle, einer Insektenzelle, einer
Pilzzelle, einer Pflanzenzelle oder einer bakteriellen Zelle oder von
einem transgenen nicht-menschliches Tier.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus nicht-menschliche
transgene Organismen, d. h. multizelluläre Organismen,
die ein Nukleinsäuremolekül umfassen, das ein
chimäres Peptid der Erfindung bevorzugt stabil in dessen
Genom integriert, mindestens in einem Teil der Zellen dieses Organismus,
oder in Teilen davon wie z. B. Geweben oder Organen. Am meisten
bevorzugt handelt es sich bei einem solchen nicht-menschlichen Ursprung
des Transgens um ein Säugetier wie eine Maus, eine Ratte,
ein Schaf, eine Ziege, ein Schwein, einen Hund, eine Ratte oder
ein Pferd.
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Die
erfindungsgemäße Zell-Linie, die den β/β1-adrenergen Rezeptor als auch das chimäre
Peptid als cAMP-Sensor stabil exprimiert, ist besonders nützlich
in pharmakologischen Studien, bei Screeningverfahren und bei Verfahren
zur Identifizierung wie hierin bereitgestellt. Es ist zu beachten,
dass gerade für diese Studien nicht nur Zellen, sondern
auch Organe oder Teile von Organen dieser nicht-menschlichen transgenen
Tiere besonders nützlich sind. Es ist vorgesehen, dass
zum Beispiel Herz, Blutgefäße, Muskel, Drüse,
Knochen, Niere oder Leber oder Gehirn oder Kulturen von Hirngewebeschnitten
des hierin beschriebenen nicht-menschlichen transgenen Tiers bei
dem hierin bereitgestellten Screeningverfahren und Verfahren zur
Identifizierung verwendet werden. Neben den nicht-menschlichen transgenen
Tieren, die Säugetiere sind, ist es auch vorgesehen, dass
es sich bei diesen nicht-menschlichen transgenen Organismen auch
um ein Amphibium, ein Insekt, ein Pilz oder sogar eine Pflanze handeln
kann. Besonders bevorzugte nicht-menschliche Zell-Linien werden
aus Zellen von Drosophila, C. elegans, Xenopus ebenso wie Hefen
wie S. pombe oder S. cerevisiae oder die Aspergillus-Spezies. Transgene
Pflanzen-Zellkulturen umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Weizen, Tabak, Petersilie oder Arabidopsis.
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Wie
hierin vorstehend erwähnt und insbesondere in den beigefügten
Beispielen bildlich dargestellt, ist die die hierin definierte stabil
transformierte/transfizierte Zell-Linie besonders nützlich
bei Screening-Verfahren und Verfahren zur Identifizierung von Molekülen
oder Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an
das chimäre Peptid oder die biologische und/oder pharmakologische
Aktivität von Adenylatzyklasen und/oder Phosphodiesterasen
zu modifizieren. Wie die Beispiele zeigen kann Isoprenalin als ein
Aktivator (Agonist) von Gs-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine Erhöhung
von cAMP in der Zelle induzieren. Direkte Aktivatoren von Adenylatzyklase,
welche zur Gruppe der Katecholamine gehören erzeugen ein
nachweisbares FRET-Signal.
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Stärker
bevorzugt handelt es sich bei dem verwendeten Aktivator (Agonist)
um Noradrenalin, Adrenalin, Isoprenalin, Denopamin, Dobutamin.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem
verwendeten Katecholamin um Isoprenalin.
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Stärker
bevorzugt handelt es sich bei der stabil transformierten Zell-Linie,
wobei die Zell-Linie aus einer Säugerzelle um eine CHO-Zellen,
HEK 293-, Cos 7-, HeLa-, PC12-, B35-, CHW-, BHK-21, HUVEC-, MyEnd-,
HL-1, oder NIH 3T3-Zellen ebenso wie aus primäre Zellkulturen
wie neuronale Kulturen stammt. Wie es einem Fachmann auf dem Gebiet
ersichtlich ist, können auch primäre Zellen oder
transgene Tiere, die das chimäre Peptid exprimieren für
diese Screening-Verfahren und Verfahren zur Identifizierung eingesetzt
werden.
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Darüber
hinaus betrifft die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Bestimmung
der Konzentration von cAMP in der stabilen transformierten Zell-Linie,
umfassend das Zugeben einer Verbindung oder Substanz wie vorstehend
definiert oder wie mit Hilfe des erwähnten Verfahrens erhältlich
zu der Probe und Messen/Erfassen von FRET oder BRET und Bestimmen
der cAMP-Konzentration in der Probe durch Vergleichen der Werte
der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve, die unter Abwesenheit
der Verbindung oder Substanz erhalten wurde.
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Wie
bereits hierin vorstehend erklärt, ermöglichen
die dem Nachweis dienenden Teile/Markierungen, die in dem chimären
Peptid der Erfindung vorhanden sind, den Nachweis einer Konformationsänderung
innerhalb des chimären Peptids der Erfindung auf eine Bindung
von cAMP hin, was wiederum zu einer Änderung der Lichtintensität
führt, die von den dem Nachweis dienenden Teilen/Markierungen
emittiert wird, was mittels FRET oder BRET verfolgt werden kann.
Die Konformationsänderung der cAMP-Bindeeinheit auf die
Bindung von cAMP hin führt zu einer nachweisbaren Veränderung
von FRET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen/Markierungen.
Eine solche Veränderung kann zum Beispiel aus einem Vergleich
der Emissionsspektren einer cAMP-Bindeeinheit in Abwesenheit einer
geeigneten bindenden Verbindung, d. h. cAMP, mit derselben cAMP-Bindeeinheit
in Anwesenheit einer solchen Verbindung entnommen werden. Wenn zum
Beispiel FRET zunimmt, ist der Emissions-Peak des Akzeptors erhöht
und der Emissions-Peak des Donors ist verringert. Somit ist das
Verhältnis der Stärke der Emission des Akzeptors
zu der des Donors ein Hinweis auf das Maß von RET zwischen
den dem Nachweis dienenden Teilen. Die Konformationsänderung
des chimären Peptids auf die Bindung von cAMP hin kann
entweder zu einer Abnahme oder zu einer Zunahme der Distanz zwischen den
dem Nachweis dienenden Teilen führen. Somit stellt das
chimäre Peptid der Erfindung ein monomolekulares Werkzeug
bereit, das besonders geeignet ist, die cAMP-Spiegel in einer Probe
direkt zu bestimmen. Zum Beispiel kann man das wie vorstehend definierte
chimäre Peptid zu einer Probe hinzugeben und man kann, indem
man FRET oder BRET misst und/oder erfasst, die cAMP-Konzentration
in der stabil transformierten Zell-Linie messen, indem man die Werte
der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve vergleicht, die
man durch Applikation verschiedener Isoprenalin-Konzentrationen
erstellt. Alternativ werden in einer weiteren Ausführungsform
die Werte der Fluoreszenzemission mit einem Kontrollwert verglichen,
die man unter Abwesenheit einer Verbindung oder Substanz erhielt.
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Um
ein Beispiel für einen möglichen Assay zur Messung
von cAMP in vitro zu geben, kann die hierin beschriebene Zell-Linie
transfiziert werden, das z. B. ein auf Epac1 basierendes chimäres
Peptid codiert, das wie vorstehend beschrieben eCFP und eYFP und
beinhaltet und den β/β1-adrenergen
Rezeptor beinhaltet. Man kann nach Transfektion der Zellen, Selektionierung
mit den geeigneten Selektionsantibiotika (wie in Beispielen illustriert
Hygromycin für den Epac1-CAMP-Sensor und G418 für
den β1-adrenergen Rezeptor) und Vereinzelung
der Klone mit anschließender Untersuchung der Reaktion
auf β/β1-agonistische
(aktivierende) Antikörper stabile Klone der Zell-Linie
erhalten. Unter Verwendung dieser stabil transformierten Zell-Linie
kann man Emissionsspektren nach Zugabe von verschiedenen Aktivatoren
(Agonisten) wie in den Beispielen angegeben messen. Eine Abnahme
der Intensität bei 542 nm mit einer Zunahme bei 483 nm
stellt einen Verlust an FRET-Signal zwischen eCFP und eYFP dar.
Das Verhältnis der Signal-Intensität 542 nm/Intensität
483 nm zur cAMP-Konzentration kann für anschließende
genaue Messungen der cAMP-Konzentration bei verschiedenen Konzentrationen
des Aktivators/Agonisten in Form einer Dosis-Wirkungs-Kurve aufgetragen
werden.
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In Übereinstimmung
mit dem Vorhergehenden kann es sich bei der Probe wie sie hierin
definiert ist, zum Beispiel um eine Zelle, um ein Zell-Lysat, einen
Rohzellextrakt, eine Membranpräparation, ein Gewebe oder
um Bioflüssigkeiten handeln. Bioflüssigkeiten
wie hierin verwendet beziehen sich bevorzugt auf Körperflüssigkeiten
wie z. B. Samen, Lymphe, Seren, Plasma, Urin, Gelenkflüssigkeit
oder Liquor. In einer bevorzugten Ausführungsform wird
aus der hierin beschriebenen Probe die ImmunglobulinG-Fraktion,
wie in den Beispielen illustriert (siehe z. B. Beispiel 6), aufgereinigt,
gegen einen geeigneten Messpuffer (wie z. B. FRET-Puffer) über
Nacht dialysiert und dann in den hierein beschriebenen Verfahren
eingesetzt.
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Der
vorstehend beschriebene Assay, bei dem die stabil transformierte
Zell-Linie verwendet wird, zeigt verschiedene Vorteile. Zum Beispiel
ist es mit der hierin beschriebenen Zell-Linie möglich
Messungen verschiedener Messtage zu vergleichen und somit „Follow-up”-Versuche
durchzuführen. Somit kann die stabil transformierte Zell-Linie
verwendet werden, pathologische Zustände zu untersuchen,
bei denen man eine mögliche über den β/β1-adrenergen Rezeptor abnorme vermittelte
cAMP Signalgebung als pathophysiologisch relevant ermittelt (identifiziert)
vorgeschlagen hat (Lohse, Cir. Res. 93: 896–906
(2003)). Solche Krankheiten umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Herzkrankheiten, umfassend infektiöse und nicht-infektiöse
Herzkrankheiten, ischämische und nicht-ischämische
Herzkrankheiten, inflammatorische Herzkrankheiten und Myocarditis,
Herzdilatation, idiopathische Kardiomyopathie, idiopathische dilatative
Kardiomyopathie (DCM), immunologische-Kardiomyopathie, und jede
Herzrhythmusstörung einschließlich ventrikulärer
und supraventrikulärer Extrasystolen, sowie atrialer Rhytmusstörungen
einschließlich Vorhofflimmern und Vorhofflattern.
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Der
Fachmann auf dem Gebiet kann daher leicht die Verbindungen und die
Verfahren der Erfindung verwenden, um die antagonistischen und/oder
antagonistischen Wirkungen und/oder Eigenschaften einer Verbindung/eines
Moleküls/einer Substanz am β/β1-adrenergen Rezeptor aufzuklären.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäß stabil
transformierte Zell-Linie dazu verwendet werden Infektionskrankheiten
oder chronisch verlaufende Infektionskrankheiten, die beispielsweise
durch einzellige Parasiten (wie z. B. durch Trypanosomen) verursacht
mit einer Beeinflussung der β/β1-adrenergen
Signaltransduktion einhergehen, zu diagnostizieren und in ihrem
Verkauf zu beurteilen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäß stabil
transformierte Zell-Linie, dazu verwendendet werden, verschiedene
Nierenerkrankungen und tropische Infektionskrankheiten (wie z. B.
Chagas) zu untersuchen.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die über
eine chronische Aktivierung des β/β1-adrenergen
Rezeptors vermittelte Herzkrankheit die idiopathische dilatative
Kardiomyopathie (DCM).
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Somit
kann die hierin beschriebene stabil transformierte Zell-Linie für
eine auf FRET/BRET basierende Überwachung von cAMP-Spiegeln
eingesetzt werden, um die Rolle über eine Aktivierung des β/β1-adrenergen Rezeptors vermittelten cAMP-Veränderungen
zu ermitteln, in dem man den Gehalt von cAMP nach Inkontaktbringen
der Zell-Linie mit einer Flüssigkeit, Verbindung oder Substanz
misst. Somit kann die stabil-transformierte Zell-Linie für
eine FRET/BRET basierende Überwachung und zur Diagnose
vom β/β1-adrenergen Rezeptor
vermittelte Krankheiten, und hier besonders. Herzkrankheiten, eingesetzt
werden. Anschließend kann man dieselbe Art der Untersuchung
unter Verwendung eines Aktivators durchführen, wodurch
eine maximale cAMP-Änderung in der stabil transformierten
Zell-Linie erzielt wird.
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Demnach
ist die hierin beschrieben Zell-Linie, eine stabil transformierte
Zell-Linie, die sich besonders für den Nachweis der intrazellulären
cAMP-Konzentration nach Stimulation des β/β1-adrenergen Rezeptors eignet. Eine solche,
stabil transformierte Zell-Linie zeigt verschiedene Vorteile im
Vergleich zu der auf dem Fachgebiet beschriebene transient transformierte
Zell-Linie. Somit ist es mit der hierein beschriebenen teilungsfähigen
stabil transformierten Zell-Linie erstmals möglich über
einen längeren Beobachtungs-Zeitraum repititiv (horizontal
und longitudinal) den Verlauf und die Rolle/klinischen Effekte der
cAMP-Änderungen bzw. des Aktivierungsgrades des β/β1-adrenergen Rezeptorsystems in der Pathogenese
der hierin beschriebenen Herzkrankheiten zu untersuchen.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung von Molekülen
(z. B. Antikörper) oder Substanzen (z. B. Agonisten), die
in der Lage sind, an den β/β1-adrenergen
Rezeptor zu binden oder aber eine Bindung von Molekülen
oder Substanzen an den β/β1-adrenergen
Rezeptor zu verhindern (z. B. Zyklopeptide) und somit entweder eine
Produktion/Generierung (Freisetzung) von cAMP zu aktivieren oder
aber eine Generierung (Freisetzung) von cAMP zu verhindern/inhibieren,
umfassend die Schritte:
- (a) das Inkontaktbringen
der stabil transformierten Zell-Linie mit (einem/einer) zu testenden
Molekül(en) oder Verbindung(en); und
- (b) das Messen, inwieweit das (die) zu testende(n) Molekül(en)
oder Verbindung(en) zu einer Änderung der Lichtintensität
führt (führen), die durch die nachweisbare Markierung
emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten cAMP-Sensor
als chimäres Peptid enthalten sind.
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Wie
hierin vorstehend erwähnt und insbesondere in den beigefügten
Beispielen erläutert, ist die hierin definierte Zell-Linie
besonders nützlich bei Screeningverfahren und bei Verfahren zur
Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die in
der Lage sind, an einen β/β1-adrenergen
Rezeptors zu binden und diesen zu aktivieren, sowie von Molekülen
oder Verbindungen, vorzugsweise zyklische Peptide (Zyklopeptide),
die in der Lage sind, eine Bindung anderer Moleküle oder
Substanzen (z. B. Antikörper) and den β/β1-adrenergen Rezeptor zu verhindern. Zum
Beispiel kann man die stabil transformierte Zell-Linie mit (einem)
zu testenden Molekülen) oder (einer) zu testenden Verbindung(en)
in Kontakt bringen. Durch Messen, ob diese(s) zu testende(n) Molekül(e)
oder diese zu testende(n) Verbindungen zu einer einer Aktivierung
des β/β1-adrenergen Signalwegs
führt und somit eine zu einer Änderung der (Licht-)Intensitäten
führt, die von den zwei benachbarten Markierungen emittiert
wird, ist es möglich Moleküle oder Verbindungen
zu identifizieren, die in der Lage sind, den β/β1-adrenergen Rezeptor zu aktivieren. Wie
die Beispiele zeigen, basiert die vorliegende Erfindung auf dem überraschenden
Befund, dass man unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie
ein uniformes Testsystem entwickelt hat, mit der es möglich
ist, basierend auf einer Konformationsänderung und sukzessiven
Aktivierung bzw. Modulierung der Aktivität (= veränderten
Aktivitätszustand) des β/β1-adrenergen
Rezeptors, eine Veränderung (Zunahme oder Abnahme) der
emittierten Lichtintensitäten zu messen (messbar mittels
Veränderungen im FRET oder BRET).
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Der
Begriff „uniform” beschreibt die eine gleichmäßige,
einheitliche und/oder gleichförmige Reaktion der hierin
beschriebenen Zell-Linie auf eine Substanz oder Verbindung, beispielsweise
auf einen hierin definierten Aktivator/Agonisten.
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Die
Identifizierung und/oder Charakterisierung von Molekülen
oder Substanzen, die in der Lage sind, den Aktivierungsgrad des β/β1-adrenergen Rezeptorsystems zu verändern,
kann unter Einsatz einer stabil transformierten Zell-Linie erreicht
werden, die neben dem β/β1-adrenergen
Rezeptor auch einen cAMP-Sensor, wie hierin beschrieben, codiert.
Solche Zell-Linien können aus CHO-Zellen, HEK 293-, HeLa-,
Cos 7-, PC12- oder NIH 3T3-Zellen, (primären) Kardiomyozyten,
Fibroblasten, Endothel- oder embryonale Stammzellen, (primären)
in Kultur gehaltene Nervenzellen, Muskelzellen oder Frosch-Oocyten,
wobei es sich bei diesen Zellen nicht um menschliche embryonale
Zellen handelt, Die stabil transformierte Zell-Linie wird dann mit
(einem) zu testenden Molekül(en) oder (einer) zu testenden
Verbindung(en) in Kontakt gebracht und man misst, ob diese(s) Molekül(e)
oder diese Verbindung(en) zu einer Veränderung in der Energie
(Intensitäten) führen. die von den zwei nachweisbaren
Markierungen emittiert werden, die in dem wie vorstehend definierten
chimären Peptid enthalten sind. Wie die beigefügten
Beispiele veranschaulichen, umfassen die besonders bevorzugten Messverfahren
die FRET- oder BRET-Messungen.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von
Molekülen oder Verbindungen, die Aktivatoren (Agonisten)
oder Inhibitoren (Antagonisten) eines β/β1-adrenergen Rezeptors sind, und somit in
der Lage sind die Konzentration des, im Verlauf der weiterführenden
Signalkaskade gebildeten cAMP zu erhöhen oder zu erniedrigen,
umfassend die Schritte:
- (a) das Inkontaktbringen
der stabil transformierten Zell-Linie mit (einem/einer) zu testenden
Molekül(en) oder Verbindung(en);
- (b) das Messen, inwieweit das (die) zu testende(n) Molekül(en)
oder Verbindung(en) zu einer Änderung der Lichtintensität
führt (führen), die durch die nachweisbare Markierung
emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten cAMP Sensor
als chimäres Peptid enthalten sind; und
- (c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität
mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en)
gemessen wurde.
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Wie
hierin vorstehend erwähnt und insbesondere in den beigefügten
Beispielen erläutert, ist die hierin beschriebene stabil
transformierte Zell-Linie besonders nützlich bei Screeningverfahren
und bei Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung
von Molekülen, Verbindungen oder Substanzen, die in der
Lage sind den Aktivierungsgrad des β/β1-adrenergen Rezeptorsystems zu verändern,
d. h. β/β1-adrenerge Rezeptoren
zu aktivieren oder zu hemmen (inhibieren). Durch Messen, ob diese(s)
zu testende(n) Molekül(e) oder diese zu testende(n) Verbindungen
zu einer Änderung der Energie führt, die von den
zwei benachbarten Markierungen emittiert wird, ist es möglich
Moleküle, Verbindungen oder Substanzen (wie beispeilsweise
Antikörper) zu identifizieren, die in der Lage sind, die
Bindung an den β/β1-adrenergen
Rezeptor zu aktivieren oder zu hemmen. Wie die Beispiele zeigen,
basiert die vorliegende Erfindung auf dem überraschenden
Befund, dass man unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie
ein uniformes Testsystem entwickelt hat mit dem es möglich
ist, basierend auf einer Konformationsänderung mit sukzessiver
Aktivierung oder Inhibierung des β/β1-adrenergen
Rezeptors, über eine Veränderung der zellulären
cAMP-Konzentration eine Veränderung der Lichtintensität
im Sensormolekül Epac-camps zu messen (messbar mittels
FRET oder BRET). Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung zum
ersten Mal Mittel und Verfahren bereit, mit denen die Aktivierung
(ebenso wie Deaktivierung) oder Hemmung der Bindung eines/einer
Moleküls/Substanz oder Verbindung an den β/β1-adrenergen Rezeptor, unter Verwendung der
stabil transformierten Zell-Linie, uniform beobachtet werden kann
(wie z. B. in 1 gezeigt). Daher gewährleistet
die vorliegende Erfindung eindeutiges Screening ebenso wie Verfahren
zur Identifizierung von Aktivatoren (Agonisten), partiellen Agonisten,
inversen Agonisten ebenso wie von Antagonisten des β/β1-adrenergen Rezeptors. Bei Antagonisten
erfolgt der Nachweis durch die verminderte agonistische Antwort
eines nachfolgend applizierten Agonisten. Im Kontext dieser Erfindung ebenso
wie in Übereinstimmung mit den pharmakologischen Wissenschaften
kann der Begriff „Agonist” auf ein Molekül
oder eine Verbindung eingegrenzt werden, das den β/β1-adrenergen Rezeptors aktiviert. Als „partielle Agonisten” werden
im Fachgebiet Moleküle/Verbindungen definiert, die sich
wie Agonisten verhalten, aber die, sogar bei hohen Konzentrationen,
den β/β1-adrenergen Rezeptors
nicht bis zum gleichen maximalen Ausmaß aktivieren können
wie Agonisten. Der Begriff „Antagonist” bezieht
sich auf Moleküle/Verbindungen, welche den β/β1-adrenergen Rezeptor binden allerdings keine
Rezeptoraktivierung bewirken.
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Folglich
gewährleistet gemäß den hierin bereitgestellten
Verfahren die Erfindung die Identifizierung, die Charakterisierung
und das Screenen von Verbindungen, Substanzen oder Molekülen,
die in der Lage sind, β/β1-adrenerge
Rezeptoren zu aktivieren, zu desaktivieren oder zu inaktivieren,
wobei diese Interaktion zu einer Aktivierung, einer partiellen Aktivierung,
einer Hemmung oder einer partiellen Hemmung der biologischen und/oder
pharmakologischen Funktion dieses β/β1-adrenergen
Rezeptors führen kann. Daher gewährleistet die
vorliegende Erfindung ein eindeutiges Screening ebenso wie Verfahren
zur Identifizierung von Agonisten, partiellen Agonisten, inversen
Agonisten ebenso wie von Antagonisten des β/β1-adrenergen Rezeptors. Im Kontext dieser
Erfindung ebenso wie in Übereinstimmung mit den pharmakologischen
Wissenschaften kann der Begriff „Agonist” oder „volle
Agonist” auf ein Molekül oder eine Verbindung
eingegrenzt werden, das an den β/β1-adrenergen
Rezeptor bindet und diesen aktiviert. Als „partielle Agonisten” werden
im Fachgebiet Moleküle/Verbindungen definiert, die sich
wie Agonisten verhalten, aber die, sogar bei hohen Konzentrationen,
den β/β1-adrenergen Rezeptor
nicht bis zum gleichen maximalen Ausmaß aktivieren können
wie volle Agonisten. Der Begriff „inverser Agonist” bezieht
sich auf Moleküle/Verbindungen, welche an den entsprechenden β/β1-adrenergen Rezeptor binden und dessen (spontane)
Aktivität hemmen. Diese inversen Agonisten sind von besonderer
Bedeutung und sichtbar, wenn die β/β1-adreneregen
Rezeptoren intrinsische, von Agonisten unabhängige (Eigen-)Aktivität
zeigen. Der Begriff „Antagonist” bezieht sich
auf Moleküle/Verbindungen, die an den β/β1-adrenergen Rezeptor binden, aber die intrinsische
Aktivität des Rezeptors nicht verändern. Diese können
auch die Bindung des entsprechenden Liganden des β/β1-adrenergen Rezeptors verhindern und sie können
die Bindung und Aktivierung des β/β1-adrenergen
Rezeptors durch deren Agonisten oder partielle Agonisten verhindern.
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Gemäß der
vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Antagonist” Moleküle/Substanzen,
die in der Lage sind, einen agonistischen Effekt zu inhibieren und/oder
zu verringern. Der Begriff „Antagonist” umfasst
kompetitive, nicht-kompetitive, funktionelle und chemische Antagonisten
wie sie unter anderem in
Mutschler, „Arzneimittelwirkungen",
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Deutschland
(1986) beschrieben worden sind. Der Begriff „partieller
Antagonist” gemäß der vorliegenden Erfindung
bedeutet ein Molekül/eine Substanz, das/die in der Lage
ist, die Aktivität von Agonisten durch unter anderem auch nicht-kompetitive
Mechanismen unvollständig zu blockieren. Als „Agonisten” werden
gemäß dieser Erfindung Moleküle/Substanzen
bezeichnet, die eine Affinität zu ebenso wie eine intrinsische
Aktivität an einem bestimmten Rezeptor/Rezeptorsystem aufweisen.
In den meisten Fällen ist diese intrinsische Aktivität
(α) als proportional zu dem Quotienten aus der Wirkung,
die durch diesen Agonisten ausgelöst wird (E
A),
und der Wirkung, die in einem gegebenen biologischen System maximal
erreicht werden kann (E
max), definiert:
daher kann die intrinsische Aktivität definiert werden
als:
-
Die
höchste relative intrinsische Aktivität ergibt
sich aus EA/Emax =
1. Agonisten mit einer intrinsischen Aktivität von 1 sind
volle Agonisten, wohingegen Substanzen/Moleküle mit einer
intrinsischen Aktivität von > 0 und < 1
partielle Agonisten sind. Partielle Agonisten zeigen einen dualistischen
Effekt, d. h. sie umfassen agonistische ebenso wie antagonistische
Wirkungen.
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Der
Fachmann auf dem Gebiet kann daher leicht die Verbindungen und die
Verfahren der Erfindung verwenden, um die agonistischen und/oder
antagonistischen Wirkungen und/oder Eigenschaften einer Verbindung/eines
Moleküls/einer Substanz aufzuklären, die/das/die
gemäß einem beliebigen der vorstehend beschriebenen
Verfahren zu identifizieren oder zu charakterisieren ist.
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Die
Identifizierung und/oder Charakterisierung von Molekülen,
die in der Lage sind, den β/β1-adrenergen
Rezeptor zu aktivieren, zu desaktivieren oder zu inaktivieren, kann
unter Verwendung der hierein beschriebenen stabil transformierten
Zell-Linie erreicht werden. Solche Zell-Linie stammen vorzugsweise
aus CHO-Zellen, HEK 293-, HeLa-, Cos 7-, PC12- oder NIH 3T3-Zellen,
Frosch-Oocyten oder primären Zellen wie primären
Kardiomyozyten, Fibroblasten, endothialen oder embryonalen Stammzellen,
wobei es sich bei diesen Zellen nicht um menschliche Embryonalzellen
handelt.
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Darüber
hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer β/β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit,
umfassend die Schritte:
- (a) Bereitstellung
einer Probe von einem Patienten;
- (b) das Inkontaktbringen der stabil transformierten Zell-Linie
mit einem zu testenden oder zu testenden Verbindung aus dem Probenmaterial;
- (c) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der
Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung
emittiert wird, die von dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid
umfasst ist; und
- (d) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität
mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en)
gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in den
Zellen der stabil transformierten Zell-Linie als Reaktion auf das
Probenmaterial, im Vergleich zur Standardkurve hindeutet, dass der
Patient durch den β/β1-adrenergen
Rezeptor-vermittelten Krankheit leidet.
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Das „Vergleichen
der Änderung der Lichtintensität” wie
hierein verwendet bezieht sich auf ein Signal, d. h. eine Veränderung
im FRET, welche aus einer routinemäßigen Kontrollmessung
(z. B. Probenmaterial von gesunden Patienten) stammt. Alternativ
bezieht sich die „Standardkurve” wie hierin verwendet
auf ein Signal, d. h. eine Veränderung im FRET, welche
durch routinemäßig verwendete Aktivatoren (Agonisten)
eines β/β1-adrenergen Rezeptors
induziert wird, als Referenzverbindung eingesetzt. In einer bevorzugten
Ausführungsform bezieht sich die Standardantwort, wie in
den hierin aufgeführten Beispielen, auf ein Signal, d.
h. eine Veränderung im FRET, welches durch die Zugabe von
Isoprenalin induziert wird.
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Darüber
hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnosestellung
und zum Verlauf einer β/β1-adrenergen
Rezeptor-vermittelten Krankheit über einen Zeitraum von
z. B. mindestens 3 bis hin zu 48 Monaten, umfassend die Schritte:
- (a) Bereitstellung einer Probe von einem Patienten;
- (b) das Inkontaktbringen der Zell-Linie nach einem der Ansprüche
1 bis 17 mit einem zu testenden Molekül oder zu testenden
Verbindung aus dem Probenmaterial;
- (c) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der
Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung
emittiert wird, die von dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid
wie definiert in einem der Ansprüche 2 bis 13 umfasst ist;
und
- (d) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität
mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit eines des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en)
gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in den
Zellen der stabil transformierten Zell-Line als Reaktion auf das
Probenmaterial (durch in dem Probenmaterial vorhandende agonistisch
wirkende Verbindungen), im Vergleich zur Standardkurve hindeutet, dass
der Patient an einer über den β/β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit
leidet, und wobei der Gehalt an cAMP horizontal (gleicher Zeitpunkt,
verschiedene Patienten) oder longitudinal (gleicher Patient, verschiedende
Zeitpunkte) gemessen werden kann.
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Bei
potenziellen Kandidatenmolekülen oder Gemischen von Kandidatenmolekülen
kann es sich unter anderem um Substanzen, Verbindungen oder Zusammensetzungen
handeln, die chemischen oder biologischen Ursprungs sind, die in
der Natur vorkommen oder die synthetisch, rekombinant und/oder chemisch
hergestellt worden sind. Demnach kann es sich bei Kandidatenmolekülen
um Antikörper handeln, um Proteine, Proteinfragmente, Peptide,
Aminosäuren und/oder Derivate davon oder um andere Verbindungen
wie z. B. Ionen, die unter anderem an den β/β1-adrenergen Rezeptor bindet und/oder mit
diesem interagiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der hierein beschriebenen
Erfindung erfolgte die Präparation der hierin beschriebenen
Kandidatenmoleküle aus humanem Serum von Probanden (Patienten),
die an einer Herz-Krankheit leiden, welche durch idiopathische dilatative
Kardiomyopathie vermittelt wird. Hierbei betrug die Ejektionsfraktion
der als DCM-Patienten charakterisierten Patientengruppe < 40%. Ebenso wurden
Ischämie und Erkrankungen der Koronargefäße,
Alkoholmissbrauch sowie andere toxische Einflüsse ausgeschlossen
(Jahns, Circulation. 99: 649–654 (1999)).
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Der
hierin beschriebene Begriff „Kandidatenmolekül” ist
in der vorliegenden Anmeldung mit dem Begriff „das zu testende
Molekül, oder die zu testende Verbindung” gleichzusetzen.
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Darüber
hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung einer
gewählten Dosis von β-adrenergen Rezeptorhomologen
bei der Behandlung einer über den β/β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit,
umfassend die Schritte:
- (a) Bereitstellung
einer Probe von einem Patienten
- (b) das Inkontaktbringen der stabil transformierten Zell-Linie
mit einem zu testenden Molekül oder zu testenden Verbindung
aus dem Probenmaterial;
- (c) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der
Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung
emittiert wird, die von dem cAMP Sensor als chimäres Peptid
umfasst ist; und
- (d) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität
mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit eines des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en)
gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in den
Zellen der erfindungsgemäßen stabil transformierten
Zell-Linie, im Vergleich zur Standardkurve darauf hindeutet, dass
die Probe aktivierende Antikörper des Rezeptors aufweist,
oder das die gewählte Dosis an β/β1-adrenergen Rezeptorhomologen (wie z. B.
(Zyklo)peptide) zur Behandlung einer β/β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit
nicht ausreichend ist, und wobei die Dosis so gewählt sein
sollte, dass kein erhöhter Gehalt der cAMP-Konzentration
in den Zellen der erfindungsgemäßen Zell-Linie
im Vergleich zur Standardkurve nachweisbar ist.
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Bei β/β1-adrenergen Rezeptorhomologen kann es sich
unter anderem um Moleküle, Substanzen oder Verbindungen
handeln, die chemischen oder biologischen Ursprungs sind, in der
Natur vorkommen oder die synthetisch, rekombinant und/oder chemisch
hergestellt worden sind. Speziell handelt es sich bei den β-adrenergen
Rezeptorhomologen um (β1-adrenerge
Rezeptorhomologe. Speziell sind die β/β1-adrenergen Rezeptorhomologe Peptide oder,
vorzugsweise Zyklopeptide, die eine Sequenzähnlichkeit
mit der ersten (β-ECI/β1-ECI), der zweiten
(β-ECII/β1-ECII) oder der dritten extrazellulären
Domäne (β-ECIII/β1-ECIII) eines β/β1-adrenergen Rezeptors besitzen. Die dritte
extrazellulären Domäne (β-ECIII/β1-ECIII) eines β/β1-adrenergen Rezeptors enthält oder
besteht aus der Aminosäuresequenz KAFHRELVPDR. Die „ECII-immitierenden Peptide oder Zyklopeptide
umfassen die allgemeine Formel (x-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x) oder cyclo(x-xh-Cys-x-xa-xb-xc-x-Cys-y-xi-x). In dieser Formel, kann „y” jede
Aminosäure außer Cys sein, vorzugsweise kann „y” jede
Aminosäure außer Cys und Pro sein. Generell kann „y
jede Aminosäure sein, so lange diese Aminosäure
keine intramolekulare Verknüpfung (z. B. eine Disulfidbindung)
mit einer anderen Aminosäure des hierein beschriebenen
Zyklopeptids (z. B. eine anderes Cys des hierein beschriebenen Zyklopeptids)
eingeht. Vorzugsweise kann „y” jede Aminosäure
sein, die zu Cys ähnlich ist (das heißt die eine ähnliche
chemische Struktur und/oder eine ähnliches biochemisches
Verhalten wie Cys aufweist), mit der Ausnahme, dass es keine intramolekulare
Verknüpfung (z. B. eine Disulfidbrücke) mit einer
anderen Aminosäure eines hierein beschriebenen Zyklopeptids
(z. B. mit einem anderen Cys eines hierin beschriebenen Zyklopeptids)
oder intermolekulare Bindungen mit endogenen Zellproteinen, die
Cys enthalten, eingeht. Vorzugsweise kann „y” jede
polare Aminosäure sein, mit der Ausnahme von Cys oder Thr.
Speziell, kann „y” in dem hierin beschriebenen
(Zyklo)peptid Ser sein. In einem weiteren Beispiel kann „y” auch
Selenocystein oder ein Analogon davon sein. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform kann „y” auch alpha-Buttersäure
(Abu) oder ein Abu-Analog sein. Beispiele für entsprechende
(Zyklo)peptide sind: (cyclo)(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly);
(cyclo)(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Gln),
und (cyclo)(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arm-Gln).
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In
einem hierin beschriebenen (Zyklo)peptid (siehe obige Formeln) kann „h” eine
Gesamtzahl von 1 bis 15, vorzugsweise 5 bis 9 sein, und/oder „i” kann
eine Gesamtzahl von 0 bis 14, vorzugsweise von 1 bis 14. In einer
weiteren Ausführungsform kann „i” eine
Gesamtzahl von 0 bis 6, vorzugsweise von 1 bis 6. Demzufolge kann „h” 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15 und/oder „i” 0,
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 sein. Vorzugsweise
ist „h” 5 oder 9 und oder ist „i” 3
oder 6. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung steht xh speziell für
die Aminosäuresequenz DEARR oder RAESDEARR und/oder xi steht speziell für Aminosäuresequenz
DFV, DFVT oder DFVTNR. In einer weiteren speziellen Ausführungsform
steht xh für die Aminosäuresequenz
AESDEARR und/oder xi steht im speziellen
für die Aminosäuresequenz DFVT.
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Das
(Zyklo)peptid (siehe obige Formeln), wie hierin beschrieben, beinhaltet
nur ein Pro. Demzufolge, ist es bevorzugt, dass weder „y” noch „x”,
ausgenommen von genau einem von xa, xb und xc, Pro ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist „xc” Pro, „xb”,
wie hierin in einer der obigen Formeln beschrieben, eine saure Aminosäure,
wie Asp oder Glu. Beispielsweise, wenn „xc” Pro
ist, kann xb eine saure Aminosäure
sein, wenn xb Pro ist, kann xa eine
saure Aminosäure sein, und wenn xa Pro
ist, kann das x, wie hierein in einer der beiden obigen Formeln
beschrieben, welches sich zwischen xa und
dem ersten Cys liegt eine saure Aminosäure sein.
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Das
(Zyklo)peptid (oder der cyclische Teil davon), wie in der vorliegenden
Erfindung beschrieben umfasst 18 bis 25 Aminosäuren. Demzufolge,
umfasst das Zyklopeptid der vorliegenden Erfindung 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24 oder 25 Aminosäuren, wobei das Zyklopeptid bevorzugt
18, 22 oder 25, besonders bevorzugt 18 oder 22, Aminosäuren
umfasst. In einer weniger bevorzugten Ausführungsform kann
das Zyklopeptid (oder der cyclische Teil davon) weniger Aminosäuren
umfassen, z. B. 16 oder 17 Aminosäuren.
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Wie
bereits oben erwähnt, können in weiteren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung die hierein vorgestellten β-adrenerge
Rezeptorhomologe mutatis mutandis lineare Peptide sein. Die hierin
beschriebenen β/β
1-adrenergen
Rezeptorhomologe können auch (Zyklo)peptide sein, die eine
Sequenzähnlichkeit mit der dritten extrazellulären
Domäne (β-EC
III/β
1-EC
III) besitzen
(siehe oben). β/β
1-adrenerge
Rezeptorhomologe sind im Fachgebiet wohlbekannt, unter anderem aus
WO2009/027063 oder in
WO 2006/103101 .
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Die
in
WO 2009/027063 und
WO 2006/103101 offenbarten β/β
1-adrenergen Rezeptorhomologe sind im Sinne
dieser Erfindung bevorzugt. Besonders bevorzugt sind dabei die in
WO 2009/027063 offenbarten
Zyklopeptide (jeweils mit den in
WO
2009/027063 angegebenen weiteren Bevorzugungen).
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In
einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
ist in den β-adrenergen Rezeptorhomologen das Cystein durch
eine andere Aminosäure ersetzt, das dem Cystein an Position
131 und/oder 216 je nachdem, ob das β/β1-adrenerge Rezeptorhomolog einer Sequenz
der ersten (β/β1-ECI) oder der zweiten (β/β1-ECII) extrazellulären
Schleife ähnlich ist. Die „andere” Aminosäure
kann z. B. ein „y”, wie es für die oben genannten
Formeln definiert wurde, sein. Vorzugsweise ist die „andere
Aminosäure” Ser, oder ein Ser-Analogon, oder ein
Abu, oder ein Abu-Analogon (wie z. B. 2-Aminopropansäure,
2-Aminopentansäure oder 2-Aminohexansäure).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann es sich
bei an den β-adrenergen Rezeptorhomologen bindenden mit
dem β/β1-adrenergen Rezeptor
interagierenden Substanzen um β/β1-adrenerge
Rezeptorblocker handeln. Speziell kann es sich hierbei um β1-Rezeptorblocker handeln, wobei die β1-Rezeptorblocker ausgewählt sind
aus der Gruppe bestehend aus umfassend Atenolol, Metoprolol, Nebivolol,
Oxprenolol, Bupranolol, Betaxolol, Penbutolol, Pindolol, Bisoprolol,
Acebutolol, Metipranolol, Carteolol, Celiprolol, Esmolol, Timolol,
Levobunolol, Propranolol, Talinonlol, Alprenolol, Sotalol, Cartesolol,
Carvedilol und Bisoprolol.
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Bei
einem potenziellen zu testenden Molekül (Kandidatenmolekül)
oder zu testenden Verbindung (Testverbindung) aus dem Probenmaterial
kann es sich unter anderem um Substanzen, Verbindungen oder Zusammensetzungen
handeln, die chemischen oder biologischen Ursprungs sind, die in
der Natur vorkommen oder die synthetisch, rekombinant und/oder chemisch
hergestellt worden sind. Demnach kann es sich bei dem zu testenden
Molekül oder der zu testenden Verbindung aus dem Probenmaterial
um Antikörper handeln, um Proteine, Proteinfragmente, Peptide,
Aminosäuren und/oder Derivate davon oder um andere Verbindungen wie
z. B. Ionen, die unter anderem an den β/β1-adrenergen Rezeptor binden und/oder mit
diesem interagieren.
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Wie
in den beiliegenden Beispielen illustriert, kann eine besondere
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die Bestimmung
des β/β1-agonistischen
Potenzials aus Probenmaterial sein. Durch die Aktivierung des β/β1-adrenergen Rezeptors wird im weiteren Verlauf
der Signalkaskade über die Aktivierung des von stimulatorischen
G-Protein und Adenylatzyklase cAMP in den Zellen der hierin beschriebenen
erfindungsgemäßen stabil transformierten Zell-Linie
gebildet, was durch den intrazellulären cAMP-Sensor im
Zytosol nachgewiesen wird.
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Wie
hierin bereits vorliegend definiert, umfasst das Probenmaterial
vorzugsweise Blut, Plasma oder Serum. Wie in den beiliegenden Beispielen
illustriert können diese Substanzen oder Verbindungen insbesondere
Antikörper sein, die aus dem Serum aufgereinigt werden
(so wie z. B. in Beispiel 6) und anschließend, zum Beispiel
in verschiedenen Konzentrationen, unter Verwendung der stabil transformierten
Zell-Linie auf den vom β1-adrenergen
Rezeptor vermittelten cAMP-Gehalt vermessen werden. Dieser ermittelte
cAMP-Gehalt kann mit einer Standardkurve, vorzugsweise von einem
Aktivator des β/β1-adrenergen
Rezeptors (wie z. B. von Isoprenalin) verglichen werden. Somit stellt
die Verwendung der vorliegenden stabil transformierten Zell-Linie
eine allgemein anwendbare, auf Fluoreszenz basierende Technik, zur
Bestimmung von cAMP in der stabil transformierten Zell-Linie dar.
Da es sich bei der vorliegenden Zell-Linie, um eine stabil transformierte Zell-Linie
handelt können die hierin beschriebenen Verfahren repetitiv
(und/oder longitudinal wie z. B. monatlich, alle 3 Monate bis hin
zu jährlich wiederholten Messungen) durchgeführt
werden.
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Ein
Fachmann auf dem Gebiet wird sofort erkennen, dass die Verfahren
der Erfindung einen wichtigen Beitrag zur pharmakologischen Forschung
darstellen können, insbesondere auf dem Gebiet des Arzneistoffscreenings.
So umfassen entsprechende Methoden zum Arzneistoffscreening, die
in der Literatur beschrieben worden sind, zum Beispiel Kyranos,
Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 4: 719–728 (2001); Pochapsky,
Curr. Top. Med. Chem. 1: 427–441 (2001) und Bochats,
Curr. Top. Med. Chem. 1: 367–383 (2001).
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Die
Kandidatenverbindungen oder Testverbindungen können im
Prinzip von jeder Quelle genommen werden. Es kann sich dabei um
natürlich vorkommende Substanzen handeln, um modifizierte
natürlich vorkommende Substanzen, um chemisch synthetisierte
Substanzen oder um Substanzen, die von einem transgenen Organismus
hergestellt und gegebenenfalls bis zu einem gewissen Grad aufgereinigt
und/oder weiter modifiziert worden sind. Praktischerweise kann die
Kandidatenverbindung aus einer Bank von Verbindungen stammen, wie
sie routinemäßig für Screening-Prozesse
eingesetzt werden.
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Der
Begriff „Inkontaktbringen” bezieht sich auf die
Zugabe einer Kandidaten-Verbindung/von Testverbindungen zu der stabil
transformierten Zell-Linie auf eine Weise, so dass die Verbindung
an der Zelloberfläche oder nach Aufnahme in die Zelle auf
die Zelle einwirken kann. Üblicherweise kann die Kandidatenverbindung oder
eine Lösung, die diese enthält, zu dem Assay-Gemisch
hinzugegeben werden. Schritt (a) der Verfahren der vorliegenden
Erfindung, d. h. der „Schritt des Inkontaktbringens” lässt
sich ebenso erreichen, indem man der stabil transformierten Zell-Linie
eine Probe hinzugibt, die diese Kandidatenverbindung oder eine Vielzahl von
Kandidatenverbindungen enthält. Sofern man mit Hilfe des
vorliegenden Verfahrens herausfindet, dass eine solche Probe oder
eine Vielzahl von Verbindungen eine Verbindung von Interesse enthält,
dann ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe
zu isolieren oder die Originalprobe weiter zu unterteilen, wenn
sie zum Beispiel aus einer Vielzahl von verschiedenen Verbindungen
besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu
verringern, und das Verfahren mit den Teilmengen der Originalprobe
zu wiederholen. Je nach Komplexität der Probe kann man
die hierin beschriebenen Schritte mehrmals durchführen,
bevorzugt bis die nach dem Verfahren der Erfindung identifizierte
Probe nur eine begrenzte Zahl von Substanzen oder nur eine Substanz
umfasst. Bevorzugt umfasst diese Probe Substanzen mit ähnlichen
chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften und am meisten
bevorzugt sind diese Substanzen identisch.
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Der „Mess-
oder Identifizierungsschritt” kann gemäß den
Erklärungen ausgeführt werden, welche das Messen
einer vom β/β1-adrenergen
Rezeptor vermittelten Veränderung in den Intensitäten
des emittierten Lichts der Fusionsproteine betreffen, d. h. der
chimären Peptide der Erfindung wie sie hierin vorstehend
angegeben sind. Besonders bevorzugt sind optische Messverfahren,
die eine Auflösung der Fluoreszenz auf der Ebene von Einzelzellen
erlauben, bevorzugt auf der subzellulären Ebene. Geeignete
Bildgebungsverfahren sind in der Literatur beschrieben wie z. B.
in Periasamy, Methods in Cellular Imaging, (2001), Oxford
University Press oder in Fluorescence Imaging Spectroscopy
and Microscopy, 1996, hrsg. von X. F. Wang, Brian Harman, John Wiley
and Sons. Sie können Fluoreszenz umfassen, bevorzugt
FRET-Mikroskopie, digitale Bildaufnahme, z. B. mit Hilfe einer CCD-Kamera
und einer geeigneten Bildauswertungs-Software. Die beigefügten
Beispiele stellen auch nützliche Einstellungen bereit,
um Kandidatenverbindungen zu messen. Bevorzugt wird Schritt (c)
ausgeführt, indem man parallele Kontrollexperimente durchführt.
Zum Beispiel kann man die stabil transformierte Zell-Linie, unter
entsprechenden Bedingungen beobachten wie in Schritt (b), jedoch
ohne diese mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt zu bringen.
Alternativ kann man die stabil transformierte Zell-Linie, unter
entsprechenden Bedingungen beobachten wie in Schritt (b), jedoch
dass man die stabil transformierte Zell-Linie mit einem Aktivator
des β-adrenergen Rezeptors in Kontakt bringt.
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Der
Bergriff „Dosis” bezieht sich auf die Gabe einer
Menge eines Stoffes, wie z. B. eines hierin definierten β/β1-Rezeptorhomologs, die dem Patienten zugeführt
werden muss um eine bestimmte Wirkung zu erzielen. Hierbei unterscheidet
der Fachmann zwischen der totalen Dosis, die während der
gesamten Behandlung zugeführt wird. Die totale effektive
Dosis bezieht sich auf die bioverfügbare Dosis nach der
Gabe eines Stoffes, wie z. B. eines hierein definierten β/β1-Rezeptorhomologs. Da in den hierin beschriebenen
Verfahren die Aufnahme und Metabolisierung des zugeführten
Stoffes keine Rolle spielt, entspricht die totale Dosis der totalen
effektiven Dosis.
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Demzufolge
können potenzielle Kandidatenmoleküle mit einer
wie hierein beschriebenen transformierten Zell-Linie, die sowohl
einen β/β1-adrenergen
Rezeptor als auch einen cAMP Sensor (chimäres Peptid) stabil
exprimiert, in Kontakt gebracht werden und man kann eine entsprechende
Reaktion messen (unter anderem eine Dosis-Reaktion) um eine beliebige
Wirkung aufzuklären, welche von dem Kandidatenmolekül
verursacht wird. Eine solche Reaktion wird am meisten bevorzugt
durch Verfahren gemessen, die hierin bereitgestellt sind, und speziell
mittels FRET- oder BRET-Technologie.
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Innerhalb
des Gültigkeitsbereichs der vorliegenden Erfindung liegen
auch Verfahren zur Identifizierung, Charakterisierung und zum Screenen
von Molekülen, die in der Lage sind, mit dem β/β1-adrenergen Rezeptor zu interagieren, welche
sogenannte Hochdurchsatz-Screeningverfahren und ähnliche
Ansätze umfassen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Spencer,
Biotechnol. Bioeng. 61: 61–67 (1998); Oldenburg,
Annu. Rep, Med. Chem. 33: 301–311 (1998); Milligan,
Trends Pharmacol. Sci. 20: 118–124 (1999)), die
man mit Platten mit 96 Vertiefungen, 384 Vertiefungen, 1536 Vertiefungen
und mit anderen im Handel erhältlichen Platten durchführt.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung,
Charakterisierung und/oder zum Screenen von Molekülen,
die in der Lage sind, mit dem β-adrenergen Rezeptor zu
interagieren, können unter anderem wie hierin definierte
transformierte Zell-Linie eingesetzt werden, welche sowohl den β-adrenergen Rezeptor
als auch einen cAMP-Sensor (chimäres Peptid) stabil exprimiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der Screeningverfahren
der Erfindung handelt es sich bei der Änderung der Lichtintensität
um eine Zunahme oder eine Abnahme des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers
(FRET) oder Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform entsprechen die in den
hierin bereitgestellten Verfahren zu messenden Veränderungen
der Reaktion oder der Energie einer Zunahme oder einer Abnahme des
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET). Beim FRET sind sowohl
Donor als auch Akzeptor, d. h. beide dem Nachweis dienenden Teile,
Teile von fluoreszierenden Proteinen, und zur Messung von FRET wird
das Fusionsprotein mit Energie versorgt, z. B. mit Strahlung, die
für die Emission der Resonsanzenergie durch den ersten
dem Nachweis dienenden Teil geeignet ist.
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Die
Effizienz von FRET hängt von der Distanz zwischen den zwei
fluoreszierenden Partner ab. Die mathematische Formel, die FRET
beschreibt, ist die folgende: E = R0 6/(R0 6 +
r6), wobei E die Effizienz von FRET ist,
r die tatsächliche Distanz zwischen den fluoreszierenden
Partner ist und R0 die Förster-Distanz
ist, bei der der FRET 50% des maximalen FRET-Werts beträgt,
der für ein vorgegebenes Paar von FRET-Partnern möglich
ist. R0, die experimentell bestimmt werden
kann, hängt von der relativen Orientierung zwischen den
Fluoreszenz-Partnern (κ), dem Refraktionsindex des Mediums
(n), dem Integral der Überlappung der Emission des Donor-
mit der Anregung des Akzeptor-Partners (J(λ)) und der Quantenausbeute
des Fluoreszenz-Donor-Partners (QD) ab (R0 6 = 8,79 × 10–25[κ2n–4QDJ(λ)]
(in cm6). Bei klassischen auf FRET basierenden
Anwendungen nimmt man an, dass der Orientierungsfaktor κ2 gleich 2/3 ist, was der Wert für
Donoren und Akzeptoren ist, die vor dem Energietransfer durch Rotationsdiffusion
zufallsmäßig verteilt werden (Lakovicz,
Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2. Ausg., S. 370).
Demnach nimmt man bei einer zufallsmäßigen Rotationsdiffusion
an, dass die Veränderung des Verhältnisses nur
auf eine Veränderung der Distanz zwischen den Chromophoren zurückzuführen
ist. Für senkrechte Dipole ist κ2 0.
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Demnach
kann eine Abnahme des FRET-Signals mit Hilfe der folgenden Gleichung
bestimmt werden: r(t) = A × (1 – e–t/τ),
wobei τ die Zeitkonstante (s) ist und A die Signalstärke.
Sofern es für die Berechnung von t erforderlich können
Agonisten-unabhängige Veränderungen beim FRET
subtrahiert, die auf Photobleichung zurückzuführen
waren.
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Um
FRET für den Nachweis von Agonisten, Antagonisten, partiellen
Agonisten und partiellen Antagonisten ebenso wie von inversen Agonisten
anzuwenden, ist der Fachmann auf dem Gebiet in der Lage, geeignete
Nachweismarkierungen (die vorstehend definiert sind) für
die stabil transformierte Zell-Linie der Erfindung auszuwählen,
die einen nachweisbaren FRET zeigen sowie eine nachweisbare Veränderung
des FRET auf eine Konformationsänderung in ihrer Struktur.
Bevorzugt ist die maximale FRET-Effizienz mindestens 5%, stärker
bevorzugt mindestens 50% und am meisten bevorzugt 80% der Energie,
die von der ersten Markierung auf die Anregung hin freigesetzt wird.
Außerdem ist es notwendig, dass die zwei Nachweismarkierungen
eine spektrale Überlappung aufweisen. Je größer
die Überlappung des Emissionsspektrums des Donors mit dem Absorptionsspektrum
des Akzeptors ist, desto höher ist der Wert von R0. Akzeptoren mit höheren Extinktionskoeffizienten
führen zu höheren R0-Werten.
Im Gegensatz dazu sollte die Überlappung in den Anregungsspektren
der beiden dem Nachweis dienenden Teile klein genug sein um eine
gleichzeitige Anregung des Akzeptor-Chromophors zu verhindern. Ebenso
sollten die Spektren der beiden dem Nachweis dienenden Teile nur in
einem Maß überlappen, dass eine Unterscheidung
zwischen den zwei Emissionssignalen noch möglich ist.
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Wie
es in den beigefügten Beispielen ausführlich dargestellt
ist, handelt es sich in einer besonders bevorzugten Ausführungsform
bei dem ersten dem Nachweis dienenden Teil um verstärktes
blaugrün fluoreszierendes Protein (eCFP) und bei dem zweiten
dem Nachweis dienenden Teil um verstärktes gelb fluoreszierendes
Protein (eYFP).
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Es
ist gezeigt worden, dass CFP und YFP besonders gut für
das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung geeignet
sind, da sie eine brauchbare Veränderung im FRET zeigen.
eCFP und eYFP sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und Nukleinsäuremoleküle,
die die entsprechenden codierenden Sequenzen enthalten, sind im
Handel erhältlich, z. B. von Clontech.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung beruhen die hierin bereitgestellten Verfahren auf dem
Nachweis von Veränderungen der Reaktion oder der Energie,
die eine Zunahme oder eine Abnahme des biolumineszenten Resonanz-Energie-Transfers
(BRET) umfassen. Die BRET-Technologie ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt
und unter anderem in
Angars, Proc Natl Acad Sci U S A. 97: 3684–3689
(2000); in
Mercier, J. Biol. Chem. 277: 44925–44931
(2002); in
Barcock, J. Biol. Chem 278: 3378–3385
(2003) oder in
WO 99/66324 beschrieben.
Wie hierin vorstehend dargelegt ist, ist ein bevorzugtes biolumineszierendes
Protein Renilla-Luciferase, es kann aber auch Glühwürmchen-Luciferase
verwendet werden. Als ein bevorzugter fluoreszierendes Proteinteil
in dem chimären Peptid der vorliegenden Erfindung, das Renilla-Luciferase
als ein erstes Nachweissystem umfasst, kann verstärktes
gelb fluoreszierendes Protein oder ein gelb fluoreszierendes Protein
verwendet werden.
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Gemäß den
hierein bereitgestellten Verfahren handelt es sich bei der stabil
transformierte Zell-Linie der vorliegenden Erfindung in einer am
meisten bevorzugten Ausführungsform um eine HEK293-Zelle,
die sowohl den β-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor
exprimiert. Es ist zu beachten, dass im Kontext der vorliegenden
Erfindung mehrere Kontrollen verwendet werden können, wie
hierein vorstehend bereits kurz erörtert worden ist. Man
kann zum Beispiel Aktivatoren verwenden, die sicherstellen, dass
eine maximale Veränderung der emittierten Energie auftritt,
die gemessen werden kann. Demzufolge kann man die Testmoleküle oder
Testverbindungen oder Proben, die allein oder in Kombination mit
solchen Molekülen oder Verbindungen vorliegen, in Parallelexperimenten
unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie testen, die
in der Lage sind, eine unterschiedliche Reaktion auf eine Konformationsänderung
hin auszulösen.
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Die
Erfindung stellt auch eine diagnostische Zusammensetzung bereit,
umfassend die stabil transformierte Zell-Linie, das Nukleinsäuremolekül
des β/β1-adrenergen Rezeptors
und des cAMP-Sensors, und den Aktivator (Agonist). Eine solche diagnostische
Zusammensetzung ist bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung
besonders nützlich.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Kit, umfassend die stabil transformierte
Zell-Linie, das Nukleinsäuremolekül des β/β1-adrenergen Rezeptors und des cAMP Sensors,
einen Aktivator, sowie Rezeptorhomologe wie sie vorstehend charakerisiert
worden sind.
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Die
Ausführungsformen, die in Zusammenhang mit dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung offenbart worden sind, gelten mutatis
mutandis auch für das Kit der vorliegenden Erfindung.
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Vorteilhafterweise
umfasst das Kit der vorliegenden Erfindung ferner wahlweise (a)
Reaktionspuffer, Aufbewahrungslösungen, Waschlösungen
und/oder übrige Reagenzien oder Materialien, die für
die Durchführung von wissenschaftlichen, pharmakologischen
und Arzneimittel-Screening-Assays oder dergleichen wie hierin beschrieben
erforderlich sind. Darüber hinaus können Teile
des Kits der Erfindung einzeln in Röhrchen oder Flaschen
oder in Kombination in Behälter oder Einheiten mit mehreren
Behältern verpackt werden.
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Der
Kit der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise unter anderem
dazu verwendet werden, das wie hierin beschriebene Verfahren zum
Nachweis vom von über den β/β1-adrenergen Rezeptor vermittelten cAMP-Konzentrationen,
auf die hierin Bezug genommen wurde, z. B. zum Screenen von Verbindungen, die
in der Lage sind, die Bindung des β/β1-adrenergen
Rezeptors zu aktivieren oder zu hemmen, ebenso wie Screeningverfahren,
die in der Lage sind, die Pathogenese und den Verlauf von über
den β/β1-adrenergen Rezeptor
vermittelten Herzkrankheiten zu beobachten. Die Herstellung der
Kits folgt bevorzugt Standardprozeduren, die dem Fachmann auf dem
Gebiet bekannt sind. Das Kit der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt
nützlich in einem wie hierin bereitgestellten. Verfahren.
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Auf ähnliche
Weise werden Kits bereitgestellt, mindestens eine Verbindung der
Erfindung umfassen, insbesondere die stabil transformierte Zell-Linie.
Zusätzlich können die Kits auch ein oder mehrere
hierein beschriebenen β-adrenergen Rezeptorhomologe umfassen.
Diese Kits wie sie hierein bereitgestellt sind besonders nützlich
bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung und insbesondere bei
der Bestimmung von Agonisten des β/β1-adrenergen
Rezeptors in vitro. Diese Kits ebenso wie die hierin bereitgestellten
Verfahren sind auch nützlich bei pharmazeutischen Screenings,
was auch „Hochdurchsatz”-Screening umfasst. Der
technische Vorteil der stabil transformierten Zell-Linie, der Kits
und der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
der stabil transformierten Zell-Linie als funktioneller Biosensor.
Demzufolge sind die stabil-transformierte Zell-Linie, die Verbindungen
und Verfahren der vorliegenden Erfindung auch in der Grundlagenforschung
nützlich, bevorzugt in der biomedizinischen und/oder biochemischen
Forschung sowie bei den hierin beschriebenen Verfahren. Die Erfindung
ermöglicht auch die Verwendung spezieller Vorrichtungen,
die man einsetzen kann um die cAMP-Konzentration in der stabil transformierten
Zell-Linie zu verfolgen. Diese Vorrichtungen sind nützlich
bei der Messung von cAMP mit Hilfe der chimären Peptide/Konstrukte
der Erfindung. Die Vorrichtungen umfassen unter anderem Lichtquellen,
Filtersysteme, Systeme zum Nachweis von Licht, insbesondere Emissionsdetektoren.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung der stabil transformierten
Zell-Linie in einem der hierin beschriebenen Verfahren.
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Die
Abbildungen zeigen:
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1:
Vergleich der FRET-Ratio Änderung von transient versus
stabil transformierten HEK-293 Zellen nach Applikation eines β-adrenergen
Agonisten. HEK-293 Zellen mit stabil integriertem β1-adrenergen Rezeptor, wurden zur transienten
Expression von Epac1-camps mit dem Vektor pcDNA3Epac1-camps bzw.
zur stabilen Expression von Epac1-camps mit dem Vektor pCEP4Epac1-camps
transfiziert. Die maximale Lichtintensitätsänderung
wurde mittels FRET (im Falle der transient transfizierten Zellen
18 Stunden nach Transfektion) mit dem Agonisten Isoprenalin [10 μM]
bestimmt. Die Zugabe des Aktivators (Agonisten) führte
in transient bzw. stabil transformierten Zellen zu einer Abnahme
von FRET-Ratio, was auf eine cAMP-induzierte Konformationsänderung
hindeutet, die zu einer Vergrößerung der Distanz
zwischen CFP und YFP führte. Nachweisbare FRET-Änderungen
wurden in beiden Zell-Linien beobachtet. Der Mittelwert der FRET-Ratio Änderung
(Ratio YFP/CFP) betrug bei transient transfizierten Zellen 0,24
mit einer Standardabweichung von 0,15. Im Gegensatz dazu weist die
stabil transformierte Zell-Linie einen Mittelwert von 0,16 mit einer
Standardabweichung von 0,01. Die Basalwerte jeder Messung wurden
als FRET-Ratio auf den Wert 1 normalisiert und die Veränderung
der FRET-Ratio in Bezug gesetzt. Die maximale FRET-Ratio Änderung
bei Agonistenapplikation wurde bei jeweils n = 8 Messungen verglichen.
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2:
cAMP-Messungen in vitro. Konzentrations-Wirkungs-Kurve der stabil
transformierten Zell-Linie, wie hinterlegt mit der Nummer DSM ACC
2985. Die Zell-Linie wurde stabil mit einem Plasmid transfiziert, das
einen cAMP-Sensor codiert (EYFP-E157-E316-ECFP). Das Emissionsspektrum
wurde wie in 2 beschrieben, nach Zugabe verschiedener
Konzentrationen eines Aktivators (Agonisten) aufgenommen. Eine Abnahme
der Signalintensität bei 542 nm, verbunden mit einer Zunahme
bei 483 nm zeigt den Verlust des FRET-Signals zwischen CFP und YFP.
Das Verhältnis des Quotienten der Signalintensität
483 nm und der Signalintensität 543 nm zur Konzentration
des Aktivators (Agonisten) konnte in einer Dosis-Wirkungs-Kurve
graphisch verfolgt werden. Bei einer Zugabe von 5 μM eines β/β1-adrenergen Aktivators/Agonisten (wie z.
B. Isoprenalin) weist die stabil transformierte Zell-Linie eine
maximale cAMP-Bildung auf. Die mittlere effektive Konzentration
(EC50) von Isoprenalin beträgt
0,2 nM, damit ist die Zell-Linie hochsensitiv für intrazelluläre cAMP-Konzentrationsänderungen
im physiologischen Bereich. Die maximale Änderung der FRET-Ratio
nach Agonistenapplikation wurde auf 100% normalisiert In einem Kontrollexperiment
verursachte die Applikation von FRET-Puffer (50 μl) in
Abwesenheit eines Aktivators/Agonisten (wie z. B. Isoprenalin) des β1-adrenergen Rezeptors keine Änderung
der FRET-Ratio (0%).
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3:
Messung des cAMP-Gehaltes in den stabil transformierten Zellen (wie
z. B. DSM-ACC 2985) mittels anti-β1-Antikörpern
aus DCM-erkrankten Ratten, die aus mit dem GST/β1-ECII-Konstrukt
(Jahrs, Eur. J. Pharmacol (1996)) immunisiert wurden.
Der Basalwert der FRET Ratio wurde auf den Wert 1 normalisiert.
Die anti-β1-Antikörpervermittelte
Reaktion der Zellen betrug 16,9% der maximalen Isoprenalin-induzierten
Aktivierung. Der verwendete Caprylsäure-gefällte
und über Nacht mittels FRET-Puffer dialysierte anti-β1-Antikörper wurde in einer Endkonzentration
von 0,26 mg pro ml eingesetzt, die Endkonzentration des Aktivators
betrug 5 μM.
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4:
Kontroll-cAMP-Messung unter Verwendung einer Antikörperpräparation
einer NaCl-injizierten Ratte. Der Basalwert der FRET Ratio wurde
auf den Wert 1 normalisiert. Die Versuchsbedingungen der FRET-Messung
waren identisch zu denjenigen der Messung von anti-β1-Antikörpern aus positiven Rattenseren
(siehe 3).
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5:
Messung des cAMP-Gehaltes unter Verwendung eines monoklonalen murinen
anti-β1-Antikörpers. Der
Basalwert der FRET Ratio wurden auf den Wert 1 normalisiert. Die
anti-β1-Antikörper vermittelte
Reaktion der Zellen betrug 38,2% der maximalen Isoprenalininduzierten
Aktivierung. Der verwendete dialysierte Zellkulturüberstand
der Hybridomazellen wurde in einer Endkonzentration von 0,26 mg
pro ml eingesetzt Die Endkonzentration des verwendeten Aktivators
(Isoprenalin) betrug 2,5 μM.
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6:
Messung des cAMP-Gehaltes unter Verwendung von anti-β1-Autoantikörper. Die verwendeten anti-β1 Autoantikörper wurden aus dem
Serum an DCM-erkrankten Patienten mittels Caprylsäure-Fällung
(siehe Beispiel 7) isoliert. Der Basalwert der FRET-Ratio ist auf
den Wert 1 normalisiert. Die anti-β1-Autoantikörper vermittelte
Reaktion der Zellen beträgt 26,8% der maximalen Isoprenalin-induzierten
Aktivierung. Der verwendete dialysierte anti-β1-Autoantikörper
wurde in einer Endkonzentration von 0,26 mg pro ml eingesetzt. Die Endkonzentration
des Aktivators (Isoprenalin) betrug 2,5 μM.
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7:
Fluoreszenzmessungen der Emissionen der Einzelkanäle (eCFP,
Wellenlänge = 483 nm, durchgezogener Graph; eYFP, Wellenlänge
= 542 nm, gestrichelter Graph) einer cAMP-Messung unter Verwendung
eines anti-β1-Autoantikörper
eines an DCM-erkrankten Patienten (6). Der
humane anti-β1-Autoantikörper
bewirkte eine Reduktion der eYFP-Emissionsintensität bei
einem parallelen Anstieg der eCFP-Emissionsintensität.
Aus den abgebildeten Emissionsintensitäten der Einzelkanäle
errechnet sich die FRET-Ratio (siehe 6).
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8:
Vergleich einer cAMP-Messung unter Verwendung von anti-β1-Autoantikörper eines an DCM erkrankten
Patienten, in Abwesenheit (durchgehende Linie) bzw. Anwesenheit
(gestrichelte Linie) eines Zyklopeptids. Caprylsäure-gefällte
und dialysierte anti-β1-Autoantikörper
sind wurden in einer Endkonzentration von 0,26 mg pro ml über
einen Zeitraum von 12 Stunden bei 4°C unter Schütteln
in FRET-Puffer in 40fach molarem Überschuss mit dem Zyklopeptid
[cyclo(Arb-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly)]
inkubiert. Die maximale Reaktion der Zellen auf Isoprenalin wurde
auf 100% normalisiert. Die unblockierten, d. h. in Abwesenheit des
Zyklopeptids inkubierten anti-β1-Autoantikörperweisen
im Vergleich zur Maximalantwort 10,2% Aktivierung auf, wohingegen
die blockierten, d. h. in Gegenwart des Zyklopeptids inkubierten
anti-β1-Autoantikörper
der Patientin keine Aktivierung zeigen.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden
Beispiele veranschaulicht.
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Beispiele
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Beispiel 1: Konstruktion der verwendeten
Vektoren
-
A) Konstruktion des zur transienten Transformation
verwendeten pcDNA3-Vektors
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Das
DNA-Konstrukt pcDNA3-Epac1, das zur transienten Transformation des
cAMP-Sensors in HEK-293 Zellen, die den β
1-adrenergen
Rezeptor stabil exprimieren, wurde in einer mehreren Stufen umfassenden
Klonierungsstrategie hergestellt. Für die Klonierung des
neuen Vektors wurde der Expressionsvektor pcDNA3 mit den Restriktionsenzymen
EcoRI und ApaI verdaut. Parallel dazu wurde die cDNA, welche die
fluoreszierenden Markierungen codieren, mittels PCR unter Verwendung
der jeweiligen Primer
aus den
Plasmiden pEYFP und pECFP (Clontech) reamplifiziert und für
den späteren Restriktionsverdau mit den Schnittstellen
XbaI, NotI und XhoI (eCFP) bzw. HindIII und EcoRI (eYFP) versehen.
Die Sequenzen wurden anschließend über die Restriktionsschnittstellen
in den Vektor pcDNA3 cloniert. Der neue Vektor wurde mit dem Namen
pcDNA3-camps bezeichnet. Parallel dazu wurde die cDNA von menschlichem
Epac1 wurde unter der Verwendung nachstehender Primer mittels PCR
amplifiziert
und für
den späteren Restriktionsverdau mit den Restriktionsschnittellen
EcoRI und XbaI versehen. Anschließend werden die Fragmente über
die angegebenen Restriktionsschnittstellen in den zuvor konstruierten
Vektor pcDNA3 cloniert. Der so konstruierte Vektor wurde mit dem
Namen pcDNA3-EpacI bezeichnet.
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B) Konstruktion des zur stabilen Transformation
verwendeten pCEP4 Vektors
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Zur
Herstellung des DNA-Konstrukts pCEP4-Epac1-camps, das zur stabilen
Transformation des cAMP-Sensors in HEK-293 Zellen, die den β1-adrenergen Rezeptor stabil exprimieren,
verwendet wurde, wurden die Sequenzen für die cAMP-Bindungsdomänen
mit denen von eYFP und eCFP aus dem Vektor pcDNA3-Epac1 mit den
Restriktionsenzymen HindIII und XhoI cloniert.
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Beispiel 2: Kultivierung der stabil transformierten
Zell-Linie DSM ACC 2985
-
Man
kultivierte HEK293-Zellen, die stabil den β1-adrenergen
Rezeptor exprimierten in DMEM mit 4,5 g/L Glucose, 10% fötalem
Kälberserum, 200000 U/L Penicillin, 200 mg/L Streptomycin,
2 mM Glutamin, 440 mg/L G418, transfizierte diese Zellen mit 10 μg
DNA für den cAMP-Sensor (pCEP4-Epac1-camps), wobei man die
Calciumphosphat-Methode verwendete. Transfizierten Zellen wurden
mit Hilfe eines Hämocytometers gezählt und verdünnt,
sodass eine Zellkonzentration von 10 Zellen pro ml eingestellt wurde.
Die Kultivierung der eingestellten Zellsuspension (100 μl)
erfolgte in DMEM mit 4,5 g/L Glucose, 10% fötalem Kälberserum,
200000 U/L Penicillin, 200 mg/L Streptomycin, 2 mM Glutamin, 440
mg/L G418 und 50 mg/L Hygromycin bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit
und 7% CO2 in einer 96-Well-Platte. Transfizierte
Zellen wurden nach zehn Tagen fluoreszenzmikroskopisch analysiert,
wobei jede Zellkolonie eines Wells für die fluoreszenzmikroskopischen
Messungen auf einer 96-Well-Platte ausplattiert wurde. Bei der fluorimetrischen
Analyse wurde die FRET-Emission wie in Beispiel 4 und 7 beschrieben
vermessen und sowohl der Einfluss eines Agonisten (Isoprenalin),
als auch auf einen murinen β1-adrenergen
Antikörper (GST/ECII) in der Endkonzentration
von 0,26 mg pro ml analysiert. Eine auf diese Weise untersuchte
Zell-Linie wurde mit der Nummer DSM ACC 2985 als biologisches Material bei
der DSMZ hinterlegt.
-
Beispiel 3: FRET-Messungen und Bildgebung
von Zellen
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Für
fluoreszensmikroskopische Messungen wurden die Zellen in einen Puffer
der 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2,
1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.33 enthielt,
in eine Testkammer überführt. Die Testkammer war
in einem Zeiss Axiovert 200 Umkehrmikroskop, das mit einem 10 × Olympus
air-Objektiv, einem photometrischen System mit zweifacher Emission
(Till Photonics), und einer Interline „IMAGO Type QE”-CCD-Kamera
ausgestattet war. Die Proben wurden mit Licht der Wellenlänge
436 nm von einem Polychrom IV (Till Photonics) angeregt. Die FRET-Ratio
wurde mit Hilfe der Software MetaFluor 5.0r6 (Universal Imaging
Corp.), als das Verhältnis der Emission bei 535 15 nm und
480 ± 20 nm nach Anregung bei 436 ± 10 nm hin
verfolgt. Die Bilddaten wurden mit der Software Till Vision analysiert
und für Überstrahlung von CFP in den 535 nm – Kanal
ebenso wie für Photobleichung des Akzeptors korrigiert,
um ein korrigiertes Verhältnis F 535 nm/F 480 nm zu erhalten.
Für die Messung der durch Aktivatoren (Agonisten) induzierte
Veränderungen des FRET zu untersuchen, wurden die Zellen
permanent mit Messpuffer und Aktivatoren (Agonisten) umspült.
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Beispiel 4: FRET-Messung in vitro
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Die
stabil transformierte Zell-Line DSM ACC 2985, wurde bei 37°C
zu einer Dichte von mindestens 80% Konfluenz auf Poly-D-Lysin gecoatete
96-Well-Platten mit mikroskopiegeeignetem Folienboden ausgebracht
und zwölf Stunden in DMEM mit 4,5 g/L Glucose, 10% fötalem
Kälberserum, 200000 U/L Penicillin, 200 mg/L Streptomycin,
2 mM Glutamin, 440 mg/L G418 und 50 mg/L Hygromycin bei 37°C,
95% Luftfeuchtigkeit und 7% CO2 inkubiert.
Zur fluorimetrischen Analyse wurden die Wells zweimal mit 100 μl
FRET-Puffer, der 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2,
1 mM MeCl2, 10 mM HEPES, pH 7.33 enthielt,
gespült und für 10 min inkubiert. Nach dieser
10 minütigen Inkubation wurden bei 37°C die Fluoreszenzemissionsspektren
des Überstands (Anregung bei 436 nm, Emissionsbereich 460
bis 550 nm) aufgenommen.
-
Beispiel 5: Messung des cAMP-Gehalts
-
Messungen
von cAMP-Gehalts können mit Hilfe eines optischen Verfahrens
durchgeführt werden, das auf Fluoreszenz Resonanz Energie
Transfer (FRET) zwischen zwei fluoreszierenden Markierungen (z.
B. CFP und YFP) basiert, die direkt an eine einzelne cAMP-Bindungsdomäne
fusioniert sind. Auf FRET beruhende Messungen von cAMP unter Verwendung
der erfingungsgemäß stabilen Zell-Linie, welche
mit der Nummer DSM ACC 2985 hinterlegt ist, sind aufgrund einer
Konformationsänerung in der cAMP-Bindungsdomäne
möglich, was zu einer Vergrößerung der
Distanz zwischen beiden fluoreszierenden Markierungen führt.
Diese Distanzvergrößerung hat eine Abnahme von
FRET zur Folge. Eine Abnahme von FRET wird als eine Vergößerung
des Intensitätsverhältnises der Emission von eYFP
zu eCFP, das heißt der FRET-Ratio gemessen. Folglich führt
die Bindung von cAMPan den cAMP-Sensor zu einer Verringerung der
Intensität von YFP bei einer gleichzeitigen Zunahme von
CFP, was sich in einer Verringerung des Intensitätsverhältnisses
von YFP zu CFP wiederspiegelt. Somit lässt sich unter Verwendung
der stabil transformierten Zell-Linie DSM ACC 2985 mit einem cAMP-Sensor,
der auf einer einzelnen cAMP-Bindungsdomänen basiert (die
nur eine cAMP-Bindestelle umfassen), der intrazelluläre
cAMP-Gehalt in einem physiologischen Bereich zwischen 0 und 200 μM
messen.
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Beispiel 6: Präparation von ImmunglobulinG
(IgG) aus humanem Serum
-
Die
Immunglobulin-Präparation erfolgte aus humanem Serum von
Probanden, die an einer Herz-Krankheit leiden, welche durch idiopathische
dilatative Kardiomyopathie vermittelt wird. Hierbei betrug die Ejektionsfraktion
der als DCM-Patienten charakterisierten Patientengruppe < 40%. Ebenso wurden
Ischämie und Erkrankungen der Koronargefäße,
Alkoholmissbrauch sowie andere toxische Einflüsse ausgeschlossen
(Jahns, Circulation. 99: 649–654 (1999)).
Ferner wurde ImmunglobulinG aus Ratten, die gegen die zweite extrazelluläre
Domäne des humanen β1-adrenergen
Rezeptors unter Verwendung des GST/beta1-ECII-Fusionproteins immunisiert
wurden, gewonnen. Die Präparation der ImmunglobulinG-Fraktion
aus humanem Serum erfolgte mittels der Caprylsäure-Fällung.
Hierzu wurde ein Volumenanteil Serum mit zwei Volumenanteilen 60
mM Natriumacetat (pH 4,0) versetzt, wobei tropfenweise unter Rühren
0,07 Volumenenteile Caprylsäure zugegeben wurden. Anschließend
wurde der Ansatz 30 min bei Raumtemperatur unter Rühren
inkubiert und dann bei 4°C und 5000 g für 15 min
zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Hilfe einer 14000
MWCO Dialysemembran gegen 5 L FRET-Puffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl,
5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, pH 7,33) dialysiert und als Testsubstanz
in einer Konzentration von 0,26 mg pro ml.
-
Beispiel 7: Herstellung monoklonaler Antikörper
mittels Hybridomazellen
-
Zellkulturüberständen
der Hybridomazellen zur Produktion monoklonaler Antikörper
wurden nicht mit Caprylsäure gefällt, sondern
direkt dialysiert. Für die Generierung der Hybridomazellen
wurde die Myelomzell-Linie SP2/0-Ag14, bezogen von der Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, verwendet. Zur Herstellung
der monoklonalen Antikörper wurden Milzzellen von den mit
dem Fusionsprotein GST/biECIIE3
(SEQ ID: ADEARRCYNDPKCSDFVQ), immunisierten Mäusen mit
den Meyelomzellen SP2/0-Ag14 nach Standardbedingungen fusioniert
und kultiviert.
-
Beispiel 8: Verwendung der stabil transformierten
Zell-Linie DSM ACC 2985
-
Messungen
von cAMP mittels der erfindungsgemäß, stabil transformierten
Zell-Linie DSM ACC 2985 eignet sich zur Anwendung bei biologisch,
pharmakologisch und Antikörper relevantem Screening von β1-adrenerg vermittelten Krankheiten (wie
z. B. idiopathische dilatative Kardiomyopathie). Hierfür
wurde zunächst über einen Zeitraum von vier Minuten
die FRET-Emission in Abwesenheit der zu testenden Verbindung visualisiert. Anschließend
wurden die in den Beispielen 6 und 7 beschriebenen Antikörperpräparationen
in einer Endkonzentration von 0,26 mg pro ml appliziert und der
Verlauf des Emissionsprofils wurde über einen Zeitraum
von 22 Minuten graphisch verfolgt. Um relative Aussagen über
den cAMP-Gehalt treffen zu können, wurde zum Ende einer
jeden Messung ein Aktivator (z. B. Isoprenalin) in einer Endkonzentration
von 2.5 μM appliziert, um die maximal β1-adrenerg vermittelten FRET-Emission über
einen Zeitraum von sechs Minuten bestimmen zu können. In
einer weiteren Andwendungsform wurden Caprylsäure-gefällte
und dialysierte anti-β1-Autoantikörper
eines an DCM erkrankten Patienten in einer Endkonzentration von
0.26 mg pro ml für einen Zeitraum von 12 Stunden bei 4°C
unter Schütteln in FRET-Puffer bei einem 40-fachen Überschuss
von dem Zyklopeptid (cyclo(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly)
inkubiert und anschließend, wie oben beschrieben, der Verlauf
des Emissionsprofils über einen Zeitraum von 22 Minuten
graphisch verfolgt. Um relative Aussagen über den cAMP-Gehalt
treffen zu können, wurde zum Ende einer jeden Messung ein
Aktivator (z. B. Isoprenalin) in einer Endkonzentration von 2,5 μM
appliziert, um die maximal β1-adrenerg
vermittelte FRET Emission über einen Zeitraum von sechs
Minuten bestimmen zu können (8).
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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