JP2009523024A - 発光性トランスジェニック非ヒト動物、子孫、派生細胞(cellderivatives)およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
in vivoでアポ発光タンパク質を合成および発現することができる非ヒトトランスジェニック動物、その子孫、派生細胞、およびそれらの使用を記載する。
Description
本発明は、in vivoでアポ発光タンパク質(apophotoprotein)を合成および発現することができるトランスジェニック非ヒト動物、およびそれらの使用に関する。
幹細胞は、長期の細胞分裂によって自己再生することができる未分化細胞である(1)。さらに、幾つかの生理または実験条件下では、幹細胞は、鼓動する心筋細胞または膵臓のインシュリン産生細胞などの異なる細胞型に分化することができる(2、3)。
幹細胞は、それらの発生能に基づいて細分および分類することができる。全能性幹細胞は、卵と精子細胞の間の融合から生成される。受精卵細胞の最初の数回の分裂によって生成される細胞も、全能性である。これらの細胞は任意の型の細胞に増殖する可能性がある。多能性幹細胞は全能性細胞の子孫であり、全能性幹細胞以外の任意の細胞型に分化する可能性がある。多能性幹細胞は密接に関連があるファミリーの細胞である細胞(例えば、赤血球細胞、白血球細胞および血小板などの血液細胞)のみを生成することができる。(時折単能性と呼ばれる)前駆細胞は一種の細胞型のみを生成することができるが、それらを非幹細胞と区別する自己再生の性質を有する(3〜6)。
幹細胞は、それらの源によって成体または胚のいずれかとして分類することもできる。成体幹細胞は特定組織の分化細胞内で見られる未分化細胞であり、大部分は多能性であり、数個の限られた数の細胞型だけには限られないがそれらを生成することができる。成体幹細胞は新生児、臍帯、胎盤および羊水由来の幹細胞も含む。成体幹細胞は体性幹細胞、または組織幹細胞とも呼ばれ、分化組織中で見られ、その中で成体幹細胞は制御された形式で、分化および/または分裂して、それらが由来する組織のあらゆる特殊化細胞型を生成する(7〜9)。
胚幹細胞は、生殖細胞を含めたあらゆる型の特殊化細胞になる発生能(多能性)を有する。胚幹細胞は、分化を伴わずにそれらの増殖を可能にする条件下で、培養中に無限に増殖する能力を有する(3)。げっ歯類およびヒト由来の3つの型の多能性胚幹細胞が現在までに発見されてきている(10):
−着床前の胚盤胞段階の胚の内細胞塊由来の胚幹細胞(ES)。これらは通常の核型を有する。例えばマウスES TBV2、R1、D3細胞のような、幾つかの型のマウスおよびヒトの胚幹細胞が知られており、樹立されている(11〜13、63)。
−奇形腫由来の胚性癌腫細胞(EC)。奇形腫は、3つの一次胚葉(内肺葉、中肺葉、および外肺葉)由来の広範囲の組織内に存在する、多能性幹細胞を含む性腺腫瘍である。最も使用される細胞系はマウスEC P19細胞系である。これらの細胞は通常の核型を有していない(14〜18)。
−胎児の生殖隆起(PGC)の培養始原生殖細胞由来の胚性生殖細胞(EG)。これらは通常の核型を有するが、遺伝的には異常に刷り込まれている(19〜22)。
−着床前の胚盤胞段階の胚の内細胞塊由来の胚幹細胞(ES)。これらは通常の核型を有する。例えばマウスES TBV2、R1、D3細胞のような、幾つかの型のマウスおよびヒトの胚幹細胞が知られており、樹立されている(11〜13、63)。
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−胎児の生殖隆起(PGC)の培養始原生殖細胞由来の胚性生殖細胞(EG)。これらは通常の核型を有するが、遺伝的には異常に刷り込まれている(19〜22)。
ESおよびEG細胞をレシピエントマウスの胚盤胞に注入して、キメラ動物を生成することができる。キメラマウスでは、これらの多能性細胞は、生殖細胞系列を含めたそれぞれの細胞型に貢献する可能性がある(20、21、23、24)。対照的に、胚中に導入されたマウスEC細胞は大部分の胚系列に定着するが、1つの実験を除いて(25〜27)生殖細胞系列には一般に定着しない。EC細胞が機能性配偶子を形成できないことは、それらの異常な核型を表す可能性が最も高い(28)。
幹細胞はハイスループットスクリーニング(HTS)技術の非常に強力なツールである、何故なら幹細胞はin vitroで長時間培養および増殖することができ、自己再生の性質を維持し、さらにそれらは微細化を経る可能性があるからである。幹細胞は、純粋なES細胞群を調製するために選択および誘導マーカーの使用を可能にする。遺伝子標的化/相同的組換えの技術は、特定遺伝子のノックアウト(KO)またはノックイン(KI)を可能にする。さらに胚幹細胞は、初代細胞と似た任意の細胞型に分化することができる(何故ならそれらは非腫瘍細胞だからである)。このようにして、胚幹細胞は標的に本来の環境をもたらし、胚幹細胞は、本来の方法で制御および発現される(マルチサブユニットイオンチャンネルのような)複合標的に対処することができる。これは非常に重要な改良点である、何故なら通常HTSスクリーニングでは、細胞ベースのアッセイは腫瘍細胞系を使用して設定し、この腫瘍の環境は生理的細胞条件を変えることができることは知られているからである。
多能性胚幹細胞の使用は、製薬分野において基本的役割を得ている(29)。薬剤発見における遺伝子機能の理解は成功の根本なので、例えば標的評価用に、マウスES細胞はKOマウスと比較してより迅速で安価なツールとなる。さらに致死的KOの場合、ES細胞の使用は遺伝子機能の評価に非常に有用である可能性がある。
幹細胞は胚幹細胞試験(EST)用にも使用されてきており、これはEVCAM試験(European Centre for the Validation of Alternative Methods)によって肯定的に評価された。これは、3つの生殖細胞系列(内肺葉、中肺葉、および外肺葉)から生じる細胞および組織の分化に対する、薬剤の毒性および奇形学的試験である。幹細胞は、多能性幹細胞の分化によって得られた鼓動する心筋細胞における、変時作用に対する薬剤の二次的影響を分析するためにも非常に重要である。この種の試験は、毒性試験に使用する動物の数を減らすことができる。例えば欧州連合では、現在市場に出ている30000までの化学物質を向こう10年内に再度評価しなければならない。これは、約1千万の動物の使用を意味する。ESTのようなin vitro試験の作成はこの意味において重要である可能性があり、従来の全動物実験より短い時間でより多くの化学物質の試験を可能にする可能性もある(30、31、32)。
生物発光は、様々な化学発光反応系を介して生きている生物またはそれらに由来する物質によって、可視光線が発せられる現象である。生物発光反応は、3つの主な要素、ルシフェリン(基質)、ルシフェラーゼ(酵素)および分子酸素を必要とする。しかしながら、幾つかの反応では、カチオン(Ca++およびMg++)および補因子(ATP、NAD(P)H)を含めた、他の要素が必要とされる可能性もある。ルシフェラーゼは基質、ルシフェリンの酸化を触媒する酵素であり、不安定な中間体を生成する。不安定な中間体がその基底条件に崩壊し、オキシルシフェリンを生成するとき、光が発せられる。多くの異なる無関係な型のルシフェリンが存在するが、少なくとも7個の門由来の多くの種は、セレンテラジンとして知られる同じルシフェリンを使用する。幾つかの動物(例えばクラゲ)では、ルシフェリン/ルシフェラーゼ系は、カルシウムの結合によって光を発する安定した「発光タンパク質」の形で抽出することができる。発光タンパク質は、それらがルシフェラーゼとルシフェリンの安定条件の酸化型中間複合体である点でルシフェラーゼと異なる。
発光タンパク質は多くの海洋腔腸動物中に存在し、これらの生物が繁殖、採食および防御を含めた様々な目的で光を発するのを可能にする(33)。多くの発光生物が存在するが、わずか7個の発光タンパク質、すなわちサラシコリン(34、35)、エクオリン(36、37、38)、ミトロコミン(ハリスタウリンとの合成)(39、40)、クリチン(フィアリジンとの合成)(40、41)、オーベリン(34、38、42、43)、ムネミオプシン(44、45)およびベロビン(44、45)がこれまで単離されてきている。全てのこれらのタンパク質は、アポタンパク質、イミダゾピラジン発色団(すなわち、セレンテラジン)および酸素によって形成される複合体である。それらのアミノ酸配列は、特に3つのカルシウム結合部位(EF−ハンド構造)を含む領域中で高度に保存されている。用語「発光タンパク質」は発光することができるセレンテラジン結合ポリペプチドを示し、一方「アポ発光タンパク質」はセレンテラジンを含まないタンパク質を示すために使用する。
最も試験されている発光タンパク質はエクオリアビクトリア(Aequorea victoria)から単離されるエクオリン(46)、およびオーベリアロンギシマ(Obelia longissima)から単離されるオーベリン(47)である。発光タンパク質はセレンテラジン、分子酸素、EDTAおよび2−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールとのインキュベーションによってアポ発光タンパク質から再生することができる。セレンテラジンは発光タンパク質エクオリン、ミトロコミン、クリチンおよびオーベリンによって使用される共通の発光基質なので、これら4個の発光タンパク質において発光反応はおそらく同じである(48、49、50、51)。
細胞事象およびそれらの制御の試験は、感度の良い、非侵襲性の分析法を必要とする。発光タンパク質および一般に生物発光の使用は優れたレポーター系である、何故ならそれらは、蛍光系とは対照的にバックグラウンドを実質的に有していないからである。
発光タンパク質は、シグナル伝達および遺伝子発現と関係がある細胞事象をモニタリングするためのレポーター遺伝子として、細胞培養系において広く使用されている(33、34、46)。異なる刺激に応じたカルシウムの変化をモニタリングするために、哺乳動物細胞中で発光タンパク質を発現させる。細胞内カルシウム濃度は、アポ発光タンパク質を発現する哺乳動物細胞に補因子セレンテラジンを加えること、および細胞内カルシウム濃度の指標である光子放出を検出することによって測定することができる。細胞内カルシウム濃度の調節と関係があるアポ発光タンパク質と受容体の両方を発現する細胞の使用により、化合物を細胞内カルシウムの放出に対するそれらの影響に関してスクリーニングするための有効なシステムが提供される。
ハイスループットスクリーニングアッセイは、レポーター系として発光タンパク質を使用して設計されることが多い。系の感度およびそのノイズに対する高いシグナル比は、少ないアッセイ体積の使用を可能にする。
カルシウムフラックスアッセイは、多数のサンプルを同時分析するのに適しており発光画像化システムを備える光学スクリーニング装置を使用して、HTS形式で一般に実施される。
しかしながら、カルシウム濃度の変化は、HTSアッセイにおいて最も使用されている機器の1つである、FLIPR(登録商標)(蛍光イメージングプレートリーダー、Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA)のような蛍光測定機器を使用して、例えばFluo3、Fluo4、Fura2およびCalcium dyes(Molecular Devices and Molecular Probes)のような蛍光カルシウム用色素を使用して検出することもできる。この装置は細胞単層上でのシグナル分離を可能にする光学的検出用デバイスを備えており、これによって細胞ベースのアッセイの感度を増大させる。
最も近年のFLIPR(登録商標)システムのバージョンは、CCDカメラベースの機器と比較して低い感度を有する場合でさえ、発光アッセイにも適した条件になっている。このシステムの低い発光感度を克服するために、増大した発光を有する発光タンパク質は非常に有利である。
欧州特許第1413584号
WO2006/094805
欧州特許出願第05005390.9号
欧州特許出願第06000171号
本発明者らは、アポ発光タンパク質を発現することができる、元のゲノムの遺伝的改変によって得られる非ヒトトランスジェニック動物を開発した。動物モデルとして、アポ発光タンパク質を発現する胚幹細胞を偽妊娠メスマウスの胚盤胞に注入し、生成したキメラを野生型マウスと交配させることによって、トランスジェニックマウスを得た。
本発明の目的は、アポ発光タンパク質遺伝子を発現することができ、細胞内カルシウム濃度の変化に応じて生物発光シグナルを生成することができる、非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞である。
派生細胞は、初代または幹細胞、委任細胞(committed cell)、分化細胞、細胞群、組織または器官である細胞であると考えられる。
好ましい態様では、アポ発光タンパク質遺伝子の発現および/または細胞内カルシウム濃度の変化に応じた生物発光シグナルの生成は偏在する。
他の好ましい態様では、アポ発光タンパク質遺伝子の発現および/または細胞内カルシウム濃度の変化に応じた生物発光シグナルの生成は、誘導性および/または器官、組織、細胞または発生段階特異的である。
好ましい実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物、より好ましくはげっ歯類、最も好ましくはマウスである。
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、当技術分野で知られている技法、すなわちアポ発光タンパク質を発現することができ、細胞内カルシウム濃度の変化に応じて適切な発色団基質の存在下で生物発光シグナルを生成することができる胚幹細胞を使用することによって得られる。発光タンパク質、および一般に生物発光は、有効なレポーター系として使用されることが多い。
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、アポ発光タンパク質を発現することができる、原型ゲノムの遺伝的改変によって得られる任意の非ヒト哺乳動物であると考えられる。典型的には、トランスジェニック動物は、当技術分野で知られている技法、すなわちアポ発光タンパク質を発現する胚幹細胞を偽妊娠メスの胚盤胞に注入し、生成したキメラを野生型動物と交配させることによって得られる。
アポ発光タンパク質は、天然の、または組換えもしくは合成による、任意のアポ発光タンパク質であると考えられる。アポ発光タンパク質は、改善された発光活性および/またはカルシウム感受性をさらに有する天然または変異誘発突然変異体、または発光タンパク質の活性プロファイルが、発光およびカルシウム応答性の点で維持されるかあるいは増大するという条件で、1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、付加または置換によってさらに他に修飾されている2つの異なる天然アポ発光タンパク質由来のキメラタンパク質であってよい。アポ発光タンパク質の配列は、哺乳動物のコドン使用頻度に対して最適化し、および/またはミトコンドリア標的配列と融合することもできる(52、53、54)。増大した生物発光を有するアポ発光タンパク質、すなわちクリチン(Clytin)タンパク質の領域を用いたタンパク質Obelinのキメラ化によって得られた、アポ発光タンパク質Photina(登録商標)(欧州特許第1413584号中に記載され、かつ本明細書では配列番号1として報告する)は、従来技術において既に開示されている。
増大した生物発光を有するアポ発光タンパク質は、以下の位置Gly142→Cysで変異誘発したClytin配列(GenBank登録番号Q08121)、または以下の12の位置:G1y58→Glu、Asp69→Val、A1a70→Cys、Lys76→Arg、Lys77→Gly、Ile78→Cys、Asp81→Glu、Val86→Ile、G1u87→Ala、Ala90→Gln、Val92→Leu、およびG1u97→Glnで変異誘発されたClytin配列(GenBank登録番号Q08121)など、WO2006/094805中に記載されたのと同様に変異誘発から誘導することもできる。
レポーターアポ発光タンパク質は、偏在的、器官、組織、細胞または発生段階特異的または誘導性プロモーターの制御下でクローニングすることができることが好ましい。
幹細胞は一般に、胚または成体由来である、全能性および/または多能性非ヒト細胞、あるいはヒトまたは非ヒト腫瘍多能性細胞、あるいは多能性細胞またはその子孫として考えられる。トランスジェニック動物を作製するのに好ましい幹細胞は、全能性および多能性胚幹細胞である。
特に好ましい幹細胞はマウス胚幹細胞、好ましくはES TBV2(63)細胞である。
典型的には、胚幹細胞は、アポ発光タンパク質コード配列を含む発現ベクターが安定的にトランスフェクトされる。
アポ発光タンパク質を発現する最終的な陽性クローンは、それらの発光タンパク質含有量、および適切な刺激に応答するそれらの能力に基づいて選択する。
胚幹細胞は、偽妊娠メスマウスの胚盤胞に注入する。このように作製したキメラマウスは、次いで他のマウスと交配させて、トランスジェニック異型動物を作出する。
同型動物を得るためには、2つの異型動物同士を交配する。
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、薬理学的ex−vivo試験または移植実験に使用することができる、組織または器官の貴重な供給源である。例えば膵臓ランゲルハンス島は、グルコースの(glucidic)または脱分極刺激によるカルシウムの動きをモニタリングするためにex−vivoで使用することができる。
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、成体および胚由来の幹細胞および/または例えばマクロファージ前駆細胞のようなアポ発光タンパク質レポーター遺伝子を含む初代細胞などの、派生細胞の貴重な供給源である。この状況において派生細胞は、胚または成体起源である、初代細胞または幹細胞全能性または多能性または多分化能または前駆細胞である。
レポーター系としてアポ発光タンパク質を含む派生細胞を直接使用して、セレンテラジンを添加した後、あるいはセレンテラジンを動物に静脈内注射し、次いで試験用分子または刺激を加えた後に、細胞ベースのアッセイを作製することができる。
レポーター系としてアポ発光タンパク質を含む初代派生細胞は、特定の標的のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング目的で、あるいはES/発光タンパク質細胞の分化後に得る「初代様(primary−like)」細胞の陽性対照として直接使用することができる。
派生幹細胞を特定の細胞系列に分化させて、特定の標的を発現させることが可能である。派生幹細胞は、セレンテラジン添加後に分化条件で使用して細胞ベースのアッセイを作製することができ、特定の標的のアゴニストまたはアンタゴニストを同定することができ、あるいは未分化条件で使用して分化促進剤または分化阻害剤を同定することができる。
特定の細胞系列は、筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列あるいは造血または間葉細胞系列由来の細胞系列であることが好ましい。
本発明は有利なことに、多くの用途、例えば治療、診断用途の化合物をin vivoにおいて同定および/または試験するための方法を提供する。
本発明の状況では、化合物ライブラリーは、試験または同定する化合物の、合成または組換え体のいずれかの集合である。
本発明の他の目的は、細胞内Ca++の変化が得られるように特定の標的を刺激することができるリガンドを同定するための方法であって、
a) 初代細胞または幹細胞である本発明による派生細胞を用意するステップと、
b) 最終的には前記細胞を特定の細胞系列に分化させることによって、前記標的を発現させるステップと、
c) 基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
d) 前記標的の推定リガンドを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
e) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
a) 初代細胞または幹細胞である本発明による派生細胞を用意するステップと、
b) 最終的には前記細胞を特定の細胞系列に分化させることによって、前記標的を発現させるステップと、
c) 基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
d) 前記標的の推定リガンドを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
e) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
初代細胞または幹細胞は、標的を内因的に発現することができる。
特定の細胞系列は、筋肉心臓細胞系列もしくは神経細胞系列または造血もしくは間葉細胞系列由来の細胞系列であることが好ましい。
ハイスループットスクリーニングによって方法を実施することがより好ましい。
本発明の他の目的は、細胞内Ca++の変化が得られるように、標的に対するアンタゴニストを同定するための方法であって、
a) 初代細胞または幹細胞である本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞を用意するステップと、
b) 最終的には前記細胞を特定の細胞系列に分化させることによって、前記標的を発現させるステップと、
c) 基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
d) 前記標的の推定アンタゴニストを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
e) 前記標的を刺激することができるリガンドと細胞を接触させるステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光の変化を検出するステップとを含む方法である。
a) 初代細胞または幹細胞である本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞を用意するステップと、
b) 最終的には前記細胞を特定の細胞系列に分化させることによって、前記標的を発現させるステップと、
c) 基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
d) 前記標的の推定アンタゴニストを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
e) 前記標的を刺激することができるリガンドと細胞を接触させるステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光の変化を検出するステップとを含む方法である。
初代細胞または幹細胞は、標的を内因的に発現することができる。
特定の細胞系列は、筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列あるいは造血または間葉細胞系列由来の細胞系列であることが好ましい。
ハイスループットスクリーニングによって方法を実施することがより好ましい。
本発明の他の目的は、特定の細胞系列への本発明による派生細胞の分化を刺激する作用物質を同定するための方法であって、
a) 未分化段階の請求項1から12のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
b) 推定分化誘導剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
c) 少なくとも1つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
d) 基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
e) 細胞内Ca++の変化を得るようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
a) 未分化段階の請求項1から12のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
b) 推定分化誘導剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
c) 少なくとも1つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
d) 基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
e) 細胞内Ca++の変化を得るようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニングによって方法を実施する。
本発明の他の目的は、特定の細胞系列への本発明による派生幹細胞の分化を阻害する作用物質を同定するための方法であって、
a) 未分化段階の請求項1から12のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
b) 推定分化阻害剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
c) 知られている分化誘導剤に前記派生幹細胞を曝して、少なくとも1つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
d) 基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
e) 細胞内Ca++の変化を得るようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
a) 未分化段階の請求項1から12のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
b) 推定分化阻害剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
c) 知られている分化誘導剤に前記派生幹細胞を曝して、少なくとも1つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
d) 基質として適した発色団を細胞に添加するステップと、
e) 細胞内Ca++の変化を得るようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップとを含む方法である。
好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニングによって方法を実施する。
本発明の他の態様は、ES/発光タンパク質細胞の分化後に得られる「初代様」細胞の陽性対照としての、本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞の使用である。
本発明の他の態様は、レポーター系として発光タンパク質を含む前記派生細胞を化合物、典型的にはアゴニスト、アンタゴニスト、分化促進剤または分化阻害剤のスクリーニングに使用する、本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞の使用である。
本発明の他の態様は、薬理学的ex−vivo試験および動物モデルにおける移植実験のための、レポーター系として発光タンパク質を含む本発明による非ヒトトランスジェニック動物の派生組織または派生器官の使用である。
本発明の他の態様は、バイオイメージング試験用の、本発明による非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用である。
本発明の他の態様は、薬理学的関連がある動物モデルとの交配用の、本発明による非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用である。動物モデルは、レポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物、またはKOもしくはKI突然変異動物モデルであることが好ましい。このような交配によって、他のトランス遺伝子(レポーターなど)および/または突然変異遺伝子(相同的組換えによって得た遺伝子など)と組合せて本発明の発光タンパク質レポーター遺伝子を有する、新たな動物モデルの子孫を作製することができる。
本発明の他の態様は、物質の毒性および/または奇形学的in vivo試験用の、本発明による非ヒトトランスジェニック動物の使用である。
以下の図面を参照することによって、本発明を以下の実験項においてより詳細に記載する。
材料および方法
発光タンパク質に関する記載
Photina(登録商標)
キメラ発光タンパク質Photina(登録商標)は欧州特許第1413584号中に記載されており、本明細書では配列番号1として報告する:
Met Ser Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp Asn Pro Arg Trp Ile Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu Asp Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Lys Ala Ser Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Thr Lys Arg His Gln Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Lys Lys Ile Gly Met Asp Tyr Gly Lys Glu Val Glu Phe Pro Ala Phe Val Asp Gly Trp Lys Glu Leu Ala Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala Arg Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Glu Trp Gly Asp Ala Val Phe Asp Ile Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Thr Ile Thr Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Lys
Ile Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gln Glu Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu Asp Asn Ser Gly Asp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val Pro
発光タンパク質に関する記載
Photina(登録商標)
キメラ発光タンパク質Photina(登録商標)は欧州特許第1413584号中に記載されており、本明細書では配列番号1として報告する:
Met Ser Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp Asn Pro Arg Trp Ile Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu Asp Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Lys Ala Ser Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Thr Lys Arg His Gln Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Lys Lys Ile Gly Met Asp Tyr Gly Lys Glu Val Glu Phe Pro Ala Phe Val Asp Gly Trp Lys Glu Leu Ala Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala Arg Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Glu Trp Gly Asp Ala Val Phe Asp Ile Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Thr Ile Thr Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Lys
Ile Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gln Glu Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu Asp Asn Ser Gly Asp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val Pro
i−Photina(登録商標)
i−Photina(登録商標)(欧州特許出願第05005390.9号)は、Clytin発光タンパク質(GenBank登録番号Q08121)の変異誘発Gly142→Cysによって得られる。
i−Photina(登録商標)(欧州特許出願第05005390.9号)は、Clytin発光タンパク質(GenBank登録番号Q08121)の変異誘発Gly142→Cysによって得られる。
c−Photina(登録商標)
c−Photina(登録商標)(欧州特許出願第06000171号)は、以下の12の位置:G1y58→Glu、Asp69→Val、A1a70→Cys、Lys76→Arg、Lys77→Gly、Ile78→Cys、Asp81→Glu、Val86→Ile、G1u87→Ala、Ala90→Gln、Val92→Leu、およびG1u97→GlnでのClytin配列(GenBank登録番号Q08121)の変異誘発によって得られる。
c−Photina(登録商標)(欧州特許出願第06000171号)は、以下の12の位置:G1y58→Glu、Asp69→Val、A1a70→Cys、Lys76→Arg、Lys77→Gly、Ile78→Cys、Asp81→Glu、Val86→Ile、G1u87→Ala、Ala90→Gln、Val92→Leu、およびG1u97→GlnでのClytin配列(GenBank登録番号Q08121)の変異誘発によって得られる。
哺乳動物細胞中での発現のための発光タンパク質の最適化
c−Photina(登録商標)およびi−Photina(登録商標)の遺伝子のコドン使用頻度を、高度に発現した哺乳動物遺伝子のコドンの傾向に適合させた。さらに、非常に高い(>80%)または非常に低い(<30%)GC含有率の領域は、可能な場合は回避した。
c−Photina(登録商標)およびi−Photina(登録商標)の遺伝子のコドン使用頻度を、高度に発現した哺乳動物遺伝子のコドンの傾向に適合させた。さらに、非常に高い(>80%)または非常に低い(<30%)GC含有率の領域は、可能な場合は回避した。
効率の良い翻訳開始のために、Kozak−コンセンサス配列を開始コドンの上流に導入した。2つの停止コドンを加えて効率の良い停止を確実にした。
クローニング手順
遺伝子をミトコンドリアタグ(mito)を含むかあるいは含まないpcDNA3.1ベクター(Invitrogen)でクローニングして、pcDNA3 mito c−Photina(登録商標)、pcDNA3 mito i−Photina(登録商標)、およびpcDNA3 i−Photina(登録商標)を得た。ミトコンドリア標的化用に(52〜54)、ヒトシトクロムcオキシダーゼ、サブユニットVIII、シグナル配列を使用した:
5'−ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTT
GACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGC
CAAGATCCATTCGTTGGGATCCGCCACC−3' (配列番号2)。
遺伝子をミトコンドリアタグ(mito)を含むかあるいは含まないpcDNA3.1ベクター(Invitrogen)でクローニングして、pcDNA3 mito c−Photina(登録商標)、pcDNA3 mito i−Photina(登録商標)、およびpcDNA3 i−Photina(登録商標)を得た。ミトコンドリア標的化用に(52〜54)、ヒトシトクロムcオキシダーゼ、サブユニットVIII、シグナル配列を使用した:
5'−ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTT
GACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGC
CAAGATCCATTCGTTGGGATCCGCCACC−3' (配列番号2)。
得られた構築体は完全長ジデオキシのシークエンスによって確認した。
ES細胞の培養
ES細胞は標準的な方法を使用して培養した(55、56)。
ES細胞は標準的な方法を使用して培養した(55、56)。
ES培養培地、播種およびインキュベーション;
TBV2(129S2/SvPas)胚幹細胞(63)を、15%のウシ胎児血清、FBS(ES適任、Invitrogen、カタログ番号16141079)、DMEMダルベッコの改変イーグル培地、high glucose、ピルビン酸ナトリウム非含有(Invitrogen、カタログ番号10313021)、100μMのβ−メルカプトエタノール(Invitrogen、カタログ番号31350010)、2mMのグルタミン(Invitrogen、カタログ番号25030024)、1000U/mlの白血球阻害因子、LIF(Prodotti Gianni、カタログ番号ESG1107)と共に、37℃、5%CO2において培養する。
TBV2(129S2/SvPas)胚幹細胞(63)を、15%のウシ胎児血清、FBS(ES適任、Invitrogen、カタログ番号16141079)、DMEMダルベッコの改変イーグル培地、high glucose、ピルビン酸ナトリウム非含有(Invitrogen、カタログ番号10313021)、100μMのβ−メルカプトエタノール(Invitrogen、カタログ番号31350010)、2mMのグルタミン(Invitrogen、カタログ番号25030024)、1000U/mlの白血球阻害因子、LIF(Prodotti Gianni、カタログ番号ESG1107)と共に、37℃、5%CO2において培養する。
初代マウス胎児繊維芽(MEF)細胞を、10%のウシ胎児血清、FBS(Celbio、カタログ番号CHA11152)、DMEMダルベッコの改変イーグル培地、high glucose(Invitrogen、カタログ番号10313021)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Invitrogen、カタログ番号11360039)、非必須アミノ酸(Invitrogen、カタログ番号11140−035)、2mMのグルタミン(Invitrogen、カタログ番号25030024)と共に、37℃、5%CO2において培養する。
安定的なトランスフェクション
発光タンパク質に対応するDNA構築体を、エレクトロポレーション法、30〜40μgのmito c−Photina(登録商標)、mito i−Photina(登録商標)、およびBgl II(New England Biolabs)を用いて線状にしたi−Photina(登録商標)DNAを使用してトランスフェクトし、7×106個のES細胞を使用してトランスフェクトし(エレクトロポレーション条件:500μF、0.24kV、BioRad遺伝子パルサー)、10〜20分間氷上でインキュベートした。細胞懸濁液はLIFを含むES細胞培地に希釈し、ゼラチン状100mm径プレートに移した。約48時間後、200μg/mlのG148(Geneticin、SIGMA、カタログ番号G5013)を含むES培地を使用して選択を開始した。
発光タンパク質に対応するDNA構築体を、エレクトロポレーション法、30〜40μgのmito c−Photina(登録商標)、mito i−Photina(登録商標)、およびBgl II(New England Biolabs)を用いて線状にしたi−Photina(登録商標)DNAを使用してトランスフェクトし、7×106個のES細胞を使用してトランスフェクトし(エレクトロポレーション条件:500μF、0.24kV、BioRad遺伝子パルサー)、10〜20分間氷上でインキュベートした。細胞懸濁液はLIFを含むES細胞培地に希釈し、ゼラチン状100mm径プレートに移した。約48時間後、200μg/mlのG148(Geneticin、SIGMA、カタログ番号G5013)を含むES培地を使用して選択を開始した。
コロニーはエレクトロポレーション後8〜9日で採取する準備を概略的に整えた。
クローン選択法:
1. 114のES pcDNA3/mito c−Photina(登録商標)、130のES pcDNA3/mito i−Photina(登録商標)および99のES pcDNA3/i−Photina(登録商標)クローンを採取した。
2. 播種後24時間および48時間で、トランスフェクトした細胞は2×96MTP白色プレート中、LIFを含むES培地中に平板培養した。
3. 培地はウエル当たり50μlのタイロード液(130mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl2、1mMのMgCl2、5mMのNaHCO3および20mMのHEPES、pH7.4、2mMのCa2+)およびセレンテラジン10μM(Pharma Tech International)と交換した。
4. 陽性クローンを選択し、以下のことを評価した:
− 100μMヒスタミン(Sigma、カタログ番号H7125−5G)に対する応答性。CCDカメラベースの照度計条件:高感度、読み取り時間60秒。
− TritonX−100による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。CCDカメラベースの照度計条件:低感度、読み取り時間5秒。各構築体用に12のクローンを選択して、増殖させ、計数細胞10000〜20000c/w96MTP中、および2500c/w384MTP中で再度試験した。
− 100μMヒスタミンに対する応答性。CCDカメラベースの照度計条件:高感度、読み取り時間60秒。
− TritonX−100による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。CCDカメラベースの照度計条件:低感度、読み取り時間5秒間。
1. 114のES pcDNA3/mito c−Photina(登録商標)、130のES pcDNA3/mito i−Photina(登録商標)および99のES pcDNA3/i−Photina(登録商標)クローンを採取した。
2. 播種後24時間および48時間で、トランスフェクトした細胞は2×96MTP白色プレート中、LIFを含むES培地中に平板培養した。
3. 培地はウエル当たり50μlのタイロード液(130mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl2、1mMのMgCl2、5mMのNaHCO3および20mMのHEPES、pH7.4、2mMのCa2+)およびセレンテラジン10μM(Pharma Tech International)と交換した。
4. 陽性クローンを選択し、以下のことを評価した:
− 100μMヒスタミン(Sigma、カタログ番号H7125−5G)に対する応答性。CCDカメラベースの照度計条件:高感度、読み取り時間60秒。
− TritonX−100による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。CCDカメラベースの照度計条件:低感度、読み取り時間5秒。各構築体用に12のクローンを選択して、増殖させ、計数細胞10000〜20000c/w96MTP中、および2500c/w384MTP中で再度試験した。
− 100μMヒスタミンに対する応答性。CCDカメラベースの照度計条件:高感度、読み取り時間60秒。
− TritonX−100による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。CCDカメラベースの照度計条件:低感度、読み取り時間5秒間。
DNA抽出
ゼラチンコーティング皿上に平板培養したES細胞由来のDNAを、標準的なプロテイナーゼKによる消化およびフェノール−クロロホルム−イソプロパノール抽出法を用いて抽出した(59)。
ゼラチンコーティング皿上に平板培養したES細胞由来のDNAを、標準的なプロテイナーゼKによる消化およびフェノール−クロロホルム−イソプロパノール抽出法を用いて抽出した(59)。
定量PCRによる挿入数の測定
QPCR(定量ポリメラーゼ連鎖反応)を、反応当たり約3ngのDNA、および「Platinum(登録商標)SYBR Green(登録商標)QPCR SuperMix UDG」プロトコル(60、Invitrogen)を使用してES/mito c−Photina(登録商標)細胞に実施した。使用したプライマーは、c−Photina(登録商標)(CPH)およびネオマイシン(neo)遺伝子にPrimer Express(登録商標)Software v2.0(Applied Biosystems)を使用して設計して、トランスフェクションにおいて使用しgusB遺伝子に特異的なプラスミドを検出し、ゲノムDNAを検出した:
CPH−正方向:CACCAAGTGTGCGTGGAGG(配列番号3);
CPH−逆方向:GCGATCTCCTTGCCGTACTC(配列番号4);
neo−正方向:CACGTACTCGGATGGAAGCC(配列番号5);
neo−逆方向:CCCTGATGCTCTTCGTCCAG(配列番号6);
gusB−正方向:GGAGGTGATTCAGCCACAGC(配列番号7);
gusB−逆方向:TCGGCTTCTGATGCGTCTTA(配列番号8)。
QPCR(定量ポリメラーゼ連鎖反応)を、反応当たり約3ngのDNA、および「Platinum(登録商標)SYBR Green(登録商標)QPCR SuperMix UDG」プロトコル(60、Invitrogen)を使用してES/mito c−Photina(登録商標)細胞に実施した。使用したプライマーは、c−Photina(登録商標)(CPH)およびネオマイシン(neo)遺伝子にPrimer Express(登録商標)Software v2.0(Applied Biosystems)を使用して設計して、トランスフェクションにおいて使用しgusB遺伝子に特異的なプラスミドを検出し、ゲノムDNAを検出した:
CPH−正方向:CACCAAGTGTGCGTGGAGG(配列番号3);
CPH−逆方向:GCGATCTCCTTGCCGTACTC(配列番号4);
neo−正方向:CACGTACTCGGATGGAAGCC(配列番号5);
neo−逆方向:CCCTGATGCTCTTCGTCCAG(配列番号6);
gusB−正方向:GGAGGTGATTCAGCCACAGC(配列番号7);
gusB−逆方向:TCGGCTTCTGATGCGTCTTA(配列番号8)。
全てのQPCR実験はABI Prism 7700シークエンスディテクター(Applied Biosystems)で行った。
PCRプロトコルは以下の通りであった:50℃に2分間保つ、95℃に2分間保つ、40サイクルの:95℃、15秒間、60℃、1分間;95℃、15秒間、20分間の長さの温度勾配、60℃〜95℃(溶解曲線ステップ(melting curve step))。
実験の最後に、PCR中に得た蛍光データを、ABI Prism 7700のユーザー用マニュアル中に記載されたのと同様に処理した。
PCR産物の溶解温度プロファイル分析は、「Dissociation Curves 1.0」ソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して実施した。QPCR実験のいずれにおいてもプライマー−ダイマーは生成しなかった。
二倍体ゲノム当たり(すなわち、細胞当たり)のネオマイシンおよび/またはc−Photina(登録商標)遺伝子のコピー数を計算するために、我々はCts(サイクルの閾値)およびPCR効率を以下の式に入れた:
細胞あたりのコピー数=2X{(PCR効率標的)−(Ct標的)}/{(PCR効率gusB)−(Ct gusB)}
上式で:
PCR効率標的=ネオマイシンまたはc−Photina(登録商標)遺伝子のPCR効率;
PCR効率guaB=gusB遺伝子のPCR効率;
Ct標的=ネオマイシンまたはc−Photina(登録商標)遺伝子のCt;
CtgusB=gusB遺伝子のCt。
PCR効率標的=ネオマイシンまたはc−Photina(登録商標)遺伝子のPCR効率;
PCR効率guaB=gusB遺伝子のPCR効率;
Ct標的=ネオマイシンまたはc−Photina(登録商標)遺伝子のCt;
CtgusB=gusB遺伝子のCt。
式の右側部分は、gusBコピー当たりの挿入DNAのコピー数を与える。2つのgusBコピーが二倍体ゲノム中に存在するので、この部分に2を掛ける。
サザンブロット
ES/mito c−Photina(登録商標)細胞の10μgのESゲノムDNAを異なる制限酵素、HindIII、XbaI、BamHI、HindIII/XbaI(Biolabs)で消化し、0.8%のアガロースゲル上に載せ、正に帯電したナイロン膜(Roche、カタログ番号1417240)に移した。プローブとして、[32P]dCTP−標識c−Photina(登録商標)コード配列を使用した(59)。
ES/mito c−Photina(登録商標)細胞の10μgのESゲノムDNAを異なる制限酵素、HindIII、XbaI、BamHI、HindIII/XbaI(Biolabs)で消化し、0.8%のアガロースゲル上に載せ、正に帯電したナイロン膜(Roche、カタログ番号1417240)に移した。プローブとして、[32P]dCTP−標識c−Photina(登録商標)コード配列を使用した(59)。
ES/mito i−Photina(登録商標)およびES/i−Photina(登録商標)細胞の10μgのESゲノムDNAをEcoRI制限酵素(Biolabs)で消化し、0.8%のアガロースゲル上に載せ、正に帯電したナイロン膜(Roche、カタログ番号1417240)に移した。プローブとして、[32P]dCTP−標識i−Photina(登録商標)コード配列を使用した(59)。
免疫蛍光分析
1. 培地を除去し、1×PBSを用いて3回洗浄した。
2. ES細胞を4%のパラホルムアルデヒド(PFA、MERCK、Whitehouse Station、NJ、USA、カタログ番号1.04005.1000)溶液で20分間室温において固定した。
3. 固定溶液を除去し、1×PBSを用いた3回の洗浄を室温で実施した。
4. ブロッキングおよび透過処理手順は、細胞と10%の正常ヤギ血清(Chemicon、カタログ番号S26−100ml)/0.2%のTritonX−100を1×PBS中で30分間室温においてインキュベートして実施した。
5. ブロッキング溶液を除去し、1×PBSを用いた2回の洗浄を室温で実施した。
6. 異なる抗体を、10%の正常ヤギ血清0.1%のTritonX入り100中1×PBS中で、2時間室温においてインキュベートした。
− マウスモノクローナル抗体抗oct3/4(C−10)(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号SC−5279)を1:100希釈で使用した。
− マウスモノクローナル抗体抗SSEA−1(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号SC21702)を、TritonX−100透過処理剤を含まなかったバッファー中に1:100希釈で使用した。
− ウサギポリクローナル抗体抗ミオシン重鎖(MHC)(H−300)(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号SC−20641)を1:50希釈で使用した。
− ウサギポリクローナル抗体抗GATA−4(H−112)(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号SC−9053)を1:50希釈で使用した。
− マウスモノクローナル抗体抗サルコメアα−アクチニン(EA−53)(SIGMA、カタログ番号A7811)を1:50希釈で使用した。
− ウサギポリクローナル抗体抗ニューロフィラメントH(NF−H)(Chemicon、カタログ番号AB1989)を1:100希釈で使用した。
− マウスモノクローナル抗体抗ニューロン核(NeuN)(Chemicon、カタログ番号MAB377)を1:100希釈で使用した。
− ウサギポリクローナル抗体抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質(Dako、カタログ番号Z0334)を1:100希釈で使用した。
− マウスモノクローナル抗体抗ネスチン(Rat−401)(Chemicon、カタログ番号MAB353)を1:100希釈で使用した。
7. 1×PBSを用いた3回の洗浄を室温で実施した。
8. 二次抗体とのインキュベーションは、フルオレセイン標識抗マウス、または抗ウサギFITC二次抗体単独、あるいはローダミン標識抗マウス抗体(ヤギおよびマウスIgG/IgMローダミン、Chemicon、カタログ番号AP130R)と組合せて、10%の正常ヤギ血清/0.1%のTritonX−100入り1×PBS中で1時間室温において実施した。抗体は1:200希釈で使用した。
9. 1×PBSを用いた3回の洗浄を室温で実施した。
10. 細胞は1×PBS中に4℃で放置した。
1. 培地を除去し、1×PBSを用いて3回洗浄した。
2. ES細胞を4%のパラホルムアルデヒド(PFA、MERCK、Whitehouse Station、NJ、USA、カタログ番号1.04005.1000)溶液で20分間室温において固定した。
3. 固定溶液を除去し、1×PBSを用いた3回の洗浄を室温で実施した。
4. ブロッキングおよび透過処理手順は、細胞と10%の正常ヤギ血清(Chemicon、カタログ番号S26−100ml)/0.2%のTritonX−100を1×PBS中で30分間室温においてインキュベートして実施した。
5. ブロッキング溶液を除去し、1×PBSを用いた2回の洗浄を室温で実施した。
6. 異なる抗体を、10%の正常ヤギ血清0.1%のTritonX入り100中1×PBS中で、2時間室温においてインキュベートした。
− マウスモノクローナル抗体抗oct3/4(C−10)(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号SC−5279)を1:100希釈で使用した。
− マウスモノクローナル抗体抗SSEA−1(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号SC21702)を、TritonX−100透過処理剤を含まなかったバッファー中に1:100希釈で使用した。
− ウサギポリクローナル抗体抗ミオシン重鎖(MHC)(H−300)(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号SC−20641)を1:50希釈で使用した。
− ウサギポリクローナル抗体抗GATA−4(H−112)(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号SC−9053)を1:50希釈で使用した。
− マウスモノクローナル抗体抗サルコメアα−アクチニン(EA−53)(SIGMA、カタログ番号A7811)を1:50希釈で使用した。
− ウサギポリクローナル抗体抗ニューロフィラメントH(NF−H)(Chemicon、カタログ番号AB1989)を1:100希釈で使用した。
− マウスモノクローナル抗体抗ニューロン核(NeuN)(Chemicon、カタログ番号MAB377)を1:100希釈で使用した。
− ウサギポリクローナル抗体抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質(Dako、カタログ番号Z0334)を1:100希釈で使用した。
− マウスモノクローナル抗体抗ネスチン(Rat−401)(Chemicon、カタログ番号MAB353)を1:100希釈で使用した。
7. 1×PBSを用いた3回の洗浄を室温で実施した。
8. 二次抗体とのインキュベーションは、フルオレセイン標識抗マウス、または抗ウサギFITC二次抗体単独、あるいはローダミン標識抗マウス抗体(ヤギおよびマウスIgG/IgMローダミン、Chemicon、カタログ番号AP130R)と組合せて、10%の正常ヤギ血清/0.1%のTritonX−100入り1×PBS中で1時間室温において実施した。抗体は1:200希釈で使用した。
9. 1×PBSを用いた3回の洗浄を室温で実施した。
10. 細胞は1×PBS中に4℃で放置した。
心筋細胞分化プロトコルおよび胚様体(EB)形成ステップ
参考文献(57)中に記載したプロトコルを参照
参考文献(57)中に記載したプロトコルを参照
心筋細胞を用いたCCDカメラベースの照度計による測定
− EBは分化第9日でAccutase(商標)(Chemicon、カタログ番号SCR005)を用いて解離させ、計数し、10μMセレンテラジンを溶かした標準的なタイロード液バッファー(GqPCRに関する試験用)中およびKClを含まないタイロード液(L型カルシウムチャンネルに関する試験用)中で、3時間37℃においてインキュベートした(20000細胞/ウエル、96MTP中)。
− 試験は細胞播種後3時間で実施した。
− 50nMのエンドセリン−1、100μMのノルエピネプリンに対する応答性を、CCDカメラベースの照度計(条件:高感度、読み取り時間60秒)で測定した。
− EBは分化第9日でAccutase(商標)(Chemicon、カタログ番号SCR005)を用いて解離させ、計数し、10μMセレンテラジンを溶かした標準的なタイロード液バッファー(GqPCRに関する試験用)中およびKClを含まないタイロード液(L型カルシウムチャンネルに関する試験用)中で、3時間37℃においてインキュベートした(20000細胞/ウエル、96MTP中)。
− 試験は細胞播種後3時間で実施した。
− 50nMのエンドセリン−1、100μMのノルエピネプリンに対する応答性を、CCDカメラベースの照度計(条件:高感度、読み取り時間60秒)で測定した。
電位依存性カルシウムチャンネルを40mMのKClで刺激した。チャンネルの特異性は、5μMのニフェジピン(特異的L型電位依存性カルシウムチャンネル阻害剤)(SIGMA、カタログ番号N7634)を用いた測定前に15分間細胞をインキュベートして調べた。
− 残留した全発光タンパク質の活性は、TritonX−100による細胞溶解後にCCDカメラベースの照度計(条件:高感度、読み取り時間30秒間)で測定した。
− 残留した全発光タンパク質の活性は、TritonX−100による細胞溶解後にCCDカメラベースの照度計(条件:高感度、読み取り時間30秒間)で測定した。
神経分化プロトコルおよび胚様体(EB)形成ステップ
参考文献(64、65)中に記載したプロトコルを参照
参考文献(64、65)中に記載したプロトコルを参照
ニューロンに関するCCDカメラベースの照度計による測定
− レチノイン酸誘導型(RA.Sigma、カタログ番号R−2625)EBを解離させ、ポリD−リシン(Sigma、カタログ番号G7121)コーティングした384MTPにウエル当たり6500個の細胞を、他の分化期間用に94MTP形式でウエル当たり24000個の細胞を播種した。
− レチノイン酸誘導型(RA.Sigma、カタログ番号R−2625)EBを解離させ、ポリD−リシン(Sigma、カタログ番号G7121)コーティングした384MTPにウエル当たり6500個の細胞を、他の分化期間用に94MTP形式でウエル当たり24000個の細胞を播種した。
分化第14日で、それらは10μMセレンテラジンを溶かした標準的なタイロード液バッファー(グルタミン酸応答性の試験用)中、およびKClを含まないタイロード液(電位依存性カルシウムチャンネルに関する試験用、6μMのオメガコノトキシンGVIA(特異的N型電位依存性カルシウムチャンネル阻害剤)(BACHEM、カタログ番号H6615.1000)との15分のプレインキュベーション時間有りまたは無し)中で、3時間37℃においてインキュベートした。
−応答性は、CCDカメラベースの照度計で測定した(96MTPにおけるグルタミン酸応答性に関する条件:低感度、読み取り時間60秒;384MTPにおける電位依存性カルシウムチャンネル応答性に関する条件:高感度、読み取り時間60秒)。
−応答性は、CCDカメラベースの照度計で測定した(96MTPにおけるグルタミン酸応答性に関する条件:低感度、読み取り時間60秒;384MTPにおける電位依存性カルシウムチャンネル応答性に関する条件:高感度、読み取り時間60秒)。
蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR(登録商標))による分化ニューロンおよび未分化ES/mito c−Photina(登録商標)ES/29クローンの測定
(レチノイン酸誘導型EBの解離およびポリD−リシンコーティングした384黒壁透明底プレート上でのウエル当たり6500個の細胞播種後に得た)分化細胞を第16日で測定した。
(レチノイン酸誘導型EBの解離およびポリD−リシンコーティングした384黒壁透明底プレート上でのウエル当たり6500個の細胞播種後に得た)分化細胞を第16日で測定した。
未分化ES/mito c−Photina(登録商標)ES/29クローンは、ゼラチンコーティングした384黒壁透明底プレートに、試験24時間前にウエル当たり10000個の細胞で播種した。
実験を開始する前に、培地を除去し、ウエル当たり25μlの膜電位測定用色素(Molecular Devices、カタログ番号R8034)を溶かしたタイロード液中で、細胞を37℃において30分間インキュベートした。
ウエル当たり12.5μlのタイロード液および120mMのKCl(3X)(15mMのNaCl、120mMのKCl、2mMのCaCl2、5mMのNaHCO3および20mMのHEPES)を注射し、蛍光シグナルは250秒間記録し、RFU(相対的蛍光単位)として表した。
FLIPR384設定:
実験時間:0.3秒
注射速度:20μl/秒
注射体積(Injection height):50μl
実験時間:0.3秒
注射速度:20μl/秒
注射体積(Injection height):50μl
発光タンパク質トランスジェニックマウスにおける発光タンパク質組織の分析
第一実験
c−Photina(登録商標)トランス遺伝子に対して1匹が陽性であり1匹が陰性である2匹のマウスを使用した。200μlの血液のサンプルを2匹のマウスの尾静脈から取り出した。それらは生理溶液と共にかん流させて血液汚染を排除した。数種の組織を2匹のマウスから外植し(大脳、小脳、肝臓、脂肪、脾臓、骨格筋、坐骨神経、膵臓全体、肺、腎臓、血液、胃、精巣、心臓)、20mMのTris−HCl pH7.5、150mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのEDTA、0.1%のBSA、20μMのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、カタログ番号1836145)を含む溶液と共に室温において3時間インキュベートした。
第一実験
c−Photina(登録商標)トランス遺伝子に対して1匹が陽性であり1匹が陰性である2匹のマウスを使用した。200μlの血液のサンプルを2匹のマウスの尾静脈から取り出した。それらは生理溶液と共にかん流させて血液汚染を排除した。数種の組織を2匹のマウスから外植し(大脳、小脳、肝臓、脂肪、脾臓、骨格筋、坐骨神経、膵臓全体、肺、腎臓、血液、胃、精巣、心臓)、20mMのTris−HCl pH7.5、150mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのEDTA、0.1%のBSA、20μMのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、カタログ番号1836145)を含む溶液と共に室温において3時間インキュベートした。
サンプルは全て外科用ハサミで切断して、組織を小部分に縮小した。
サンプルは次いで、白色96白色ウエル/プレートの3ウエルに等分した。
TritonX−100および250mMのCaCl2の溶液の注射後に、サンプルは全てCCDカメラベースの照度計、高感度、60秒間、0.6秒の積分時間で読み取った。
経時的な異なる組織/器官中の発光タンパク質レポータータンパク質の存在および安定性を調べるために、(c−Photina(登録商標)トランス遺伝子に対して3匹が陽性であり3匹が陰性である)6匹の動物を、異なる年齢:2匹のマウスは3カ月齢、2匹のマウスは6カ月齢、および2匹のマウスは10カ月齢でさらに殺傷した。それらは全て生理溶液と共にかん流させて血液汚染を排除した。大脳、小脳、脾臓、肺、腎臓、胃、生殖腺、および心臓をマウスから外植し、20mMのTris−HCl pH7.5、150mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのEDTA、0.1%のBSA、20μMのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液と共に室温において3時間インキュベートした。
サンプルは全て外科用ハサミで切断して組織を小部分に縮小し、次いで白色96白色ウエル/プレートに等分した。
TritonX−100および250mMのCaCl2の溶液の注射後に、サンプルは全てCCDカメラベースの照度計、高感度、60秒間、0.6秒の積分時間で読み取った。
第二実験
(c−Photina(登録商標)トランス遺伝子に対して1匹が陽性であり1匹が陰性である)2匹のマウスを使用した。セレンテラジン2.8mg/マウス1kgを含む300μlのセレンテラジン溶液(373μMのセレンテラジン、3.3%のDMSO、990nMのグルタチオン、生理溶液中)を尾静脈を介して注射した。
(c−Photina(登録商標)トランス遺伝子に対して1匹が陽性であり1匹が陰性である)2匹のマウスを使用した。セレンテラジン2.8mg/マウス1kgを含む300μlのセレンテラジン溶液(373μMのセレンテラジン、3.3%のDMSO、990nMのグルタチオン、生理溶液中)を尾静脈を介して注射した。
3時間後、200μlの血液のサンプルを2匹のマウスの尾静脈から取り出した。
− マウスはアベルチン(12.5μl/体重1g)で麻酔をかけた。肝管へのコラゲナーゼ(V型、1mg/ml)(Sigma Chemical、St.Louis、MO)注射によって、マウスからの膵島の単離を実施した。次いでマウスは、腹部大静脈/大動脈の切断後に放血によって殺傷した。単離した膵臓は次いで消化し、β島は密度勾配(Histopaque−1077;Sigma)によって精製した。次いで膵島は、5%C02での湿度雰囲気中、10%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充したM199培地(Invitrogen、カタログ番号22350−029)中で37℃において一晩培養した。
− マウスはアベルチン(12.5μl/体重1g)で麻酔をかけた。肝管へのコラゲナーゼ(V型、1mg/ml)(Sigma Chemical、St.Louis、MO)注射によって、マウスからの膵島の単離を実施した。次いでマウスは、腹部大静脈/大動脈の切断後に放血によって殺傷した。単離した膵臓は次いで消化し、β島は密度勾配(Histopaque−1077;Sigma)によって精製した。次いで膵島は、5%C02での湿度雰囲気中、10%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充したM199培地(Invitrogen、カタログ番号22350−029)中で37℃において一晩培養した。
ウエル当たり10個のMito c−Photina(登録商標)トランスジェニックマウスの膵島を白色96MTPに置き、10μMのセレンテラジンを含む標準的なタイロード溶液中で37℃において4時間インキュベートした。膵島カルシウムの反応速度応答性を、グルコース刺激(11mM)、または陰性対照としてマンニトール(l1mM)による刺激後にLuminoskan Ascent(Labsystems)照度計;150秒間、積分時間0.5秒で測定した。次いでグルコース濃度を3mMに標準化し、次いで膵島はCCDカメラベースの照度計(高感度、60秒間)で脱分極刺激(40mMのKCl)によって刺激した。膵島中の全発光タンパク質含有量を、TritonX−100ベースのバッファーによる細胞溶解後に測定した(高感度、60秒間)。
− 数種の組織を次いで2匹のマウスから外植し(大脳、小脳、肝臓、脂肪、脾臓、心臓、坐骨神経、胃、肺、精巣、骨、骨格筋、腎臓、皮膚、胸腺)、外科用ハサミで切断して組織を小部分に縮小した。
− 数種の組織を次いで2匹のマウスから外植し(大脳、小脳、肝臓、脂肪、脾臓、心臓、坐骨神経、胃、肺、精巣、骨、骨格筋、腎臓、皮膚、胸腺)、外科用ハサミで切断して組織を小部分に縮小した。
全サンプルを2つのバッチに分けた。一部分は20mMのTris−HCl pH7.5、150mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのEDTA、0.1%のBSA、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含みセレンテラジンを含まない溶液中に置き、CCDカメラベースの照度計ですぐに試験した;もう一部分はCCDカメラベースの照度計による試験前に、代わりに20mMのTris−HCl pH7.5、150mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのEDTA、0.1%のBSA、20μMのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液と共に室温において3時間インキュベートした。
次いで全てのサンプルを96白色ウエル/プレートの2ウエルに等分した。
TritonX−100および250mMのCaCl2の溶液の注射後に、サンプルは全てCCDカメラベースの照度計、高感度、60秒間、0.6秒の積分時間で読み取った。
第三実験
1匹の他のc−Photina(登録商標)トランスジェニックマウスおよび1匹の陰性マウスを殺傷して、骨髄から単球を単離した(これらはin vitroでマクロファージに分化させた)(68)。
1匹の他のc−Photina(登録商標)トランスジェニックマウスおよび1匹の陰性マウスを殺傷して、骨髄から単球を単離した(これらはin vitroでマクロファージに分化させた)(68)。
ウエル当たり20000個の各マウスに関する細胞を96MTPプレートに播種し、細胞はTritonX−100の溶液により溶解して、全細胞の溶解活性を調べた(高感度、60秒間、積分時間0.6秒)。
P19細胞の培養
P19培養培地、播種およびインキュベーション
P19胚性癌腫多能性幹細胞(ATCC、カタログ番号CRL−1825)を、10%のウシ胎児血清、FBS(ES適任、Invitrogen、カタログ番号16141079)、αMEM、GLUTAMAX添加最小必須イーグル培地(Invitrogen、カタログ番号32571028)、1%Pen./Strep.(Invitrogen、カタログ番号15140122)と共に、37℃において5%CO2での湿度雰囲気中で培養する(61)。
P19培養培地、播種およびインキュベーション
P19胚性癌腫多能性幹細胞(ATCC、カタログ番号CRL−1825)を、10%のウシ胎児血清、FBS(ES適任、Invitrogen、カタログ番号16141079)、αMEM、GLUTAMAX添加最小必須イーグル培地(Invitrogen、カタログ番号32571028)、1%Pen./Strep.(Invitrogen、カタログ番号15140122)と共に、37℃において5%CO2での湿度雰囲気中で培養する(61)。
Mito c−Photina(登録商標)による安定的なトランスフェクション
好ましいプロトコルと交換することができるエレクトロポレーション法を使用して、DNA構築体をトランスフェクトした。
好ましいプロトコルと交換することができるエレクトロポレーション法を使用して、DNA構築体をトランスフェクトした。
pcDNA3 DNA中の約10μgのmito c−Photina(登録商標)をBglII(New England Biolabs)を用いて線状にし、2.5×106個の細胞におけるエレクトロポレーションによってトランスフェクトした(エレクトロポレーション条件:500μF、0.24kV、BioRad遺伝子パルサー)。
700μg/mlのG148を用いたトランスフェクションから48時間後に選択を開始した。
コロニーはエレクトロポレーション後8〜9日で採取する準備を概略的に整えた。
クローン選択法:
1. P19pcDNA3/mito c−Photina(登録商標)クローン。
2. 播種後24時間および48時間で、トランスフェクトした細胞は2×96MTP白色プレート中にウエル当たり10000個および15000個の細胞で平板培養した。
3. 培地はウエル当たり50μlのタイロード液(2mMのCa2+およびセレンテラジン10μM)と交換した。
4. 陽性クローンを選択し、以下のことを評価した:
− 100μMヒスタミンに対する応答性。CCDカメラベースの照度計条件:高感度、読み取り時間60秒。
− TritonX−100による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。CCDカメラベースの照度計条件:低感度、読み取り時間30秒。
1. P19pcDNA3/mito c−Photina(登録商標)クローン。
2. 播種後24時間および48時間で、トランスフェクトした細胞は2×96MTP白色プレート中にウエル当たり10000個および15000個の細胞で平板培養した。
3. 培地はウエル当たり50μlのタイロード液(2mMのCa2+およびセレンテラジン10μM)と交換した。
4. 陽性クローンを選択し、以下のことを評価した:
− 100μMヒスタミンに対する応答性。CCDカメラベースの照度計条件:高感度、読み取り時間60秒。
− TritonX−100による細胞溶解後に測定した残留した全発光タンパク質の活性。CCDカメラベースの照度計条件:低感度、読み取り時間30秒。
P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンin vitro神経分化
参考文献(67)中に記載したプロトコルを参照
参考文献(67)中に記載したプロトコルを参照
P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンに由来するニューロンのCCDカメラベースの照度計による測定
神経分化のプロトコルの第8日および第11日(ポリD−リシンコーティングした384MTPにおける播種後それぞれ第4日および第7日)に、P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンから分化したニューロンを、ウエル当たり25μlの10μMセレンテラジンと共に標準的なタイロードバッファー中で37℃において4時間インキュベートした。
神経分化のプロトコルの第8日および第11日(ポリD−リシンコーティングした384MTPにおける播種後それぞれ第4日および第7日)に、P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンから分化したニューロンを、ウエル当たり25μlの10μMセレンテラジンと共に標準的なタイロードバッファー中で37℃において4時間インキュベートした。
40mMのKClの注射によって誘導した脱分極刺激に対する応答性を、CCDカメラベースの照度計で記録した(条件:高感度、読み取り時間60秒)。
P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンに由来するニューロンのFLIPR(登録商標)による測定
神経分化のプロトコルの第8日(ポリD−リシンコーティングした384ウエルプレートにおける播種後第4日)に、P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンから分化したニューロンを、ウエル当たり25μlのFluo−4NW(登録商標)カルシウム感受性蛍光色素(Invitrogen、カタログ番号F36205)と共に暗所でインキュベートした。
神経分化のプロトコルの第8日(ポリD−リシンコーティングした384ウエルプレートにおける播種後第4日)に、P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンから分化したニューロンを、ウエル当たり25μlのFluo−4NW(登録商標)カルシウム感受性蛍光色素(Invitrogen、カタログ番号F36205)と共に暗所でインキュベートした。
プレートは30分間37℃で、次いでさらに30分間室温でインキュベートした。
ウエル当たり12.5μlの120mM KCl(3X)溶液を注射し、蛍光シグナルは330秒間記録し、RFU(相対的蛍光単位)として表した。
FLIPR384設定:
実験時間:0.3秒
注射速度:20μl/秒
注射体積:50μl
実験時間:0.3秒
注射速度:20μl/秒
注射体積:50μl
未分化P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンおよびP19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンに由来するニューロンのFLIPR(登録商標)による測定
未分化P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンに関しては、ウエル当たり3000個の細胞をゼラチンコーティングした384ウエルプレートに播種した。播種後24時間で、細胞をウエル当たり25μlのFluo−4NW(登録商標)カルシウム感受性蛍光色素と共に暗所でインキュベートした。
未分化P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンに関しては、ウエル当たり3000個の細胞をゼラチンコーティングした384ウエルプレートに播種した。播種後24時間で、細胞をウエル当たり25μlのFluo−4NW(登録商標)カルシウム感受性蛍光色素と共に暗所でインキュベートした。
P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンから分化したニューロンに関しては、神経分化のプロトコルの第8日(ポリD−リシンコーティングした384ウエルプレートにおける播種後第4日)に、ウエル当たり25μlのFluo−4NW(登録商標)カルシウム感受性蛍光色素と共に暗所でインキュベートした。
両方のプレートは30分間37℃で、次いで30分間室温でインキュベートした。
ウエル当たり12.5μlの以下の3X化合物を溶かしたタイロードバッファーを注射し、蛍光シグナルは360秒間記録しRFUとして表した。
3X化合物:300μMのヒスタミン、および300μMのグルタミン酸。
3X化合物:300μMのヒスタミン、および300μMのグルタミン酸。
FLIPR384設定:
実験時間:0.3秒
注射速度:20μl/秒
注射体積:50μl
実験時間:0.3秒
注射速度:20μl/秒
注射体積:50μl
一過性トランスフェクションの分析:
1. トランスフェクション後24時間で、培地はウエル当たり50μlのタイロード液(2mMのCa2+およびセレンテラジン10μM)と交換し、37℃において4時間インキュベートした。
2. ウエル当たり50μlの200μMヒスタミン(2X)を、Luminoskan Ascent(Labsystems)を使用して注射した。照度計の条件:積分時間1秒、読み取り時間60秒。
− 残留全発光タンパク質の活性を、TritonX−100による細胞溶解後にMicrolumat LB 96P(EG&G Berthold)で測定した。読み取り時間3秒。
1. トランスフェクション後24時間で、培地はウエル当たり50μlのタイロード液(2mMのCa2+およびセレンテラジン10μM)と交換し、37℃において4時間インキュベートした。
2. ウエル当たり50μlの200μMヒスタミン(2X)を、Luminoskan Ascent(Labsystems)を使用して注射した。照度計の条件:積分時間1秒、読み取り時間60秒。
− 残留全発光タンパク質の活性を、TritonX−100による細胞溶解後にMicrolumat LB 96P(EG&G Berthold)で測定した。読み取り時間3秒。
Mito i−Photina(登録商標)およびmito Photina(登録商標)による安定的なトランスフェクション
好ましいプロトコルと交換することができるエレクトロポレーション法を使用して、DNA構築体をトランスフェクトした。
好ましいプロトコルと交換することができるエレクトロポレーション法を使用して、DNA構築体をトランスフェクトした。
約10μgのmito Photina(登録商標)およびDNAを、BglII(New England Biolabs)を用いて線状にし、2.5×106個の細胞におけるエレクトロポレーションによってトランスフェクトした(エレクトロポレーション条件:500μF、0.24kV、BioRad遺伝子パルサー)。
700μg/mlのG148を用いたトランスフェクションから48時間後に選択を開始した。
コロニーを集め、エレクトロポレーション後第9日で採取した。
− 50、100および150μMのヒスタミンに対する応答性。CCDカメラベースの照度計の条件:高感度、読み取り時間60秒。
− 残留全発光タンパク質の活性を、TritonX−100による細胞溶解後に測定した。CCDカメラベースの照度計の条件:低感度、30秒間。
− 50、100および150μMのヒスタミンに対する応答性。CCDカメラベースの照度計の条件:高感度、読み取り時間60秒。
− 残留全発光タンパク質の活性を、TritonX−100による細胞溶解後に測定した。CCDカメラベースの照度計の条件:低感度、30秒間。
蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR(登録商標))による測定
ウエル当たり20000個の細胞を384黒壁透明底プレート(MATRIX、カタログ番号4332)に平板培養し(ウエル当たり25μl)、試験は細胞播種後24時間で実施した。実験を開始する前に、培地を除去し、ウエル当たり50μlのカルシウム3アッセイキット0.5X(Molecular Devices、カタログ番号R8O9O)中で、細胞を37℃において30分間インキュベートした。ウエル当たり25μlのヒスタミン300μM(3X)を注射し、蛍光シグナルは60秒間記録し、RFU(相対的蛍光単位)として表した。
ウエル当たり20000個の細胞を384黒壁透明底プレート(MATRIX、カタログ番号4332)に平板培養し(ウエル当たり25μl)、試験は細胞播種後24時間で実施した。実験を開始する前に、培地を除去し、ウエル当たり50μlのカルシウム3アッセイキット0.5X(Molecular Devices、カタログ番号R8O9O)中で、細胞を37℃において30分間インキュベートした。ウエル当たり25μlのヒスタミン300μM(3X)を注射し、蛍光シグナルは60秒間記録し、RFU(相対的蛍光単位)として表した。
FLIPR384設定:
実験時間:0.3秒
注射速度:20μl/秒
注射体積:50μl
実験時間:0.3秒
注射速度:20μl/秒
注射体積:50μl
(実施例1)
発光タンパク質を用いてトランスフェクトしたES細胞系の作製
(実施例1.1.1)
Mito c−Photina(登録商標)ES TBV2クローン
マウスES TBV2 mito c−Photina(登録商標)細胞系を、BglII制限酵素(材料および方法)を用いて線状にしたmito c−Photina(登録商標)発光タンパク質遺伝子を含むpcDNA3ベクターを用いたES TBV2 pl6細胞のエレクトロポレーションによって得た。
発光タンパク質を用いてトランスフェクトしたES細胞系の作製
(実施例1.1.1)
Mito c−Photina(登録商標)ES TBV2クローン
マウスES TBV2 mito c−Photina(登録商標)細胞系を、BglII制限酵素(材料および方法)を用いて線状にしたmito c−Photina(登録商標)発光タンパク質遺伝子を含むpcDNA3ベクターを用いたES TBV2 pl6細胞のエレクトロポレーションによって得た。
トランスフェクション後48時間で、200μg/mlのG418を用いて細胞を選択した。選択の8日後、152の薬剤耐性コロニーを採取した。形態分析後、約114のみがそれらが以下の96ウエル/プレートにおける5回の反復実験においてコンフルエンス(confluence)に達するまでMEF層で増殖した:
1− 2回は、播種後24および48時間におけるCCDカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
2− 1回は、DNA抽出用にゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
3− 2回は、−80℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
1− 2回は、播種後24および48時間におけるCCDカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
2− 1回は、DNA抽出用にゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
3− 2回は、−80℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
(実施例1.1.2)
Mito c−Photina(登録商標)ES TBV2クローンの選択
測定4時間前に、陽性クローンの培地を、暗所で37℃において5%C02での湿度雰囲気中で、ウエル当たり50μlのタイロードバッファー、2mMのCa2+および10μMのセレンテラジンと交換して、活性発光タンパク質を再構成(reconstitute)させた。
Mito c−Photina(登録商標)ES TBV2クローンの選択
測定4時間前に、陽性クローンの培地を、暗所で37℃において5%C02での湿度雰囲気中で、ウエル当たり50μlのタイロードバッファー、2mMのCa2+および10μMのセレンテラジンと交換して、活性発光タンパク質を再構成(reconstitute)させた。
発光測定用に、ES内因性ヒスタミン−1受容体を刺激し(58)細胞質Ca2+濃度を上昇させることが知られているヒスタミンに応答する能力(発光シグナル)に関して、細胞を最初に分析した。最初の60秒中に100μMのヒスタミンの注射後に発せられた光子の数を、CCDカメラベースの照度計によって測定した。得られた応答の反応速度(kinetics)は図1A中に示す。
各実験の最後に、(TritonX−100を含む溶液によって)細胞を溶解させた。細胞中で発現された全発光タンパク質は遊離カルシウムと反応し、発光を測定した(図1B)。そのシグナルは、細胞内に含まれていた発光タンパク質の全量の指標である。
12個の最良ヒスタミン応答性クローンを選択し、96MTPにおいて計数した細胞で再度試験した(図2AおよびB)。
2個の最終クローンを、異なるパラメータに基づいて選択した。ヒスタミンに応答する能力(図3)および細胞溶解後の全発光タンパク質含有量(データ示さず)は主な識別因子であったが、細胞形態および増殖率も分析した。さらにサザンブロット分析(59)および定量PCR(60)を実施した。サザンブロット分析は、ただ1つのランダムな挿入が起こったことを確かめるのに必須であった。これを調べるために、ゲノムDNAは(連結を調べるために)トランスフェクトしたベクター中で1回のみ切断する制限酵素で消化し、あるいは発光タンパク質遺伝子を切除することができる(いずれも1回の消化において使用した)2つの酵素で二重消化し、結果の特異性を保証した。アッセイに使用したプローブは発光タンパク質遺伝子であった。定量PCRをさらに実施して、遺伝子挿入の数を分析した。
最終クローンは、核型分析によってさらに特徴付けた(61)。クローンN.29および84を選択した。クローンN.29はゲノム中に組み込まれた1つのみの発光タンパク質遺伝子のコピーを有し、一方クローンN.84はゲノム中に1回のみ組み込まれた逆位連結として2つのコピーを有する。
それらはさらに、懸滴培養による胚様体形成の標準的方法後に自然に鼓動する心筋細胞に、およびレチノイン酸の存在下での胚様体形成後に神経細胞型に分化した(57、64、65)。
(実施例1.1.3)
ES/mito c−Photina(登録商標)/29クローンのステム形成(stemness)の実証
− 間接的な免疫蛍光アッセイをES/mito c−Photina(登録商標)/29クローンに実施して、特異的細胞表面抗原(SSEA−1)(図4A)および転写因子oct3/4(図4B)のような、未分化多能性マウス胚幹細胞の特異的マーカーの存在を調べた。結果は良好であり、図4Aおよび4B中に報告した。
− これらの細胞によって示された他のステム形成の特徴は、ELF(登録商標)ホスファターゼ染色キット(ATCC、カタログ番号SCRR−3010)を用いて測定した、アルカリホスファターゼの酵素活性の存在である(図5)。
ES/mito c−Photina(登録商標)/29クローンのステム形成(stemness)の実証
− 間接的な免疫蛍光アッセイをES/mito c−Photina(登録商標)/29クローンに実施して、特異的細胞表面抗原(SSEA−1)(図4A)および転写因子oct3/4(図4B)のような、未分化多能性マウス胚幹細胞の特異的マーカーの存在を調べた。結果は良好であり、図4Aおよび4B中に報告した。
− これらの細胞によって示された他のステム形成の特徴は、ELF(登録商標)ホスファターゼ染色キット(ATCC、カタログ番号SCRR−3010)を用いて測定した、アルカリホスファターゼの酵素活性の存在である(図5)。
(実施例1.1.4)
ES/mito c−Photina(登録商標)/29クローンで実施したin vitroでの分化アッセイ
29クローン細胞の多能性も、心筋細胞およびニューロンのような、異なる胚葉由来の細胞型にin vitroで分化するこれらの細胞の能力によって実証した。
ES/mito c−Photina(登録商標)/29クローンで実施したin vitroでの分化アッセイ
29クローン細胞の多能性も、心筋細胞およびニューロンのような、異なる胚葉由来の細胞型にin vitroで分化するこれらの細胞の能力によって実証した。
胚様体(EB)形成のステップを含む懸濁培養プロトコルおよび接着におけるプロトコル(データ示さず)のような異なる手法を使用して、分化の実験を実施した。
EBステップを含むプロトコルを使用して、特に最適な結果を得た(材料および方法を参照)。
心筋細胞
前に記載した手順を使用して、分化第6日から始まった自然に鼓動する心筋細胞の出現を我々は発見した。鼓動領域を含むEBの割合は約80%であった(図6)。異なる支持体、すなわちゼラチンコーティングした24MTP、96MTP、384MTP、およびチャンバースライドのような支持体を使用して、この割合をさらに維持した(データ示さず)。
前に記載した手順を使用して、分化第6日から始まった自然に鼓動する心筋細胞の出現を我々は発見した。鼓動領域を含むEBの割合は約80%であった(図6)。異なる支持体、すなわちゼラチンコーティングした24MTP、96MTP、384MTP、およびチャンバースライドのような支持体を使用して、この割合をさらに維持した(データ示さず)。
成熟心筋細胞の存在を確認するために、免疫蛍光アッセイを実施して、細胞骨格タンパク質α−アクチニン(図7A)、ミオシン重鎖(MHC)(図7B)、または転写因子GATA−4(図7C)のような特異的心筋細胞マーカーの存在を検索した。
Accutase(登録商標)バッファーを用いた胚様体の解離、および10μMのセレンテラジンタイロード液バッファー中での再懸濁後に、予備機能試験をCCDカメラベースの照度計装置で実施した。細胞を計数し、96MTPにウエル当たり20000個の細胞の細胞濃度で播種した。4時間後37℃において、対照的として標準的なタイロード液バッファー、それぞれGqPCRエンドセリン受容体およびα1−アドレナリン受容体のアゴニストでありいずれも心筋細胞中に高濃度で存在する、50nMのエンドセリン−1および100μMのノルエピネフリンで細胞を刺激した(CCDカメラベースの照度計の条件:高感度、60秒間)。示された応答性は強く(特にエンドセリン受容体に関して)かつ特異的であった(図8A)。同じ細胞を40mMのKCl、脱分極刺激で刺激して、心筋細胞中に高濃度で存在したL型電位依存性カルシウムチャンネルを活性化した。応答の特異性を、(KCl注射前に)特異的L型電位依存性カルシウムチャンネル阻害剤である5μMのニフェジピンと細胞の、15分間のプレインキュベーション有りまたは無しで調べた(図8B)。
残留発光タンパク質の活性を、細胞溶解バッファーを注射して調べた(CCDカメラベースの照度計の条件:高感度、30秒間)(図8C)。
ニューロン
神経分化に関しては、1μMのオールトランス型レチノイン酸の存在下で胚様体が形成された。組織培養処理皿上への平板培養後2日で、その長さが経時的に増大する細胞の延長部分の存在を見ることができた(図9)。
神経分化に関しては、1μMのオールトランス型レチノイン酸の存在下で胚様体が形成された。組織培養処理皿上への平板培養後2日で、その長さが経時的に増大する細胞の延長部分の存在を見ることができた(図9)。
レチノイン酸処理したEBはさらに解離させ、異なるコーティング支持体に再度平板培養し、血清の不在下において神経特異的培地で培養することができる。
これらの細胞において、免疫蛍光性(ニューロフィラメントH、ニューロン核抗原、2つの異なるフルオロクロムを用いた二重染色に関してここでは報告する−図10AおよびB)、またはグリア細胞マーカー(グリア細胞繊維性酸性タンパク質、図10C)、または神経前駆細胞のマーカー(ネスチン、図10D)によって、特異的マーカーの存在を調べた。この種の細胞集団は完全に分化したニューロンによって形成されないが、グリア細胞および神経前駆細胞をさらに含むことを記すことは重要である。図10中に、(分化第18日での)このような集団の一例を報告する。
これらの細胞の機能性をCCDカメラベースの照度計で調べた。分化第14日で、10μMのセレンテラジンを含むタイロード溶液と共に細胞を4時間インキュベートした。細胞はグルタミン酸受容体応答性を調べるために100μMのグルタミン酸を注射して刺激し(図11A)、あるいは6μMのオメガコノトキシンGVIAの存在または不在下において40mMのKClで脱分極刺激して(15分間のプレインキュベーション)、N型電位依存性カルシウムチャンネルを特異的に阻害した(図11B)。
これらの細胞の機能性はFLIPR384でも調べた。分化第16日で培地を除去し、標準的なタイロード液に溶かした膜電位測定用色素と共に、30分間37℃において細胞をインキュベートした。40mMのKClによる刺激後、蛍光シグナルを180秒間記録し、RFUとして表した(図12、連続線)。同じ実験を、対照として未分化ES/mito c−Photina(登録商標)/29クローンに実施した(図12、破線)。
(実施例1.1.5)
生殖細胞系伝達の分析
発光タンパク質レポーター遺伝子を含むマウス胚幹細胞(ES TBV2)を、生殖細胞系伝達によって試験した。クローンN.29および84を両方共、妊娠した宿主メスマウス(EMBL Monterotondo)の胚盤胞に注入した。子孫は、高度のキメラ性(ほぼ100%)およびオスの表現型を示した。29由来の2匹の最良キメラオスマウスを選択し、それらが成熟期に達したとき、BL6メスマウスと交配させて、トランスジェニックES細胞の生殖細胞系伝達能力を調べた。生殖細胞系伝達は、マウス胚幹細胞の全能性を実証するための唯一の明確な方法である。
生殖細胞系伝達の分析
発光タンパク質レポーター遺伝子を含むマウス胚幹細胞(ES TBV2)を、生殖細胞系伝達によって試験した。クローンN.29および84を両方共、妊娠した宿主メスマウス(EMBL Monterotondo)の胚盤胞に注入した。子孫は、高度のキメラ性(ほぼ100%)およびオスの表現型を示した。29由来の2匹の最良キメラオスマウスを選択し、それらが成熟期に達したとき、BL6メスマウスと交配させて、トランスジェニックES細胞の生殖細胞系伝達能力を調べた。生殖細胞系伝達は、マウス胚幹細胞の全能性を実証するための唯一の明確な方法である。
予想通り、これらの交配から生まれたマウスの半分は、発光タンパク質遺伝子が異型であるトランスジェニックマウスである。
これらの異型トランスジェニックマウスを互いに交配させて、同型集団を得た。生まれたマウスの4分の1は同型で表現型が正常であり、トランス遺伝子は如何なる重要な遺伝子も破壊しなかったことを実証した。
これらのc−Photina(登録商標)トランスジェニックマウスは、成体幹細胞(例えば造血、または間葉系幹細胞)、前駆細胞、およびさらに発光タンパク質を含む初代細胞などの細胞の、非常に重要な供給源である。
発光タンパク質トランスジェニック動物由来の細胞は、(ES細胞からの分化後に得られる)「初代様」細胞の陽性対照として使用することができるが、これらの細胞はさらに、本来HTSプロセス用の発光タンパク質を含む初代細胞の良い供給源である。
この理由のため、我々は発光タンパク質が発現される組織を調べることを決めた。
c−Photina(登録商標)トランス遺伝子に対して1匹が陽性であり1匹が陰性である、2匹のマウスを我々は殺傷した。幾つかの組織を2匹のマウスから外植し、20mMのTris−HCl pH7.5、150mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのEDTA、0.1%のBSA、20μMのセレンテラジンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液と共にインキュベートした。3時間のインキュベーション後室温で、我々はTritonX−100および250mMのCaCl2の溶液を注射して組織/器官を溶かして、不飽和カルシウム環境でサンプル中に存在する全発光タンパク質を放出させた(図13A)。異なる組織中の発光タンパク質トランス遺伝子の存在を、異なる年齢(3、6、10カ月齢)の動物において経時的に調べ、同時に前に記載したのと同じ手順を用いてより多くの動物を分析した。サンプル量が標準化されなかった事実を考慮すると、測定したシグナルは保持時間中安定しているようである(図13B)。
次いで我々は第二実験を実施し、その中で我々は、尾静脈を介してセレンテラジン2.8mg/kgを静脈内全身注射した後に異なる組織/器官中に存在する発光タンパク質を、拡散および帯電させるセレンテラジンの能力を調べた(66)。3時間後、マウスを殺傷し幾つかの組織/器官を外植した。材料の半分は、細胞溶解およびカルシウム溶液の注射後に、CCDカメラベースの照度計で直接試験した(高感度、60秒間、0.6積分時間)(図14A)。材料の他の半分は他の96MTPに移し、20μMのセレンテラジンを含む溶液と共にさらに3時間インキュベートした。さらにこの他のプレートは、細胞溶解およびカルシウム溶液の注射後に、CCDカメラベースの照度計で試験した(高感度、60秒間、0.6積分時間)(図14B)。
殺傷前に、我々は膵島の単離および精製も実施した(材料および方法を参照)。膵島は一晩37℃で培養した。翌日膵島を手作業で採取し96MTPに置いた(ウエル当たり10個の膵島)。それらは37℃において3時間、10μMのセレンテラジンを含む標準的なタイロード液中でインキュベートした。
その後膵島を11mMのグルコースで刺激して、カルシウム介在性インシュリン経路を活性化した。対照として、他の糖(カルシウム介在性インシュリン応答を誘導することができない)、マンニトール(最終濃度11mM)でも、膵島を刺激した。これらはLuminoskan照度計;150秒間、積分時間0.5で測定した(図15A)。
次いでグルコース濃度を3mMに標準化し、膵島はさらに脱分極物質(40mMのKCl)で刺激し、CCDカメラベースの照度計で測定した(高感度、60秒間)(図15B)。残留発光タンパク質の活性は、細胞溶解バッファーを注射して調べた(高感度、60秒間)(図15C)。
トランスジェニック動物は、発光タンパク質を含む初代細胞の非常に重要な供給源でもある。この目的のため、初代細胞の例として、単球を陽性マウスおよび対照として陰性マウスの骨髄から単離した。次いでこれらの細胞をin vitroで分化させてマクロファージを得た(68)。細胞培養物を樹立した後、TritonX−100の溶液で細胞を溶解することによって、c−Photina(登録商標)トランス遺伝子の存在を調べた(図16)。
(実施例1.2.1)
Mito i−Photina(登録商標)ES TBV2クローン
マウスES TBV2 mito i−Photina(登録商標)細胞系を、BglII制限酵素を用いて線状にしたmito i−Photina(登録商標)発光タンパク質遺伝子を含むpcDNA3ベクターで、ES TBV2p16細胞のエレクトロポレーションによって得た(材料および方法)。
Mito i−Photina(登録商標)ES TBV2クローン
マウスES TBV2 mito i−Photina(登録商標)細胞系を、BglII制限酵素を用いて線状にしたmito i−Photina(登録商標)発光タンパク質遺伝子を含むpcDNA3ベクターで、ES TBV2p16細胞のエレクトロポレーションによって得た(材料および方法)。
トランスフェクション後48時間で、200μg/mlのG418を用いて細胞を選択した。選択の8日後、130の薬剤耐性コロニーを採取し、以下の96ウエル/プレートにおける5回の反復実験においてコンフルエンシーに達するまでMEF層でそれらを増殖させた:
− 2回は、播種後24および48時間におけるCCDカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
− 1回は、DNA抽出用にゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
− 2回は、−80℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
− 2回は、播種後24および48時間におけるCCDカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
− 1回は、DNA抽出用にゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
− 2回は、−80℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
(実施例1.2.2)
Mito i−Photina(登録商標)ES TBV2クローンの選択
ES TBV2 mito c−Photina(登録商標)細胞系に関して前に報告したのと全く同様にクローンを選択した。
Mito i−Photina(登録商標)ES TBV2クローンの選択
ES TBV2 mito c−Photina(登録商標)細胞系に関して前に報告したのと全く同様にクローンを選択した。
最終クローンは番号70および43である。70クローンは最高のヒスタミン応答性を示したが(図17A)、クローン43も良いヒスタミン用量応答性を示した(データ示さず)。細胞溶解時の全体の発光は両方共良好である(図17B)。
それらはリアルタイムPCR用ではなく、唯一の積分値を示すサザンブロットによってさらに分析した。
2つのクローンに関する核型は正確であった。
(実施例1.3.1)
i−Photina(登録商標)ES TBV2クローン
マウスES TBV2 i−Photina(登録商標)細胞系を、BglII制限酵素を用いて線状にしたi−Photina(登録商標)発光タンパク質遺伝子を含むpcDNA3ベクターで、ES TBV2p16細胞のエレクトロポレーションによって得た(材料および方法)。
i−Photina(登録商標)ES TBV2クローン
マウスES TBV2 i−Photina(登録商標)細胞系を、BglII制限酵素を用いて線状にしたi−Photina(登録商標)発光タンパク質遺伝子を含むpcDNA3ベクターで、ES TBV2p16細胞のエレクトロポレーションによって得た(材料および方法)。
トランスフェクション後48時間で、200μg/mlのG418を用いて細胞を選択した。選択の8日後、99の薬剤耐性コロニーを採取し、以下の96ウエル/プレートにおける5回の反復実験においてコンフルエンシーに達するまでMEF層でそれらを増殖させた:
− 2回は、播種後24および48時間におけるCCDカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
− 1回は、DNA抽出用にゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
− 2回は、−80℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
− 2回は、播種後24および48時間におけるCCDカメラベースの照度計での試験用に、ゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
− 1回は、DNA抽出用にゼラチンコーティングした96白色MTP上であった。
− 2回は、−80℃での凍結および保存用にフィーダー層上であった。
(実施例1.3.2)
i−Photina(登録商標)ES TBV2クローンの選択
ES TBV2 mito c−Photina(登録商標)細胞系に関して前に報告したのと全く同様にクローンを選択した。
i−Photina(登録商標)ES TBV2クローンの選択
ES TBV2 mito c−Photina(登録商標)細胞系に関して前に報告したのと全く同様にクローンを選択した。
最終クローンは番号113および109ある。113クローンは最高のヒスタミン応答性を示した(図18A)。細胞溶解時の全体の発光は両方共良好である(図18B)。
それらはリアルタイムPCR用ではなく、唯一の積分値を示すサザンブロットによってさらに分析した。
2つのクローンに関する核型は正確であった。
(実施例2)
発光タンパク質を用いてトランスフェクトしたP19細胞系の作製
(実施例2.1.1.Mito c−Photina(登録商標)P19クローン)
P19 mito c−Photina(登録商標)細胞系を、BglII制限酵素を用いて線状にしたmito c−Photina(登録商標)発光タンパク質遺伝子を含むpcDNA3ベクターで、P19細胞のエレクトロポレーションによって得た(材料および方法)。
発光タンパク質を用いてトランスフェクトしたP19細胞系の作製
(実施例2.1.1.Mito c−Photina(登録商標)P19クローン)
P19 mito c−Photina(登録商標)細胞系を、BglII制限酵素を用いて線状にしたmito c−Photina(登録商標)発光タンパク質遺伝子を含むpcDNA3ベクターで、P19細胞のエレクトロポレーションによって得た(材料および方法)。
トランスフェクション後48時間で、700μg/mlのG418を用いて細胞を選択した。選択の約第7〜8日後、薬剤耐性コロニーを採取し、増殖させた。
(実施例2.1.2)
Mito c−Photina(登録商標)P19の選択
測定4時間前に、培地を暗所で37℃において5%CO2での湿度雰囲気中で、ウエル当たり50μlのタイロードバッファー、2mMのCa2+および10μMのセレンテラジンと置換して、活性発光タンパク質を再構成した。
Mito c−Photina(登録商標)P19の選択
測定4時間前に、培地を暗所で37℃において5%CO2での湿度雰囲気中で、ウエル当たり50μlのタイロードバッファー、2mMのCa2+および10μMのセレンテラジンと置換して、活性発光タンパク質を再構成した。
発光測定用に、P19内因性ヒスタミン−1受容体を刺激し(58)細胞質Ca2+濃度を上昇させることが知られているヒスタミンに応答する能力(発光シグナル)に関して、細胞を最初に分析した。
2個の最終クローンを、ヒスタミンに応答する際の発光タンパク質の活性、およびTritonX−100による細胞溶解後に測定した全発光タンパク質含有量に基づいて選択した(図19)。心筋細胞発生のための誘導物質として0.5〜1%のDMSOおよびニューロン用にレチノイン酸の存在または不在下で胚様体形成を使用して得られる、自然に鼓動する心筋細胞およびニューロンに、分化プロセス後に分化するそれらの能力も考慮した(61、62、64、67)。
(実施例2.1.3)
P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンin vitroでの神経系統への分化
多能性胚性癌腫P19発現mito c−Photina(登録商標)細胞の1A1クローンは、in vitroで神経細胞型に分化することができることを示した。これらの細胞がニューロフィラメントH(NFH)およびニューロン核(NeuN)(図20Aおよび20B)、または神経前駆細胞のマーカー(ネスチン)(図20C)のような神経特異的マーカーを発現することを、免疫蛍光によって実証した。
P19/mito c−Photina(登録商標)/1A1クローンin vitroでの神経系統への分化
多能性胚性癌腫P19発現mito c−Photina(登録商標)細胞の1A1クローンは、in vitroで神経細胞型に分化することができることを示した。これらの細胞がニューロフィラメントH(NFH)およびニューロン核(NeuN)(図20Aおよび20B)、または神経前駆細胞のマーカー(ネスチン)(図20C)のような神経特異的マーカーを発現することを、免疫蛍光によって実証した。
これらの細胞の機能性はCCDカメラベースの照度計でも調べた。分化第8日および第11日(ポリD−リシンコーティングした384MTPにおける胚様体の解離および播種後それぞれ第4日および第7日)に、10μMセレンテラジンを含むタイロード溶液と共に細胞を4時間インキュベートした。電位依存性カルシウムチャンネルは、40mMのKClまたは対照として標準的なタイロード液の注射で刺激し、最適な応答性を示した(図21)。
分化第8日に、同じ細胞を、FLUO−4NW(登録商標)と共に細胞をインキュベートし、40mMのKCl脱分極物質を注射し、FLIPR384でさらに分析した。さらにこの場合、細胞中へのカルシウムの進入によるシグナルの感知し得る増大があり、最悪の反応速度の場合でさえ、発光レポーター系で観察されるシグナルをしたがって形成する(図22)。
同じ発生段階(第8日)のこれらの細胞を、代謝調節型またはイオンチャンネル型グルタミン酸受容体(図23B、破線)あるいはヒスタミン−1受容体(GqPCR)(図23B、連続線)の存在に関してFLIPR384でさらに分析した。同じ実験を未分化P19/mito c−Photina(登録商標)1A1クローンに(384MTPにウエル当たり3000個の細胞の播種後24時間で、図23A)同時に実施した。特に、ヒスタミン刺激後に記録したシグナルは未分化細胞中ではより大きく(それはその段階で高度に発現されるので予想通り)、分化中に低下する。反対のことがグルタミン酸刺激に関して示された、何故ならそれは未分化細胞中より分化細胞中に多量に存在するからである。グルタミン酸受容体の存在は、これらの細胞の神経関与の他の証拠である。
(実施例3)
一過性トランスフェクション
P19細胞を異なるミトコンドリアタグ発光タンパク質でトランスフェクトして(材料および方法)これらの他の発光タンパク質の能力を評価して、細胞内のカルシウム放出を測定し、発光タンパク質発現のレベルに関する情報を得た。
一過性トランスフェクション
P19細胞を異なるミトコンドリアタグ発光タンパク質でトランスフェクトして(材料および方法)これらの他の発光タンパク質の能力を評価して、細胞内のカルシウム放出を測定し、発光タンパク質発現のレベルに関する情報を得た。
測定4時間前に、培地を暗所で37℃において5%C02での湿度雰囲気中で、タイロードバッファーおよび10μMのセレンテラジンと置換して、活性発光タンパク質を再構成した。
100μMのヒスタミン注射後に60秒間蛍光シグナルを記録した。
次いで細胞をTritonX−100で溶かして、全発光を検出した(図24)。
(実施例4)
安定的なトランスフェクション
P19細胞における異なるミトコンドリアタグ発光タンパク質の安定的なトランスフェクション(材料および方法)を実施して、安定して組み込まれた形式での発光タンパク質発現のレベルを調べ、P19細胞において安定して発現された発光タンパク質はいずれも、培養中の長期間毒性がないことを確認した。
安定的なトランスフェクション
P19細胞における異なるミトコンドリアタグ発光タンパク質の安定的なトランスフェクション(材料および方法)を実施して、安定して組み込まれた形式での発光タンパク質発現のレベルを調べ、P19細胞において安定して発現された発光タンパク質はいずれも、培養中の長期間毒性がないことを確認した。
測定4時間前に、培地を暗所で37℃において5%CO2での湿度雰囲気中で、タイロードバッファーおよび10μMのセレンテラジンと交換して、活性発光タンパク質を再構成した。
蛍光シグナルを50、100および150μMのヒスタミン注射後に記録し、60秒間測定した。
次いで細胞をTritonX−100で溶かして、全発光を検出した(図25)。
(実施例5)
FLIPR384での細胞ベースの蛍光アッセイ
P19 mito c−Photina(登録商標)最終クローン(1A1および1A2)も、発光の代わりに蛍光を使用する検出法を用いて、内因性ヒスタミン1受容体の活性化によって誘導されるカルシウム濃度の変化を測定することによってFLIPR384で試験した。
FLIPR384での細胞ベースの蛍光アッセイ
P19 mito c−Photina(登録商標)最終クローン(1A1および1A2)も、発光の代わりに蛍光を使用する検出法を用いて、内因性ヒスタミン1受容体の活性化によって誘導されるカルシウム濃度の変化を測定することによってFLIPR384で試験した。
細胞はカルシウム3アッセイキット(Molecular Devices Corporation、Sunnyvale、CA、USA)でインキュベートした。
これらの実験を実施して、発光ベースのカルシウム検出の代わりに蛍光カルシウム検出法を使用して得た結果を比較し、蛍光に優る発光の利点を評価した。得られた結果は、蛍光ベースの方法は発光と比較して高いバックグラウンドを有することを示す。これは蛍光の低いシグナル対ノイズバックグラウンドを反映する。それとは反対に、発光に関するシグナル対ノイズバックグラウンドは高く、これは蛍光と比較して広いダイナミックレンジを反映する(図26)。
[参考文献]
[参考文献]
Claims (31)
- アポ発光タンパク質遺伝子を発現することができ、細胞内カルシウム濃度の変化に応じて生物発光シグナルを生成することができる、非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 前記アポ発光タンパク質遺伝子の発現および/または細胞内カルシウム濃度の変化に応じた生物発光シグナルの生成が偏在する、請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 前記アポ発光タンパク質遺伝子の発現および/または細胞内カルシウム濃度の変化に応じた生物発光シグナルの生成が誘導性および/または器官、組織、細胞もしくは発生段階特異的である、請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 非ヒト哺乳動物である、請求項1から3のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- げっ歯類である、請求項4に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- マウスである、請求項5に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 前記アポ発光タンパク質遺伝子が天然の、または組換えもしくは合成による任意のアポ発光タンパク質遺伝子である、請求項1から6のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 前記アポ発光タンパク質が、改善された発光活性および/またはカルシウム感受性を有する天然または変異誘発突然変異体である、請求項7に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 前記アポ発光タンパク質遺伝子が、哺乳動物のコドン使用頻度に対して最適化されたおよび/またはミトコンドリア標的配列と融合した配列を有する、請求項8に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 前記アポ発光タンパク質の配列が配列番号1である、請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 前記アポ発光タンパク質の配列が以下の位置Gly142→Cysで変異誘発されたClytin配列(GenBank登録番号Q08121)である、請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 前記アポ発光タンパク質の配列が以下の12の位置:G1y58→Glu、Asp69→Val、A1a70→Cys、Lys76→Arg、Lys77→Gly、Ile78→Cys、Asp81→Glu、Val86→Ile、G1u87→Ala、Ala90→Gln、Val92→Leu、およびG1u97→Glnで変異誘発されたClytin配列(GenBank登録番号Q08121)である、請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物、その子孫および派生細胞。
- 特定の標的遺伝子を発現することができる、または特定の細胞系列に分化して特定の標的遺伝子を発現する請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞。
- 前記特定の細胞系列が筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列または間葉細胞系列または造血細胞系列である、請求項13に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞。
- 細胞内Ca++の変化が得られるように特定の標的を刺激することができるリガンドを同定するための方法であって、
a) 請求項13または14に記載の派生細胞を用意するステップと、
b) 前記標的を発現させるステップと、
c) 基質として適する発色団を細胞に添加するステップと、
d) 前記標的の推定リガンドを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
e) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップ
を含む方法。 - 前記特定の細胞系列が筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列である、請求項15に記載の方法。
- ハイスループットスクリーニングによって実施する、請求項15または16に記載の方法。
- 細胞内Ca++の変化が得られるように、標的に対するアンタゴニストを同定するための方法であって、
a) 請求項13または14に記載の派生細胞を用意するステップと、
b) 前記標的を発現させるステップと、
c) 基質として適する発色団を細胞に添加するステップと、
d) 前記標的の推定アンタゴニストを含む化合物ライブラリーと細胞を接触させるステップと、
e) 前記標的を刺激することができるリガンドと細胞を接触させるステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光の変化を検出するステップ
を含む方法。 - 前記特定の細胞系列が筋肉心臓細胞系列または神経細胞系列または間葉細胞系列または造血細胞系列である、請求項18に記載の方法。
- ハイスループットスクリーニングによって実施する、請求項18または19に記載の方法。
- 特定の細胞系列への請求項13または14に記載の派生細胞の分化を刺激する作用物質を同定するための方法であって、
a) 未分化段階の請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
b) 推定分化誘導剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
c) 少なくとも1つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
d) 基質として適する発色団を細胞に添加するステップと、
e) 細胞内Ca++の変化が得られるようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップ
を含む方法。 - ハイスループットスクリーニングによって実施する、請求項21に記載の方法。
- 特定の細胞系列への請求項13または14に記載の派生幹細胞の分化を阻害する作用物質を同定するための方法であって、
a) 未分化段階の請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生幹細胞を用意するステップと、
b) 推定分化阻害剤を含む化合物ライブラリーに前記派生幹細胞を曝すステップと、
c) 既知の分化誘導剤に前記派生幹細胞を曝して、少なくとも1つの特定の細胞系列標的を発現させるステップと、
d) 基質として適する発色団を細胞に添加するステップと、
e) 細胞内Ca++の変化を得るようにリガンドによって前記特定の細胞系列標的を刺激するステップと、
f) 発光タンパク質の生物発光を検出するステップ
を含む方法。 - ハイスループットスクリーニングによって実施する、請求項23に記載の方法。
- ES/発光タンパク質細胞の分化後に得られる「初代様」細胞の陽性対照としての、請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞の使用。
- レポーター系として発光タンパク質を含む前記派生細胞を化合物のスクリーニングに使用する、請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生細胞の使用。
- 薬理学的ex−vivo試験または動物モデルにおける移植実験のための、レポーター系として発光タンパク質を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の派生組織または派生器官の使用。
- バイオイメージング試験用の、請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用。
- 薬理学的関連がある動物モデルとの交配用の、請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用。
- 前記動物モデルがレポーター遺伝子を有するトランスジェニック動物、またはKOもしくはKI突然変異動物モデルである、請求項28に記載の非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫の使用。
- 物質の毒性および/または奇形学的in vivo試験用の、請求項1から12のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物の使用。
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