CN102816854A

CN102816854A - 一种空间诱变机制的研究方法及其所使用生物遗传突变分子报告模型

Info

Publication number: CN102816854A
Application number: CN2012103191497A
Authority: CN
Inventors: 李飞; 赵仁滨; 张文德; 王玮
Original assignee: Beijing Tianchen Space Biomedical R & D Co Ltd
Current assignee: Biotechnology Group Co.,Ltd of space flight divine boat
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2012-12-12

Abstract

一种空间诱变机制的研究方法及其所使用生物遗传突变分子报告模型。本发明提供了一种利用生物遗传突变分子报告模型研究空间诱变机制的研究方法以及检测并评估空间诱变频率的方法。该方法通过构建含有不同突变形式报告基因的转基因生物突变体，在地面模拟空间环境条件或经空间搭载后，通过报告基因的变化检测并评估空间诱变频率，进一步研究空间诱变机制。该方法能够直接检测生物体DNA水平发生的变异，检测准确性高、方法灵敏、重复性好、检测方法快速、直接。

Description

一种空间诱变机制的研究方法及其所使用生物遗传突变分子报告模型

技术领域

本发明涉及空间生命科学领域和分子生物学领域，包括空间诱变研究，特别是空间诱变育种领域。具体而言，本发明提供了一种研究空间诱变机制以及评估空间诱变频率的方法，特别是一种利用生物遗传突变分子报告模型研究空间诱变机制的研究方法以及检测并评估空间诱变频率的方法。

本发明还涉及在本发明所述方法中使用的生物遗传突变分子报告模型，及其设计和使用方法。本发明进一步还提供了一种可以活体检测植物体细胞基因组DNA同源重组模型的构建方法。

背景技术

随着人类对空间资源的开发利用和载人航天的发展，有关空间环境对生物体的效应研究已经受到广泛重视。空间环境具有强辐射、微重力、高真空和复杂电磁环境等特点，研究显示这些环境会对生物体带来一系列复杂的效应和作用：①引起人类心血管功能障碍、肌肉萎缩、骨质减少、免疫功能低下、内分泌紊乱等病理变化；②导致细胞形态发生变化，细胞壁变薄并凹凸、细胞器及其结构发生变化、微丝和微管的解聚、微管和中间纤维的形态异常，有序性降低；③对生物遗传物质产生影响，诱发染色体畸变和DNA损伤，产生变异。

空间环境诱导产生的遗传物质变异容易诱发细胞发生癌变、形成肿瘤，对于宇航员的健康产生潜在危害；同时也会影响航天环境中生物遗传稳定性，如受控生态生命保障系统中的生物部件和空间环境中的微生物为长期载人航天任务带来潜在风险。空间诱变既有有害的一方面，也有有利的一方面，如我国利用空间诱变产生新的种质资源——空间诱变育种。空间诱变育种是利用返回式航天器(卫星、航天飞机和宇宙飞船)将农作物种子或微生物菌种等生物样品带到太空，利用太空特殊的环境条件(主要是空间宇宙射线、微重力、高真空、弱磁场等因素)对生物体进行空间诱变，使种质资源产生变异，再返回地面选育新品种（系）。我国的空间诱变育种在作物品种改良、微生物菌种选育中已经取得了很大的成就，获得了不少优良的突变类型，据统计在水稻、玉米、大豆、棉花、番茄、青椒、苜蓿等多种农作物上培育出进入省级以上区域试验的优异新品系200多个；在微生物方面也选育得到具有高产酶活性、高产次级代谢产物活性的菌种，其中一些优良的菌种在生产上得以应用，取得了良好的经济效益和社会效益。

研究空间环境诱变机制，阐明空间诱变发生的分子途径及诱发变异的主要因素，有助于防护装置和保护药物的开发，保证空间飞行人员的健康；可以为受控生态生命保障系统设计以及航天环境生物防护技术开发等提供依据；同时还有益于人类更有效开发利用空间资源，为空间诱变育种奠定理论基础，促进空间诱变育种产业进一步发展。但是，目前空间诱变机制研究还处于起步阶段，研究多侧重于简单描述，空间诱变的分子机制严重滞后，存在诱变机制不清，诱变因素不确定等诸多问题。空间诱变机制研究瓶颈之一是研究手段有限，目前现有技术中空间诱变分子水平检测DNA变异主要是通过分子标记的方法，在分子水平研究方面主要有RAPD、SSR、ISSR、AFLP等分子标记手段检测遗传物质变异，而这些研究手段存在准确性低、重复性和稳定性差、周期长、工作量大等缺陷。

因此，本领域需要一种新的研究/检测空间诱变机制的方法和系统。

发明内容

本发明应用生物遗传突变分子报告模型作为研究空间诱变的研究手段，从而克服了上述缺陷，能够直接检测生物体DNA水平发生的变异，检测准确性高、方法灵敏、重复性好、检测方法快速、直接。我们所述的方法和模型即可以用于检测空间诱变的因素，又可以检测发生的变异方式，

生物遗传突变分子报告模型主要是利用基因工程手段构建含有突变报告基因的转基因生物突变体，由于报告基因含有突变，失去功能活性，在对转基因生物突变体进行外界条件胁迫后，报告基因发生变化而恢复了活性功能，此时即可检测到报告基因，由此判断外界条件胁迫对生物体基因组DNA变异影响。目前国外研究者已经在微生物、植物和动物中构建了多种生物遗传突变分子报告模型，主要用于检测污染物的遗传毒性，如食品添加剂、化妆品等的致突变性，农药和化合物致癌性等等；重金属离子、病原菌侵染、盐胁迫等条件对植物遗传稳定性影响等等。该种生物遗传突变分子报告模型在国内外研究中还未发现有在空间诱变机制研究中应用的报道。本发明首次将这种生物遗传突变分子报告模型应用到一个新的领域——空间诱变机制研究，从而解决空间诱变机制研究方法有限的瓶颈，克服目前空间诱变分子水平检测遗传物质变异方法中存在的准确性低、重复性和稳定性差、周期长、工作量大等缺陷。

本发明涉及一种利用生物遗传突变分子报告模型研究空间诱变机制的研究方法。生物遗传突变分子报告模型主要是一种含有突变报告基因的转基因生物，由于转基因生物含有的是一个突变的报告基因，失去功能活性，正常条件下不能检测到该报告基因，只有该突变的报告基因发生变异恢复为有功能活性时，即可以检测到报告基因。突变的报告基因是整合到生物体基因组上，因此该报告基因发生的变异可以反映生物体基因组DNA水平的变异情况，即可以直接检测生物体DNA水平的变异，由此可以判断外界条件胁迫对生物体基因组DNA水平的变异影响。通过构建不同突变形式的报告基因（如点突变、移码突变、重组突变等）即可以检测生物体发生的各种DNA变异方式（如点突变、移码突变、重组突变等）。

本发明涉及的这种生物遗传突变分子报告模型是通过检测报告基因的变异情况来检测生物体基因组DNA水平的变异，而报告基因的检测方法均快速、简便，因此利用该种模型检测生物体基因组DNA水平的变异相对于分子标记技术更简单快速，节约成本。目前常用的报告基因主要有抗性筛选标记基因、GUS（β-葡萄糖苷酸酶）、LUC（荧光素酶）、GFP（绿色荧光蛋白）等等。

本发明涉及的这种生物遗传突变分子报告模型经空间培养或搭载后，通过检测报告基因的变异水平，即可以检测空间环境条件对生物体遗传变异的影响，从分子水平上证明空间环境条件能否诱导产生DNA水平的变异以及变异频率等；通过使用不同突变形式的报告基因模型（如点突变、移码突变、重组突变等）即可以检测空间环境条件能否诱导生物体发生的主要DNA变异方式（如点突变、移码突变、重组突变等）。同时研究与DNA变异相关基因的表达差异，揭示诱变产生的分子途径，为空间诱变机制研究提供理论基础。在本发明的实施方式中，所检测到的特定基因的变化一方面证明了突变的发生；另一方面也说明空间诱变能够引起这些基因表达发生变化，可能是通过这些基因调控实现变异的（变异产生的分子途径）。

另外，还可以通过地面模拟空间环境条件的单一因素或复合因素对生物遗传突变分子报告模型的影响，研究哪些因素会诱导产生变异，以及相关基因的表达差异，综合分析真实的空间环境条件和地面模拟空间环境条件对生物遗传突变分子报告模型影响的异同和相关性，进而阐释空间诱变机制。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

本发明涉及的生物遗传突变分子报告模型之一是一种检测微生物DNA点突变的大肠杆菌(E.coli)FC40模型（John Cairns and PatriciaL.Foster,Genetics,128,p695-701,1991）。大肠杆菌FC40是由P90C衍生的菌株，其染色体上带有Rif抗性基因，缺失包括lac操纵子在内的部分DNA区域。另外FC40包含一个F因子，F因子上末端缺失4个氨基酸序列的lacI与前端缺失23个氨基酸序列的lacZ形成融合基因，由于lacP和lacO的缺失，lacI变为组成型转录，但因为lacI的320bp处加入一个碱基C，密码子由CCC变成了CCCC，发生移码突变，所以FC40是lac^-表型，不能在乳糖为唯一碳源的选择平板上生长，当空间环境条件诱发DNA发生突变回复正常读码框时即可利用乳糖，即可在乳糖为唯一碳源的选择平板上生长，由此判断空间环境条件对大肠杆菌DNA变异的影响。

本发明通过地面模拟空间环境条件中的辐照和微重力，利用这种检测微生物DNA点突变的生物遗传突变分子报告模型（大肠杆菌FC40）研究发现该种模型能够很好的检测大肠杆菌DNA的点突变频率（参见实施例1）。该种方法检测空间环境对微生物诱变效应研究具有如下几个优势：

第一，能够有效的检测到生物在外界刺激后是否发生DNA水平变异以及变异发生的频率，回答空间环境是否能否诱导DNA水平变异的问题。

第二，可以对多种胁迫条件做出响应，这样就可以通过该模型对地面模拟空间环境的单一因素或复合因素的响应，知道哪些因素是空间诱变的主要因素，回答空间诱变的诱变因素问题。

第三，可通过检测大肠杆菌FC40发生点突变涉及基因的变化来阐释空间环境条件下的突变机制，为空间环境诱变机制提供理论依据。

本发明涉及的生物遗传突变分子报告模型之二是一种检测植物基因组DNA同源重组的转基因拟南芥生物模型（AtJML1418B）(PeterSwoboda et al,The EMBO Joural,13,p484-489,1994)。该种模型是将β-葡萄糖苷酸酶基因（udiA gene）基因分割为两部分，这两部分含有618bp的重叠序列，将其插入到植株的基因组中，由于分割后的基因失去功能活性，不能行使功能，但当这两部分重复序列发生同源重组后基因会恢复功能，通过组织化学染色检测β-葡萄糖苷酸酶（Gus）活性判断基因组DNA同源重组事件，由此判断空间环境条件对植物基因组DNA变异的影响。

本发明通过地面模拟空间环境条件中的辐照和微重力，利用这种检测基因组DNA同源重组的生物遗传突变分子报告模型（AtJML1418B）研究发现该种模型能够很好的检测植物基因组DNA同源重组频率（参见实施例2）。该种方法检测空间环境对植物诱变效应研究除了具有上述微生物模型的优势外，还具有以下几个优势：

第一，能够在植株发育的整个阶段对重组事件进行分析。

第二，能够检测到植物单个细胞发生的DNA水平变异，检测方法非常灵敏，通过不同变异点大小即可以判断变异发生的早晚。

第三，所用植物为拟南芥，是一种模式植物，基因组小，已经完成全基因测序，遗传背景清楚，基因功能明确，利用该模式植物模型对不同诱变因素的响应，进一步研究基因的响应情况较为容易，可以进一步揭示空间诱变的分子机制。

第四，该转基因植物模型的检测只需要染色实验即可，方法简单、快速、成本低。

本发明涉及的这种检测植物基因组DNA同源重组的Gus报告基因模型也存在一定得局限性：

第一，是一种终点检测模型，通过染色固定的方法进行检测，检测完成后植株死亡，不能进行活体检测。

第二，检测单个细胞突变时需要借助显微镜观察，工作量较大，不能进行高通量检测。

本发明鉴于上述缺陷，构建了一种用于活体检测的植物模型——拟南芥基因组DNA同源重组荧光素酶报告系统（参见实施例3）。

本发明构建的拟南芥基因组DNA同源重组荧光素酶报告系统是一种可以用于活体检测植物体细胞基因组DNA同源重组的生物报告模型。该模型包含四个植物表达载体（附图1），分别用于检测植物体细胞染色体内同源序列同向重组（pGreen-LU′-U′C）、植物体细胞染色体内同源序列反向重组（pGreen-U′L-U′C、pGreen-LU′-CU′）、植物体细胞染色体间同源序列重组（pGreen-U′L-CU′），各个载体检测重组方式示意图如附图2所示。该模型主要是通过基因工程手段，将完整的报告基因（Luc）表达框破坏，分割为两个部分（LU′、U′C），两部分包含一段同源序列（U′），被破坏的报告基因不能行使功能，不能检测到报告基因的表达，只有当这两部分同源片段经过同源重组，成为正确表达框（LUC）时才能行使功能，才可以检测到报告基因的表达，由此直接检测植物体细胞发生DNA水平的变异情况。如图2所示，各个载体pGreen-LU′-U′C的插入序列从5’至3’由启动子（35S启动子）、正向的LU’片段、Gus片段、正向的U’C片段、终止子（35S终止子）组成；pGreen-U′L-U′C的插入序列从5’至3’由反向的LU’片段、反向启动子（35S启动子）、Gus片段、正向的U’C片段、终止子（35S终止子）组成；pGreen-LU′-CU′的插入序列从5’至3’由正向的U’C片段、终止子（35S终止子）、Gus片段、反向的LU’片段、反向的启动子（35S启动子）组成；pGreen-U′L-CU′的插入序列从5’至3’由正向的U’C片段、终止子（35S终止子）、Gus片段、正向的启动子（35S启动子）、正向的LU’片段组成。

具体而言，LU′-U′C、U′L-U′C、LU′-CU′、U′L-CU′片段的核苷酸序列分别是SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ IDNo：4所示。

本发明构建的拟南芥基因组DNA同源重组荧光素酶报告系统使用的报告基因是萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）。萤火虫荧光素酶基因全长1653bp，编码550aa。本发明使用的荧光素酶基因完整表达框来源于质粒pGreen1579，含35s启动子、luc基因编码区、35s终止子构成的完整表达框。通过PCR方法扩增得到两个同源序列片段，一片段为“35s启动子-luc基因上游编码区”，另一片段为“luc基因下游编码区-35s终止子”，两同源序列片段在luc基因编码区有1153bp的重叠区（同源序列区）。两同源序列片段均是不完整的基因，正常条件下不能编码具有活性功能的荧光素酶，不能够作用于底物，因此不能够检测到。但是当两个同源片段发生重组后，即可形成完整的荧光素酶表达框，可以编码具有活性功能的荧光素酶，作用于底物发光，可以通过活体成像检测到。所以只有发生同源重组的细胞才能够检测到荧光亮点，由此检测植物体细胞发生的基因组DNA变异。

两个同源片段中间通过一个接头（linker）连接，该接头具有如下两个功能：一是可以增加两同源片段的柔韧性，更利于两同源片段发生重组。二是所用接头为β-葡萄糖苷酸酶基因（gus gene）的完整表达框，可以编码葡萄糖苷酸酶，用于筛选转基因阳性植株。该Gus完整表达框来源于质粒pGreen35S-Gus，含35s启动子、Gus基因编码区、35s终止子构成的完整表达框。

本发明构建的荧光素报告基因同源重组拟南芥模型，为研究外界胁迫条件对植物基因组DNA变异的影响提供了一种有效的研究工具。该生物模型除具有上述拟南芥基因组DNA同源重组Gus报告系统的优点外，还具有如下三个独特优点：

第一，检测方法是一种活体检测，通过发光检测植物基因组DNA变异情况，不会对植物生长产生影响，可以检测植物生长的不同时期DNA变异情况。

第二，检测不同DNA同源重组变异方式，可以检测同源染色体内、同源染色体间的正向和反向重组。

第三，检测方法是发光检测，可以高通量检测。

本发明所构建的这种荧光素酶报告基因植物体细胞同源重组模型，可以用于活体成像检测，克服了组织化学检测需要损失植株的缺陷；同时检测是应用高度灵敏的制冷CCD相机及成像暗箱，可以观测并记录单个光子进行成像，因此可以检测到单个细胞水平的重组事件，并且不需要借助显微镜观察，可以极大的减少人力及时间，可以高通量检测。

本发明所涉及的这种生物遗传突变分子报告模型在空间诱变机制研究中的应用方法，不仅局限于上述的三个生物模型的应用（微生物点突变模型、拟南芥基因组DNA同源重组Gus报告系统和拟南芥基因组DNA同源重组荧光素酶报告系统），还包括与上述原理相同其他生物报告模型。

例如一

检测微生物DNA变异的Ames test模型(BRUCR NAMES(1973),Proc.Nat.Acad.Sci,Vol.70,No 3,p782-786)：是利用组氨酸突变鼠伤寒沙门氏菌的突变体，在组氨酸培养基中不能生长，当发生DNA变异后恢复突变到能够利用组氨酸的野生型，从而在组氨酸培养基上生长，以此判断外界胁迫条件对微生物DNA变异的影响。

例如二

大肠杆菌点突变模型：1989年由CLAIRE G.CUPPLES等人构建的lacZ点突变模型（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 p5345），lacZ基因编码的β-galactosidase酶461位置的谷氨酸是活性必须氨基酸，该位点突变后酶失去功能活性，该模型在该位点构建了6种不同的碱基突变后得到lac^-表型突变体，当该位点发生DNA点突变恢复编码谷氨酸时表现lac⁺。

例如三

2000年Barbara Hohn等人构建了一种可以检测植物体细胞点突变的转基因拟南芥模型（The EMBO journal,vol.19 No.17p4431-4438）：该模型是将报告基因GUS（udiA gene）的5′端改变一个核苷酸，产生终止密码子，从而不能编码活性蛋白，当该位点发生点突变后恢复功能，编码活性蛋白后通过组织化学法检测Gus染色判断基因组DNA点突变事件。该模型的缺点是突变频率较低，需要检测大量植株。

例如四

2006年F.J.Belzile等人构建的一种可以检测植物体细胞多种点突变的转基因拟南芥模型（Genome 49:1366-1373）：在GUS报告基因5′端引入一个含16个G（鸟嘌呤）的微卫星DNA，产生移码突变，当增加两个G或缺失1个G时恢复功能活性，由于微卫星DNA通常有较高的变异频率，因此转基因植株上的突变点较多，可以使用更少的植株进行检测。

例如五

1992年JOHN C.SCHIMENTI构建的检测染色体交换的转基因小鼠模型（MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,June 1992,p.2545-2552）：将lacZ报告基因改造为供体和受体两个部分，受体部分含完整的基因表达框，但基因中间插入2bp产生移码突变，供体部分缺失启动子和氨基端36个氨基酸及羧基端136个氨基酸，供体和受体含有2.5kb的同源序列，供体和受体两部分均不能编码活性蛋白，当受体部分与供体部分发生染色体交换后恢复正常功能，通过组织化学染色检测转基因雄鼠配子基因组重组情况。

例如六

1996年Maria Jasin构建的检测染色体内同向重组转基因小鼠模型（Human Molecular Genetics,1996,Vol.5,No.7 875–886）：在lacZ报告基因中间插入一个片段将基因破坏掉，该插入片段含有1.7kb的同向重复序列，当该重复序列发生染色体内重组后恢复报告基因活性，通过流式细胞仪检测含有报告基因的精子细胞判断基因组DNA重组情况。

附图说明

附图1同源重组表达载体：a为检测分子内同向重组植物表达载体pGreen-LU′-U′C；b为检测分子内反向重组植物表达载体pGreen-U′L-U′C；c为检测分子内反向重组植物表达载体pGreen-LU′-CU′；d为检测分子间重组植物表达载体pGreen-U′L-CU′。

附图2同源重组载体重组方式：a为分子内同向重组，两个片段通过luc基因编码区1153bp的重叠区同向重组后成为有功能活性的luc⁺基因完整表达框，编码出有功能活性的荧光素酶，可以检测到荧光信号，两个同源片段中间的接头在重组过程中从染色体中去除。b为分子内反向重组，“35s启动子-luc基因上游编码区”片段发生翻转后，通过同源区重组后成为有功能活性的luc⁺基因完整表达框，接头在重组过程中会保留在染色体上。c为分子内反向重组，“luc基因下游编码区-35s终止子”片段发生翻转后，通过同源区重组后成为有功能活性的luc⁺基因完整表达框，接头在重组过程中会保留在染色体上。d为分子间重组，两个片段通过同源染色体间的重组成为有功能活性的luc⁺基因完整表达框，接头在重组过程中会从染色体中去除。

附图3UVC模拟辐照诱导FC40产生点突变：LB平板和lac平板被均分为左右两部分，左侧经UVC辐照处理，右侧遮有锡箔纸未经辐照处理，结果可见在lac平板上生长有蓝色菌落，该蓝色菌落即为FC40发生点突变后恢复为lac⁺。

附图4UVC辐照处理对FC40点突变影响。

附图5UVC、UVB模拟辐照、模拟微重力、辐照和模拟微重力协同对FC40点突变影响：a图为UVC处理，b图为UVB处理。使用t-test检验分析模拟微重力处理组（MG）与对照组（ck）显示点突变频率没有显著性差异；UVC、UVB模拟辐照处理组与对照组均有显著性提高。

附图6UVC模拟辐照对微生物点突变相关基因影响：统计方法为t-test，“**”表示p＜0.01。图中，“recA”是指DNA strand exchangeand recombination gene(Genebank ID:947170)。

附图7显微镜检测拟南芥发生同源重组突变的细胞：箭头所指的蓝色细胞即为发生同源重组突变的细胞。

附图8辐照、模拟微重力、辐照与模拟微重力对植物同源重组影响：a图为不同剂量UVB辐照处理对植物同源重组突变频率影响，b图为模拟微重力、辐照和模拟微重力协同对植物同源重组突变频率影响。突变频率以每棵苗发生突变的事件数目计算，a图每个处理组统计苗数目约为150棵，b图每个处理组统计苗数目为约180棵，误差线为标准误差（SEM），统计方法为t-test，“＊”表示p＜0.05，“＊＊”表示p＜0.01。图中a的纵坐标“每棵苗突变点数”，是指平均每棵苗发生突变点的数目。因为突变很低，每棵苗发生不到一个点，如0.25意思是4棵苗才可以检测到一个突变点。

附图9旋转培养模拟微重力处理对拟南芥形态影响：左侧两图为垂直培养处理对照组；右侧两图为旋转培养模拟微重力处理组。

附图10同源重组相关基因表达影响：a图为不同剂量UVB辐照处理对同源重组相关基因表达影响，b图为模拟微重力处理对同源重组相关基因表达影响，统计方法为t-test，“＊＊”表示p＜0.01。图中，“rad51”是指DNA repair protein RAD51-like1 gene(GenebankID:NM_122092.2)，“min”是指SMC-like gene(Genebank ID:NM_125539.1)，“brcal”是指breast cancer susceptibility 1-likegene(Genebank ID:NM_118225.4)。

附图11初始质粒：a为pGreen1579，含有Luc基因完整表达框，使用的为35S启动子和终止子；b为pGreen0179，是植物表达载体，含有潮霉素抗性基因，用于转基因植株筛选鉴定，在多克隆位点中含有EcoRI、HindIII单酶切位点，用于插入目的片段。

附图12重组载体酶切鉴定：泳道M为Trans 15k DNA Marker（购自北京全式金生物技术有限公司），自上而下依次为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、1500bp、1000bp、500bp；泳道1、5为pGreen-LU′-U′C；泳道2、6为pGreen-U′L-U′C；泳道3、7为pGreen-LU′-CU′；泳道4、8为pGreen-U′L-CU′；EcoRI单酶切同源重组载体得到约11.4kb片段，EcoRI/HindIII双酶切同源重组载体得到约5.1kb（载体pGreen0179）+6.2kb（重组片段）两片段。

附图13转基因种子潮霉素抗性筛选：左侧为野生型种子、右侧为转基因种子。

附图14转基因幼苗Gus染色鉴定：左侧为Gus染色阳性植株、右侧为Gus染色阴性植株。

附图15转基因植株荧光成像：其中阳性荧光对照为转有完整luc基因表达框的转基因阳性植株；阴性荧光对照为野生型植株；重组载体为荧光素酶同源重组转基因植株。

实施例

下述实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照J.萨姆布鲁克分子克隆实验指南第三版所建议条件或者参照照本领域内的文献所描述的技术或条件实施。所用试剂和材料如无特殊说明，均从商业途径获得。

实施例1微生物点突变模型在空间诱变机制研究中的应用

利用微生物点突变模型（大肠杆菌FC40模型）研究了紫外模拟辐照和旋转培养模拟微重力、辐照及模拟微重力协同条件对微生物点突变的影响。

1实验材料与装置：

实验菌株为大肠杆菌FC40（rif^R），由Dr Foster赠送；存活率计算采用LB培养基，突变筛选采用lac培养基（硫胺20ug/ml；乳糖0.4%；M9培养液）），菌株均在37℃条件下生长。

模拟微重力实验装置使用二维回转仪(购于中国科学院生物物理所)。

2紫外（UVC）模拟辐照处理对微生物点突变的影响

将进入平台初期的FC40菌液经过一定稀释后分别均匀涂布LB平板和lac平板，lac平板是乳糖作为唯一碳源的培养基，lac平板含40ulx-gal（20mg/ml），然后用锡箔纸将平板覆盖一半（右侧），于波长254nm紫外灯管下采用5J/m²±0.5J/m²、10J/m²±1.0J/m²、15J/m²±1.5J/m²剂量辐照处理，每个处理做三个重复，迅速放置于黑暗环境中保持30min后放入37℃培养24h左右，分别统计LB平板左右两侧菌落数LBN_右和LBN_左，按照公式：存活率=LBN_右/LBN_左*100%；唉计算辐照存活率，LBN（左）代表LB平板上未覆盖铝箔部分的菌落数，LBN（右）代表LB平板上覆盖铝箔部分的菌落数，统计lac平板左右两侧蓝色菌落数结合存活率计算突变频率提高倍数。

实验结果显示经辐照处理后，FC40菌株在lac平板上生长出蓝色菌落（附图3），说明发生了DNA点突变。实验结果显示经5J/m²±0.5J/m²、10J/m²±1.0J/m²和15J/m²±1.5J/m²三个剂量处理后，大肠杆菌FC40的点突变频分别提高2.4倍、3.0倍和3.3倍，由此说明UVC辐照处理后，FC40发生点突变频率明显提高，具体数据可以参考附图4），且随着辐照剂量的增大而增大（附图4）。

3紫外（UVC、UVB）模拟辐照处理、旋转培养模拟微重力处理、辐照和模拟微重力协同处理对微生物点突变的影响。

进入平台初期的菌液经过一定稀释后分别涂布LB平板和lac平板上，直接或经UVC（5J/m²±0.5J/m²）、UVB（378J/m²±30J/m²）辐照处理后固定在模拟微重力培养装置（即上述二维回转仪）上，以30rpm/min的速度在37℃培养箱内培养72h左右统计菌落个数。最后按公式(突变频率=每毫升待测样品产生的突变体数/每毫升待测样品活菌总数x100%)分别计算对照，UVC辐照后，模拟微重力（MG）处理后及两者协同条件下（UVC/MG）的菌种突变频率。

结果显示E.coli FC40的自发突变率为8.27×10^-7，UVC处理的突变频率与UVC/MG协同处理的突变频率分别为1.81×10^-6和1.67×10^-6，较自发突变频率提高2倍左右，而单独模拟微重力（MG）处理后的突变频率与对照基本无异，为8.63×10^-7（附图5a）。UVB处理的突变频率与UVB/MG协同处理的突变频率分别为2.38×10^-6和2.18×10^-6，较自发突变频率提高2.5倍左右，而MG处理后的突变频率与对照基本无异，为8.7×10^-7（附图5b）。

4紫外（UVC）模拟辐照处理对点突变相关基因表达的影响

取一定量的平台期菌液涂布于LB（含Rif⁵⁰）平板上，进行UVC5J/m²的辐照处理，分别在辐照后第0h、第1h、第2h、第4h取样，以不作处理的为对照（CK），用无菌水洗下菌体后离心收集，提取RNA，cDNA的逆转录，以rpsE为内参，进行点突变相关基因recA基因的实时荧光定量PCR，最终对结果进行分析，其引物设计如下：

结果显示经辐照处理2h后与突变相关的基因recA表达量均显著性升高（Student’s t-test检验）（附图6），由此在基因水平对辐照引起微生物点突变增加得到确定；也表明紫外模拟辐照处理能够引起微生物大肠杆菌recA基因表达发生变化，大肠杆菌可能是通过这些基因调控发生点突变。

实施例2拟南芥基因组DNA同源重组Gus报告系统在空间诱变机制研究中的应用

应用Gus同源重组报告转基因植物模型研究了紫外辐照、旋转培养模拟微重力、辐照及模拟微重力协同条件对拟南芥同源重组的影响。

1实验材料与装置：

实验材料为转基因拟南芥AtJML1418B，由Dipl.-Biol.AlexanderKnoll赠送（Karlsruhe Institute of Technology(KIT)Botany II-Molecular Biology and Biochemistry of Plants,德国），含有检测植物体细胞基因组DNA同向重组Gus报告系统，转基因植株的生态型为哥伦比亚（Columbia）。

模拟微重力培养装置使用二维回转仪(购于中国科学院生物物理所)；UVB紫外灯EB-160C/FE紫外灯（312nm）（美国Spectronics公司生产）

2紫外（UVB）模拟辐照处理对拟南芥体细胞基因组DNA同源重组的影响

采用垂直平板培养法培养转基因拟南芥AtJML1418B，培养基为1/2MS，拟南芥培养室温度21℃，光周期为16h日照/8h黑暗。待幼苗生长到7天时开始辐照（UVB）处理，辐照处理剂量设计3个梯度，0.75±0.045kJ/m²d、1.5±0.09kJ/m²d、3±0.18kJ/m²d，每个梯度6个平板（每个平板30株幼苗），未辐照处理组作为对照。辐照处理开始后将平板倒置培养，连续辐照处理10天后取出各个梯度下的植株进行Gus染色（例如参考R.Jefferson,Plant Mol.Biol，1987，Rep.5：387-405）。Gus染色37℃ 24h，70%乙醇脱色后，显微镜检测植株中被染成蓝色的细胞，所检测到的蓝色细胞即为发生基因组DNA同源重组的细胞，以一个蓝色斑点作为一个突变事件，统计每棵植株发生同源重组的频率,突变频率以每棵苗发生突变的事件数目计算。

结果在部分组织中可以检测到Gus染色的蓝色细胞（附图7），说明该细胞发生了基因组DNA同源重组变异，说明该种模型可以用来研究胁迫条件对植物基因组DNA同源重组变异研究。在植株根和叶的细胞中都能够检测到发生变异的细胞，通过显微镜下检测，可以检测到单细胞水平，由此说明该种模型检测基因组DNA同源重组变异非常灵敏。在观察到的突变点中，有的是多个细胞，这些细胞都是由同一个细胞分裂而来，说明该位置发生变异的时间较早，在极个别的样品可以用肉眼观察到；所检测到的突变点中大部分为单个细胞的突变，说明该位置变异发生较晚。

统计UVB辐照处理后拟南芥体细胞突变点数目结果显示：0.75±0.045kJ/m²d、1.5±0.09kJ/m²d和3±0.18kJ/m²d三个UVB模拟辐照处理剂量后，拟南芥体细胞基因组DNA同源重组突变频率分别增加2.4倍、3.1倍和7.9倍。由此说明UVB模拟辐照处理可以显著（Student’st-test检验）增加拟南芥基因组体细胞基因组DNA同源重组频率，且随剂量增加而增加（附图8a）。

3模拟微重力（MG）处理、辐照和模拟微重力协同处理

采用垂直平板培养法培养转基因拟南芥AtJML1418B，培养基为1/2MS，拟南芥培养室温度21℃，光周期为16h日照/8h黑暗。待幼苗生长到7天时将平板分为4组个处理组：静止培养处理组，旋转培养处理组，辐照+静止培养处理组，辐照+旋转培养处理组，每个处理组7个平板（每个平板30棵幼苗）。静止培养处理组和辐照+静止培养处理组平板倒置培养，辐照处理剂量为1.5±0.09kJ/m²d；旋转培养使用二维回转仪，转速为4rpm/min。连续辐照处理10天后取出各个处理组的植株进行GUS染色，GUS染色37℃24h，70%乙醇脱色后，显微镜检测植株中被染成蓝色的细胞，所检测到的蓝色细胞即为发生基因组DNA同源重组的细胞，以一个蓝色斑点作为一个突变事件，统计每棵植株发生同源重组的频率。

结果显示倒置平板的静止培养处理组、辐照+静止培养处理组的根的生长发生倒转后竖直生长，但是旋转处理组、辐照+旋转培养处理组的根的生长不发生倒转，交错在一起，成为一团（附图9）。

统计分析显示（Student’s t-test检验）旋转培养处理组较静止培养处理组，突变频率没有显著性差异；辐照组与静止培养组相比，拟南芥体细胞基因组DNA突变频率增加1.7倍，有极显著性差异；UVB辐照+旋转培养处理组较UVB辐照处理组没有显著性差异。基于上述结果说明旋转培养及辐照协同的旋转培养对拟南芥的同源重组频率均没有显著性影响（附图8b）。

4紫外辐照、旋转培养模拟微重力对重组相关基因表达影响

在UV辐照处理后6h和旋转培养模拟微重力处理第10天时，每个处理组分别取出三份样品Triol法提取RNA，Real-time PCR法检测重组相关基因rad51、mim、brca1三个基因表达情况，选择actin作为内参基因。具体引物序列如下：

Real-time PCR结果显示经UVB模拟辐照处理后，与重组相关的rad51、mim、brca1三个基因表达均有显著性升高（附图10a）（Student’st-test检验），由此在基因水平对辐照引起植物体细胞基因组DNA同源重组频率增加得到确定。而旋转培养模拟微重力处理对rad51、mim、brca1三个基因表达没有显著性影响（附图10b）（Student’s t-test检验），结合上述突变频率的结果，说明在本实验所用的这种模拟微重力条件对植物体细胞基因组DNA同源重组频率没有显著性影响。

实施例3拟南芥基因组DNA同源重组荧光素酶报告系统的建立及在空间诱变机制研究中的应用

1同源重组表达载体构建

1）初始质粒获得：

质粒pGreen0179（附图11）（购自John Innes Centre,Norwich,UK）为植物表达载体，T-DNA区含多克隆位点，用于外源片段插入，另含有潮霉素抗性筛选标记，用于转基因植物抗性筛选。

质粒pGreen1579（附图11）（购自John Innes Centre,Norwich,UK）为报告基因luc同源重组片段来源，含35s启动子、luc基因编码区、35s终止子构成的完整表达框。

质粒pGreen35S-Gus（购自John Innes Centre,Norwich,UK）为同源重组片段接头来源，含35s启动子、Gus基因编码区、35s终止子构成的完整表达框。

2）植物同源重组载体同源序列区构建：

主要方法是通过PCR扩增得到目的片段，在PCR扩增引物5′端引入不同的限制性内切酶酶切位点，再经过酶切和连接将各个表达载体元件构建到中间载体pMD18-T vector（购自宝生物工程有限公司）中，得到同源重组表达载体T-DNA区。

①接头片段获得（Gus片段）

设计PCR扩增引物GusF/GusR，以质粒pGreen35S-Gus为模板，PCR扩增得到接头序列：

GusF 5'-GATATCGTACCCCTACTCCAAAAATG-3'（SEQ IDNo：17）

GusR 5'-GATATCGATCTGGATTTTAGTACTGGATT-3'（SEQID No：18）

PCR扩增条件为：预变性94℃ 5min；94℃ 20s，58℃ 20s，68℃3min，30个循环；68℃ 7min；4℃保存。

高保真KOD DNA polymerase（购自TOYOBO公司）进行PCR扩增，扩增得到约2.4kb目的片段，该片段含有gus基因的完整表达框（含35S启动子和终止子），胶回收后加“A”，通过T-A克隆连接pMD18-T vector，转化大肠杆菌DH5a，菌落PCR方法挑取阳性克隆送公司测序，挑取测序正确的克隆pG-19用于后续操作。

②同源重组片段LUC-35s term获得：

设计PCR扩增引物LUC-TF1/LUC-TR1，LUC-TF2/LUC-TR2，在引物5′端分别引入酶切位点。以质粒pGreen1579为模板，PCR扩增得到同源重组片段LUC-35s term，该片段含luc基因下游区和35s终止子：

LUC-TF15'ggatcc-ATATCGATCTGGATTTTAGTACTGGA 3'

BamHI （SEQ ID No：19）

LUC-TR15'gaattc-GGCGCCATTCTATCCGCTGG 3'

EcoRI （SEQ ID No：20）

LUC-TF25'gaattc-ATATCGATCTGGATTTTAGTACTGGA 3'

EcoRI （SEQ ID No：21）

LUC-TR25'ggatcc-GGCGCCATTCTATCCGCTGG 3'

BamHI （SEQ ID No：22）

高保真KOD DNA polymerase进行PCR扩增，LUC-TF1/LUC-TR1扩增得到约1.9kb目的片段CU′，该扩增片段luc基因端为EcoRI、35s终止子端为BamHI；LUC-TF2/LUC-TR2扩增得到约1.9kb目的片段U′C，该扩增片段luc基因端为BamHI、35s终止子端为EcoRI。U′C、CU′两片段胶回收后加“A”，通过T-A克隆连接pMD18-Tvector，转化大肠杆菌DH5a，菌落PCR方法挑取阳性克隆送华大基因公司测序，挑取测序正确的克隆CU′8、U′C5用于后续操作。

③同源重组片段35S-LUC获得：

设计PCR扩增引物35S-LUCF1/35S-LUR1，35S-LUCF2/35S-LUR2，在引物5′端分别引入酶切位点。以质粒pGreen1579为模板，PCR扩增得到同源重组片段35S-LUC，该片段含luc基因上游区和35s启动子：

35S-LUCF15'ctgcag-AGGACCTCTCACACACAGTTC 3'

PstI （SEQ ID No：23）

35S-LUR15'aagctt-TTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA 3'

HindIII （SEQ ID No：24）

35S-LUCF25'aagctt-AGGACCTCTCACACACAGTTC 3'

HindIII （SEQ ID No：25）

35S-LUR25'ctgcag-TTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA 3'

PstI （SEQ ID No：26）

高保真KOD DNA polymerase进行PCR扩增，35S-LUCF1/35S-LUR1扩增得到约1.8kb目的片段LU′，该扩增片段luc基因端为PstI、35s启动子端为HindIII；35S-LUCF2/35S-LUR2扩增得到约1.8kb目的片段U′L，该扩增片段luc基因端为HindIII、35s启动子端为PstI。LU′、U′L两片段胶回收后，连接pEASY-Blunt T vector（购自北京全式金生物技术有限公司），转化大肠杆菌DH5a，菌落PCR方法挑取阳性克隆送华大基因公司测序，挑取测序正确的克隆LU′6、U′L2用于后续操作。

④植株同源重组载体同源序列区各元件连接

同源重组片段LUC-35s term与接头片段连接：CU′8、U′C5经BamHI/EcoRI双酶切，胶回收1.9kb目的片段CU′和U′C，pG19同样经BamHI/EcoRI双酶切回收载体片段pG，使用TakaRa公司连接试剂盒Soultion I连接CU′与pG得到pG-CU′片段；U′C与pG得到pG-U′C片段。连接产物转化大肠杆菌DH5a，经PCR、质粒酶切鉴定得到阳性克隆pG-CU′6和pG-U′C8。

同源重组片段35S-LUC与LUC-35s term:接头片段连接：LU′6、U′L2经HindIII/PstI双酶切，胶回收1.8kb目的片段LU′和U′L，pG-CU’6同样经HindIII/PstI双酶切回收载体片段pG-CU′，使用TakaRa公司连接试剂盒Soultion I连接LU′与pG-CU′得到LU′-pG-CU′片段；U′L与pG-U′C得到U′L-pG-CU′片段。连接产物转化大肠杆菌DH5a，经PCR、质粒酶切鉴定得到阳性克隆LU′-pG-CU′4和U′L-pG-CU′2。

LU′6、U′L2经HindIII/PstI双酶切，胶回收1.8kb目的片段LU′和U′L，pG-U′C8同样经HindIII/PstI双酶切回收载体片段pG-U′C，使用TakaRa公司连接试剂盒Soultion I连接LU′与pG-U′C得到LU′-pG-U′C片段；U′L与pG-U′C得到U′L-pG-U′C片段。连接产物转化大肠杆菌DH5a，经PCR、质粒酶切鉴定得到阳性克隆LU′-pG-U′C3和U′L-pG-U′C4。

3）同源重组载体同源序列区与植物表达载体骨架连接：

HindIII/EcoRI分别双酶切LU′-pG-CU′4、U′L-pG-CU′2、LU′-pG-U′C3、U′L-pG-U′C4质粒，胶回收构建好的同源序列区目的片段，HindIII/EcoRI双酶切pGreenII0179胶回收载体区，Soultion I连接pGreenII0179与LU′-pG-CU′得到pGreen-LU′-CU′;连接pGreenII0179与U′L-pG-CU′得到pGreen-U′L-CU′;连接pGreenII0179与LU′-pG-U′C得到pGreen-LU′-U′C；连接pGreenII0179与U′L-pG-U′C得到pGreen-U′L-U′C；连接产物转化大肠杆菌DH5a，经PCR、质粒酶切鉴定得到阳性克隆（附图12）。

阳性克隆送华大基因测序鉴定得到正确的四个植物同源重组表达载体，测序结果表明所构建的四个载体均符合预期。各个载体具体序列信息见序列表。

2同源重组表达载体转化农杆菌

将步骤1中构建好的四个植物同源重组表达载体pGreen-LU′-CU′、pGreen-U′L-CU′、pGreen-LU′-U′C、pGreen-U′L-U′C 0.5μg，加入50μL农杆菌GV1301的感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置5min；2500伏电击5ms，立刻加入800μL YEB培养基，28℃，150rpm，恢复培养45min后取200μL涂布于YEB筛选培养基平板（卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L），超净台吹干表层液体；28℃培养两天，获得重组农杆菌阳性菌株。

3农杆菌转化拟南芥

将步骤2中得到得重组农杆菌阳性菌株转化拟南芥。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）转化实验所用生态型为哥伦比亚，转化方法参照蘸花法(Fitzgerald et al.,2003)：

(1)将阳性重组子GV1301农杆菌接种于10mlYEB液体培养基中（卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L），于28℃200rpm振荡过夜；

(2)转化前一天接种于200ml含相同抗生素的YEB液体培养基中，扩大培养至OD600值为1.2~1.6；

(3)5000g离心15分钟，收集菌体，重悬于5％蔗糖溶液中，调整OD600值至0.8；

(4)在蘸花之前加Silwet L-77至终浓度为0.03％，混匀。蘸花2～3次，每次蘸15s，可以看到植株上附有一层液膜。把蘸过的植株用薄膜覆盖16－24小时，保湿，置于阴凉地方。

(5)收获得到的拟南芥种子即为转基因种子

4转基因拟南芥筛选

将步骤3中收获的转基因拟南芥种子播种于含30mg/ml潮霉素的1/2MS筛选平板上进行抗性筛选，28℃避光培养一周后，下胚轴伸长的植株为阳性转基因植株（附图13）。将阳性植株移苗于小盆后培养，待幼苗生长出莲座叶时，取约0.2cm²叶片进行Gus染色鉴定（附图14）；另取少量叶片提取基因组DNA做PCR鉴定。PCR鉴定引物使用潮霉素特异引物：

HygF 5'-AAGATGTTGGCGACCTCGTATTGG-3'（SEQ IDNo：27）

HygR 5'-TTCGACAGCGTCTCCGACCTGAT-3'（SEQ ID No：28）

以野生型拟南芥作为阴性对照。PCR扩增阳性和Gus染色阳性的植株为阳性转基因植株。

5同源重组模型功能鉴定

将步骤4中筛选得到了阳性拟南芥植株播种于1/2MS培养基平板中，4℃低温处理2天后，23℃垂直培养，光周期为16h光照/8h黑暗。待培养10天后，UVB辐照处理幼苗，辐照剂量为3kJ/m²d，连续处理10天后，用活体化学发光和荧光成像系统P80（日本Dragon具体？）进行荧光成像。使用含完整荧光素酶表达框的转基因植株作为荧光阳性对照，野生型拟南芥植株作为荧光阴性对照。荧光成像结果如附图15，结果显示转入完整荧光素酶表达框的转基因植株可以检测到整株均可发出荧光，而野生型拟南芥中则不能检测到荧光。所构建的荧光素酶同源重组转基因植株，在经过UVB辐照处理后，在植株的一些细胞中可以检测到荧光亮点，该荧光亮点即为发生同源重组的体细胞。说明本发明的植物体细胞荧光素酶报告系统可以用于检测植物体细胞基因组DNA同源重组的发生。

Claims

1.一种用于检测空间诱变的系统，其包括生物遗传突变分子报告模型，优选地生物遗传突变分子报告模型包括突变报告基因。

2.权利要求1的系统，其中所述物遗传突变分子报告模型包括微生物模型、植物体细胞模型或转基因动物模型中的一种或多种。

3.权利要求1或2的系统，其中所述突变报告基因是点突变、移码突变、重组突变报告基因。

4.权利要求1或2的系统，其中所述报告基因包括抗性筛选标记基因、GUS（β-葡萄糖苷酸酶）、LUC（荧光素酶）、GFP（绿色荧光蛋白）。

5.权利要求1或2的系统，其中所述模型是Ames test模型。

6.权利要求1或2的系统，其中所述模型是大肠杆菌点突变模型，优选的是大肠杆菌FC40（rif^R）或lazZ点突变模型。

7.权利要求1或2的系统，其中所述模型是拟南芥模型，优选的是拟南芥基因组DNA同源重组Gus报告系统，例如是拟南芥AtJML1418B；或者拟南芥基因组DNA同源重组荧光素酶报告系统。

8.权利要求1或2的系统，其中所述模型是小鼠模型，优选的是检测染色体交换的转基因小鼠模型、检测染色体内同向重组转基因小鼠模型。

9.权利要求1或2的系统，其中所述模型是使用包含四个植物同源重组表达载体pGreen-LU′-U′C、pGreen-U′L-U′C pGreen-LU′-CU′、pGreen-U′L-CU′的农杆菌GV130转化的拟南芥，所述载体pGreen-LU′-U′C、pGreen-U′L-U′C pGreen-LU′-CU′、pGreen-U′L-CU′分别是通过载体pGreenII0179经过HindIII/EcoRI双酶切后分别连接两端分别有HindIII/EcoRI限制性酶切位点的如下插入序列而产生，其中LU′-U′C插入序列从5’至3’由启动子（35S启动子）、正向的LU’片段、Gus片段、正向的U’C片段、终止子（35S终止子）组成；U′L-U′C插入序列从5’至3’由反向的LU’片段、反向启动子（35S启动子）、Gus片段、正向的U’C片段、终止子（35S终止子）组成；LU′-CU′插入序列从5’至3’由正向的U’C片段、终止子（35S终止子）、Gus片段、反向的LU’片段、反向的启动子（35S启动子）组成；U′L-CU′插入序列从5’至3’由正向的U’C片段、终止子（35S终止子）、Gus片段、正向的启动子（35S启动子）、正向的LU’片段组成；

优选地，所述载体pGreen-LU′-U′C、pGreen-U′L-U′CpGreen-LU′-CU′、pGreen-U′L-CU′分别是通过载体pGreenII0179经过HindIII/EcoRI双酶切后分别连接序列SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4所得。

10.一种用于检测空间诱变并评估空间诱变频率的方法，其包括构建含有不同突变形式报告基因的转基因生物突变体，所述转基因生物突变体包括权利要求1－9中任一项所述的模型。

11.权利要求10所述的方法，其包括以下步骤：

a.提供权利要求1－9所述的模型；

b.进行空间诱变处理，包括空间环境条件和地面模拟空间环境条件处理；

c.检测诱变并评估空间诱变频率。

12.权利要求10或11所述的方法，其中所述所述地面模拟空间环境条件处理包括：紫外线辐照；旋转处理及其组合。

13.权利要求10－12中任一项所述的方法，其中所述紫外线辐照包括UVC、UVB或其组合；辐照的强度范围：UVC为0-15J/m²，UVB为0-3kJ/m²。优选地强度是UVC（5J/m²±0.5J/m²）、UVB（378J/m²±30J/m²）辐照处理；优选地辐照处理剂量设计为进行3个梯度处理，例如UVC使用3个梯度5J/m²±0.5J/m²、10J/m²±1.0J/m²、15J/m²±1.5J/m²剂量辐照处理，或者UVＢ使用3个梯度0.75±0.045kJ/m²d、1.5±0.09kJ/m²d、3±0.18kJ/m²d剂量辐照处理。

14.权利要求10－13中任一项所述的方法，其中旋转处理的转速为1-50rpm/min，优选的转速为30rpm/min、4rpm/min。

15.权利要求10－14中任一项所述的方法，其中检测诱变的方法包括：对微生物进行计数并计算突变频率；Gus染色并显微镜检查；荧光检查。

16.权利要求10－15中任一项所述的方法，其中对微生物评估空间诱变频率是通过如下公式来计算突变频率：突变频率=每毫升待测样品产生的突变体数/每毫升待测样品活菌总数x100％。